JPH11504211A - CNS neurite growth regulators and compositions, cells and methods of embodying and using the same - Google Patents

CNS neurite growth regulators and compositions, cells and methods of embodying and using the same

Info

Publication number
JPH11504211A
JPH11504211A JP8531932A JP53193296A JPH11504211A JP H11504211 A JPH11504211 A JP H11504211A JP 8531932 A JP8531932 A JP 8531932A JP 53193296 A JP53193296 A JP 53193296A JP H11504211 A JPH11504211 A JP H11504211A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
nerve
growth
cell
cam
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP8531932A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
シャックナー メリッタ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Acorda Therapeutics Inc
Original Assignee
Acorda Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Acorda Therapeutics Inc filed Critical Acorda Therapeutics Inc
Publication of JPH11504211A publication Critical patent/JPH11504211A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は神経成長を促進するためグリア細胞及びミエリン上に見いだされる阻害的な手掛かり分子に打ち勝つことができる神経細胞接着分子を投与することによる、哺乳動物の中枢神経系における神経成長をイン・ビボで促進する方法であることを特徴とする。また、それらの活性な断片、同起源の分子、同種のもの、模倣物、アナログ、分泌細胞及び可溶性分子、及びそれらに対する抗体、並びにＤＮＡ分子、ベクター及びそれらを発現することができる形質転換細胞を特徴とする。本発明は分化した星状グリア細胞中で神経接着分子を発現するトランスゲニックマウス・ライン及びそれに由来する細胞及び組織をも含む。神経接着分子の発現はこれらのトランスゲニックマウス由来の中枢神経系組織上でニューライト成長を高める。本発明は、ＣＮＳニューロンのニューロン成長を高める方法、記憶を強化する方法及びシナプス効率を増強する方法であることをも特徴とする。また、神経接着分子の効果を調節する薬物を試験する方法であること、並びにかかる方法に適する試験系であることを特徴とする。   (57) [Summary] The present invention provides in vivo neuronal growth in the central nervous system of mammals by administering neuronal cell adhesion molecules capable of overcoming the inhibitory cue molecules found on glial cells and myelin to promote nerve growth. It is a method of promoting with. Also, active fragments thereof, cognate molecules, allogeneic substances, mimetics, analogs, secretory cells and soluble molecules, and antibodies thereto, as well as DNA molecules, vectors and transformed cells capable of expressing them are disclosed. Features. The invention also includes a transgenic mouse line that expresses neural adhesion molecules in differentiated astrocytes, and cells and tissues derived therefrom. Expression of neural adhesion molecules enhances neurite growth on central nervous system tissue from these transgenic mice. The invention is also characterized by a method for enhancing neuronal growth of CNS neurons, a method for enhancing memory, and a method for enhancing synaptic efficiency. The present invention is also characterized in that it is a method for testing a drug that regulates the effect of a nerve adhesion molecule, and that the test system is suitable for such a method.

Description

【発明の詳細な説明】 中枢神経系ニューライトの成長調節因子 並びに構成物、細胞及びそれを具体化し使用する方法 発明の背景 発明の分野 本発明は中枢神経系における神経成長の調節一般に関し、そしてより具体的に はＣＮＳ神経成長を改善するための諸方法並びに関連する作用物質類、構築物及 び構成物に関する。特に本発明は、かかる神経成長を促進し改善するため、細胞 接着分子類、より好ましくはＬ１のような神経細胞の接着分子類を使用すること に関する。 関連技術の記載 ニューロン（neuron）がニューライト(neurites)を伸ばす能力は発育の過程で ニューロンの連結を完成させる際に第１義的に重要である。それはまた、損傷の 結果破壊された結合を再形成するための再生の過程でも要求される。 ニューライトはすべての動物種の中枢及び末梢の両神経系において、発育の過 程で大いに伸長する（カヤール(Cajal)(1928)，神経系における変性と再生，オ クスフォード ユニバーシティ プレス、ロンドン）。この現象は軸索と樹状突 起に関連する。しかし、成人においては、中枢神経系における軸索や樹状突起の 再成長は発生の進行につれて次第に失われる。 末梢神経系においては、損傷の苦しみの後、すべての脊椎動物種の軸索は再成 長することができる(カヤール(Cajal)(1928)，マルチニ(Martini)(1994)，J．Ne urocytol．23: 1-28)。しかしながら、哺乳動物では、損傷の後のニューライト の再成長はニューライトの発芽に限定される。しかし、ニューロン突起(neurona l processes)の再成長は下等脊椎動物種では可能である(スターマー(Stuermer) ら，(1992)J．Neurobiol.23: 537-550)。対照的に、中枢神経系では、高等及び 下等脊椎動物の成熟動物のすべてとまでは言わないまでもその多くはニューライ トの再成長の潜在能力を持っている（アグアヨ(Aguayo)(1985)「成熟哺乳動物の 中枢神経系における損傷を受けたニューロンからの軸索の再生」，Synaptic Pla sticity(C.W.コトマン編)中，ニューヨーク、ザ ギルフォード プレス、457-4 84 頁）。 グリア細胞は軸索再成長を調節するための明白な決定因子である。哺乳動物の グリア細胞は発育の過程で中枢神経系の（シルバー(Silver)ら(1982)，J．Comp. Neurol. 210: 10-29、ミラー(Miller)ら(1985)，Develop．Biol. 111: 35-41、 ポラーバーグ(Pollerberg)ら(1985)，J.Cell．Biol．101: 1921-1929）そして成 熟動物の末梢神経系の（フォーセット(Fawcett)ら(1990)、Annu．Rev．Neurosci . 13: 43-60）ニューライトの成長を一般に許容する。このようにして、損傷の 苦しみの際、成熟哺乳動物末梢神経系のグリア細胞はある程度初期ニューライト の成長促進能にまで戻し再生を促進させることができる(カルデロン(Kalderon)( 1988)J．Neurosci．Res.21: 501-512、クリオット(Kliot)ら「成熟哺乳動物脊髄 への後根ファイバーの再生の誘発」，神経再生における現代的課題，ニューヨー ク，311-328 頁、カールステット(Carlstedt)ら(1989)，Brain Res．Bull．22: 93-102)。下等脊椎動物の一部の中枢神経系のグリア細胞は成熟動物のニューラ イト再成長を許容し続ける（スターマー(Stuermer)ら，(1992)J．Neurobiol.23: 537-550)。これに反して、成熟哺乳動物の中枢神経系のグリア細胞は損傷後の ニューライト再成長を促さない(not conductive)。 ニューライト成長の促進及び／又は阻害の基礎となる分子状の手掛かりとして 働く幾つかの認識分子が同定されてきた（マルチニ(Martini)(1996))。ニューラ イト成長促進の認識分子の中でも、神経細胞接着分子Ｌ１はニューライト成長を 媒介する点で卓越した役割を果たす(シャックナー(Schachner)(1990)，Seminars in the Neurosciences 2: 497-507)。Ｌ１依存性のニューライト成長は同種親 和性の(homophilic)相互作用により媒介される。Ｌ１はＬ１発現性のニューライ ト及びシュワン細胞、並びにＬ１でトランスフェクトされた繊維芽細胞でのニュ ーライト成長を増進する（ビクスビー(Bixby)ら(1982)，Proc．Natl．Acad．Sc i．U.S.A． 84: 2555-2559、チャン(Chang)ら(1987)，J．Cell．Biol. 104: 355 -362、ラゲナウア(Lagenaur)ら(1987)，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A． 84: 7 753-7757、ザイルハイマー(Seilheimer)ら(1988)，J．Cell．Biol. 107: 341-35 1、カドモン(Kadmon)ら(1990a)，J．Cell．Biol．110: 193-208、ウイリアムズ( Williams)ら(1992)，J．Cell．Biol. 119:883-892)。Ｌ１の発現は成熟マウスの 末梢神経を切断又は破砕した後に劇的に増大する（ニーケ(Nieke)ら(1985)，Dif ferentiation 30: 141-151、マルチニ(Martini)ら(1994a)，Glia 10: 70-74)。 二日以内にＬ１はニューロンとシュワン細胞の間の接触面に、ニューロン上では なく主としてシュワン細胞の細胞表面に集中して蓄積する(マルチニ(Martini)ら (1994a))。さらに、Ｌ１の同種親和性の結合能力は神経細胞接着分子であるＮ− ＣＡＭと分子会合することにより増強され、同種親和的な補助を通じて結合が起 こることを可能にする（カドモン(Kadmon)ら(1990a)、カドモン(Kadmon)ら(1990 b)，J．Cell．Biol．110: 209-218 及び 110: 193-208、ホーストコルテ(Horst korte)ら(1993)，J．Cell．Biol. 121: 1409-1421)。ニューライト成長促進性の ほかに、Ｌ１は細胞接着(ラチエン(Rathjen)ら(1984)，EMBO J．3: 1-10、カド モン(Kadmon)ら(1990b)，J．Cell．Biol．110: 209-218、アッペル(Appel)ら(19 93)，J．Neurosci.，13: 4764-4775)、顆粒細胞移動(リンドナー(Lindner)ら(19 83)，Nature 305: 427-430)及び軸索のミエリン形成(ウッド(Wood)ら(1990)，J ．Neurosci. 10: 3635-3645)にも関与する。 Ｌ１は６個の免疫グロブリン様ドメインと５個のフィブロネクチン・タイプII I に相同な反復とから成っている。Ｌ１はシグナル変換器として働く。その認識 過程は細胞内メッセンジャーの定常状態レベルの変化に導く複雑な一連の事象の 第一段階である。細胞内メッセンジャーには、イノシトールリン酸、Ｃａ2+、ｐ Ｈ及び環状ヌクレオチド類(シュック(Schuch)ら(1990)，Neuron 3: 13-20、フォ ンボーレン(von Bohlen)とハルバッハ(Hallbach)ら(1992)，Eur．J．Neurosci． 4: 896-909、ドハーティ(Doherty)ら(1992)，Curr．Opin．Neurobiol. 2: 595-6 01)がプロテインキナーゼＣやｐｐ６０c-src(シュック(Schuch)ら(1990)，Neuro n 3: 13-20、アタシ（Atashi）ら(1992)，Neuron 8: 831-842)のようなプ ロテインキナーゼ類の活性の変化と同様に含まれる。Ｌ１はカゼインタイプIIキ ナーゼ及びＬ１をリン酸化する別の未同定のキナーゼ（サドウル（Sadoul）ら(1 989)，J．Neurochem．328: 251-254）とも関連している。Ｌ１に媒介されるニュ ーライトの成長はＬ型Ｃａ2+チャンネルの閉塞及び百日咳毒素に感受性である。 これらの知見はＣａ2+及びＧタンパク質の両者がＬ１に媒介されるニューライト の成長に重要であることを示す（ウイリアムズ（Williams）ら(1992)，J．Cell. Biol. 119: 883-892）。Ｌ１は培養中の増殖しつつある未成熟の星状グリア細胞 （astrocytes）上にも存在し、そしてニューライトの成長はこれらの細胞上で分 化したＬ１免疫陰性の星状グリア細胞上よりも遙かに良く促進される（サード（ Saad）ら(1991)，J．Cell．Biol. 115: 473-484)。しかしながら、イン・ビボで は、星状グリア細胞は胚芽１３日から成熟までの試験されたどの発育段階でもＬ １を発現することが示された（バーチ(Bartsch)ら(1989)，J．Comp．Neurol.284 : 451-462、及び未発表データ）。 ニューライトの成長を促進させるＬ１の能力が明らかになれば、Ｌ１及びＬ１ が属する免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーの星状グリア細胞で の発現が、成人中枢神経系でグリア細胞及びミエリン上に存在すると報告された 潜在的に阻害的な手掛かり分子（シャックナー(Schachner)ら，発生学的な神経 生物学の将来展望，印刷中、シュバブ(Schwab)ら(1993)，Ann．Rev．Neurosci． 16: 565-595)を打ち負かすかどうかを研究することが重要となる。このことは、 ＣＮＳの神経組織の先天異常又は損傷により引き起こされる衰弱を治療するため の有効な戦略の開発にとって特に重要であり、そして本発明が志向しているのは まさにこのような目的に対してである。 発明の概要 本発明によれば、神経の成長の調節のための、特に中枢神経系（ＣＮＳ）の領 域内でそして特にミエリン化された神経組織の中で、成長が促進され得るように 調節するための作用物質(an agent)および対応する方法が開示される。本発明の 作用物質は、既知のニューライト成長因子の成長促進的刺激に対して阻害的であ ると従来みなされてきた環境において、このような神経成長を促進させる能力を 有する点で特筆すべきである。特に、この阻害的環境には、中枢神経系のグリア 細胞及びミエリン上に存在する阻害的な手掛かり分子が含まれる。 本発明の作用物質は細胞接着分子の群から、そしてより好ましくは神経細胞接 着分子の群から広く選択される。本発明の作用物質は免疫グロブリンスーパーフ ァミリー、特にＬ１、Ｎ−ＣＡＭ及びミエリン関連のグリコプロテインがその特 殊なメンバーであるＣａ2+非依存性の神経細胞接着を媒介するファミリーに属す る分子の群から選択されるのが最も好ましい。ＣＮＳ神経成長にも影響を与える かも知れない他の細胞接着分子としては、ラミニン(laminin)、フィブロネクチ ン、Ｎ−カドヘリン（N-cadherin）、ＢＳＰ−２(マウスのN-CAM)、Ｄ−２、２ ２４−１Ａ６−Ａ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＮＩＬＥ、Ｎｒ−ＣＡＭ、ＴＡＧ−１（ax onin-1）、Ｎｇ−ＣＡＭ及びＦ３／Ｆ１１が挙げられる。 本発明のさらなる側面では、本発明の作用物質は神経認識分子のＬ１ファミリ ーとしてここに参照した新規なファミリーに属する。このファミリーには、Ｌ１ 、ＮｇＣＡＭ、ニューロフアシン(neurofascin)、ドロソフィラ（ショウジョウ バエ）ニューログリアン、ゼブラフィッシュ(zebrafish)Ｌ１．１及びＬ１．２ 及びその他のものが含まれる。このグループの作用物質はすべて、Ｌ１の特徴で あるＩｇ様ドメインとＦＮ様反復とを示し、この点について、顕著な共直線性、 ＨＮＫ−１炭水化物構造を含む高度にＮ−グリコシド結合を有する炭水化物、そ して主要な１８５ｋＤのバンドとより小さな１６５及び１２５ｋＤのバンドを含 むタンパク質断片のパターンを示す。 本発明の作用物質はまた、ＣＮＳにおけるニューライトの成長を調節する、細 胞接着分子の断片、同起源の分子、同種のもの(congeners)及びそれらの模倣物 を含む。特に、この作用物質には、細胞外マトリックス分子、特にフィブロネク チンタイプIII の相同反復及び免疫グロブリン様ドメインの特徴的な構造的モチ ーフを含む分子が含まれる。これらの構造的モチーフはフィブロネクチンタイプ III の相同反復１−２及び免疫グロブリン様ドメインＩ−II、III−IV及びＶ−V Iに構造的に類似のモチーフを含むことが好ましい。 本発明はイン・ビボの神経再生を促進し増強する方法、及びこのような方法の 目的を達成させるために使用されうる、プラスミド、ベクター、トランスジーン などの対応する遺伝的構築物、そして薬学的組成物のすべてに及ぶ。より具体的 には、本発明の作用物質はベクター又はプラスミドとして調製され、そして再生 が必要とされているＣＮＳの部位に局在する神経細胞中に、本発明の作用物質の 発現を惹起させるべく例えば遺伝子治療技術により導入され、そしてこれにより 必要な神経の成長を促進させる。別の戦略は、非経口的投与によりＣＮＳ部位に 直接送達されうるようにした、ある組成物中の適当な作用物質の１以上を含む処 方を提供する。Ｌ１のようなある種の作用物質は同種親和性の結合をするので、 その組成物の投与は神経成長の促進よりもむしろ阻害の目的で役立つかも知れな い。この効果は、望ましくない又はコントロールできない成長が起こり又は起こ っている特殊な場合に望ましいものである、従って本発明はこの使用にも同様に 及ぶことになる。 同様に、同種親和性の結合をする作用物質の能力はアンタゴニストを作用物質 にする。かかる作用物質は、元の作用物質の抗体を含み、アゴニストとして作用 することができ、そしてそれにより神経成長及び再生の促進に関与する。このよ うにして、本発明は本明細書に述べた治療目的に使用するための、作用物質に対 する抗体を含む適当な構築物及び組成物の調製を含む。また、本明細書において 後に示すように、Ｌ１に対する抗体は、例えば、本発明に従って診断及び治療の 両面で活性及び有用性を有する別の作用物質を同定するための、薬物発見試験な どに役立つ可能性がある。具体的には、Ｌ１のアナログであるＣＨＬ１の分離及 び特性解明に関して本明細書で後に例示するように、ポリクローナル抗体のよう な抗体はＬ１ＣＡＭファミリーの別のメンバーを同定するために使用することが でき、従って本発明はこのような抗体の使用によって単離されるＣＡＭメンバー をも含むものである。本発明は診断的適用をもカバーする。ここでは、例えば、 本発明の作用物質の１以上の量又は活性の存在の検出又は測定により、ＣＮＳ神 経成長のポテンシァル又はその実際の発育を評価することが望ましい。同様に、 そして本明細書で記述するように、本発明はＣＮＳ神経成長の調節における本発 明の作用物質の活性を利用する試験、薬物発見試験を包含する試験にまで及ぶ。 例えば、本発明の作用物質を含む試験により、見込みのある薬物をＣＮＳ神経成 長について試験することができ、あるいは本発明との関連で発展させられた株化 細胞又は培養はこの試験系として役立つかも知れない。 簡単に言えば、本発明は分化した星状グリア細胞、グリア細胞、細胞及びそれ から誘導された組織中で神経接着分子を発現するトランスゲニックマウスをも特 徴とする。特に、神経接着分子はＬ１である。星状グリア細胞のＬ１発現はこれ らのトランスゲニックマウス由来の中枢神経系組織上でのニューライトの成長を 増強する。 上に論じたように、本発明は、ＣＮＳニューロンのニューロンの成長を増強す る方法、記憶を増強する方法、及び長期ポテンシエーション(long term potenti ation)の安定化により測定されるシナプスの有効性を増強する方法、並びにその 他の類似の有用な方法であることを特徴とする。神経接着分子の効果を調節する 薬物やその他の操作を試験する方法であり、そしてこのような方法に適する試験 系であることも本発明の特徴である。 従って、そのグリア細胞が外因性の神経接着分子を発現するトランスゲニック 哺乳動物を提供することが本発明の主要な目的である。 本発明のさらなる目的は、該トランスゲニック哺乳動物のグリア細胞を含む細 胞培養を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、トランスゲニック哺乳動物の神経系の損傷を受け 又は受けていない視神経又はその他の部分を含む細胞培養系を提供することであ る。 本発明のさらなる目的は、グリア細胞培養系のニューロンを培養することを含 む、ＣＮＳニューロンのニューロン成長を増強する方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、ＣＮＳニューロンのニューロン成長を増強する方法 を提供することである。この方法は細胞培養系に置かれた神経系の視神経又は他 の部分の上でニューロンを培養することを含む。 本発明のさらなる目的は、移植された細胞による神経接着分子の分泌を含む、 ＣＮＳニューロンのニューロン成長を増強する方法を提供することである。 本発明の別の目的は、記憶増強の必要な哺乳動物の脳に哺乳動物の記憶を増強 するのに有効な量のグリア細胞培養系の細胞を投与することを含む、記憶を増強 するための方法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、記憶増強の必要な哺乳動物の脳に、細胞培養系に 置かれた神経系の視神経又は他の部位の細胞の哺乳動物の記憶を増強するのに有 効な量を投与することを含む、記憶を増強する方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、このような記憶の増強の必要な哺乳動物の脳のグリ ア細胞に、該グリア細胞中で神経接着分子の発現を可能とするベクターを送達す ることを含む、記憶を増強する方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、移植された細胞による神経接着分子の分泌を含む、 記憶を増強する方法を提供することである。 本発明の別の目的は、哺乳動物の脳におけるシナプス効率を増強するのに有効 なだけのグリア細胞培養系の細胞の量を哺乳動物の脳に投与することを含む、そ のような増強の必要な哺乳動物のＣＮＳにおけるシナプスの効率を増強する方法 を提供することである。 本発明のさらなる目的は、哺乳動物の脳におけるシナプス効率を増強するのに 有効なだけの細胞培養系に置かれた神経系の視神経又はその他の部分の細胞の量 を哺乳動物の脳に投与することを含む、そのような増強の必要な哺乳動物のＣＮ Ｓにおけるシナプス効率を増強する方法を提供することである。 さらなる目的は、そのような増強の必要な哺乳動物の脳のグリア細胞に、該グ リア細胞中で神経接着分子の発現を可能とするベクターを送達することを含む、 このような増強の必要な哺乳動物のＣＮＳにおけるシナプス効率を増強する方法 を提供することである。 本発明のさらなる目的は、移植された細胞による神経接着分子の分泌を含む、 シナプス効率を増強する方法を提供することである。 本発明の別の目的は、ＣＮＳニューロンをグリア細胞培養系に添加すること、 試験対象である薬物をこの培養細胞系に添加すること、ＣＮＳニューロンのニュ ーロン成長を測定すること、そして薬物が添加されていないコントロール培養に 対する薬物の存在下における細胞の神経成長のレベルの差を神経接着分子の活性 を調節する該薬物の能力に対して相関させることを含む、薬物やその他の物質の 神経接着分子の活性を調節する能力を試験する方法を提供することである。 本発明の別の目的は、ＣＮＳニューロンを神経系細胞培養系の視神経又はその 他の部分に添加すること、この細胞培養系に試験対象である薬物を添加すること 、ＣＮＳニューロンのニューロン成長を測定すること、そして薬物が添加されて いないコントロール培養に対する薬物の存在下における細胞のニューロン成長レ ベルの差を神経接着分子の活性を調節する薬物の能力に対して相関させることを 含む、薬物やその他の物質の神経接着分子の活性を調節する能力を試験する方法 を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、神経接着分子の産生を調節する薬物及びその他の 作用物質の能力をスクリーニングする試験系であって、グリア細胞培養系を含み 、そしてこの細胞培養系にＣＮＳニューロンが添加されている試験系を提供する ことである。 本発明のさらなる目的は、神経接着分子の産生を調節する薬物及びその他の作 用物質の能力をスクリーニングするための試験系であって、薬物又は作用物質と 共に接種されたグリア細胞系を培養すること、ＣＮＳニューロンをこの細胞培養 系に添加すること、そしてニューロンの成長を測定し該薬物のそれに対する効果 を測定することを含む試験系を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、神経接着分子の産生を調節する薬物及びその他の 作用物質の能力をスクリーニングするための試験系であって、薬物又は作用物質 と共に接種された細胞培養系における神経系の視神経又はその他の部分を培養す ること、ＣＮＳニューロンをこの細胞培養系に添加すること、そしてニューロン の成長を測定し該薬物のそれに対する効果を測定することを含む試験系を提供す ることである。 本発明の別の目的は、神経接着分子の産生を調節する薬物及びその他の作用物 質の能力をスクリーニングするための試験系であって、ＣＮＳニューロンの培養 を薬物又は作用物質と共に接種すること、可溶性神経接着分子を添加すること、 そしてニューロンの成長を測定し該薬物のそれに対する効果を測定することを含 む試験系を提供することである。 その他の目的及び利点は、以下の例示的図面を参照して次の詳細な記述を検討 すれば、当技術分野における熟練者にとって明らかである。 図面の簡単な説明 図１はキメラトランスジーンＧＦＡＰ−Ｌ１の地図を示す。４．０５ｋｂのマ ウスＬ１ｃＤＮＡをＮｏｔＩリンカーを用いて修飾ＧＦＡＰ遺伝子のエキソン１ 中に挿入した。この構築物では、Ｌ１ｃＤＮＡはその前５’側にＳＶ４０レイト ジーンスプライス（Ｖ）があり、その後ろ３’側にはＳＶ４０のポリアデニル化 シグナル（ｐＡ）が置かれている。Ｌ１ＡＴＧの位置及びポリアデニル化シグナ ルが示されている。エキソンはボックスとして示されている。 図２は別種のトランスゲニックライン由来の脳ＲＮＡのノーザンブロット分析 を示す。成熟動物の全脳のトータルＲＮＡのうちの１０μｇを各レーンにロード しそしてマウスＬ１ｃＤＮＡでプローブした。曝露時間は３日であった。レーン １〜３は別のトランスゲニック子孫由来の脳である（レーン１：ライン３４２６ 、レーン２：ライン３４２７、レーン３：ライン３４１８、レーン４：非トラン スゲニック対照由来の脳）。トランスゲニックＬ１ｍＲＮＡ（矢印）のレベルは ３種のトランスゲニックラインで異なっており、ライン３４２６が最高レベル、 ライン３４２７が中レベルそしてライン３４１８が最低レベルであることに注意 せよ。２８Ｓ及び１８ＳｒＲＮＡは右側の端に示してある。 図３は、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションによる、ライン３４２６の 非トランスゲニック成熟マウス（Ａ、Ｂ及びＥ）とトランスゲニック成熟マウス （Ｃ及びＤ）由来の損傷を受けていない（Ａ、Ｃ及びＥ）及び損傷を受けた（損 傷を受けた後１５日、Ｂ及びＤ）視神経中のＬ１ｍＲＮＡの局在を示す。野生型 動物では、Ｌ１ｍＲＮＡは視神経のグリア細胞にではなく、網膜のニューロン細 胞中にのみ検出することができる（Ａ及びＢ）。トランスゲニック動物では、Ｌ １転写物を含む細胞が視神経中に見える（Ｃ及びＤ）。Ｌ１陽性の細胞の密度は 神経のミエリン化されていない部分に近い方で最も高い。神経におけるＬ１ｍＲ ＮＡ陽性細胞の密度は損傷の後に僅かに増加する（ＣとＤを比較せよ）。視神経 では、Ｌ１を発現する細胞の分布は（Ｃ及びＤ）ＧＦＡＰを発現する細胞のそれ に類似する（Ｅ）。Ｅにおけるスケールバーは１００μｍである（Ａ〜Ｅに対し ）。 図４は、成熟トランスゲニック（ライン３４２６、Ａ及びＢ）及び野生型（Ｃ ）動物由来の損傷を受けていない（Ａ及びＣ）及び損傷を受けた（損傷後２８日 、Ｂ）視神経中のＬ１（Ａ及びＢ）及びＧＦＡＰ（Ｃ）の二重免疫蛍光顕微鏡に よる位置確認を示す。トランスゲニック動物由来の視神経中のＬ１免疫反応性は 損傷後に有意に増加する（ＡとＢを比較せよ）。損傷を受けたトランスゲニック 神経中のＬ１免疫反応性のパターンは損傷を受けていない野生型神経中のＧＦＡ Ｐ免疫染色のパターンに類似している。Ｌ１陽性のミエリン化されていない網膜 細胞神経節軸索が損傷を受けていない野生型神経中に存在している（Ａ）。Ｃに おけるスケールバーは５０μｍである（Ａ〜Ｃに対して）。 図５は，ライン３４２６のトランスゲニック動物（Ａ、Ｂ及びＣ）及び野生型 動物（Ｄ、Ｅ及びＦ）由来の培養された星状グリア細胞中のＬ１（Ａ及びＤ）及 びＧＦＡＰ（Ｂ及びＥ）の二重免疫蛍光顕微鏡による位置確認を示す。トランス ゲニック動物由来の細胞のみがＬ１を発現し、一方、野生型動物由来の星状グリ ア細胞はＬ１陰性であることに注意せよ。Ｆにおけるスケールバーは３０μｍで ある（Ａ〜Ｆに対して）。 図６は、トランスゲニック及び野生型動物由来の損傷を受けた（損傷後１５日 ）及び損傷を受けていない視神経のウエスタンブロット分析を示す（Ａ）。損傷 を受けた神経（レーン１、３及び５）又は損傷を受けていない神経（レーン２、 ４及び６）の全タンパク質の２５μｇをロードし、親和性精製されたＬ１に対す るポリクローナル抗体を用いて検出した。タンパク質抽出物はトランスゲニック ライン３４２６のマウス（レーン１及び２）及び３４２７（レーン３及び４）及 び野生型動物（レーン５及び６）から調製された。非トランスゲニックな対照と 比較するとトランスゲニック動物中ではＬ１の発現の増加がみられる。次の視神 経領域では、トランスゲニック動物ではＬ１の高レベル調節が起こり、一方野生 型動物ではＬ１の量は減少した。見掛けの分子量（ｋＤで）は左端に示してある 。 図７は、野生型動物（Ａ及びＢ）及びトランスゲニック動物（Ｃ及びＤ、ライ ン３４２６）由来の視神経のクリオスタット切片上で培養されたマウス小脳ニュ ーロン由来のニューライトの成長の例を示す。Ａ及びＣは損傷を受けていない視 神経を表し、Ｂ及びＤは損傷を受けた視神経を表す。Ｄにおけるスケールバーは ５０μｍである（Ａ〜Ｄに対して）。 図８は、野生型動物（ＷＴ）及びトランスゲニック動物（ライン３４２６、３ ４２７及び３４１８）由来の損傷を受けていない（ｃ）及び損傷を受けた（１） 視神経（損傷後２８日）のクリオスタット切片上で維持された小脳ニューロンの ニューライトの長さを図示し比較している。トランスゲニック動物由来の切片上 のニューライトの長さは野生型動物由来の切片上のものよりも長いことに注意せ よ。トランスゲニックラインでは、ニューライトは常に損傷を受けていない神経 上よりも損傷を受けた神経上でより長くなるが、一方野生型動物では、損傷を受 けていない神経上及び損傷を受けた神経上でのニューライトの長さには有意の差 がみられない。ニューライトの長さは異なるトランスゲニックラインにおけるＬ １発現のレベルと確かに相関がある（ウエスタンブロットのデータも見よ）。一 つの代表的実験（１２回から）の平均値±平均値の標準誤差を示す。 図９は、親和性精製されたＬ１に対するポリクローナル抗体（抗Ｌ１）及びマ ウス肝臓膜に対する親和性精製されたポリクローナル抗体（抗肝臓）と共に前培 養した後及び前培養せずに、野生型動物（ＷＴ）及びトランスゲニック動物由来 の損傷を受けていない（ｃ）及び損傷を受けた（１）視神経（損傷後２８日）の クリオスタット切片上で維持された小脳ニューロンのニューライト長を測定した グラフである。抗体との前培養なしの神経のニューライト長を１００％とし、抗 体処理後に得られた同じ神経の切片上のニューライト長をこの値を基準にして表 した。Ｌ１抗体によりニューライト長の有意の減少（６０％）がトランスゲニッ ク動物由来のクリオスタット切片上で見いだされた。トップの数字は各数値に対 して測定された神経の総数を表す。平均値±平均値の標準誤差は二連で行われた 少なくとも４回の独立した実験から求めたものである。 図１０は、抗体の不存在下に及び親和性精製されたＬ２に対するポリクローナ ル抗体（抗Ｌ１）及びマウス肝臓膜に対するポリクローナル抗体（抗肝臓）と共 に切片を前培養した後、野生型動物（ＷＴ）及びトランスゲニック動物（ライン ３４２６）から調製された星状グリア細胞の単層上でマウス小脳（Ａ）又はひよ こＤＲＧ（Ｂ）のニューロンのニューライト長を図示し比較している。抗体との 前培養なしの星状グリア細胞上でのニューライト長を１００％とし、そして抗体 処理後に得られた星状グリア細胞単層上でのニューライト長をこの値を基準にし て表している。ニューライト長の有意の減少（約４０％）がＬ１抗体と単層との 前培養の後のトランスゲニック星状グリア細胞上でだけ見られる。平均値±標準 偏差は四連で行われた２回の独立の実験に由来する少なくとも１００個のニュー ロンから得られたものである。*は対照（抗体処理をしていない野生型又はトラ ンスゲニック星状グリア細胞）から有意に異なっていた（ｐ＜０．０５、マン− ホイットニーＵテスト）平均値を示す。 図１１は、視神経（０〜２０００μｍ）における軸索のイン・ビボ再成長を示 す。６〜８週令のＧＦＡＰ−Ｌ１トランスゲニックマウス及び野生型マウスを眼 窩内で破砕し、そして１４日後に前方に動く標識（anterograde labeling）によ り網膜のガングリオン細胞の軸索をマークするためフルオレッセイン標識ビオチ ンエステルで追跡した。各点は１頭の動物を表す。 図１２は、視神経（０〜８００μｍ）における軸索のイン・ビボ再成長を示す 。６〜８週令のＧＦＡＰ−Ｌ１トランスゲニックマウス及び野生型マウスを眼窩 内で破砕し、そして１４日後に前方に動く標識（anterograde labeling）により 網膜の神経節細胞の軸索をマークするためフルオレッセイン標識ビオチンエステ ルで追跡した。各点は１頭の動物を表す。 図１３は、１回試行積極回避課題における回避％（記憶の保持）に対するにわ とりＬ１抗体のＩＭＨＶ中への注入の効果を示す。各点は示されたトレーニング 時間においてＬ１抗体（抗−Ｌ１）（黒丸）又は食塩水（白四角）の注射を受け た一群の鳥を表す。動物はすべてトレーニング後２４時間目に試験された（*， 食塩水群と抗体群との間でｐ＜０．０５、χ2）。 図１４は、−３０分及び＋５．５時間の時点でのＩｇＩ〜IV及びＦＮ断片の注 射が積極回避課題に対する記憶の保持に対して有する効果を示す二つのグラフを 含む。動物はすべてトレーニング後２４時間目にテストされた。各群の動物の数 はヒストグラム中に示してある（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．００５）。 図１５は、ラット海馬のスライスのＣＡ１領域中の錐体のニューロンにおける ＬＴＰに対するＬ１の抗体（抗−Ｌ１）の影響を示す一連のグラフを含む。ａは 抗体を注射されなかった対照部位におけるＴＢＳ（矢印）の前及び５０分後に記 録された平均されたＥＰＳＰ（ｎ＝４）である。ｂはマウスＬ１に対するウサギ のポリクローナル抗体（ラチエン(Rathjen)ら(1984)）の存在下にＴＢＳ（矢印 ）の前及び５０分後に記録された平均された（ｎ＝４）ＥＰＳＰである。ｃはＬ １抗体（ＩｇＧ画分、６．２ｍｇ／ｍｌ○）又はＣＨＯ細胞(ハインズ（Hynes） (1992)Cell 69: 11-25)中で組換え的に発現された免疫グロブリン様ドメインに 対するポリクローナル抗体（特異的抗体の約１ｍｇ／ｍｌを含む抗血清、▼）の 存在下にＴＢＳの前又は後のＥＰＳＰ初期スロープの時間経過である。そして対 照は次のものである、すなわち（１）対照ＬＴＰ（抗体なし、□）、（２）ラッ トの海馬スライスと強く反応する（リンドナー(Lindner)ら(1983)，Nature 305: 427-430)、マウス肝臓膜（３．５ｍｇ／ｍｌ、●）に対するポリクローナル抗 体のＩｇＧ画分の存在下に、（３）ウサギ非免疫血清の存在下に、（４）ＴＢＳ によるＬＴＰの誘導なしにＬ１抗体の存在下に（６．２ｍｇ／ｍｌ；○、ｅ，ｆ も見よ）測定されたものである。その結果は少なくとも３頭の動物から得られた スライス（ｎ＝５）につきＴＢＳ前２０分間に記録されたベースライン値の％に おけるＥＰＳＰ初期スロープの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表される。Ｌ１抗体 の存在下のＬＴＰの値はＬ１に対する抗体に対してはｐ＜０．００１において対 照のＬＴＰと相違しており、そして免疫グロブリン様ドメインＩ〜VIに対する抗 体に対してはｐ＜０．０１において対照のＬＴＰと相違している。ｄはＬ１に対 するポリクローナル抗体のＩｇＧ画分によるＬＴＰの減少の濃度依存性である（ ６．２ｍｇ／ｍｌ；○、２ｍｇ／ｍｌ；●、０．６ｍｇ／ｍｌ；▲、０．０６ｍ ｇ／ｍｌ；□、ｐ＜０．０００１）。対照として、肝臓膜に対するポリクローナ ル抗体で得られた結果が示されている（３．５ｍｇ／ｍｌ；■）。ｅはＴＢＳの 非存在下にＬ１に対するポリクローナル抗体を適用（矢印）する前と適用した６ ０分後に記録されたＥＰＳＰの平均値（ｎ＝４）である。ｆはＴＢＳの非存在下 でＬ１に対するポリクローナル抗体を適用（矢印）する前と適用した３０分後に 記録された細胞内興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＰ）の平均値（ｎ＝４）である 。 図１６は、免疫グロブリン様ドメインＩ〜VI、ポリクローナルＮＣＡＭ抗体及 びオリゴマンノシディック・グリコペプチドのＬＴＰに対する影響を示す。ａは 対照のＬＴＰ（２０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．６、□）と比較した場合の、Ｌ１ の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインＩ〜VI（２０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．６ 中、２１６μｇ／ｍｌ、３．２ｍＭ、○、ｐ＜０．０１）及びＬ１のフィブロネ クチン（ＦＮ）タイプIII 相同反復Ｉ〜Ｖ（２０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．６中 、２２５μｇ／ｍｌ、３．８ｍＭ、■）の存在下におけるＴＢＳの前及び後のＥ ＰＳＰ初期スロープの時間経過である。ｂはＮＣＡＭに対する抗体（ＩｇＧ画分 、３．９ｍｇ／ｍｌ、▲）、アクソニン（axonin）−１に対する抗血清（●）の 存在下で記録されたＴＢＳの前後におけるＥＰＳＰ初期スロープの時間経過であ る。そしてコントロールは次の通りである、（１）非免疫ウサギ血清（▲）、（ ２）非免疫ウサギ血清のＩｇＧ画分（３．０ｍｇ／ｍｌ、◆）、及び（３）ＴＢ ＳによるＬＴＰの誘導なしにＮＣＡＭ抗体（３．９ｍｇ／ｍｌ、□、ｐ＜０．０ ６）の存在下におけるＥＰＳＰ初期スロープの時間経過である。Ｃはオリゴマン ノシディックグリコペプチドの存在下（○）、アシアロフェトゥイン(asialofet uin)由来の対照のグリコペプチド（●）の存在下（両者共１００μＭで）、及び グリコペプチドの非存在下（□）で記録されたＴＢＳの前後におけるＥＰＳＰ初 期スロープの時間経過である。結果はＴＢＳ前２０分間に記録されたベースライ ン値の％におけるＥＰＳＰ初期スロープの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されて いる（少なくとも３頭の動物由来のスライス、ｎ＝５又は６）。 図１７はＬ１抗体及びオリゴマンノシディック炭水化物が以前に確立されたＬ ＴＰ及びＭＮＤＡ受容体により媒介されるシナプス伝達に対して有する影響をグ ラフ的に図示する。ａは実験を通して（６．２ｍｇ／ｍｌ、○）又はＴＢＳの１ ０分後に開始して（６．２ｍｇ／ｍｌ、●）添加されるＬ１抗体の存在下で記録 されたＴＢＳの前後におけるＥＰＳＰ初期スロープの時間経過である。ｂは実験 を通して（１００μＭ、○）又はＴＢＳの２０分後に開始して（１００μＭ、● ）添加されるオリゴマンノシディック炭水化物の存在下で記録されたＴＢＳの前 後におけるＥＰＳＰ初期スロープの時間経過である。ｃはＬ１抗体の添加（矢印 ）前又は３０分後にＣＮＱＸ（３０μＭ）の存在下で記録されたＮＭＤＡ受容体 −依存性のＥＰＳＰの平均値（ｎ＝４）である。ｄはオリゴマンノシディック炭 水化物の添加（矢印）の前又は６０分後にＣＮＱＸの存在下（１０μＭ）で記録 されたＮＭＤＡ受容体−依存性のＥＰＳＰの平均値（ｎ＝４）である。ａ及びｂ の結果はＴＢＳの前２０分間に記録したベースライン値の％におけるＥＰＳＰ初 期スロープの平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されている（少なくとも３頭の動物 由来のスライス、ｎ＝５）。 図１８はクローンｐＸ＃２の４．４３ｋｂのｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配 列及びそれから帰納されるマウスＣＨＬ１のアミノ酸配列を図示する。最長のオ ープンリーディングフレーム（ｂｐ２９６〜ｂｐ３９２２）はＴＧＡ終止コドン で終わる１２０９個のアミノ酸を含む。シグナルペプチド（アミノ酸１〜２４） 及び膜貫通領域（１０８２〜１１０４）を表す二つの疎水領域は下線を引いてあ る。２個の矢印はλｇｔ１１ライブラリーから単離されたクローン３１１の５’ 及び３’末端を示す。アスパラギンの結合した潜在的グリコシレーション部位は (ハバード(Hubbard)とイバット(Ivatt)，1981)はアミノ酸配列の下に黒ダイヤモ ンドでマークしてある。免疫グロブリン（Ｉｇ）−様ドメインは保存されたトリ プトファンの下にＩからVIまでローマ数字で番号が打ってある。特徴的なシステ インは円で示されている。ＦＮ−様反復はＦ１からＦ５まで番号が打たれており 、そして特徴的なトリプトファン（Ｆ１にはなく、Ｆ２にはＷ７３２、Ｆ３には Ｗ８３０、Ｆ４にはＷ９３６、Ｆ５にはＷ１０５３）及びチロシン／フェニルア ラニン（Ｆ１にはＹ６８２、Ｆ２にはＹ７８１、Ｆ３にはＦ８８８、Ｆ４にはＹ ９８９、そしてＦ５にはない）はボックスで囲ってある。括弧はＲＧＤ及びＤＧ ＥＡ配列（それぞれ、アミノ酸残基１８５〜１８７及び５５５〜５５８）を強調 している。翻訳されていない配列はイタリックで番号が打ってある。この配列デ ータは寄託番号Ｘ９４３１０によりＥＭＢＬ／ジーンバンク／ＤＤＢＪから入手 することができる。 図１９はマウスＣＨＬ１のドメイン構造、細菌により発現されるタンパク質断 片のコード領域、及び疎水性プロットを示す。 （ａ）この図はＣＨＬ１の一次構造から推論される構造的特徴をスケッチしてい る。数値は翻訳開始部位で始まるアミノ酸配列を指している。Ｉｇ−様ドメイン Ｉ〜VIは半円で表してある（アミノ酸番号はジスルフィド橋を形成するシステイ ンを指している）。ＦＮ−様反復１〜５はボックスでシンボル化している（アミ ノ酸番号はドメインの境界を指している）。Ｎ−グリコシレーションの部位と思 われる部位は黒円で示してある。シグナルペプチドと膜貫通領域は斜線を引いた ボックスで示される。（ｂ）線は大腸菌中で生産される組換えタンパク質をコー ドするｃＤＮＡの位置を示す。（ｃ）帰納されたアミノ酸配列の疎水性プロット （カイト(Kyte)及びドゥーリトル(Doolittle)，1982)は、推定上の疎水性シグナ ル配列及び膜貫通ドメイン（*）を持った完全な膜タンパク質の特徴的性質を示 す。＋の数字は疎水性を示す。横軸の番号はアミノ酸の位置を指す。 図２０はＬ１ファミリーの分子の細胞内ドメインの配列を示す。推定的膜貫通 領域の後の最初のアミノ酸残基で始まる細胞内ドメインの配列は、マウスＣＨＬ １、マウスＬ１、にわとりＮｒ−ＣＡＭ、にわとりＮｇ−ＣＡＭ、にわとりニュ ーロファシン(neurofascin)、ショウジョウバエニューログリアン(neuroglia)、 及びゼブラフィッシュ(zebrafish)Ｌ１．２と配列されている。数字はＣＨＬ１ のアミノ酸位置を指し、そしてグレイボックスはＣＨＬ１配列で導入されたギャ ップを示す。大部分の配列に現れる同一のアミノ酸は黒のボックスでマークして ある。３個の括弧（Ｉ、II 及び III）は高度に保存されている配列を示す。 図２１はマウス及びラットの異なる組織におけるＣＨＬ１及びＬ１のｍＲＮＡ のノーザンブロット分析である。 （ａ）９日令マウスの小脳（レーン２、８）を除く脳（レーン１、５）、脊髄（ レーン３、７）及び後根ガングリア（レーン４、８）のポリ（Ａ）ＲＮＡ（２μ ｇ）並びに小脳の全ＲＮＡ（１０μｇ）をＣＨＬ１（レーン１〜４）又はＬ１（ レーン５〜８）リボプローブとハイブリダイズさせた。腎臓（レーン９）、脾臓 （レーン１０）、肝臓（レーン１１）、及び胸腺（レーン１２）由来のポリ（Ａ ）*ＲＮＡ（１μｇ）及び９日令マウスの小腸（レーン１３）及び肺（レーン１ ４）由来のポリ（Ａ）*ＲＮＡ（０．５μｇ）をＣＨＬ１リボプローブとハイブ リダイズさせた。（ｂ）ＮＧＦ誘導（レーン１）及び非誘導（レーン２）のＰＣ １２細胞、コス−１細胞（レーン３）の全ＲＮＡ（２０μｇ）、及び９日令（レ ーン４）及び６日令（レーン５）ラットの小脳の全ＲＮＡ（３０μｇ）をＣＨＬ １リボプローブとハイブリダイズさせた。ＲＮＡマーカーは左端に示してある。 図２２はＣＨＬ１に対するポリクローナル抗体の特異性及び異種組織における ＣＨＬ１の発現を示す。 （ａ）脳由来の免疫精製されたＬ１（レーン１（２μｇ））、Ｎ−ＣＡＭ（レー ン２（２μｇ））、ＭＡＧ（レーン３（２μｇ））、ＣＨＬ１抗体を用いて組換 えアニオン交換クロマトグラフィーで精製されたＣＨＬ１タンパク質断片（レー ン４（０．１μｇ））のウエスタンブロット分析。（ｂ）９日令マウスの脳（レ ーン１)、肝臓（レーン２）、肺（レーン３）、腎臓（レーン４）、及び小腸（ レーン５）由来の粗製膜の界面活性剤溶解物の可溶性画分（Ｓ）と不溶性画分（ Ｍ）のウエスタンブロット分析。左の数字（ｂ）は脳（レーン１）及び肝臓（レ ーン２）のＣＨＬ１免疫反応性バンドの分子質量を指している。 分子質量の基準は左側（ａ）及び右側（ｂ）の端にｋＤで示してある。 図２３は一時的にトランスフェクトされたコス−１細胞上でのＣＨＬ１の検出 を示す。ＣＨＬ１をトランスフェクトさせた（ａ）及びモック−トランスフェク トさせた（ｃ）コス−１細胞の単層培養をＣＨＬ１に対するポリクローナル抗体 で免疫染色させた（ｂ、ｄ）、そして対応する位相差顕微鏡写真はそれぞれ（ａ 、ｃ）である。ｄ中の線はａ〜ｄに対して３０μｍである。 図２４はイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション分析による、マウスの網膜 、視神経及び小脳皮質の切片におけるＣＨＬ１及びＬ１のｍＲＮＡの位置を図示 する。７日令マウスの網膜では、Ｌ１ｍＲＮＡはガングリオン細胞層に局在する ガングリオン細胞（ａの１）でそして内部核層に局在する無軸索細胞(amacrine) 及び水平細胞（１の２）で検出される。視神経中の網膜又はグリア細胞における 他の細胞型は検出可能なレベルのＬ１転写物を含んでいない（ａ）。ＣＨＬ１ｍ ＲＮＡはガングリオン細胞及び内部核層の内部境界(すなわちビトリード(vitrea d))に局在する数個の細胞で毎週検出することができる（ｂ）。視神経の近位（ すなわち網膜付近）領域に局在するグリア細胞はＣＨＬ１アンチセンスｃＲＮＡ プローブにより強く標識されるが、より遠位領域に局在するグリア細胞は弱く標 識されるだけである（ｂ）。２週令マウスの小脳皮質では、Ｌ１転写物が分子層 （ｍｏｌ）中の星状細胞及びかご状細胞中でそして内部顆粒層（Ｉｇ１：ｄ）の ゴルジ細胞及び顆粒細胞中で検出することができる。ＣＨＬ１転写物は同様のパ ターンで分布している。唯一の例外は分子層の薄い部分では殆ど標識が見えない ことである（ｂ）。ＣＨＬ１センスｃＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた切 片では標識されない（７日令の網膜及び視神経に対しては、ｃを見よ）。 ｃにおける線はａ〜ｃに対しては１００μｍであり、ｅにおける線はｄ及びｅに 対して１５０μｍである。 図２５は星状グリア細胞の培養におけるＣＨＬ１の免疫蛍光顕微鏡による位置 確認を示す。 培養されたマウス星状グリア細胞の二重免疫標識はＣＨＬ１に対するポリクロー ナル抗体（ａ、ｄ）及びＧＦＡＰに対するモノクローナル抗体（ｂ、ｅ）を用い て行われた。（ｃ及びｆ）はそれぞれ（ａ、ｂ及びｄ、ｅ）に対する対応する位 相差顕微鏡写真である。ｃ及びｆにおける線はａ〜ｃ及びｄ〜ｆに対してそれぞ れ２０μｍである。 図２６は脱グリコシレートされたＣＨＬ１のウエスタンブロット分析である。 ７日令マウスの脳由来の粗製膜の界面活性剤溶解物の可溶性（Ｓ）又は不溶性（ Ｍ）画分をＮ−グリコシダーゼＦ（Ｎ）、Ｏ−グリコシダーゼ（Ｏ）、両酵素（ Ｎ＋Ｏ）、又は酵素無し（−）とインキュベートし、そしてウエスタンブロット 中でＣＨＬ１に対する抗体と反応させた。分子質量の基準は右側の端にｋＤで示 してある。グリコシレートされたＣＨＬ１及び脱グリコシレートされたＣＨＬ１ のタンパク質成分の分子質量は下部のボックス中にｋＤで示してある。 図２７は脳組織由来のＣＨＬ１免疫沈降物中にＭＮＫ−１炭水化物が存在する ことを示す。ＣＨＬ１は９日令マウスの脳の全脳組織の界面活性剤溶解物からＣ ＨＬ１抗体を用いて免疫沈澱させられた。脳溶解物（レーン１）及び免疫沈澱物 （レーン２、３）はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、ブロットされそしてＨＮＫ− １エピトープ（レーン１、２）に対するモノクローナル抗体３１２又はＣＨＬ１ 抗体（レーン３）と共にインキュベートされた。分子質量の基準は右側の端にｋ Ｄで示してある。 図２８：Ｌ９２９−トランスフェクタントと培養した場合の海馬ニューロンの ニューライトの成長 胚１８日令のラット由来の海馬ニューロンをＬ９２９−トランスフェクタント 又は親のＬ９２９細胞のサブコンフルエントな単層中で培養した。１１〜１２時 間の培養の後、細胞を固定しモノクローナル抗体４１２（ＨＮＫ−１炭水化物エ ピトープを認識する）又はＮＣＡＭに対するポリクローナル抗体で標識した。総 ニューライト長の測定のため、これらの細胞中ではニューロンは高度に分岐する という性質があるため、各分枝当たり最長のニューライトのみを測定した。 （Ａ）ニューライトの成長はＣＨＬ１により促進されそして抗体により阻害可能 である。ニューロンを、ＣＨＬ１−トランスフェクタント（ＣＨＬ１）又は親の Ｌ９２９細胞（Ｌ９２９）と共に、組換えＣＨＬ１に対するポリクローナル抗体 （精製ＩｇＧの５００μｇ／ｍｌをプレーティングの後４５分で添加）を添加し （＋ＡＢ）又は添加せず、そしてＬ１−トランスフェクタント上で培養した。４ 〜５回の独立した実験の総ニューライト長の平均が示してある。誤差の線は平均 値の標準誤差である。 （Ｂ）異なるＣＨＬ１ラインはＬ１よりもより良くニューライトの成長を促進す る。ニューロンを僅かに発現レベルの異なる、２種の異なるＣＨＬ１−トランス フェクタント（ＣＨＬ１ライン１、ＣＨＬ１ライン２）並びに親のＬ９２９細胞 （Ｌ９２９）及びＬ１トランスフェクタント（Ｌ１）上で培養した。総ニューラ イト長は対照（ｃｔｒ）であるＬ９２９細胞のパーセントとして表した。誤差の 線は平均の標準誤差である。 （Ｃ）ニューライトの成長促進はニューライトのすべての長さのクラスにも影響 を与える。抗体を添加し（＋ＡＢ）、又は（Ａ）で与えたような抗体処理をする ことなく、ＣＨＬ１−トランスフェクタント（ＣＨＬ１ライン１及び２）及び親 のＬ９２９細胞（Ｌ９２９）と共に培養された海馬ニューロンのニューライト長 の総量の累積頻度分布プロット。ある長さｘ（縦軸）に等しいかより長いニュー ライトを持つニューロンのパーセントを、ニューライト長ｘ（横軸）の関数とし てプロットした。これらの値は一つの代表的な実験から得られたものである。 図２９：Ｌ９２９−トランスフェクタントと培養した場合の小さな小脳ニュー ロンのニューライトの成長 ６〜７日令マウス由来の小脳ニューロンを、ＣＨＬ１−トランスフェクタント （ＣＨＬ１）、ＣＨＬ１でトランスフェクトされた非発現性のＬ９２９細胞（モ ック）、親のＬ９２９、又はＬ１−トランスフェクタント（Ｌ１）上で２０時間 培養した。細胞の染色は既に図７で記述したように行った。 （Ａ）ＣＨＬ１は小さな小脳ニューロンのニューライト成長を促進する。３回の 実験の総ニューライト長の平均が示してある。誤差の線は平均の標準誤差である 。 （Ｂ）ＣＨＬ１は小さな小脳ニューロンのニューライト成長をもＬ１よりもより 良く促進する。総ニューライト長は対照（ｃｔｒ）であるＬ９２９細胞のパーセ ントとして表される。誤差は平均の標準誤差である。 （Ｃ）ＣＨＬ１による小脳ニューロンのニューライト成長の増加はすべてのサイ ズのニューライトに影響を与える。ある長さｘ（縦軸）より長いか等しいニュー ライトを持つニューロンのパーセントとしての総ニューライト長の累積頻度分布 プロットをニューライト長ｘ（横軸）の関数としてプロットした。ひとつの代表 的実験から得られた値が示されている。 図３０：可溶性ＣＨＬ１で処理された海馬ニューロンのニューライトの成長 海馬ニューロンをポリ−Ｌ−リジンで被覆されたカバーグラス上で、ＣＨＬ１ −トランスフェクタント（ＣＨＬ１）、親Ｌ−９２９細胞（Ｌ９２９）、又はＬ １−トランスフェクタント（Ｌ１）の粗製膜調製物の上清（総タンパク４０μｇ ／ｍｌ）を添加して１２時間培養した。ニューライト長の染色及び測定は既に述 べたと同様に（図７）行った。 （Ａ）Ｌ９２９トランスフェクタント由来の可溶性ＣＨＬ１は細胞当たり全ニュ ーライトの最長及び総和の成長を促進する。最長ニューライトの絶対長及び総ニ ューライト長が示してある。これらの値は３回の独立の実験の平均である。誤差 は平均の標準誤差である。 （Ｂ）可溶性のＣＨＬ１はニューライト数の増加を僅かに促進する。親Ｌ９２９ 細胞（ｃｔｒ）由来の上清で処理された海馬ニューロンのニューライト長のパー セントとしての総ニューライト長がプロットされている。数値は３回の独立した 実験の平均である。誤差は平均の標準誤差である。 （Ｃ）可溶性ＣＨＬ１はすべての長さのニューライトの成長促進に影響を与える 。一つの代表的実験から得られた総ニューライト長の累積頻度分布プロットが示 されている。 図３１：Ｌ９２９トランスフェクタント中におけるＣＨＬ１−及びＬ１−タン パク質の定量的凝集分析及び安定性 （Ａ）Ｓ２細胞トランスフェクタントの凝集の定量的分析。凝集を検出するため 、ＣＨＬ１−（ＣＨＬ１）（ｃｔｒ）及びＬ１−（Ｌ１）トランスフェクト細胞 を（約３×１０6細胞／ｍｌの密度で）、ＣｕＳＯ4によるトランスジーン発現の 誘導の有り（＋ind）又はなし（−ind）で、培養培地中で１８時間培養した。粒 子数はインキュベーションの最初及び終わりに血球計で計測した。凝集のパーセ ントはインデックス（１−Ｎ／ＮＯ）×１００により計算された。Ｎ１８及びＮ Ｏはそれぞれインキュベーションの終わり又は最初における粒子数を表す。数値 は少なくとも４回の独立した実験の平均である。誤差の線は標準偏差である。 （Ｂ）Ｌ９２９−トランスフェクタントの凝集の動力学。ＣＨＬ１−トランスフ ェクト細胞（ＣＨＬ１）、ＣＨＬ１−トランスフェクトされたが非発現性細胞（ モック）、親Ｌ９２９細胞（Ｌ９２９）、及びＬ１−トランスフェクト細胞（Ｌ １）を低濃度のトリプシン−ＥＤＴＡで処理して組織培養から剥離し、洗浄し、 ポリスチレンチューブ中３７℃でインキュベートした。各試料の一定量を３０分 ごとに取り、粒子数を血球計で計測した。その結果は（Ａ）に記述している。示 した数値は少なくとも３回の独立した実験の平均値である。線は標準偏差である 。 発明の好ましい実施態様の詳細な説明 より具体的には、本発明は中枢神経系（ＣＮＳ）におけるニューライトの成長 を促進するために、本明細書において「ＣＮＳ神経成長調節因子」（ＣＮＧＭｓ ）と同定された或る作用物質の使用に関し、特に本明細書で定義されたような一 群の神経細胞接着分子に関する。一般に、成人の中枢神経系におけるニューロン はグリア細胞上に存在する阻害的な手掛かり分子のために、再生長できないと考 えられてきた。本発明の作用物質及び方法はこの阻害を打ち負かしそしてＣＮＳ ニューライトの成長を促進するために使用することができる。 本発明の作用物質はＣＮＳニューライトの成長を調節し促進することができる すべての細胞接着分子、特に免疫グロブリン・スーパーファミリーに属する分子 を含みそしてかかる分子から選択することができる。より具体的には、これらの 分子は、Ｌ１、Ｎ−ＣＡＭ及びミエリン関連グリコプロテインなどを含む、Ｃａ2+ −非依存性のニューロン細胞接着を媒介する免疫グロブリン・スーパーファミ リーのメンバーから選択される。本発明はまた、ニューライト促進活性を有する これらの分子の断片、アナログ、同族体、同種の物及び模倣物をも包含する。こ れらの断片やアナログの特に好ましい構造上のモチーフは、フィブロネクチン・ タイプIII 相同反復（特に反復１−２）に類似のドメイン及び免疫グロブリン− 様ドメイン（特にドメインＩ−II、III −IV、及びＶ−VI）を含んでいる。本発 明の作用物質はそして特にＬ１ＣＡＭファミリーのメンバーは作用物質及びそれ らのアンタゴニスト共に同種親和性結合を示すから、それらの抗体は作用物質に 対する受容体という点でアゴニストとして働くことができ、こうして作用物質そ れ自体と同じ方法でそして同じ目的で診断及び治療の両面での適用に使用するこ とができる。このようにして、Ｌ１は受容体として作用し、そしてその抗体は本 明細書で述べたようにニューライトの成長を促進し、特にＣＮＳにおける神経再 生を助けるためのアゴニストとして用いることができる。この能力はさらに、Ｌ １に対する抗体が本明細書で作用物質として働く神経認識分子のＬ１ＣＡＭファ ミリーのさらなるメンバーを同定するための方法において役立つというその能力 においてさらに立証される。従って、本発明はこのような抗体によって同定され 、単離されそして特性を明らかにされた分子にまで及ぶことになる。それ故に、 そのようなものとして、ＣＮＳ神経成長調節因子として以下に同定される一群の 物質は、Ｌ１のようなＣＡＭに対する抗体及び数ある中でも特に本明細書におい て後述されるＣＨＬ１のようなそのアナログを含むものと考えられる。 本発明はＣＮＳ神経成長調節因子（ＣＮＧＭｓ）又は分化した星状グリア細胞 上で神経細胞接着分子のイン・ビボでの異所性(ectopic)発現に一面では関係す る。これらの分子はこのような星状グリア細胞の単層上での、及び損傷を受けて いない及び損傷を受けた成熟マウス視神経のクリオスタット切片上での、そして トランスゲニック動物でのイン・ビボ視神経破砕実験での、ニューライト成長を 増強することが見いだされた。増加したニューライト成長促進能は異所性ＣＮＧ Ｍ発現レベルに比例する。このことは、トランスゲニックにコードされたＣＮＧ Ｍの基礎的発現を異にする本発明の異なるトランスゲニック・ラインの比較によ り、そして視神経の損傷後のそれに続くＣＮＧＭ発現の増加の相関により証明さ れた。 視神経は損傷させたもの及び損傷を受けていないものの両者とも本発明の使用 に適しているが、脳や脊髄の部分を含む神経系のどの部分も同様に使用すること ができることは評価されるべきである。 ニューライト成長は星状グリア細胞によるＣＮＧＭ発現のレベルに依存する。 そしてこれはトランスゲニック動物でのニューライト成長を促進する際にＣＮＧ Ｍが及ぼす特異的効果を示すものである。ニューライト成長がポリクローナルＣ ＮＧＭ抗体により阻害されるが、マウス肝臓膜に対する抗体では阻害されないと いうことは、両抗体ともトランスゲニック動物のニューロン及び星状グリア細胞 の細胞表面と良く反応するから、特に、この特異性をさらに支持することになる 。 好ましい態様においては、ＣＮＧＭはＬ１である。Ｌ１の生物学的効果はＬ１ 抗体により阻害することができる、このことはＬ１がトランスゲニック星状グリ ア細胞の細胞表面においてトランス配置(trans configuration)で同種親和性的 に活性であることを示すものである。さらに、にわとり後根神経節ニューロンと 反応しないＬ１スピーシーズ−特異的な抗体はトランスゲニック星状グリア細胞 上のニューロン細胞型のニューライト成長を阻害する。これらの事実はＬ１を紛 れもなくトランス作用型の活性分子として同定する、そして通常Ｌ１の発現を欠 如しているグリア細胞によるＬ１の異所発現がイン・ビトロでのニューライトの 成長を顕著に増強することを示している。 イン・ビボで通常Ｌ１を発現しないグリア細胞の上でのニューライト成長がト ランスジーンに媒介されて増強されることは、成熟哺乳動物の中枢神経系のグリ ア細胞がニューライトの成長に対してもっと誘導力を持つようにすることができ ることを示す。ニューライト成長を促進するグリアに誘導される分子が、成熟す るにつれて失われる(スミス(Smith)ら，（1986）J．Comp．Neurol．251: 23-43 、スミス(Smith)ら，（1990）Dev．Biol．138: 377-390)ことは、従って成熟哺 乳動物末梢神経系におけるグリア細胞により通常高度に発現される認識分子の発 現によって償われているようにみえる(ニーケ(Niecke)ら(1985)、ビクスビ(Bixb y)ら(1988)，J．Cell．Biol．107: 353-362、ザイルハイマー(Seilheimer)ら(19 88)，J．Cell．Biol．107: 341-351)。 本トランスゲニック・ライン由来の成熟星状グリア細胞の表現型は、損傷の苦 痛を受けた後Ｌ１を再発現するシュワン細胞に関連したより大きな能力を目指し て修飾されるかも知れない。シュワン細胞によるＬ１発現の増強はオートクライ ン(autocrine)メカニズムにより、損傷の後に高レベルに調節されるニューロト ロフィン(neurotrophins)により媒介されるようである(ザイルハイマー(Seilhei mer)ら(1987)，EMBO J．6: 1611-1616)。同様に、培養中で星状グリア細胞によ るＬ１発現がＴＧＦ−β及びＮＧＦにより高レベルに調節され得る（サード(Saa d)ら(1991)）。ＧＦＡＰ−Ｌ１トランスジーンでマウスをトランスフェクトする ことにより、成熟した星状グリア細胞が神経損傷に応答する能力を有しないこと が、ニューライト成長促進分子であるＬ１の高レベル調節により克服されること になる。Ｌ１の発現はニューライトの成長を阻害する幾つかの分子（シャックナ ー(Schachner)ら，発生神経生物学の将来展望、印刷中、シュワブ（Schwab） ら(1995)Ann．Rev．Neurosci．16: 565-595）を通常含んでいる中枢神経系のミ エリン化された管におけるニューライトの成長にとって特に有益である。 本発明は、星状グリア細胞及び稀突起グリア細胞の阻害作用が、本明細書で定 義された作用物質のニューライト成長促進性により、そして異所的に発現される Ｌ１の活性により特に例示されるように、少なくとも一部は克服され得ることを 証明する。星状グリア細胞によるＬ１の発現は稀突起グリア細胞が示す阻害効果 を償うようにも思われる。許容的及び非許容的手掛かり分子は、従って、ニュー ライトの成長が起こる同じ細胞型の上に局在する必要はないことになる。そうで はなく、このような手掛かり分子は別の細胞型の間に散らばっていてもよい。Ｌ １及びその他のニューライト成長促進分子の細胞レベルそして分子レベルの操作 は従って成熟哺乳動物の中枢神経系の損傷又は疾病に続く再生能力の増強を可能 にする。 前にも述べたように、本発明はＣＮＳにおける神経成長の促進を包摂する。こ のような成長には、不完全なあるいは未成熟な形成を示す構造や組織と同様に、 損傷や病気により失われた構造をも望ましいものに再生することが含まれている 。本発明の作用物質は、本明細書で後に例示するように、神経保護的なあるいは 神経保存的な効果をも示し、例えば、種々の病因による神経の変性や喪失を阻害 しあるいは妨げるために投与することができる。 本発明は、従って、遺伝子治療などを通じてこの作用物質の発現の促進による 場合であろうと、損傷を受けあるいは病気に罹ったＣＮＳ構造を治療するため薬 学的な組成物の形で適当かつ有益な場所にこの作用物質を外因的に投与する方法 によろうと、本発明の作用物質を含み又は送達する構築物や組成物をすべて包含 する。後者の関連では、Ｌ１やＮ−ＣＡＭなどの現在同定されているグループの メンバーは同種親和性により結合するようにみえ、従って発現の方法により送達 されるときより有利であるようにみえるかも知れないが、上記のように外因的に 投与されると、この作用物質のあるものは成長促進効果を発揮することができる と期待される。本発明は可能であるときは投与ルートとプロトコルの両者を包含 する。 本発明はＣＮＳにおける神経の成長、再生及び神経の生存の調節を目的とする ＣＮＧＭ分泌細胞の使用に関係することも評価すべきである。そのようなものと して、ある種の可溶性ＣＮＧＭs 及びそれらの断片、そしてそれらの同族体分子 もまた本発明の範囲内にある。 従って、本明細書で使用するときは、次の用語は以下に述べる定義を有するも のとすべきである。 用語「作用物質(agent)」、「ＣＮＳ神経成長調節因子(CNS neural growth mo dulator)」、「ＣＮＧＭ」、「神経認識分子」、「認識因子」、「認識因子タン パク（単数又は複数）」、「神経接着分子」及び具体的にリストしなかったすべ ての言い換えは本明細書で相互に交換可能なものとして使用することができ、そ して本明細書及び請求の範囲を通じて使用するとき、一本鎖又は多重鎖タンパク 質を含むタンパク性の物質を指し、そして既に述べたアミノ酸配列や本明細書及 び請求の範囲で述べた活性の特徴を有するすべてのタンパク質をも包含する。上 記の用語は、このようなタンパク質、同族体、同種物、模倣物及びアナログの活 性な断片をも包含し、さらには該作用物質に類似の挙動をする小分子を含む。 従って、実質的に同等な又は修正された活性を示すタンパク質も同様に考えら れる。これらの修正は、例えば部位置換突然変異により得られる修正のような意 図的なものであることもあり、又は複雑なあるいはその著名なサブユニットの生 産者である宿主の変異により得られる偶発的なものであることもある。また、用 語「ＣＮＳ神経成長調節因子」、「ＣＮＧＭ」、「神経認識因子」、「認識因子 」、「認識因子タンパク質（単数又は複数）」及び「神経接着分子」は本明細書 で具体的に列挙したタンパク質をその範囲で含むと共に実質的に相同なアナログ 及び対立遺伝子変異のすべてを含むものとする。 本明細書に記述されたアミノ酸残基は「Ｌ」異性体型であることが好ましい。 しかしながら、「Ｄ」異性体型の残基は、免疫グロブリン結合という望ましい機 能的性質が該ポリペプチドに保持される限り、どのＬ−アミノ酸残基に対しても 置換することができる。ＮＨ2はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のア ミノ基を指す。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカル ボキシ基を指す。ポリペプチドの標準的命名法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２ ４３：３５５２−５９（１９６９）に従い、アミノ酸残基の略語を次の対応表に 示す。 本明細書で表されるアミノ酸残基配列はすべて、その左と右の向きはアミノ酸 末端からカルボキシ末端への通常の向きであることに注意すべきである。さらに 、アミノ酸残基配列の始まりと終わりにあるダッシュはさらに１個以上のアミノ 酸残基からなるさらなる配列にペプチド結合していることを示すことに注意すべ きである。上の表は本明細書でどちらも現れる３文字表記と１文字表記を相関さ せるために示してある。 「レプリコン」はイン・ビボでの自律性のＤＮＡ複製単位として機能する、す なわちそれ自体の制御の下で複製することができる遺伝的要素（例えば、プラス ミド、クロモソム、ウイルス）である。 「ベクター」は別のＤＮＡ断片をそれに結合させ結合させた断片の複製を行わ せることができる、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプリコンである 。 「ＤＮＡ分子」はデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン又 はシトシン）のポリマー型を指し、一本鎖又は二本鎖ヘリックスの形をとる。こ の用語は分子の一次構造又は二次構造のみを指し、特定の三次構造にそれを限定 するものではない。このようにして、この用語は、特に直鎖状ＤＮＡ分子（例え ば、制限断片）の形で見いだされた２本鎖ＤＮＡ、ウイルス、プラスミド、及び クロモソムを含む。特定の２本鎖ＤＮＡの構造を論ずる場合には、配列は本明細 書ではＤＮＡの転写されない鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同的な配列を有する鎖 ）に沿って５’から３’方向にのみ配列を記載する通常の慣行に従って記載され る。 「複製起点」はＤＮＡ合成に参加するＤＮＡ配列を指す。 ＤＮＡ「コード配列」は適当な調節配列の制御の下に置かれるとイン・ビボで 転写されそしてポリペプチドに翻訳される２本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列 の境界は５’（アミノ）末端にある開始コドンと３’（カルボキシ）末端にある 翻訳停止コドンにより決定される。コード配列には原核生物の配列、真核生物の ｍＲＮＡから作られるｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）由来のゲノムＤ ＮＡ配列、そして合成されたＤＮＡ配列さえも含まれるが、これらに限定される ものではない。ポリアデニル化シグナルや転写終結配列は通常コード配列の３’ 側に位置される。 転写及び翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグ ナル、ターミネーター及びその他のものなどのＤＮＡ調節配列であり、宿主細胞 でコード配列の発現を指令するのである。 「プロモーター配列」は細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列の 下流に向けて（３’方向）の翻訳を開始させることができるＤＮＡ調節領域であ る。本発明を規定するために、プロモーター配列は転写開始部位によりその３’ 末端に結合しそして上流（５’方向）に延ばし、上記のバックグラウンドで検出 可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の塩基または要素の量を含ませ る。プロモーター配列の中には、転写開始部位（便宜的にヌクレアーゼＳ１でマ ッピングすることにより確定できる）とＲＮＡポリメラーゼとの結合に関与する タンパク結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされる。真核生物のプロモ ーターは常にではないが、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボック スを含んでいる。原核生物のプロモーターは−１０及び−３５のコンセンサス配 列に加えてシャイン−ダルガーノ配列を含む。 「発現制御配列」は別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳をコントロールし調節する ＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡ に転写し、ついでそれがコード配列によってコードされているタンパク質に翻訳 されるとき、細胞内では転写制御配列及び翻訳制御配列の「コントロールの下に 」ある。 「シグナル配列」はコード配列の前に含めることができる。この配列はポリペ プチドのＮ末端にあって、ポリペプチドを細胞表面に向け又はポリペプチドを培 地に分泌させるべく宿主に伝えるシグナルペプチドをコードする。そしてこのシ グナルペプチドはタンパクが細胞から放出される前に宿主細胞により切り落とさ れる。シグナル配列は原核生物及び真核生物に固有の多様なタンパク質と関連し て見いだすことができる。 用語「オリゴヌクレオチド」はプローブを指して本明細書で使用されるときは 、２個以上、好ましくは３個以上のリボヌクレオチドを含む分子として定義され る。その正確なサイズは多くの因子により左右され、そしてこれらの因子は今度 は該オリゴヌクレオチドの最終的機能や使用に依存することになる。 用語「プライマー」は本明細書で使用されるとき、精製された制限消化物中の ように自然に生じようと、あるいは合成的に作られようと、オリゴヌクレオチド を指す。プライマーは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導され る条件、すなわちヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼのような誘導物質の存在 下でかつ適当な温度及びｐＨの下に、置かれたとき、合成の開始点として働くこ とができる。プライマーは、一本鎖でも二本鎖でもよいが、誘導物質の存在下で 望みの伸長産物の合成を開始するのに十分な長さを持たねばならない。プライマ ーの正確な長さは温度、プライマーの起源及び使用方法などの多くの因子に左右 される。例えば、標的配列の複雑さに依存する診断への適用の場合はオリゴヌク レオチドプライマーは通常１５〜２５又はそれ以上を含むことになる。また、そ れ以下のヌクレオチドを含むこともある。 本明細書におけるプライマーは特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に“実質的に ”相補的となるように選択される。これは、プライマーがそれぞれの鎖とハイブ リッドを形成できる程に十分に相補的でなければならないことを意味する。従っ て、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、プライ マー配列の残りがその鎖に相補的であれば、非−相補的なヌクレオチド断片はプ ライマーの５’末端に付着することができる。また、プライマー配列が鎖とハイ ブリッドを形成する程に鎖の配列と十分な相補性を有しており、それによって伸 長産物の合成のための鋳型となるのであれば、非−相補的な塩基やより長い配列 がプライマー中に散らばって入ることができる。 本明細書で使用するとき、用語「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」 は、それぞれが特定のヌクレオチド配列で又はその付近で２本鎖ＤＮＡを切断す る細菌の酵素を指す。 細胞は外因性のまたは異種のＤＮＡが細胞内に導入されたとき、このようなＤ ＮＡにより細胞は「形質転換された」という。形質転換ＤＮＡは染色体ＤＮＡに 組み込まれ（共有結合により連結され）、細胞のゲノムの一部となることもあり ならないこともある。原核生物、酵母、及び哺乳動物の細胞では、例えば形質転 換ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上に維持されうる。真核細胞に関 しては、安定に形質転換された細胞は染色体複製により娘細胞に遺伝されるよう に染色体の中に形質転換ＤＮＡが組み込まれてしまった細胞である。この安定性 は形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞株又はクローンを確立する真 核細胞の能力により明らかとなる。「クローン」は単一細胞又は有糸***による 共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は多世代の間イン・ビトロ で安定な成長をすることができる一次細胞のクローンである。 ２個のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の一定の長さにわたってヌクレオチドの少な くとも約７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約 ９０又は９５％）が合致するときに「実質的に相同」である。実質的に相同な配 列は配列データバンクで入手可能な標準ソフトウェアを用いて配列を比較するこ とにより、又は例えば特定の系に対して規定された厳格な条件の下でのサザン・ ハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適当なハイブリダ イゼーション条件を定めるのは技術の熟練の範囲内にある。例えば、マニアティ ス(Maniatis)ら，上述、ＤＮＡクローニング、Ｉ及びII巻，上述、核酸ハイブリ ダイゼーション，上述。 ＤＮＡ構築物の「異種」領域とは、自然界ではより大きな分子との関連では発 見されない、より大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡ断片である。こうして 、この異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードするとき、この遺伝子は通常起源生 物のゲノムでは哺乳動物のゲノムＤＮＡの両側には存在しないＤＮＡによりその 両側が挟まれる。異種コード配列の別の例としては、コード配列それ自体が自然 界では発見されない構築物がある（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含 むようなｃＤＮＡ、あるいは天然の遺伝子とは異なるコドンを持つ合成された配 列）。対立遺伝子変異又は天然に起こる突然変異事象は本明細書で規定したよう なＤＮＡの異種領域を生じない。 「抗体」とは特異的エピトープと結合する免疫グロブリンであって抗体及びそ れらの断片を含む。この用語はポリクローン、モノクローン、及びキメラ抗体を 含む。最後のキメラ抗体については、さらに詳細が米国特許第４，８１６，３９ ７号及び第４，８１６，５６７号に記載されている。 「抗体結合部位」とは、抗原に特異的に結合する重鎖及び軽鎖の可変及び超可 変領域から構成される抗体分子の構造的部分である。 「抗体分子」という用語は本明細書で使用するとき、種々の文法的な変形をも 含めて、完全な免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部 分との両方を意味する。 典型的な抗体分子は完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリ ン分子、及びその部分が本明細書に記載された治療法に使用するのに好ましいＦ ａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦ（ｖ）として当業者に知られているこ れらの部分などのパラトープを含む免疫グロブリン分子の部分である。 抗体分子のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）2の部分は、よく知られた方法により、実 質的に完全な抗体分子にそれぞれパパイン及びペプシンのタンパク分解反応を作 用させて調製される。例えば、テオフィロポロウス(Theofilopolous)らの米国特 許第４，３４２，５６６号をみよ。Ｆａｂ’抗体分子部分も同様に良く知られて おり、Ｆ（ａｂ’）2部分からメルカプトエタノールで２個の重鎖を連結してい るジスルフィド結合を還元し、ついで得られるタンパクメルカプタンをヨードア セタミドのような試薬でアルキル化することにより製造される。完全な抗体を含 む抗体が本発明では好ましい。 「モノクローナル抗体」という用語は、その文法的変形を含めて、特定の抗原 と免疫反応をすることができる抗体結合部位を１種だけ持っている抗体を指す。 こうして、モノクローナル抗体は、通常、それが免疫反応する抗原に対して１個 の結合親和性を示す。従って、モノクローナル抗体には、それぞれが異なる抗原 に対して免疫特異性を持つ、例えば二重特異性の（キメラ）モノクローナル抗体 のような、複数の抗体結合部位を持つ抗体分子を含めることができる。 「薬学的に許容され得る」という用語は生理学的に耐えられそしてヒトに投与 するときに、通常アレルギー又は胃の不具合、目まいなどの同様に不都合な反応 を起こさないような分子的実体及び組成物を指す。 「治療上有効な量」という用語は本明細書では、標的細胞群のＳ相活性におけ る臨床上重要な変化、あるいは例えば、高血圧、高熱、白血球数の上昇など病気 の存在及び活動に伴う病理学的諸症状を防止し、そして好ましくは少なくとも約 ３０％まで、より好ましくは少なくとも約５０％まで、最も好ましくは少なくと も約９０％まで諸症状を低減させるのに十分な量を意味する。 ＤＮＡ配列は、発現制御配列がそのＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御し調節す るとき、この発現制御配列に「機能的に連結」しているという。「機能的に連結 」という用語には、発現させるべきＤＮＡ配列の前に適当な開始シグナル（例え ば、ＡＴＧ）があることや、発現制御配列のコントロールの下にＤＮＡ配列の発 現が可能となりこのＤＮＡ配列によりコードされている望ましい産物の生産が可 能となるように正しいリーディング・フレームが維持されることも含まれる。組 換えＤＮＡ分子中に挿入したいと願う遺伝子が適当な開始シグナルを含んでいな いときは、このような開始シグナルをこの遺伝子の前に挿入することができる。 「標準的ハイブリド形成条件」という用語は、ハイブリッド形成及び洗浄の両 方に対して５×ＳＳＣ及び６５℃に実質的に同等な塩及び温度の条件を指す。 一面では、本発明はＣＮＧＭ又は神経認識分子、殊にＬ１そして好ましくは星 状グリア細胞においてそれらを発現するトランスゲニック動物に関する。これら の動物は中枢神経系における神経成長に対する増強された能力を持っている。 本発明はまた、ＣＮＧＭの神経認識活性を妨害又は強めることにより、標的哺 乳動物細胞の神経成長を調節するのに有効な潜在的な薬物をスクリーニングする ための試験系を含んでいる。「神経認識活性」又は「神経接着活性」により、二 次メッセンジャーに対する細胞内効果を含むＣＮＧＭの他の分子への結合の結果 である生物学的効果が意味される。一つの例では、被験薬物を、ＣＮＳ神経成長 調節因子の化学試料又は被験薬物に対する結合活性について対照と比較すること によりその効果を測るために、ＣＮＳ神経成長調節因子を活性化するリガンドと 共に細胞試料に投与するか、又はＣＮＳ神経成長調節因子を発現するトランスゲ ニック動物に投与することができる。現在のＣＮＳ神経成長調節因子の少なくと も一つ、特にＬ１の特性を同定することは、Ｃａ2+、ｐＨ、環状ヌクレオチド、 を含む細胞内メッセンジャーの定常状態レベルにおける変化並びにプロテインキ ナーゼＣ、ｐｐ６０c-src、カゼインタイプIIキナーゼ及びＬ１をリン酸化する ことが知られている他のキナーゼなどのプロテインキナーゼの活性変化の中にそ の調節因子が関与することになる。 試験系はＣＮＧＭや細胞質又は核の中のタンパク質に結合し、それによって転 写活性を阻害又は強化することができる薬物や他の実体を同定できるように適合 させることがより重要であろう。このような試験は神経成長あるいはシナプス効 率の増強のような特定の細胞活性に特異的な薬物あるいは時間的に又は活性のレ ベルの点でそのような活性を増強する薬物の開発に有用となるであろう。例えば 、このような薬物は損傷に応じて神経成長を調節するために、あるいは他の病因 を治療するために、例えばパーキンソン病、ＡＬＳ、ハンチントン病及びアルツ ハイマー病などの神経変性に関する疾患を治療する場合に有用であるかも知れな い。 さらなる態様において、本発明はＣＮＳ神経成長調節因子の活性のアゴニスト 及びアンタゴニストを提供する。特にＬ１のようなＣＮＧＭを認識するニューロ ンの能力を阻害する作用物質又は分子は、神経成長が禁忌であり、先に述べたよ うに作用物質を含む薬学的組成物を標的部位に直接投与することができる場合に は、神経成長を阻止するために使用することができる。他の態様においては、ア ゴニストはＬ１ドメインの一部の配列特にフィブロネクチンタイプIII の相同反 復２と３の間を有するペプチド、又はその領域に対する抗体であり得る。これら の分子はいずれも、Ｌ１のような特定のＣＮＧＭが同種親和性的結合（すなわち 、Ｌ１はそれ自体に結合することができ、従ってＬ１に対する抗体とＬ１それ自 体の断片は共にＬ１に結合することができる。）を受ける能力を持つ場合には使 用できる可能性がある。 本発明の診断的利用の一つは本ＣＮＧＭをプロテインキナーゼ阻害剤のスクリ ーニング試験に使用することである。本明細書で記載されたＣＮＧＭの活性はリ ン酸化されるから、ＣＮＧＭはおそらく特異的ホスファターゼにより脱リン酸化 されると思われる。従って特異的キナーゼ又はホスファターゼの阻害は、これら の神経認識タンパクの活性を調節するであろう薬学的干渉の方途となる。 本発明はＣＮＧＭに対する抗体の開発に及ぶ。かかる抗体には自然に生ずるも のも組換え的に調製される抗体も含まれる。例えば、抗体はＣＮＧＭをコードす る遺伝子又は遺伝子群を得るため発現ライブラリーをスクリーニングするのに抗 体を使用することができる。このような抗体は既知の遺伝学的技法によって調製 されるポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含み、さらに二重特異的 （キメラ）抗体や神経成長を調節する能力との関係で付加的な診断的使用にそれ らを適合させる他の機能を持つ抗体なども含まれる。 特に、ＣＮＳ神経成長調節因子に対する抗体は、このタンパクに結合するとい う特殊な能力を利用して選択することができ、そしてこれらは本発明の範囲に含 められる。こうして、神経成長調節因子の活性又はそれに因果関係的に連結され ると考えられる特異的ポリペプチドの活性は、従って、後に論ずる試験技術によ り、適当に標識された量の神経成長調節因子又は抗体又はそれらのアナログの使 用により、直接的に追求できるものである。 こうして、ＣＮＧＭ、それらのアナログ及びアンタゴニスト又はこれらに対す る抗体は多様な診断技法との関連で使用することができる。これらの診断技法に は、例えば放射活性付加、ソジウムボロハイドライドによる還元、もしくは放射 活性ヨー素化により標識された、ＣＮＧＭに対する抗体を用いるラジオイムノア ッセーのような免疫試験が含まれる。 免疫試験では、アンタゴニストまたはそれに対する抗体などの対照量を調製し 酵素、特異的結合パートナー及び／又は放射活性元素で標識し、ついで細胞試料 中に導入する。標識物質またはその結合パートナー（単数又は複数）が試料内の 部位と反応する機会を与えられた後、得られるマスを付加された標識の性質によ り変わりうる既知の技法で検討する。例えば、ＣＮＧＭに対する抗体を選択し、 上述のようなタンパクを追跡する目的で典型的試験計画を採用することができる 。3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、1 25 Ｉ、131Ｉ、及び186Ｒｅなどの同位体のような放射活性標識を使用する場合に は、現在入手可能な既知の計測操作が利用できる。標識が酵素である場合は、検 出は現技術水準で知られており現在利用可能な比色法、分光光度法、蛍光分光光 度法、電流定量法、気体定量法のいずれかで行うことができる。 本発明は神経成長調節因子の存在の程度の定量的分析のため又はそれらの活性 を模倣し又は阻止する薬物又は他の作用物質を同定するための試験キットの形で 調製することができる試験系を包含する。この系又は試験キットは本明細書で論 じられた放射活性及び／又は酵素的技法の一つにより標識を神経成長調節因子、 それらのアゴニスト及び／又はアンタゴニストにカップリングして調製された標 識化成分並びに１以上の付加的な免疫化学的試薬であって少なくともその一つが フリー又は固定化されたリガンドであって標識化成分、その結合パートナー、測 定されるべき成分の一つ又はそれらの結合パートナー（単数又は複数）と結合す ることができるリガンドを含むことができる。 さらなる態様においては、本発明はＣＮＳ神経成長調節因子（単数又は複数） 、その（又はそれらの）サブユニット、又はそれらの活性断片の活性に基礎を置 く、又は同活性を持つと決定された作用物質又は他の薬物に基礎を置く治療方法 に関する。第１の治療方法はＣＮＧＭ、その活性断片、アナログ、同族体、同種 物又は模倣物の存在及び活性から生ずるＣＮＳ神経成長の促進と関連し、そして ＣＮＧＭの産生及び／又は活性を調節することができる作用物質を、宿主中でＣ ＮＳの発育、再成長、又はリハビリテーションを促進するのに有効な量で投与す ることを含む。逆に、薬物又は他のＣＮＧＭ又はタンパクに対する中和性の結合 パートナーを望ましくない神経成長を阻害し防止するために投与することもでき る。また、ＣＮＧＭ又はタンパクのリン酸化又は脱リン酸化に関与する特異的キ ナーゼ又はホスファターゼの作用の調節は、ＣＮＧＭ／タンパクの活性化に基礎 を置く治療を同時に強化するであろう調節因子又はタンパクの活性の調節方法を 提供する。 より具体的には、本明細書で一般的に言及した治療方法は、ＣＮＳ神経成長調 節因子又はそのサブユニット、または例えば本発明の他の側面に従って調製され 使用された薬物スクリーニング試験により開発された同様に効果的な他の薬物の 活性の効果的な阻害剤又は強化剤を含む薬学的組成物の投与による、種々の病気 又は他の細胞性機能不全、及び障害の治療方法を包含する。例えば、ＣＮＳ神経 成長調節因子又はタンパクに対する薬物又は他の結合パートナーは、結合及び二 次メッセンジャーの活性を阻害又は強化するために投与することができる。 上で言及したように、本発明はＬ１ＣＡＭｓ、及び特にＣＨＬ１として知られ るＬ１に対するアナログの全ファミリーの発見を包含する。ＣＨＬ１はＮ−末端 のシグナル配列、６個の免疫グロブリン（Ｉｇ）−様ドメイン及び４．５フィブ ロネクチン・タイプIII(FN)−様反復、膜貫通ドメイン、及び約１００個のアミ ノ酸の細胞内ドメインと考えるのが最も妥当なＣ−末端ドメインを含む。ＣＨＬ １は細胞外ドメインではにわとりＮｇ−ＣＡＭ（約４０％のアミノ酸が同一）に 最も類似し、それに続いてマウスＬ１、にわとりニューロファシン、にわとりＮ ｒ−ＣＡＭ、ショウジョウバエ・ニューログリアン、及びゼブラフィッシュＬ１ ．１（それぞれ３７〜２８％のアミノ酸同一）となり、そしてマウスＦ３、ラッ トＴＡＧ−１、及びラットＢＩＧ−１（約２７％アミノ酸同一）となる。Ｉｇス ーパーファミリーの他のメンバー（例えば、Ｎ−ＣＡＭ、ＤＣＣ、ＨＬＡＲ、ｒ ｓｅ）との類似性は１６〜１１％である。細胞内ドメインはマウス及びにわとり のＮｒ−ＣＡＭ、マウス及びラットのニューロファシン（約５０％アミノ酸同一 ）であり、続いてにわとりのニューロファシン及びＮｇ−ＣＡＭ、ショウジョウ バエ・ニューログリアン、及びゼブラフィッシュＬ１．１及びＬ１．２（約４０ ％アミノ酸同一）である。Ｌ１ファミリーの既に認められたメンバーの中では高 度な全体的相同性が認められそしてモデュール構造が保存されている（マウス／ ヒトＬ１／ラットＮＩＬＥ：にわとりＮｇ−ＣＡＭ、にわとり／マウスＮｒ−Ｃ ＡＭ、ショウジョウバエ・ニューログリアン、ゼブラフィッシュＬ１．１及びＬ １．２、にわとり／マウスニューロファシン／ラットＡＤＧＰ）ことの他に、距 離を定める保存されたアミノ酸残基の位置の間及び２個の隣接するＩｇ−様ドメ インとＦＮ−様反復の間のアミノ酸の数に関して、Ｌ１に特徴的な基準が見つか った。これらは６個のＩｇ−様ドメインと隣接する４個のＦＮ−様反復の共直線 性を示す。そして４個のＦＮ−様反復はＬ１とこれらのモデュール（Ｌ１ファミ リーカセットと名づけられた）を含む分子との間で顕著に保存されている。これ らのモデュールとしては、Ｆ３サブグループ（マウスＦ３／にわとりＦ１１／ヒ トＣＮＴＮ１、ラットＢＩＧ−１／マウスＰＡＮＧ、ラットＴＡＧ−１／マウス ＴＡＸ−１／にわとりアクソニン−１）のＧＰＩリンク型が含まれる。以前にＮ −ＣＡＭ様分子として紹介された結腸直腸ガン分子（ＤＣＣ）はＬ１ファミリー カセットに一致する。Ｌ１ファミリーのメンバーの間で共有されているＣＨＬ１ の他の構造的特徴は高度のＮ−グルコシド結合炭水化物（その分子量の約２０％ ）である、そしてこれはＨＮＫ−１炭水化物構造を含み、そして１８５ｋＤの主 要バンドと１００及び１２５ｋＤのより小さな断片を含むタンパク断片のパター ンを含む。外側のＬ１ファミリーメンバーに関しては、ＣＨＬ１の優勢な発現が 神経系及び後期発育段階において観察されている。 次の実施例は、本発明の好ましい態様をより十分に例示するために提供される 。しかし、これは本発明の広い範囲を限定するものと解してはならない。 実施例１ ＧＦＡＰ−Ｌ１トランスジーン及びトランスゲニックマウスの作成 グリア原線維酸性タンパク（ＧＦＡＰ、イング(Eng)ら(1971)，Brain Res．28 : 351-354）は、マウス中枢神経系の発生の後期の段階で星状グリア細胞により 優勢に発現される(ランドリー(Landry)ら(1990)，J．Neurosci．Res．25: 194-2 03)。従って、トランスゲニックマウスの成熟星状グリア細胞に神経細胞接着分 子Ｌ１の発現を命ずるためＧＦＡＰ遺伝子の調節配列を従来は使用していた。Ｇ ＦＡＰ−Ｌ１トランスジーン（図１）は、ＧＦＡＰ遺伝子のＡＴＧは変異しＬ１ コード配列は３’側に翻訳停止シグナルとポリアデニル化シグナルが続くので、 神経細胞接着分子Ｌ１だけをコードしている(トガス(Toggas)ら(1994)，Nature 367 : 188-193)。この構築物は従来、３４１８、３４２６及び３４２７と命名さ れた３種の異なるラインのトランスゲニックマウスを確立するために用いられた 。 マウスのＬ１ｃＤＮＡ(ムース(Moos)ら(1988)，Nature 334: 701-703)は既に 記載されているように(トガス(Toggas)ら(1994)，Nature 367: 188-193)修飾さ れたねずみのグリア原線維酸性タンパク（ＧＦＡＰ）遺伝子のエキソン１の中に 挿入された。このタンパクの全コード配列及び２５０個の３’非翻訳ヌクレオチ ドを含む４．０５ｋｂマウスＬ１ｃＤＮＡを修飾されたＧＦＡＰ−Ｌ１トランス ジーンと融合させた。 この１４．５ｋｂのＧＦＡＰ−Ｌ１トランスジーンをＳｆｉＩによる消化それ に続く電気泳動及びアガロースゲルからの電気溶出により修飾クローニングベク ターから切り出した。精製したＤＮＡをＴ5Ｅ0.1（５ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７ ．４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中最終濃度２μｇ／ｍｌまで希釈した。希釈され たＤＮＡの約２ｐｌをＣ５７Ｂ１／６Ｊ雄に交配したＣＢ６Ｆ１雌（過***させ た）由来の受精卵の雄前核中にマイクロインジェクションした。生き続ける卵を 記載された方法（ホーガン(Hogan)ら（1986）マウス胚の操作、Cold Springs Ha rbor Laoratory,New York）に従ってマイクロマニピュレーションにより偽妊娠 養母の卵管中に移した。 実施例２ サザンブロット分析 トランスジーンがマウスのゲノム中に取り込まれたか否かについて尾の生検か ら単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によりマウスを分析した。（サザ ン(Southern)(1975)，J．Mol．Biol．98: 503-517)。トランスゲニックラインを 確立するため、トランスゲニック初代マウスを交配し、子について同様にスクリ ーニングを行った。１０μｇの試料ＤＮＡをＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＩ及びＸｂ ａＩで消化し、次いで０．７％アガロースゲル上で電気泳動的に分離しそしてア ルカリ条件下でハイボンドＮ＋膜（アマシャム）に移した。Ｌ１ｃＤＮＡの３． ３ｋｂＥｃｏＲＩ−断片又はＳＶ４０後期スプライスの３３０ｂｐＨｉｎｄIII 断片及びＡ１．５プラスミド（マクセル(Maxwell)ら(1989)，Biotechniques 7: 276-280）から精製されたポリアデニル化部位を32πα−ＣＴＰを用いてランダ ムプライミング（ベーリンガーマンハイム）により標識してプローブとして用い た。５×ＳＳＰＥ、５×デンハルツ溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び０．１ ｍｇ／ｍｌ音波処理した非相同ＤＮＡの中、６５℃で１時間、プリハイブリダイ ゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは１夜行った。すべてのサザンブ ロットに対する最終の厳格洗浄条件は０．１×ＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳ（ｗ ／ｖ）、６５℃であった。 実施例３ ノーザンブロット分析 麻酔をかけた成熟マウス（１２週令）をクロラルハイドルートの致死量で殺し 、脳を切除して直ちに液体窒素中で凍結した。液体窒素中で組織を砕き、全細胞 ＲＮＡを単離した。砕いた組織に４モルのグアニジニウム・チオシアネートを添 加した。全ＲＮＡの分離は記載された通り行った（チョムシンスキー(Chomczyns ki)ら(1987)，Anal．Biochem．162: 156-159、パグリウシ(Pagliusi)ら(1989)， AMOG J．Neurosci．Res．22: 113-119)。ＲＮＡの収量は２６０ｎｍの吸光度か ら求めた。１０μｇのＲＮＡをノーザンブロット分析のために１％アガロース− ホルムアルデヒドゲル上で分画した(トーマス(Thomas)(1980)，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 77: 201-205)。 ランダム・プライミングされたＬ１ｃＤＮＡプローブを用いて、内因性の６ｋ ｂＬ１ｍＲＮＡ（タッケ(Tacke)ら(1987)，Neurosci．Lett．82: 89-94）及びト ランスジーン由来の４．２ｋｂＬ１ｍＲＮＡを同時に検出した。ノーザンブロ ットのデンシトメーターによる分析をイメージ・プログラム（ＮＩＨ、リサーチ ・サービシーズ・ブランチ、ＮＩＨＭ）を用い、オリジナルフィルムについて走 査イメージ（アーカス・スキャンナー、アグファーガバート）上で行った。 トランスゲニック動物の全脳由来の全ＲＮＡのノーザンブロット分析により、 トランスジーン由来のｍＲＮＡに対して予想されたサイズ（４．２ｋｂ）のＬ１ 転写物が明らかにされた（図２）。これらの転写物は有糸***後のニューロン由 来の６ｋｂの内因性Ｌ１ｍＲＮＡとははっきりと異なっている。デンシトメータ ーによる分析によれば、トランスジーン由来のＬ１ｍＲＮＡのレベルは、内因性 Ｌ１ｍＲＮＡのレベル（１００％とする）と比較すると、ライン３４２６、３４ ２７及び３４１８においてそれぞれ３４％、１３％及び８％であった。 実施例４ 動物 クリオスタット切片上での培養に対する免疫細胞化学及びイン・サイチュハイ ブリダイゼーション実験。対照の動物は年齢を同一にした正常なＣ５７ｂ１／６ Ｊマウスのストックまたは非トランスゲニックの同腹のマウスから取った。小さ な小脳ニューロンの単離及び星状グリア細胞の培養の調製のために、６日令ＩＣ Ｒ非トランスゲニックな子を使用した。後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンは８日 令ヒヨコの胚から調製した。 実施例５ イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション トランスゲニック動物の星状グリア細胞がイン・ビボでＬ１を発現したことを 確認するため、視神経をイン・サイチュ・ハイブリダイゼーションで分析した。 視神経を選んだのはそれがグリア細胞のみを含みニューロン細胞体を含まないか らである。イン・ビボでは星状グリア細胞は通常どの発生段階でもＬ１の発現を 欠いている（未発表データ）。 クリオスタット切片における新鮮凍結脳切片のＬ１ｍＲＮＡの検出のため、イ ン・ビトロ転写（ドーリース(Doerries)ら(1993)，Histochemistry 99: 251-262 ）によりジゴキシゲニン−標識ｃＲＮＡを調製した。Ｌ１の細胞外部分をコード する配列（ムース(Moos)ら(1988)）を pBluescriptＫＳ＋（ストラタジーン）ベ クター中にサブクローニングした。Ｔ７及びＴ３プロモーターをそれぞれ用いて 、得られたプラスミドをＸｈｏＩ又はＸｂａＩで直鎖状とした後、Ｌ１挿入物を 転写することによりアンチ−センス及びセンスｃＲＮＡプローブを調製した。Ｇ ＦＡＰのｃＲＮＡプローブを調製するため、このタンパクのＮ−末端をコードす るＧＦＡＰｃＤＮＡの１．２ｋｂ断片（ルイス(Lewis)ら(1984)，Proc．Natl．A cad．Sci．81: 2743-2745、N．J．Cowan 博士から入手）を pBluescriptＫＳ＋ ベクター中にサブクローニングした。アンチ−センス及びセンスｃＲＮＡプロー ブは、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで直鎖状としたプラスミドをそれぞれＴ７及びＴ ３プロモーターから転写することにより調製した。組織侵入性を改善するため、 アンチ−センス及びセンスプローブをアルカリ加水分解条件下で処理してサイズ により分け、平均断片長約３００のヌクレオチドを得た。成熟（１２週令）動物 から調製された視神経の切片についてのイン・サイチュ・ハイブリダイゼーショ ンは他で記載されたように行った（ドーリース(Doerries)ら(1993)、バーチ(Bar tsch)ら，J．Neurosci.印刷中）。 非トランスゲニック対照では、Ｌ１転写は損傷の前（図３Ａ）も後（図３Ｂ） も視神経には検出されず網膜の神経細胞においてのみ検出された。対照すれば、 Ｌ１ｍＲＮＡはトランスゲニックマウスの視神経のグリア細胞により発現された （図３Ｃ）。Ｌ１ｍＲＮＡ陽性細胞は神経の遠位のミエリン化された部分と近位 のミエリン化されていない部分の両方で検出された。ハイブリダイゼーションシ グナルの強度は神経のミエリン化された遠位の部分に比べるとミエリン化されて いない近位の部分の方が高かった。 陽性細胞の類似の分布及び非ミエリン化部位とミエリン化部位の間の標識強度 における類似の相違がＧＦＡＰｃＲＮＡプローブを用いて観察された（図３Ｃと ３Ｅを比較せよ）。トランスゲニック動物の視神経におけるＬ１ｍＲＮＡ陽性細 胞の数は、しかしながら、常にＧＦＡＰ−陽性細胞の数よりも有意に低い、おそ らくＬ１ｃＲＮＡプローブの感受性の低さによるのであろう。また、Ｌ１ｍＲＮ Ａの検出可能なレベルは、高レベルのＧＦＡＰの発現をする星状グリア細胞での み得られるかも知れない。このような閾値効果はＧＦＡＰの５’フランキング配 列の２ｋｂしか含んでいないというＧＦＡＰ−Ｌ１トランスジーンの設計による のであろう。イン・ビトロの研究は転写開始部位の上流２ｋｂと６ｋｂの間の領 域がＧＦＡＰ由来の融合遺伝子のＣ６細胞(サリド(Sarid)(1991)，J．Neurosci ．28: 217-228)における発現を増強する配列要素を含んでいることを示唆する。 最後に、大きなＬ１ｃＤＮＡの導入を含むＧＦＡＰエキソン１の修飾により、Ｇ ＦＡＰｍＲＮＡと比べるとキメラｍＲＮＡの安定性が低下し、そして修飾された 領域の上流及び下流に位置する調節ＧＦＡＰ配列の及ぼす影響も変化するおそれ がある。 視神経を損傷した後、Ｌ１の発現が高レベルに調節されることがトランスゲニ ックの視神経では観察された（図３Ｄ）が、非トランスゲニックの視神経では観 察されなかった（図３Ｂ）。Ｌ１を発現した細胞の数及びＬ１ハイブリダイゼー ション・シグナルの強度は、同一のトランスゲニック・ラインでは個体が異なっ ても同様であったが、異なるトランスゲニック・ラインの間では差異がみられた 。ノーザンブロット分析で得られた結果（上をみよ）と一致して、Ｌ１ｍＲＮＡ 陽性細胞では、ライン３４２６が最も豊富であり、ライン３４２７がこれに続き 、そしてライン３４１８が最後であった。異なるラインの間でのトランスジーン 発現レベルの変動は幾つかの要因、特に異なるトランスジーン組み込み部位をフ ランキングしている近くの宿主のクロマチン領域により引き起こされる効果に関 係づけることができよう（プラウドフット(Proudfoot)(1986)，Nature 322: 562 -565、ライク(Reik)ら(1987)，Nature 328: 248-251、サピエンツェ(Sapienze) ら(1987)，Nature 328: 251-254）。 実施例６ 抗体 マウスＬ１に対するウサギポリクローナル抗体の生産およびＬ１免疫親和性カ ラム（ラチエン(Rathien)ら(1984)、マルチニ(Martini)ら(1988)）上での精製及 びマウス肝臓膜に対するポリクローナル抗体(リントナー(Lindner)ら(1983)、ポ ラーベルグ(Pollerberg)ら(1985))が記述された。ＧＦＡＰに対するマウスのモ ノクローナル抗体は購入したものである（ベーリンガーマンハイム）。 ウエスタンブロット分析のために、ポリクローナル及びモノクローナル抗体が ヤギの抗−マウス抗体又は抗−ウサギ抗体と共役したホースラディッシュ・ペル オキシダーゼ（ディアノバ、ハンブルグ、ドイツ）により可視化された。免疫細 胞化学のために、フルオレセイン・イソチオシアネート−又はテトラメチルロー ダミン・イソチオシアネート−共役ヤギ抗ウサギ及びヤギ抗マウス抗体（ディア ノバ）を用いて一次抗体を検出した。イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション のためのジゴキシゲニン−標識化ｃＲＮＡプローブはジゴキシゲニンに対するア ルカリホスファターゼ共役Ｆａｂ断片により可視化された（ベーリンガーマンハ イム）。 実施例７ クリオスタット・切片上でのニューロンの維持 トランスゲニック動物由来の視神経が野生型動物由来の視神経よりもニューラ イト成長にもっと誘導的かどうかを分析するため、損傷を受けた視神経及び損傷 を受けていない反対側の視神経のクリオスタット切片上で小脳ニューロンを維持 した（図７）。 ６から１６−週令のマウスの視神経をバーチ(Bartsch)ら(1989)，J．Comp．Ne urol．284: 451-462 に記載されているように調製した。簡単に述べると、損傷 を受けた視神経及び損傷を受けていない視神経を、血清無添加でホルモンで規定 された培地（フィッシャー(Fischer)(l986b)，Neurosci．Lett．28: 325-329） 中に液体窒素を用いて包埋し凍結した。フリゴカット２７０−クリオスタット（ ユング−ライハルト）上、ポリ−Ｌ−リジン（シグマ、水中０．００１％）で被 覆された滅菌カバーガラス上に載せ、無菌室で２−３時間風乾してから縦に切断 して組織切片（１４μｍ厚さ）を調製した。切片を培地で５分間洗浄した後、６ 日令ＩＣＲマウス（１００μｌ培地中６×１０4細胞数）由来のパーコル(Percol l)グラディエント−精製された小さな小脳ニューロン(カイルハウエル(Keilhaue r)ら(1985)，Nature 316: 728-730)をカバーガラスのそれぞれに載せた。細胞は 加湿された５％ＣＯ2と９５％空気で３７℃に保持されたインキュベーター中に 維持された。 ニューライト成長は抗体の存在下でも測定された。切片をポリクローナルＬ１ 抗体又はマウス肝臓膜に対するポリクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ、培養液 に対して十分に透析し同培地に希釈したもの）と共に３７℃で１時間前培養した 。抗体を除いた後、切片を培養培地で注意深く洗浄し（室温で５分間の洗浄を５ 回）そしてパーコル・グラディエント・精製した小脳ニューロンを添加した。２ 日後クリオスタット培養をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドの中で室温で３０ 分間固定した後、ニューライト長の測定を行った。測定時の「エッジ効果」を避 けるため、カバーガラスの２０％を占める外側の縁にあった切片は評価しなかっ た。半自動コンピュータ・イメージ分析プログラム（ＩＢＡＳ、コントロン、ツ アイス）を用いてこれらの切片上で成長したニューライトすべての長さを測定し 、そしてニューロン細胞体当たりの平均ニューライト長を計算した。各実験に対 しそして各視神経（損傷あり、なし）に対し、トランスゲニック動物の神経の上 で成長したニューライトの平均長が対照動物の対応する数値に関係付けられた。 少なくとも２頭のトランスゲニック動物を用い、損傷を受けた神経と損傷を受け ていない反対側の神経を用いて、１２の独立の実験を行った。 トランスゲニック動物について、損傷を受けた神経で観察されたニューライト 長の増加を損傷を受けていない神経と比較した。対照的に、野生型動物の損傷を 受けた視神経と損傷を受けていない視神経上でのニューライト長はほとんど差が みられなかった（図８）。トランスゲニック動物由来の損傷を受けていない視神 経の上で培養されたニューロンのニューライトは常に野生型動物由来の損傷を受 けていない神経の上で培養されたニューロンのニューライトよりも長かった。３ ４２６由来の切片を用いたとき、約３００％というニューライト長の最大増加が 観察された。同様に、トランスゲニック・ラインの損傷を受けた神経のニューラ イト長は野生型動物由来の損傷を受けた神経と比較すると、４００％まで増加し た。 トランスゲニック視神経のニューライト成長促進活性はＬ１の発現レベルと明 確に相関した（図８）。Ｌ１タンパクの最高レベルを発現するライン３４２６の 損傷を受けていない視神経は、比較すると低レベル（３４２７よりも３４１８は さらに低い）のＬ１しか発現しないライン３４２７及び３４１８の視神経よりも ニューライト成長を増強する点でずっと強力であった。ライン３４２６と３４２ ７の損傷を受けた視神経（損傷後２８日）については、ニューライトの成長は野 生型動物の損傷を受けた視神経についてのものよりも４倍も高かった。損傷を受 けた視神経におけるニューライト成長の増加はライン３４２６と３４２７とで同 様であった（ライン３４２６はライン３４２７と比較したとき、損傷後Ｌ１タン パクの発現では２５％の増加を示すけれども）という事実は、ライン３４２７で はＬ１タンパクのレベルが既に小脳ニューロン由来のニューライト成長の最大誘 導を満たしていることを示すものであろう。 Ｌ１又はマウス肝臓膜に対するポリクローナル抗体と共に野生型動物由来の損 傷を受けていない視神経を前培養したが、ニューライト成長に有意に影響しなか った（図９）。対照的に、トランスゲニック・ライン３４２６由来の損傷を受け ていない又は損傷を受けた視神経のクリオスタット切片をＬ１抗体と前培養した ときは、ニューライトの成長は５０％以上まで減少した（図９）。視神経及び小 脳ニューロンに強く結合する肝臓膜に対する抗体（データは示していない）は、 同様な阻害効果を示さなかった。野生型動物由来の損傷を受けた視神経をＬ１抗 体と前培養すると、予め抗体と前培養をしていない野生型動物由来の損傷を受け た神経と比較した場合、ニューライト成長の増加が誘導されたことは興味深い。 マウス肝臓膜に対する抗体は同一条件下で有意の増加を示さなかった。このこと は細胞表面反応性の抗体の添加それ自体はニューライトの成長を妨害しないこと を示す。 実施例８ 星状グリア細胞の単層上でのニューロンの維持 星状グリア細胞の単層を調製するため、６日令マウス由来の前脳をきれいにし 、非ニューロン組織を除去し、既に記載された通り分離された（シュニッツァー (Schnitzer)ら(1981)，J．Neuroimmunol．1: 429-456、フィッシャー(Fischer) ら(1982a)，Neurosci．Lett．29: 297-302、カイルハウアー(Keilhauer)ら(1985 )）。細胞は、ポリ−Ｌ−リジン（シグマ、水中０．００１％）で被覆された細 胞培養フラスコ上、１０％馬血清及び２ｍＭグルタミンを含むＢＭＥ培地（ギブ コ）中、１４〜２１日間維持された。汚染している稀突起グリア細胞やニューロ ンは培地交換の都度フラスコを振ることによりおよび４日の間隔で細胞を継代培 養することにより除去した。１４日の維持の後、ＧＦＡＰに対する免疫染色をす ると、細胞の９０％以上が星状グリア細胞であることが分かった。１４日培養し た後細胞をトリプシン処理し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上で５日間単 層として維持した。６日令マウス由来のパーコール・グラディエント・精製小脳 ニューロン（シュニッツアー(Schnitzer)ら(1981)）及び８日令にわとり胚由来 の後根神経節（ＤＲＧ）(ザイルハイマー（Seilheimer）ら(1988)，J．Cell. Bi ol．107: 341-351)ニューロンを次に星状グリア細胞の単層上に添加した。小脳 との共培養の６時間後、そしてＤＲＧニューロンとの共培養の１２時間後に、こ の共培養をＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドで固定し、そして実施例７に記 載したようにニューライト長を分析した。 マウス小脳又はにわとり後根神経節（ＤＲＧ）のニューロンからのニューライ ト成長は、トランスゲニック（ライン３４２６）又は非トランスゲニック対照由 来の星状グリア細胞の単層中でも研究された（図１０、表１）。 トランスゲニック星状グリア細胞上の小脳又はＤＲＧニューロンのニューライ ト長は、野生型星状グリア細胞を用いるニューライト長と比較すると、約１５％ 又は５０％高かった（表１）。抗肝臓膜抗体は野生型又はトランスゲニック動物 由来の星状グリア細胞単層上のニューライト長には影響を与えなかった（図１０ 、表１）。Ｌ１抗体と星状グリア細胞単層との前培養は野生型動物由来の細胞上 でのニューライト長には有意に影響しなかった。対照的に、トランスゲニック動 物由来の細胞上で成長した小脳又はＤＲＧニューロンのニューライト長を約４０ ％まで減少させた。このような状況においては、この研究で用いられたマウスＬ １に対するポリクローナル抗体はにわとり由来のニューロンとは反応しない（マ ルチニ(Martini)ら、1994a、データは示していない）ことが注目すべきである。 しかしながら、免疫蛍光分析により、これらの抗体はＬ１抗体と同様の効率でマ ウス小脳ニューロンにもトランスゲニック動物由来の星状グリア細胞にも結合す ること（データは示していない）が明らかにされるであろう。 実施例９ 免疫蛍光及びオーリオン(Aurion)−ＧＰ免疫金顕微鏡検査 新鮮な凍結され横又は縦に切断された野生型及びトランスゲニック動物の視神 経もしくは星状グリア細胞単層のＬ１及びＧＦＡＰ免疫染色を文献記載（バーチ (Bartsch)ら(1989)）のように行った。二重標識のため、まず、星状グリア細胞 を生細胞としてＬ１抗体（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中２μｇ／ｍｌ）と共に４℃で３ ０分間インキュベートした。この細胞を−２０℃の７０％メタノールで１０分間 処理して透過性を高めた後、この細胞を４℃で３０分間ＧＦＡＰ抗体と共にイン キュベートした。 クリオスタット培養実験でのニューライト長の定量化のため、オーリオン社の イムノ・Ｒ−ゲント・シルバー・エンハンスド・ステーニングを製造業者の説明 書に従い、少し修正して使用した（Aurion，Immuno Gold Reagents & Accessori es Custom Labelling，Wageningen，The Netherlands）。要するに、培養物をＰ ＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中に室温で１０分間固定し、ＰＢＳ中の５０ｍ Ｍグリシン中で１０分間インキュベートし、ついでブロッキング・バッファー（ ＰＢＳ中、ＢＢ、０．５％ＢＳＡ）中で１５分間処理した。ＢＢ中で３回各５分 洗浄した後、細胞をＢＢ（２μｇ／ｍｌ）中に希釈したＬ１抗体と共に３０分間 室温でインキュベートした。続いて、培養をＢＢ中で３回各５分洗浄し、そして ＢＢ中に１：２０に希釈された二次抗体を室温で１時間かけて添加した。蒸留水 で３回洗浄した後、培養をＰＢＳ中の２％グルタルアルデヒド中に室温で１０分 間固定し、そして蒸留水で３回洗浄した。ついで、エンハンサーとディベロッパ ーの１：１混合液を室温で添加した。反応生成物が現れた後、カバーガラスを蒸 留水で３回洗浄し、グリセリン中に包埋した。 非トランスゲニックマウスの視神経では、Ｌ１免疫反応性が非ミエリン化網膜 神経節細胞軸索に限定された（バーチ(Bartsch)ら(1989)）。トランスゲニック 動物由来の損傷を受けていない視神経では、弱いＬ１免疫反応性も細胞体や放射 状に伸びた細胞突起との関連で発見された（図４Ａ）。トランスゲニック視神経 におけるこのＬ１免疫反応性の強度は損傷後に有意に増加し（図４Ｂ）そして損 傷を受けていない（図４Ｃ）又は損傷を受けた（示されていない）野生型神経で 見いだされたＧＦＡＰ免疫反応性に対する分布も同様であった。 Ｌ１の発現は６日令トランスゲニック動物の前脳から調製された星状グリア細 胞の培養において付加的に分析された。野生型動物由来の星状グリア細胞上では Ｌ１の免疫反応性は検出できなかった（図５Ｄ）。対照的に、トランスゲニック 動物由来の培養にはＬ１陽性細胞が存在していた（図５Ａ）。二重免疫染色によ り証明されるように、同じ細胞がＧＦＡＰに対しても陽性であることが明らかと なった（図５Ｂおよび５Ｅ）、このことはＬ１を発現するこの細胞が実際に星状 グリア細胞であることを示すものである。Ｌ１免疫染色は生きている細胞で行わ れたから、トランスゲニック動物では、Ｌ１がイン・ビボで星状グリア細胞の細 胞表面に露出されているように思われる。 実施例１０ ウエスタン・ブロット分析 ＧＦＡＰ−Ｌ１トランスゲニックマウス中でのＬ１の発現の量をさらに定量す るために、野生型及びトランスゲニック成熟マウス由来の損傷を受けていない又 は損傷を受けている（損傷後１５日）視神経のホモゲネートの界面活性剤抽出液 をウエスタン・ブロットで分析した（図６）。 ８週令動物由来の損傷を受けた（損傷後１５日）視神経及び反対側の損傷を受 けていない視神経をきれいに洗って非ニューロン組織を除き、ついで液体窒素中 で凍結した。この神経のＬ１免疫反応性のミエリン化されていない又は部分的に しかミエリン化されていない近位の領域ではなく、ミエリン化されている遠位の 領域だけを使用するように注意がなされた。ブランソンＢ１５ソニケーターで４ ℃で５分間音波処理をする前に、神経を１０回凍結融解した。ついで、組織をダ ウンス(Dounce)ホモゲナイザーを用いホモゲナイゼーション緩衝液（ＰＢＳ中、 １％トライトンＸ−１００、２Ｍ尿素、５ｍＭベンズアミディン、０．１ｍＭヨ ードアセトアミド、１ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド、５ｍＭｐ −トシル−Ｌ−リジンクロロ−メチルケトンナトリウム）中でホモゲナイズした 。ホモゲネートを１６，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離して澄明にした。上 清をメタノール／クロロホルムで処理してウェッセル(Wessel)ら(1984)の記載の ようにタンパクを沈澱させた。タンパク含量は上清について測定した（ピャース (Pierce)）。還元条件下で、７％スラブゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、タ ンパク（２５μｇ）をウエスタン・ブロットにより、ポリクローナルＬ１抗体（ ０．４μｇ／ｍｌ）を用いて分析した。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ 共役二次抗体（２μｇ／ｍｌ）をＥＣＬウエスタン・ブロッティング・ディテク ション・キット（アマシャム）により検出した。免疫ブロットのデンシトメータ による分析もイメージ・プログラム（ＮＩＨ、リサーチ・サービシース・ブラン チ、ＮＩＭＨ）を用い、オリジナルフィルムの走査イメージ（アークス・スキャ ナー、アグファーガバート）上で行った。 免疫ブロットのデンシトメータ分析により、トランスゲニック動物の損傷を受 けていない視神経におけるＬ１の発現が野生型動物の損傷を受けていない視神経 におけるよりも約４０％及び１３％（それぞれ、ライン３４２６と３４２７）高 いことが証明された。損傷を受けたトランスゲニック神経におけるＬ１の発現は 野生型動物の損傷を受けた神経と比較したとき３１０％及び２００％（それぞれ 、ライン３４２６と３４２７）高かった。野生型動物由来の損傷を受けた視神経 と損傷を受けていない反対側の視神経の比較により、損傷を受けた側に約４０％ のＬ１タンパク発現の減少が明らかになった。対照的に、ライン３４２７と３４ ２６の損傷を受けた神経でのＬ１タンパクの量は、損傷を受けていない反対側と 比較すると約３０％だけ増加した。ライン３４２６のＬ１発現レベルはライン３ ４２７の損傷を受けていない視神経及び損傷を受けた視神経での発現レベルより もそれぞれ約３５％及び２５％高かった。 実施例１１ 視神経における軸索のイン・ビボ再成長 ６〜８週令ＧＦＡＰ−Ｌ１トランスゲニックマウス及び野生型マウスの眼窩内 を破砕し、そして１４日後に、網膜神経節細胞軸索を前へ動く標識によりマーク するため、フルオレセイン−標識化ビオチンエステルを用いて追跡した。結果を 図１１及び図１２に示す。各点は１頭の動物を表す。 実施例１２ フィブロネクチン・タイプIII の相同反復２及び３の間の境界とニューライト成 長促進及びシグナル伝達ドメインとしての神経細胞接着分子Ｌ１の同定 ニューライトの成長に関与する神経細胞接着分子Ｌ１のドメインを決定するた め、Ｌ１に対するモノクローナル抗体を作成し、培養中の小脳ニューロンのニュ ーライトの成長に対してそれらが持つ効果を研究した。１１個の抗体を基質とし てコートしたところ、抗体５５７．Ｂ６だけがニューライト成長の促進する点、 Ｃａ2+の細胞内レベルを増加させる点、及びイノシトールリン酸の代謝回転を刺 激する点で、Ｌ１と同等の能力を持っていた。この抗体はフィブロネクチン・タ イプIII の相同反復２及び３の間の境界にあるアミノ酸８１８〜８３２を含む合 成ペプチドにより提示されるエピトープを認識する。これらの事実はニューライ トの成長とこれらの二次メッセンジャーの変化が相関していることを示唆する。 このような相関関係は、Ｃａ2+−チャンネル・アンタゴニストや百日咳毒素がＬ １及び抗体５５７．Ｂ６上でのニューライトの成長を阻害する能力を有すること により確認された。これらの観察は、認識事象がそれを通ってニューライトの成 長の引金を引き、イノシトールリン酸の代謝回転を増加させ、そして細胞内のＣ ａ2+レベルを高める卓越したシグナル伝達ドメインとして、細胞表面に結合した Ｌ１の上の明確な部位を初めて示すものである。 実施例１３ Ｌ２／ＨＮＫ−１の再成長した末梢神経における免疫反応性：以前の運動軸索関 連シュワン細胞の優先発現 炭水化物エピトープＬ２／ＨＮＫ−１（以下、Ｌ２と名づける）は成熟マウス 中で前根及び筋の神経のシュワン細胞をミエリン化することにより発現されるが 、後根又は皮膚の神経のシュワン細胞では滅多に発現しない。基質をコートされ たＬ２グリコリピドは培養された運動ニューロンを促進するが感覚ニューロンは 促進しないから、Ｌ２はイン・ビボで運動軸索を再生することにより筋神経の優 先的再支配に影響を与えることができる。 従って、再生しつつある軸索が再成長したシュワン細胞によるＬ２の発現に対 して及ぼす影響は、８週令マウスの大腿神経の筋分岐及び皮膚分岐に運動軸索又 は感覚軸索を向けることにより分析された。皮膚分岐からの再生しつつある軸索 は筋神経分岐又は皮神経分岐では免疫細胞化学的に検出できる程のＬ２発現に導 かなかった。筋分岐から再生する軸索は皮膚分岐のほとんどないシュワン細胞に よって弱いＬ２発現に導いたが、筋分岐の多数のシュワン細胞による強いＬ２発 現が引き起こされた。以前に運動軸索と関連していたミエリン化しているシュワ ン細胞は、こうして以前に感覚軸索と関連していたミエリン化しているシュワン 細胞とは、運動軸索と接触したときＬ２を発現するそれらの能力という点で異な っていた。再成長の重要な段階でこのＬ２発現を高いレベルに調節することは、 適当な筋の経路に再生していく運動軸索を提供するので、不適当な感覚経路に再 生していくものよりも有利である。 実施例１４ ヒヨコに対する積極回避課題のための記憶の強化におけるＬ１ １回試行積極回避課題について日令ヒヨコを訓練する。ここでヒヨコは苦い味 のメチルアントラニレートを被覆した小さなきらきらしたビーズをついばむ性質 を抑制することを学ぶ。その結果、前脳の二つの別の領域にあるシナプス前要素 及びシナプス後要素、インターメディエイト・メディアル・ハイパーストリアト ウム・ベントレール(the intermediate medial hyperstriatum ventrale)（ＩＭ ＨＶ）、及びロブス・パロルファクトリウス(Lobus parolfactorius)(ＬＯＰ)の リモデリングに至る、時間依存性の細胞性及び分子性のカスケードを生ずる(ロ ーズ(Rose)（1991）Trends In Neurosciences 14: 390-397)。このカスケードは フコース取り込みの増大により明らかなように、グリコプロテイン合成の二つの 異なる波を含み、訓練に続く種々の時間でＩＭＨＶ及びＬＰＯの両方で起こる。 回避課題に対する長期間（すなわち、２４時間プラス）の記憶保持のためには両 方の波が必要である。この回避課題では、そうでなければ前に苦かったビーズを 避けるであろうヒヨコが、テストでは乾いたビーズをついばんでしまうことによ り、ヒヨコによる記憶消失が証明される。 細胞−細胞接触を媒介する際のＬ１の役割が知られているので、本研究はＬ１ が学習関連グリコプロテインの中でグリコプロテイン合成の片方又は両方の波の 何れに関与しているのかそして記憶の形成に必要なのかを決定するために行われ た。もしそうであるならば、訓練に関して適当な時間に投与されたＬ１に対する 抗体は長期間記憶に必要なシナプスのリモデリングを妨害し、従ってこの課題に 対する記憶消失をもたらすはずである。同様に、もしＬ１分子の細胞外ドメイン が認識及びシナプス・リモデリング及び安定化のために必要とされる接着過程で 、ある役割を果たすのであれば、内因性分子に同種親和性的に結合する細胞外ド メイン断片を外因的に与えれば、この過程は破壊されるかも知れない。抗体と断片 ポリクローナル抗体は、確立された免疫化操作に従い（ラチェン(Rathjen)ら( 1984)）、免疫親和性で精製されたＬ１（Ｎｇ−ＣＡＭ，８Ｄ９）を用いる免疫 化によりウサギで調製された。Ｌ１は１日令ニワトリの脳から、確立された方法 （ラチェン(Rathjen)ら(1984)）再びを用い、８Ｄ９モノクローナル抗体（ラー ゲナウアとレモン(Lagenaur and Lemmon)(1987)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 7753-7757）カラムを用いて単離された。抗体は第３回の免疫化の後に得ら れた血清から製造業者の説明書に従ってプロテインＧセファロース（ファルマシ アＬＫＢ）を用いて単離した。アッペル(Appel)ら(1993)の記載のようにして、 ６個の免疫グロブリン様（Ｉｇ−Ｉ〜VI）と５個のフィブロネクチン・タイプII I の相同反復（ＦＮ１〜５）を表す組換え的に発現させた融合タンパクを大腸菌 で調製した。 ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）とヒヨコの非細胞画分 脳ホモゲネート、粗製膜、可溶性画分（バーシュラツ(Burchuladze)ら(1990)B rain Res．535: 131-138）及びシナプス後部密度（ムラカミ(Murakami)ら(1986) J．Neurochem．46: 340-348）由来の、すべて日令ニワトリの脳由来のタンパク ５０μｇを還元条件下、５〜１５％ポリアクリルアミド勾配ゲル上(レムリ(Laem mli)(1970)Nature 227: 146-148)、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後バー ネット(Burnette)(1981)Anal．Biochem．112: 195-203）の方法に従ってニトロ セルロースに移された。５％脱脂ミルク粉末を含むトリス−緩衝食塩水、ｐＨ７ ．２中に１：１０００で希釈したＬ１抗体と共に一晩インキュベーションした後 、免疫反応性バンドを既に記載した方法（ショーレー(Scholey)ら(1993)Neurosc iences 55: 499-509）に従って検出した。 訓練操作及びテスト操作 インキュベーター中で孵化した両方の性の１日令(day-old)ロス・チャンキー ヒヨコを一対で小さな（２．５ｍｍ）白いビーズをついばみ易いようにした小さ な囲いの中にいれ、ついでロスナーとローズ((Lossner and Rose)(1983)J．Neur osciences 41: 1357-1363）が記載したようにメチルアントラニレートで被覆し たより大きな（４ｍｍ）クロムのビーズを用いて訓練した。苦いビーズをついば んだ鳥はステレオタイプの嫌な応答を示し、頭を激しく振り、ビーズから後ずさ りした。訓練の２４時間後に、各動物を訓練に使用したものと同一の乾いたクロ ムビーズを提示して試験した。積極回避学習の保持はテストビーズを避ける動物 の中で示された。この計画の繰り返しのそれぞれで、２４〜３６匹のヒヨコが訓 練されテストされた。訓練され、注射されていないヒヨコの８０％以上がこれら の条件下で正常にビーズを回避するか、食塩水を注射した鳥の中にはしばしば回 避の減少がみられる。対照的に、水−被覆ビーズで訓練された鳥はテストで乾い たビーズを貧欲についばみ、それらの回避スコアは５〜１０％を越えることは稀 である。訓練及びテストはすべて動物の前の処置に関してはブラインドにした実 験でルーチンに行われた。 注射 Ｌ１抗体、ＦＮ１〜５、及びＩｇＩ〜VI断片を０．９％食塩水に対して一晩透 析し、濃度をＬ１については１ｍｇ／ｍｌにそして断片については２５０μｇ／ ｍｌに調整した。ヒヨコはインターメディエイト・メディアル・ハイパーストリ アトゥム・ベントレール（ＩＭＨＶ）中に半球当たり１０μｌのＬ１を両側の頭 蓋内に注射された。対照の動物は同様の食塩水の注射を受けた。ＩＭＨＶ中への 正確な送達をするために特に工夫されたヘッドホールダーとスリーブを持つハミ ルトン・シリンジ（デイビス(Davis)ら(1982)，Pharm．Biochem．Behav．17: 89 3-896）が使用された。食塩か抗体を訓練またはテストの前に注射されたヒヨコ は明白な挙動上の効果を示さず、訓練の間正確にビーズをついばんだ。新たに孵 化したヒヨコの脳の大部分の細胞外容積はこのサイズの注射に十分に耐えられる ことを意味し、漏れなしに達成できる。以前の報告は、注射後数時間のうちに注 射部位から抗体が徐々に拡散することを示した（ショーレー(Scholey)ら(1993) ）。注射の位置の精度はルーチンに死後の脳の視覚的検査によりモニターされた 。実験の反復のそれぞれで、食塩及び抗体又は断片を注射されたヒヨコの釣合い のとれたグループ分けが行われた。Ｌ１実験ではヒヨコのグループは訓練に関す る８個の時点の１点で食塩又は抗体を注射された。すなわち、訓練前２時間また は３０分、又は訓練後＋１時間、＋３時間、＋４時間、＋５．５時間、＋８時間 又は＋１２時間である。以前の観察に基づいて、訓練前−３０分又は訓練後＋５ ．５時間に注射された鳥でどのように効果が観察されるかが予想された、そして これらの時点での反復の数は従ってかなり大きくなった（抗体注射に対してそれ ぞれ、Ｎ＝１７、２８、１７、１９、１８、２１、１９、及び１８であった）。 Ｌ１断片であるＦＮ１〜５及びＩｇＩ〜ＩV は、−３０分又は＋５．５時間で注 射されそして保持は２４時間でテストされた。食塩及びＬ１抗体又はＬ１断片を 注射されたヒヨコのグループでの保持はχ2により統計的に比較された。結果は 図１３及び１４に示してある。 実施例１５ 長期間増強の場合のＬ１及びＮＣＡＭの関与 ハロセン麻酔をかけた雄ウイスターラット（１８０〜２２０ｇ）由来の海馬横 断切片（４００μｍ）を標準的技法で調製した。切片をインターフェースチェン バーに維持し、まず高浸透圧（３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ）の人工脳脊髄液（ＡＣＳ Ｆ）中、室温で４５分間回復させた。ついで浴温を３０℃に上げ、培地をＮａＣ ｌ，１２４．０、ＫＣｌ，２．５、ＭｇＳＯ4，２．０、ＣａＣｌ2，２．５、Ｋ Ｈ2ＰＯ4，１．２５、ＮａＨＣＯ3，２６．０、グルコース，１０、スクロース ，４、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2でバブリング（ｐＨ７．４）を含む（単位はｍＭ） 正常浸透圧のＡＣＳＦ（３０７ｍＯｓｍ／ｋｇ）に変更した。灌流速度は０．７ ５ｍｌ／分であった。シャーファー（Schaffer）副行／交連ファイバーはＣＡ１ 領域の放線構造（stratum radiatum）に置かれた捩じったプラチナ−イリジウム ・ワイヤ（５０μｍ直径）により刺激した。テスト刺激は１００μｓ持続各３０ 秒の単相衝撃からなり、そして刺激の強さは最大ＥＰＳＰ振幅（重なりあった多 重スパイクのない最大ＥＰＳＰ）の３０％が得られるように調節された。ＥＰＳ Ｐは各サイドの刺激電極から約３００μＭ離して取り付けられた２個のガラスの ミクロピペット（２ＭのＮａＣｌ，１〜５ＭΩ）によりＣＡ１放線構造（stratu m radiatum）から記録された。 少なくとも１５分間安定な記録をした後、抗体又はタンパク断片を、一つの記 録電極（注意深く３０％に調節されたもの）の近く（５０〜７５μｍ）にあるＣ Ａ１の樹状突起部分に改良ミクロインジェクション・システム（ナノリッター・ インジェクター、ＷＰＩ）を用いて、特に断らない限り、実験の終わりまで１０ 秒毎に５ｎｌを連続的に送達する方法で放出させた。続くＬＴＰの誘導により抗 体を洗い流すことは明らかな理由から不可能であったが、各切片内でＬＴＰが誘 導され得たかどうかは、抗体が適用されなかった第２の電極から記録することに より確認された。放出ミクロピペットの先端は切片内にはいらなかったが、放出 が開始されるとしばしばＥＰＳＰ振幅の小さな減少が観察された。この容積のア ーティファクトは放出された物質の性質とは無関係であった。タンパクは特に断 らない限り２０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して透析した。濃度はピペットの 濃度を指す。 ミクロインジェクションの開始２０分後に、４秒間隔で３回の刺激(train)か らなるシータ・バースト・刺激（ＴＢＳ）方式によりＬＴＰが誘導された。各刺 激は１００Ｈｚで５個のパルスがある１０回の高周波数の衝撃からなり、そして この衝撃は２００ｍｓだけ離れている(ライヒャルト(Reichardt)ら(1991)Annu． Rev．Neurosci．14: 531-570)。刺激パルスの持続はＴＢＳの間２倍であった。 ＬＴＰの誘導は１０μＭのＤ（−）−２−アミノ−５−ホスホノペンタノイン酸 （Ｄ−ＡＰ５Ｄ、トクリス）の灌流により全く防止された。全細胞の記録はＥＰ Ｃ−９パッチ・クランプ・アンプリファイアーを用い、「盲目」パッチ・クラン プ法によりＣＡ１ニューロンから得られた。浴温は３０℃であった。パッチ電極 は１．５ｍｍＯＤボロシリケートガラスから引っ張り、そして抵抗は３と８ＭΩ の間であった。ピペットはファイア・ポリッシュもコーティングもしなかった。 電極はポタシウム・グルコネート，１２９、ＫＣｌ，５、ＭｇＣｌ2１、ＣａＣ ｌ2，１、Ｎ−（１−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンス ルホン酸）（ヘペス），５、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ），５、Ｎａ−ＡＴＰ，１０及びＮ ａ−ＧＴＰ，０．３（ｐＨはＫＯＨで７．３に調整）をｍＭで含む溶液でルーチ ンに洗った。直列抵抗は補償しなかった。応答は可視的分析のためプリントアウ トされた、もしくはさらに分析するためディスク上に保存されたシグナルの３〜 ４個の平均として集められた。統計的評価は計画的比較や対比分析を含む分散分 析により行った。時間は反復測定の１レベルと共に従属変数と考えられた。抗− Ｌ１（ラチェン(Rathjen)ら(1984)）、抗−ＩｇＩ〜VI（ハインズ(Hynes)ら(199 2)）及び抗−肝臓膜抗体（リンダー(Linder)ら(1983)）は前に記載されてい る方法で調製された。結果を図１５に示す。 Ｉｇ様ドメインＩ〜VI及びＬ１のＦＮタイプIII 相同反復Ｉ〜Ｖは細菌で発現 させ、記載されたように精製した（ハインズ(Hynes)ら(1992)）。ＮＣＡＭに対 する抗体及びアクソニン−１は記載されたように調製した（ラーソン(Larson)ら (1986)，Science 232:985-988、ベイリー（Bailey）ら(1992)，Science 256: 64 5-649）。リボヌクレアーゼからオリゴマンノシディック・グリコペプチドの調 製及びアシアロフェトゥインから対照のグリコペプチドの調製も記載されている （ラーソン(Larson)ら(1986)）。結果は図１６に示す。 ＮＭＤＡ受容体に媒介されるＥＰＳＰは抗体又はグリコペプチドの適用の２０ 分前に非ＮＭＤＡブロッカーである６−シアノ−７−ニトロキノクサリン−２， ３−ジオン（ＣＮＱＸ、トクリス）を３０μＭ適用することにより単離された。 各実験の終わりに、Ｄ（−）−２−アミノ−５−ホスホノペンタノイン酸（Ｄ− ＡＰ５、３０μＭ、トクリス）がこれらの応答を完全に抑制したことが確認され た。結果は図１７に示す。 実施例１６ Ｌ１は神経保存的効果を持つ Ｌ１の活性をさらに解明するための実験をＣＮＳ神経組織を用いて行った。具 体的には、次のように調製した培地を持つ４枚の別のプレートに、マウス中脳細 胞の一定量の試料を蒔き培養した。すなわち、第１の対照プレートはポリ−Ｌ− リジンのみで被覆した、第２のプレートはポリ−Ｌ−リジンとＬ１で被覆した、 第３の対照プレートはポリ−Ｌ−リジンとラミニンで被覆した、そして第４のプ レートはポリ−Ｌ−リジン、ラミニン及びＬ１で被覆した。すべてのプレートに 一定量の細胞を蒔きそして同一の条件の下でインキュベートした。７日後にすべ てのプレートをドパミンの存在を調べるため染色し、その後観察した。Ｌ１で被 覆したプレートは対照よりも２００〜４００％の成長を示した。ラミニンで被覆 したプレートはＬ１で被覆したプレートよりも大きなニューライト成長を示した が、細胞数は多くなかった。これらの結果から、Ｌ１は成長した細胞数で測られ た細胞の生存率は対照よりも劇的に増大したので、Ｌ１は顕著な神経保存効果を 示すことが示されまた示唆される。実施例１７ 可溶性Ｌ１（Ｌ１−Ｆｃ）は機能的に活性でありそしてニューロンの生き残りの ための強力な作用物質である 可溶性Ｌ１は Neuron 14: 57-66，1995 に記載された操作により組換えＬ１− Ｆｃ融合タンパクとしてコス細胞中で作られた。この組換えタンパクはプロテイ ンＡアフィニティ・クロマトグラフィーで精製され、プラスチック上を被覆する 基質として又は約１〜１０μｇ／ｍｌで培養培地に添加される可溶性分子として 用いられた。日令１７のラット胚由来の中脳ニューロンのニューライト成長及び 生存がイン・ビトロ維持７日後に培養で検討された。ドパミン作用性のニューロ ンはドパミン−β−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）に対する免疫染色により認識さ れ、ＩＢＡＳ体型測定装置を用いて定量された。可溶性Ｌ１−Ｆｃを添加された 培養はポリ−ＤＬ−オルニチン（ＰＯＲＮ）上で維持され、そして基質−被覆さ れたＬ１−Ｆｃは予め被覆されたＰＯＲＮの表面の上に添加された（アッペル(A ppel)ら，J．Neuroscience 13: 4764-4775，1993 に記載された条件の下で）。 ＮＣＡＭ−Ｆｃは対照として使用された。 神経細胞の中での認識は機能性神経系の発育にとって重要な前提条件である。 認識分子は細胞表面で発現され、そこで認識分子はカドヘリン(cadherin)のよう な近所の細胞間の相互作用を仲介するかまたは細胞表面とインテグリンのような 細胞外マトリックスとの間を仲介する（タケイチ(Takeichi)1991、ルオスラーチ （Ruoslahti）1988、ハインズ(Hynes)1992）。認識分子の最も優れたファミリー は免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含む。このＩｇ−様ドメインは共通の免 疫グロブリン及び細胞接着分子の祖先を反映しており、この両方が特異的な認識 事象に関与している(エーデルマン(Edelman)1970)。神経系では、Ｉｇスーパー ファミリーは今日まで２ダース以上の異なる分子を含んでいる。一部のＩｇ様ド メインを含む分子は細胞外ドメインの中に多重機能を持っている。サイトカイン やニューロトロフィンの受容体は認識性と同様に高い親和性のある受容機能を持 っている(タンナヒル(Tannahill)ら，1995、プリド（Pulido）ら，1992))。Ｉｇ −様ドメインの３次元構造はＦＮ−様反復に類似しており（メイン(Main)ら，19 92、リーヒ(Leahy)ら，1992）、後者はフィブロネクチン、テナシン(tenascin) ファミリーのメンバーそしてその他のものなどの幾つかの細胞外マトリックス分 子の構造モチーフでもある（ウイリアムスとバークレー(Williams and Barclay) ，1988、バロン(Baron)ら，1992、エリックスン(Erickson)，1993）。Ｉｇスー パーファミリーの神経認識分子は暫定的、スパートレル(spatlel)、そして細胞 型に特異的な発現パターンなどの特徴をもっている（レビューのためには、エー デルマン(Edelman)1988、シャックナー(Schachner)1991、1994、ラチェンとジョ セリ(Rathjen and Josseli)1991、ルティーハウザー(Rutiehauser)，1993)。こ のファミリーの認識分子はすべて細胞接着及びニューライト成長を促進するとい う点で機能的に重なっている。一部の認識分子は強い同種親和性である、すなわ ち自己結合パートナーであるが、他のものは圧倒的に異種親和性(heterophilic) である、すなわちＩｇスーパーファミリー又は細胞外マトリックス分 子の他のメンバーをときに含む非自己パートナーに結合する（ブリュンメルドル フとラチェン(Bruemmendorf and Rathjen)1993，1994)。Ｉｇ−様ドメイン及び ／又は神経認識分子のＦＮ−様反復の個々の機能的諸性質についての現在の知識 は別個のものであり、かつ認識、ニューライト成長、及び反発の点で重複した機 能的性質を示す（ゲンナリニ(Gennarini)ら，1991))、フレル(Frel)ら，1992、 テイラー(Taylor)ら，1993、アッペル(Appel)ら，1993，1995、ペシェバ(Peshev a)ら，1993、ファイゼンフェルト(Feisenfeld)ら，1994、ホイム(Hoim)ら，1995 ）。 Ｉｇスーパーファミリーの神経認識分子の中では、神経認識分子Ｌ１に関係の ある分子のファミリーは機能及び構造に強い類似性を示す。これらは強力なニュ ーライト成長プロモーターでありそして発育の比較的遅い期間、ほとんどは軸索 形成が起こる時期に発現される。これらはニューロンにより優勢に発現されるが 、Ｌ１ファミリーのメンバーの一部はニューライト成長を促進するグリア細胞に も存在する（マルチニとシャックナー(Martini and Schachner，1986、ビクスビ (Bixby)ら，1988、ザイルハイマーとシャックナー(Seilheimer and Schachner) ，1988。 次の実験では、Ｌ１ファミリーの別のメンバーが同定され特性決定がなされ、 Ｌ１の近いホモログ（ＣＨＬ１）と命名された。これは６個のＩｇ−様ドメイン とＦＮ−様反復を含み、そのうちの４個は他のＬ１ファミリーメンバーのＦＮ− 様反復と高度に相同的である。一部のＦＮ−様反復はこの分子の膜隣接領域に局 在している。それはＬ１関連分子の中でも最も変動する領域である。ＣＨＬ１が Ｌ１ファミリーのメンバーと共有している他の特徴は、それが神経系で優勢かつ 発育的に後期に発現されること、そしてそれがＨＮＫ−１炭水化物の発現を含み 、Ｎ−グリコシレーションが高レベルであることである。 実施例１８ 材料と方法 動物 ＩＣＲマウス及びウイスターラットが組織調製に使用された。 抗体 組換え的に発現されたＣＨＬ１（アミノ酸４９９〜１０６３（図１８及び１９ ））とＬ１（アミノ酸１２６〜１９８１（アッペル(Appel)ら，1993）の細胞外 部分に対するポリクローナル抗体を記載されたように(ラチェンとシャックナー( Rathjen and Schachner)，1984)ウサギ中で形成させた。ＣＨＬ１に対する抗体 を形成させるため、精製したペプチドの２００μｇをウサギに注射し、ついで３ 週間の間隔で１００μｇの付加的注射を４回行った。Ｌ１抗体を硫酸アンモニウ ム沈澱（１３．５ｍｇ／ｍｌ）により血清から濃縮した。ラットのモノクローナ ル抗体４１２をＨＮＫ−１炭水化物エピトープ（クルーゼ(Kruse)ら，1984）の 同定に使用した。グリア・原線維・酸性タンパク（ＧＦＡＰ）に対するモノクロ ーナル抗体はベーリンガー（マンハイム）から入手した。Ｏ１抗原（単数又は複 数）に対するモノクローナル抗体は記載されている（ゾンマーとシャックナー(S ommer and Schachner)，1981）。 神経接着分子の精製 Ｌ１、Ｎ−ＣＡＭ及びＭＡＧは、成熟マウスの脳由来の粗製膜画分の界面活性 剤抽出物からモノクローナル抗体カラムを用いて免疫親和性により精製した（ラ チェンとシャックナー(Rathjen and Schachner)，1984、ファルスナー(Falssner )ら，1985、ポルトラク(Poltorak)ら，1987）。 ｃＤＮＡライブラリー及びスクリーニング ８日令マウスの脳のポリ（Ａ）+ＲＮＡから誘導されたλｇｔｌ１ライブラリ ーの調製及びこのライブラリーの免疫親和性で精製されたポリクローナルＬ１抗 体によるスクリーニングは、記載されたように行った（タケ(Tacke)ら，1987） 。より長いｃＤＮＡクローンを得るため、新たなＤＮＡライブラリーを構築した 。すなわち、ＲＮＡを６〜１４日令マウスの脳からグアニジニウム・チオシアネ ー ト／酸性フェノール法により精製した（コメツィンスキーとサッチ(Chomezynski and Sacchi)，1987）。ポリ（Ａ）+ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルローズカラ ムに２回連続して通すことにより濃縮した（サムブルック(Sambrook)ら，1989） 。８μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを使用しｃＤＮＡ合成キット（アマシャム）を用 いてオリゴ（ｄＴ）をプライマーとする二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを サイズで選択しそしてＳａｌＩ部位を含むＤｒａIII −アダプターを有するプラ スミドｐＸＭＤ１中に連結した（クルクセン(Kluxen)ら，1992）。ライブラリー の増幅のため、大腸菌ＴＯＰ１０株（インビトロゲン，オランダ）を使用した。 スクリーニングのため、一定量を直接約２×１０4細菌／フィルター（１３８ｃ ｍ2）の密度でナイロン膜（ＢＩＯＤＹＮＥTM、パル）上に接種した。レプリカ フィルターを３７℃で一夜インキュベートした。続いて、細菌を溶解し（０．５ ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣｌ）、フィルターを中和し（３ＭのＮａＣｌ、 ０．５Ｍのトリス−塩酸ｐＨ８．０）、２×ＳＳＣで洗浄し、空気乾燥しそして ８０℃で２時間加熱した。ナイロン膜をプリハイブリダイズし、製造業者の説明 書に従ってランダム−プライミング（ベーリンガー・マンハイム）により放射標 識されたＣＨＬ１（λｇｔｌ１ライブラリー由来）の１ｋｂ断片（ＨｉｎｃII／ ＫｐｎＩ）を用いてハイブリッド形成を行い、高厳格条件下、４２℃で洗浄し、 次いで他で記載したようにＸ線フィルムに曝した（サムブルック(Sambrook)ら， 1989）。６個の陽性クローンを制限地図及び標準プロトコールに従う配列決定に よりさらに特性決定を行った（サムブルック(Sambrook)ら，1989）。４．４３ｋ ｂＣＨＬ１挿入物を含む一つのクローン（ｐＸ＃２）をさらなる分析に供した。 ＤＮＡ配列決定及び配列分析 ヌクレオチド配列は、ジデオキシ−チェイン−ターミネーション法（サンガー (Sanger)ら，1977）により、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア）に対する 鋳型として二本鎖ＤＮＡ、プライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用いて決 定された。ｃＤＮＡ配列は集められ、そしてＤＮＡＳＴＡＲプログラム（ＤＮＡ ＳＴＡＲ社、ロンドン）を用いて分析された。他に断らない限り、アミノ酸配列 はジョルン・ハイン法(ハイン(Hein),1990)により配列した（ギャップ・ペナル ティ＝１１、ギャップ長・ペナルティ＝５、Ｋチュープル＝２）。 タンパク配列の比較 保存されたアミノ酸残基間の距離の比較に対する類似性インデックス（％）を 計算するために、６個のＩｇ−様ドメインと少なくとも４個のＦＮ−様反復を含 む幾つかの明確なタンパク質を、Ｉｇ−様ドメイン（Ｓ−Ｓブリッジを指すシス テイン類）及びＦＮ−様反復（トリプトファン及びチロジン／フェニルアラニン ）中の保存されたアミノ酸残基について配列した。これらの保存された位置の間 のアミノ酸残基の数を調べた。これを共通距離と呼ぶ。Ｌ１ファミリーのメンバ ー内でのこの距離の平均値、すなわち共通の距離と標準偏差（ＳＤ）を計算した 。ＳＤ値は次の整数まで丸められた。各プロテインに対する距離は平均値と比較 されそしてこの距離値が平均値±ＳＤ（＝共通距離）に等しかったときは、合致 するものと考えられた。１９の共通距離に対する合致数が各タンパクについて計 算された（類似インデックス＝合致数／１９×１００）。例えば、ＣＨＬ１タン パクでは、１６の距離値が共通距離に合致するか、すべての基準のうち３個は合 致しなかった。これから、ＣＨＬ１に対し、類似インデックス１６／１９すなわ ち８４％が得られる。 実施例１９ 細胞培養及びコス−１細胞中でのＣＨＬ−１もしくはＬ１の発現 クローンｐＸ＃２の４．４３ｋｂ挿入物をＳａｌＩで消化されたｐＸＭＤ１（ クルクセン(Kluxen)ら，1992、クルクセンとロベルト(Kluxen and Lobbert)，19 93)に連結した。マウスＬ１のｃＤＮＡ（ムース(Moos)ら，1988）のサブフラグ メント（ＥｃｏＲＩ（プラスミドポリリンカー）／ＰｖｕII bp 4048）をＴ４Ｄ ＮＡポリメラーゼで処理しそしてｐＸＭＤ１に連結した。 コス−１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ（０．１ ％グルコース）中、５％ＣＯ2を含む加湿空気を送って３７℃で維持した。ＤＥ ＡＥデキストラン仲介ＤＮＡトランスフェクションは一部修正を加えて記載され たように（クルクセン(Kluxen)ら，1992）行った。簡単に記せば、細胞を約１０ ，０００細胞／ｃｍ2で蒔いた。１日後に、ＤＭＥＭ（０．４５％グルコース） で２回洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）Ｎｕ−血清（ベクトン・ディッキンソン、 スイス）、０．４ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）ＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア ）、５０μＭクロロキン、及び１．２５μｇ／ｍｌＤＮＡ（１０ｃｍディッシュ 当たり４ｍｌ）を補給されたＤＭＥＭからなるトランスフェクション溶液で培地 を置換した。細胞は３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。次いで、 培地を除去し、細胞を１０％ジメチルスルホキサイド（ｖ／ｖ）を含むリン酸塩 緩衝化食塩水（ｐＨ７．３）中で２分間インキュベートした。ＤＭＥＭ（０．４ ５％グルコース）で２回洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び２０μ ｇ／ｍｌゲンタミシンを補給したＤＭＥＭを添加しそして細胞をこの培地でイン キュベートした。２４時間後に細胞をハンクの均衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中の０． ０１％トリプシンと０．０００４％ＥＤＴＡと共に３７℃で５分間インキュベー トして剥離し、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス（直径１１ｍｍ）を含む２４ 穴プレート（ファルコン）中に約２０，０００細胞／ｃｍ2の密度で再プレート し、そしてさらに２４時間インキュベートして免疫細胞化学用の試料とした。ウ エスタン・ブロット分析のために、細胞を組織培養ディッシュ上に再プレートし さらに４８時間インキュベートした。 ＰＣ１２細胞を、コラーゲン被覆組織培養ディッシュ上の１０％（ｖ／ｖ）ウ シ胎児血清及び５％（ｖ／ｖ）ウマ血清を補給されたＤＭＥＭ中に維持した。細 胞を神経成長因子（ＮＧＦ）で誘導するため、約５０％のコンフルーエンシーの ところで培地を単層から除き、１００ｎｇ／ｍｌの７ｓＮＧＦ（シグマ、スイス ）を補給された血清含量の少ない（５％ウマ血清）培地で置換した。２日のイン キュベーションの後、細胞を０．１％トリプシンと０．０４％ＥＤＴＡとインキ ュベートして剥離し、集めそしてＲＮＡ抽出に付した。 星状グリア細胞の一次培養は一部修正（ゲナード(Guenard)ら，1994）を加え マッカーシー(McCarthy)とデベリス(De Vellis)(1980)に従って調製し、そして １〜２週間イン・ビトロにおいた後免疫染色に使用した。稀突起グリア細胞の一 次培養はレング(Laeng)ら(1994)によって記載された通り調製し、１２日間イン ・ビトロで維持した。 実施例２０ アンチセンスＲＮＡの調製 クローンｐＸ＃２の４．４３ｋｂ挿入物をＳａｌＩ消化ｐＢＡIIＳＫ（ストラ タジーン）に連結し、ついでＡｐａＩ（ベクター）／ＡｖｒII（ｂｐ３３３０（ 図１８））断片を欠失させてこのタンパクの細胞外部分をコードする、ＣＨＬ１ のｃＤＮＡ断片を得た（図１８及び１９をみよ）。Ｌ１の同様な構築物を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理されたＬ１ｃＤＮＡ（ムース(Moos)ら，1988）のＥｃ ｏＲＩ（プラスミドポリリンカー）／ＥｃｏＮＩ（ｂｐ３３０４）断片のＳｍａ Ｉ消化ｐＢＳIIＳＫ- に連結することにより調製した。これらのプラスミドをＸ ｂａＩで消化しそして記載された（メルトン(Melton)ら，1984）ようにＴ７ＲＮ Ａポリメラーゼを用いて32Ｐ標識アンチセンスＲＮＡの合成に使用した。 ノーザン・ブロット分析 ポリ（Ａ）-ｍＲＮＡは出産直後の及び９日令のマウスの異なる組織から製造 業者の説明に従いＯｌｉｇｏｔｅｘTMダイレクトｍＲＮＡ法（クイアゲン社、デ ュッセルドルフ、ドイツ）を用いて調製された。ポリ（Ａ）-ｍＲＮＡ及びＲＮ Ａマーカー（ＲＮＡラダー、ギブコ／ＢＲＬ）を０．８％ホルムアルデヒド／ア ガロース・ゲルの電気泳動に付し、続いて２０×ＳＳＣ中毛細管移転（サザン(S outhern)(1975)）によりハイボンド−Ｎ膜（アマシャム）に移した。ＵＶ架橋（ UV-Stratalinker(登録商標)1800、Stratagene，La Jolla，CA）の後、膜に移転 し結合させらるＲＮＡの量はメチレンブルー染色（サムブルック(Sambrook)ら， 1989）によりコントロールした。６５℃で２時間プレハイブリダイゼーションし た後、この膜を、ＣＨＬ１−及びＬ１−特異的32Ｐ標識アンチセンスＲＮＡプロ ーブを用い、ハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、２．５×デンハルト 溶液、５０ｍＭのＮａ2ＰＯ4（ｐＨ６．５）、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤ ＴＡ、２μｇ／ｍｌの鮭***ＤＮＡ、５０％ホルムアルデヒド）、６５℃で一夜 ハイブリダイゼーションに付した。ついで、このフィルターを０．１×ＳＳＣ、 ０．１％ＳＤＳ中、６５℃、１時間の洗浄を３回行い、Ｘ線フィルムに曝した。 実施例２１ 大腸菌中での組換えＣＨＬ１タンパクの発現及び精製 第６番目のＩｇ−様ドメイン（ＩｇVI）及びＦＮ−様反復１，４，５（図１８ 及び１９ｂをみよ）をコードするＣＨＬ１の１．７ｋｂのｃＤＮＡ−断片（Ｍｓ ｃ１；ｂｐ１７９１（ベクタークローニング部位でλｇｔｌ１由来のＣＨＬ１ク ローンの５’末端に起源を有する）及びＢｓｍＡ１；ｂｐ３４９４）をｐＥＴ− ベクター（ストゥディアとモファット(Studier and Moffatt)，1986)のユニーク ＢａｍＨＩ制限部位中にサブクローニングした。このプラスミドの正確な配列は 配列決定により確認された。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をこのプラスミドで形 質転換した。組換えタンパクの発現及び陰イオン交換クロマトグラフィーによる 精製はアッペル(Appel)ら(1993)の方法に従って行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び クーマシー染色により、予想された分子量（７０ｋＤ）に主要バンドがみられ、 それは少なくとも全タンパク量の８０％を占めた（示されていない）。 組織分画 全組織の界面活性剤溶解物は４０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのフェニルメチ ルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１％のトライトンＸ−１００中で組織 をホモゲナイズすることにより調製されそして絶えず攪拌しながら４℃に３時間 維持した。その可溶性画分は１００，０００ｇで遠心分離することにより不溶性 物質から分離された。 膜画分の界面活性剤溶解物の調製のために、組織を１ｍＭのＮａＨＣＯ3（ｐ Ｈ７．９）、０．２ｍＭのＣａＣｌ2、０．２ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのスペル ミディン、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌの大豆トリプシンイ ンヒビター、１ｍＭのＰＭＳＦ及び０．５ｍＭのヨードアセトアミドの中で４℃ でホモゲナイズした。次いで、膜と可溶性画分を分離し、膜ペレットを可溶化緩 衝液（２０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．９）、０．１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭ のＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５％のトライトンＸ−１００、５μｇ／ｍ ｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌの大豆トリプシンインヒビター、１ｍＭのＰ ＭＳＦ及び０．５ｍＭのヨードアセトアミド）中に再懸濁した。 一時的にトランスフェクトされたコス−１細胞をＨＢＳＳで２回洗浄しそして ＨＢＳＳ中の１ｍＭのＥＤＴＡと共に３７℃で１０分間インキュベートした。つ いで、細胞を火に炙ったパストゥール・ピペットで剥離しそして２００ｇ、４℃ 、１０分間の遠心分離により集めた。この細胞を、２０ｍＭのトリス−塩酸（ｐ Ｈ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ ｍＭのヨードアセトアミド、１ｍＭのＰＭＳＦ及び１％のＭＰ−４０中で溶解し 、そして遠心分離（１３０００ｇ）により澄明な上清を得た。タンパクの測定は ブラドフォード(Bradford)(1976)により記載されたように行った。 ウエスタン・ブロット分析 タンパクは、還元条件下、８％又は１０％のスラブ・ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ（レミル(Laemmil)，1970）により分離し、そしてニトロセルローズ・フィル ター（０．４５μＭ、ＢＡ８５、シュライヒャーとシュル（Schleicher & Schue ll，ダセル、ドイツ）に移し、ファイスナー(Faissner)ら(1985)に従って、ＣＨ Ｌ１抗血清（ＥＣＬに対して１：５００、１：１００００に希釈）、Ｌ１ポリク ローナル抗体（ＥＣＬに対して１：１０００、１：１５０００に希釈）、又はモ ノクローナル抗体４１２（ＥＣＬに対して１：１０００、１：１００００に希釈 ）及びアルカリホスファターゼ共役二次抗ウサギ又は抗ラットＩｇＧを用いる免 疫検出に付した。結合された抗体は、製造業者の説明書に従って、ＥＣＬウエス タン・ブロッティング・ディテクション試薬（アマシャム）及びＸ線フィルムを 用い、又は発色基質としてＢＣＩＰ及びＮＢＴを用いて、高感度化学発光（ＥＣ Ｌ）法により検出した。 実施例２２ 酵素結合イムノソルベント試験 酵素結合イムノソルベント試験（ＥＬＩＳＡ）は、タンパクが１００ｎｇ／ｍ ｌの濃度で被覆されたことを除き、ハスマン(Husmann)ら(1992)によって記載さ れた通り行った。ＣＨＬ１抗血清は１：２５０〜１：２×１０6の間で数段階希 釈して使用した。 ＣＨＬ１の脱グリコシレーション ７日令マウス由来の脳組織ホモゲネートの界面活性剤溶解物（２００μｌ、６ ｍｇ／ｍｌのタンパク濃度）を遠心分離により可溶性画分と不溶性物質に分け（ 組織分画をみよ）そして０．５ユニットのＮ−グリコシダーゼＦ又は２．５ユニ ットのＯ−グリコシダーゼ、又は製造業者の説明書（ベーリンガー・マンハイム 、ドイツ）に従った濃度における両方の酵素と共にインキュベートした。溶解物 を１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。このタンパクをニトロセルロ ーズに移しそして組換えＣＨＬ１タンパク断片に対するＣＨＬ１抗血清（１：５ ００希釈）（図１８をみよ）と共にインキュベートした。 免疫沈降 ９日令マウス由来の脳組織ホモゲネートの界面活性剤溶解物の可溶性画分（３ ００μｌ，５ｍｇ／ｍｌタンパク濃度）（組織画分をみよ）をＣＨＬ１抗血清又 はＬ１に対するポリクローナル抗体の１０μｌと、１％ＮＰ４０と３０μｌのＧ −セファローズ（ファルマシア／ＬＫＢ）を含む５ｍｌの緩衝液（２０ｍＭのト リス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ）の中で ５℃で一夜インキュベートした。０．１％ＮＰ４０、０．０５％ＳＤＳを含む緩 衝液ついで２０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．４）で逐次洗浄した後、このセフ ァローズ・ビーズを１０分間、５×試料緩衝液（２５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐ Ｈ６．６）、１０％ＳＤＳ、５０％グリセリン、０．５％ブロムフェノールブル ー、２５％Ｂ−メルカプトエタノール）中で煮沸し、そして上清を１０％ゲル上 でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。このタンパクをニトロセルローズに移しそ してウエスタン・ブロット分析により、Ｌ１に対するポリクローナル抗体、ＣＨ Ｌ１抗血清、又はモノクローナル抗体４１２を用いて検出した。 間接免疫蛍光 細胞表面染色（シュニッツァーとシャックナー(Schnitzer and Schachner)198 1）のために、カバーガラス上にプレートされたＣＨＬ１−及びモック（ベクタ ーのみ）−トランスフェクトされたコス−１細胞を、一次抗体（ＣＨＬ１抗血清 （１：１００希釈されたもの）又はＬ１ポリクローナル抗体（１：２００希釈さ れたもの））と共に、１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭのヘペス（ｐＨ７．３）、 及び０．０２％ＮａＮ3を含むＤＭＥＭ中、室温で３０分間インキュベートし、 次いで二次抗体とインキュベートした。免疫染色をした後、細胞をリン酸緩衝化 食塩水（ｐＨ７．３）中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして２．５％ 沃化カリウムを含むモビオール(Moviol)( ヘキスト）に固定した。星状グリア細 胞及び稀突起グリア細胞の二重免疫蛍光染色のために、細胞表面抗原に対する一 次抗体をトランスフェクトされたコス-1細胞について記載されたようにインキュ ベートした。続いて細胞間抗原に対する一次抗体と細胞とのインキュベーション を、この細胞を−２０℃でメタノール処理して透過性を増大させた後、実施した 。 実施例２３ イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション ＣＨＬ１及びＬ１の対応する部分から等サイズのジゴキシゲニン−標識化アン チセンスｃＲＮＡプローブを作成するために、ノーザン・ブロット分析のためと 同様な構築物を使用した。センスプローブは反対向きに挿入物を持つ同様の構築 物から作成した。ｃＲＮＡプローブはすべてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用い、つ いでアルカリ処理して平均長２５０ヌクレオチドの断片を得ることにより作成し た。イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションは記載されたように行った(バー チ(Bartsh)ら，1992、ドリース(Dorries)ら,1994)）。 結果と討論 ＣＨＬ１ｃＤＮＡの同定 細胞接着分子Ｌ１をコードするｃＤＮＡクローンのためのλｇｔｌ１発現ライ ブラリーを、脳由来の免疫精製Ｌ１（タケ(Tacke)ら，1987）に対して形成させ たポリクローナル抗体を用いてスクリーニングすることにより、クローン３１１ が同定された。これはＬ１に相同的な部分的ｃＤＮＡ（リップマンとピアソン(L ipman and Peason)(1985)によれば３４．１％）及び細胞質部分を含む７０４個 のアミノ酸をコードする２１１２塩基対（ｂｐ）のオープン・リーディング・フ レームを含んでいた。ｃＤＮＡクローンの全長を単離するため、このクローンの １個のＤＮＡ断片を別のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用 した。６個の独立のクローンが単離された。２個のクローンはＬ１の近いホモロ グ（ＣＨＬ１）の全コード領域を含む４．２及び４．４ｋｂの挿入物を含んでい た。４．４ｋｂの挿入物を含むクローンをさらに研究した。 ＤＮＡ並びに演繹されたアミノ酸配列及び構造的特徴 この４．４ｋｂ挿入物は５’側に２９５ｂｐの翻訳されない領域、３６２７ｂ ｐのオープン・リーディング・フレーム、そして３’側に５１８ｂｐの翻訳され ない領域をコードする（図１８）。その３’末端にはオリゴ（Ａ）領域があるけ れども、この配列の上流には明確なコンセンサス・ポリアデニル化シグナルが欠 失している。ＡＵＧ開始コドン（２９６位、図１８）のフランキング配列は翻訳 開始のための最適共通配列には一致しない(コザック(Kozak)，1987)。しかしな がら、このＡＵＧは二組の証拠に基づき翻訳の開始コドンと考えられる。３個の リーディング・フレームのすべてで停止コドンがその上流に先行し、そして残基 ２４又は２５（フォンハイジン(von Heijne)(1986)のアルゴリズムによれば、そ れぞれ、８．６５及び６．４０のスコア）後に、予想される開裂部位を持つ潜在 的シグナル配列が続く（図１８）。 オープン・リーディング・フレームの翻訳は計算分子量１３４．９ｋＤのそし て完全な膜グリコプロテインの特性を持つ１２０９個のアミノ酸を生ずる。仮定 的な細胞外ドメインは１０８１アミノ酸からなり、Ｎ−グリコシレーションのた めの潜在的部位が１８あり（図１８及び１９ａ）、そして６０を越える潜在的Ｏ −グリコシレーション共通部位を持ち（示していない）（ピサノ(Pisano)ら，19 93）、カイトとドゥーリトル(Kyte and Doolittle)(1982))によるハイドロパシ ー(hydropathy)分析により判断されるように、２３アミノ酸の膜貫通ドメインが 続く（図１９ｃ）。このドメインは極性残基がＮ−末端にフランクしそしてのＣ 末端には塩基性アミノ酸がフランクし、停止移転シグナルと一致する（図１８） 。細胞内領域は１０５アミノ酸残基から構成される。 細胞外領域はＬ１ファミリーの特徴−すなわちＩｇ−様ドメインに相同性をも つ６８５アミノ酸の広がり及びＦＮ−様反復に相同性をもつ４７２アミノ酸の広 がり（図１及び２ａ）−である反復ドメインの２個の主要な構造モチーフを含む 。６個のＩｇ−様ドメインはすべて、相互に４７〜５４アミノ酸だけ離れて位置 する特徴的なシステイン残基の対を含んでいる（図１９）。各ドメインの第２の システイン残基の付近の保存されているアミノ酸のＣ２−型クラスター（ＤＸＧ ＸＹＸＣＸＡＸＮ）と結合しているβ−鎖Ｂの末端にある保存されているプロリ ン（第６Ｉｇ−様ドメインの場合を除く）はＩｇ−様ドメインをＣ２−セットに 割り当てる（ウイリアムズとバークレー(Williams and Barclay)，1988）。Ｉｇ −様ドメインと膜展開領域の間には、フィブロネクチンのＦＮ−様反復に相同な ４個のドメインがある（コーンブリート(Kornblihtt)ら，1985）。約１００のア ミノ酸のこれらの領域はそれぞれ、高度に保存されたトリプトファン（第１ＦＮ −様反復を除く）及びＮ−及びＣ−末端領域にそれぞれチロシン／フェニルアラ ニン残基を含む。第５ＦＮ−様反復はＬ１ファミリーの他のメンバーに対照的に 、未発達の１／２ＦＮ−様反復であることは興味深い（図１８）。この半ＦＮ− 様反復は、その中の一つが全ＦＮ−様反復を含む幾つかの選択的スプライス型の の一つであるかどうかはノーザン・ブロット分析以外の方法により決定されるべ き課題である。選択的スプライスに対する証拠は６個の独立に単離されたクロー ンの制限分析では発見されなかった（示されていない）ことはこの論旨において 注目すべきことである。第５のＦＮ−様ドメインの選択的スプライスはＮｒ−Ｃ ＡＭ／ＢＲＡＶＯについて観察された。ここでは第５ＦＮ−様反復を欠失してい るｃＤＮＡのイソ型が単離された（グルメト(Grumet)ら，1991、カイエム（Kayy em）ら，1992）。ニワトリのニューロファシンに第５ＦＮ−様ドメインが存在し ないこと（フォークマー(Volkmer)ら，1992）は、選択的スプライスによること も極めてありそうである。そのラットホモログであるアンキリン(ankyrin)−結 合グリコプロテイン（ＡＢＧＰ）（デイビス(Davis)ら，1993）が、第５ＦＮ− 様ドメインを含むからである。このようにして、ＣＨＬ１はＬ１ファミリーに新 たな構造的特徴を加える、すなわち僅か４個と１／２のＦＮ−様反復が発現され る（図１９）。 ＣＨＬ１の別の構造的特徴は、第２のＩｇ−様ドメインの中にＲＧＤ配列（ア ミノ酸１８５〜１８７）が存在することである（図１８）。このトリペプチドは フィブロネクチンの第１０タイプIII ドメイン内の細胞接着部位として最初に同 定され(ピヤシュバッハーとルソラーチ(Pierschbacher and Rusolahti)，1984) そしてインテグリン結合に寄与する（レビューとしては、ルソラーチとピヤシュ バッハー(Rusolahti and Pierschvbacher)，1987）。ＦＮ−様反復の三次元構造 分析はＲＧＤモチーフがβ−鎖Ｆ及びＧの間に局在していることを示した（メイ ン(Main)ら，1992）。このモチーフはＬ１ファミリーの他のメンバーにも見いだ される。ニワトリＮｇ−ＣＡＭの第３のＦＮ−様反復（ブルグーン(Burgoon)ら ，1991）及び種ホモログであるニワトリのニューロファシン及びラットのＡＢＧ Ｐの第３ＦＮ−様反復では、ＲＧＤ配列はβ−鎖ＦとＧの間の同じ位置に見いだ される。ＲＧＤモチーフはＬ１（マウスとラット（ＮＩＬＥ）のＬ１に２個、そ してヒトＬ１に１個（ムース(Moos)ら，1988、ラビンとレモン(Hlavin and Lemm on)，1991、プリンス(Prince)ら，1991））にも見いだされる。ＬＩＲＧＤ配列 はすべて第６Ｉｇ−様ドメインに見いだされるが、フィブロネクチンのＦＮ−様 モデュールにあるＲＧＤとは異なったアミノ酸環境の中で見いだされている。Ｌ １におけるように、ＣＨＬ１中のトリペプチドは第２Ｉｇ−様ドメインのβ−鎖 Ｅの上に局在している。これらのタンパク中のＲＧＤ配列が機能的に活性である かどうかは現在のところ知られていない。この文脈で、第２のＦＮ−様ドメイン にＲＧＤモチーフを含むＦ３／Ｆ１１ファミリーの１メンバーである（ブリュー メンドルフとラチェン(Bruemmendorf and Rathjen)，1993、1994）ＴＡＧ−１（ ファーレー(Furley)ら，1990）により誘導されるニューライト伸長が、Ｂ、イン テグリン及びＬ１に依存する（フェルゼンフェルト(Felsenfeld)ら，1994）こと は注目すべきである。この観察はＴＡＧ−１の第２のＦＮ−様反復とβ1インテ グリンの間の直接の物理的相互作用の可能性を提起する。 ＣＨＬ１は第６Ｉｇ−様ドメインのβ−鎖ＣにあるＤＧＥＡ配列（アミノ酸５ ５５〜５５８）をも含む（図１８）。この配列はＬ１ファミリーの他のメンバー には見いだされない。このＤＧＥＡ配列もこのモチーフを含むタイプＩコラーゲ ンのα2β1インテグリン認識にも関与している（スターツ(Staatz)ら，1991）。 Ｉｇスーパーファミリーの他の認識分子とのＣＨＬ１の構造的類似性 ＣＨＬ１のアミノ酸配列を翻訳されたＥＭＢＬ遺伝子配列データベースと比較 すると、ＣＨＬ１はヒト脳で以前に同定された１０９アミノ酸長鎖に８７．２％ 同一でありそして９３アミノ酸長鎖に７９．６％同一である（寄託番号ＨＳ２４ ３１及びＨＳＸＴ０２６１０（アダムズ(Adams)ら，1992，1993）。このように して、ヒトには高度に保存されたＣＨＬ１分子があるようにみえる。翻訳された ＥＭＢＬ遺伝子配列データベースから取られた、マウス、ヒト、及びラットのＬ １／ＮＩＬＥ、ニワトリのＮｇ−ＣＡＭ、ニワトリのＮｒ−ＣＡＭ、ゼブラフィ ッシュのＬ１．１（トンギオルギ(Tongiorgi)ら，1995）、ニワトリのニューロ ファシン/ ラットのＡＢＧＰ、ショウジョウバエのニューログリアン（ビーバー (Bieber)ら，1989）、マウスのＦ３／ニワトリのＦ１／ヒトのＣＮＴＮ１（ゲン ナリニ(Gennarini)ら，1989、ランスト(Ranscht)，1988、ブリューメンドルフ（ Bruemmendorf）ら，1989、ベルグルントとランスト(Berglund and Ranscht)，19 94）、ラットＴＡＧ−１／ニワトリのアクソニン−１／ヒトＴＡＸ−１（ファー レー(Furley)ら，1990、ハスラー(Hasler)ら，1993、ツィオトラ(Tsiotra)ら ，1993）、及びラットＢＩＧ−１／マウスＰＡＮＧ（ヨシハラ(Yoshihara)ら，1 994、コネリー(Connelly)ら，1994）の配列を、ＣＨＬ１と比較した。この比較 は以下の表１に示す。 ＣＨＬ１はニワトリのＮｇ−ＣＡＭ（細胞外ドメインで３７％アミノ酸同一、 表１）及びマウスＮｒ−ＣＡＭ（細胞内ドメインで６４％アミノ酸同一、表２） に最も類似している。しかしながら、同一性の程度は、特に細胞外部分において は、これらのタンパクを種ホモログとみなすには十分でない。最近、マウスＮｒ −ＣＡＭの部分的ｃＤＮＡクローンが同定された（モスコソとサネス(Moscoso a nd Sanes)，1995）。マウスＮｒ−ＣＡＭはニワトリのＮＲ−ＣＡＭとほとんど 同一（９９％）である（表２をみよ）。従って、ＣＨＬ１はマウスにおけるＮｒ −ＣＡＭのホモログではないようである。ＣＨＬ１はＬ１、Ｎｒ−ＣＡＭ、ニュ ーロファシン（モスコソとサネス(Moscoso and Sanes)，1995）及びＣＨＬ１か らなるマウスのＬ１ファミリーの、ヒトにおいて高度に保存されている種ホモロ グを有する（アダムス(Adams)ら，1992，1993）、第４のメンバーである。 ニワトリ及びマウスのＮｒ−ＣＡＭ及びニワトリとマウスのニューロファシン の類似性（それぞれ、９９％及び８７％、表２）を考えると、マウスＬ１とニワ トリＮｇ−ＣＡＭは細胞内ドメインで僅か６１％の配列同一性しか示さない（表 ２）から、これらが種ホモログであることは到底ありそうにない。むしろ、マウ スにおけるＬ１ファミリーの、高度に保存された細胞内ドメインを有する、第５ のメンバーとしてＮｇ−ＣＡＭの存在を予想すべきである。マウスＬ１はニワト リＮｇ−ＣＡＭとの異種親和性相互作用の上にニューライト成長を促進する（レ モン(Lemmon)ら，1989）ことは興味深い。このことはＬ１ファミリーのメンバー が相互に相互作用をすることを示唆する。 Ｌ１ファミリーメンバーの全体的構造における類似性のほかに（表１及び表３ ）、最も高度に保存されている領域が細胞質ドメインで同定された（図２０）。 この驚くべき相同性はこれまで同定されたすべての種におけるＬ１ファミリーの メンバーについて明らかである。細胞内ドメインを含むこれらのメンバーとして は、Ｌ１、ＣＨＬ１、Ｎｒ−ＣＡＭ、Ｎｇ−ＣＡＭ、ニューロファシン、ニュー ログリアン、及びゼブラフィッシュＬ１．１及びゼブラフィッシュＬ１．２の部 分配列も（トンギオルギ(Tongiorgi)ら，1995）及びマウスのＮｒ−ＣＡＭ及び ニューロファシン（モスコソとサネス(Moscoso and Sanes)，1995）（表２）が 挙げられる。この領域内には二つの広がりがあり、一方は原形質膜にかかるセグ メントに近くそして部分的にその内部に位置し、他方はそのＣ−末端に位置する が(図２０のＩ、III)、この二つはほとんど同一である。Ｌ１、Ｎｇ−ＣＡＭ、 Ｎｒ−ＣＡＭ、ニューロファシン、Ｌ１．１及びＬ１．２に保存されているがＣ ＨＬ１には保存されていない（表２）もう一つのアミノ酸の広がりは、選択的ス プライスによって発生しそしてニューロンでのみ発現されるＲＳＬＥモチーフ（ 図３におけるII）を含むものである（グルメト(Grumet)ら，1991、ミウラ(Miura )ら，1991、フォークマー(Volkmer)ら，1992）。細胞内領域はこれらのプロテイ ンの間で極めて高度に保存されているから、Ｌ１ファミリーのすべてのメンバー はニューライト伸長を活性化するため同一のシグナル伝達経路を利用することが できる。ＡＢＧＰ、Ｌ１、及びＮｒ−ＣＡＭの細胞質ドメインはアンキリン連結 細胞認識と相互作用し細胞骨格の足場物質に至ることが証明された(デイビス(Da vis)ら，1993、デイビスとベネット(Davis and Bennett)，1994)。 実施例２４ Ｌ１ファミリーのメンバーを分類するための細胞外ドメインにおける構造的要求 の同定 Ｌ１ファミリーの資格に対する一般的基準をさらに研究するため、われわれは Ｉｇ−様ドメイン（Ｓ−Ｓブリッジを指すシステイン）及びＦＮ−様反復（トリ プトファン、チロシン／フェニルアラニン）中の高度に保存されたアミノ酸の位 置をＩｇスーパーファミリーの幾つかのメンバーについて研究した（表３）。６ 個のＩｇ−様ドメインと少なくとも４個のＦＮ−様反復（Ｌ１ファミリー及びＧ ＰＩ結合Ｆ３／Ｆ１１サブグループ（ブリューメンドルフとラチェン(Bruemmend orf and Rathjen)，1993）を含む分子は、これらの保存されているアミノ酸を隔 てているアミノ酸の数が極めて一定であることを示す。５種類の異なる距離パラ メータが考察された。 １）各Ｉｇ−様ドメインのシステイン（Ｓ−Ｓ）ブリッジを形成する保存された システインを隔てているアミノ酸の数（表３、カラムＩｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ４、 Ｉｇ５、及びＩｇ６）。 ２）一つのＩｇ−様ドメインの第２のシステインと次のＩｇ−様ドメインの第１ のシステインの間のアミノ酸の数。これは二つの隣接するＩｇ−様ドメインの間 の距離を反映する（表３、カラム１−２、２−３、３−４、４−５及び５−６） 。 ３）第６Ｉｇ−様ドメインの最後に保存されたシステインとＦＮ−様反復の保存 されたトリプトファンとの間のアミノ酸の数。これはＩｇ−様ドメイン−モデュ ールとＦＮ−様反復−モデュールの間の距離を反映する（表３、カラムＩｇＧ− ＦＮ１）。 ４）個々のＦＮ−様反復それぞれの保存されているトリプトファン、チロシン／ フェニルアラニンの間のアミノ酸の数（表３、カラムＦＮ１、ＦＮ２、ＦＮ３、 及びＦＮ４）。 ５）一つのＦＮ−様反復のチロシン／フェニルアラニンと次のＦＮ−様反復のト リプトファンの間のアミノ酸の数。これは二つの隣接するＦＮ−様反復の間の距 離を反映する（表３、カラムＦＮ１−ＦＮ２、ＦＮ２−ＦＮ３、及びＦＮ３−Ｆ Ｎ４）。 Ｌ１−様分子の比較のための高度に厳格な条件を得るべく、おそらく選択的ス プライスのためと思われる平均からの逸脱を明らかに示した幾つかの数値につい ては平均距離及び標準偏差の計算には考慮しなかった（ニューログリアン：Ｉｇ ２，２−３：Ｎｒ−ＣＡＭ及びＡＢＧＰ：Ｉｇ６−ＦＮＩ；Ｆ３：Ｉｇ４，ＦＮ ３；Ｎｇ−ＣＡＭ；ＦＮ２，ＦＮ３（表３、*でマーク））。第１及び第６Ｉｇ −様ドメインのＳ−Ｓブリッジ間のアミノ酸の数（Ｉｇ１：標準偏差（ＳＤ）＝ ３、Ｉｇ６：ＳＤ＝４）及びＦＮ−様反復３及び４の保存されたトリプトファン 、チロシン／フェニルアラニンのアミノ酸数（ＦＮ３：ＳＤ＝４、ＦＮ４：ＳＤ ＝４）は僅かに変動するが、他の距離パラメータはすべて異なる分子に対して顕 著な程一定に止まっている（ＦＮ１−ＦＮ２：ＳＤ＝０、ＦＮ２及び２−３：Ｓ Ｄ＝２（表３））。これらの基準に基づき、われわれは幾つかのＩｇ−様分子に ついて表３にリストした平均値に関して類似性インデックス（材料と方法をみよ ）を計算した。Ｌ１、ＣＨＬ１、Ｎｇ−ＣＡＭ、Ｎｒ−ＣＡＭ、ＡＢＧＰ、Ｌ１ ．１、ＴＡＧ−１及びＢＩＧ−１について、７４〜９５％の類似性インデックス が得られた（表３）。ショウジョウバエ・ニューログリアンについては僅かに低 い数値が得られた（６６％）が、おそらく脊椎動物と昆虫の間の進化の距離を反 映するものであろう。Ｆ３とその種ホモログは、特にそれらのＩｇ−様ドメイン において、保存性を失っているが、それでも６３％の類似性インデックスを示し ている。しかしながら、強く保存された共直線性の基礎となる一部の保存された アミノ酸の広がりは（例えば、第１ＦＮ−様反復の末端にあるＦｘＶｘＡｘＮｘ ｘＧ（８ｘ）Ｓ（４ｘ）ＴｘｘＡｘＰｘｘｘＰ又は第３のＦＮ−様反復（示され ていない）の最後の２個のβ−鎖の間のＮｘｘＧｘＧＰｘＳ）、Ｆ３がＬ１ファ ミリーに属するという概念を支持する。隣接ドメイン（Ｉｇ−様ドメイン又はＦ Ｎ−様反復）の間のアミノ酸の数はこれらの分子の中ではさらに一層保存されて いることは興味深い。このことは個々のドメイン間の距離が重要な構造的特徴で あること、すなわち神経認識分子の機能にとって決定的であることを示す（表３ 、カラム１−２、２−３、３−４、４−５、５−６、ＦＮ１−ＦＮ２、ＦＮ２− ＦＮ３、及びＦＮ３−ＦＮ４）。このようにして、順序（共直線性）及び間隔(s pacing)のこの高度の保存性はＬ１ファミリーメンバーの細胞外ドメインをより 一般的に定義するために使用することができる。ここに定義された基準を用いれ ば、これらはＮ−末端に６個のＩｇ−様ドメインそれに続き４個のＦＮ−様反復 からなるモデュールを含むことになる。われわれはこの構造的特徴をＬ１ファミ リー・カセットと呼ぶことにする。 このようにして、Ｌ１ファミリーのメンバーはすべて、Ｌ１ファミリー・カセ ットの特徴を共有しそして付加的に高度に保存されたアミノ酸を共有する。これ らの結果はこれらの分子がＬ１ファミリー・カセットを含む共通の祖先であるＬ １−様分子から分かれてきたことを示唆する。この祖先分子はより複雑な神経系 において多様化する細胞相互作用に対する進化的要求を受け入れるため遺伝子複 製を通じてその機能のポテンシャルを拡大させたかも知れない。こうして、一般 的Ｌ１ファミリーは、変動し得る第５ＦＮ−様反復、膜貫通ドメイン、及び高度 に保存された細胞内ドメインを含む「古典的」Ｌ１ファミリー・メンバー（Ｌ１ 、ＣＨＬ１、Ｎｇ−ＣＡＭ、Ｎｒ−ＣＡＭ、ニューロファシン、ニューログリア ン、Ｌ１．１）とその共通の特徴がＧＰＩによる膜への連結でありそして変動可 能な第５ＦＮ−様反復がこれまでのところ同定されていない、Ｆ３／Ｆ１１サブ グループ（Ｆ３／Ｆ１１／ＣＮＴＮ１、ＢＩＧ−１／ＰＡＮＧ、及びＴＡＧ−１ ／アクソニン−１／ＴＡＸ−１）に分けることができる。両サブグループの細胞 外ドメインはＬ１ファミリー・カセットを含む。 Ｉｇ−スーパーファミリーの他のメンバー、例えば、Ｎ−ＣＡＭ（カニンガム (Cunningham)ら，1987、バルテルス(Barthels)ら，1987）、ＭＡＧ（アルクイン ト(Arquint)ら，1987、ライ(Lai)ら，1987、ザルツォル(Salzor)ら，1987）、ニ ューロマスクリン( カンラ(Kanla)ら，1993)、及びｒｓｅ（マーク(Mark)ら，19 94）又はフィブロネクチン（コーンブリート(Kornblihtt)ら，1985）は、Ｉｇ− 様ドメイン及び／又はＦＮ−様反復を含むが、はっきりと異なる距離パラメ ータを示す。このことはこれらが相互にそしてＬ１ファミリーのメンバーにも遙 かに弱く関係していることを示す（表３）。ヒト白血球の共通抗原−関連遺伝子 （ＨＬＡＲ）（シュトロイル(Streull)ら，1988）及び結腸直腸ガンに欠失して いる腫瘍抑圧遺伝子産物（ＤＣＣ）（フィアロン(Fearon)ら，1990）が距離パラ メータによれば（それぞれ、４２％及び５０％類似性インデックス）Ｌ１ファミ リーに近い関係にあることは興味深い。保存されたアミノ酸を精査すると、ＤＣ Ｃは第５及び第６Ｉｇ−様ドメインを失っているようにみえるが、ＤＣＣはフィ アロン(Fearon)ら（1990）及びピアシール(Pierceall)ら(1994)によって以前に 示唆されたＮ−ＣＡＭによりもＬ１ファミリーに一層近い関係にあることが実際 に明らかになる。最近の研究により、ＤＣＣが脳中で優勢に発現されそしてラッ トＰＣ１２細胞のニューライト成長がＤＣＣ−トランスフェクトされその細胞表 面上でそのタンパクを発現している線維芽細胞の基質の上で刺激されることが示 されている（ピアシール(Pierceall)ら(1994)）。ＨＬＡＲも比較的高い類似性 インデックスを示すが、そのＬ１ファミリーへの関係はそれ程明らかでない。 実施例２５ ＣＨＬ１ｍＲＮＡ及びタンパクの組織内分布 ＣＨＬ１がＬ１ファミリーの他のメンバーと神経系で優勢な発現を共有するか どうかを研究するため、われわれは種々の組織におけるＣＨＬ１の発現をｍＲＮ Ａ及びタンパクの各レベルで分析した。ノーザン・ブロット分析で、ＣＨＬ１リ ボプローブはＬ１プローブで検出されるｍＲＮＡのサイズ（約６ｋｂ）（タケ(T acke)ら，1987）よりも有意に大きい約８ｋｂの優勢なｍＲＮＡバンドとハイブ リッドを形成した（図２１）。より小さなそしてより弱いＲＮＡバンド（図２１ ａ、レーン３）はおそらくリボゾームＲＮＡとのクロスハイブリッド形成による 可能性が高い。８ｋｂＲＮＡは小脳、脳マイナス小脳、脊髄で検出されたが、後 根神経節（ＤＲＧ）では検出されなかった（図２１ａ）。対照的に、Ｌ１リボプ ローブはＤＲＧ由来のＲＮＡで強いシグナルを示した（図２１ａ）。ＣＨＬ１ｍ ＲＮＡは９日令ラットの小脳及び６日令ラットの脊髄でも検出可能であったが、 ＮＦＧの存在又は不存在下に維持されたラットＰＣ１２細胞又はコス−１細胞中 では検出されなかった（図２１ｂ）。分析された他の組織（胸腺、肺、肝臓、小 腸、脾臓及び膵臓）すべてにおいて、シグナルは検出できなかった（図２１ａ） 。 ＣＨＬ１タンパクを同定するために、ＣＨＬ１タンパクの細菌により発現させ た断片に対する抗体を作成した。既知の他のＬ１ファミリーのメンバーに高い相 同性をもつ排除領域(excluding regions)、例えば膜貫通進展領域または細胞内 領域である、１．７ｋＤのｃＤＮＡ断片で第６Ｉｇ−様ドメイン及び４個のＦＮ −様反復（図１８及び１９ｂ）を表す断片をｐＥＴ発現ベクターにクローニング した。発現により得られたタンパク断片は、陰イオン交換クロマトグラフィーに より精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にクーマシー・ブルー染色をすることにより７ ０ｋＤのバンドを生じた。ウエスタン・ブロット分析（図２２ａ）及びＥＬＩＳ Ａ（示されていない）により、２頭のウサギ由来の抗血清はＣＨＬ１タンパク断 片と反応したが精製したＬ１、Ｎ−ＣＡＭ又はＭＡＧとは反応しなかった。ＣＨ Ｌ１ペプチド又はＣＨＬ１断片の分解産物と共精製された細菌性タンパクとの反 応も一部観察された（図２２ａ、レーン４）。 抗体の特異性をさらに検討しそしてそれらが天然の細胞表面に発現されるＣＨ Ｌ１を認識するか否かを決定するため、一時的にトランスフェクトさせたコス− １細胞をその抗体で試験した。免疫細胞化学により、ＣＨＬ１−トランスフェク ト細胞上でのＣＨＬ１の細胞表面発現が明らかにされた、しかし、同じベクター を用いてモック−トランスフェクトされた細胞上では発現は認められなかった（ 図２３）。これらの結果も仮定的シグナル配列が機能しており、そしてオープン ・リーディング・フレームが正しいことを証明するものである。 最初のＣＨＬ１ｃＤＮＡクローンはＬ１由来の免疫親和性で精製した脳に対す るポリクローナル抗体を用いてスクリーニングすることにより発現ライブラリー から単離されたが、Ｌ１の組換え的に発現させたＩｇ−様ドメインに対するＬ１ 抗体の別の調製物とＣＨＬ１−トランスフェクト細胞との反応は観察されなかっ た（示されていない）。ＣＨＬ１分子（図１９）の細胞外部分に対するＣＨＬ− １抗体もＬ１−トランスフェクト細胞とは反応しなかった（示されていない）。 従って、発現ライブラリーのスクリーニングに使用したＬ１ポリクローナル抗体 は、ＣＨＬ１とＬ１の間で最も相同性の高いＣＨＬ１のＣ−末端の細胞内部分と 反応した可能性がある。 幾つかの組織（９日令マウスの脳、肝臓、肺、腎臓、そして小腸、図２３ｂ） 中の免疫反応性のタンパクを同定するためにＣＨＬ１抗血清を使用した。０．５ ％トライトンＸ１００に可溶及び不溶な粗製膜画分をウエスタン・ブロッティン グにより分析した。Ｌ１に対するポリクローナル抗体を対照として使用した。Ｃ ＨＬ１抗体は脳膜の不溶性及び可溶性画分中の１８５、１６５、及び１２５ｋＤ の３個の明確なバンドを認識した。１８５ｋＤバンドは可溶性画分では弱く検出 できるだけであり、そして１２５ｋＤバンドは不溶性画分中でさらに弱かった（ 図２３ｂ、レーン１及び２）。このことは、１８５ｋＤバンドがおそらくＣＨＬ １の膜結合型であるのに対し、１２５と１６５ｋＤ型はおそらくプロテアーゼに より切断された断片であることを示す。免疫反応性バンドの同様なパターンがＬ １（ファイスナー(Faissner)ら，1985、サドゥール(Sadoul)ら，1988）、Ｎｇ− ＣＡＭ（グルメト(Grumet)ら，1984）、及びＮｒ−ＣＡＭ（カイエム(Kayyem)ら ，1992）について観察された。しかしながら、第３ＦＮ−様ドメインにおけるプ ロテアーゼによる切断のための２塩基性共通配列（Ｌ１：「ＳＫＲ」、Ｎｇ−Ｃ ＡＭ：「ＳＲＲ」、Ｎｒ−ＣＡＭ：「ＳＲＲ」、Ｎｒ−ＣＡＭ：「ＳＲＲＳＫＲ 」）はＣＨＬ１には存在しない。Ｌ１ファミリーの他のメンバーのように、ＣＨ Ｌ１は発育の後期においてのみ発現されることが見いだされた。ウエスタン・ブ ロット分析では胚令１５日前には脳で検出されなかった（示されていない）。５ ０ｋＤの免疫反応性バンドが全肝臓組織の界面活性剤可溶性画分中に検出された 。ＣＨＬ１−特異的ｍＲＮＡはノーザン・ブロット分析により肝臓にみられなか ったから（図２２ａ）、このバンドはＣＨＬ１抗体がＣＨＬ１関連タンパクと一 部クロス反応をしていることによる可能性がある。ＣＨＬ１免疫反応性は試験さ れた他の組織でも検出することができなかった（図２３ｂ）。 ＣＮＳでは、Ｌ１ファミリーのメンバーがニューロンにより優勢に発現される 。従って、われわれはＣＨＬ１がＬ１とこの発現のパターンを共有するかどうか に興味があった。イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション実験を行い、若い生 後のマウスの網膜、視神経、小脳皮質におけるＣＨＬ１とＬ１を合成する細胞を 同定した。７日令マウスの網膜では、Ｌ１（図２４ａ）とＣＨＬ１ｍＲＮＡ（図 ２４ｂ）が神経節細胞により発現される。Ｌ１転写物は内部核層に局在する無軸 索細胞及び水平細胞中でさらに検出可能であった（図２４ａ）。ＣＨＬ１ｍＲＮ Ａは対照的に核間層の内部(すなわち、ビトリード(vitread))境界に局在する僅 かな細胞において時たま検出されるにすぎなかった（図２４ｂ）。視神経のグリ ア細胞は検出可能なレベルのＬ１転写物を含んでいなかった（図２４ａ）。全く 対照的に、ＣＨＬ１ｍＲＮＡは視神経の近位（すなわち、網膜の近く）に局在す るグリア細胞により強く発現され（図２４ｂ）、そしてこの神経のより遠位の領 域に局在するグリア細胞では低レベルのＣＨＬ１発現がみられた（図２４ｂ）。 ２週令マウスの小脳皮質では、Ｌ１ｍＲＮＡは分子層に局在する星状及びかご 状細胞中、及び内部顆粒層に局在するゴルジ細胞及び顆粒細胞中で検出可能であ った（図２４ｄ）。切片をＣＨＬ１アンチセンスｃＲＮＡプローブとハイブリッ ド形成をさせたとき、同じ細胞型が標識された（図２４ｅ）が、例外としてＣＨ Ｌ１転写物は分子層の中間部位に局在する細胞中ではほとんど検出できなかった （図２４ｄとｅを比較せよ）。負の対照として、切片を対応するセンスｃＲＮＡ プローブとハイブリッド形成させたが、細胞の標識化は検出できなかった（網膜 及び視神経をＣＨＬ１センスｃＲＮＡプローブとハイブリッド形成させた、図２ ４ｃをみよ）。グリア細胞がイン・ビトロでＣＨＬ１を発現するかどうかを研究 するため、精製した星状グリア細胞または稀突起グリア細胞の培養物を若い生後 のマウスまたはラットの前脳から調製した。トランスフェクト−コス細胞の細胞 表面でＣＨＬ１を特異的に検出したポリクローナルＣＨＬ１抗体と同じものを使 用した。星状グリア細胞または稀突起グリア細胞は、それぞれＧＦＡＰに対する 抗体又はＯ１抗原に対する抗体を用いて同定した。星状グリア細胞の培養物はポ リクローナルＣＨＬ１（図２５ａ、ｄ）抗体及びモノクローナルＧＦＡＰ（図２ ５ｂ、ｅ）抗体で二重標識された細胞を一部ふくんでいた。稀突起グリア細胞の 培養物の分析は、しかし、ＣＨＬ１及びＯ１抗原の共−局在を示さなかった。こ のことは，成熟した稀突起グリア細胞はイン・ビトロで検出可能レベルのＣＨＬ １を発現しないことを示す。これらの観察を併せ考えると、ＣＨＬ１とＬ１は重 複を示すが、異なった発現パターンをも示すといえる。Ｌ１ではなくＣＨＬ１が イン・ビボで神経系のあるグリア細胞により発現されることは極めて印象的であ り、これはＬ１ファミリーの異なるメンバーが異なる機能を果たすことを示唆す るものである。 グリコシレーションの分析及びＣＨＬ１グリコプロテインによるＨＮＫ−１炭水 化物の検出 ＣＨＬ１（１８５ｋＤ）の観察された分子量は計算された分子質量（１３４． ９ｋＤ）よりもかなり大きいので、分子質量に対する炭水化物の寄与及び炭水化 物修飾のタイプについて分析した。７日令マウスの粗製脳膜由来の界面活性剤可 溶性又は不溶性画分を酵素による脱グリコシレーションに付した。Ｎ−グリコシ ダーゼＦ（ＰＮＧａｓｏＦ）処理の後、ＣＨＬ１免疫反応性プロテインすべての 分子質量は減少した（図２６）。すなわち、１８５ｋＤバンドは１５０ｋＤに、 １６５ｋＤバンドは１３５ｋＤにそして１２５ｋＤバンドは１１０ｋＤに減少し た。セリン／スレオニン連結ガラクトシルβ（１−３）Ｎ−アセチルガラクトサ ミニル ジサッカライドを切断することが知られている酵素であるＯ−グリコシ ダーゼ（グラスゴウ(Glasgow)ら，1977）で処理すると、僅かに移動度が増加す るという結果になった。すなわち、１８５及び１６５ｋＤバンドは約１８０及び １６０ｋＤにそれぞれシフトしたが、１２５ｋＤバンドはシフトしなかった。こ れらの観察は、炭水化物の分子質量のほとんどはＮ−結合炭水化物によることを 示す。両酵素を一緒に用いて処理すると（図２６）、個々の酵素で処理したとき にみられるよりもより大きなシフトを生じ、１８５から１４５ｋＤにシフトした 。このことはＯ−グリコシダーゼ単独で開裂されたＯ−グリコシレーション部位 はすべてのグリコシレーション部位ではないことを示唆する。この結果はＣＨＬ １はその分子質量の約３０％をＮ−グリコシディル結合炭水化物として含むこと を示す。 Ｌ１（クルーゼ(Kruse)ら，1984）、ＴＡＧ−１（ドッド(Dodd)ら，1988）、 Ｎｒ−ＣＡＭ（グルメト(Grumet)ら，1991）、Ｆ３（ゲナリニ(Gennarini)ら，1 989、Ｎ−ＣＡＭ（クルーゼ(Kruse)ら，1984）、ミエリン関連グリコプロテイン ＭＡＧ（マックガリイ(McGarry)ら，1983、クルーゼ(Kruse)ら，1984）及びＰo （ボレンソンとシャクナー(Bollenson and Schachner),1987）などのような幾つ かの神経細胞接着分子はＨＮＫ−１炭水化物を持つ。従って、われわれはＣＨＬ １がＨＮＫ−１炭水化物を持っているかどうかを分析した。ＣＨＬ１を９日令マ ウス由来の全脳組織の界面活性剤溶解物からＣＨＬ１抗体で免疫沈降させた。対 照として、Ｌ１を同様にポリクローナル抗体で同じ脳抽出液から免疫沈降させた 。ＨＮＫ−１炭水化物エピトープに対するモノクローナル抗体４１２を用いるウ エスタン・ブロット分析により、両免疫沈降物ともＣＨＬ１（図２７）又はＬ１ （示していない）に予想される分子質量の位置にモノクローナル抗体４１２によ り認識されたバンドを含んでいたことが示された。ＨＮＫ−１炭水化物は細胞− ｔｏ−細胞の接着に関与しそしてラミニン(laminin)（カイルハウエル(Keilhaue r)ら，1985、キューネムント(Kuenemund)ら，1988、ホール(Hall)ら，1993、199 5）に結合するから、Ｌ１ファミリーの他のメンバーのように、ＣＨＬ１はＨＮ Ｋ−１炭水化物を通してラミニンと相互作用をするかも知れない。 結論 上の実験は、ヒト、ラット、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュおよびショ ウジョウバエなどの多様な種に見いだされる神経認識分子のＬ１ファミリーの別 のメンバーとしてＣＨＬ１を加えた。こうして、すべてが発育の後期軸索形成の 開始時にニューロン及びニューロンのサブセットにより発現される系統学的に保 存された分子のファミリーを構成する。多くのＬ１関連分子が存在するという事 実は、構造的に類似な、しかし機能的に極めて妥当な独自のニューライト成長促 進分子に対する自然の要求を指摘するものであり、そして軸索の経路発見の微調 整を行う１群の分子としてＬ１ファミリーが進化してきたことを指摘するもので ある。 以下のものは、実施例１８〜２５で参照した参考文献のアルファベット順のリ ストである。 アダムス，エム．ディー.(Adams，M.D.)，デュブニック，エム.(Dubnick，M.)， カーラヴァグ，エイ．アール.(Kerlavage，A.R.)，モレノ，アール.(Moreno，R. )，ケリー，ジェイ．エム.(Kelley，J.M.)，ユターバック，ティー．アール.(Ut terback，T.R.)，ナグレ，ジェイ．ダブリュー.(Nagle，J.W.)，フィールズ，シ ー.(Fields，C.)及びベンター，ジェイ．シー.(Venter，J.C.)(1992)，ヒト脳遺 伝子 2375 の配列同定，Nature 355: 623-634． アダムス，エム．ディー.(Adams，M.D.)，カーラヴァグ，エイ．アール.(Kerlav age，A.R.)，フィールズ，シー.(Fields，C.)及びベンター，ジェイ．シー.(Ven ter，J.C.)(1993)，3400 の新たに発現された配列タグはヒト脳中の多様な転写 物を同定する，Nature Genet．4: 258-267． アッペル，エフ.(Appel，F.)，ホルム，ジェイ.(Holm，J.)，コンシエンス，ジ ェイ．エフ.(Conscience，J.F.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1993 )，神経細胞接着分子Ｌ１の幾つかの細胞外ドメインはニューライト成長及び細 胞体接着に関与する，J．Neurosci．13: 4764-4775． アッペル，エフ.(Appel，F.)，ホルム，ジェイ.(Holm，J.)，コンシエンス，ジ ェイ．エフ.(Conscience，J.F.)，フォンボーレン ウント ハルバッハ，エフ. (von Bohlen und Halbach，F.)，ファイスナー，エイ.(Faissner，A.)，ジェイ ムズ，ピー.(James，P.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1995)，ニュ ーライト成長促進及びシグナル伝達ドメインとしての神経細胞接着分子Ｌ１を 、フィブロネクチン・タイプIII 相同反復２及び３の間の境界と同定，J．Neuro biol．28: 297-312． アクェイント，エム.(Arquint，M.)，ローダー，ジェイ.(Roder．J.)，チア，エ ル．エス.(Chia，L.-S.)，ドーン，ジェイ.(Down，J.)，ウィルキンソン，ディ ー.(Wilkinson，D.)，ベイリー，エイチ.(Bayley，H.)，ブラウン，ピー.(Braun ，P.)及びダン，アール.(Dunn，R.)(1987),ミエリン関連グリコプロテインの分 子クローニングと一次構造，Proc．Natl．Acad．Sci.(USA)84: 600-604． バロン，エム.(Baron，M.)，メイン，エイ．エル.(Main，A.L.)，ドリスコール ，ピー．ー.(Driscoll，P.C.)，マードン，エイチ．ジェイ.(Mardon，H.J.)，ボ イド，ジェイ.(Boyd，J.)及びキャンプベル，アイ．ディー.(Campbell，I.D.)(1 992),フィブロネクチンの細胞接着タイプIII モデュールのＨ−ＮＭＲ構造決定 と二次構造，Biochem．31: 2068-2073． バータイス，ディー.(Bartheis，D.)，サントニ，エム．ジェイ.(Santoni，M.-J .)，ウィリー，ダブリュー.(Wille，W.)，ルパート，シー.(Ruppert，C.)，チャ ックス，ジェイ．シー.(Chaix，J.-C.)，ハーシュ，エム．アール.(Hirsch，M.- R.)，フォンテシラ- キャンプス，ジェイ．シー.(Fontecilla-Champs，J.C.)及 びゴリディス，シー.(Goridis，C.)(1987)，膜進展領域をもたないＭｒ７９００ ０ポリペプチドをコードするマウスＮ−ＣＡＭｃＤＮＡの単離及びヌクレオチド 配列，EMBO J. 6: 907-914． バーチ，エス.(Bartsch，S.)，バーチ，ユー.(Bartsch，U.)，ドリス，ユー.(Do rries，U.)，ファイスナー，エイ.(Faissner，A.)，ウェラー，エイ.(Weller，A .)，エクブロム，ピー.(Ekblom，P.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)( 1992)，発育中及び成熟した小脳皮質でのテナシンの発現，J．Neurosci，12: 73 6-749． バーグルンド，イー．オー.(Berglund，E.O.)及びランシュト，ビー.(Ranscht, B.)(1994)，染色体12q11-q12 上のヒトコンタクチン遺伝子(CNTN1)の分子クロー ニングとイン・サイチュ位置決定，Genomics 21: 571-582． ビーバー，エイ，ジェイ.(Bieber，A.J.)，スノウ，ピー．エム.(Snow，P.M.)， ホーチュ，エム.(Hortsch，M.)，ペイテル，エヌ．エイチ.(Patel，N.H)，ジェ イコブス，ジェイ．アール.(Jacobs，J.R.)，トラキナ，ゼット．アール.(Traqu ina，Z.R.)，シェーリング，ジェイ.(Schilling，J.)及びグッドマン，シー．エ ス.(Goodman，C.S.)(1989)，ショジョウバエのニューログリアン：脊椎動物の神 経細胞接着分子Ｌ１に広い相同性のある免疫ブログリンスーパーファミリーの一 員，Cell 59:447-460． ビクスビー，ジェイ．エル.(Bixby，J.L.)，リリアン，ジェイ.(Lilien，J.)及 びライチャード，エル．エフ.(Reichardt，L.F.)(1988)，インビトロでシュワン 細胞上ノニューロン成長過程を促進する主タンパク質の同定，J．Cell Biol，10 7: 353-362． ボレンソン，イー.(Bollenson，E.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1 987)，末梢ミエリングリコプロテインＰｏは神経接着分子に共有されるＬ２／Ｈ ＮＫ−１とＬ３炭水化物構造物を発現する，Neurosci．Lett．82:77-82． ブラッドフォード，エム．エム.(Bradford，M.M.)(1976),タンパク−色素結合の 原理を利用するミクログラム量のタンパクの迅速かつ高感度な定量法，Anal．Bi ochem．72: 248-254． ブルーメンドルフ，ティー.(Brummendorf，T.)，ウォルフ，ジェイ．エム.(Wolf f，J.M.)，フランク，アール(Frank，R.)及びラチエン，エフ．ジー.(Rathjen， F.G.)(1989)，神経細胞認識分子Ｆ11：フィブロネクチンタイプIII ドメイン及 び免疫グロブリンタイプＣドメインとの相同性，Neuron 2: 351-1361． ブルーメンドルフ，ティー.(Brummendorf，T.)及びラチエン，エフ．ジー.( Rat hjen，F.G.)(1993)，脊椎動物における免疫グロブリンドメイン及びフィブロネ クチンタイプIII 関連ドメインをもつ軸索グリコプロテイン： 構造的特徴、結 合活性及びシグナル伝達，J．Neurochem．61: 1207-1219． ブルーメンドルフ，ティー.(Brummendorf，T.)及びラチエン，エフ．ジー.(Rath jen，F.G.)(1994),細胞接着分子１：免疫グロブリン・スーパーファミリー，InS heterline，P.，ed．Protein Profile，Academic Press，London，951-1058． サーグーン，エム．ピー.(Surgoon，M.P.)，グルメト，エム.(Grumet，M.),マウ ロ，ブイ．(Mauro，V.)，エーデルマン，ジー．エム.(Edelman，G.M.)及びカニ ングハム，ビー．エイ.(Cunningham，B.A.)(1991),ニワトリニューロン−グリア 細胞接着分子Ｎｇ−ＣＡＭ：ポリペプチドの起源及びＩｇスーパーファミリーへ の関連，J．Cell Biol．112: 1017-1029． チョムツィンスキー，ピー.(ChomczynsKi，P.)及びサッチ，エヌ.(Sacchi，N.)( 1987),酸性グアニディニウム・チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出 による一段階ＲＮＡ単離法，Anal．Biochem．162: 158-159． コンネリー，エム．エイ(Connelly，M.A.)，グレイディ，アール．シー.(Grady, R.C.)，ムシンスキー，ケイ．エフ.(Mushinski，J.F.)及びマーク，ケイ．ビー .(Marcu，K.B.)(1994)，ニューロンのグリコプロテインをコードする遺伝子であ るＰＡＮＧはねずみプラスマ細胞腫の槽内Ａ−型粒子長末端反復により外反的に 活性化される，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)91: 1337-1341． カニングハム，ビー．エイ.(Cunningham，B.A.)，ヘムパリー，ジェイ．ジェイ. (Hemperley，J.J.)，マーレイ，ビー．エイ.(Murray，B.A.)，プレディガー，イ ー．エイ.(Prediger，E.A.)，ブラッケンベリー，アール.(Brackenbury，R.) 及びエーデルマン，ジー．エム.(Edelman，G.M.)(1987)，神経細胞接着分子：構 造、免疫グロブリン−様ドメイン、細胞表面調節、及び選択的ＲＮＡのスプライ ス，Science 236: 799-806． デイビス，ジェイ．キュー.(Davis，J.Q.)，マクローリン，ティー.(McLaughlin ，T.)及びベネット，ブイ.(Bennett，V.)(1993)，神経系細胞接着分子に関連の あるアンキリン−結合タンパク：成熟脳における膜貫通及び細胞内連結を与える 候補，J．Cell Biol．121: 121-133． デイビス，ジェイ.(Davis，J.)及びベネット，ブイ.(Bennett，V.)(1994)，神経 系の細胞接着分子のニューロファシン／Ｌ１／ＮｒＣＡＭファミリーにより共有 されるアンキリン結合活性，J．Biol．Chem.269: 27163-27166． ドッド，ジェイ.(Dodd，J.)，モートン，エス.(Morton，S.)，カラゴジェエス， ディー.(Karagogeos，D.)，ヤマモト，エム.(Yamamoto，M.)及びジェセル，ティ ー.(Jessell，T.)(1988)，胚脊髄ニューロンのサブセットに対する軸索グリコプ ロテイン発現の空間的調節，Neuron 1: 105-106． ドリス，ユー.(Dorries，U.)，バーチ，ユー.(Bartsch，U.)，ノルト，シー.(No lte，C.)，ロート，ジェイ.(Roth，J.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M. )(1993)，非放射活性イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション法の電子顕微鏡 への適用：マウス小脳のテナクシンｍＲＮＡのジゴキシゲニン−標識プローブ及 び金標識抗体を用いる検出，Histochem. 99: 251-262． エーデルマン，ジー．エム.(Edelman G.M.)(1970)，ヒトＩｇＧの共有的構造。 ＸＩ．機能的意味，Biochem. 9: 3197-3205． エーデルマン，ジー．エム.(Edelman，G.M.)(1988)，形態制御分子，Biochem．2 7 : 3533-3543． エリクソン，エイチ．ピー.(Erickson，H.P.)(1993),テナシン−Ｃ、テナシン− Ｒ、テナシン−Ｘ：機能研究における能力のあるタンパクの一群，Curr．Opin. Cell Biol．5: 869-876 ファイスナー，エイ.(Faissner，A.)，テプロー，ディー．ビー.(Teplow，D.B.) ，クブラー，ディー.(Kubler，D.)，カイルハウアー，ジー.(Keilhauer，G.)， キンゼル，ブイ.(Kinzel，V.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1985), 神経細胞接着分子の生合成及び膜地形図，EMBO J. 4: 3105-3113． フェアロン，イー．アール.(Fearon，E.R.)，チョー，ケイ．アール.(Cho，K.R. )，ニグロ，ジェイ．エム.(Nigro，J.M.)，カーン，エス．イー.(Kern，S.E.)， シモンズ，ジェイ．ダブリュー.(Simons，J.W.)，ルパート，ジェイ．エム.(Rup pert，J.M.)，ハミルトン，エス．アール.(Hamilton，S.R.)，プレイジンガー， エイ．シー.(Preisinger，A.C.)，トーマス，ジー.(Thomas，G.)，キンズラー， ケイ．ダブリュー.(Kinzler，K.W.)及びボーゲルスタイン，ビー.(Vogelstein， B.)(1990),結腸直腸ガンである染色体１８ｑの同定，Science 247: 49-56． ファイゼンフェルド，ディー．ピー.(Feisenfeld，D.P.)，ハイネス，エム．エ イ.(Hynes，M.A.)，スコラー，ケイ．エム.(Skolor，K.M.)，ファーレイ，エイ ．ジェイ.(Furley，A.J.)及びジェセル，ティー．エム.(Jessel，T.M.)(1994)， ＴＡＧ−１は同種親和性的結合を媒介するが、ＴＡＧ−１上でのニューライト成 長はＬ１−様分子及びＢ1インテグリンを要求する，Neuron 12: 675-690． フライ，ティー.(Frei，T.),フォンボーレン ウント ハルバッハ，エフ.(vonB ohlen und Halbach，F.)，ウィリー，ダブリュー.(Wille，W.)及びシャックナー ，エム.(Schachner，M.)(1992)，神経接着分枝（Ｎ−ＣＡＭ）の異なる細胞外ド メインが異なる機能に関与する，J．Cell Biol．118: 177-194． ファーリー，エイ．ジェイ.(Furley，A.J.)，モートン，エス．ビー.(Morton．S .B.)，マナロ，ディー.(Manalo，D.)，カラゴゲオス，ディー.(Karagogeos，D.) ，ドッド，ジェイ.(Dodd，J.)及びジェセル，ティー．エム.(Jessel，T.M.)(199 0),軸索グリコプロテインＴＡＧ−１はニューライト成長促進活性をもつ免疫グ ロブリンスーパーファミリーの一員である。Cell 61: 157-170． ジェナリニ，ジー.(Gennarini，G.)，シベリ，ジー.(Cibelli，G.)，ローゴン， ジー.(Rougon，G.)，マッテイ，エム．ジー.(Mattei，M.G.)及びゴリディス，シ ー.(Goridis，C.)(1989)，マウスニューロン細胞表面タンパクＦ３：にわとりコ ンタクチンに関連する免疫グロブリンスーパーファミリーのホスファチジルイノ シトールで固定されたメンバー，J．Cell Biol. 109: 775-788． ジェナリニ，ジー.(Gennarini，G.)，デュベック，ピー.(Durbec，P.)，ボナー ド，エイ.(Bonad，A.)，ローゴン，ジー.(Rougon，G.),及びゴリディス，シー.( Goridis，C.)(1991)，トランスフェクトされたＦ３／Ｆ１１ニューロン細胞表面 タンパクは細胞間接着を媒介しニューライト成長を促進する。Neuron 6: 595-60 6． グラスゴウ，エル．アール.(Glasgow，L.R.)，ポールソン，ジェイ．シー.(Paul son，J.C.)及びヒル，アール．エル.(Hill，R.L.)(1977)，Streptococcus（Dipl ococcus）pneumoniae から得られる５つのグリコシダーゼの体系的精製，J．Bio l．Chem．252: 8615-8623． グルメット，エム.(Grumet，M.)，ホフマン，エス.(Hoffman，S.)，チョン，シ ー．エム.(Chuong，C.M.)及びエーデルマン，ジー．エム.(Edelman，G.M.)(1984 )，ニューロン−グリア細胞接着分子のポリペプチド構成成分と結合機能，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 81: 7989-7993． グルメット，エム.(Grumet，M.)，マウロ，ブイ.(Mauro，V.)，バーグーン，エ ム．ピー.(Burgoon，M.P.)，エーデルマン，ジー．エム.(Edelman，G.M.)及びカ ニングハム，ビー．エイ.(Cunningham，B.A.)(1991),新しい神経系グリコプロテ インNr-CAMの構造及び神経細胞接着分子のサブグループとそれとの関係，J．Cel l Biol．113: 1399-1412． ジェナード，ブイ.(Guenard，V.)，グウィン，エル.(Gwynn，L.)及びウッド，ピ ー.(Wood，P.)(1994),星状グリア細胞はインビトロで後根神経節のシュワン細胞 の増殖とミエリン化を阻害する。J．Neurosci．14: 2980-2992． ホール，エイチ.(Hall，H.)，リー，エル.(Liu，L.)，シャックナー，エム.(Sch achner，M.)，及びシュミット，ビー.(Schmitz，B.)(1993)，Ｌ２／ＨＮＫ−１ 炭水化物は神経細胞がラミニンに接着するのを媒介する。Eur．J．Neurosci．5: 34-42． ホール，エイチ.(Hall，H.)，フォーエル，ティー.(Vorherr，T.)及びシャック ナー，エム.(Schachner，M.)，ＨＮＫ−１炭水化物結合性と細胞接着性に関与す るラミニンＧ２ドメインの２１アミノ酸ペプチドの特性決定，Glycobiology 5: 435-441． ハスラー，ティー，エイチ.(Hasler，T.H.)，レイダー，シー.(Rader，C.)，ス トックリー，イー．ティー.(Stoeckli，E.T.)，ツーリッヒ，アール，エイ.(Zue llig，R.A.)及びゾンデレガー，ピー.(Sonderegger，P.)(1993)，ヒトＴＡＧ− １／アクソニン−１のｃＤＮＡクローニング、構造の特徴及び真核生物での発現 ，Eur．J．Biochem．211: 329-339． ハイン，ジェイ.(Hein，J.)(1990),配列と系統発生への統一的アプローチ，Meth ．Enzymol. 183: 628-645． ハイネ フォン，ジー.(Heijne von，G.)(1986),配列の開裂部位を予想する新し い方法，Nucl．Acids Res. 14: 4683-4690． ラビン，エム．エル.(Hlavin，M.L.)及びレモン，ブイ.(Lemmon，V.)(1991)，ヒ トＬ１ＣＡＭの分子構造と機能試験：種間の比較，Genomics 11: 416-423． ホルム，ジェイ.(Holm，J.)，アッペル，エフ.(Appel，F.)及びシャックナー， エム.(Schachner，M.)(1995)，神経細胞接着分子Ｌ１の幾つかの細胞外ドメイン は同種親和性相互作用中に関与する；J．Neurosci. 42: 9-20． フバート，エス．シー(Hubbard，S.C.)及びイバット，アール．ジェイ.(Ivatt, R.J.)(1981)，アスパラギン結合オリゴサッカライドの合成と処理，Annu．Rev. Biochem．50: 555-583． ハスマン，ケイ.(Husmann，K.)，ファイスナー，エイ.(Faissner，A.)及びシャ ックナー，エム.(Schachner，M.)(1992)，フィブロネクチンタイプIII 反復中の 異なったドメインによって、テナシンは小脳顆粒細胞の移動とニューライト成長 を促進する。J．Cell Biol．116: 1475-1486． ハイネス，アール．オー.(Hynes，R.O.)(1992)，インテグリン：細胞接着におけ る多面性、調節、及びシグナル発生，Cell 68: 11-25． カンラ，ジー．エス.(Kanla，G.S.)，ハン，ピー．エル.(Han，P.L.)，キム，ワ イ．ティー.(Kim，Y.T.)及びベレン，エイチ.(Bellen，H.)(1993),ニューロマス クリン(Neuromusculin)．末梢ニューロン前駆体及び筋肉中で発現されたショウ ジョウバエ遺伝子は細胞接着分子をコードする。Neuron. 11: 673-687． カヤム，ジェイ．エフ.(Kayyam，J.F.)，ロマン，ジェイ．エム.(Roman，J.M.) ，デラローザ，イー．ジェイ.(de la Rosa，E.J.)，シュワルツ，ユー.(Schwar z，U.)及びドレヤー，ダブリュー．ジェイ.(Dreler，W.J.)(1992),Ｂｒａｖｏ／ ＮｒＣＡＭは細胞接着分子Ｌ１及びＮｇＣＡＭに近縁であり同様のヘテロダイマ ー構造をもつ。J．Cell Biol. 118: 1259-1270． カイハハウアー，ジー.(Keihauer，G.)，ファイスナー，エイ.(Faissner，A.)及 びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1986)，Ｌ１、Ｌ２及びＮ−ＣＡＭ抗体 によるニューロン−ニューロン、ニューロン−星状グリア細胞及び星状グリア細 胞−星状グリア細胞接着の差別的阻害，Nature 316: 728-730． クラクセン，エフ．ダブリュー.(Kluxen，F.W.),ブランズ，シー.(Bruns，C.)及 びラバート，エイチ.(Lubbert，H.)(1992)，ラット脳のソマトスタチン受容体ｃ ＤＮＡの発現クローニング，Proc．Natl．Acad．Soc.(USA), 89: 4618-4022． クラクセン，エフ．ダブリュー.(Kluxen，F.W.)及びラバート，エイチ.(Lubbert ，H.)(1993)，発現クローニングに有用なコス細胞中での組み換えｃＤＮＡの最 大発現，Anal．Biochem. 208: 352-356． コーンブリット，エイ．アール(Kornblihtt，A.R.)，ウメザワ，ケイ.(Umezawa, K.)，ヴィベ−ペダーセン，ケイ.(Vibe-Pedersen，K.)及びバラール，エフ．イ ー.(Baralle，F.E.)(1985)，ヒトフィブロネクチンの一次構造：差別的スプライ シングが１個の遺伝子から少なくとも１０個のポリペプチドを作る，EMBO J. 4: 1755-1759． コザック，エム.(Kozak，M.)(1987)，ＡＵＧ開始コドンの前の少なくとも６個の ヌクレオチドが哺乳動物細胞の翻訳を増強する，J．Mol．Biol．196: 947-950． クルース，ジェイ.(Kruse，J.)，マイルハマー，アール.(Mailhammer，R.)，ウ ェルニッケ，エイチ.(Wernecke，H.)，ファルスナー，エイ.(Falssner，A.)，ソ マー，アイ.(Sommer，I.)，ゴリディス，シー.(Goridis，C.)及びシャックナ ー，エム.(Schachner，M.)(1984)，神経細胞接着分子とミエリン関連グリコプロ テインはモノクローナル抗体Ｌ２とＨＮＫ−１により認識される一般的な炭水化 物部分を共有する。Nature 311: 153-155． クネムンド，ブイ.(Kunemund，V.)，ユンガワラ，エフ．ビー.(Jungawala，F.B. )，フィシャー，ジー.(Fisher，G.)，チュー，ディー．ケイ．エイチ.(Chou，D. K.H.),カイルハウアー，ジー.(keilhauer，G.)及びシャックナー，エム.(Schach ner，M.)(1988)，神経細胞接着分子のＬ２／Ｈｎｋ−１は細胞間の作用に関与す る，J．Cell Biol．106: 213-223． カイト，ジェイ.(Kyte，J.)及びドゥーリトル，アール．エフ.(Doolittle，R.F. )(1982)，タンパク質の水治療法的特徴を表す単純な方法，J．Mol．Biol．157: 105-132． レミル，ユー．ケイ.(Laemmil．U.K.)(1970)，バクテリオファージＴ４のヘッド の組立ての間に起こる構造タンパクの開裂，Nature 227: 680-685． レング，ピー.(Laeng，P.)，デシモ，ディー.(Decimo，D.)，ペットマン，ビー. (Pettmann，B.)，ジャネット，ティー.(Janet，T.)及びラボーデット，ジー.(La bourdette，G.)(1994)，レチノイン酸は稀突起グリア細胞前駆体細胞のイン・ビ トロでの発育を制御する。J．Neurosci．Res. 39: 613-633． レイ，シー.(Lai，C.)，ブラウン，エム．エイ.(Brow，M.A.)，ネイブ，ケイ． エイ.(Nave，K.A.)，ノローナ，エイ．ビー.(Noronha，A.B.)，クワレス，アー ル．エイチ.(Quarles，R.H.)，ブルーム，エフ．イー.(Bloom，F.E.)，ミルナー ，アール．ジェイ.(Milner，R.J.)及びサットクリフ，ジェイ．ジー.(Sutcliffe ，J.G.)(1987)，生後の神経発育のための細胞接着分子、18236/ミエリン関連グ リコプロテインの２つの形態は交互スプライシングにより生産される。Proc．Na tl．Acad．Sci.(USA), 84: 4337-4341． リーハイ，ディー．ジェイ.(Leahy，D.J.)，ヘンドリクソン，ダブリュー．エイ .(Hendrickson，W.A.)，オーキル，アイ.(Aukil，I.)及びエリクソン，エイチ． ピー.(Erlckson，H.P.)(1992),セレノメチオニルタンパク質のＭＡＤ分析により 分離されたテナシン由来のフィブロネクチンタイプIII ドメインの構造，Scienc e 258: 987-991． レモン，ブイ.(Lemmon，V.)，ファー，ケイ．エル.(Farr，K.L.)及びラーゲノー ，シー.(Lagenaur，C.)(1989),Ｌ１により媒介された軸索の成長は血液親和性結 合メカニズムを介して発生する。Neuron 2: 1597-1603． リップマン，ディー．ジェイ.(Lipman，D.J.)及びピアソン，ダブリュー．アー ル.(Pearson，W.R.)(1985)，迅速かつ高感度なタンパク質の類似性の調査，Sien ce 227: 1435-1441． メイン，エイ．エル.(Main，A.L.)，ハーベイ，ティー．エス.(Harvey，T.S.)， バロン，エム.(Baron，M.)，ボイド，ジェイ.(Boyd，J.)及びキャンプベル，ア イ．ディー.(Campbell，I.D.)(1992)，フィブロネクチンの10番目のタイプIII モジュールの三次構造：ＲＧＤが媒介する相互作用の考察，Cell 71: 671-678． マーク，エム．アール.(Mark，M.R.)，スカデン，ディー．ティー.(Scadden，D. T.)，ワング，ゼット.(Wang，Z.)，グー，オー.(Gu，O.)，ゴダード，エイ.(God dard，A.)及び ゴドウィスキー，ピー．ジェイ.(Godowski，P.J.)(1994),Ａｘ １／Ｕｆｏに相同性をもつ新規の受容体型チロシンキナーゼＲｓｅは脳中で高レ ベルで発現する。J．Biol．Chem．269: 10720-10728． マルチーニ，アール.(Martini，R.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1 986)，発育中の座骨神経における神経細胞接着分子（Ｌ１、Ｎ−ＣＡＭ及びＭＡ Ｇ）、及びそれらの共有する炭水化物エピトープ及びミエリン塩基性タンパク質 の免疫電子顕微鏡による位置確認，J．Cell Biol．103: 2439-2448． マッカーシー，ケイ．ディー.(McCarthy，K.D.)及びデベリス，ジェイ.(De Vell is，J.)(1980)，ラット小脳組織から星状グリア細胞及び稀突起グリア細胞培養 物の調製，J．Cell Biol．B5: 890-902． マックガリー，アール．シー.(McGarry，R.C.)，ヘルファンド，エス．エル.(He lfand，S.L.)，クワレス，アール．エイチ.(Quarles，R.H.)及びローダー，ジェ イ．シー.(Roder，J.C.)(1983)，モノクローナル抗体ＨＮＫ−１によるミエリン 関連グリコプロテインの認識，Nature 306: 376-378． メルトン，ディー．エイ.(Melton，D.A.)，クリーグ，ピー．エイ.(Krieg，P.A. )，レバグリアチ，エム．エイ.(Rebagliati，M.A.)，マニアティス，ティー.(Ma niatis，T.)，ツィン，ケイ.(Zinn，K.)及びグリーン，エム．アール.(Green，M .R.)(1984)，ＳＰ６プロモータを含むプラスミドからの生物学的に活性なＲＮＡ とＲＮＡハイブリダイゼーション用プローブのインビトロでの有効な合成，Nucl ．Acids Res. 12: 7035-7056． ミウラ，エム.(Miura，M.)，コバヤシ，エム.(Kobayashi，M.)，アソウ，エイチ .(Asou，H.)及びウエムラ，ケイ.(Uyemura，K.)(1991)，ラット神経細胞接着分 子Ｌ１をコードするｃＤＮＡの分子クローニング。細胞質領域中の二つのイソ型 Ｌ１は差別的スプライシングにより産生される，FEBS Lett．289: 91-95． ムース，エム.(Moos，M.)，タケ，アール.(Tacke，R.)，シェーラー，エイチ.(S cherer，H.)，テプロー，ディー.(Teplow，D.)，フルー，ケイ.(Fruh，K.)及び シャックナー，エム.(Schachner，M.)(1988)，フィブロネクチンと同様の結合ド メインを有する免疫グロブリン・スーパーファミリーのメンバーとしての神経接 着分子Ｌ１，Nature 334: 701-703． モスコソ，エル．エム.(Moscoso，L.M.)及びセインズ，ジェイ．アール.(Sanes, J.R.)，発育中のマウス脊髄中で発現する４つの免疫グロブリン・スーパーファ ミリー接着分子(Ｌ１、Ｎｒ−ＣＡＭ／ＢＲＡＶＯ、ニューロファシン／ＡＢＧ Ｐ及びＮ−ＣＡＭ)，J．Comp．Neurol．352: 321-334． ペシヴァ，ピー.(Pesheva，P.)，ガナリーニ，ジー.(Gennarini，G.)，ゴリディ ス，シー.(Goridis，C.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1993)，Ｆ３ ／１１細胞接着分子は細胞外マトリックス・グリコプロテインＪ１−１６０／１ ８０によりニューロンの反発を媒介する。Neuron 10: 69-82． ピーシール，ダブリュー．イー.(Pierceall，W.E.)，チョー，ケイ．アール.(Ch o，K.R.)，ゲッツェンバーグ，アール．エイチ.(Getzenberg，R.H.)，ロール， エム．エイ.(Roale，M.A.)，ヘドリック，エル.(Hedrick，L.)，ヴォゲルスタイ ン，ビー.(Vogelstein，B.)及びフェアロン，イー．アール.(Fearon，E.R.)(199 4),欠失させた結腸直腸ガン腫抑圧遺伝子産物を発現するＮＩＨ３ＤＴ３細胞は ラットＰＣ１２褐色細胞腫細胞のニューライト成長を刺激する，J．Cell Biol. 124 : 1017-1027． ピアシュバッヒャー，エム．ディー.(Pierschbacher，M.D.)及びルオジアティ， イー.(Ruosiahti，E.)(1984)，フィブロネクチンの細胞接着活性はその分子の小 さい合成フラグメントで複製できる。Nature 309: 30-33． ピサノ，エイ.(Pisano，A.)，レドモンド，ジェイ．ダブリュー.(Redmond，J.W. )，ウィリアムス，ケイ．エル.(Williams，K.L.)及びグーリー，エイ．エイ.(Go oley，A.A.)(1993),固相エドマン分解により同定されるグリコシレーション部位 ：ヒトグリコフォリンＡ上のＯ結合グリコシレーションモチーフ，Glycobiol. 3 : 429-435． ポルトラック，エム.(Poltorak，M.)，サドール，アール.(Sadoul，R.)，ケルハ ウアー，ジー.(Kelhauer，G.)，リンダ，シー.(Landa，C.)，ファラリング，テ ィー.(Faharing，T.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1987)，神経細 胞接着分子の２／ＨＭＮＫ−１ファミリーの一員であるミエリン関連グリコプロ テイン（ＭＡＧ）は神経−稀突起グリア細胞及び稀突起グリア細胞−稀突起グリ ア細胞相互作用に関与する。J．Cell Biol. 105: 1893-1899． プリンス，ジェイ．ティー.(Prince，J.T.)，アルベルティ，エル.(Alberti，L. )，ヒーライ，ピー．エイ.(Healy，P.A.)，ナウマン，エス．ジェイ.(Nauman，S .J.)及びスタールカップ，ダブリュー．ビー.(Stallcup，W.B.)(1991),ＮＩＬＥ グリコプロテインの分子クローニング及び成熟ラットＣＮＳ中での持続的な発現 の証拠，J．Neurosci．Res．30: 567-581． プリド，ディー.(Pulido，D.)，キャンプザノ，エス.(Campuzano，S.)，キダ， ティー.(Kida，T.)，モドレル，ジェイ.(Modolell，J.)及びバーバシド，エム.( Barbacid，M.)(1992),ニューロトロフィン受容体のｔｒｋファミリーに関連する ショウジョウバエ遺伝子であるＤｔｒｋは新しいクラスの神経細胞接着分子をコ ードする。EMBO J．111: 391-404． ランシュト，ビー.(Ranscht，B.)(1988)，ニューロン間接触の領域に濃縮された １３０ｋＤのグリコプロテインであるコンタクチンの配列は神経系における免疫 グロブリンの新規のメンバーを定義する，J．Cell Biol．107: 1561-1573． ラチエン，エフ．ジー.(Rathjen，F.G.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M .)(1984),細胞接着物中に含まれる新しい神経細胞表面成分（Ｌ１抗原）の免疫 細胞学的及び生化学的特性決定，EMBO J．3: 1-10． ラチエン，エフ．ジー.(Rathjen，F.G.)及びジェセル，ティー．エム.(Jessell, T.M.)(1991)，脊椎動物の軸索の成長と誘導を調節するグリコプロテイン：免疫 グロブリン／フィブロネクチンタイプIII サブファミリーのドメインと力学，Se min．Neurosci. 3: 297-307． ルオスラートル，イー.(Ruoslahtl，E.)及びピアシュバッヒャー，エム．ディー (Pierschbacher，M.D.)(1987),細胞接着の新しい展望：ＲＧＤとインテグリン類 ，Science 238: 491-497． ルオスラートル，イー.(Ruoslahtl，E.)(1988)，フィブロネクチンとその受容体 ，Annu．Rev．Biochem．57:357-413． ラトルスハウザー，ユー.(Rutlshauser，U.)(1993)，神経系の接着分子，Curr． Opin．Neurobiol. 3: 709-715． サドール，ケイ.(Sadoul，K.)，サドール，アール.(Sadoul，R.),ファイスナー ，エイ.(Faissner，A.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1988)，神経 細胞接着分子Ｌ１の異なった分子形態の生化学的な特性決定，J．Neurochem．50 : 510-521． サルザー，ジェイ．エル.(Salzer，J.L.)，ホルムス，ダブリュー．ピー.(Holme s，W.P.)及びコルマン，ディー．アール.(Colman，D.R.)(1987),ミエリン関連グ リコプロテインのアミノ酸配列：免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの相 同性，J．Cell Biol．104: 957-965． サムブルック，ジェイ.(Sambrook，J.)，フィッチュ，イー．エフ.(Fritsch，E. F.)及びマニアティス，ティー.(Maniatis，T.)(1989),分子クローニング：実験 マニュアル，コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbo r Laboratory)，Cold Spring Harbor，NY. サンガー，エフ．エス.(Sanger，F.S.)，ニックレン，エス.(Nicklen，S.)及び クールソン，エイ．アール.(Coulson，A.R.)(1977)，連鎖を停止させる阻害剤を 用いるＤＮＡの配列決定，Proc．Natl．Acad．Sci.(USA)74: 5463-5467． シャックナー，エム.(Schachner，M.)(1991)，神経認識分子及び細胞機能に対す るその影響，In Letouneau，P.C.，Kater，S.B．及び Macagno，E.R.，eds．The Nerve Growth Cone，Raven Press，NY，237-254． シャックナー，エム.(Schachner，M.)(1994)，病気と再生における神経認識分子 ，Curr．Opin．Neurobiol. 4: 726-734． シュニッツァー，ジェイ.(Schnitzer，J.)及びシャックナー，エム.(Schachner, M.)(1981)，生後すぐのマウスと成熟マウスの小脳でのＴｈｙ−１、Ｈ−２及び ＮＳ−４細胞表面抗原と破傷風毒素受容体の発現，Neuroimmunol．1: 429-456． ザイルハイマー，ビー.(Seilheimer，B.)及びシャックナー，エム.(Schachner, M.)(1988)，末梢神経系の細胞間の相互作用を媒介する接着分子の研究は培養中 のシュワン細胞上での感覚ニューロンの成長を媒介する際におけるＬ１の主要な 役割を明らかにする，J．Cell Biol． 107: 341-351． ソマー，アイ.(Sommer，I.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1981)， 稀突起グリア細胞表面に対するモノクローナル抗体(01 〜04)：中枢神経系にお ける免疫細胞化学的研究，Dev．Biol. 83: 311-327． サザーン，イー．エム.(Southern，E.M.)(1975)，ゲル電気泳動法によって分離 されたＤＮＡ断片中の特異的配列の検出，J．Mol．Biol．98: 503． シャターツ，ダブリュー.デディー.(Staatz，W.D.)，フォーク，ケイ．エフ.(Fok ，K.F.)，ツッター，エム．エム.(Zutter，M.M.)，アダムス，エス．ピー.(Ad ams，S.P.)，ロドリゲス，ビー．エイ.(Rodriguez，B.A.)及びサントロ，エス． エイ.(Santoro，S.A.)(1991)，コラーゲン中のα2β1インテグリンのテトラペフ チド認識配列の同定，J．Biol．Chem. 266: 7363-7367． ストローリ，エム.(Streuli，M.)，クルーガー，エヌ．エックス.(Krueger，N.X .)，ホール，エル．アール.(Hall，L.R.)，シュロスマン，エス．エフ.(Schloss man，S.F.)及びサイトウ，エイチ.(Salto H.)(1988),白血球共通抗原に相同的な 細胞質領域を有する免疫グロブリン・スーパーファミリーの新規なメンバー，J ．Exp．Med. 168: 1523-1530． スチュディール，エフ．ダブリュー.(Studier，F.W.)及びモファット，ビー．エ イ.(Moffatt，B.A.)(1986)，クローニングされた遺伝子の高レベルの選択的発現 を達成するためのバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用，J．Mol.B iol．189: 113-130． タケ，アール.(Tacke，R.)，ムース，エム.(Moos，M.)，テップロー，ディー． ビー.(Teplow，D.B.)，フルー，ケイ.(Fruh，K.)，シェーラー，エイチ.(Schere r，H.)，バッハ，エイ.(Bach，A.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(19 87)，マウス神経細胞接着分子Ｌ１のｃＤＮＡクローンの単離，Neurosci．Lett ．82: 89-94． タケチ，エム.(Taketchi，M.)(1991),形態発生の調節因子としてのカドヘリン細 胞接着受容体，Science 251: 449-455． タナヒル，エル.(Tannahill，L.)，クライン，アール.(Klein，R.)及びシャック ナー．エム.(Schachner，M.)(1995)，ニューロトロフィン受容体ＴｒｋＡ及びＴ ｒｋＢはニューライト成長を阻害する。Eur．J．Neurosci．6: 1424-1428． テイラー，ジェイ.(Taylor，J.)，ペシーバ，ピー.(Pesheva，P.)及びシャック ナー，エム.(Schachner，M.)(1993)，成長錐状体の挙動に対するジャヌシン及び テナシンのイン・ビトロでの影響，J．Neurosci．Res．35: 347-362． トンジオージ，イー.(Tongiorgi，E.)，バーナード，アール．アール.(Bernardt ，R.R.)及びシャックナー，エム.(Schachner，M.)(1995)，ゼブラフィッシュの ニューロンは軸索発生初期に２つのＬ１関連分子を発現する。J．Neurosci．Res ．42: 547-561． タロトラ，ピー．シー.(Talotra，P.C.)，カラゴゲオス，ディー.(Karagogeos,D .)，テオドラキス，ケイ.(Theodorakis，K.)，ミカエリディス，ティー．エム.( Michaelidis，T.M.)，モディ，ダブリュー．エス.(Modi，W.S.)，ファーリー， エイ．ジェイ.(Furley，A.J.)，ジェセル，ティー．エム.(Jessell，T.M.)及び パパマテアキス，ジェイ.(Papamatheakis，J.)(1993)，ヒト軸索グリコプロテイ ンＴＡＧ−１をコードする遺伝子（ＴＡＸ−１）のｃＤＮＡの単離と染色体上の 位置確認，Genomics 18: 562-567． フォルクマー，エイチ.(Volkmer，H.)，ハーゼル，ビー.(Hassel，B.)，ヴォル フ．ジェイ．エム.(Wolff，J.M.)，フランク，アール.(Frank，R.)及びラチエン ，エフ．ジー.(Rathjen，F.G.)(1992)，軸索表面認識分子ニューロファシンの構 造及び免疫グロブリン・スーパーファミリーの神経サブグループに対するその関 係，J．Cell Biol．118: 149-161． ウィリアムス，エイ．エフ.(Williams，A.F.)及びバークリー，エイ．エヌ.(Bar clay，A.N.)(1988)，細胞表面認識のための免疫グロブリン・スーパーファミリ ー・ドメイン，Ann．Rev．Immunol. 6: 381-405． ヨシハラ，ワイ.(Yoshihara，Y.)，カワサキ，エム.(Kawasaki，M.)，タニ，エ イ.(Tani，A.)，タマダ，エイ.(Tamada，A.)，ナガタ，エス.(Nagata，S.),カガ ミヤマ，エイチ.(Kagamiyama，H.)，及びモリ，ケイ.(Mori，K.)(1994)，ニ ューライト成長促進活性を有する免疫グロブリン・スーパーファミリーの新しい ＴＡＧ−１／Ｆ３関連メンバーであるＢＩＧ−１，Neuron 13: 415-426． 本発明は種々の具体的材料、操作及び実施例を参照して本明細書に記述し例示 したが、本発明は上の目的のために選択された材料及び操作の特定の物質的組み 合わせに限定されるものではないことが理解されるべきである。このような詳細 の無数の修正は当技術分野における熟練せる者により予想できるものと解釈する ことができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                   Growth regulators of central nervous system neurites             And compositions, cells and methods of embodiing and using the same                               Background of the Invention                               Field of the invention   The present invention relates generally to the regulation of nerve growth in the central nervous system, and more specifically Discloses methods for improving CNS nerve growth and related agents, constructs and And components. In particular, the present invention provides a method for promoting and improving such nerve growth. Use of adhesion molecules, more preferably neuronal adhesion molecules such as L1 About.                             Description of related technology   The ability of neurons to grow neurites during development It is of primary importance in completing the connection of neurons. It also damages It is also required in the process of regeneration to recreate the resulting broken bond.   Neurite is an overgrowth of both the central and peripheral nervous systems of all animal species. (Cajal (1928), degeneration and regeneration in the nervous system, Cusford University Press, London). This phenomenon is due to axons and dendrites Related to Ki. However, in adults, axons and dendrites in the central nervous system Regrowth is progressively lost as development progresses.   In the peripheral nervous system, after injury suffering, axons of all vertebrate species regenerate. Can be lengthened (Cajal (1928), Martini (1994), J. Ne urocytol.twenty three: 1-28). However, in mammals, neurites after injury Regrowth is limited to germination of neurites. However, neuronal processes (neurona regrowth is possible in lower vertebrate species (Stuermer) (1992) J. et al. Neurobiol.twenty three: 537-550). In contrast, in the central nervous system, higher and higher Many, if not all, of the mature lower vertebrates are new (Aguayo (1985) "Mature mammals Axonal regeneration from damaged neurons in the central nervous system ", Synaptic Pla sticity (C.W. Kotman), New York, The Guildford Press, 457-4 P. 84).   Glial cells are a clear determinant for regulating axonal regrowth. Mammalian Glial cells develop during the development of the central nervous system (Silver et al. (1982), J. Comp.  Neurol.210: 10-29, Miller et al. (1985), Develop. Biol.111: 35-41, Pollerberg et al. (1985), J. Cell. Biol.101: 1921-1929) Of the peripheral nervous system of mature animals (Fawcett et al. (1990), Annu. Rev. Neurosci. .13: 43-60) Generally allows growth of neurites. In this way, the damage During suffering, glial cells in the adult mammalian peripheral nervous system may have some early neurites To promote growth and promote regeneration (Kalderon (Kalderon) 1988) J. Neurosci. Res.twenty one: 501-512, Kliot et al. "Mature mammalian spinal cord. Induction of Dorsal Root Fiber Regeneration in Nervous System ", Contemporary Issues in Nerve Regeneration, New York G, pp. 311-328, Carlstedt et al. (1989), Brain Res. Bull. twenty two: 93-102). Glial cells in the CNS of some lower vertebrates are mature neural Continue to allow site regrowth (Stuermer et al., (1992) J. Neurobiol.twenty three:  537-550). In contrast, glial cells in the central nervous system of adult mammals Does not promote new light regrowth (not conductive).   As a molecular clue to the promotion and / or inhibition of neurite growth Several working recognition molecules have been identified (Martini (1996)). Newra Among the recognition molecules that promote site growth, the neuronal adhesion molecule L1 promotes neurite growth. Plays a prominent role in mediating (Schachner (1990), Seminars  in the NeurosciencesTwo: 497-507). L1-dependent neurite growth is homozygous It is mediated by a homophilic interaction. L1 is an L1 expressing neuron And Schwann cells and fibroblasts transfected with L1 -Enhances light growth (Bixby et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sc. i. U.S.A.84: 2555-2559, Chang et al. (1987), J. Am. Cell. Biol.104: 355 -362, Lagenaur et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.84: 7 753-7757, Seilheimer et al. (1988), J. Am. Cell. Biol.107: 341-35 1, Kadmon et al. (1990a), J. Am. Cell. Biol.110: 193-208, Williams ( Williams) et al. (1992); Cell. Biol.119: 883-892). L1 expression in mature mice Increases dramatically after cutting or disrupting peripheral nerves (Nieke et al. (1985), Dif ferentiation30: 141-151, Martini et al. (1994a), GliaTen: 70-74). Within two days, L1 will reach the interface between neurons and Schwann cells, But accumulates mainly on the cell surface of Schwann cells (Martini et al.). (1994a)). In addition, the homophilic binding capacity of L1 is due to the neural cell adhesion molecule N- It is enhanced by molecular association with the CAM, and binding occurs through homophilic assistance. (Kadmon et al. (1990a), Kadmon et al. (1990a) b), J. Cell. Biol.110: 209-218 and110: 193-208, Horst Corte korte) et al. (1993). Cell. Biol.121: 1409-1421). Newlight growth promoting In addition, L1 is cell adhesion (Rathjen et al. (1984), EMBO J. et al.3: 1-10, Kad Kadmon et al. (1990b), J. Mol. Cell. Biol.110: 209-218, Appel et al. (19 93); Neurosci.,13: 4764-4775), granule cell migration (Lindner et al. (19 83), Nature305: 427-430) and myelination of axons (Wood et al. (1990), J. . Neurosci.Ten: 3635-3645).   L1 has six immunoglobulin-like domains and five fibronectin type II It consists of repeats homologous to I. L1 acts as a signal converter. Its recognition The process is a complex series of events leading to changes in the steady-state levels of intracellular messengers. This is the first stage. Intracellular messengers include inositol phosphate, Ca2+, P H and cyclic nucleotides (Schuch et al. (1990), NeuronThree: 13-20, Fo Von Bohlen and Hallbach et al. (1992), Eur. J. Neurosci. 4: 896-909, Doherty et al. (1992), Curr. Opin. Neurobiol.Two: 595-6 01) is protein kinase C or pp60c-src(Schuch et al. (1990), Neuro nThree: 13-20, Atashi et al. (1992), Neuron8: 831-842) Included as well as changes in the activity of the protein kinases. L1 is casein type II key And another unidentified kinase that phosphorylates L1 (Sadoul et al. (1) 989); Neurochem.328: 251-254). New mediated by L1 -Lite growth is L-type Ca2+Sensitive to channel blockage and pertussis toxin. These findings indicate that Ca2+And G protein are both mediated by L1 (Williams et al. (1992), J. Cell. Biol.119: 883-892). L1 is a growing immature stellate glial cell in culture (Astrocytes), and the growth of neurites is distributed on these cells. Is much better promoted than on activated L1 immunonegative astrocytes (third ( Saad) et al. (1991). Cell. Biol.115: 473-484). However, in vivo Indicate that stellate glial cells are L-expressed at all developmental stages tested from embryonic day 13 to maturity. 1 (Bartsch et al. (1989), J. Comp. Neurol.284 :  451-462, and unpublished data).   Once the ability of L1 to promote neurite growth becomes apparent, L1 and L1 Astrocytes of other members of the immunoglobulin superfamily to which they belong Has been reported to be present on glial cells and myelin in the adult central nervous system Potentially inhibitory cue molecules (Schachner et al., Prospects for Biology, in press, Schwab et al. (1993), Ann. Rev. Neurosci. 16: 565-595). This means To treat weakness caused by birth defects or damage to the nervous system of the CNS It is particularly important to the development of effective strategies for Just for such a purpose.                               Summary of the Invention   In accordance with the present invention, there is provided a method for regulating nerve growth, particularly the area of the central nervous system (CNS) So that growth can be promoted in the territory and especially in myelinated neural tissue An agent for modulation and a corresponding method are disclosed. Of the present invention The agent is inhibitory to the pro-growth stimulus of known neurite growth factors. The ability to promote such nerve growth in the traditionally regarded environment. It is noteworthy in having. In particular, this inhibitory environment includes glia in the central nervous system. Inhibitory cue molecules present on cells and myelin are included.   The agents of the present invention may be from the group of cell adhesion molecules, and more preferably, neuronal cell adhesion. Widely selected from the group of arrival molecules. The agent of the present invention is an immunoglobulin superfamily. Family, especially L1, N-CAM and myelin-related glycoproteins. Special member Ca2+Belongs to a family that mediates independent neuronal adhesion Most preferably, it is selected from the group of molecules. Affects CNS nerve growth Other cell adhesion molecules that may be: laminin, fibronectin , N-cadherin, BSP-2 (mouse N-CAM), D-2,2 24-1A6-A1, L1-CAM, NILE, Nr-CAM, TAG-1 (ax onin-1), Ng-CAM and F3 / F11.   In a further aspect of the invention, the agent of the invention is an L1 family of neural recognition molecules. Belongs to the new family referred to here as This family includes L1 , NgCAM, neurofascin, Drosophila Flies) Neuroglians, zebrafish L1.1 and L1.2 And others. All of the agents in this group are characterized by L1 2 shows an Ig-like domain and an FN-like repeat, in this regard, with significant colinearity, Highly N-glycoside-linked carbohydrates containing HNK-1 carbohydrate structures; Including the major 185 kD band and the smaller 165 and 125 kD bands. 2 shows the pattern of the protein fragment.   The agents of the invention also regulate the growth of neurites in the CNS. Fragments of cell adhesion molecules, cognate molecules, congeners and mimetics thereof including. In particular, this agent includes extracellular matrix molecules, especially fibronectin. Characteristic structural motifs of the homologous repeat and immunoglobulin-like domains of tin type III Molecules that contain the These structural motifs are of the fibronectin type III homologous repeats 1-2 and immunoglobulin-like domains I-II, III-IV and VV Preferably, it contains a motif structurally similar to I.   The present invention relates to a method for promoting and enhancing in vivo nerve regeneration, and to methods of such a method. Plasmids, vectors, and transgenes that can be used to achieve a purpose And all the corresponding genetic constructs, and pharmaceutical compositions. More specific In some cases, the agents of the invention are prepared as vectors or plasmids and regenerated. Is required in neurons located at the site of the CNS where Introduced by, for example, gene therapy techniques to drive expression, and Promotes the necessary nerve growth. Another strategy involves parenteral administration to the CNS site. A process that includes one or more suitable agents in a composition so that it can be delivered directly. Provide one. Certain agents, such as L1, bind with homophilic affinity, Administration of the composition may serve the purpose of inhibiting rather than promoting nerve growth No. The effect is that unwanted or uncontrolled growth may occur or occur. This is desirable in special cases where Will be extended.   Similarly, the ability of an agent to bind homophilic binding will To Such agents include antibodies of the original agent and act as agonists And is thereby involved in promoting nerve growth and regeneration. This Thus, the present invention relates to an agent for use for the therapeutic purposes described herein. And the preparation of appropriate constructs and compositions containing the desired antibodies. In this specification, As will be shown later, antibodies against L1 can be used, for example, in diagnostic and therapeutic applications according to the invention. Drug discovery studies to identify other agents that have activity and utility on both sides How could it help? Specifically, the separation and separation of CHL1, which is an analog of L1, As with polyclonal antibodies, as exemplified later herein for characterization and characterization. Antibodies can be used to identify other members of the L1CAM family Thus, the present invention relates to CAM members isolated by the use of such antibodies. Is also included. The invention also covers diagnostic applications. Here, for example, By detecting or measuring the presence or absence of one or more amounts or activities of the agents of the present invention, It is desirable to assess the potential for transgrowth or its actual development. Similarly, And, as described herein, the present invention relates to the invention in regulating CNS nerve growth. Tests that utilize the activity of the light active agents, including tests involving drug discovery. For example, studies involving an agent of the invention have shown that potential drugs are Stocks that can be tested for length or developed in the context of the present invention Cells or cultures may serve as this test system.   Briefly, the present invention relates to differentiated astrocytes, glial cells, cells and the like. Transgenic mice expressing neural adhesion molecules in tissues derived from Sign. In particular, the nerve adhesion molecule is L1. L1 expression in stellate glial cells Growth of neurites on CNS tissues from these transgenic mice Strengthen.   As discussed above, the present invention enhances neuronal growth of CNS neurons , Memory enhancement, and long term potenti method for enhancing synaptic efficacy as measured by stabilization of It is characterized by other similar useful methods. Modulates the effects of nerve adhesion molecules A method for testing drugs and other operations, and a test suitable for such a method The system is also a feature of the present invention.   Thus, transgenic cells whose glial cells express exogenous neural adhesion molecules It is a primary object of the present invention to provide a mammal.   A further object of the invention is a cell comprising the glial cells of the transgenic mammal. To provide a cell culture.   Yet another object of the present invention is to provide a transgenic mammal with nervous system damage. Or to provide a cell culture system containing optic nerves or other parts not received. You.   A further object of the invention involves culturing neurons of the glial cell culture system. A method for enhancing neuronal growth of CNS neurons.   A further object of the present invention is a method of enhancing neuronal growth of CNS neurons It is to provide. This method involves optic nerves or other nervous system placed in a cell culture system. Culturing the neurons on the portions of   A further object of the invention involves secretion of neural adhesion molecules by the transplanted cells, An object of the present invention is to provide a method for enhancing neuron growth of CNS neurons.   Another object of the invention is to enhance mammalian memory in the brain of a mammal in need of memory enhancement Enhance memory, including administering an effective amount of glial cell culture cells Is to provide a way to   Still another object of the present invention is to provide a cell culture system for a mammalian brain requiring memory enhancement. Useful for enhancing mammalian memory of cells in the optic nerve or other sites of the nervous system in which it is located. It is to provide a method for enhancing memory, comprising administering an effective amount.   It is a further object of the present invention to provide such a brain brain that requires such memory enhancement. A vector that enables expression of a neural adhesion molecule in the glial cell And providing a method for enhancing memory.   A further object of the invention involves secretion of neural adhesion molecules by the transplanted cells, The aim is to provide a way to enhance memory.   Another object of the present invention is to enhance synaptic efficiency in the mammalian brain. Including administering the amount of cells in the glial cell culture system to the mammalian brain. For enhancing synaptic efficiency in the mammalian CNS in need of such potentiation It is to provide.   A further object of the invention is to enhance synaptic efficiency in the mammalian brain. Amount of cells in the optic nerve or other part of the nervous system placed in a cell culture system that is only as effective as possible Administering to the mammalian brain, the CN of a mammal in need of such enhancement It is to provide a method for enhancing synaptic efficiency in S.   A further object is to provide the glial cells of the mammalian brain in need of such enhancement with the glial cells. Delivering a vector that allows expression of the neural adhesion molecule in the rear cells. Methods for enhancing synaptic efficiency in the mammalian CNS in need of such enhancement It is to provide.   A further object of the invention involves secretion of neural adhesion molecules by the transplanted cells, The aim is to provide a method for enhancing synaptic efficiency.   Another object of the invention is to add CNS neurons to a glial cell culture system, The drug to be tested is added to this cell line, Measuring cell growth and control cultures without drug Differential levels of nerve growth in cells in the presence of drug versus neuroadhesive molecule activity Correlating to the drug's ability to modulate It is to provide a method for testing the ability to modulate the activity of a nerve adhesion molecule.   Another object of the present invention is to provide a method for preparing CNS neurons from the optic nerve of a nervous cell culture system or the optic nerve thereof. Add to other parts, add the drug to be tested to this cell culture system Measuring the neuronal growth of CNS neurons, and adding the drug Neuronal growth of cells in the presence of drug versus control cultures without Correlate Bell Differences with Drugs' Ability to Modulate Nerve Adhesion Molecule Activity Methods for testing the ability of drugs and other substances to modulate the activity of neural adhesion molecules, including It is to provide.   Yet another object of the present invention is to provide drugs and other drugs that regulate the production of neural adhesion molecules. Test systems for screening the ability of an agent, including glial cell culture systems And a test system in which CNS neurons are added to the cell culture system. That is.   It is a further object of the present invention to provide drugs and other agents that modulate the production of neural adhesion molecules. Test system for screening the ability of a substance for Culturing glial cell lines co-inoculated, CNS neurons in this cell culture Adding to the system and measuring the growth of neurons and the effect of the drug on it Is to provide a test system that includes measuring   Yet another object of the present invention is to provide drugs and other drugs that regulate the production of neural adhesion molecules. A test system for screening the ability of an agent, comprising a drug or an agent The optic nerve or other part of the nervous system in the cell culture system inoculated with Adding CNS neurons to this cell culture system, and Providing a test system comprising measuring the growth of the drug and measuring the effect of the drug on it. Is Rukoto.   Another object of the invention is to provide drugs and other agents that regulate the production of neural adhesion molecules. A test system for screening quality abilities, comprising culturing CNS neurons. Inoculating with a drug or agent, adding a soluble nerve adhesion molecule, And measuring neuronal growth and measuring the effect of the drug on it. To provide a test system.   Other objects and advantages will be discussed in the following detailed description with reference to the following exemplary drawings. It will be apparent to those skilled in the art.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows a map of the chimeric transgene GFAP-L1. 4.05 kb Ex1 of the modified GFAP gene using the NotI linker Inserted inside. In this construct, the L1 cDNA has an SV40 late 5 'in front of it. There is a gene splice (V), followed by polyadenylation of SV40 on the 3 'side. The signal (pA) is located. Location of L1ATG and Polyadenylation Signal Are shown. Exons are shown as boxes.   Figure 2. Northern blot analysis of brain RNA from different transgenic lines Is shown. Load 10 μg of total brain total RNA from mature animals into each lane And probed with mouse L1 cDNA. The exposure time was 3 days. lane 1-3 are brains from another transgenic progeny (lane 1: line 3426) , Lane 2: line 3427, lane 3: line 3418, lane 4: non-trans Brain from sugenic control). The level of transgenic L1 mRNA (arrow) The three transgenic lines are different, with line 3426 being the highest level, Note that line 3427 is at medium level and line 3418 is at lowest level Please. 28S and 18S rRNA are indicated at the right edge.   FIG. 3 shows the in-situ hybridization of line 3426. Non-transgenic mature mice (A, B and E) and transgenic mature mice Undamaged (A, C and E) and damaged (damaged) from (C and D) 15 and 15 days after wounding, B and D) show the localization of L1 mRNA in the optic nerve. Wild type In animals, L1 mRNA is not found in glial cells of the optic nerve, but in neuronal cells of the retina. It can only be detected in the vesicles (A and B). In transgenic animals, L Cells containing one transcript are visible in the optic nerve (C and D). The density of L1-positive cells is Highest near the nonmyelinated part of the nerve. L1mR in nerve The density of NA-positive cells increases slightly after injury (compare C and D). optic nerve Then, the distribution of cells expressing L1 is similar to that of cells expressing (C and D) GFAP. (E). The scale bar in E is 100 μm (for A to E ).   FIG. 4 shows mature transgenic (lines 3426, A and B) and wild type (C ) Undamaged (A and C) and damaged (28 days post injury) from animal , B) Double immunofluorescence microscopy of L1 (A and B) and GFAP (C) in the optic nerve Indicate position confirmation by L1 immunoreactivity in optic nerve from transgenic animals Increased significantly after injury (compare A and B). Damaged transgenic The pattern of L1 immunoreactivity in nerves is similar to that of GFA in undamaged wild-type nerves Similar to the pattern of P immunostaining. L1-positive non-myelinated retina Cell ganglion axons are present in intact wild-type nerves (A). To C The scale bar is 50 μm (for AC).   FIG. 5 shows the transgenic animals (A, B and C) and wild type on line 3426. L1 (A and D) in cultured stellate glial cells from animals (D, E and F) 2 shows the position of GFAP (B and E) by double immunofluorescence microscopy. Trance Only cells from transgenic animals express L1, whereas astrocytes from wild-type animals. Note that cells are L1-negative. The scale bar in F is 30 μm Yes (for AF).   FIG. 6 shows damage from transgenic and wild-type animals (15 days after injury). ) And Western blot analysis of the undamaged optic nerve (A). damage Injured nerves (lanes 1, 3 and 5) or undamaged nerves (lanes 2, Load 25 μg of total protein from 4 and 6) and run against affinity purified L1 Detected using a polyclonal antibody. Protein extracts are transgenic The mice on lines 3426 (lanes 1 and 2) and 3427 (lanes 3 and 4) and And wild-type animals (lanes 5 and 6). With non-transgenic controls In comparison, an increase in L1 expression is seen in the transgenic animals. Next sight In the transgenic region, high levels of L1 regulation occur in transgenic animals while wild-type The amount of L1 was reduced in serotype animals. Apparent molecular weight (in kD) is shown on the far left .   FIG. 7 shows wild-type animals (A and B) and transgenic animals (C and D, Mouse cerebellum cultured on cryostat sections of the optic nerve from 1 shows an example of growth of neurite derived from Auron. A and C are undamaged Represents nerves, B and D represent damaged optic nerves. The scale bar in D is 50 μm (for AD).   FIG. 8 shows wild-type animals (WT) and transgenic animals (lines 3426, 3426). 427 and 3418) undamaged (c) and damaged (1) Cerebellar neurons maintained on cryostat sections of the optic nerve (28 days after injury) The length of the new light is shown and compared. On sections from transgenic animals Note that the length of the neurite is longer than that on sections from wild-type animals. Yo. In transgenic lines, neurites are always intact nerves It is longer on damaged nerves than above, while wild-type animals Significant difference in neurite length on intact and damaged nerves Is not seen. The length of the new light is L in different transgenic lines 1 There is indeed a correlation with the level of expression (see also Western blot data). one The mean ± standard error of the mean of two representative experiments (from 12) is shown.   FIG. 9 shows the affinity-purified polyclonal antibody against L1 (anti-L1) and the antibody. Preculture with affinity-purified polyclonal antibody (anti-liver) against mouse liver membrane After feeding and without preculture, derived from wild-type animals (WT) and transgenic animals Undamaged (c) and damaged (1) optic nerve (28 days after injury) Neurite length of cerebellar neurons maintained on cryostat sections was measured It is a graph. 100% neuronal neurite length without pre-culture with antibody The neurite length on a section of the same nerve obtained after body treatment is displayed based on this value. did. Significant reduction (60%) in neurite length was detected by transgenesis with L1 antibody. Was found on cryostat sections derived from zoo animals. The top numbers correspond to each number. Represents the total number of nerves measured. Mean ± standard error of the mean was performed in duplicate Determined from at least four independent experiments.   FIG. 10. Polyclonal to L2 purified in the absence of antibody and affinity purified. Antibody (anti-L1) and polyclonal antibody against mouse liver membrane (anti-liver) After pre-incubating sections, wild-type animals (WT) and transgenic animals (line Mouse cerebellum (A) or chick on astrocyte glial cell monolayer prepared from 3426) The neurite length of the DRG (B) neuron is illustrated and compared. With antibodies 100% neurite length on astrocytes without preculture, and antibody Based on this value, the neurite length on the astrocyte monolayer obtained after the treatment was used as a reference. Is shown. Significant decrease in neurite length (about 40%) was due to the L1 antibody and monolayer It is found only on transgenic astrocytes after preculture. Mean ± standard The deviation was at least 100 news from two independent experiments performed in quadruplicate. It was obtained from Ron.*Is the control (wild type or tiger without antibody treatment) (P <0.05, man-negative astrocytes). (Whitney U test) shows the average value.   FIG. 11 shows in vivo regrowth of axons in the optic nerve (0-2000 μm). You. 6-8 week old GFAP-L1 transgenic mice and wild-type mice Fracture in the fossa and after 14 days by anterograde labeling Fluorescein-labeled biotin to mark axons of retinal ganglion cells Followed by ester. Each point represents one animal.   FIG. 12 shows in vivo regrowth of axons in the optic nerve (0-800 μm). . 6-8 week old GFAP-L1 transgenic mice and wild type mice were By anterograde labeling after crushing within 14 days Fluorescein-labeled biotin ester to mark axons of retinal ganglion cells Followed by Each point represents one animal.   FIG. 13 shows the relationship between the avoidance% (memory retention) in the single trial positive avoidance task. Figure 3 shows the effect of injecting Tori L1 antibody into IMHV. Each point is the indicated training Time, injection of L1 antibody (anti-L1) (closed circle) or saline (open square) Represents a group of birds. All animals were tested 24 hours after training (*, P <0.05 between the saline group and the antibody group, ΔTwo).   FIG. 14 shows injection of IgI-IV and FN fragments at −30 minutes and +5.5 hours. Two graphs show the effect of shooting on memory retention for aggressive avoidance tasks. Including. All animals were tested 24 hours after training. Number of animals in each group Is shown in the histogram (*p <0.05,**p <0.005).   FIG. 15 shows pyramidal neurons in the CA1 region of rat hippocampal slices. 1 includes a series of graphs showing the effect of L1 antibodies (anti-L1) on LTP. a is Note before and 50 minutes after TBS (arrow) in control sites where no antibody was injected. The recorded averaged EPSP (n = 4). b is rabbit for mouse L1 TBS (arrow) in the presence of a polyclonal antibody (Rathjen et al. (1984)) ) Is the averaged (n = 4) EPSP recorded before and after 50 minutes. c is L 1 antibody (IgG fraction, 6.2 mg / ml ○) or CHO cells (Hynes) (1992) Cell69: 11-25) to an immunoglobulin-like domain recombinantly expressed in Against polyclonal antibody (antiserum containing about 1 mg / ml of specific antibody, ▼) Time lapse of EPSP initial slope before or after TBS in presence. And the pair The controls were as follows: (1) control LTP (no antibody, □), (2) Reacts strongly with the hippocampal slices of the animal (Lindner et al. (1983), Nature305:  427-430), polyclonal antibody against mouse liver membrane (3.5 mg / ml, ●) In the presence of the body IgG fraction, (3) in the presence of rabbit non-immune serum, (4) TBS (6.2 mg / ml; ○, e, f) See also) Measured. The results were obtained from at least three animals Percent of baseline value recorded 20 minutes before TBS per slice (n = 5) Mean value of EPSP initial slope ± S. E. FIG. M. It is expressed as L1 antibody Of LTP in the presence of LTP differs from that of control LTP, and is directed against immunoglobulin-like domains I-VI. It differs from the control LTP at p <0.01 for the body. d corresponds to L1 Concentration dependence of the reduction of LTP by the IgG fraction of the polyclonal antibodies 6.2 mg / ml; ○, 2 mg / ml; ●, 0.6 mg / ml; ▲, 0.06 m g / ml; □, p <0.0001). As a control, polyclonal against liver membranes The results obtained with the antibody are shown (3.5 mg / ml; ■). e is TBS Before and after application (arrow) of polyclonal antibody against L1 in the absence 6 The average value of EPSP recorded after 0 minute (n = 4). f is in the absence of TBS Before and 30 minutes after application of polyclonal antibody against L1 (arrow) The average (n = 4) of the recorded intracellular excitatory postsynaptic current (EPSP) .   FIG. 16 shows immunoglobulin-like domains I to VI, polyclonal NCAM antibody and 2 shows the effect of oligomannosidic glycopeptides on LTP. a is L1 compared to control LTP (20 mM Tris / HCl pH 7.6, □) Immunoglobulin (Ig) -like domains I-VI (20 mM Tris / HCl pH 7.6) 216 μg / ml, 3.2 mM, o, p <0.01) and L1 fibrone Kutin (FN) type III homologous repeats IV (in 20 mM Tris / HCl pH 7.6) E before and after TBS in the presence of 225 μg / ml, 3.8 mM, ■) This is the elapse of the PSP initial slope. b is an antibody against NCAM (IgG fraction 3.9 mg / ml,）), antiserum (●) against axonin-1 Time lapse of EPSP initial slope before and after TBS recorded in presence You. The controls are as follows: (1) Non-immune rabbit serum (▲), ( 2) IgG fraction of non-immune rabbit serum (3.0 mg / ml, ◆), and (3) TB NCAM antibody without induction of LTP by S (3.9 mg / ml, □, p <0.0 6 is the time lapse of the EPSP initial slope in the presence of 6). C is oligoman Asialofetin (asialofet) in the presence of nosidic glycopeptide (○) uin) in the presence of a control glycopeptide (●) (both at 100 μM), and First EPSP before and after TBS recorded in the absence of glycopeptide (□) This is the time lapse of the initial slope. The results are the baseline recorded 20 minutes before TBS. Mean ± EPS of the EPSP initial slope in% of the E. FIG. M. Represented as (Slices from at least 3 animals, n = 5 or 6).   FIG. 17 shows that the L1 antibody and the oligomannosidic carbohydrate were previously established for L To determine the effects it has on synaptic transmission mediated by TP and MNDA receptors It is illustrated roughly. a is the value of (6.2 mg / ml, ○) or 1% of TBS throughout the experiment. Recording in the presence of added L1 antibody starting at 0 min (6.2 mg / ml, ●) 7 is a time lapse of the EPSP initial slope before and after the performed TBS. b is an experiment Through (100 μM, ○) or 20 minutes after TBS (100 μM, ● ) Before TBS recorded in the presence of added oligomannosidic carbohydrates This is the time lapse of the EPSP initial slope later. c is the addition of L1 antibody (arrow ) NMDA receptor recorded before or after 30 minutes in the presence of CNQX (30 μM) The average of the dependent EPSPs (n = 4). d is oligomannosidic charcoal Recorded in the presence of CNQX (10 μM) before or 60 minutes after hydrate addition (arrow) Averaged NMDA receptor-dependent EPSP (n = 4). a and b Results are EPSP first at% of baseline value recorded 20 minutes prior to TBS Mean ± S.P. E. FIG. M. (At least three animals Derived slices, n = 5).   FIG. 18 shows the nucleotide sequence of the 4.43 kb cDNA insert of clone pX # 2. The columns and the amino acid sequence of mouse CHL1 derived therefrom are illustrated. The longest The open reading frame (bp 296 to bp 3922) is the TGA stop codon Includes 1209 amino acids ending with Signal peptide (amino acids 1 to 24) And two hydrophobic regions representing the transmembrane regions (1082 to 1104) are underlined. You. Two arrows indicate 5 'of clone 311 isolated from the λgt11 library. And the 3 'end. A potential glycosylation site associated with asparagine is (Hubbard and Ivatt, 1981) show a black diamond under the amino acid sequence. Marked with The immunoglobulin (Ig) -like domain is a conserved bird Under Putfan there are Roman numerals from I to VI. Characteristic system Inns are indicated by circles. FN-like repeats are numbered from F1 to F5 And characteristic tryptophan (not in F1, W732 in F2, F3 in F3) W830, W936 for F4, W1053 for F5) and tyrosine / phenyla Lanin (Y682 for F1, Y781 for F2, F888 for F3, Y for F4 989, and not in F5) are boxed. Parentheses are RGD and DG Highlight the EA sequence (amino acid residues 185-187 and 555-558, respectively) doing. Untranslated sequences are numbered in italics. This array data Data obtained from EMBL / Genebank / DDBJ under accession number X94310 can do.   FIG. 19 shows the domain structure of mouse CHL1, the protein fragment expressed by bacteria. Shown is the coding region of one piece, and the hydrophobicity plot. (A) This figure sketches the structural features inferred from the primary structure of CHL1. You. The numbers indicate the amino acid sequence starting at the translation start site. Ig-like domain I to VI are represented by semicircles (amino acid numbers represent cysteine forming disulfide bridges). Point). FN-like repeats 1-5 are symbolized by boxes (a Noic acid numbers point to domain boundaries). N-glycosylation site The part to be covered is indicated by a black circle. Signal peptide and transmembrane region are shaded Indicated by a box. (B) Lines code for recombinant proteins produced in E. coli. Indicates the position of the cDNA to be loaded. (C) Hydrophobic plot of the derived amino acid sequence (Kyte and Doolittle, 1982) disclose a putative hydrophobic signal. Sequence and transmembrane domain (*Characteristic properties of a complete membrane protein with You. The number of + indicates hydrophobicity. The numbers on the horizontal axis indicate amino acid positions.   FIG. 20 shows the sequence of the intracellular domain of the L1 family of molecules. Putative transmembrane The sequence of the intracellular domain, starting at the first amino acid residue after the region, is the mouse CHL 1. Mouse L1, chicken Nr-CAM, chicken Ng-CAM, chicken -Neurofascin, Drosophila neuroglia, And zebrafish L1.2. The number is CHL1 And the gray box indicates the amino acid position introduced in the CHL1 sequence. Shows the top. Identical amino acids that appear in most sequences are marked with black boxes. is there. Three brackets (I, II and III) indicate a highly conserved sequence.   FIG. 21 shows CHL1 and L1 mRNA in different tissues of mouse and rat. 5 is a Northern blot analysis. (A) Brain (lanes 1 and 5) except for cerebellum (lanes 2 and 8) of 9-day-old mouse, spinal cord ( Lane 3, 7) and poly (A) RNA (2 μl) of dorsal root ganglia (lanes 4, 8) g) as well as cerebellar total RNA (10 μg) with CHL1 (lanes 1-4) or L1 ( Lanes 5 to 8) Hybridized with riboprobe. Kidney (lane 9), spleen (Lane 10), poly (A) from liver (lane 11) and thymus (lane 12) )*RNA (1 μg) and small intestine (lane 13) and lung (lane 1) of 9-day-old mice 4) Poly (A) derived*RNA (0.5 μg) was mixed with CHL1 riboprobe and hybridized. It was redisused. (B) NGF induced (lane 1) and non-induced (lane 2) PC Total RNA (20 μg) of 12 cells, Kos-1 cells (lane 3), and 9 days old (La 4) and 6 days old (lane 5) Rat cerebellum total RNA (30 μg) Hybridized with one riboprobe. RNA markers are shown on the left.   FIG. 22 shows the specificity of polyclonal antibodies to CHL1 and 3 shows expression of CHL1. (A) Brain-derived immunopurified L1 (lane 1 (2 μg)), N-CAM (Lae 1) 2 (2 μg)), MAG (lane 3 (2 μg)), recombinant using CHL1 antibody CHL1 protein fragment purified by anion exchange chromatography 4 (0.1 μg)). (B) 9-day-old mouse brain 1), liver (lane 2), lung (lane 3), kidney (lane 4), and small intestine (lane 4). The soluble fraction (S) and the insoluble fraction ( M) Western blot analysis. The number (b) on the left indicates the brain (lane 1) and liver ( 2) refers to the molecular mass of the CHL1 immunoreactive band.   Molecular mass standards are indicated in kD at the left (a) and right (b) ends.   FIG. 23 shows detection of CHL1 on transiently transfected Cos-1 cells. Is shown. CHL1 transfected (a) and mock-transfect (C) Monoclonal culture of COS-1 cells was subjected to polyclonal antibody against CHL1. (B, d), and the corresponding phase contrast micrographs were respectively (a , C). The line in d is 30 μm for ad.   FIG. 24 shows mouse retina by in situ hybridization analysis. , Illustrating the location of CHL1 and L1 mRNA in sections of optic nerve and cerebellar cortex I do. In the retina of 7-day-old mice, L1 mRNA is localized in the ganglion cell layer Amacrine cells located in ganglion cells (a-1) and in the inner nuclear layer And horizontal cells (1 of 2). In the retina or glial cells in the optic nerve Other cell types do not contain detectable levels of L1 transcript (a). CHL1m RNA is present at the inner boundaries of ganglion cells and the inner nuclear layer (i.e., vitrea It can be detected weekly with several cells localized in d)) (b). Proximal to the optic nerve ( That is, glial cells localized in the (near retina) region are CHL1 antisense cRNA. Glia cells that are strongly labeled by the probe, but are localized to more distant regions, are weakly labeled. (B). In the cerebellar cortex of 2-week-old mice, L1 transcripts are (Mol) in astrocytes and cage cells and in the inner nuclear layer (Ig1: d) It can be detected in Golgi cells and granule cells. The CHL1 transcript has a similar pattern. Distributed in turns. The only exception is that the label is barely visible in the thin part of the molecular layer (B). A section hybridized with a CHL1 sense cRNA probe No label on the strip (for 7 day old retina and optic nerve, see c). The line at c is 100 μm for ac, and the line at e is d and e. On the other hand, it is 150 μm.   FIG. 25 shows the position of CHL1 in astrocyte glial cell culture by immunofluorescence microscopy. Indicates confirmation. Double immunolabeling of cultured mouse astrocytes was performed with polyclonal against CHL1. Using a null antibody (a, d) and a monoclonal antibody (b, e) against GFAP Was done. (C and f) are the corresponding positions for (a, b and d, e) respectively. It is a phase contrast micrograph. The lines at c and f are for ac and df respectively. 20 μm.   FIG. 26 is a western blot analysis of deglycosylated CHL1. Soluble (S) or insoluble (S) of surfactant lysate of crude membrane derived from 7-day-old mouse brain M) Fractions were collected from N-glycosidase F (N), O-glycosidase (O), both enzymes ( N + O) or without enzyme (-) and Western blot And reacted with an antibody against CHL1. Molecular mass standards are shown in kD at the right end I have. Glycosylated and deglycosylated CHL1 Are shown in kD in the lower box.   FIG. 27 shows the presence of MNK-1 carbohydrate in CHL1 immunoprecipitate from brain tissue Indicates that CHL1 is derived from surfactant lysate of whole brain tissue of 9-day-old mouse brain. Immunoprecipitated using HL1 antibody. Brain lysate (lane 1) and immunoprecipitate (Lanes 2, 3) were separated by SDS-PAGE, blotted and HNK- Monoclonal antibody 312 or CHL1 against one epitope (lanes 1 and 2) Incubated with antibody (lane 3). The standard of molecular mass is k at the right end. Indicated by D.   Figure 28: Hippocampal neurons when cultured with L929-transfectants New Light Growth   Hippocampal neurons from 18-day-old rat embryos were transformed with L929-transfectants. Alternatively, the cells were cultured in a subconfluent monolayer of parental L929 cells. 11-12 After incubation between the cells, the cells were fixed and monoclonal antibody 412 (HNK-1 carbohydrate (Recognizing pitopes) or polyclonal antibodies against NCAM. Total Neurons highly diverge in these cells to measure neurite length Therefore, only the longest neurite per branch was measured. (A) Neurite growth is promoted by CHL1 and can be inhibited by antibodies It is. Neurons are treated with CHL1-transfectant (CHL1) or parental Polyclonal antibodies against recombinant CHL1 with L929 cells (L929) (Addition of 500 μg / ml of purified IgG 45 minutes after plating) (+ AB) or without addition and cultured on L1-transfectants. 4 The average of the total neurite length of ~ 5 independent experiments is shown. Error line is average The standard error of the value. (B) Different CHL1 lines promote neurite growth better than L1 You. Neurons are expressed in two different CHL1-trans with slightly different expression levels. Pectants (CHL1 line 1, CHL1 line 2) and parental L929 cells (L929) and L1 transfectants (L1). Total Nura The site length was expressed as a percentage of control (ctr) L929 cells. Error The line is the standard error of the mean. (C) Newlight growth promotion also affects all length classes of newlight give. Add antibody (+ AB) or treat with antibody as given in (A) Without the CHL1-transfectant (CHL1 lines 1 and 2) and parent Length of hippocampal neurons cultured with L929 cells of L929 (L929) Cumulative frequency distribution plot of the total amount of. New length equal to or greater than some length x (vertical axis) The percentage of neurons with light is a function of the new light length x (horizontal axis) Plotted. These values are from one representative experiment.   Figure 29: Small cerebellar nucleus cultured with L929-transfectant Ron's New Light Growth   Cerebellar neurons from 6-7 day-old mice were transformed with CHL1-transfectant (CHL1), non-expressing L929 cells transfected with CHL1 (model 20 hours on parental L929 or L1-transfectant (L1) Cultured. Staining of the cells was performed as previously described in FIG. (A) CHL1 promotes neurite growth of small cerebellar neurons. Three times The average of the total neurite length of the experiment is shown. Error line is standard error of the mean . (B) CHL1 also promotes neurite growth of small cerebellar neurons more than L1 Promote well. Total neurite length is the percentage of control (ctr) L929 cells. Represented as Error is the standard error of the mean. (C) Increase in cerebellar neuron neurite growth by CHL1 Affect the new light. New longer than or equal to a certain length x (vertical axis) Cumulative frequency distribution of total neurite length as a percentage of neurons with light The plot was plotted as a function of neurite length x (horizontal axis). One representative The values obtained from experimental experiments are shown.   Figure 30: Neurite growth of hippocampal neurons treated with soluble CHL1   Hippocampal neurons were cultured on coverslips coated with poly-L-lysine with CHL1 -Transfectant (CHL1), parental L-929 cells (L929) or L 1-Transfectant (L1) crude membrane preparation supernatant (40 μg total protein) / Ml) and cultured for 12 hours. The staining and measurement of neurite length has already been described. This was performed in the same manner as the solid (FIG. 7). (A) Soluble CHL1 derived from L929 transfectant is expressed in whole cells per cell. -Promotes longest and aggregate growth of light. The absolute length of the longest new light and the total Turlite length is indicated. These values are the average of three independent experiments. error Is the standard error of the mean. (B) Soluble CHL1 slightly promotes increase in neurite number. Parent L929 Percent of neurite length of hippocampal neurons treated with supernatant from cells (ctr) The total new light length in cents is plotted. The numbers are three independent It is the average of the experiment. Error is the standard error of the mean. (C) Soluble CHL1 affects growth promotion of neurites of all lengths . The cumulative frequency distribution plot of the total neurite length obtained from one representative experiment is shown. Have been.   FIG. 31: CHL1- and L1-tan in L929 transfectants Quantitative aggregation analysis and stability of protein (A) Quantitative analysis of S2 cell transfectant aggregation. To detect aggregation , CHL1- (CHL1) (ctr) and L1- (L1) transfected cells (About 3 × 106Cells / ml), CuSOFourOf transgene expression by The cells were cultured in a culture medium for 18 hours with (+ ind) or without (-ind) induction. grain Pups were counted at the beginning and end of the incubation with a haemocytometer. Aggregation parsing Was calculated by the index (1-N / NO) × 100. N18 and N O represents the number of particles at the end or at the beginning of the incubation, respectively. Number Is the average of at least four independent experiments. The error line is the standard deviation. (B) L929-transfectant aggregation kinetics. CHL1-Transf Cell (CHL1), CHL1-transfected but non-expressing cells (CHL1). Mock), parent L929 cells (L929), and L1-transfected cells (L 1) treated with low concentration of trypsin-EDTA to detach from tissue culture, wash, Incubated at 37 ° C. in polystyrene tubes. 30 min for each sample And the number of particles was counted with a hemocytometer. The results are described in (A). Show The figures given are the average of at least three independent experiments. Line is standard deviation .                   DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS OF THE INVENTION   More specifically, the present invention relates to the growth of neurites in the central nervous system (CNS). In order to promote osteoporosis, the term “CNS nerve growth regulator” (CNGMs ), The use of certain agents identified in particular as defined herein. Group of neuronal adhesion molecules. Generally, neurons in the adult central nervous system Believes that regeneration is not feasible due to inhibitory cue molecules present on glial cells. It has been obtained. The agents and methods of the present invention overcome this inhibition and Can be used to promote the growth of new light.   Agents of the Invention Can Regulate and Promote CNS Neurite Growth All cell adhesion molecules, especially those belonging to the immunoglobulin superfamily And can be selected from such molecules. More specifically, these Molecules include Ca, including L1, N-CAM and myelin-associated glycoprotein, etc.2+ -Immunoglobulin superfamily mediates independent neuronal cell adhesion Selected from Lee members. The invention also has neurite promoting activity Also encompassed are fragments, analogs, homologs, congeners, and mimetics of these molecules. This Particularly preferred structural motifs of these fragments and analogs include fibronectin Domains and immunoglobulins similar to type III homologous repeats (particularly repeats 1-2) Like domains (especially domains I-II, III-IV, and V-VI). Departure Ming agents and especially members of the L1CAM family are agents and Since both of these antagonists show homophilic binding, their antibodies are Can act as agonists in terms of receptors for Be used for diagnostic and therapeutic applications in the same manner and for the same purpose as itself. Can be. Thus, L1 acts as a receptor, and the antibody Promotes the growth of neurites as described in the specification, particularly in the CNS. It can be used as an agonist to help life. This ability is also L L1CAM protein, a neural recognition molecule in which an antibody against Its ability to be useful in methods for identifying additional members of Millie Is further proven in Accordingly, the present invention has been identified by such antibodies. , Isolated and characterized molecules. Therefore, As such, a group of compounds identified below as CNS nerve growth regulators The substance may be an antibody against a CAM such as L1 and, among other things, herein. And its analogs, such as CHL1 described below.   The present invention relates to CNS nerve growth regulators (CNGMs) or differentiated astrocytes. Is related in part to ectopic expression of neuronal cell adhesion molecules in vivo You. These molecules are located on and in the monolayer of such astrocytes. On cryostat sections of undamaged and damaged adult mouse optic nerve, and Neurite growth in in vivo optic nerve crush experiments in transgenic animals It was found to enhance. Increased neurite growth promoting ability is due to ectopic CNG It is proportional to the M expression level. This indicates that transgenically encoded CNG Comparison of different transgenic lines of the invention that differ in the basal expression of M And correlates with subsequent increases in CNGM expression following optic nerve injury. Was.   Optic nerves both injured and undamaged use of the present invention. Suitable for use in any part of the nervous system, including parts of the brain and spinal cord What can be done should be appreciated.   Neurite growth is dependent on the level of CNGM expression by astrocytes. And this is how CNG is promoted in promoting neurite growth in transgenic animals. It shows the specific effects of M. New light growth is polyclonal C Inhibited by NGM antibody, but not by antibody against mouse liver membrane This means that both antibodies are neurons and astrocytes in transgenic animals. Reacts well with the cell surface, especially supporting this specificity .   In a preferred embodiment, CNGM is L1. The biological effect of L1 is L1 Can be inhibited by antibodies, which indicates that L1 Allophilic in trans configuration on the cell surface Is active. In addition, the chicken dorsal root ganglion neurons Non-reactive L1 species-specific antibodies are transgenic astrocytes Inhibits neurite growth of upper neuronal cell types. These facts distract L1. Rarely identified as a trans-acting active molecule, and usually lack L1 expression Ectopic expression of L1 by glial cells in vitro Significantly enhances growth.   Neurite growth on glial cells that do not normally express L1 in vivo Transgene-mediated potentiation is associated with the central nervous system of mature mammals. Cells can be more inductive to the growth of neurites Indicates that Glia-induced molecules that promote neurite growth (Smith et al., (1986) J. Comp. Neurol.251: 23-43 Smith, et al., (1990) Dev. Biol.138: 377-390) Generation of recognition molecules normally highly expressed by glial cells in the mammalian peripheral nervous system Seems to be compensated for by the present (Niecke et al. (1985), Bixb y) et al. (1988). Cell. Biol.107: 353-362, Seilheimer et al. (19 88); Cell. Biol.107: 341-351).   The phenotype of mature astrocytes from this transgenic line is Aiming for greater capacity associated with Schwann cells to reexpress L1 after pain May be modified. The enhancement of L1 expression by Schwann cells A neuron that is adjusted to a high level after injury by an autocrine mechanism It appears to be mediated by neurotrophins (Seilheimer mer) et al. (1987), EMBO J .;6: 1611-1616). Similarly, stellate glial cells in culture L1 expression can be regulated at high levels by TGF-β and NGF (Saad (Saa d) et al. (1991)). Transfect mice with GFAP-L1 transgene That mature astrocytes are not capable of responding to nerve damage Is overcome by high-level regulation of the neurite growth-promoting molecule L1 become. Expression of L1 inhibits several molecules that inhibit neurite growth (Shackna -(Schachner) et al., Future perspectives on developmental neurobiology, in print, Schwab (1995) Ann. Rev. Neurosci. 16: 565-595) It is particularly beneficial for the growth of neurites in erinized tubes.   The present invention is based on the finding that the inhibitory effect on astrocytes and oligodendrocytes is defined herein. Ectopically expressed by the neurite growth-promoting properties of defined agents That it can be at least partially overcome, as particularly exemplified by the activity of L1. Prove it. L1 expression by astrocytes is an inhibitory effect of oligodendrocytes It also seems to compensate. Permissive and non-permissive cue molecules are therefore new. It will not need to be located on the same cell type where light growth occurs. So Rather, such clue molecules may be scattered between different cell types. L Cellular and molecular manipulation of 1 and other neurite growth promoting molecules Can therefore enhance regenerative capacity following damage or disease of the central nervous system in adult mammals To   As mentioned previously, the present invention encompasses the promotion of nerve growth in the CNS. This Growth like, as well as structures and tissues that show incomplete or immature formation, Includes regeneration of structures lost due to damage or disease . The agents of the present invention may be neuroprotective or as exemplified herein below. It also has a nerve-preserving effect, for example, inhibiting nerve degeneration and loss due to various etiologies Can be administered to prevent or inhibit.   The present invention therefore provides for the promotion of expression of this agent, such as through gene therapy. Drugs to treat damaged or diseased CNS structures, if any Of exogenously administering this agent to a suitable and beneficial location in the form of a biological composition Include all constructs and compositions that contain or deliver the agents of the present invention. I do. In the latter context, the currently identified groups such as L1 and N-CAM Members appear to bind with homophilic affinity and are therefore delivered by the method of expression May appear to be more advantageous when When administered, some of these agents can exert a growth-promoting effect Is expected. The invention encompasses both routes of administration and protocols where possible I do.   The present invention is aimed at regulating nerve growth, regeneration and nerve survival in the CNS It should also be evaluated for implications for the use of CNGM secreting cells. With such Thus, certain soluble CNGMs and their fragments, and their homologous molecules Are also within the scope of the present invention.   Accordingly, as used herein, the following terms have the definitions set out below. Should be.   The terms "agent", "CNS neural growth regulator" dulator) ”,“ CNGM ”,“ neural recognition molecule ”,“ recognition factor ”,“ recognition factor tan Park (s) ”,“ Neuroadhesion molecules ”and any list not specifically listed All of the paraphrases can be used interchangeably herein. As used throughout the specification and claims, single or multi-chain proteins Refers to proteinaceous substances, including quality, And all proteins having the activity characteristics mentioned in the claims. Up The term is used to describe the activities of such proteins, homologs, homologs, mimetics and analogs. Sexual fragments as well as small molecules that behave similarly to the agent.   Therefore, proteins that exhibit substantially equivalent or modified activity are likewise considered. It is. These modifications are intended, for example, as those obtained by site-substitution mutations. The production of complex or prominent subunits, which may be diagrammatic It may be accidental, resulting from mutation of the producing host. Also for The words "CNS nerve growth regulator", "CNGM", "neural recognition factor", "recognition factor" "," Recognition factor protein (s) "and" neural adhesion molecule "are used herein. Analogs that include within their scope the proteins specifically listed in And all allelic variations.   Preferably, the amino acid residues described herein are in the "L" isomeric form. However, residues in the "D" isomeric form are responsible for the desired mechanism of immunoglobulin binding. Any L-amino acid residue as long as the functional property is retained in the polypeptide. Can be replaced. NHTwoIs the free amino acid at the amino terminus of the polypeptide. Refers to a mino group. COOH is a free radical at the carboxy terminus of the polypeptide. Refers to a boxy group. Standard nomenclature for polypeptides, J. et al. Biol. Chem. , 2 43: 3552-59 (1969), the abbreviations for amino acid residues are given in the following correspondence table. Show.   All amino acid residue sequences shown in this specification have left and right Note that the normal orientation is from terminal to carboxy terminal. further And the dash at the beginning and end of the amino acid residue sequence are one or more amino acids. Note that this indicates a peptide bond to a further sequence of acid residues. It is. The above table correlates the three-letter notation and one-letter notation that appear both in this specification. It is shown to make   “Replicons” function as autonomous DNA replication units in vivo. That is, a genetic element that can replicate under its own control (eg, plus Midos, chromosomes, viruses).   A "vector" binds another DNA fragment to it and replicates the ligated fragment. A replicon such as a plasmid, phage or cosmid .   "DNA molecules" are deoxyribonucleotides (adenine, guanine, thymine or Refers to the polymer form of cytosine) and takes the form of a single-stranded or double-stranded helix. This Term refers only to the primary or secondary structure of the molecule and limits it to a particular tertiary structure It does not do. Thus, the term especially refers to linear DNA molecules (eg, Double-stranded DNA, viruses, plasmids, and Including chromosome. When discussing the structure of a particular double-stranded DNA, In the description, the non-transcribed strand of DNA (ie, a strand having a sequence homologous to mRNA) ) Are described according to the usual practice of describing sequences only in the 5 'to 3' direction You.   "Origin of replication" refers to DNA sequences that participate in DNA synthesis.   DNA "coding sequences" are placed in vivo when placed under the control of appropriate regulatory sequences. A double-stranded DNA sequence that is transcribed and translated into a polypeptide. Code array Borders the initiation codon at the 5 '(amino) terminus and the 3' (carboxy) terminus Determined by translation stop codon. Coding sequences include prokaryotic sequences, eukaryotic sequences cDNA made from mRNA, genome D from eukaryotes (eg, mammals) NA sequences, and even synthetic DNA sequences, including but not limited to Not something. The polyadenylation signal and transcription termination sequence are usually 3 'of the coding sequence. Located on the side.   Transcription and translation control sequences include promoters, enhancers, polyadenylation signals. DNA regulatory sequences such as nulls, terminators and others, Directs the expression of the coding sequence.   A “promoter sequence” binds to RNA polymerase in a cell and A DNA regulatory region capable of initiating translation in the downstream direction (3 'direction). You. For purposes of the present invention, the promoter sequence is 3 'to its transcription start site. Binds to ends and extends upstream (5 'direction), detected in background above Include the minimum amount of bases or elements needed to initiate transcription at the possible level You. The promoter sequence contains a transcription initiation site (for convenience, a nuclease S1 is used). Can be determined by tapping) and RNA polymerase A protein binding domain (consensus sequence) is found. Eukaryotic promo Data is not always, but often, “TATA” box and “CAT” box Contains Prokaryotic promoters have a consensus arrangement of -10 and -35. Contains the Shine-Dalgarno sequence in addition to the rows.   An "expression control sequence" controls and regulates the transcription and translation of another DNA sequence DNA sequence. The coding sequence is an RNA polymerase that converts the coding sequence to mRNA. And then translates it into the protein encoded by the coding sequence In the cell, the transcription control sequence and the translation control sequence "is there.   A "signal sequence" can be included before the coding sequence. This sequence is At the N-terminus of the peptide, direct the polypeptide to the cell surface or culture the polypeptide. It encodes a signal peptide that is transmitted to the host for secretion into the earth. And this The gnal peptide is cut off by the host cell before the protein is released from the cell. It is. Signal sequences are associated with a variety of prokaryotic and eukaryotic proteins. Can be found.   The term “oligonucleotide” when used herein to refer to a probe Defined as a molecule comprising two or more, preferably three or more ribonucleotides You. Its exact size depends on many factors, and these factors, in turn, Will depend on the ultimate function and use of the oligonucleotide.   The term "primer", as used herein, refers to the term "primer" in a purified restriction digest. Oligonucleotides, whether naturally occurring or synthetically made Point to. Primers induce the synthesis of primer extension products complementary to the nucleic acid strand. Conditions, ie the presence of inducers such as nucleotides and DNA polymerase Can act as a starting point for synthesis when placed under a suitable temperature and pH. Can be. Primers can be single-stranded or double-stranded, but in the presence of an inducer. It must be long enough to begin the synthesis of the desired extension product. Primer The exact length of a primer depends on many factors, including temperature, source of primer and method of use. Is done. For example, oligonucleotides may be used for diagnostic applications that depend on the complexity of the target sequence. Reotide primers will usually contain 15-25 or more. Also, And may contain the following nucleotides:   As used herein, a primer "substantially" binds to different strands of a particular target DNA sequence. "Selected to be complementary, since primers hybridize with each strand Means that they must be sufficiently complementary to form a lid. Follow Thus, the primer sequence need not reflect the exact sequence of the template. For example, ply If the remainder of the mer sequence is complementary to that strand, then the non-complementary nucleotide fragment is It can be attached to the 5 'end of the primer. In addition, the primer sequence is It has sufficient complementarity with the strand sequence to form a bridging, Non-complementary bases or longer sequences can serve as templates for the synthesis of long products. Can be scattered throughout the primer.   As used herein, the terms "restriction endonuclease" and "restriction enzyme" Cuts double-stranded DNA, each at or near a specific nucleotide sequence Refers to bacterial enzymes.   The cell is capable of producing such D when exogenous or heterologous DNA is introduced into the cell. The cells are said to be "transformed" by the NA. Transformation DNA becomes chromosomal DNA May be integrated (covalently linked) and become part of the cell's genome Sometimes it doesn't. In prokaryotic, yeast, and mammalian cells, for example, transformation The replacement DNA may be maintained on an episomal element such as a plasmid. Eukaryotic cells Thus, stably transformed cells may be inherited by daughter cells through chromosome duplication. In which the transforming DNA has been integrated into the chromosome. This stability Is a strain that establishes a cell line or clone consisting of a population of daughter cells containing the transforming DNA. Revealed by nuclear cell capabilities. "Clone" is by single cell or mitosis A population of cells derived from a common ancestor. "Cell lines" are in vitro for many generations This is a clone of primary cells that can grow stably.   Two DNA sequences have fewer nucleotides over a given length of the DNA sequence. At least about 75% (preferably at least about 80%, most preferably at least about (90 or 95%) are "substantially homologous" when matched. Substantially homologous arrangement Sequences can be compared for sequences using standard software available in the sequence databank. Or under the strict conditions specified for a particular system, for example. Can be identified in hybridization experiments. Suitable hybrida Defining the conditions of is within the skill of the art. For example, Maniati Maniatis et al., Supra, DNA cloning, Volumes I and II, supra, nucleic acid hybrids. Dization, supra.   The "heterologous" region of a DNA construct is naturally originated in the context of larger molecules. Unidentified DNA fragments within a larger DNA molecule that are not seen. In this way When the heterologous region encodes a mammalian gene, the gene is In the genome of a product, DNA that is not present on both sides of the mammalian genomic DNA Both sides are pinched. Another example of a heterologous coding sequence is that the coding sequence itself is natural. Some constructs are not found in the world (for example, if the genomic coding sequence contains introns). Such cDNA or a synthetic sequence with codons different from the natural gene. Column). An allelic variation or a naturally occurring mutation event is as defined herein. No heterologous regions of DNA.   An “antibody” is an immunoglobulin that binds to a specific epitope, Including these fragments. This term refers to polyclonal, monoclonal, and chimeric antibodies. Including. For more information on the last chimeric antibody, see US Pat. No. 4,816,39. No. 7 and 4,816,567.   "Antibody binding site" refers to the variable and ultra-light chain of the heavy and light chains that specifically bind to an antigen. It is the structural part of the antibody molecule composed of the variable region.   The term "antibody molecule", as used herein, may have various grammatical variants. The complete immunoglobulin molecule, including the immunologically active portion of the immunoglobulin molecule, including Minute means both.   A typical antibody molecule is a complete immunoglobulin molecule, a substantially complete immunoglobulin. Molecules, and portions thereof, are preferred for use in the therapeutic methods described herein. ab, Fab ', F (ab')Two, And F (v) known to those skilled in the art. These are the portions of the immunoglobulin molecule that contain the paratope, such as those portions.   Fab and F (ab ') of antibody moleculeTwoPart can be implemented in a well-known manner. Proteolytic reactions of papain and pepsin on qualitatively complete antibody molecules, respectively. Prepared. For example, Theofilopolous et al. See No. 4,342,566. Fab 'antibody molecule portions are also well known Yes, F (ab ')TwoLinking two heavy chains with mercaptoethanol Disulfide bond, and the resulting protein mercaptan It is prepared by alkylation with a reagent such as cetamide. Includes complete antibody Antibodies are preferred in the present invention.   The term "monoclonal antibody" is intended to include certain antigens, including grammatical variants thereof. Refers to an antibody having only one antibody binding site capable of immunoreacting with Thus, a monoclonal antibody usually contains only one antibody against the antigen with which it immunoreacts. Shows the binding affinity of Therefore, monoclonal antibodies have different antigens For example, bispecific (chimeric) monoclonal antibodies with immunospecificity against An antibody molecule having multiple antibody binding sites, such as   The term "pharmaceutically acceptable" refers to physiologically tolerated and administered to humans. As well as allergic or similarly adverse reactions such as stomach problems, dizziness Refers to molecular entities and compositions that do not cause   The term "therapeutically effective amount" is used herein to refer to the S phase activity of a target cell population. Clinically significant changes or diseases such as high blood pressure, high fever, and increased white blood cell count To prevent the pathological symptoms associated with the presence and activity of Up to 30%, more preferably up to at least about 50%, most preferably at least Also means an amount sufficient to reduce symptoms by about 90%.   The DNA sequence is such that the expression control sequences control and regulate the transcription and translation of the DNA sequence. Is said to be "operably linked" to this expression control sequence. "Functionally linked The term "" includes a suitable initiation signal (e.g., For example, the presence of ATG) or the generation of a DNA sequence under the control of an expression control sequence To produce the desired product encoded by this DNA sequence. This includes maintaining the correct reading frame to work. set The gene you want to insert into the recombinant DNA molecule does not contain an appropriate start signal. When this is the case, such a start signal can be inserted before this gene.   The term "standard hybridization conditions" refers to both hybridization and washing. For 5 × SSC and 65 ° C. salt and temperature conditions.   In one aspect, the invention relates to CNGM or neural recognition molecules, especially L1 and preferably Transgenic animals that express them in dendritic glial cells. these Of the animals have an enhanced ability for nerve growth in the central nervous system.   The present invention also provides for the targeting of target proteins by interfering with or enhancing CNGM's neurorecognition activity. Screen for potential drugs effective in regulating nerve growth in mammalian cells Includes test system for "Neural recognition activity" or "nerve adhesion activity" Consequences of CNGM binding to other molecules, including intracellular effects on second messengers Means a biological effect. In one example, the test drug is administered to CNS nerve growth To compare the binding activity of a modulator to a chemical sample or test drug with a control And a ligand that activates the CNS nerve growth regulator to measure its effect Transgenes that are co-administered to a cell sample or that express a CNS nerve growth regulator Nick animals can be administered. At least some of the current CNS nerve growth regulators Another, especially to identify the properties of L1, is that Ca2+, PH, cyclic nucleotide, In steady-state levels of intracellular messengers containing liposomes and protein ink Nase C, pp60c-srcPhosphorylates casein type II kinase and L1 Changes in the activity of protein kinases, such as other kinases that are known to Regulators will be involved.   The test system binds to CNGM and proteins in the cytoplasm or nucleus and thereby Adaptable to identify drugs and other entities that can inhibit or enhance transcriptase activity It would be more important to do so. Such tests may have a nerve growth or synaptic effect. Drugs specific to a particular cellular activity, such as enhancement of It will be useful in the development of drugs that enhance such activity in terms of bells. For example , Such drugs may regulate nerve growth in response to injury or have other etiologies. For treating Parkinson's disease, ALS, Huntington's disease and Alz It may be useful in treating neurodegenerative diseases such as Heimer's disease. No.   In a further aspect, the present invention provides an agonist of the activity of a CNS nerve growth regulator. And antagonists. In particular, neurons that recognize CNGM like L1 Agents or molecules that inhibit the ability of neurons are contraindicated in nerve growth and If the pharmaceutical composition containing the agent can be administered directly to the target site Can be used to block nerve growth. In other embodiments, The gonist recognizes some sequences in the L1 domain, especially the fibronectin type III homology It may be a peptide having between 2 and 3 or an antibody against that region. these All of these molecules have homophilic binding (ie, a specific CNGM) such as L1 , L1 is capable of binding itself, and therefore, is capable of binding antibodies to L1 Both body fragments can bind to L1. If you have the ability to receive Could be used.   One of the diagnostic uses of the present invention is to use the CNGM as a protein kinase inhibitor screen. It is used for testing. The activity of CNGM described herein is CNGM is likely to be dephosphorylated by specific phosphatases It seems to be. Thus, inhibition of specific kinases or phosphatases Is a way of pharmaceutical interference that would modulate the activity of neuronal recognition proteins.   The present invention extends to the development of antibodies to CNGM. Such antibodies naturally occur Also, recombinantly prepared antibodies are included. For example, the antibody encodes CNGM To screen expression libraries to obtain genes or genes The body can be used. Such antibodies are prepared by known genetic techniques Antibodies, both polyclonal and monoclonal (Chimeric) for additional diagnostic use in relation to antibodies and the ability to regulate nerve growth Antibodies having other functions for matching them are also included.   In particular, antibodies to the CNS nerve growth regulator bind to this protein. Can be selected using special capabilities, and these are within the scope of the present invention. Can be Thus, the activity of the nerve growth regulator or the causal link to it The activity of a specific polypeptide, which is believed to be Use of an appropriately labeled amount of a nerve growth regulator or antibody or analog thereof. Depending on the application, it can be pursued directly.   Thus, CNGM, their analogs and antagonists or their counterparts Such antibodies can be used in connection with a variety of diagnostic techniques. These diagnostic techniques Can be, for example, radioactive addition, reduction with sodium borohydride, or radiation. Radioimmunoasage with antibodies to CNGM labeled by active iodination An immunological test such as a sie is included.   In immunoassays, a control amount such as an antagonist or antibody thereto is prepared. Labeled with enzymes, specific binding partners and / or radioactive elements, then cell samples Introduce inside. The labeling substance or its binding partner (s) After being given the opportunity to react with the site, the resulting mass depends on the nature of the added label. Consider a known technique that can vary. For example, selecting an antibody against CNGM, A typical test design can be adopted to track proteins as described above .ThreeH,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,1 twenty five I,131I, and186When using radioactive labels such as isotopes such as Re The known measurement operation currently available is available. If the label is an enzyme, Sources known in the state of the art and currently available colorimetry, spectrophotometry, fluorescence spectroscopy It can be carried out by any one of the degree method, the current determination method, and the gas determination method.   The present invention is directed to quantitative analysis of the degree of presence of nerve growth regulators or their activity. In the form of a test kit to identify drugs or other agents that mimic or block Includes test systems that can be prepared. This system or test kit is discussed herein. Labeling by one of the following radioactive and / or enzymatic techniques: Standards prepared by coupling to their agonists and / or antagonists An intellectual component and one or more additional immunochemical reagents, at least one of which is Free or immobilized ligands that are labeled components, their binding partners, Binds to one of the components to be defined or their binding partner (s) May be included.   In a further aspect, the invention relates to a CNS nerve growth regulator (s). , Its (or their) subunits, or their active fragments Or other drug-based treatment methods determined to have the same activity About. The first method of treatment is CNGM, its active fragments, analogs, homologs, homologs. Associated with the promotion of CNS nerve growth resulting from the presence and activity of the substance or mimetic, and Agents capable of modulating the production and / or activity of CNGM are identified in the host as C Administered in an amount effective to promote NS development, regrowth, or rehabilitation Including Conversely, neutralizing binding to drugs or other CNGMs or proteins Partners can also be administered to inhibit and prevent unwanted nerve growth You. Also, specific keys involved in the phosphorylation or dephosphorylation of CNGM or protein Modulation of the action of enzymes or phosphatases is based on CNGM / protein activation How to modulate the activity of modulators or proteins that would simultaneously enhance treatment provide.   More specifically, the methods of treatment generally referred to herein comprise the CNS nerve growth control. A nodal factor or subunit thereof, or prepared, for example, according to another aspect of the present invention. Of other equally effective drugs developed by the drug screening test used Various diseases caused by the administration of pharmaceutical compositions containing effective inhibitors or potentiators of the activity Or other methods of treating cellular dysfunction and disorders. For example, CNS nerve Drugs or other binding partners for growth regulators or proteins may bind and It can be administered to inhibit or enhance the activity of a second messenger.   As mentioned above, the present invention is known as L1CAMs, and especially CHL1. Includes the discovery of the entire family of analogs for L1. CHL1 is N-terminal Signal sequence, six immunoglobulin (Ig) -like domains and 4.5 fibs Lonectin type III (FN) -like repeat, transmembrane domain, and approximately 100 amino acids It contains the C-terminal domain, which is most likely to be considered the intracellular domain of noic acid. CHL 1 is chicken in extracellular domain Ng-CAM (about 40% amino acid is the same) Most similar, followed by mouse L1, chicken neurofasin, chicken N r-CAM, Drosophila neuroglian, and zebrafish L1 . 1 (37-28% amino acid identity each), and mouse F3, rat TAG-1 and rat BIG-1 (about 27% identical amino acids). Igs Other members of the family (eg, N-CAM, DCC, HLAR, r The similarity to se) is 16-11%. Intracellular domain is mouse and chicken Nr-CAM, mouse and rat neurofasin (about 50% amino acid identity) ), Followed by chicken neurofasin and Ng-CAM, Bae Neuroglian, and zebrafish L1.1 and L1.2 (about 40 % Amino acids). High among already recognized members of the L1 family Great overall homology is observed and the module structure is preserved (mouse / Human L1 / rat NILE: chicken Ng-CAM, chicken / mouse Nr-C AM, Drosophila neuroglian, zebrafish L1.1 and L 1.2, chicken, mouse neurofasin, rat ADGP) Between conserved amino acid residue positions that define the separation and two adjacent Ig-like domains. Characteristic L1 criteria found for number of amino acids between in and FN-like repeats Was. These are co-linear with six Ig-like domains and four adjacent FN-like repeats Shows sex. And the four FN-like repeats are L1 and their modules (L1 family). (Named the Ley cassette). this These modules include the F3 subgroup (mouse F3 / chicken F11 / human To CNTN1, rat BIG-1 / mouse PANG, rat TAG-1 / mouse GPI-linked form of TAX-1 / chicken axonin-1) is included. Previously N -Colorectal cancer molecule (DCC) introduced as CAM-like molecule is L1 family Match the cassette. CHL1 shared among members of the L1 family Another structural feature is the high N-glucoside linked carbohydrate (about 20% of its molecular weight). ), Which contains the HNK-1 carbohydrate structure and has a 185 kD major Patterning of protein fragments containing bands of interest and smaller fragments of 100 and 125 kD Including For outer L1 family members, the predominant expression of CHL1 is It has been observed in the nervous system and late developmental stages.   The following examples are provided to more fully illustrate the preferred embodiments of the present invention. . However, this should not be construed as limiting the broad scope of the invention.                                 Example 1 Preparation of GFAP-L1 transgene and transgenic mouse   Glial fibrillary acidic protein (GFAP, Eng et al. (1971), Brain Res.28 :  351-354) are caused by astrocytes in the late stages of mouse central nervous system development. Predominantly expressed (Landry et al. (1990), J. Neurosci. Res.twenty five: 194-2 03). Therefore, the neuronal adhesion component was found on mature astrocytes in transgenic mice. Conventionally, a regulatory sequence of the GFAP gene has been used to direct the expression of the offspring L1. G In the FAP-L1 transgene (FIG. 1), the ATG of the GFAP gene Since the coding sequence is followed by a translation termination signal and a polyadenylation signal on the 3 'side, Encodes only the neuronal adhesion molecule L1 (Toggas et al. (1994), Nature 367 : 188-193). This construct was previously designated 3418, 3426 and 3427. Used to establish three different lines of transgenic mice .   Mouse L1 cDNA (Moos et al. (1988), Nature334: 701-703) is already As described (Toggas et al. (1994), Nature367: 188-193) Modified In exon 1 of the glial fibrillary acidic protein (GFAP) gene Inserted. The entire coding sequence of this protein and 250 3 'untranslated nucleotides -Modified GFAP-L1 transgenic mouse containing 4.05 kb mouse L1 cDNA Fused with Jean.   This 14.5 kb GFAP-L1 transgene was digested with SfiI. Cloning vector by electrophoresis and electroelution from agarose gel Cut out from the tar. The purified DNA isFiveE0.1(5 mM Tris-HCl, pH7 . 4, diluted to a final concentration of 2 μg / ml in 0.1 mM EDTA). Diluted Approximately 2 pl of the DNA obtained was crossed to a C57B1 / 6J male (CB6F1 female ) Were microinjected into the male pronucleus of the fertilized eggs. Eggs that keep alive (1986) Manipulation of mouse embryos, Cold Springs Ha rbor Laoratory, New York) Transferred into fetal oviduct.                                 Example 2 Southern blot analysis   Tail biopsy on whether the transgene has been integrated into the mouse genome? Mice were analyzed by Southern blot analysis of genomic DNA isolated from them. (Saza (Southern) (1975); Mol. Biol.98: 503-517). Transgenic line To establish, the transgenic primary mice are bred and Training. 10 μg of sample DNA was ligated with BamHI or EcoRI and Xb digested with aI, then electrophoretically separated on a 0.7% agarose gel and Transferred to Hybond N + film (Amersham) under Lucari conditions. 2. L1 cDNA 3 kb EcoRI-fragment or 330 bp HindIII of SV40 late splice Fragment and A1.5 plasmid (Maxwell et al. (1989), Biotechniques7:  276-280)32Lander using πα-CTP Labeled by mu priming (Boehringer Mannheim) and used as a probe Was. 5 × SSPE, 5 × Denhardz solution, 0.5% (w / v) SDS and 0.1 Pre-hybridization at 65 ° C for 1 hour in mg / ml sonicated heterologous DNA The zation was performed. Hybridization was performed overnight. All Southernbu The final stringent wash conditions for the lot were 0.1 × SSPE and 0.1% SDS (w / V), 65 ° C.                                 Example 3 Northern blot analysis   Anesthetized adult mice (12 weeks old) were killed with a lethal dose of chloralhydrut. The brain was excised and immediately frozen in liquid nitrogen. Crush tissue in liquid nitrogen to remove whole cells RNA was isolated. Add 4 moles of guanidinium thiocyanate to the crushed tissue Added. Isolation of total RNA was performed as described (Chomczyns ki) et al. (1987), Anal. Biochem.162: 156-159, Pagliusi et al. (1989), AMOG J. Neurosci. Res.twenty two: 113-119). Is RNA yield 260nm absorbance? I asked. 10 μg of RNA was added to 1% agarose- for Northern blot analysis. Fractionated on formaldehyde gel (Thomas (1980), Proc. Natl. Aca) d. Sci. USA77: 201-205).   Using a randomly primed L1 cDNA probe, the endogenous 6k bL1 mRNA (Tacke et al. (1987), Neurosci. Lett.82: 89-94) and g A 4.2 kb L1 mRNA from transgene was simultaneously detected. Northern Bro Analysis using the Densitometer of the CIT Image Program (NIH, Research ・ Services Branch, NIHM) Scanning images (Arcus Scanner, Agfa Gabat).   By Northern blot analysis of total RNA from the whole brain of the transgenic animal, L1 of expected size (4.2 kb) for mRNA from transgene Transcripts were revealed (FIG. 2). These transcripts are postmitotic neurons It is distinctly different from the original 6 kb endogenous L1 mRNA. Densitometer The level of L1 mRNA from the transgene was found to be When compared to the level of L1 mRNA (assumed to be 100%), lines 3426, 34 27 and 3418 were 34%, 13% and 8%, respectively.                                 Example 4 animal   Immunocytochemistry and in situ culture for culture on cryostat sections Hybridization experiments. Control animals were normal age-matched C57b1 / 6 J mice were taken from stock or non-transgenic littermates. small 6 days old IC for isolation of cerebellar neurons and preparation of cultures of astrocyte glial cells R non-transgenic offspring were used. Dorsal root ganglion (DRG) neurons 8 days Prepared from embryos of chicks.                                 Example 5 In situ hybridization   Transgenic animals' astrocyte glial cells expressed L1 in vivo. To confirm, the optic nerve was analyzed by in situ hybridization. Choosing the optic nerve whether it contains only glial cells and no neuronal cell bodies It is. In vivo, astrocytes usually express L1 at any stage of development. Missing (unpublished data).   For detection of L1 mRNA in freshly frozen brain sections in cryostat sections, In vitro transcription (Doerries et al. (1993), Histochemistry 99: 251-262). ) To prepare digoxigenin-labeled cRNA. Codes for the extracellular part of L1 Sequence (Moos et al. (1988)) to pBluescript KS + (Stratagene) Subcloned into the vector. Using the T7 and T3 promoters respectively After linearizing the resulting plasmid with XhoI or XbaI, the L1 insert was Anti-sense and sense cRNA probes were prepared by transcription. G To prepare a FAP cRNA probe, the N-terminus of this protein is encoded. 1.2 kb fragment of the GFAP cDNA (Lewis et al. (1984), Proc. Natl. A cad. Sci.81: 2743-2745, N.P. J. Obtained from Dr. Cowan) pBluescript KS + It was subcloned into the vector. Anti-sense and sense cRNA probes The plasmids linearized with EcoRI and XhoI were T7 and Tho, respectively. Prepared by transcription from 3 promoters. To improve tissue penetration, Treatment of anti-sense and sense probes under alkaline hydrolysis conditions And an average fragment length of about 300 nucleotides was obtained. Mature (12 weeks old) animal -Situ hybridization on optic nerve sections prepared from yeast Performed as described elsewhere (Doerries et al. (1993), Birch). tsch) et al. Neurosci. Printing).   In non-transgenic controls, L1 transcription was before (FIG. 3A) and after (FIG. 3B) damage. Was not detected in the optic nerve, but was detected only in retinal nerve cells. In contrast, L1 mRNA was expressed by glial cells of the optic nerve of transgenic mice (FIG. 3C). L1 mRNA positive cells are located at the distal myelinated part of the nerve and proximal Was detected in both non-myelinated parts of Hybridization The intensity of the signal is more myelinated compared to the myelinated distal part of the nerve Not the proximal part was higher.   Similar distribution of positive cells and label strength between non-myelinated and myelinated sites A similar difference was observed with the GFAP cRNA probe (FIG. 3C and Compare 3E). L1 mRNA positive cells in the optic nerve of transgenic animals The number of cells, however, is always significantly lower than the number of GFAP-positive cells, This is probably due to the low sensitivity of the L1 cRNA probe. Also, L1mRN A detectable levels of A in astrocytes that express high levels of GFAP May be obtained. Such a threshold effect is due to the 5 'flanking distribution of GFAP. Due to the design of the GFAP-L1 transgene, which contains only 2 kb of rows Will be. In vitro studies show that the region between 2 kb and 6 kb upstream of the transcription start site C6 cells having a fusion gene derived from GFAP (Sarid (1991), J. Neurosci . 28: 217-228). Finally, modification of GFAP exon 1 including the introduction of a large L1 cDNA, Chimeric mRNA was less stable compared to FAP mRNA and was modified The effect of regulatory GFAP sequences located upstream and downstream of the region may also change There is.   After injury to the optic nerve, L1 expression is regulated to high levels by transgenesis. (Fig. 3D), but not in the non-transgenic optic nerve. Not detected (FIG. 3B). Number of cells expressing L1 and L1 hybridization The intensity of the signal is different for the same transgenic line. Similar, but with differences between the different transgenic lines . Consistent with the results obtained by Northern blot analysis (see above), L1 mRNA For positive cells, line 3426 is the most abundant, followed by line 3427 And line 3418 was last. Transgene between different lines Variations in expression levels can be attributed to several factors, particularly different transgene integration sites. The effects caused by the chromatin region of the nearby host ranking Can be linked (Proudfoot (1986), Nature322: 562 -565, Reik et al. (1987), Nature328: 248-251, Sapienze Et al. (1987), Nature328: 251-254).                                 Example 6 antibody   Production of rabbit polyclonal antibody against mouse L1 and L1 immunoaffinity Purification and purification on lamb (Rathien et al. (1984), Martini et al. (1988)) And polyclonal antibodies against mouse liver membranes (Lindner et al. (1983) Pollerberg et al. (1985)) have been described. Mouse model for GFAP Noclonal antibodies were purchased (Boehringer Mannheim).   For Western blot analysis, polyclonal and monoclonal antibodies were Horseradish pels conjugated to goat anti-mouse or anti-rabbit antibodies Visualized by oxidase (Dianova, Hamburg, Germany). Immunity For cell chemistry, fluorescein isothiocyanate- or tetramethyl laurate Damine isothiocyanate-conjugated goat anti-rabbit and goat anti-mouse antibodies (Dia Nova) was used to detect the primary antibody. In situ hybridization Digoxigenin-labeled cRNA probe for digoxigenin Visualized by Lucari phosphatase conjugated Fab fragment (Boehringer Manha Im).                                 Example 7 Maintaining neurons on cryostats and sections   The optic nerve from transgenic animals is more neural than the optic nerve from wild-type animals Damaged optic nerve and injury to analyze if more inducible for site growth Preserving cerebellar neurons on cryostat sections of the contralateral optic nerve that have not received (FIG. 7).   The optic nerve of 6- to 16-week old mice was isolated from Bartsch et al. Comp. Ne urol.284: 451-462. Simply stated, damage The optic nerve that has been damaged and undamaged is defined by hormones without serum Media (Fischer (l986b), Neurosci. Lett.28: 325-329) It was embedded in liquid nitrogen and frozen. Frigocut 270-Cryostat ( Jung-Reichhardt) with poly-L-lysine (Sigma, 0.001% in water) Place on a covered sterile cover glass, air-dry for 2-3 hours in a sterile room, then cut vertically Then, a tissue section (14 μm thickness) was prepared. After washing the sections with medium for 5 minutes, Aged ICR mice (6 × 10 in 100 μl medium)FourPercol derived from the number of cells) l) Gradient-purified small cerebellar neurons (Keilhaue r) et al. (1985), Nature316: 728-730) was placed on each of the cover glasses. Cells 5% CO humidifiedTwoAnd 95% air in an incubator maintained at 37 ° C Maintained.   Neurite growth was also measured in the presence of the antibody. Sections are polyclonal L1 Antibody or polyclonal antibody against mouse liver membrane (100 μg / ml, culture solution And then diluted in the same medium) for 1 hour at 37 ° C. . After removal of the antibody, the sections were carefully washed with culture medium (5 minutes at room temperature for 5 minutes). Times) and Percoll gradient purified cerebellar neurons were added. 2 One day later, the cryostat cultures were incubated in 4% paraformaldehyde in PBS at room temperature for 30 days. After fixing for minutes, the neurite length was measured. Avoid "edge effect" during measurement Sections on the outer edge, which account for 20% of the cover glass, were not evaluated Was. Semi-automated computer image analysis programs (IBAS, Kontron, Ice) to measure the length of all neurites grown on these sections. And the average neurite length per neuron cell body was calculated. For each experiment And for each optic nerve (with and without damage) on the nerve of the transgenic animal The mean length of the neurites grown in was associated with the corresponding value in control animals. Using at least two transgenic animals, Twelve independent experiments were performed with the non-contralateral nerve.   New light observed in damaged nerves in transgenic animals The increase in length was compared to the undamaged nerve. In contrast, damage to wild-type animals The difference in neurite length between the injured and undamaged optic nerves is almost the same. Not observed (FIG. 8). Undamaged sight god from transgenic animals Neurites cultured on the neurons are always damaged by wild-type animals. The neurons cultured on unopened nerves were longer than neurites. 3 When using sections from 426, the maximum increase in neurite length was about 300%. Was observed. Similarly, the neural nerves injured in the transgenic line Site length increased by up to 400% when compared to damaged nerves from wild-type animals. Was.   The transgenic optic nerve neurite growth-promoting activity depends on the expression level of L1 The correlation was positive (FIG. 8). Line 3426 expressing the highest level of L1 protein The undamaged optic nerve had a lower level by comparison (3418 than 3427 Lower) than the optic nerves of lines 3427 and 3418, which express only L1 It was much more powerful in enhancing newlight growth. Lines 3426 and 342 For 7 injured optic nerves (28 days after injury), the growth of neurites was It was four times higher than that for the damaged optic nerve in live animals. Suffer damage The increase in neurite growth in the optic nerve is the same at lines 3426 and 3427. (Line 3426 was compared to line 3427 when the L1 tank was The fact that the expression of Park shows a 25% increase) Indicates that L1 protein levels are already the largest inducer of neurite growth from cerebellar neurons It will show that you have fulfilled the guidance.   Loss from wild type animals with polyclonal antibodies against L1 or mouse liver membranes Pre-cultured intact optic nerve does not significantly affect neurite growth (FIG. 9). In contrast, damage from transgenic line 3426 Cryostat sections of undamaged or damaged optic nerve were pre-cultured with L1 antibody Occasionally, neurite growth decreased to over 50% (FIG. 9). Optic nerve and small Antibodies against liver membranes that strongly bind to brain neurons (data not shown) It did not show a similar inhibitory effect. Anti-L1 anti-damage optic nerve from wild-type animals Pre-culture with the body may cause damage from wild-type animals that have not been pre-cultured with the antibody. Interestingly, an increase in neurite growth was induced when compared to nervous nerves. Antibodies against the mouse liver membrane did not show a significant increase under the same conditions. this thing Does not interfere with neurite growth by itself Is shown.                                 Example 8 Maintenance of neurons on astrocyte monolayers   To prepare a monolayer of stellate glial cells, clean the forebrain from 6-day-old mice Non-neuronal tissue was removed and isolated as previously described (Schnitzer (Schnitzer) et al. Neuroimmunol.1: 429-456, Fischer (1982a), Neurosci. Lett. 29: 297-302, Keilhauer et al. (1985 )). Cells were coated with poly-L-lysine (Sigma, 0.001% in water) coated cells. Medium containing 10% horse serum and 2 mM glutamine (given G) and maintained for 14 to 21 days. Contaminating oligodendrocytes and neurons Cells were subcultured by shaking the flask after each medium change and at 4 day intervals. Removed by feeding. After 14 days of maintenance, immunostaining for GFAP is performed. As a result, it was found that 90% or more of the cells were stellate glial cells. Culture for 14 days After that, the cells were trypsinized and placed on poly-L-lysine-coated coverslips for 5 days. Maintained as layers. Percoll gradient, purified cerebellum from 6-day-old mice Neurons (Schnitzer et al. (1981)) and 8 day old chicken embryos Dorsal root ganglion (DRG) (Seilheimer et al. (1988), J. Cell. Bi ol. 107: 341-351) Neurons were then added onto astroglial monolayers. cerebellum After 6 hours of co-culture with DRG neurons and 12 hours after co-culture with DRG neurons, Was fixed with 2% paraformaldehyde in PBS and described in Example 7. Newlite length was analyzed as described.   New neurons from mouse cerebellum or chicken dorsal root ganglion (DRG) neurons Growth is due to transgenic (line 3426) or non-transgenic controls. It was also studied in the native monolayer of stellate glial cells (FIG. 10, Table 1).   Neurology of cerebellum or DRG neurons on transgenic astrocytes G is about 15% longer than neurite length using wild-type astrocytes. Or 50% higher (Table 1). Anti-liver membrane antibodies are wild-type or transgenic animals The neurite length on the derived astrocyte glial cell monolayer was not affected (FIG. 10). , Table 1). Preculture of L1 antibody and astrocyte monolayer on cells from wild-type animals Did not significantly affect the neurite length at In contrast, transgenic movements Of cerebellum or DRG neurons grown on cells from %. In such a situation, the mouse L used in this study 1 does not react with chicken-derived neurons. It should be noted that Martini et al., 1994a, data not shown). However, immunofluorescence analysis showed that these antibodies were as efficient as the L1 antibody. Binds to both mouse cerebellar neurons and stellate glial cells from transgenic animals (Data not shown) will be revealed.                                 Example 9 Immunofluorescence and Aurion-GP immunogold microscopy   The god of fresh-frozen wild-type and transgenic animals cut horizontally or vertically L1 and GFAP immunostaining of trans or astrocyte glial cell monolayers described in the literature (Birch (Bartsch) et al. (1989)). First, stellate glial cells for double labeling As live cells with L1 antibody (2 μg / ml in 1% BSA in PBS) at 4 ° C. Incubated for 0 minutes. The cells are incubated with 70% methanol at -20 ° C for 10 minutes. After treatment to increase permeability, the cells were incubated with GFAP antibody for 30 minutes at 4 ° C. Cubbed.   To quantify the neurite length in cryostat culture experiments, Aurion Manufacturer of Immuno R-Gent Silver Enhanced Staining (Aurion, Immuno Gold Reagents & Accessori) es Custom Labelling, Wageningen, The Netherlands). In short, the culture is P Fix in 4% paraformaldehyde in BS for 10 minutes at room temperature, 50m in PBS Incubate for 10 minutes in M glycine, then add blocking buffer ( (PBS, BB, 0.5% BSA) for 15 minutes. 5 minutes each in BB 3 times After washing, cells were incubated with L1 antibody diluted in BB (2 μg / ml) for 30 minutes. Incubated at room temperature. Subsequently, the culture is washed three times in BB for 5 minutes each, and Secondary antibody diluted 1:20 in BB was added over 1 hour at room temperature. Distilled water After washing three times with, the cultures were placed in 2% glutaraldehyde in PBS for 10 minutes at room temperature. Fixed and washed three times with distilled water. Next, enhancers and developers A 1: 1 mixture was added at room temperature. After the reaction products have appeared, the cover glass is steamed. Washed three times with distilled water and embedded in glycerin.   In the optic nerve of non-transgenic mice, L1 immunoreactivity is It was restricted to ganglion cell axons (Bartsch et al. (1989)). Transgenic In undamaged optic nerves of animal origin, weak L1 immunoreactivity also results in cell bodies and radiation. It was found in the context of elongated cell processes (FIG. 4A). Transgenic optic nerve The intensity of this L1 immunoreactivity was significantly increased after injury (FIG. 4B) and With uninjured (FIG. 4C) or damaged (not shown) wild-type nerves The distribution for GFAP immunoreactivity found was similar.   L1 expression was determined by astrocyte glial cells prepared from the forebrain of 6-day-old transgenic animals. It was additionally analyzed in the vesicle culture. On stellate glial cells from wild-type animals No immunoreactivity of L1 could be detected (FIG. 5D). In contrast, transgenics L1-positive cells were present in animal-derived cultures (FIG. 5A). By double immunostaining As evidenced, it was clear that the same cells were also positive for GFAP. (FIGS. 5B and 5E), which indicates that this cell expressing L1 is actually a star. This indicates that the cells are glial cells. L1 immunostaining is performed on living cells Therefore, in transgenic animals, L1 was expressed in vivo in stellate glial cells in vivo. It appears to be exposed on the cell surface.                               Example 10 Western blot analysis   Further quantify the amount of L1 expression in GFAP-L1 transgenic mice Intact or uninjured from wild-type and transgenic mature mice. Is a surfactant extract of damaged (15 days after injury) optic nerve homogenate Was analyzed by Western blot (FIG. 6).   Damaged optic nerve and contralateral (15 days after injury) from 8-week-old animals Wash the unexposed optic nerve to remove non-neuronal tissue and then place in liquid nitrogen. Frozen. Unmyelinated or partially L1 immunoreactive of this nerve Only the proximal region that is only myelinated, but not the distal region that is myelinated Care was taken to use only the area. 4 at the Branson B15 sonicator Nerves were thawed 10 times before sonication at 5 ° C for 5 minutes. Then, the organization Using a Dounce homogenizer, a homogenization buffer (in PBS, 1% Triton X-100, 2M urea, 5mM benzamidine, 0.1mM Dodeacetamide, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, 5 mM p -Tosyl-L-lysine chloro-methyl ketone sodium). . The homogenate was clarified by centrifugation at 16,000 g at 4 ° C. for 15 minutes. Up The supernatant was treated with methanol / chloroform and treated as described by Wessel et al. (1984). Was precipitated as described above. The protein content was measured on the supernatant (Piers (Pierce)). After SDS-PAGE on a 7% slab gel under reducing conditions, The protein (25 μg) was analyzed by Western blot for polyclonal L1 antibody ( (0.4 μg / ml). Horseradish peroxidase Conjugate secondary antibody (2μg / ml) was applied to ECL Western Blotting Detector Detection kit (Amersham). Immunoblot densitometer Analysis by Image Program (NIH, Research Services Bran) Scan image of the original film (Arc Scan) Gnar, Agfer Gabat).   Densitometer analysis of immunoblots shows damage to transgenic animals. Expression of L1 in an intact optic nerve is not affected in wild-type animals About 40% and 13% higher than in (lines 3426 and 3427, respectively) It was proved that. L1 expression in damaged transgenic nerves 310% and 200% when compared to the damaged nerves of wild-type animals (respectively , Lines 3426 and 3427). Damaged optic nerve from wild type animals Approximately 40% on the injured side as compared to the contralateral optic nerve Decreased L1 protein expression. In contrast, lines 3427 and 34 The amount of L1 protein in 26 injured nerves was the opposite By comparison, it increased by about 30%. The L1 expression level at line 3426 is line 3 427 from expression levels in undamaged and damaged optic nerves Were also about 35% and 25% higher, respectively.                               Example 11 In vivo regrowth of axons in the optic nerve   In the orbit of 6-8 week old GFAP-L1 transgenic mice and wild type mice Crushed, and 14 days later marked retinal ganglion cell axons with moving label Were followed using fluorescein-labeled biotin ester. The result It is shown in FIG. 11 and FIG. Each point represents one animal.                               Example 12 The boundary between the homologous repeats 2 and 3 of fibronectin type III and neurite formation Identification of neural cell adhesion molecule L1 as long-promoting and signaling domain   To determine the domain of neural cell adhesion molecule L1 involved in the growth of neurite Therefore, a monoclonal antibody against L1 was prepared and cultured in cerebellar neurons. -We studied their effects on light growth. Using 11 antibodies as substrates Antibody 557. Only B6 promotes new light growth, Ca2+Increase the intracellular level of inositol and stimulate inositol phosphate turnover. He was as intense as the L1. This antibody is a fibronectin A match containing amino acids 818-832 at the boundary between homologous repeats 2 and 3 of ip III Recognizes the epitope presented by the synthesized peptide. These facts are This suggests that the growth of these messengers is correlated with the growth of the second messenger. Such a correlation is due to Ca2+-Channel antagonist or pertussis toxin is L 1 and antibody 557. Have the ability to inhibit the growth of neurites on B6 Confirmed by These observations indicate that the cognitive event is through which the formation of new light occurs. Triggers the inositol phosphate turnover and increases intracellular C a2+Bound to the cell surface as a prominent signaling domain that raises levels This is the first time a clear site above L1 is shown.                               Example 13 L2 / HNK-1 immunoreactivity in regrown peripheral nerves: previous motor axon barrier Preferential expression of Schwann cells   The carbohydrate epitope L2 / HNK-1 (hereinafter referred to as L2) is a mature mouse Is expressed by myelination of Schwann cells in the anterior root and muscle nerves Seldom expressed in Schwann cells of dorsal roots or cutaneous nerves. Substrate coated L2 glycolipid promotes cultured motor neurons but sensory neurons Because it does not promote, L2 regenerates the motor axons in vivo, resulting in superior muscle nerves. Can influence first-run re-domination.   Thus, the regenerating axons have no effect on the expression of L2 by the regrown Schwann cells. The effect of the axon on the muscle branch and skin branch of the femoral nerve of the 8-week-old mouse was as follows. Was analyzed by directing sensory axons. Regenerating axons from skin bifurcation Leads to detectable L2 expression in the muscle nerve branch or cutaneous nerve branch. I didn't. Axons regenerating from muscle bifurcation into Schwann cells with almost no skin bifurcation Therefore, L2 expression was weakly induced, but strong L2 expression was caused by many Schwann cells in the muscle branch. The reality has been triggered. Myelinating Schwa previously associated with motor axons Cells are thus myelinating Schwann previously associated with sensory axons Cells differ in their ability to express L2 when contacted with motor axons. I was Regulating this L2 expression to high levels at key stages of regrowth is Providing a regenerating motor axon to the appropriate muscle pathway, re-establishing an inappropriate sensory pathway It is more advantageous than what grows.                               Example 14 L1 in memory enhancement for aggressive avoidance tasks for chicks   Train daily chicks on one trial active avoidance task. Chick tastes bitter here Properties of small glittering beads coated with methyl anthranilate Learn to curb. As a result, presynaptic elements in two separate areas of the forebrain And post-synaptic elements, Intermediate Medial Hyperstriat Umm Ventrail (the intermediate medial hyperstriatum ventrale) (IM HV) and Lobus parolfactorius (LOP) Generates a time-dependent cellular and molecular cascade leading to remodeling (B Rose (1991) Trends In Neurosciences 14: 390-397). This cascade is As evidenced by the increased fucose uptake, two of the glycoprotein synthesis It involves different waves and occurs at both IMHV and LPO at various times following training. For long term (ie, 24 hours plus) memory retention for avoidance tasks, both I need more waves. In this evasion task, you would use beads that were otherwise The chicks that you will avoid will pick up the dry beads in the test. And chicks prove memory loss.   Because the role of L1 in mediating cell-cell contact is known, this study Is one of the learning-related glycoproteins in one or both waves of glycoprotein synthesis. To determine which ones are involved and are necessary for the formation of memory Was. If so, against L1 administered at the appropriate time for training Antibodies prevent synaptic remodeling, which is necessary for long-term memory, and Should result in amnesia. Similarly, if the extracellular domain of the L1 molecule In the adhesion process required for recognition and synapse remodeling and stabilization If it plays a role, extracellular domains that bind homologously to endogenous molecules This process may be disrupted if the main fragment is given exogenously.Antibodies and fragments   Polyclonal antibodies can be obtained according to established immunization procedures (Rathjen et al. 1984)), Immunization using L1 (Ng-CAM, 8D9) purified with immunoaffinity Prepared in rabbits. L1 is an established method from the brain of one-day-old chickens (Rathjen et al. (1984)) again using the 8D9 monoclonal antibody Genaur and Lemmon (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7753-7757). Antibodies were obtained after the third immunization Protein G Sepharose (Pharmacia) AKB). As described by Appel et al. (1993), 6 immunoglobulin-like (Ig-I-VI) and 5 fibronectin type II Recombinantly expressed fusion proteins representing homologous repeats (FN1-5) of I Was prepared. Sodium dodecyl sulfate / polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAG E) and non-cell fraction of chicks   Brain homogenate, crude membrane, soluble fraction (Burchuladze et al. (1990) B rain Res. 535: 131-138) and post-synaptic density (Murakami et al. (1986) J. Neurochem. 46: 340-348), all derived from the brain of aged chickens 50 μg was loaded on a 5-15% polyacrylamide gradient gel under reducing conditions (Laemli mli) (1970) Nature227: 146-148), separated by SDS-PAGE, Burnette (1981) Anal. Biochem. 112: 195-203) Transferred to cellulose. Tris-buffered saline with 5% skim milk powder, pH 7 . After overnight incubation with L1 antibody diluted 1: 1000 in 2 Immunoreactive bands have been described previously (Scholey et al. (1993) Neurosc. iences 55: 499-509). Training and test operations   Day-old Ross Chunky of both sexes hatched in incubator Chick paired small (2.5mm) white beads to make it easier to pinch In a fence, then Rossner and Rose (1983) J. Neur osciences 41: 1357-1363) coated with methylanthranilate Trained with larger (4 mm) chrome beads. Spit bitter beads The bird shows a stereotypical response, shakes his head violently, and moves backwards from the beads. I did. Twenty-four hours after training, each animal was treated with the same dry cloth used for training. The beads were presented and tested. Animals with active avoidance learning avoid test beads Shown in In each iteration of the program, 24 to 36 chicks were trained Elaborated and tested. More than 80% of trained, uninjected chicks Avoid birds normally under normal conditions or in some birds injected with saline Evacuation has been reduced. In contrast, birds trained on water-coated beads are dry in the test Beaded to greed, their avoidance score rarely exceeds 5-10% It is. All training and testing should be blind with respect to animal pretreatment. Performed routinely in the experiment. injection   Pass L1 antibody, FN1-5 and IgI-VI fragments overnight in 0.9% saline And the concentration was 1 mg / ml for L1 and 250 μg / ml for fragments. Adjusted to ml. Chick is Intermediate Medial Hyperstory 10 μl L1 per hemisphere into Atum Bentrail (IMHV) heads on both sides Injected into lid. Control animals received similar saline injections. Into IMHV Hami with a specially designed head holder and sleeve for accurate delivery Luton Syringe (Davis et al. (1982), Pharm. Biochem. Behav. 17:89). 3-896) was used. Chick injected with saline or antibody before training or testing Showed no apparent behavioral effects and pinched the beads precisely during training. Newly hatched Most of the extracellular volume of the adult chick brain is well tolerated by injections of this size Means that it can be achieved without leakage. Earlier reports were noted within a few hours after the injection. Showed that antibody diffused slowly from the site of injection (Scholey et al. (1993) ). Injection location accuracy was routinely monitored by visual inspection of the postmortem brain . Balance of chicks injected with saline and antibody or fragment at each of the experimental repetitions A good grouping was done. Chick group is involved in training in L1 experiment At one of eight time points, saline or antibody was injected. That is, two hours before training Is 30 minutes or +1 hour, +3 hours, +4 hours, +5.5 hours, +8 hours after training Or +12 hours. Based on previous observations, -30 minutes before training or +5 after training . It was expected how the effect would be observed in birds injected 5 hours, and The number of repeats at these time points was therefore considerably larger (that for antibody injections). N = 17, 28, 17, 19, 18, 21, 19, and 18, respectively). The L1 fragments FN1-5 and IgI-IV were injected at -30 minutes or +5.5 hours. Fired and retention tested at 24 hours. Salt and L1 antibody or L1 fragment The retention of the group of injected chicks is χTwoWere compared statistically. Result is This is shown in FIGS.                               Example 15 Involvement of L1 and NCAM in long-term potentiation   Next to hippocampus from male Wistar rat (180-220 g) anesthetized with halothane Sections (400 μm) were prepared by standard techniques. Interface chain to section First, a high osmotic pressure (320 mOsm / kg) artificial cerebrospinal fluid (ACS In F), it was allowed to recover for 45 minutes at room temperature. Then, the bath temperature was raised to 30 ° C. 1, 124.0, KCl, 2.5, MgSOFour, 2.0, CaClTwo, 2.5, K HTwoPOFour, 1.25, NaHCOThree, 26.0, glucose, 10, sucrose , 4,95% OTwo/ 5% COTwoIncluding bubbling (pH 7.4) (unit is mM) The normal osmotic pressure was changed to ACSF (307 mOsm / kg). Perfusion rate 0.7 It was 5 ml / min. Schaffer deputy / commissure fiber is CA1 Twisted platinum-iridium placed in the stratum radiatum of the region -Stimulated by wire (50 μm diameter). Test stimulus lasts 100 μs for 30 each And a stimulus intensity of maximum EPSP amplitude (multiple overlapping). Adjusted to obtain 30% of the maximum EPSP without heavy spikes). EPS P is the value of two glass plates mounted approximately 300 μM away from the stimulation electrode on each side. Using a micropipette (2 M NaCl, 1 to 5 MΩ), CA1 radiation structure (stratu) m radiatum).   After a stable recording for at least 15 minutes, the antibody or protein fragment is C near (50-75 μm) near the recording electrode (carefully adjusted to 30%) Improved microinjection system (nanoliter Injector, WPI) until the end of the experiment, unless otherwise noted. It was released in a manner that delivered 5 nl continuously every second. Following the induction of LTP, Although it was not possible for obvious reasons to flush the body, LTP was induced in each section. Whether it could be induced was recorded from the second electrode where no antibody was applied. More confirmed. The tip of the release micropipette was not in the section, but was released. A small decrease in EPSP amplitude was often observed when was started. This volume The artifact was independent of the nature of the substance released. Proteins are particularly Dialysis was performed against 20 mM PBS, pH 7.4 unless otherwise. The concentration of the pipette Refers to the concentration.   20 minutes after the start of microinjection, 3 trains at 4 second intervals LTP was induced by the theta-burst-stimulation (TBS) method. Each stab Fierce consists of 10 high frequency shocks with 5 pulses at 100 Hz, and The impact is 200 ms apart (Reichardt et al. (1991) Annu. Rev. Neurosci. 14: 531-570). The duration of the stimulation pulse was doubled during TBS. The induction of LTP was 10 μM of D (−)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid. Perfusion of (D-AP5D, Tocris) completely prevented it. All cell records are EP "Blind" patch clamp using C-9 patch clamp amplifier Were obtained from CA1 neurons by the MAP method. The bath temperature was 30 ° C. Patch electrode Pulls from 1.5 mm OD borosilicate glass, and resistance is 3 and 8 MΩ Was between. The pipette was neither fire polished nor coated. Electrodes are potassium gluconate, 129, KCl, 5, MgClTwo1, CaC lTwo, 1, N- (1-hydroxyethyl) -piperazine-N ′-(2-ethanes Sulfonic acid) (Hepes), 5,1,2-bis (2-aminophenoxy) ethane-N , N, N ', N'-tetraacetic acid (BAPTA), 5, Na-ATP, 10 and N Run a solution containing a-GTP, 0.3 (pH adjusted to 7.3 with KOH) in mM. I washed it. The series resistance was not compensated. Responses are printed out for visual analysis Three to three of the signals that were saved or saved on disk for further analysis Collected as an average of four. Statistical evaluations include variances including planned comparisons and contrast analysis This was performed by analysis. Time was considered a dependent variable with one level of repeated measures. Anti- L1 (Rathjen et al. (1984)), anti-IgI-VI (Hynes et al. (199) 2)) and anti-liver membrane antibodies (Linder et al. (1983)) have been described previously. Prepared by the following method. FIG. 15 shows the results.   Ig-like domains I-VI and FN type III homologous repeats IV of L1 are expressed in bacteria And purified as described (Hynes et al. (1992)). Against NCAM Antibody and axonin-1 were prepared as described (Larson et al.). (1986), Science232:985-988, Bailey et al. (1992), Science256: 64 5-649). Preparation of oligomannosidic glycopeptide from ribonuclease The preparation of a control glycopeptide from asialofetuin is also described (Larson et al. (1986)). The results are shown in FIG.   EPSMs mediated by the NMDA receptor are useful for the application of antibodies or glycopeptides. Minutes before the non-NMDA blocker 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2, 3-dione (CNQX, Tocris) was isolated by applying 30 μM. At the end of each experiment, D (-)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid (D- AP5, 30 μM, Tocris) completely suppressed these responses. Was. The results are shown in FIG.                               Example 16 L1 has a nerve-conserving effect   Experiments to further elucidate the activity of L1 were performed using CNS neural tissue. Ingredient Physically, mouse midbrain cells were placed on four separate plates with media prepared as follows: An aliquot of the vesicles was plated and cultured. That is, the first control plate was poly-L- A second plate coated with lysine only, coated with poly-L-lysine and L1, A third control plate was coated with poly-L-lysine and laminin and a fourth control plate. The rate was coated with poly-L-lysine, laminin and L1. On all plates Aliquots of cells were plated and incubated under identical conditions. In seven days All plates were stained for the presence of dopamine and then observed. L1 The covered plate showed 200-400% growth over the control. Coated with laminin Plates showed greater neurite growth than plates coated with L1 However, the number of cells was not large. From these results, L1 was measured by the number of grown cells. Cell viability increased dramatically compared to controls, so L1 had a significant neuropreservative effect. Shown and suggested.Example 17 Soluble L1 (L1-Fc) is functionally active and survives neurons Is a powerful agent for   Soluble L1 is Neuron14: 57-66, 1995. Made in Kos cells as an Fc fusion protein. This recombinant protein is a protein A Purified by affinity chromatography and coated on plastic As a substrate or as a soluble molecule added to the culture medium at about 1-10 μg / ml Used. Neurite growth of midbrain neurons from rat embryos of age 17 and Survival was examined in culture 7 days after in vitro maintenance. Dopaminergic neurons Is recognized by immunostaining for dopamine-β-hydroxylase (DBH). And quantified using an IBAS body shape measuring device. Soluble L1-Fc was added Cultures are maintained on poly-DL-ornithine (PORN) and substrate-coated L1-Fc was added on the surface of the pre-coated PORN (Appel (A ppel) et al. Neuroscience 13: 4764-4775, 1993). NCAM-Fc was used as a control.   Recognition in nerve cells is an important prerequisite for the development of a functional nervous system. The recognition molecule is expressed on the cell surface, where the recognition molecule is like cadherin Mediates the interaction between cells in nearby neighbourhoods, such as cell surfaces and integrins Mediates between extracellular matrix (Takeichi 1991, Luos Larch (Ruoslahti) 1988, Hynes 1992). The best family of recognition molecules Contains an immunoglobulin (Ig) -like domain. This Ig-like domain has a common license Reflects the ancestors of the epiglobulin and cell adhesion molecules, both of which have specific recognition Involved in the event (Edelman 1970). In the nervous system, Ig Super The family to date contains more than two dozen different molecules. Some Ig-like The molecule containing the main has multiple functions in the extracellular domain. Cytokine And neurotrophin receptors have high affinity receptor functions as well as cognitive ability. (Tannahill et al., 1995, Pulido et al., 1992)). Ig The three-dimensional structure of the -like domain is similar to the FN-like repeat (Main et al., 19 92, Leahy et al., 1992), the latter being fibronectin, tenascin Some extracellular matrix components, such as family members and others It is also a child's structural motif (Williams and Barclay) 1988; Baron et al., 1992; Erickson, 1993). Ig Sue The parfamily of neurorecognition molecules are provisional, spatrel, and cells. It has characteristics such as type-specific expression patterns (for review, Edelman 1988, Schachner 1991, 1994, Rachen and Jo Rathjen and Josseli 1991, Rutiehauser, 1993). This All recognition molecules in the family promote cell adhesion and neurite growth In terms of functionality. Some recognition molecules have strong homophilicity, i.e. Are self-binding partners, but others are overwhelmingly heterophilic Ie, the Ig superfamily or extracellular matrix component Bind to non-self partners, sometimes including other members of the child (Brunmeldre Bruemmendorf and Rathjen 1993, 1994). An Ig-like domain and Current knowledge of the individual functional properties of FN-like repeats of neural recognition molecules Are distinct and overlap in recognition, neurite growth, and rebound. Exhibit functional properties (Gennarini et al., 1991)), Frel et al., 1992, Taylor et al., 1993; Appel et al., 1993, 1995; Peshev a) et al., 1993; Feisenfeld et al., 1994; Hoim et al., 1995. ).   Among the Ig superfamily neurorecognition molecules, those related to the neurorecognition molecule L1. Certain families of molecules exhibit strong similarities in function and structure. These are powerful news -A light growth promoter and most of the axons during relatively late periods of development Expressed when formation occurs. These are predominantly expressed by neurons, Some members of the L1 family are involved in glial cells that promote neurite growth. Also exist (Martini and Schachner, 1986, Bixby (Bixby) et al., 1988, Seilheimer and Schachner. , 1988.   In the next experiment, another member of the L1 family was identified and characterized, It was named the near homolog of L1 (CHL1). This is a 6 Ig-like domain And FN-like repeats, four of which are FN-like members of other L1 family members. Is highly homologous to the repetition. Some FN-like repeats are localized in the membrane adjacent region of this molecule. Are there. It is the most variable region among L1-related molecules. CHL1 Another characteristic shared with members of the L1 family is that it is predominant in the nervous system and Expressed late in development, which includes expression of HNK-1 carbohydrates , N-glycosylation is at a high level.                               Example 18 Materials and methods animal   ICR mice and Wistar rats were used for tissue preparation. antibody   Recombinantly expressed CHL1 (amino acids 499-1063 (FIGS. 18 and 19) )) And L1 (amino acids 126-1981 (Appel et al., 1993)) Polyclonal antibodies to the part as described (Rachen and Shackner ( Rathjen and Schachner), 1984). Antibodies to CHL1 Rabbits were injected with 200 μg of the purified peptide to form Four additional injections of 100 μg were made at weekly intervals. Ammonium sulfate for L1 antibody The serum was concentrated by serum precipitation (13.5 mg / ml). Rat Monochroma Antibody 412 binds to the HNK-1 carbohydrate epitope (Kruse et al., 1984). Used for identification. Monochrome against glial fibrillary acid protein (GFAP) Internal antibodies were obtained from Boehringer (Mannheim). O1 antigen (single or multiple Monoclonal antibodies against (number) have been described (Sommer and Shackner (S ommer and Schachner), 1981). Purification of neural adhesion molecules   L1, N-CAM and MAG are surface activities of crude membrane fractions derived from adult mouse brain Was purified by immunoaffinity using a monoclonal antibody column Rathjen and Schachner, 1984, Falssner ) Et al., 1985; Poltorak et al., 1987). cDNA library and screening   Poly (A) in 8-day-old mouse brain+Λgtl1 library derived from RNA Preparation of polyclonal L1 antibody purified by immunoaffinity of this library In vivo screening was performed as described (Tacke et al., 1987). . A new DNA library was constructed to obtain longer cDNA clones . That is, RNA was transferred from the brain of 6-14 day old mice to guanidinium thiocyanate. ー And purified by the acidic phenol method (Kometzinski and Satch (Chomezynski)  and Sacchi), 1987). Poly (A)+RNA to oligo (dT) -cellulose color And concentrated through two successive passes through the medium (Sambrook et al., 1989). . 8 μg of poly (A)+Using cDNA synthesis kit (Amersham) using RNA Then, a double-stranded cDNA using oligo (dT) as a primer was synthesized. cDNA A plasmid with a DraIII-adaptor selected by size and containing a SalI site It was ligated into Sumid pXMD1 (Kluxen et al., 1992). Library For amplification of E. coli, TOP10 strain (Invitrogen, The Netherlands) was used. For screening, a fixed amount was directly applied to about 2 × 10FourBacteria / filter (138c mTwo) Density of nylon membrane (BIODYNE)TM, Pal). replica The filters were incubated overnight at 37 ° C. Subsequently, the bacteria were lysed (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) and neutralize the filter (3 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl pH 8.0), wash with 2 × SSC, air dry and Heated at 80 ° C. for 2 hours. Pre-hybridize the nylon membrane and explain to the manufacturer Radiograph by random-priming (Boehringer Mannheim) A 1 kb fragment of HCLII (derived from the λgt11 library) (HincII / Hybridization using KpnI), washing at 42 ° C. under stringent conditions, It was then exposed to X-ray film as described elsewhere (Sambrook et al., 1989). Six positive clones for sequencing according to restriction maps and standard protocols Further characterization was performed (Sambrook et al., 1989). 4.43k One clone containing the bCHL1 insert (pX # 2) was subjected to further analysis. DNA sequencing and sequence analysis   The nucleotide sequence was determined by the dideoxy-chain-termination method (Sanger (Sanger) et al., 1977) against T7 DNA polymerase (Pharmacia). Using double-stranded DNA as template and synthetic oligonucleotide as primer Was decided. cDNA sequences are collected and the DNASTAR program (DNA (STAR, London). Amino acid sequence unless otherwise noted Were arranged by the Jorn-Hein method (Hein, 1990) (Gap Penal Tee = 11, gap length / penalty = 5, K tuple = 2). Comparison of protein sequences   The similarity index (%) for comparing the distance between conserved amino acid residues To calculate, include six Ig-like domains and at least four FN-like repeats. Some distinct proteins include Ig-like domains (cis-points to the SS bridge). Teins) and FN-like repeats (tryptophan and tyrosine / phenylalanine) ) Were sequenced for conserved amino acid residues. Between these saved positions Was examined for the number of amino acid residues. This is called a common distance. L1 family members The average value of this distance within the group, ie the common distance and the standard deviation (SD) was calculated . SD values were rounded to the next integer. Distance to each protein compared to average Match if this distance value is equal to the mean ± SD (= common distance) Was thought to be. The number of matches for 19 common distances was calculated for each protein. (Similarity index = number of matches / 19 × 100). For example, CHL1 tan In Park, 16 distance values match the common distance, or 3 of all criteria match. I didn't do it. From now on, for CHL1, similarity index 16/19 84% are obtained.                               Example 19 Cell culture and expression of CHL-1 or L1 in Kos-1 cells   The 4.43 kb insert of clone pX # 2 was digested with SalI in pXMD1 ( Kluxen et al., 1992; Kluxen and Lobbert, 19 93). Subflag of mouse L1 cDNA (Moos et al., 1988) (EcoRI (plasmid polylinker) / PvuII bp 4048) Treated with NA polymerase and ligated to pXMD1.   Kos-1 cells were cultured in DMEM (0.1%) supplemented with 10% (v / v) fetal calf serum. % Glucose) in 5% COTwoAnd maintained at 37 ° C. DE AE dextran mediated DNA transfection has been described with some modifications. (Kluxen et al., 1992). Briefly, about 10 cells 2,000 cells / cmTwoSowed. One day later, DMEM (0.45% glucose) After washing twice with 10% (v / v) Nu-serum (Becton Dickinson, Switzerland), 0.4 mg / ml (w / v) DEAE-dextran (Pharmacia) ), 50 μM chloroquine, and 1.25 μg / ml DNA (10 cm dish) Medium with a transfection solution consisting of DMEM supplemented with Was replaced. Cells are at 37 ° C, 5% COTwoFor 4 hours. Then The medium is removed and the cells are washed with phosphate containing 10% dimethyl sulfoxide (v / v). Incubated for 2 minutes in buffered saline (pH 7.3). DMEM (0.4 5% glucose), 10% (v / v) fetal calf serum and 20 μl DMEM supplemented with g / ml gentamicin was added and cells were plated in this medium. Cubbed. Twenty-four hours later, cells were washed with Hank's balanced salt solution (HBSS). Incubate at 37 ° C for 5 minutes with 01% trypsin and 0.0004% EDTA 24 including a poly-L-lysine-coated cover glass (diameter 11 mm). About 20,000 cells / cm in a well plate (Falcon)TwoReplate at a density of And incubated for an additional 24 hours to provide a sample for immunocytochemistry. C Cells were replated on tissue culture dishes for easter blot analysis. Incubated for an additional 48 hours.   PC12 cells were transferred to a 10% (v / v) cell on a collagen-coated tissue culture dish. Fetal calf serum and 5% (v / v) horse serum were maintained in DMEM supplemented. Fine Vesicles are induced with nerve growth factor (NGF), resulting in approximately 50% confluency. By the way, the medium was removed from the monolayer and 100 ng / ml of 7sNGF (Sigma, Switzerland) ) Was replaced with a supplemented medium with low serum content (5% horse serum). 2 day Inn After incubation, cells were incubated with 0.1% trypsin, 0.04% EDTA and Exfoliated, collected and subjected to RNA extraction.   Primary cultures of stellate glial cells were partially modified (Guenard et al., 1994) Prepared according to McCarthy and De Vellis (1980), and After 1-2 weeks in vitro, they were used for immunostaining. An oligodendroglial cell Subcultures were prepared as described by Laeng et al. (1994) and incubated for 12 days. ・ Maintained in vitro.                               Example 20 Preparation of antisense RNA   The 4.43 kb insert of clone pX # 2 was digested with SalI digested pBAIISK (Str Ligation to ApaI (vector) / AvrII (bp 3330 ( FIG. 18)) CHL1 which deletes the fragment and encodes the extracellular part of this protein CDNA fragments were obtained (see FIGS. 18 and 19). A similar construct of L1 was cloned into T4 Ec of L1 cDNA (Moos et al., 1988) treated with DNA polymerase Sma of oRI (plasmid polylinker) / EcoNI (bp 3304) fragment It was prepared by ligating to I digested pBSIISK-. These plasmids are digested with baI and T7RN as described (Melton et al., 1984). Using A polymerase32It was used for the synthesis of P-labeled antisense RNA. Northern blot analysis   Poly (A)-mRNA is produced from different tissues of newborn and 9 day old mice Oligotex according to the vendor's descriptionTMDirect mRNA method (Quiagen, Inc. (Usseldorf, Germany). Poly (A)-mRNA and RN A marker (RNA ladder, Gibco / BRL) is 0.8% formaldehyde / A Gallose gel electrophoresis followed by capillary transfer in 20 × SSC (Southern (S outhern) (1975)) to transfer to a high bond-N film (Amersham). UV crosslinking ( After UV-Stratalinker® 1800, Stratagene, La Jolla, CA), transferred to membrane The amount of RNA bound and bound was determined by methylene blue staining (Sambrook et al., 1989). Prehybridize at 65 ° C for 2 hours After this, the membranes were washed with CHL1- and L1-specific32P-labeled antisense RNA pro Using a hybridization buffer (5 × SSC, 2.5 × Denhardt) Solution, 50 mM NaTwoPOFour(PH 6.5), 0.1% SDS, 1 mM ED TA, 2 μg / ml salmon sperm DNA, 50% formaldehyde) at 65 ° C. overnight Hybridization was performed. Then, filter this filter with 0.1 × SSC, Washing was performed three times at 65 ° C. for 1 hour in 0.1% SDS and exposed to an X-ray film.                               Example 21 Expression and purification of recombinant CHL1 protein in E. coli   The sixth Ig-like domain (IgVI) and the FN-like repeats 1, 4, 5 (FIG. 18) And 19b), a 1.7 kb cDNA fragment of CHL1 (Ms c1; bp1791 (CHL1 clone derived from λgtl1 at the vector cloning site Bp 3494) and BsmA1 (originating at the 5 'end of the loan). Unique of vector (Studier and Moffatt, 1986) It was subcloned into the BamHI restriction site. The exact sequence of this plasmid is Confirmed by sequencing. Escherichia coli strain BL21 (DE3) is transformed with this plasmid. The quality has changed. Expression of recombinant protein and by anion exchange chromatography Purification was performed according to the method of Appel et al. (1993). SDS-PAGE and Coomassie staining showed a major band at the expected molecular weight (70 kD), It accounted for at least 80% of the total protein (not shown). Tissue fractionation   The detergent lysate of all tissues was 40 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM. mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM phenylmethyl Rusulfonyl fluoride (PMSF), tissue in 1% Triton X-100 Prepared by homogenizing and stirring at 4 ° C. for 3 hours with constant stirring. Maintained. The soluble fraction is insoluble by centrifugation at 100,000 g. Separated from material.   For the preparation of the detergent lysate of the membrane fraction, tissues were treated with 1 mM NaHCOThree(P H7.9), 0.2 mM CaClTwo0.2 mM MgClTwo1 mM spelling Midin, 5 μg / ml aprotinin, 10 μg / ml soybean trypsin Inhibitor, 1 mM PMSF and 0.5 mM iodoacetamide at 4 ° C. And homogenized. Next, the membrane and the soluble fraction are separated, and the membrane pellet is solubilized and relaxed. Buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.5% Triton X-100, 5 μg / m 1 aprotinin, 10 μg / ml soybean trypsin inhibitor, 1 mM P MSF and 0.5 mM iodoacetamide).   Wash the transiently transfected Cos-1 cells twice with HBSS and Incubated with 1 mM EDTA in HBSS at 37 ° C. for 10 minutes. One The cells were then detached with a fired Pasteur pipette and 200 g at 4 ° C. , Collected by centrifugation for 10 minutes. The cells were transformed with 20 mM Tris-HCl (p H7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 dissolved in mM iodoacetamide, 1 mM PMSF and 1% MP-40 And centrifugation (13000 g) gave a clear supernatant. The measurement of protein Performed as described by Bradford (1976). Western blot analysis   The protein was purified on an 8% or 10% slab gel on SDS-PAG under reducing conditions. E (Laemmil, 1970) and nitrocellulose fill (0.45 μM, BA85, Schleicher & Schue ll, Dussel, Germany) and according to Faissner et al. (1985), CH L1 antiserum (diluted 1: 500, 1: 10000 relative to ECL), L1 polyc Lonal antibody (diluted 1: 1000, 1: 15000 to ECL), or Noclonal antibody 412 (diluted 1: 1000, 1: 10000 to ECL) ) And the use of alkaline phosphatase-conjugated secondary anti-rabbit or anti-rat IgG Epidemiology was detected. The conjugated antibody was purified according to the manufacturer's instructions, using ECL cloth. Tan blotting detection reagent (Amersham) and X-ray film High sensitivity chemiluminescence (EC) using BCIP and NBT as chromogenic substrates. L) method.                               Example 22 Enzyme-linked immunosorbent test   The enzyme-linked immunosorbent test (ELISA) showed that the protein was 100 ng / m2. 1 described by Husmann et al. (1992), except that I went as expected. CHL1 antiserum is 1: 250 to 1: 2 × 106A few steps between It was used after it was released. Deglycosylation of CHL1   Surfactant lysate of brain tissue homogenate from 7 day old mice (200 μl, 6 (protein concentration of mg / ml) was separated into a soluble fraction and an insoluble substance by centrifugation ( (See tissue fractionation) and 0.5 units of N-glycosidase F or 2.5 units. O-glycosidase or the manufacturer's instructions (Boehringer Mannheim , Germany). Melt Was separated by SDS-PAGE on a 10% gel. Nitrocellulo And a CHL1 antiserum (1: 5) against the recombinant CHL1 protein fragment. 00 dilution) (see FIG. 18). Immunoprecipitation   Soluble fraction of detergent solution of brain tissue homogenate from 9-day-old mouse (3 00 µl, 5 mg / ml protein concentration) (see tissue fraction) with CHL1 antiserum or Represents 10 μl of polyclonal antibody against L1, 1% NP40 and 30 μl of G -5 ml of buffer containing Sepharose (Pharmacia / LKB) (20 mM In squirrel-hydrochloric acid (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) Incubate overnight at 5 ° C. Buffer containing 0.1% NP40, 0.05% SDS After washing with the buffer and successively with 20 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.4), Arrows beads for 10 minutes in 5X sample buffer (250 mM Tris-HCl (p. H6.6) 10% SDS, 50% glycerin, 0.5% bromophenol blue -, 25% B-mercaptoethanol) and the supernatant is run on a 10% gel. Was separated by SDS-PAGE. Transfer this protein to nitrocellulose Western blot analysis revealed a polyclonal antibody against L1, CH Detection was performed using L1 antiserum or monoclonal antibody 412. Indirect immunofluorescence   Cell surface staining (Schnitzer and Schachner 198) For 1), CHL1- and mock-plated on cover glass (vector -Only)-transfected COS-1 cells with primary antibody (CHL1 antiserum) (1: 100 dilution) or L1 polyclonal antibody (1: 200 dilution) 10% fetal bovine serum, 10 mM Hepes (pH 7.3), And 0.02% NaNThreeIncubate for 30 minutes at room temperature in DMEM containing It was then incubated with the secondary antibody. After immunostaining, cells are phosphate buffered Fix with 4% paraformaldehyde in saline (pH 7.3) and 2.5% Fixed in Moviol (Hoechst) containing potassium iodide. Star-shaped glare For double immunofluorescence staining of vesicles and oligodendrocytes, Incubation as described for Cos-1 cells transfected with I was vate. Subsequently, incubation of cells with primary antibodies against intercellular antigens Was performed after treating the cells with methanol at −20 ° C. to increase permeability. .                               Example 23 In situ hybridization   Digoxigenin-labeled anions of equal size from the corresponding portions of CHL1 and L1 To generate chisense cRNA probes, for Northern blot analysis and A similar construct was used. Sense probes have a similar construction with inserts in the opposite orientation Created from things. All cRNA probes use T7 RNA polymerase. To obtain fragments with an average length of 250 nucleotides. Was. In situ hybridization was performed as described (bar Bartsh et al., 1992; Dorries et al., 1994)).                               Results and discussion Identification of CHL1 cDNA   Λgtl1 expression line for cDNA clone encoding cell adhesion molecule L1 A library was formed against immunopurified L1 from brain (Tacke et al., 1987). By screening using the polyclonal antibody, clone 311 Was identified. This is a partial cDNA homologous to L1 (Lipman and Pearson (L 34.1% according to (ipman and Peason) (1985) and 704 containing the cytoplasmic portion 2112 base pairs (bp) of open reading frame encoding Lame was included. To isolate the full length cDNA clone, Use one DNA fragment to screen another cDNA library did. Six independent clones were isolated. Two clones are homologous L1 And inserts of 4.2 and 4.4 kb containing the entire coding region of the tag (CHL1). Was. Clones containing the 4.4 kb insert were further studied. DNA and deduced amino acid sequence and structural features   This 4.4 kb insert has a 5 '295 bp untranslated region, 3627 b p open reading frame and 518 bp translated 3 ' Code the missing region (FIG. 18). At its 3 'end there is an oligo (A) region However, a clear consensus polyadenylation signal is lacking upstream of this sequence. Have lost. The flanking sequence of the AUG start codon (position 296, FIG. 18) is translated Does not match the optimal consensus sequence for initiation (Kozak, 1987). But However, this AUG is considered a translation initiation codon based on two sets of evidence. Three In all of the reading frames, a stop codon precedes its upstream and 24 or 25 (according to the algorithm of von Heijne (1986)) After a score of 8.65 and 6.40, respectively) A signal sequence follows (FIG. 18).   Translation of the open reading frame is based on a calculated molecular weight of 134.9 kD. Yields 1209 amino acids with the properties of complete membrane glycoprotein. Assumption A typical extracellular domain consists of 1081 amino acids, There are 18 potential sites (Figures 18 and 19a) and more than 60 potential O Have a common glycosylation site (not shown) (Pisano et al., 19 93), Hydropathy by Kyte and Doolittle (1982) As determined by hydropathy analysis, a 23 amino acid transmembrane domain Continue (FIG. 19c). This domain has a polar residue flank the N-terminus and a C A basic amino acid flanks at the end, coinciding with the stop transfer signal (FIG. 18). . The intracellular region is composed of 105 amino acid residues.   The extracellular region also shares homology with features of the L1 family-the Ig-like domain. One 685 amino acid stretch and 472 amino acid stretches with homology to FN-like repeats Gari (Figs. 1 and 2a)-contains two major structural motifs of repetitive domains . All six Ig-like domains are located 47-54 amino acids apart from each other Cysteine residue pairs (Figure 19). The second of each domain A C2-type cluster of conserved amino acids near the cysteine residue (DXG XYXCXAXN) at the end of the β-chain B associated with (Except for the 6th Ig-like domain) puts the Ig-like domain into a C2-set Assign (Williams and Barclay, 1988). Ig Between the -like domain and the membrane unfolding region are homologous to the FN-like repeats of fibronectin. There are four domains (Kornblihtt et al., 1985). About 100 a Each of these regions of amino acids is a highly conserved tryptophan (first FN). -Like repeats) and tyrosine / phenylarala at the N- and C-terminal regions, respectively. Contains nin residues. The fifth FN-like repeat, in contrast to other members of the L1 family, Interestingly, it is an undeveloped 1 / 2FN-like repeat (FIG. 18). This half FN- -Like repeats have several alternative splice forms, one of which contains all FN-like repeats. Should be determined by methods other than Northern blot analysis. Is an issue. Evidence for an alternative splice is shown in six independently isolated clones. Not found (not shown) in this analysis It is noteworthy. An alternative splice of the fifth FN-like domain is Nr-C Observed for AM / BRAVO. Here, the fifth FN-like repeat has been deleted. CDNA isoforms have been isolated (Grumet et al., 1991, Kayy em) et al., 1992). The fifth FN-like domain is present in chicken neurofasin Nothing (Volkmer et al., 1992) depends on alternative splices Is also very likely. Ankyrin, the rat homolog Synthetic glycoprotein (ABGP) (Davis et al., 1993) is a 5th FN- This is because it contains a like domain. Thus, CHL1 is new to the L1 family. Add additional structural features, ie only 4 and 1/2 FN-like repeats are expressed (FIG. 19).   Another structural feature of CHL1 is that the RGD sequence (A Amino acids 185 to 187) (FIG. 18). This tripeptide is Initially identified as a cell adhesion site within the tenth type III domain of fibronectin. (Pierschbacher and Rusolahti, 1984) And contribute to integrin binding (reviewed by Lusolach and Piash Bacher (Rusolahti and Pierschvbacher), 1987). Three-dimensional structure of FN-like repeats Analysis showed that the RGD motif was located between the β-chains F and G (May (Main) et al., 1992). This motif is found in other members of the L1 family Is done. Third FN-like repeat of chicken Ng-CAM (Burgoon et al.) , 1991) and a species homolog, chicken neurofasin and rat ABG. In the third FN-like repeat of P, the RGD sequence is found in the same position between β-chains F and G Is done. The RGD motif is L1 (two in L1 of mouse and rat (NILE), and One per human L1 (Moos et al., 1988, Hlavin and Lemm on), 1991; Prince et al., 1991)). LIRGD sequence Are all found in the 6th Ig-like domain, but the FN-like of fibronectin It is found in a different amino acid environment than the RGD found in the module. L As in 1, the tripeptide in CHL1 is the β-chain of the second Ig-like domain. Localized on E. RGD sequences in these proteins are functionally active It is unknown at this time. In this context, the second FN-like domain Is a member of the F3 / F11 family that contains the RGD motif (Brew (Bruemmendorf and Rathjen, 1993, 1994) TAG-1 ( Newlight elongation induced by Furley et al. Depends on Tegulin and L1 (Felsenfeld et al., 1994) Is noteworthy. This observation indicates that the second FN-like repeat of TAG-1 and β1Inte Raises the possibility of a direct physical interaction between gulins.   CHL1 has a DGEA sequence (amino acid 5) in the β-chain C of the 6Ig-like domain. 55 to 558) (FIG. 18). This sequence is another member of the L1 family Is not found in This DGEA sequence is also a type I collagen containing this motif. ΑTwoβ1It is also involved in integrin recognition (Staatz et al., 1991). Structural similarity of CHL1 to other recognition molecules of the Ig superfamily   CHL1 amino acid sequence compared to translated EMBL gene sequence database Then, CHL1 had 87.2% of the 109 amino acid long chain previously identified in the human brain. Identical and 79.6% identical to a 93 amino acid long chain (accession number HS24) 31 and HSXT02610 (Adams et al., 1992, 1993). in this way Thus, it appears that humans have a highly conserved CHL1 molecule. Translated Mouse, human, and rat L taken from the EMBL gene sequence database 1 / NILE, chicken Ng-CAM, chicken Nr-CAM, zebrafish C. L1.1 (Tongiorgi et al., 1995); Chicken Neuro Fabin / Rat ABGP, Drosophila Neuroglian (Beaver (Bieber et al., 1989), mouse F3 / chicken F1 / human CNTN1 (Gen Gennarini et al., 1989, Ranscht, 1988, Brumendorf ( Bruemmendorf et al., 1989, Berglund and Ranscht, 19 94), rat TAG-1 / chicken axonin-1 / human TAX-1 (fur Furley et al., 1990; Hasler et al., 1993; Tsiotra et al. , 1993), and rat BIG-1 / mouse PANG (Yoshihara et al., 1). 994, Connelly et al., 1994) were compared to CHL1. This comparison Is shown in Table 1 below.   CHL1 is chicken Ng-CAM (37% amino acid identical in extracellular domain, Table 1) and mouse Nr-CAM (64% amino acid identity in intracellular domain, Table 2) Most similar to However, the degree of identity, especially in the extracellular Is not enough to consider these proteins as species homologs. Recently, mouse Nr -A partial cDNA clone of CAM was identified (Moscoso and Sanes). nd Sanes), 1995). Mouse Nr-CAM is almost identical to chicken NR-CAM. Identical (99%) (see Table 2). Thus, CHL1 is Nr in mice -Does not appear to be a CAM homolog. CHL1 is L1, Nr-CAM, -Lofascin (Moscoso and Sanes, 1995) and CHL1 A highly homologous species homolog of the L1 family of mice (Adams et al., 1992, 1993), and is a fourth member.   Nr-CAM of chicken and mouse and neurofasin of chicken and mouse Considering the similarity (99% and 87%, respectively, Table 2), mouse L1 and chicken Avian Ng-CAM shows only 61% sequence identity in the intracellular domain (Table From 2), it is unlikely that these are species homologs. Rather, Mau Fifth, having a highly conserved intracellular domain of the L1 family in Should expect the presence of Ng-CAM as a member of Mouse L1 is an elder Promotes neurite growth on heterophilic interactions with Ng-CAM Interesting thing is Lemmon et al., 1989). This is a member of the L1 family Suggest that they interact with each other.   In addition to similarities in the overall structure of L1 family members (Tables 1 and 3) ), The most highly conserved region was identified in the cytoplasmic domain (FIG. 20). This surprising homology indicates that the L1 family in all species identified so far. It is clear about the members. As these members that contain intracellular domains Are L1, CHL1, Nr-CAM, Ng-CAM, neurofascin, new Logrian and zebrafish L1.1 and zebrafish L1.2 (Tongiorgi et al., 1995) and mouse Nr-CAM and Neurofasin (Moscoso and Sanes, 1995) (Table 2) No. Within this region there are two extents, one of which is a segment over the plasma membrane. Is located near and partially within the element and the other is located at its C-terminus (I and III in FIG. 20), but the two are almost the same. L1, Ng-CAM, Conserved in Nr-CAM, neurofascin, L1.1 and L1.2 Another amino acid stretch, which is not conserved in HL1 (Table 2), is An RSLE motif generated by the price and expressed only in neurons ( (II in FIG. 3) (Grumet et al., 1991, Miura ) Et al., 1991; Volkmer et al., 1992). The intracellular region is responsible for these proteins. All members of the L1 family because they are highly conserved among Can use the same signaling pathway to activate neurite elongation it can. The cytoplasmic domains of ABGP, L1, and Nr-CAM are ankyrin-linked Has been shown to interact with cell recognition and lead to cytoskeletal scaffolds (Davis (Da vis) et al., 1993, Davis and Bennett, 1994).                               Example 24 Structural requirements in the extracellular domain for classifying L1 family members Identification   To further study the general criteria for L1 family qualifications, we Ig-like domains (cysteine pointing to SS bridge) and FN-like repeats (bird Highly conserved amino acid positions in putphan, tyrosine / phenylalanine) The positions were studied for several members of the Ig superfamily (Table 3). 6 Ig-like domains and at least 4 FN-like repeats (L1 family and G PI-coupled F3 / F11 subgroup (Brummendorf and Ruchenmend orf and Rathjen), 1993), separate these conserved amino acids. This shows that the number of amino acids is very constant. 5 different distance parameters The meter was considered. 1) Conserved forming a cysteine (SS) bridge for each Ig-like domain Number of amino acids separating cysteines (Table 3, columns Ig1, Ig2, Ig4, Ig5, and Ig6). 2) The second cysteine of one Ig-like domain and the first of the next Ig-like domain. Number of amino acids between cysteines. This is between two adjacent Ig-like domains (Table 3, columns 1-2, 2-3, 3-4, 4-5 and 5-6) . 3) Conservation of the last conserved cysteine and FN-like repeat of the 6th Ig-like domain Number of amino acids between tryptophan and This is an Ig-like domain-mod And the distance between the FN-like repeat-module (Table 3, column IgG- FN1). 4) Conserved tryptophan, tyrosine / each of individual FN-like repeats Number of amino acids between phenylalanines (Table 3, columns FN1, FN2, FN3, And FN4). 5) Tyrosine / phenylalanine of one FN-like repeat and the next FN-like repeat Number of amino acids between tryptophan. This is the distance between two adjacent FN-like repeats. Reflect separation (Table 3, columns FN1-FN2, FN2-FN3, and FN3-F N4).   In order to obtain highly stringent conditions for the comparison of L1-like molecules, it is likely that selective Some figures clearly show deviations from the average, probably due to price. Were not taken into account in the calculation of the average distance and the standard deviation (Neurogrian: Ig) 2, 2-3: Nr-CAM and ABGP: Ig6-FNI; F3: Ig4, FN 3; Ng-CAM; FN2, FN3 (Table 3,*Mark)). 1st and 6th Ig Number of amino acids between the SS bridges of the -like domain (Ig1: standard deviation (SD) = 3, Ig6: SD = 4) and conserved tryptophan of FN-like repeats 3 and 4. , Tyrosine / phenylalanine amino acid number (FN3: SD = 4, FN4: SD = 4) varies slightly, but all other distance parameters are apparent for different molecules. Remarkably constant (FN1-FN2: SD = 0, FN2 and 2-3: S D = 2 (Table 3)). Based on these criteria, we have developed several Ig-like molecules. The similarity index (see Materials and Methods) for the averages listed in Table 3 ) Was calculated. L1, CHL1, Ng-CAM, Nr-CAM, ABGP, L1 . 1, 74-95% similarity index for TAG-1 and BIG-1 Was obtained (Table 3). Slightly lower for Drosophila neuroglian High numbers (66%), but probably against the evolutionary distance between vertebrates and insects It will be reflected. F3 and its species homologs are particularly important for their Ig-like domains. Loses preservation, but still shows a 63% similarity index ing. However, some conserved forms underlying strongly conserved collinearity Amino acid stretches (eg, FxVxAxNx at the end of the first FN-like repeat) xG (8x) S (4x) TxxAxPxxxP or a third FN-like repeat (shown NxxGxGPxS between the last two β-strands), F3 is the L1 Supports the concept of belonging to Millie. Adjacent domains (Ig-like domain or F The number of amino acids between (N-like repeats) is even more conserved among these molecules. It is interesting. This is a structural feature where the distance between individual domains is important. Show that it is critical for the function of the neural recognition molecule (Table 3). , Columns 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6, FN1-FN2, FN2- FN3, and FN3-FN4). In this way, the order (colinearity) and spacing (s This high degree of conservation of pacing enhances the extracellular domain of L1 family members. Can be used to define generally. Using the criteria defined here If these are six Ig-like domains at the N-terminus followed by four FN-like repeats Will be included. We describe this structural feature in the L1 family. Let's call it Lee Cassette.   In this way, all members of the L1 family Shares the characteristics of the amino acids and additionally shares highly conserved amino acids. this The results show that these molecules are a common ancestor containing the L1 family cassette, L Suggests that it has separated from the 1-like molecule. This ancestral molecule is a more complex nervous system Duplication to accommodate evolutionary demands for diversifying cell interactions in plants It may have expanded the potential of that function through manufacturing. Thus, general L1 family has variable fifth FN-like repeats, transmembrane domains, and advanced "Classical" L1 family members (L1 , CHL1, Ng-CAM, Nr-CAM, neurofasin, neuroglia L1.1) and its common feature is the coupling to the membrane by GPI and is variable. A functional fifth FN-like repeat has not been identified so far, the F3 / F11 sub Groups (F3 / F11 / CNTN1, BIG-1 / PANG, and TAG-1 / AXONIN-1 / TAX-1). Cells from both subgroups The ectodomain contains the L1 family cassette.   Other members of the Ig-superfamily, such as N-CAM (Cunningham) (Cunningham et al., 1987), Barthels et al., 1987), MAG (Alquin Arquint et al., 1987, Lai et al., 1987, Salzor et al., 1987), d. Uromasculin (Kanla et al., 1993), and rse (Mark et al., 19). 94) or fibronectin (Kornblihtt et al., 1985) are Ig- -Like domains and / or FN-like repeats but distinct distance parameters Data. This indicates that they are far apart from each other and members of the L1 family. It is shown that they are weakly related (Table 3). Human leukocyte common antigen-related genes (HLAR) (Streull et al., 1988) and in colorectal cancer Tumor suppressor gene product (DCC) (Fearon et al., 1990) According to the meter (42% and 50% similarity index, respectively) L1 family It is interesting to be close to Lee. A closer look at the conserved amino acids reveals that DC C appears to have lost the fifth and sixth Ig-like domains, but DCC does not Previously by Fearon et al. (1990) and Pierceall et al. (1994). It is actually closer to L1 family than suggested N-CAM Will be apparent. Recent studies indicate that DCC is predominantly expressed in the brain and Neurite growth of PC12 cells was DCC-transfected and the cell surface Stimulated on the surface of fibroblasts expressing the protein on the surface (Pierceall et al. (1994)). HLAR also has relatively high similarity The index is shown, but its relationship to the L1 family is less clear.                               Example 25 CHL1 mRNA and protein distribution in tissues   Whether CHL1 shares predominant expression in the nervous system with other members of the L1 family To study whether, we examined the expression of CHL1 in various tissues by mRN. Analysis was performed at each level of A and protein. In Northern blot analysis, CHL1 Boprobe is the size of mRNA detected by L1 probe (about 6 kb) (Bamboo (T acke et al., 1987) a predominant mRNA band of about 8 kb and a hive significantly greater than A lid was formed (FIG. 21). Smaller and weaker RNA bands (FIG. 21) a, lane 3) probably due to cross-hybridization with ribosomal RNA Probability is high. 8 kb RNA was detected in the cerebellum, brain minus cerebellum, and spinal cord. It was not detected in the root ganglion (DRG) (FIG. 21a). In contrast, L1 ribop Lobes showed a strong signal with DRG-derived RNA (FIG. 21a). CHL1m RNA was also detectable in the cerebellum of 9-day-old rats and in the spinal cord of 6-day-old rats, In rat PC12 cells or Kos-1 cells maintained in the presence or absence of NFG Was not detected (FIG. 21b). Other tissues analyzed (thymus, lung, liver, small In all (intestine, spleen and pancreas) no signal was detectable (FIG. 21a) .   To identify the CHL1 protein, the CHL1 protein was expressed by bacteria. Antibodies were generated against the fragments. High phase with other known L1 family members Excluding regions of the same sex, such as transmembrane extension regions or intracellular Region, a 1.7 kD cDNA fragment with a 6Ig-like domain and 4 FNs The fragment representing the -like repeat (Figures 18 and 19b) was cloned into the pET expression vector did. The protein fragment obtained by the expression is subjected to anion exchange chromatography. Further purification and SDS-PAGE followed by Coomassie blue staining A 0 kD band resulted. Western blot analysis (FIG. 22a) and ELISA A (not shown) caused antisera from two rabbits to be CHL1 protein cleaved It reacted with the fragment but did not react with purified L1, N-CAM or MAG. CH Degradation of L1 peptide or CHL1 fragment and co-purified bacterial protein Some reaction was also observed (FIG. 22a, lane 4).   Further examining the specificity of the antibodies and their expression on native cell surface CH To determine whether or not to recognize L1, temporarily transfected cost One cell was tested with the antibody. By immunocytochemistry, CHL1-transfect Cell surface expression of CHL1 on E. coli cells was revealed, but with the same vector No expression was observed on cells mock-transfected with (FIG. 23). These results also indicate that the hypothetical signal sequence is functioning and open Prove that the reading frame is correct.   The first CHL1 cDNA clone was derived from L1-derived immunoaffinity-purified brain. Expression library by screening using polyclonal antibodies L1 against the recombinantly expressed Ig-like domain of L1 No reaction of CHL1-transfected cells with another preparation of antibody was observed (Not shown). CHL- to the extracellular portion of the CHL1 molecule (FIG. 19) Neither antibody reacted with L1-transfected cells (not shown). Therefore, the L1 polyclonal antibody used for screening the expression library Is the C-terminal intracellular portion of CHL1 with the highest homology between CHL1 and L1. It may have reacted.   Several tissues (brain, liver, lung, kidney, and small intestine of 9-day-old mouse, FIG. 23b) CHL1 antiserum was used to identify immunoreactive proteins in it. 0.5 % Soluble and insoluble crude fractions in Triton X100 And analyzed it. A polyclonal antibody against L1 was used as a control. C The HL1 antibody is 185, 165, and 125 kD in the insoluble and soluble fractions of the brain membrane. 3 distinct bands were recognized. 185kD band is weakly detected in the soluble fraction Only, and the 125 kD band was even weaker in the insoluble fraction ( Figure 23b, lanes 1 and 2). This indicates that the 185 kD band is probably CHL Whereas the 125 and 165 kD forms are likely to be proteases. Indicates that the fragment is more cleaved. A similar pattern of immunoreactive bands is indicated by L 1 (Faissner et al., 1985; Sadoul et al., 1988), Ng- CAM (Grumet et al., 1984), and Nr-CAM (Kayyem et al.) , 1992). However, the proposition in the third FN-like domain Dibasic consensus sequence (L1: "SKR", Ng-C AM: “SRR”, Nr-CAM: “SRR”, Nr-CAM: “SRRSKR” ") Is not present in CHL1. Like other members of the L1 family, CH L1 was found to be expressed only late in development. Western Bu Lot analysis did not detect in the brain 15 days before embryonic age (not shown). 5 An immunoreactive band of 0 kD was detected in the detergent soluble fraction of whole liver tissue . CHL1-specific mRNA is not found in liver by Northern blot analysis This band (FIG. 22a) indicates that the CHL1 antibody was not associated with the CHL1-related protein. This may be due to a partial cross reaction. CHL1 immunoreactivity tested However, no other tissue was detected (FIG. 23b).   In the CNS, members of the L1 family are predominantly expressed by neurons . Therefore, we will determine whether CHL1 shares this pattern of expression with L1. I was interested in Perform in situ hybridization experiments, Cells that synthesize CHL1 and L1 in the retina, optic nerve, and cerebellar cortex of later mice Identified. In the retina of 7-day-old mice, L1 (Fig. 24a) and CHL1 mRNA (Fig. 24b) is expressed by ganglion cells. L1 transcripts are axially localized in the inner nuclear layer It was further detectable in cord and horizontal cells (FIG. 24a). CHL1mRN A, in contrast, is a small localization at the interior (ie, vitread) boundary of the internuclear layer. It was only occasionally detected in kana cells (FIG. 24b). Grips of the optic nerve A cells did not contain detectable levels of L1 transcript (FIG. 24a). Absolutely In contrast, CHL1 mRNA is located proximal to the optic nerve (ie, near the retina) Is strongly expressed by glial cells (Fig. 24b) and Low levels of CHL1 expression were found in glial cells localized in the area (FIG. 24b).   In the cerebellar cortex of 2-week-old mice, L1 mRNA is located in the star-shaped and cage-localized molecular layers. Detectable in dendritic cells and in Golgi cells and granule cells localized in the inner nuclear layer. (FIG. 24d). The section was hybridized with a CHL1 antisense cRNA probe. When cell formation occurred, the same cell type was labeled (FIG. 24e), with the exception of CH. L1 transcript was hardly detectable in cells localized in the middle of the molecular layer (Compare FIGS. 24d and e). Sections were taken as the corresponding sense cRNA as a negative control. Hybridization with the probe did not detect cell labeling (retinal And the optic nerve hybridized with the CHL1 sense cRNA probe, FIG. 4c). Study whether glial cells express CHL1 in vitro Purify purified astrocyte or oligodendrocyte cultures at young postnatal Prepared from mouse or rat forebrain. Transfect-cells of Kos cells Use the same polyclonal CHL1 antibody that specifically detected CHL1 on the surface. Used. Astrocytes or oligodendrocytes each respond to GFAP Identification was performed using an antibody or an antibody against the O1 antigen. Culture of astrocyte glial cells Riclonal CHL1 (FIGS. 25a, d) antibody and monoclonal GFAP (FIG. 2) 5b, e) Some cells were double-labeled with the antibody. Oligodendrocyte glial cells Analysis of the culture, however, did not show co-localization of CHL1 and O1 antigens. This This means that mature oligodendrocytes have detectable levels of CHL in vitro. 1 is not expressed. Considering these observations together, CHL1 and L1 are heavy. Although it shows multiple expressions, it can be said that it also shows different expression patterns. CHL1 instead of L1 It is extremely impressive that it is expressed by glial cells with nervous system in vivo. This suggests that different members of the L1 family perform different functions. Things. Analysis of glycosylation and HNK-1 carbohydrate with CHL1 glycoprotein Compound detection   The observed molecular weight of CHL1 (185 kD) is calculated from the calculated molecular mass (134. 9 kD), so the carbohydrate contribution to the molecular mass and the carbohydrate The type of product modification was analyzed. Surfactant derived from crude brain membrane of 7-day-old mouse The soluble or insoluble fraction was subjected to enzymatic deglycosylation. N-glycos After treatment with DNase F (PNGazoF), all CHL1 immunoreactive proteins were The molecular mass decreased (FIG. 26). That is, the 185 kD band becomes 150 kD, The 165 kD band decreased to 135 kD and the 125 kD band decreased to 110 kD. Was. Serine / threonine linked galactosyl β (1-3) N-acetylgalactosa O-glycosyl, an enzyme known to cleave minyl disaccharides Treatment with dase (Glasgow et al., 1977) slightly increases mobility. Result. That is, the 185 and 165 kD bands are approximately 180 and Each shifted to 160 kD, but the 125 kD band did not. This These observations indicate that most of the molecular mass of carbohydrates is due to N-linked carbohydrates. Show. When treated with both enzymes together (FIG. 26), Shift from 185 to 145 kD resulting in a larger shift than seen in . This means that the O-glycosylation site cleaved by O-glycosidase alone Suggests that not all glycosylation sites. The result is CHL 1 contains about 30% of its molecular mass as N-glycosidyl-linked carbohydrate Is shown.   L1 (Kruse et al., 1984), TAG-1 (Dodd et al., 1988), Nr-CAM (Grumet et al., 1991), F3 (Gennarini et al., 1) 989, N-CAM (Kruse et al., 1984), myelin-related glycoprotein MAG (McGarry et al., 1983; Kruse et al., 1984) and Po (Bollenson and Schachner, 1987) Such nerve cell adhesion molecules have HNK-1 carbohydrates. Therefore, we are CHL 1 was analyzed to have HNK-1 carbohydrates. 9 days old CHL1 Mouse was immunoprecipitated with the CHL1 antibody from detergent lysates of whole brain tissue. versus As a control, L1 was also immunoprecipitated from the same brain extract with a polyclonal antibody. . Using monoclonal antibody 412 against HNK-1 carbohydrate epitope Both immunoprecipitates showed CHL1 (FIG. 27) or L1 (Not shown) by monoclonal antibody 412 at the position of the expected molecular mass. It was shown that it contained a recognized band. HNK-1 carbohydrate is cell- Involved in to-cell adhesion and laminin (Keilhaue r) et al., 1985; Kuenemund et al., 1988; Hall et al., 1993, 199. CHL1, like other members of the L1 family, May interact with laminin through K-1 carbohydrates.                                   Conclusion   The above experiments were performed on humans, rats, mice, chickens, zebrafish and L1 family of neurorecognition molecules found in various species such as Drosophila CHL1 was added as a member of. Thus, everything in late axon formation Phylogenetically maintained by neurons and subsets of neurons at initiation Make up a family of surviving molecules. That there are many L1-related molecules In fact, it is a unique newlight that is structurally similar but very functionally relevant. It points out the natural demands for hexagonal molecules, and fine-tunes axon pathway discovery It points out that the L1 family has evolved as a group of molecules that regulate is there.   The following is an alphabetical listing of the references referenced in Examples 18-25. Strike. Adams, M. (Adams, M.D.), Dubnick, M. (Dubnick, M.), Carlavag, A. (Kerlavage, A.R.), Moreno, R. (Moreno, R. ), Kelly, Jay. M. (Kelley, J.M.), Uterbach, Tee. Earl. (Ut terback, T.R.), Nagret, Jay. W. (Nagle, J.W.), Fields, -. (Fields, C.) and Venter, Jay. C. (Venter, J.C.) (1992), Human brain remains Sequence identification of gene 2375, Nature355: 623-634. Adams, M. D. (Adams, M.D.), Carravag, A. Earl. (Kerlav age, A.R.), Fields, C. (Fields, C.) and Venter, Jay. Sea. (Ven ter, J.C.) (1993), 3400 newly expressed sequence tags are diverse transcripts in the human brain Nature Genet.Four: 258-267. Appel, F., Holm, J., Conscience, J Eh. F. (Conscience, J.F.) and Schachner, M. (1993) ), Some extracellular domains of the neural cell adhesion molecule L1 J. Involved in endoplasmic reticulum adhesion. Neurosci.13: 4764-4775. Appel, F., Holm, J., Conscience, J Eh. F. (Conscience, J.F.), Fomboren und Halbach, F. (von Bohlen und Halbach, F.), Faissner, A., Jay James, P. and Schachner, M. (1995), New Neuronal adhesion molecule L1 as a growth promoting and signaling domain Boundary and identification between fibronectin type III homologous repeats 2 and 3; Neuro biol.28: 297-312. Acquaint, M. (Arquint, M.), Lauder, J. (Roder. J.), Chia, D Le. S. (Chia, L.-S.), Dawn, J. (Down, J.), Wilkinson, D. -(Wilkinson, D.), Bailey, H. (Bayley, H.), Brown, P. (Braun , P.) and Dunn, R. (1987), fractions of myelin-related glycoproteins. Child cloning and primary structure, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)84: 600-604. Baron, M., Maine, A. El. (Main, A.L.), Doris Call , P.ー. (Driscoll, PC), Maddon, H. Jay (Mardon, H.J.), Bo Id, Jay (Boyd, J.) and Campbell, I. Dee. (Campbell, I.D.) (1 992), H-NMR structure determination of fibronectin cell adhesion type III module And secondary structure, Biochem.31: 2068-2073. Bartheis, D., Santoni, M. Jay (Santoni, M.-J .), Willie, W., Rupert, C. (Ruppert, C.), Cha Books, Jay. Chaix, J.-C., Hirsch, M. Earl. (Hirsch, M.- R.), Fontesila Camps, Jay. C. (Fontecilla-Champs, J.C.) (Goridis, C.) (1987), Mr 7900 without a membrane extension region And nucleotide isolation of mouse N-CAM cDNA encoding polypeptide 0 Array, EMBO J.6: 907-914. Birch, S. (Bartsch, S.), Birch, U. (Bartsch, U.), Doris, U. (Do rries, U.), Faissner, A., Weller, A. .), Ekblom, P. and Schachner, M. 1992), Expression of tenascin in the developing and mature cerebellar cortex, J. Am. Neurosci,12: 73 6-749. Burgund, E. (Berglund, E.O.) and Ranscht, B. B.) (1994), Molecular clone of the human contactin gene (CNTN1) on chromosome 12q11-q12. And In Situ Positioning, Genomicstwenty one: 571-582. Bieber, A.J., Snow, P. M. (Snow, P.M.), (Hortsch, M.), Patel, N. H. (Patel, N.H), J Icobus, Jay. Earl. (Jacobs, J.R.), Trakina, Zett. Earl. (Traqu ina, Z.R.), Schering, J. and Goodman, C. D (Goodman, C.S.) (1989), Drosophila neuroglians: vertebrate deities A member of the immunoglobulin superfamily with broad homology to the transcellular adhesion molecule L1 Member, Cell 59: 447-460. Bixby, Jay. L. (Bixby, J.L.), Lillian, J. (Lilien, J.) And Richard, El. F. (Reichardt, L.F.) (1988), Schwann in vitro Identification of key proteins that promote the neuronal growth process on cells, J. et al. Cell Biol,Ten 7:  353-362. (Bollenson, E.) and Schachner, M. (1 987), peripheral myelinating glycoprotein Po is L2 / H shared by nerve adhesion molecules. Neurosci. Expressing NK-1 and L3 carbohydrate structures. Lett.82: 77-82. Bradford, M. M. (Bradford, M.M.) (1976), protein-dye binding Rapid and sensitive method for the determination of microgram quantities of protein using principles, Anal. Bi ochem.72: 248-254. Blumendorf, T., Wolf, Jay. M. (Wolf f, J.M.), Frank, R. and Rathen, F. G. (Rathjen, F.G.) (1989), neuronal recognition molecule F11: fibronectin type III domain and With the immunoglobulin type C domain, NeuronTwo: 351-1361. Brummendorf, T. and Rathen, F. G. (Rat hjen, F.G.) (1993), Immunoglobulin domains and fibrones in vertebrates. Axonal Glycoprotein with a Kuching Type III-Related Domain: Structural Features, Conjugation Synthetic activity and signaling, J. et al. Neurochem.61: 1207-1219. Brummendorf, T. and Rathen, F. G. (Rath jen, F.G.) (1994), Cell adhesion molecule 1: immunoglobulin superfamily, InS heterline, P., ed. Protein Profile, Academic Press, London, 951-1058. Thurgoon, M. P. (Surgoon, M.P.), Gourmet, M. (Grumet, M.), Mau B. (Mauro, V.), Edelman, G. E. (Edelman, G.M.) and crab Ngham, Be. A. (Cunningham, B.A.) (1991), chicken neuron-glia. Cell adhesion molecule Ng-CAM: to the origin of polypeptides and the Ig superfamily , J. Cell Biol.112: 1017-1029. (ChomczynsKi, P.) and Satchi, N. (Sacchi, N.) ( 1987), acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction One-Step RNA Isolation Method by Anal. Biochem.162: 158-159. Connery, M. A (Connelly, M.A.), Grady, Earl. C. (Grady,  R.C.), Musinsky, Kay. F. (Mushinski, J.F.) and Mark, Kei. Bee (Marcu, K.B.) (1994), a gene encoding neuronal glycoprotein. PANG is valgus due to long terminal repeats of A-type particles in the reservoir of murine plasmacytoma Activated, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)91: 1337-1341. Cunningham, Be. A. (Cunningham, B.A.), Hem Parry, Jay. Jay. (Hemperley, J.J.), Murray, Be. A. (Murray, B.A.), Prediger, A -. A. (Prediger, E.A.), Brackenbury, R. (Brackenbury, R.) And Edelman, G. M. (Edelman, G.M.) (1987), Neuronal cell adhesion molecule: structure Construction, immunoglobulin-like domains, cell surface regulation, and alternative RNA splicing Su, Science236: 799-806. Davis, Jay. (Davis, J.Q.), McLaughlin, Tea. (McLaughlin T.) and Bennett, V. (1993), related to neural cell adhesion molecules. Certain ankyrin-binding proteins: confer transmembrane and intracellular connections in mature brain Candidate, J. Cell Biol.121: 121-133. Davis, J. and Bennett, V. (1994), Nervous. Shared by the neurofasin / L1 / NrCAM family of cell adhesion molecules in the system Ankyrin binding activity, J. Biol. Chem.269: 27163-27166. Dodd, J. (Morton, S.), Caragojes, D. (Karagogeos, D.), Yamamoto, M. (Yamamoto, M.) and Jesel, T. ー. (Jessell, T.) (1988), axonal glycops on a subset of embryonic spinal cord neurons. Spatial regulation of rotatin expression, Neuron1: 105-106. Dorris, U., Birch, U. (Bartsch, U.), Nord, C. (No lte, C.), Roth, J. and Schachner, M. ) (1993), Electron microscopy of nonradioactive in situ hybridization. Application: digoxigenin-labeled probe of mouse cerebellum tenaxin mRNA and Using gold-labeled antibodies, Histochem.99: 251-262. Edelman, G. Edelman G.M. (1970), covalent structure of human IgG. XI. Functional meaning, Biochem.9: 3197-3205. Edelman, G. (Edelman, G.M.) (1988), Morphology controlling molecule, Biochem.Two 7 : 3533-3543. Ericsson, H. (Erickson, H.P.) (1993), Tenascin-C, Tenascin- R, Tenascin-X: A group of competent proteins in functional studies, Curr. Opin. Cell Biol.Five: 869-876 Faissner, A., Teplow, D. Bee (Teplow, D.B.) (Kubler, D.), Kylehauer, G. (Keilhauer, G.), Kinzel, V. and Schachner, M. (1985), Biosynthesis and membrane topography of neural cell adhesion molecules, EMBO J.Four: 3105-3113. Fairron, E. Earl. (Fearon, E.R.), Cho, Kei. Earl. (Cho, K.R. ), Negro, Jay. M. (Nigro, J.M.), Khan, S. E. (Kern, S.E.), Simmons, Jay. W. (Simons, J.W.), Rupert, Jay. M. (Rup pert, J.M.), Hamilton, S. Earl. (Hamilton, S.R.), Playsinger, A. C. (Preisinger, A.C.), Thomas, G. (Thomas, G.), Kinsler, Kei. (Kinzler, K.W.) and Vogelstein, B. (Vogelstein, B.) (1990), Identification of chromosome 18q, a colorectal cancer, Science247: 49-56. Feisenfeld, Dee. P. (Feisenfeld, D.P.), Highness, M. D (Hynes, M.A.), Scholar, Kay. M. (Skolor, K.M.), Farley, A . Jay (Furley, A.J.) and Jessel, T. M. (Jessel, T.M.) (1994), TAG-1 mediates homophilic binding, but neurite formation on TAG-1 Length is L1-like molecule and B1Neuron demands integrin12: 675-690. (Frei, T.), von Boren und Halbach, F. ohlen und Halbach, F.), Willie, W. and Shackner (Schachner, M.) (1992), different extracellular domains of the neural adhesion branch (N-CAM). J. Main is involved in different functions. Cell Biol.118: 177-194. Farley, A. Jay (Furley, A.J.), Morton, S .; Be. (Morton. S .B.), Manalo, D., Karagogeos, D. (Dodd, J.) and Jessel, Tee. M. (Jessel, T.M.) (199 0), axonal glycoprotein TAG-1 is an immunoglobulin with neurite growth promoting activity. He is a member of the Roblin Superfamily. Cell61: 157-170. (Gennarini, G.), Siberi, G. (Cibelli, G.), Logon, G. (Rougon, G.), Mattey, M. G. (Mattei, M.G.) and Goridis, S. -(Goridis, C.) (1989), Mouse neuronal cell surface protein F3: chicken Phosphatidylino in the immunoglobulin superfamily related to contactin Member fixed by Sitol, J.M. Cell Biol.109: 775-788. Gennarini, G., Dubec, P., Bonner (Bonad, A.), Rogon, G., and Goridis, C. Goridis, C.) (1991), Transfected F3 / F11 neuron cell surface. Proteins mediate cell-cell adhesion and promote neurite growth. Neuron6: 595-60 6． Glasgow, El. Earl. (Glasgow, L.R.), Paulson, Jay. Sea. (Paul son, J.C.) and Hill, Earl. (Hill, R.L.) (1977), Streptococcus (Dipl. ococcus) Systematic purification of five glycosidases from pneumoniae. Bio l. Chem.252: 8615-8623. Grumet, M., Hoffman, S., Chong, Si -. (Chuong, C.M.) and Edelman, G. E. (Edelman, G.M.) (1984 ), Polypeptide components and binding function of neuron-glial cell adhesion molecule, Proc . Natl. Acad. Sci. USA81: 7989-7993. Gourmet, M., Mauro, V., Burgoon, D Mu. (Burgoon, M.P.), Edelman, G. E. (Edelman, G.M.) Ningham, Bee. (Cunningham, B.A.) (1991), a new nervous system glycoprotein. Structure of in-Nr-CAM and its relationship to subgroups of neuronal adhesion molecules, J. Cel l Biol.113: 1399-1412. Gennad, V., Gwynn, L. and Wood, Pi. ー. (Wood, P.) (1994), Stellate glial cells are Schwann cells of dorsal root ganglia in vitro. Inhibits proliferation and myelination. J. Neurosci.14: 2980-2992. (Hall, H.), Lee, L. (Liu, L.), Shackner, M. (Sch achner, M.) and Schmidt, B. (1993), L2 / HNK-1. Carbohydrates mediate the attachment of nerve cells to laminin. Eur. J. Neurosci.Five:  34-42. Hall, H., Vorherr, T. and Shack Schachner, M., Involved in HNK-1 carbohydrate binding and cell adhesion Characterization of a 21 amino acid peptide of the laminin G2 domain, GlycobiologyFive: 435-441. (Hasler, T.H.), Raider, C. (Rader, C.), Tokley, E. (Stoeckli, E.T.), Zurich, R, A. (Zue llig, R.A.) and Sonderegger, P. (1993), human TAG- 1 / Axonin-1 cDNA cloning, structural features and expression in eukaryotes , Eur. J. Biochem.211: 329-339. Hein, J. (1990), Unified approach to sequence and phylogeny, Meth. . Enzymol.183: 628-645. Heijne von, G. (1986), a new predictor of sequence cleavage sites. Nucl. Acids Res.14: 4683-4690. Rabin, M. (Hlavin, M.L.) and lemon, buoy (Lemmon, V.) (1991), L1CAM molecular structure and function test: Comparison between species, Genomics11: 416-423. Holm, J., Appel, F. and Shackner, M. (Schachner, M.) (1995), Some extracellular domains of the neural cell adhesion molecule L1. Is involved in homophilic interactions; Neurosci.42: 9-20. Hubert, S. C. (Hubbard, S.C.) and Ibat, R. Jay. R.J.) (1981), Synthesis and processing of asparagine-linked oligosaccharides, Annu. Rev. Biochem.50: 555-583. Husmann, K., Faissner, A. and Shah. Schachner, M. (1992), Fibronectin type III Different domains implicate tenascin in cerebellar granule cell migration and neurite growth To promote. J. Cell Biol.116: 1475-1486. Highness, Earl. (Hynes, R.O.) (1992), Integrins: cell adhesion Versatility, regulation and signal generation, Cell68: 11-25. Kanra, G. S. (Kanla, G.S.), Han, P. L. (Han, P.L.), Kim, Wa I. T. (Kim, Y.T.) and Belen, H. (Bellen, H.) (1993), Neuromass Neuromusculin. Shows expressed in peripheral neuronal precursors and muscle The Drosophila gene encodes a cell adhesion molecule. Neuron.11: 673-687. Kayam, Jay. F. (Kayyam, J.F.), Roman, Jay. M. (Roman, J.M.) , Dela Rosa, E. Jay (de la Rosa, E.J.), Schwartz, Yu. z, U.) and Dreyer, W. Jay (Dreler, W.J.) (1992), Bravo / NrCAM is closely related to the cell adhesion molecules L1 and NgCAM and is a similar heterodimer. -Has a structure. J. Cell Biol.118: 1259-1270. Keihauer, G., Faissner, A. and (Schachner, M.) (1986), L1, L2 and N-CAM antibodies Neurons-neurons, neurons-astroglial cells and astroglial cells Differential inhibition of vesicle-astroglial adhesion, Nature316: 728-730. Kraksen, F. (Kluxen, F.W.), Brands, C. (Bruns, C.) and Lubbert, H. (1992), somatostatin receptor c in rat brain Expression cloning of DNA, Proc. Natl. Acad. Soc. (USA),89: 4618-4022. Kraksen, F. (Kluxen, F.W.) and Lubert, H. (Lubbert , H.) (1993). Large expression, Anal. Biochem.208: 352-356. Cornbrit, A. (Kornblihtt, A.R.), Umezawa, Kei.  K.), Vibe-Pedersen, K. and Ballard, F. I (Baralle, F.E.) (1985), Primary Structure of Human Fibronectin: Differential Splice Sing makes at least 10 polypeptides from one gene, EMBO J.Four:  1755-1759. Kozak, M. (1987) at least six before the AUG start codon. Nucleotides enhance the translation of mammalian cells. Mol. Biol.196: 947-950. (Kruse, J.), Milehammer, Earl (Mailhammer, R.), C Ernicke, H. (Wernecke, H.), Falsner, A. (Falssner, A.), S. Sommer, I., Goridis, C. and Shackna (Schachner, M.) (1984), Neuronal adhesion molecules and myelin-related glycopro Thein is a common carbohydrate recognized by monoclonal antibodies L2 and HNK-1 Share things part. Nature311: 153-155. Kunemund, V., Yungawara, F. B. (Jungawala, F.B. ), Fisher, G., Chu, Dee. Kei. H. (Chou, D. K.H.), Kylehauer, G. and Schachner, M. ner, M.) (1988), L2 / Hnk-1, a neuronal cell adhesion molecule, is involved in intercellular actions. J. Cell Biol.106: 213-223. Kyte, J. and Doolittle, Earl. F. (Doolittle, R.F. (1982), A simple method to characterize the hydrotherapeutic characteristics of proteins, Mol. Biol.157:  105-132. Remir, Yu. Kay (Laemmil. U.K.) (1970), head of bacteriophage T4 Of structural proteins that occur during assembly of proteins, Nature227: 680-685. (Leng, P.), Decimo, D. (Decimo, D.), Petman, B. (Pettmann, B.), Janet, T., and Labodet, G. (La. bourdette, G.) (1994), retinoic acid is an in vivo metabolite of oligodendrocyte precursor cells. Controls development in Toro. J. Neurosci. Res.39: 613-633. Ray, C., Brown, M. A. (Brow, M.A.), Nave, K. A. (Nave, K.A.), Norona, A. Be. (Noronha, A.B.), Quwares, Ah Le. H. (Quarles, R.H.), Bloom, F. E. (Bloom, F.E.), Milner ,R. Jay (Milner, R.J.) and Sutcliffe, Jay. G. (Sutcliffe (1987), Cell adhesion molecule for postnatal neural development, 18236 / myelin-related group. Two forms of lycoprotein are produced by alternate splicing. Proc. Na tl. Acad. Sci. (USA),84: 4337-4341. Lehigh, Dee. Jay (Leahy, D.J.), Hendrickson, W. Stingray (Hendrickson, W.A.), Akir, I. and Ericsson, H. (Erlckson, H.P.) (1992), MAD analysis of selenomethionyl protein Structure of the isolated fibronectin type III domain from tenascin, Scienc e258: 987-991. Lemon, V., Fur, Kay. L. (Farr, K.L.) and Lagenow (Lagenaur, C.) (1989), L1 mediated axonal growth is associated with hemophilic binding. Occurs through the integration mechanism. Neuron2: 1597-1603. Lippman, Dee. Jay (Dipman, D.J.) and Pearson, W. A (Pearson, W.R.) (1985), A quick and sensitive study of protein similarity, Sien ce227: 1435-1441. Main, ray. El. (Main, A.L.), Harvey, Tee. S. (Harvey, T.S.), Baron, M., Boyd, J. and Campbell, J. I. Dee. (Campbell, I.D.) (1992), the tenth type III of fibronectin Tertiary structure of the module: RGD-mediated interaction considerations, Cell71: 671-678. Mark, M. Earl. (Mark, M.R.), Skaden, De. Tea. (Scadden, D. T.), Wang, Z., Gud, O., Goddard, A. dard, A.) and Godwhiskey, P. Jay (Godowski, P.J.) (1994), Ax A novel receptor tyrosine kinase Rse with homology to 1 / Ufo is highly expressed in the brain. Expressed in a bell. J. Biol. Chem.269: 10720-10728. Martini, R. and Schachner, M. (1 986), Neuronal adhesion molecules in the developing sciatic nerve (L1, N-CAM and MA) G), and their shared carbohydrate epitopes and myelin basic protein Confirmation of the position by immunoelectron microscopy of J. Cell Biol.103: 2439-2448. McCarthy, Kay. McCarthy, K.D. and De Vells, J. is, J.) (1980), Culture of astrocytes and oligodendrocytes from rat cerebellar tissue Preparation of a product, J. Cell Biol.B5: 890-902. McGarry, Earl. C. (McGarry, R.C.), Hellfund, S. El. lfand, S.L.), Quwares, Earl. H. (Quarles, R.H.) and Loader, J I. C. (Roder, J.C.) (1983), Myelin with monoclonal antibody HNK-1 Recognition of related glycoproteins, Nature306: 376-378. Melton, Dee. A. (Melton, D.A.), Krieg, P. A. (Krieg, P.A. ), Revagliachi, M. A. (Rebagliati, M.A.), Maniatis, Tea. niatis, T.), Zinn, K., and Green, M. Earl. (Green, M R.) (1984), biologically active RNA from a plasmid containing the SP6 promoter. Effective Synthesis of Probes for RNA and RNA Hybridization in vitro, Nucl . Acids Res.12: 7035-7056. Miura, M., Kobayashi, M., Asou, H. (Asou, H.) and Uemura, K. (1991), Rat neuronal cell adhesion Molecular cloning of cDNA encoding child L1. Two isoforms in the cytoplasmic region L1 is produced by differential splicing, FEBS Lett.289: 91-95. Moose, M. (Moos, M.), Take, R. (Tacke, R.), Scherrer, H. (S cherer, H.), Teplow, D., Fruh, K. and Schachner, M. (1988), a binding domain similar to fibronectin. Neural connections as members of the immunoglobulin superfamily with the main Die molecule L1, Nature334: 701-703. Moscoso, El. M. (Moscoso, L.M.) and Sains, Jay. Earl. (Sanes,  J.R.), four immunoglobulin superphors expressed in the developing mouse spinal cord. Millie adhesion molecule (L1, Nr-CAM / BRAVO, neurofasin / ABG P and N-CAM), J.M. Comp. Neurol.352: 321-334. (Pesheva, P.), Ganallini, G. (Gennarini, G.), Goridi (Goridis, C.) and Schachner, M. (1993), F3 / 11 cell adhesion molecule is extracellular matrix glycoprotein J1-160 / 1 80 mediates the repulsion of neurons. NeuronTen: 69-82. Peasil, W. E. (Pierceall, W.E.), Cho, Kei. Earl. (Ch o, K.R.), Götenberg, Earl. H. (Getzenberg, R.H.), Roll, M. A. (Roale, M.A.), Hedrick, L. (Hedrick, L.), Vogelstein (Vogelstein, B.) and Fairron, E. Earl. (Fearon, E.R.) (199 4), NIH3DT3 cells expressing the deleted colorectal carcinoma suppression gene product Stimulates neurite growth of rat PC12 pheochromocytoma cells. Cell Biol. 124 : 1017-1027. Piashbacher, M. (Pierschbacher, M.D.) and Luoziati, (Ruosiahti, E.) (1984). Cell adhesion activity of fibronectin is small Can be replicated with synthetic fragments. Nature309: 30-33. Pisano, A., Redmond, Jay. (Redmond, J.W. ), Williams, Kay. L. (Williams, K.L.) and Gourry, A. A. (Go oley, A.A.) (1993), Glycosylation sites identified by solid-phase Edman degradation : O-linked glycosylation motif on human glycophorin A, Glycobiol.Three : 429-435. Poltorak, M., Sador, R., Kerha Wer, G. (Kelhauer, G.), Linda, C. (Landa, C.), Faralling, Te (Faharing, T.) and Shackner, M. (Schachner, M.) (1987). Myelin-related glycopros that are members of the 2 / HMNK-1 family of vesicle adhesion molecules Thein (MAG) is expressed in neural-oligodendritic glial cells and oligodendrocytes-oligodendritic glia. Involved in cell interactions. J. Cell Biol.105: 1893-1899. Prince, Jay. T. (Prince, J.T.), Alberti, L. (Alberti, L. ), Heli, P. A. (Healy, P.A.), Nauman, S. Jay (Nauman, S .J.) And Stahl Cup, W. B. (Stallcup, W.B.) (1991), NILE Molecular cloning of glycoprotein and persistent expression in the adult rat CNS Evidence, J. Neurosci. Res.30: 567-581. (Pulido, D.), Campzano, S., Kida, T. (Kida, T.), Modrel, J. (Modolell, J.) and Barbashid, M. Barbacid, M.) (1992), related to the trk family of neurotrophin receptors Dtrrk, a Drosophila gene, provides a new class of neuronal adhesion molecules. To load. EMBO J.111: 391-404. Ranscht, B. (1988), concentrated in the area of interneuronal contact The sequence of Contactin, a 130 kD glycoprotein, is important for immunity in the nervous system. J. Defining new members of globulin Cell Biol.107: 1561-1573. La Chien, F. (Rathjen, F.G.) and Shackner, M. (Schachner, M. .) (1984), Immunization of a new nerve cell surface component (L1 antigen) contained in cell adhesives. Cytological and biochemical characterization, EMBO J.3: 1-10. La Chien, F. G. (Rathjen, F.G.) and Jessel, T. M. (Jessell,  T.M.) (1991), Glycoproteins regulate vertebrate axon growth and induction: immunity Domain and dynamics of the globulin / fibronectin type III subfamily, Se min. Neurosci.Three: 297-307. Ruoslahtl, E. and Piashbacher, M. Dee (Pierschbacher, M.D.) (1987), New perspectives on cell adhesion: RGD and integrins , Science238: 491-497. Ruoslahtl, E. (1988), Fibronectin and its receptor , Annu. Rev. Biochem. 57: 357-413. (Rutlshauser, U.) (1993), Nervous system adhesion molecule, Curr. Opin. Neurobiol.Three: 709-715. (Sadoul, K.), Sador, R. (Sadoul, R.), Faisner , A. (Faissner, A.) and Shackner, M. (Schachner, M.) (1988), Neurology Biochemical characterization of different molecular forms of cell adhesion molecule L1, Neurochem.50 : 510-521. Salzar, Jay. Elzer (Salzer, J.L.), Holms, W. P. (Holme s, W.P.) and Colman, Dee. Earl. (Colman, D.R.) (1987) Lycoprotein Amino Acid Sequence: Phases of the Immunoglobulin Gene Superfamily Same sex, J. Cell Biol.104: 957-965. Sambrook, J., Fitch, E. (Fritsch, E. F.) and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: experiments Manual, Cold Spring Harbor Laboratory r Laboratory), Cold Spring Harbor, NY. Sanger, F. S. (Sanger, F.S.), Nick Len, S. (Nicklen, S.) and Coulson, A. (Coulson, A.R.) (1977) proposes an inhibitor to terminate the chain. DNA sequencing, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)74: 5463-5467. Schachner, M. (1991), on neural recognition molecules and cellular functions. Influences, In Letouneau, PC, Kater, S.B. And Macagno, E.R., eds. The  Nerve Growth Cone, Raven Press, NY, 237-254. Schachner, M. (1994), Neurorecognition molecules in disease and regeneration , Curr. Opin. Neurobiol.Four: 726-734. Schnitzer, J. and Schachner, M.  M.) (1981), Thy-1, H-2 and cerebellum in the cerebellum of newborn and adult mice. Expression of NS-4 cell surface antigen and tetanus toxin receptor, Neuroimmunol.1: 429-456. Seilheimer, B. and Schachner, M. M.) (1988), Studies on adhesion molecules that mediate interactions between cells in the peripheral nervous system are in culture. Of L1 in mediating sensory neuron growth on human Schwann cells Reveal the role, J. Cell Biol.107: 341-351. Sommer, I. and Schachner, M. (1981), Monoclonal antibodies against oligodendrocyte surface (01-04): Immunocytochemical research, Dev. Biol.83: 311-327. Southern, E. (Southern, E.M.) (1975), separated by gel electrophoresis Detection of a specific sequence in a DNA fragment obtained, J. et al. Mol. Biol.98: 503. Shatters, W. D., Folk, Kay. F. (Fok , K.F.), Tutter, M. M. (Zutter, M.M.), Adams, S. P. (Ad ams, S.P.), Rodriguez, Be. A. (Rodriguez, B.A.) and Santoro, S. (Santoro, S.A.) (1991), α in collagenTwoβ1Integrin tetrapef Identification of tide recognition sequences, J. et al. Biol. Chem.266: 7363-7367. Strolli, M., Kruger, N. X. (Krueger, N.X .), Hall, El. Hall, L.R., Schlossmann, S. F. (Schloss man, S.F.) and Saito, H. (1988), homologous to leukocyte common antigen. J, a new member of the immunoglobulin superfamily with a cytoplasmic region . Exp. Med.168: 1523-1530. Studier, F. (Studier, F.W.) and Moffat, Be. D (Moffatt, B.A.) (1986), High-level selective expression of cloned genes. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to achieve Mol.B iol.189: 113-130. Take, R., Moose, M., Teplow, De. Bee (Teplow, D.B.), Flue, K. (Fruh, K.), Scherrer, H. (Schere r, H.), Bach, A. and Schachner, M. (19) 87), Isolation of a cDNA clone of mouse neural cell adhesion molecule L1, Neurosci. Lett .82: 89-94. Taketchi, M. (1991), Cadherin cells as regulators of morphogenesis. Cell adhesion receptor, Science251: 449-455. Tannahill, L., Klein, R., and Shack Ner. M. (Schachner, M.) (1995), Neurotrophin receptors TrkA and T rkB inhibits neurite growth. Eur. J. Neurosci.6: 1424-1428. Taylor, J., Pesheva, P. and Shack Schachner, M. (1993), Janusin and In vitro effects of tenascin, J. et al. Neurosci. Res.35: 347-362. Tongiorgi, E., Bernard, Earl. Earl. (Bernardt , R.R.) and Schachner, M. (1995), Zebrafish Neurons express two L1-related molecules early in axon development. J. Neurosci. Res .42: 547-561. Tarotra, P. (Talotra, P.C.), Karagogeos, D. (Karagogeos, D .), Theodorakis, K., Michaelidis, Tea. M. Michaelidis, T.M.), Modi, W. S. (Modi, W.S.), Farley, A. J. (Furley, A.J.), Jesel, T. M. (Jessell, T.M.) and Papamatheakis, J. (1993), Human axonal glycoprotein Of the cDNA of the gene encoding TAG-1 (TAX-1) Positioning, Genomics18: 562-567. Volkmer, H., Hasel, B., Vol. F. Jay. M. (Wolff, J.M.), Frank, R. and Lachien , F. (Rathjen, F.G.) (1992), Structure of neurofascin, an axon surface recognition molecule. And its involvement in the neuronal subgroup of the immunoglobulin superfamily Section, J. Cell Biol.118: 149-161. Williams, A. F. (Williams, A.F.) and Berkeley, A. N. (Bar clay, A.N.) (1988), Immunoglobulin superfamily for cell surface recognition -Domain, Ann. Rev. Immunol.6: 381-405. Yoshihara, Y., Kawasaki, M., Tani, D (Tani, A.), Tamada, A. (Tamada, A.), Nagata, S. (Nagata, S.), Kaga (Kagamiyama, H.), and Mori, K. (1994), d. A new member of the immunoglobulin superfamily with tulite growth promoting activity TAG-1 / F3-related members BIG-1, Neuron13: 415-426.   The present invention is described and illustrated herein with reference to various specific materials, procedures and examples. However, the present invention is not limited to the specific material combinations of materials and operations selected for the above purposes. It should be understood that the combination is not limited. Such details Interpret the myriad of modifications as can be expected by those skilled in the art. be able to.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/18 48/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/04 ＡＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 37/02 ＡＥＤ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｔ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 39/395 A61K 39/395 N 48/00 C07K 16/18 48/00 C12Q 1/02 C07K 16/18 G01N 33/15 Z C12N 5/10 C12P 21/08 C12Q 1/02 C12N 5/00 B G01N 33/15 A61K 37/04 AAA // C12P 21/08 37/02 AED (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE , DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR) , NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, A M, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, IS, JP, KG, KP, KR, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK , MN, MX, NO, NZ, PL, RO, SG, SI, SK, TR, TT, UA, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 哺乳動物の中枢神経系における神経成長をイン・ビボで促進する方法であ って、該哺乳動物に作用物質の神経成長を促進する量を投与することを含み、該 作用物質がグリア細胞及びミエリン上に見いだされる阻害的な手掛かり分子に打 ち勝つことができそして該神経成長を促進することができる神経細胞接着分子、 それらの活性断片、それらと同起源の分子、それらと同種のもの、それらの模倣 物、それらのアンタゴニスト、それらに対する抗体、それらのアナログ、それら の分泌細胞及びそれらの可溶性分子である方法。 ２． 該作用物質がＣａ2+−依存性ニューロン細胞接着を媒介する免疫グロブリ ン・スーパーファミリーのメンバーから誘導されるものである、請求項１記載の 方法。 ３． 該作用物質がフィブロネクチン・タイプIII 相同反復及び免疫グロブリン 一様ドメインに類似の構造的モチーフを含む分子から誘導されるものである、請 求項１記載の方法。 ４． 該構造的モチーフがフィブロネクチン・タイプIII 相同反復１−２、及び 免疫グロブリン−様ドメインＩ−11、 III−IV、及びＶ−VIに構造的に類似であ る、請求項３記載の方法。 ５． 該作用物質がＬ１、Ｎ−ＣＡＭ及びミエリン関連グリコプロテインからな る群より選択されるものである、請求項２記載の方法。 ６． 該作用物質がラミニン、フィブロネクチン、Ｎ−カドヘリン、ＢＳＰ−２ （マウスＮ−ＣＡＭ）、Ｄ−２、２２４−１Ａ６−Ａ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＮＩＬ Ｅ、Ｎｒ−ＣＡＭ、ＴＡＧ−１（アクソニン−１）、Ｎｇ−ＣＡＭ及びＦ３／Ｆ １１よりなる群から選択されるものである、請求項２記載の方法。 ７． 請求項１〜請求項６いずれか１項に記載の方法に使用するための組換えＤ ＮＡ分子であって、作用物質またはそれらの活性断片、同起源の分子、同種の物 、模倣物又はアナログを発現制御配列と共に含む組換えＤＮＡ分子。 ８． 請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子を含むベクター。 ９． 請求項８に記載のベクターを含む形質転換宿主。 １０． 請求項１〜請求項６いずれか１項に記載の作用物質に対して形成された 抗体。 １１． ポリクローナル抗体を含む請求項１０記載の抗体。 １２． モノクローナル抗体を含む請求項１０記載の抗体。 １３． 哺乳動物の中枢神経系における神経成長を調節する方法であって、請求 項１０に記載の抗体、又はそれらの活性断片、同起源の分子、同種の物、アナロ グ、模倣物、分泌細胞又は可溶性分子の神経成長を調節する量を該哺乳動物に投 与することを含む方法。 １４． 哺乳動物の中枢神経系における神経成長を調節するための薬学的組成物 であって、請求項１に記載の作用物質、それらのアゴニスト、それらに対するア ンタゴニスト、それらの断片、それらと同起源の分子、それらと同種の物、模倣 物、アナログ、それらの分泌細胞又はそれらの可溶性分子の治療上の有効量、並 びに薬学的に許容される担体を含む組成物。 １５． 外因性の神経接着分子を発現するグリア細胞を含むトランスゲニック哺 乳動物。 １６． グリア細胞が星状グリア細胞である、請求項１５記載のトランスゲニッ ク哺乳動物。 １７． 神経接着分子がＬ１である、請求項１５記載のトランスゲニック哺乳動 物。 １８． 請求項１５〜１７いずれか１項に記載のトランスゲニック哺乳動物のグ リア細胞を含む細胞培養。 １９． 請求項１５〜１７いずれか１項に記載のトランスゲニック哺乳動物の中 枢神経系由来の組織を含む細胞培養系。 ２０． ＣＮＳニューロンのニューロン成長を増強する方法であって、請求項１ ８記載の細胞培養系で該ニューロンを培養する方法。 ２１． ＣＮＳニューロンのニューロン成長を増強する方法であって、請求項１ ９記載の細胞培養系で該ニューロンを培養する方法。 ２２． 記憶を増強する方法であって、記憶の増強の必要な哺乳動物の脳に請求 項１８記載の細胞培養系の細胞を哺乳動物の記憶の増強に有効な量投与すること を含む方法。 ２３． 記憶を増強する方法であって、記憶の増強の必要な哺乳動物の脳に請求 項１９記載の細胞培養系の細胞を哺乳動物の記憶の増強に有効な量投与すること を含む方法。 ２４． 記憶を増強する方法であって、記憶の増強の必要な哺乳動物の脳のグリ ア細胞に該グリア細胞中で神経接着分子の発現を可能とするベクターを送達する こ とを含む方法。 ２５． 神経接着分子がＬ１である、請求項２４記載の方法。 ２６． シナプス効率の増強の必要な哺乳動物のＣＮＳにおけるシナプス効率を 増強する方法であって、哺乳動物の脳に請求項１８記載の細胞培養系の細胞を哺 乳動物の脳におけるシナプス効率の増強に有効な量投与することを含む方法。 ２７． シナプス効率の増強の必要な哺乳動物のＣＮＳにおけるシナプス効率を 増強する方法であって、哺乳動物の脳に請求項１９記載の細胞培養系の細胞を哺 乳動物の脳におけるシナプス効率の増強に有効な量投与することを含む方法。 ２８． シナプス効率の増強の必要な哺乳動物のＣＮＳにおけるシナプス効率を 増強する方法であって、哺乳動物の脳のグリア細胞に該グリア細胞中で神経接着 分子の発現を可能とするベクターを送達することを含む方法。 ２９． シナプス効率の増強が長期間のポテンシエーション（potentiation）の 安定化により示される、請求項２６記載の方法。 ３０． シナプス効率の増強が長期間のポテンシエーションの安定化により示さ れる、請求項２７記載の方法。 ３１． シナプス効率の増強が長期間のポテンシエーションの安定化により示さ れる、請求項２８記載の方法。 ３２． 神経接着分子の活性を調節する薬物又は他の物質の能力を試験する方法 であって、該方法が、 ａ． 請求項１８記載の細胞培養系にＣＮＳニューロンを添加すること、 ｂ． 細胞培養系に試験対象の薬物を添加すること、 ｃ． ＣＮＳニューロンのニューロン成長を測定すること、及び ｄ． 薬物が添加されない対照培養と比べた薬物の存在下での細胞のニュー ロン成長レベルの差を神経接着分子の活性を調節する薬物の能力に相関させるこ と、 を含んでなるものである方法。 ３３． 神経接着分子の活性を調節する薬物又は他の物質の能力を試験する方法 であって、該方法が、 ａ． 請求項１９記載の細胞培養系にＣＮＳニューロンを添加すること、 ｂ． 細胞培養系に試験対象の薬物を添加すること、 ｃ． ＣＮＳニューロンのニューロン成長を測定すること、及び ｄ． 薬物が添加されない対照培養と比べた薬物の存在下での細胞のニュー ロン成長レベルの差を神経接着分子の活性を調節する薬物の能力に相関させるこ と、 を含んでなるものである方法。 ３４． 神経接着分子がＬ１である、請求項３２記載の方法。 ３５． 神経接着分子がＬ１である、請求項３３記載の方法。 ３６． 神経接着分子の産生を調節する能力について薬物及び他の作用物質をス クリーニングするための試験系であって、該試験系が、 ａ． 薬物又は作用物質が添加された請求項１８記載の細胞培養系を培養す ること、 ｂ． 工程ａの細胞培養系にＣＮＳニューロンを添加すること、及び ｃ． ニューロンの成長を測定しそれに対する薬物の効果を決定すること、 を含んでなるものである試験系。 ３７． 神経接着分子の産生を調節する能力について薬物又は他の作用物質をス クリーニングするための試験系であって、 ａ． 薬物又は作用物質が添加された請求項１８記載の細胞培養系を培養す ること、 ｂ． 工程ａの細胞培養系にＣＮＳニューロンを添加すること、及び ｃ． ニューロン成長を測定しそれに対する薬物の効果を決定すること、 を含んでなる試験系。 ３８． 請求項３６記載の試験系であって、神経接着分子がラミニン、フィブロ ネクチン、Ｎ−カドヘリン、ＢＳＰ−２（マウスＮ−ＣＡＭ）、Ｄ−２、２２４ −１Ａ６−Ａ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＮＩＬＥ、Ｎｒ−ＣＡＭ、ＴＡＧ−１（アクソ ニン−１）、Ｎｇ−ＣＡＭ及びＦ３／Ｆ１１よりなる群から選択されるものであ る、試験系。 ３９． 神経接着分子がＬ１である、請求項３６記載の試験系。 ４０． 請求項３７記載の試験系であって、神経接着分子がラミニン、フィブロ ネクチン、Ｎ−カドヘリン、ＢＳＰ−２（マウスＮ−ＣＡＭ）、Ｄ−２、２２４ −１Ａ６−Ａ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＮＩＬＥ、Ｎｒ−ＣＡＭ、ＴＡＧ−１（アクソ ニン−１）、Ｎｇ−ＣＡＭ及びＦ３／Ｆ１１よりなる群から選択されるものであ る、試験系。 ４１． 神経接着分子がＬ１である、請求項３７記載の試験系。[Claims] 1. A method of promoting nerve growth in the central nervous system of a mammal in vivo, comprising administering to the mammal an amount of the agent that promotes nerve growth, wherein the agent is present on glial cells and myelin. Nerve cell adhesion molecules, their active fragments, their cognate molecules, their congeners, their mimetics that can overcome the inhibitory cue molecules found in , Their antagonists, antibodies to them, their analogs, their secretory cells and their soluble molecules. 2. 2. The method of claim 1, wherein said agent is derived from a member of the immunoglobulin superfamily that mediates Ca2 + -dependent neuronal cell adhesion. 3. 2. The method of claim 1, wherein said agent is derived from a molecule containing a structural motif similar to a fibronectin type III homologous repeat and an immunoglobulin uniform domain. 4. 4. The method of claim 3, wherein said structural motif is structurally similar to fibronectin type III homologous repeats 1-2 and immunoglobulin-like domains I-11, III-IV, and V-VI. 5. 3. The method of claim 2, wherein said agent is selected from the group consisting of L1, N-CAM and myelin-associated glycoprotein. 6. The agent is laminin, fibronectin, N-cadherin, BSP-2 (mouse N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, L1-CAM, NILE, Nr-CAM, TAG-1 (axonin-1) 3.) The method of claim 2, wherein the method is selected from the group consisting of: Ng-CAM and F3 / F11. 7. A recombinant DNA molecule for use in a method according to any one of claims 1 to 6, comprising an agent or an active fragment thereof, a cognate molecule, a homologous substance, a mimetic or an analog. A recombinant DNA molecule comprising, together with an expression control sequence. 8. A vector comprising the recombinant DNA molecule according to claim 7. 9. A transformed host comprising the vector according to claim 8. 10. An antibody formed against the agent according to any one of claims 1 to 6. 11. The antibody according to claim 10, comprising a polyclonal antibody. 12. The antibody according to claim 10, comprising a monoclonal antibody. 13. A method for regulating nerve growth in the central nervous system of a mammal, comprising the antibody of claim 10, or an active fragment thereof, a cognate molecule, a homolog, an analog, a mimetic, a secretory cell or a soluble molecule. Administering to the mammal an amount that modulates nerve growth of the mammal. 14． A pharmaceutical composition for regulating nerve growth in the central nervous system of a mammal, the agent of claim 1, an agonist thereof, an antagonist thereto, a fragment thereof, a cognate molecule thereof, A composition comprising a therapeutically effective amount of a homolog, mimetic, analog, secretory cell or soluble molecule thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier. 15. A transgenic mammal comprising glial cells that express exogenous neural adhesion molecules. 16. 16. The transgenic mammal of claim 15, wherein the glial cells are stellate glial cells. 17． The transgenic mammal according to claim 15, wherein the nerve adhesion molecule is L1. 18. A cell culture comprising the glial cells of the transgenic mammal according to any one of claims 15 to 17. 19. A cell culture system comprising a tissue derived from the central nervous system of the transgenic mammal according to any one of claims 15 to 17. 20. A method for enhancing neuronal growth of CNS neurons, wherein the neurons are cultured in the cell culture system according to claim 18. 21. A method for enhancing neuronal growth of CNS neurons, wherein the neurons are cultured in the cell culture system according to claim 19. 22. 19. A method for enhancing memory, comprising administering to the brain of a mammal in need of memory enhancement, cells of the cell culture system of claim 18 in an amount effective for enhancing memory in a mammal. 23. 21. A method for enhancing memory, comprising administering to the brain of a mammal in need of memory enhancement, cells of the cell culture system according to claim 19 in an amount effective for enhancing memory in a mammal. 24. A method of enhancing memory, comprising delivering a vector that enables expression of a neural adhesion molecule in glial cells of a mammalian brain in need of memory enhancement. 25. The method according to claim 24, wherein the nerve adhesion molecule is L1. 26. A method for enhancing synaptic efficiency in the CNS of a mammal in need of enhancing synaptic efficiency, comprising using the cells of the cell culture system according to claim 18 in the mammalian brain to enhance synaptic efficiency in the mammalian brain. A method comprising administering an amount. 27. A method for enhancing synaptic efficiency in the CNS of a mammal in need of enhancing synaptic efficiency, comprising using the cell of the cell culture system according to claim 19 in the mammalian brain to enhance synaptic efficiency in the mammalian brain. A method comprising administering an amount. 28. A method of enhancing synaptic efficiency in the mammalian CNS in need of synaptic efficiency, comprising delivering a vector that enables expression of a neural adhesion molecule in glial cells of a mammalian brain. Including methods. 29. 27. The method of claim 26, wherein an increase in synaptic efficiency is indicated by long-term potentiation stabilization. 30. 28. The method of claim 27, wherein an increase in synaptic efficiency is indicated by long-term potentiation stabilization. 31. 29. The method of claim 28, wherein an increase in synaptic efficiency is indicated by long-term potentiation stabilization. 32. A method for testing the ability of a drug or other substance to modulate the activity of a nerve adhesion molecule, comprising: a. Adding CNS neurons to the cell culture system of claim 18, b. Adding the drug to be tested to the cell culture system; c. Measuring neuronal growth of CNS neurons; and d. Correlating the difference in the level of neuronal growth of the cell in the presence of the drug relative to a control culture to which the drug has not been added, with the ability of the drug to modulate the activity of a nerve adhesion molecule. 33. A method for testing the ability of a drug or other substance to modulate the activity of a nerve adhesion molecule, comprising: a. Adding CNS neurons to the cell culture system of claim 19, b. Adding the drug to be tested to the cell culture system; c. Measuring neuronal growth of CNS neurons; and d. Correlating the difference in the level of neuronal growth of the cell in the presence of the drug relative to a control culture to which the drug has not been added, with the ability of the drug to modulate the activity of a nerve adhesion molecule. 34. 33. The method of claim 32, wherein the nerve adhesion molecule is L1. 35. 34. The method of claim 33, wherein the nerve adhesion molecule is L1. 36. A test system for screening drugs and other agents for the ability to modulate the production of neural adhesion molecules, comprising: a. Culturing the cell culture system according to claim 18, to which a drug or an active substance has been added; b. Adding CNS neurons to the cell culture system of step a, and c. Measuring the growth of neurons and determining the effect of the drug on it. 37. A test system for screening a drug or other agent for its ability to modulate the production of a neural adhesion molecule, comprising: a. Culturing the cell culture system according to claim 18, to which a drug or an active substance has been added; b. Adding CNS neurons to the cell culture system of step a, and c. Measuring neuronal growth and determining the effect of the drug on it. 38. 37. The test system of claim 36, wherein the nerve adhesion molecule is laminin, fibronectin, N-cadherin, BSP-2 (mouse N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, L1-CAM, NILE, Nr. A test system which is selected from the group consisting of CAM, TAG-1 (axonin-1), Ng-CAM and F3 / F11. 39. 37. The test system of claim 36, wherein the nerve adhesion molecule is L1. 40. 38. The test system according to claim 37, wherein the nerve adhesion molecule is laminin, fibronectin, N-cadherin, BSP-2 (mouse N-CAM), D-2, 224-1A6-A1, L1-CAM, NILE, Nr. A test system which is selected from the group consisting of CAM, TAG-1 (axonin-1), Ng-CAM and F3 / F11. 41. The test system according to claim 37, wherein the nerve adhesion molecule is L1.
JP8531932A 1995-04-19 1996-04-19 CNS neurite growth regulators and compositions, cells and methods of embodying and using the same Pending JPH11504211A (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42499595A 1995-04-19 1995-04-19
US08/424,995 1995-04-19
US48395995A 1995-06-07 1995-06-07
US08/483,959 1995-06-07
PCT/US1996/005434 WO1996032959A1 (en) 1995-04-19 1996-04-19 Cns neurite outgrowth modulators, and compositions, cells and methods embodying and using same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH11504211A true JPH11504211A (en) 1999-04-20

Family

ID=27026535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8531932A Pending JPH11504211A (en) 1995-04-19 1996-04-19 CNS neurite growth regulators and compositions, cells and methods of embodying and using the same

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0821591A1 (en)
JP (1) JPH11504211A (en)
KR (1) KR19990007893A (en)
AU (1) AU718508B2 (en)
CA (1) CA2218599A1 (en)
CZ (1) CZ330197A3 (en)
EA (1) EA199700323A1 (en)
HU (1) HUP9900060A3 (en)
IS (1) IS4590A (en)
MX (1) MX9708127A (en)
NO (1) NO974811L (en)
PL (1) PL322947A1 (en)
SK (1) SK142497A3 (en)
TR (2) TR199701203T1 (en)
WO (1) WO1996032959A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013501919A (en) * 2009-08-07 2013-01-17 アフィニマーク テクノロジーズ，インコーポレイテッド Apparatus and method for immunological identification of cerebrospinal fluid

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2190418A1 (en) * 1996-11-15 1998-05-15 Zhi-Cheng Xiao Neuron and neural tumor growth regulatory system, antibodies thereto and uses thereof
EP0910641A1 (en) * 1997-02-13 1999-04-28 Smithkline Beecham Plc Neural cell adhesion molecule splicing variants
CA2343975A1 (en) * 1998-09-29 2000-04-06 Lars Christian Ronn Ncam binding compounds
AUPQ614200A0 (en) * 2000-03-10 2000-03-30 Department Of Human Physiology, Flinders University School Of Medicine Method for treating chronic spinal cord injury
US20020164668A1 (en) * 2000-04-03 2002-11-07 Durham L. Kathryn Nucleic acid molecules, polypeptides and uses therefor, including diagnosis and treatment of alzheimer's disease
EP1408333A3 (en) * 2001-10-03 2006-10-25 Pfizer Products Inc. Diagnosis and treatment of Alzheimer's disease
TWI323265B (en) 2002-08-06 2010-04-11 Glaxo Group Ltd Antibodies
US20040081653A1 (en) 2002-08-16 2004-04-29 Raitano Arthur B. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 251P5G2 useful in treatment and detection of cancer
GB0306309D0 (en) 2003-03-19 2003-04-23 Glaxo Group Ltd Method of treatment

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU652537B2 (en) * 1988-11-04 1994-09-01 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
AU2152092A (en) * 1991-06-24 1993-01-25 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Neurite growth regulatory factors
CA2173731A1 (en) * 1993-11-08 1995-05-18 Martin Grumet Neuron-glia cell adhesion molecule, ng-cam, in treatment of nerve damage

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013501919A (en) * 2009-08-07 2013-01-17 アフィニマーク テクノロジーズ，インコーポレイテッド Apparatus and method for immunological identification of cerebrospinal fluid

Also Published As

Publication number Publication date
CZ330197A3 (en) 1998-04-15
AU5557296A (en) 1996-11-07
TR199701203T1 (en) 1998-03-21
AU718508B2 (en) 2000-04-13
EA199700323A1 (en) 1998-04-30
KR19990007893A (en) 1999-01-25
HUP9900060A3 (en) 2001-08-28
SK142497A3 (en) 1999-08-06
EP0821591A1 (en) 1998-02-04
PL322947A1 (en) 1998-03-02
HUP9900060A2 (en) 1999-04-28
CA2218599A1 (en) 1996-10-24
NO974811L (en) 1997-12-19
MX9708127A (en) 1998-06-28
WO1996032959A1 (en) 1996-10-24
IS4590A (en) 1997-10-15
NO974811D0 (en) 1997-10-17
TR199801650T2 (en) 1999-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Honda et al. The coxsackievirus-adenovirus receptor protein as a cell adhesion molecule in the developing mouse brain
EP0619841B1 (en) T-cadherin adhesion molecule
Holz et al. Molecular and developmental characterization of novel cDNAs of the myelin-associated/oligodendrocytic basic protein
US5792743A (en) Method for promoting neural growth comprising administering a soluble neural cell adhesion molecule
JPH09509314A (en) Nucleic acid encoding neuropeptide Y / peptide YY (Y2) receptor, and use of the nucleic acid
JP2010207239A (en) Nogo RECEPTOR ANTAGONIST
JP5492567B2 (en) Use of semaphorin 6A to promote myelination and oligodendrocyte differentiation
JPH09511127A (en) DNA encoding human neuropeptide Y / peptide YY / pancreatic polypeptide receptor (Y4), and use of the DNA
JP2007501612A (en) Nogo receptor antagonist
US6576607B1 (en) Methods using CNS neurite outgrowth modulators
JPH11504211A (en) CNS neurite growth regulators and compositions, cells and methods of embodying and using the same
US5753502A (en) Neuron-specific ICAM-4 promoter
KR20050042826A (en) Gpr54 knock-out mammals and screening methods using them
JP3787473B2 (en) Semaphorin receptor
JP2006525784A (en) Transmembrane protein AMIGO and uses thereof
US6559288B1 (en) Ninjurin
JP2001501476A (en) Vertebrate Smoothened protein
EP1337558B1 (en) A &#34;bach&#34; g protein coupled receptor polypeptide and polynucleotide encoding this receptor
JPH10505508A (en) ICAM-4 Materials and Methods
CN1187774A (en) CNS neurite out growth modulators, and compositions, cells and methods embodying and using same
KR20060036466A (en) Receptor
US20100272647A1 (en) Receptor
RU2208230C2 (en) Icam-4 and method for applying it in diagnosing diseases
US20100158807A1 (en) Receptor
JP2003199587A (en) New nkt cell