SK131197A3 - Conditional expression system - Google Patents

Conditional expression system Download PDF

Info

Publication number
SK131197A3
SK131197A3 SK1311-97A SK131197A SK131197A3 SK 131197 A3 SK131197 A3 SK 131197A3 SK 131197 A SK131197 A SK 131197A SK 131197 A3 SK131197 A3 SK 131197A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
molecule
region
sequence
transactivator
protein
Prior art date
Application number
SK1311-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Laurent Bracco
Fabien Schweighoffer
Bruno Tocque
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer Sa filed Critical Rhone Poulenc Rorer Sa
Publication of SK131197A3 publication Critical patent/SK131197A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka nového systému na podmienenú expresiu génov. Vynález sa taktiež týka použitia tohto systému v génovej alebo bunkovej terapii na dosiahnutie veľmi selektívnej expresie zainteresovaného génu.
Doterajší stav techniky
Génová a bunková terapia spočíva v korekcii nedostatočnosti alebo anomálie (mutácia, aberantná expresia a podobne) alebo v zaistení expresie terapeutického zainteresovaného proteínu zavedením genetickej informácie do liečeného orgánu alebo do liečenej bunky. Táto genetická informácia môže byť zavedená buď ex vivo do bunky izolovanej z orgánu, pričom táto bunka, ktorá bola takto modifikovaná, sa potom zavedie späť do organizmu (bunková terapia), alebo priamo in vivo do príslušného tkaniva (génová terapia).
Pre uskutočnenie prenosu génov existujú rôzne techniky, z ktorých možno predovšetkým uviesť rôzne techniky transfekcie, pri ktorých nachádzajú uplatnenie prírodné alebo syntetické, chemické alebo biochemické vektory, akými sú napríklad komplexy DNA a DEAE-dextránu (Pagano a kol., J.Virol. 1 (1967)891), DNA a jadrových proteínov (Kaneda a kol., Science 243(1989)375), DNA a lipidov (Felgner a kol., PNAS 84 (1987)7413), použitie lipozómov (Fraley a kol., J.Biol.Chem.255(1980)10431), ako i katiónových lipidov a podobne. Iná transfekčná technika spočíva v použití vírusov, ako i vektorov na prenos génov. V tomto ohľade boli testované rôzne vírusy za účelom stanovenia ich schopnosti infikovať určité bunkové populácie. Predovšetkým ide o retrovírusy (RSV, HMS, MMS a podobne), vírus HSV, adeno-pridružené vírusy a adenovírusy.
Jednou z hlavných ťažkostí, ktoré sa vyskytujú pri rozvoji génovej a bunkovej terapie, je však selektivita liečenia. V závislosti od danej aplikácie a od prenášaného génu je veľmi dôležité mať možnosť zacieliť niektoré tkanivá alebo len niektoré časti organizmu, a to s cieľom nasmerovania terapeutického účinku len na tieto tkanivá alebo časti organizmu a obmedzenie rozptylu tohto účinku a sekundárnych nežiadúcich účinkov.
Takéto zacielenie terapeutického účinku môže byť uskutočnené za použitia vektorov, ktoré vykazujú potrebnú danú bunkovú špecifickosť, t. j. vektorov, ktoré sú selektívne špecifické len pre zainteresované bunky.
Iný prístup k riešeniu uvedeného problému spočíva v použití špecifických expresných signálov niektorých bunkových typov. V tomto ohľade boli špecifické promótory, akými kódujúcich pyruvát-kinázu, v literatúre popísané takzvané sú napríklad promótory génov vi11in, GFAP, promótor intestinálnej väzby mastných kyselín, promótor aktínu alfa buniek hladkého svalu alebo promótor génov apo-AI, apo-AII, ľudský albumín a podobne. Tieto promótory však majú niektoré nedostatky, a predovšetkým vykazujú určitý transkripčný šum, ktorý môže byť nepríjemný pri expresii toxických génov. Použitie týchto promótorov je teda obmedzené len na niektoré bunky a nemôžu byť teda použité na akúkoľvek aplikáciu.
Podstata vynálezu
Vynález teraz popisuje nový systém podmienenej expresie génov, ktorý je obzvlášť selektívny a účinný. Výhodným znakom tohto systému podľa vynálezu je jeho schopnosť exprimovať gén nie v závislosti od bunkového typu, ale v závislosti od prítomnosti špecifického bunkového prvku alebo špecifickej fyziologickej situácie. Tento systém sa v skutočnosti týka chimerických bišpecifických molekúl obsahujúcich oblasť, ktorá je schopná selektívne viazať definovanú sekvenciu DNA a detekčnú oblasť, ktorá je schopná špecificky viazať transaktivátor alebo transaktivačný komplex.
Prvý znak vynálezu spočíva vo vytvorení a expresii chimerických bišpecifických molekúl obsahujúcich oblasť, ktorá je schopná selektívne viazať definovanú sekvenciu DNA a oblasť, ktorá je schopná špecificky viazať transaktivátor alebo transrepresor alebo transaktivačný alebo transrepresorový komplex.
Ďalší znak vynálezu spočíva v sekvencii nukleovej kyseliny kódujúcej vyššie definovanú chimerickú molekulu, ako je to v každom expresnom vektore, ktorý obsahuje uvedenú nukleovú sekvenciu.
Ďalší znak vynálezu spočíva v systéme podmienenej expresie génov zahrňujúcich i) vyššie definovanú chimerickú molekulu a ii) expresnú kazetu obsahujúcu regulačnú sekvenciu, minimálny promótor (ktorého aktivita závisí od prítomnosti transaktivátora) a uvedený gén.
Ďalší znak vynálezu spočíva taktiež v expresnom vektore zahrňujúcom
- nukleovú sekvenciu kódujúcu vyššie definovanú chimerickú molekulu a
- uvedenú expresnú kazetu.
Systém podmienenej expresie podľa vynálezu je obzvlášť vhodný na použitie v génovej alebo bunkovej terapii pre dosiahnutie veľmi selektívnej expresie zainteresovaných génov.
Jedna zo zložiek systému podľa vynálezu je teda tvorená chimerickými bišpecifickými molekulami obsahujúcimi oblasť, ktorá je schopná selektívne viazať definovanú sekvenciu DNA a oblasť, ktorá je schopná selektívne viazať transaktivátor alebo transaktivačný komplex. Bišpecifickosť molekúl podľa vynálezu spočíva jednak v ich schopnosti viazať definovanú sekvenciu DNA (ktorá je obvykle označovaná ako regulačná alebo operačná sekvencia), a jednak v ich schopnosti špecificky tvoriť transaktivačnú alebo transrepresívnu proteínovú oblasť, ktorá umožňuje indukovať alebo potlačiť expresiu génov.
Vynález spočíva vo vytvorení chimériokých bišpecifických molekúl umožňujúcich získanie každého transkripčného faktora, ktorého aktivácia alebo inaktivácia vedie k fyziopatologickej situácii. Chimerické bišpecifické molekuly podľa vynálezu takto umožňujú selektívne získanie špecifických transkripčných transaktivátorov fyziopatologického stavu, fixovanie týchto transkripčných faktorov k promótorom prostredníctvom väzby týchto molekúl k definovaným sekvenciám DNA lokalizovaných v blízkosti týchto promótorov (regulačná alebo operačná sekvencia) a takto aj dosiahnutie podmienenej expresie génov (obr. 1) .
Vynález sa taktiež týka chimerických bišpecifických molekúl umožňujúcich vytvorenie nielen molekuly nesúcej transkripčnú oblasť, ale aj transkripčného transaktivačného komplexu, t. j. komplexu vytvoreného medzi cieľovou molekulou prítomnou v bunke a molekulou nesúcou transaktivačnú oblasť (obr. 2). V tomto prípade je transaktivačný komplex výhodne vytvorený pomocou druhej chimerickej bišpecifickej molekuly obsahujúcej transaktivačnú oblasť a oblasť selektívnej väzby k uvedenej bunkovej molekule. Fixovanie tejto druhej molekuly umožňuje vytvorenie transkripčného transaktivačného binárneho komplexu, pričom tento komplex je takto tvorený detekčným systémom podľa vynálezu. Fixovanie tohto ternárneho komplexu v blízkosti promótorov takto umožňuje regulovanú expresiu génov. Tento typ konštrukcie umožňuje výhodne rozšíriť oblasť použitia systému podľa vynálezu na detekciu ľubovoľnej intracelulárnej molekuly zbavenej transaktivačnej oblasti, a to nech ide už o endogénnu molekulu alebo napríklad o molekulu infekčného pôvodu.
Systém podľa vynálezu takto vďaka veľmi selektívnemu detekčnému systému (senzor) umožňuje aktivovať výlučne expresiu zainteresovaných génov v prítomnosti cieľových proteínov. Môže ísť o transkripčné faktory vyskytujúce sa v rámci fyziologických alebo fyziopatologických situácií alebo o ľubovoľnú endogénnu molekulu alebo napríklad o molekulu infekčného pôvodu.
V rámci vynálezu výraz transaktivátor označuje každý transaktivačný faktor transkripcie alebo každý proteín zahrňujúci transkripčnú transaktivačnú oblasť. Výraz transaktivačný komplex označuje komplex vytvorený medzi molekulou prítomnou v bunke a bispecifickou molekulou podľa vynálezu obsahujúcou transaktivačnú oblasť a oblasť špecifickej väzby k uvedenej molekule.
Expresný systém podľa vynálezu môže byť použitý na získanie ľubovoľného transaktivačného proteínu alebo proteínu nesúceho transaktivačnú oblasť, a predovšetkým ľubovoľného proteínu vírusového, parazitného alebo mykobakteriálneho pôvodu, ako i bunkového pôvodu, majúceho transkripčnú transaktivačnú účinnosť.
Z transkripčných faktorov vírusového pôvodu možno uviesť predovšetkým proteín Tat vírusu HIV, proteíny E6/E7 vírusu papilomu alebo tiež proteín EBNA vírusu Epsteina a Barrovej. Tieto proteíny majú transkripčnú transaktivačnú oblasť a sú prítomné výlučne v bunkách infikovaných týmito vírusmi, t. j. za špecifických fyziopatologických podmienok. Systém podmienenej expresie podľa vynálezu výhodne umožňuje detekciu takej fyziologickej situácie (výskyt uvedených špecifických transaktivátorov vírusovej infekcie) a indukciu selektívnej expresie daného génu alebo daných génov.
Z bunkových proteínov možno výhodne uviesť mutovaný alebo divoký proteín p53. Tento proteín p53 je tvorený 393 aminokyselinami. Vo svojej divokej forme je tento proteín supresorom nádorov schopným negatívne regulovať rast a delenie buniek. Táto účinnosť je spojená s prítomnosťou transkripčnej transaktivačnej oblasti v štruktúre proteínu p53, lokalizovanej v N-terminálnej oblasti proteínu (asi zvyšky 1 až 100). V niektorých situáciách je divoký proteín p53 rovnako schopný indukovať apoptózu (Yonish-Rouach a kol., Náture, 352, 345-347, 1991). Tieto vlastnosti sa prejavujú v stresových situáciách, kedy je ohrozená integrita bunkovej DNA a proteín p53 je takto pokladaný za strážcu genómu. Prítomnosť mutovaných proteínov p53 v asi 40 % ľudských nádoroch všetkých typov posilňuje túto hypotézu a podčiarkuje pravdepodobne kľúčovú úlohu, ktorú zohráva mutácia tohto génu pri rozvoji nádorov (o tom viď: Montenarh, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992, Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992, Zambetti a Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993). V rámci vynálezu je možné selektívne regrutovať transaktivačnú oblasť proteínu p53 a takto indukovať regulovanú expresiu génu alebo génov výlučne v bunkách obsahujúcich tento proteín. Podľa vynálezu je obzvlášť zaujímavé špecificky regrutovať mutované formy proteínu p53, ktoré sa, ako už bolo vyššie uvedené, vyskytujú vo fyziopatologických situáciách bunkovej proliferácie (rakovinového typu). Takéto zacielenie môže byt výhodne uskutočnené pomocou oblasti špecifickej väzby k mutovaným formám proteínu p53. Avšak existuje tu špecifickosť spojená s akumuláciou mutovaných foriem, ktoré majú polčas života výrazne dlhší oproti divokej forme.
Systém podľa vynálezu môže byť taktiež použitý na indukovanie selektívnej expresie génu alebo génov detekciou každej cieľovej molekuly prítomnej v bunke. Detekovaným proteínom je výhodne proteín vyskytujúci sa v bunke pri abnormálnych situáciách (infekcia, hyperproliferácia a podobne). Môže predovšetkým ísť o vírusové proteíny, akými sú napríklad štruktúrové alebo funkčné proteíny vírusu, predovšetkým vírusu HIV, hepatitídy, herpes a podobne. Môže ísť taktiež o špecifické proteíny bunkového hyperproliferačného stavu, akými sú predovšetkým proteíny myc, fos, jun, cykliny a podobne.
Jedna z vlastností chimerických molekúl podľa vynálezu spočíva teda v ich schopnosti viazať sa na špecifické oblasti DNA (regulačné alebo operačné oblasti). Táto väzba umožňuje priviesť transaktivačnú oblasť do blízkosti promótora a týmto spôsobom aktivovať expresiu génu vloženého pod kontrolu uvedeného promótora.
Oblasť schopná selektívne viazať definovanú sekvenciu DNA prítomná v molekulách podľa vynálezu je v podstate proteínového pôvodu. Výhodnejšie je táto oblasť odvodená od prokaryotického alebo eukaryotického proteínu schopného interakcie so sekvenciami DNA. Početné genetické a štrukturálne štúdie dnes už umožňujú presne definovať v proteínoch vstupujúcich do interakcie so sekvenciami dvojvláknovej DNA oblasti, ktoré sú zodpovedné za tieto interakcie.
Z prokaryotických proteínov vstupujúcich do interakcie so sekvenciami dvojvláknovej DNA možno uviesť predovšetkým bakteriálne represory a výhodnejšie tetracyklínový represor odvodený z E.coli a represor Cro odvodený od bakteriofága Lambda.
Uvedený tetracyklínový represor (tetR) od E.coli je proteínom s asi 210 aminokyselinami. V E.coli tento tetracyklínový supresor tetR negatívne reguluje transkripciu génov mediujúcich rezistenciu k tomuto antibiotiku v operóne tet. Za neprítomnosti tetracyklínu sa represor tetR fixuje k DNA na úrovni špecifickej sekvencie (ktorá je označovaná ako operačná sekvencia alebo Tetop) a potláča transkripciu rezistentného génu. Naopak, v prítomnosti tetracyklínu sa represor tetR už nefixuje k operátoru tetop umožňujúc tak konštitučnú transkripciu uvedeného génu (Hillen. W a Wissman A. (1989) v Protein-Nucleic Acid Interaction. Topics in Molecular and Structural Biology, ed., Saenger W. a Heinemann U. (Macmillan, Londýn), sv.10, str. 143-162). Sekvencia tetracyklínového supresora tetR už bola publikovaná (je uvedená predovšetkým v patentovom dokumente WO94/04682). Sekvencia dvojvláknovej DNA, ktorá je špecifická pre väzbu tetracyklínového supresora tetR k DNA (Tetop) je tvorená nasledujúcim motívom:
TCTCTATCACTGATAGGGA (SEQ ID n° 1).
Tento motív sa môže opakovať niekoľkokrát s cieľom zvýšenia afinity a účinnosti systému. Regulačná sekvencia môže takto obsahovať 10 uvedených motívov, pričom výhodne obsahuje dva motívy (Tetop2) alebo sedem motívov (Tetop7) (viď obr. 3).
Proteín Cro bol definovaný pôvodne ako regulátor expresie represora CI (Eisen H. a kol. (1970)PNAS 66, str. 855). Klonovanie génu cro umožnilo identifikáciu proteínu so 66 aminokyselinami (SEQ ID n° 21, Roberts T. a kol. (1977), Náture 270, str. 274). Cro vykonáva svoju fyziologickú úlohu tým, že sa prednostne fixuje na operátor 0R3 odvodeného od bakteriofága Lambda.
Sekvencia dvojvláknovej DNA špecifická pre väzbu Cro k DNA (oblasť označovaná ako 0R3) je tvorená nasledujúcimi bázami:
TATCACCGCAAGGGATA (SEQ ID n° 2).
Táto oblasť môže byť opakovaná niekoľkokrát s cieľom dosiahnutia zvýšenej afinity a účinnosti systému (viď obr. 4).
Z eukaryotických proteínov vstupujúcich do interakcie so sekvenciami dvojvláknovej DNA sa na konštrukciu molekúl podľa vynálezu výhodne používajú proteíny alebo oblasti odvodené od proteínov STAT, p53 alebo NFkB (Inoue a kol., PNAS 89(1992) 4333). Pokiaľ ide o proteín p53, je jeho väzbová oblasť k DNA lokalizovaná v centrálnej oblasti proteínu, presnejšie v oblasti medzi aminokyselinami 102 až 292 (Pavletich a kol., Genes and Dev. 7 (1993)2556).
Ako už bolo vyššie uvedené, oblasť je schopná selektívne viazať definovanú sekvenciu DNA prítomnú v molekulách podľa vynálezu výhodne odvodenú od prokaryotického alebo eukaryotického proteínu schopného vstúpiť do interakcie s oblasťou dvojvláknovej DNA. Oblasť použitá na konštrukciu molekúl podľa vynálezu môže byť tvorená celým proteínom alebo jeho častou obsahujúcou oblasť interakcie s DNA. Táto oblasť bola identifikovaná v prípade rôznych proteínov, a predovšetkým v prípade TetR (viď napríklad Berens a kol., J.Biol.Chem267 (1992) 1945). Táto oblasť môže byť rovnako tvorená derivátom tohto proteínu alebo jeho fragmentom, ktorý si zachoval schopnosť väzby k DNA. Takými derivátmi sú predovšetkým proteíny s modifikáciou jednej alebo niekoľkých aminokyselín, napríklad s cieľom umožnenia ich fúzie s ostatnými oblasťami molekúl podľa vynálezu, ktoré môžu byť pripravené klasickými technikami molekulárnej biológie. Tak napríklad takéto deriváty proteínov TetR a Cro boli už popísané v literatúre, pričom tieto deriváty majú presné lokálne mutácie alebo/a delécie (Hecht a kol., J. Bact.175(1993) , str. 1206, Atlschmied a kol., EMBO J 7 (1988) 4011, Baumister a kol., Proteins 14 (1992)168, Hansen a kol., J.Biol.Chem.262 (1987) 14030). Schopnosť týchto derivátov viazať sa k definovanej sekvencií DNA môže byť potom testovaná inkubáciou pripraveného derivátu s regulačnou sekvenciou a detekciou vytvorených komplexov. Okrem toho uvedenými derivátmi môžu byť taktiež proteíny majúce zlepšenú schopnosť väzby k DNA (špecifickosť, afinita a podobne).
Podľa výhodnej formy uskutočnenia je oblasť schopná selektívne viazať definovanú sekvenciu DNA prítomnú v molekulách podľa vynálezu odvodenú od prokaryotického proteínu. Tento typ konštrukcie je obzvlášť výhodný vzhľadom na to, že tieto proteíny neľudského pôvodu rozpoznávajú dvojvláknové DNA s aspoň 14 nukleotidmi. Pravdepodobnosť nájdenia rovnakej sekvencie v ľudskom genóme je takmer nulová a získaný expresný systém je takto ešte selektívnejší.
V rámci inej výhodnej formy uskutočnenia je oblasť schopná selektívne viazať definovanú sekvenciu DNA, prítomnú v molekulách, podľa vynálezu odvodenú od proteínov TetR alebo Cro. Je obzvlášť výhodné použiť proteíny TetR alebo Cro (SEQ ID n° 21) v kompletnom stave.
Oblasť schopná špecificky viazať transkripčný transaktivátor alebo transkripčný transaktivačný komplex, prítomná v molekulách, podľa vynálezu môže byť oblasťou rôzneho typu. Predovšetkým môže ísť o oligomerizačnú oblasť v prípade, kedy transaktivátor alebo transaktivačný komplex, ktorý má byť zacielený, takú oblasť taktiež obsahuje. Môže ísť taktiež o každú syntetickú alebo prírodnú oblasť, o ktorej je známe, že vstupuje do interakcie s uvedeným transaktivátorom alebo transaktivačným komplexom. Môže tiež ísť o protilátku alebo o fragment, alebo derivát protilátky nasmerovaný proti uvedenému transaktivátoru, alebo transaktivačnému komplexu.
Z oligomeračných oblastí použiteľných v rámci vynálezu možno predovšetkým menovať leucínové zipsy, napríklad oblasti SH2 alebo oblasti SH3. Leucínové zipsy sú alfa-amfipatickými helixami, ktoré obsahujú 4 alebo 5 leucínov každých 7 aminokyselín. Táto periodicita umožňuje lokalizáciu leucínov takmer v rovnakej polohe na alfa helixe. Dimerácia je podmienená hydrofóbnymi interakciami medzi bočnými reťazcami leucínov dvoch priľahlých zipsových oblastí (Vogt a kol., Trend In Bioch.Science 14 (1989). O oblastiach SH2 je známe, že vstupujú do interakcie s fosforylovanými špecifickými peptidovými oblasťami v tyrozíne. Oblasti SH3 môžu byť použité na vytvorenie oligoméru s každým transaktivátorom alebo transaktivačným komplexom, ktorý obsahuje odpovedajúci peptid bohatý na prolín (Pawson a kol., Current Biology 3) (1993) 434). Taktiež môžu byť použité oblasti proteínov, o ktorých je známe, že indukujú oligomeráciu, akými sú predovšetkým C-terminálna oblasť proteínu p53. Použitie tejto oblasti umožňuje regrutovať selektívnym spôsobom proteíny p53 prítomné v bunke. V rámci vynálezu sa výhodne používa oblasť p53 obsiahnutá medzi aminokyselinami 320-393 (SEQ ID n° 3) 302-360 alebo 302-390.
Zo syntetických alebo prírodných oblastí, o ktorých je známe, že vstupujú do interakcie s molekulou obsahujúcou cieľový transaktivačný prvok, možno napríklad uviesť oblasť proteínu MDM2 vstupujúcou do interakcie s proteínom p53. Tento typ konštrukcie takto umožňuje regrutovať ako transaktivátor divoký alebo mutovaný proteín p53.
Výhodnou oblasťou špecifickej väzby k transkripčnému transaktivátoru podľa vynálezu je protilátka alebo fragment alebo derivát protilátky. Fragmenty alebo deriváty protilátky sú napríklad fragmenty Fab alebo F(ab)'2, oblasti VH alebo VL protilátky s jednoduchým reťazcom (ScFv) obsahujúcim oblasť VH spojenú s oblasťou VL ramenom. Tento typ oblasti je obzvlášť výhodný vzhľadom na to, že môže byť nasmerovaný proti celej molekule.
Protilátky tvorené molekulami skupiny imunoglobulínov sú tvorené rôznymi reťazcami (2 ťažké (H) a 2 ľahké (L)), pričom tieto reťazce sú tvorené rôznymi oblasťami (variabilná oblasť (V), pripojovacia oblasť (J) a podobne). Oblasť väzby k transaktivátoru alebo k transaktivačnému komplexu prítomná v molekulách podľa vynálezu je výhodne tvorená fragmentom alebo derivátom protilátky obsahujúcim aspoň väzbové miesto zodpovedné za väzbu k antigénu. Tento fragment môže byť buď variabilnou oblasťou ľahkého reťazca (V ) alebo ťažkého reťazca (V ) , prípadne vo forme fragmentu fab alebo F(ab')2 alebo výhodne vo forme protilátky s jednoduchým reťazcom (jednoreťazcová protilátka) (ScFv). Jednoreťazcové protilátky použité na konštrukciu molekúl podľa vynálezu sú tvorené peptidom zodpovedajúcim väzbovému miestu variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátky a pripojeným peptidovým ramenom k peptidu zodpovedajúcemu väzbovému miestu variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky. Konštrukcia sekvencii nukleových kyselín kódujúcich také modifikované protilátky podľa vynálezu bola napríklad popísaná v patentovom dokumente US 4,946,778 alebo v patentových prihláškach W094/02610 a WO94/29446. Táto konštrukcia je ilustrovaná v ďalej zaradených príkladoch.
Výhodná konštrukcia podľa vynálezu zahrňuje oblasť väzby k proteínu p53. Výhodne ide o derivát protilátky nasmerovaný proti proteínu p53. Výhodnou formou tejto oblasti je jednoreťazcová protilátka nasmerovaná proti p53. Ako ilustračný príklad je možné uviesť použitie ScFv so sekvenciou SEQ ID n° 4, ktorého konštrukcia je.popísaná v príkladoch uskutočnenia.
Oblasť väzby k DNA a oblasť väzby k transaktivátoru sú vzájomne spojené prostredníctvom ramena. Toto rameno je všeobecne tvorené peptidom zaisťujúcim celému komplexu dostatočnú flexibilitu, nevyhnutnú k tomu, aby obe uvedené oblasti molekúl podľa vynálezu mohli byt funkčné autonómnym spôsobom. Tento peptid je všeobecne tvorený nezaťaženými aminokyselinami, ktoré neinterferujú s aktivitou molekúl podľa vynálezu a ktorými sú napríklad glycín, serín, tryptofán, lyzín alebo prolín. Toto rameno obsahuje všeobecne 5 až 30 aminokyselín, výhodne 5 až 20 aminokyselín. Príklady peptidových ramien použiteľných na konštrukciu molekúl podľa vynálezu sú napríklad:
-GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID n° 5),
-PKPSTPPGSS (SEQ ID n° 6), ktorého kódujúca sekvencia je CCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCA (SEQ ID n° 6) ,
Výhodnými príkladmi molekúl podľa vynálezu sú predovšetkým nasledujúce molekuly:
a) ScFv-tag-Hinge-TET alebo Cro (obr. 5A) .
Tento typ molekuly zahrňuje:
- oblast väzby k transaktivátoru tvorenú jednoreťazcovou protilátkou,
- peptidovú sekvenciu tag rozpoznávanú monoklonálnou protilátkou umožňujúcou imunologickú detekciu molekuly. Touto sekvenciou môže byť napríklad epitóp VSV sekvencie MNRLGK (SEQ ID n°
7) , ktorej kódujúcou sekvenciou je ATGAACCGGCTGGGCAAG (SEQ ID n° 7), alebo epitóp myc so sekvenciou EQKLISEEDLN (SEQ ID n°
8) , ktorého kódujúcou sekvenciou je
GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT (SEQ ID n° 8) a ktorý je rozpoznateľný protilátkou 9E10.
- peptidové rameno so sekvenciou SEQ ID n° 6 (Hinge) a
- oblasť väzby k DNA tvorenú proteínom TET alebo Cro.
ScFv je výhodne nasmerovaný proti proteínu p53.
b) ŠcFv-Hinge-TET1 alebo Cro (obr. 5B)
Tento typ molekuly obsahuje rovnaké prvky ako molekula a) s výnimkou spočívajúcou v tom, že je tu neprítomná sekvencia tag.
c) ScFv-TET alebo Cro (obr. 5V).
Tento zjednodušený typ molekuly obsahuje len oblasť väzby k transaktivátoru tvorenú jednoreťazcovou protilátkou a oblasť väzby k DNA tvorenú proteínom TET alebo Cro. Táto molekula neobsahuje ani rameno ani sekvenciu tag. V tejto konštrukcii je oblasť väzby k transaktivátoru lokalizovaná v N-terminálnej časti molekuly a oblasť väzby k DNA sa nachádza v C-terminálnej časti molekuly.
d) TET alebo Cro-ScFv (obr. 5D)
Tento typ molekuly je podobný vyššie uvedenému typu c). Jediný rozdiel spočíva v podstate v usporiadaní oblastí: oblasť väzby k transaktivátoru je teraz lokalizovaná v C-terminálnej časti molekuly a oblasť väzby k DNA sa nachádza v N-terminálnej oblasti molekuly.
e) TET alebo Cro-Hinge-ScFv (obr. 5E)
Tento typ molekuly obsahuje rovnaké prvky ako vyššie uvedený typ b) molekuly. Rozdiel spočíva v podstate v usporiadaní oblastí: oblasť väzby k transaktivátoru je teraz lokalizovaná v C-terminálnej časti molekuly, zatiaľ čo oblasť väzby k DNA sa v tomto prípade nachádza v N-terminálnej časti molekuly.
f) 01igom-tag-Hinge-TET alebo Cro (obr. 5A)
Tento typ molekuly je podobný vyššie uvedenému typu a) s výnimkou spočívajúcou v tom, že oblasť väzby k transaktivátoru je nahradená oblasťou oligomerácie s proteínom p53 so sekvenciou SEQ ID n° 3. Táto molekula umožňuje regrutovať mutované proteíny p53 vyskytujúce sa v nádorových bunkách.
g) Oligom-Hinge-TET alebo Cro (obr. 5B)
Tento typ molekuly je podobný vyššie uvedenému typu b) s výnimkou spočívajúcou v tom, že oblasť väzby k transaktivátoru je v tomto prípade nahradená oblasťou oligomerácie s proteínom p53 so sekvenciou SEQ ID n° 3.
h)01igom-TET alebo Cro (obr. 5C)
Tento typ molekuly je podobný vyššie uvedenému typu c) s výnimkou spočívajúcou v tom, že oblasť väzby k transaktivátoru je v tomto prípade nahradená oblasťou oligomerácie s proteínom p53 so sekvenciou SEQ ID n° 3.
i) TET alebo Cro-Oligom (obr. 5D)
Tento typ molekuly je podobný vyššie uvedenému typu d) s výnimkou spočívajúcou v tom, že oblasť väzby k transaktivátoru je tu nahradená oblasťou oligomerácie s proteínom p53 so sekvenciou SEQ ID n° 3.
j) TET alebo Cro-Hinge-Oligom (obr. 5E)
Tento typ molekuly je podobný vyššie uvedenému typu e) s výnimkou spočívajúcou v tom, že oblasť väzby k transaktivátoru je tu nahradená oblasťou oligomeráciou s proteínom p53 so sekvenciou SEQ ID n° 3.
Inak môže byť v každej z týchto molekúl peptidové rameno ľahko nahradené sekvenciou (G4S)3 (SEQ ID n° 5).
Ďalším predmetom vynálezu je sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca vyššie definovanú chimerickú molekulu. Výhodne ide o sekvenciu DNA, predovšetkým cDNA. Môže taktiež ísť o RNA. Tieto sekvencie podľa vynálezu sa všeobecne konštruujú zostavením sekvencií v klonovacom vektore kódujúcich rôzne oblasti technikami molekulárnej biológie. Uvedené sekvencie nukleových kyselín podľa vynálezu môžu byť prípadne modifikované chemickou, enzymatickou alebo genetickou cestou za účelom generovania stabilizovaných oblastí alebo/a multifunkčných oblastí alebo/a oblastí s redukovanou dĺžkou alebo/a s cieľom priaznivého ovplyvnenia ich lokalizácie v tom či onom intracelulárnom úseku. Sekvencie nukleových kyselín podľa vynálezu môžu takto obsahovať sekvencie kódujúce peptidy jadrovej lokalizácie (NLS). Predovšetkým je možné uskutočniť fúziu sekvencií podľa vynálezu so sekvenciou kódujúcou NLS vírusu SV40, ktorý má nasledujúcu peptidovú sekvenciu:
PKKKRKV (SEQ ID n° 9) (Kalderon a kol., Celí 39(1984)499).
Nukleové sekvencie podľa vynálezu tvoria výhodne časť expresného vektora, ktorý môže mať plazmidový alebo vírusový charakter.
Ďalším predmetom vynálezu je fúzny proteín obsahujúci transkripčnú transaktivátorovú oblasť a oblasť špecifickej väzby k danej molekule, ktorej oblasti sú prípadne spojené s peptidovým ramenom, ako i ľubovoľnou sekvenciou nukleovej kyseliny kódujúcou takúto fúziu. Transaktivačná oblasť môže pochádzať z ľubovoľného transkripčného transaktivačného proteínu, akým je napríklad p53, VP16, EBNA, E6/E7, Tat a podobne.
Ďalším predmetom vynálezu je systém podmienenej expresie génov zahrňujúci:
- vyššie definovanú chimerickú molekulu a
- expresnú kazetu obsahujúcu regulačnú sekvenciu, minimálny transkripčný promótor a uvedený gén.
Uvedená expresná kazeta obsahuje prvky nevyhnutné pre aktiváciu expresie génu transaktivátorom alebo transaktivačným komplexom regrutovaným bišpecifickou molekulou. Regulačná sekvencia je takto väzbovou sekvenciou zodpovednou za väzbu k DNA exprimovanej chimerickej molekuly. V prípade, že oblasť väzby k DNA chimerickej molekuly je reprezentovaná celkom alebo časťou tetracyklínového supresora TetR, potom regulačná sekvencia obsahuje sekvenciu SEQ ID n° 1 alebo jej derivát, opakovanú prípadne niekoľkokrát. Výhodne ide o sekvenciu op2 (obsahujúca 7 motívov Tetop, ktoré sa opakujú tak, ako je to popísané napríklad Weinmannom a kol., v The Plánt Journal 5(1994)559). Rovnako tak, keď je oblasť väzby k DNA chimerickej molekuly reprezentovaná celkom alebo časťou Cro, obsahuje regulačná sekvencia sekvenciu SEQ ID n° 2 alebo jej derivát, ktoré sú prípadne niekoľkokrát opakované. Výhodne ide o sekvenciu 0R3. Deriváty sekvencií SEQ ID n° 1 a n° 2 môžu byť tvorené každou sekvenciou získanou modifikáciou genetického charakteru (mutácia, delécia, adícia, repetícia a podobne), ktorá zachováva schopnosť derivátu špecificky viazať proteín. Takéto deriváty boli popísané v literatúre (Baumeister a kol. (už vyššie citovaný), Tovar a kol., Mol.Gen.Genet.215(1988)76, WO94/04672).
Pokiaľ ide o minimálny transkripčný promótor, ide o promótor, ktorého aktivita závisí od prítomnosti transaktivátora. Vzhľadom na to je promótor v neprítomnosti chimerickej molekuly neaktívny a nedochádza k expresii génu alebo dochádza len k veľmi obmedzenej expresii tohto génu. Naopak, v prítomnosti chimerickej molekuly umožňuje regrutovaný transaktivátor alebo transaktivačný komplex indukovať aktivitu minimálneho promótora a taktiež i expresiu zainteresovaného génu.
Uvedený minimálny promótor je všeobecne tvorený boxom TATA alebo INR. Tieto prvky sú v skutočnosti minimálne potrebnými prvkami na expresiu génu v prítomnosti transaktivátora. Tento minimálny promótor môže byť pripravený z každého promótora genetickou modifikáciou. Ako príklad výhodného promótorového kandidáta možno uviesť promótor génu tymidín-kinázy. Zaujímavé výsledky boli dosiahnuté s minimálnym promótorom odvodeným od promótora TK tvoreného nukleotidmi -37 až +19. Uvedený minimálny promótor môže byť taktiež odvodený od ľudského CMV. Predovšetkým môže byť tvorený fragmentárni obsiahnutými medzi nukleotidmi -53 až +75 alebo -31 až +75 vírusu CMV. Avšak môže byť použitý každý konvenčný promótor, akým je napríklad promótor génov kódujúcich enzýmy chloramfenikolacetyl-transferázu, betagalaktozidázu alebo tiež luciferázu.
Expresná kazeta je výhodne tvorená nasledujúcimi prvkami:
- regulačná sekvencia: sekvencia zahrňujúca sekvenciu SEQ ID n° 1 alebo n° 2 alebo jej derivát, ktoré sú prípadne niekoľkokrát opakované,
- minimálny promótor: promótor odvodený od promótora génu tymidín-kinázy (TK),
- zainteresovaná kódujúca sekvencia.
Ešte výhodnejšie je minimálny promótor tvorený oblasťou -37 až +19 promótora génu tymidín-kinázy.
Výhodne je expresná kazeta zvolená z množiny zahrňujúcej štruktúrne kazety Tetop2.TK-Gen, Tetop7.TK-Gen a 0R3.TK-Gen.
Ďalším znakom vynálezu je expresný vektor obsahujúci sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu chimerickú molekulu a vyššie definovanú vynálezu môžu byť chimerickú molekulu expresnú kazetu. Do vektorov podľa sekvencie nukleových kyselín kódujúce a expresná kazeta vložené v rovnakej orientácii alebo v opačných orientáciách. Inak uvedený vektor môže mať plazmidovú alebo vírusovú povahu.
Z vírusových vektorov možno uviesť výhodnejšie adenovírusy, retrovírusy, herpesvírusy alebo tiež adeno-pridružené vírusy. Vírusy podľa vynálezu sú detektívnymi vírusmi, t. zn. vírusy, ktoré nie sú schopné replikovať sa autonómnym spôsobom v cieľovej bunke. Všeobecne je teda genóm defektných vírusov použitých v rámci vynálezu zbavený aspoň sekvencii nevyhnutných na replikáciu uvedeného vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti môžu byť buď eliminované (celkom alebo čiastočne), alebo urobené nefunkčnými, alebo nahradené inými sekvenciami, predovšetkým sekvenciami podľa vynálezu. Avšak výhodne si defektný vírus zachováva tie sekvencie svojho genómu, ktoré sú nevyhnutné na inkapsidáciu vírusových častíc.
Pokiaľ ide o adenovírusy, boli už charakterizované rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa čiastočne líšia. Z týchto sérotypov je výhodné použiť v rámci vynálezu ľudské adenovírusy typu 2 alebo 5 (Ad 2 alebo Ad 5) alebo adenovírusy zvieracieho pôvodu (viď prihláška WO94/26914). Z adenovírusov zvieracieho pôvodu použiteľných v rámci vynálezu možno uviesť adenovírusy psieho, bovínneho, murínneho (príklad: Mavl, Beard a kol., Virology 75(1990)81), ovčieho, prasačieho, vtáčieho alebo tiež opičieho (príklad: SAV) pôvodu. Výhodne je adenovírusom zvieracieho pôvodu psí adenovírus, predovšetkým adenovírus CAV2 (kmeň Manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800), napríklad). Výhodne sa v rámci vynálezu použijú adenovírusy ľudského alebo psieho pôvodu alebo zmiešaného pôvodu.
Výhodne genóm rekombinantných adenovirusov podľa vynálezu obsahuje aspoň sekvencie ITR a inkapsidačnú oblasť adenovirusu a sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu chimerickú molekulu, ako i vyššie definovanú expresnú kazetu. Výhodne v genóme adenovirusov je podľa vynálezu nefunkčná aspoň oblasť El. Uvažovaný vírusový gén môže byť urobený nefunkčným ľubovoľnou o sebe známou technikou, predovšetkým celkovou supresiou, substitúciou (napríklad sekvenciami podľa vynálezu), čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo niekoľkých báz v uvažovanom géne alebo v uvažovaných génoch. Takéto modifikácie môžu byť dosiahnuté in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ, napríklad za použitia techník génového inžinierstva alebo tiež pôsobením mutagénnych činidiel. Rovnako ostatné oblasti môžu byť modifikované, predovšetkým Oblasť E3 (WO95/02697), oblasť E2 (WO94/28938), oblasť E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a oblasť L5 (W095/02697).
V rámci výhodnej formy uskutočnenia adenovírus obsahuje podľa vynálezu deléciu v oblastiach El a E4. V rámci inej výhodnej formy uskutočnenia tento adenovírus obsahuje deléciu v oblasti El, v ktorej úrovni sú vložené oblasť E4 a sekvencie podľa vynálezu (viď FR 9413355).
Defektné rekombinantné adenovírusy podľa vynálezu môžu byť pripravené ľubovoľnou o sebe známou technikou (Lavrero a kol., Gene 101(1991)195, EP185573, Graham, EMBO J.
3(1984)2917. Tieto adenovírusy môžu byť predovšetkým pripravené homologickou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom nesúcim okrem iného sekvencie DNA podľa vynálezu (sekvencie kódujúce chimerickú molekulu + expresnú kazetu). Uvedená homologická rekombinácia sa uskutočňuje po ko-transfekcii uvedených adenovirusov a plazmidu do príslušného bunkového kmeňa. Použiteľný bunkový kmeň musí (výhodne 1) byť transformovateľný uvedenými prvkami a 2) musí obsahovať sekvencie schopné komplementovat časť genómu defektného adenovirusu, výhodne v integrovanej forme s cieľom zamedzenia rekombinantných rizík. Ako príklad takého bunkového kmeňa možno uviesť ľudský embryo19 nálny renálny kmeň 293 (Graham a kol., J.Gen.Virol.36 (1977)59), ktorý obsahuje predovšetkým v integrovanej forme vo svojom genóme ľavú časť genómu adenovírusu Äd5 (12 %) alebo kmene schopné komplementovať funkcie El a E4, ktoré boli opísané predovšetkým v prihláškach W094/26914 a WO95/02697.
Následne sa multiplikované a izolované adenovírusy purifikujú klasickými technikami molekulárnej biológie, ktoré sú ilustrované v ďalej zaradených príkladoch uskutočnenia.
Pokiaľ ide o adeno-pridružené vírusy (AkV), ide o vírusy s DNA majúcou relatívne redukovanú veľkosť a integrujúce sa do genómu buniek, ktoré infikujú stabilným a miestne špecifickým spôsobom. Tieto vírusy sú schopné infikovať široké spektrum buniek, bez toho, aby indukovali akýkoľvek účinok ovplyvňujúci rast, morfológiu alebo delenie buniek. Inak sa nezdá, že by tieto vírusy boli implikované do ľudských patológií. Genóm adeno-pridružených vírusov už bol klonovaný, sekvenovaný a charakterizovaný. Zahŕňa asi 4700 báz a obsahuje na každom konci oblasť obrátenej repetície (ITR) s asi 145 bázami, slúžiacu ako začiatok replikácie vírusu. Zbytok genómu je rozdelený do dvoch hlavných oblastí nesúcich inkapsidačné funkcie: ľavá časť genómu, ktorá obsahuje gén rep implikovaný pri vírusovej replikácii a expresiu vírusových génov, a pravá časť genómu, ktorá obsahuje gén cap kódujúci proteíny kapsidu vírusu.
Použitie vektorov adeno-pridružených vírusov (AAV) pre prenos génov in vitro a in vivo už bol opísaný v literatúre (viď predovšetkým W091/18088, WO93/09239, US 4,797,368, US
5,139,941, EP 488 528). V týchto prihláškach sú opísané rôzne konštrukcie odvodené od adeno-pridružených vírusov AAV, v ktorých sú gény rep alebo/a cap eliminované deléciami a nahradené zainteresovaným génom, ako i ich použitie na prenos in vitro (na bunkách v bunkovom kmeni) alebo in vivo (priamo do organizmu) zainteresovaného génu. Defektné rekombinantné adeno-pridružené adenovírusy ko-transfekciou do bunkového vírusom ľudského pôvodu (napríklad adenovírusom) plazmidom obsahujúcim nukleové sekvencie podľa vynálezu (sekvencie
AAV môžu byť pripravené kmeňa infikovaného pomocným kódujúce chimerickú molekulu + expresnú kazetu) ohraničené dvoma oblasťami obrátenej repetície (ITR) odvodenými od adeno-pridružených vírusov a plazmidu nesúceho inkapsidačné gény (gény rep a cap) odvodené z adeno-pridružených vírusov AAV. Produkované rekombinantné AAV sa potom purifikujú klasickými technikami.
Pokiaľ ide o herpesvírusy a retrovírusy, bola konštrukcia rekombinantných vektorov v širokej miere opísaná v literatúre. 0 tom viď predovšetkým: Breakfield a kol., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP 178220, Bernstein a kol. Genet.Eng.7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985)689 a podobne.
Retrovírusy sú integratívnymi vírusmi, ktoré selektívne infikujú bunky v štádiu ich delenia. Tieto vírusy takto tvoria žiadané vektory pri rakovinových aplikáciách. Genóm retrovírusov v podstate obsahuje dve sekvencie LTR, inkapsidačnú sekvenciu a tri kódujúce oblasti (gag, pol a env). V rekombinantných vektoroch odvodených od retrovírusov sú gény gag, pol a env všeobecne eliminované deléciou, a to celkom alebo čiastočne a nahradené zainteresovanou heterologickou sekvenciou nukleovej kyseliny. Tieto vektory môžu byt získané z rôznych typov retrovírusov, akými sú predovšetkým MoMuLV (vírus murínna Maloneyova leukémia, tiež označovaná ako MoMLV), MSV (vírus murínneho Maloneyovho sarkómu), HaSV (vírus Harveyovho sarkómu), SNV (vírus slezinnej nekrózy), RSV (vírus Rousovho sarkómu) alebo tiež Friendov vírus.
S cieľom konštrukcie rekombinantných retrovírusov podľa vynálezu sa všeobecne zostrojí plazmid obsahujúci predovšetkým sekvenciu LTR, inkapsidačnú sekvenciu a sekvenciu podľa vynálezu (sekvencia kódujúca chimerickú molekulu + expresnú kazetu), ktorý sa potom použije na transfekciu takzvaného inkapsidačného bunkového kmeňa, schopného priniesť do polohy trans retrovírusové funkcie, ktoré sú v plazmide deficitné. Všeobecne sú inkapsidačné kmene teda schopné exprimovať gény gag, pol a env. Také inkapsidačné kmene boli opísané v rámci doterajšieho stavu techniky a sú nimi predovšetkým kmene PA317 (US 4,861,-719), PsiCRIP (W090/02806) a GP+envAm-12 (W089/07150). Ináč môžu rekombinantné retrovírusy zahrňovať modifikácie potlačenie uskutočnené s cieľom ako i rozložených časť génu gag (Bender na úrovni sekvencií LTR transkripčnej aktivity, inkapsidačných sekvenciách zahrňujúcich a kol., J.Virol.61(1987)1639). Produkované rekombinantné retrovírusy sa potom purifikujú klasickými technikami.
Príklad konštrukcie defektného rekombinantného vírusu podľa vynálezu (retrovírus) je opísaný na obr. 8. Z tohto obrázku je zrejmá druhá výhoda konštrukcií podľa vynálezu, ktorá spočíva v absencii expresie zainteresovaného génu v inkapsidačných kmeňoch. Vzhladom na to, že v týchto kmeňoch nie je prítomný transaktivátor alebo transaktivačný komplex regrutovaný systémom podľa vynálezu, je promótor neaktívny a nedochádza tak k expresii génu v produkčnej bunke (obr. 8A). K tomu dochádza len v prípade, kedy vírus účinne infikoval cieľovú bunku, t. j. bunku, v ktorej je prítomný transaktivátor alebo transaktivačný komplex regrutovaný systémom podľa vynálezu, a kedy dochádza k účinnej expresii génu (obr. 8B). To je obzvlášť výhodné na konštrukciu vírusu obsahujúceho gény, ktorých expresia by bola pre bunky toxická (gény Grb3-3, IL-2, difterický toxín a podobne).
V rámci realizácie vynálezu je obzvlášť výhodné použiť defektný rekombinantný adenovírus alebo retrovírus. Tieto vektory majú v skutočnosti vlastnosti, ktoré sú mimoriadne zaujímavé pre prenos génov do nádorových buniek.
V rámci vynálezu môžu byť taktiež použité rôzne typy nevírusových vektorov. Systém podmienenej expresie podľa vynálezu môže byť v skutočnosti zabudovaný do nevirusového činidla schopného podporovať prenos a expresiu nukleových kyselín do eukaryotických buniek. Chemické alebo biochemické vektory predstavujú zaujímavú alternatívu prírodných vírusov, a to predovšetkým vzhladom na ľahkú manipuláciu, na zvýšenú bezpečnosť a vzhľadom na to, že tu neexistuje teoretická medza týkajúca sa veľkosti DNA, ktorá má byť transfektovaná.
Tieto syntetické vektory majú dve základné funkcie, a síce zhutňovať transfektovanú nukleovú kyselinu a podporovať jej bunkovú fixáciu, ako i jej priechod cez plazmovú membránu a prípadne cez obe jadrové membrány. Aby sa zabránilo polyaniónovému charakteru nukleových kyselín, majú nevírusové vektory vo všetkých prípadoch polykatiónové náboje.
Z vyvinutých syntetických vektorov sú najvýhodnejšie katiónové polyméry typu polylyzínu, (LKLK)n, (LKKL)n, polyetylénimín a DEAE-dextrán alebo tiež katiónové a lipofektantné lipidy. Tieto vektory majú schopnosť zhutnit DNA a podporovať jej spojenie s bunkovou membránou. Z týchto posledne uvedených možno uviesť lipopolyamíny (lipofektamín, transfektám a podobne) a rôzne katiónové alebo neutrálne lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE a podobne). V nedávnej dobe bol vyvinutý systém cielenej transfekcie, mediovanej receptorom, ktorý využíva princíp kondenzácie DNA vďaka katiónovému polyméru riadiac fixovanie komplexu k membráne v dôsledku chemickej kopulácie medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora prítomného na povrchu bunkového typu, ktorý má byť transformovaný. Bolo už opísané nasmerovanie receptora transferínu, inzulínu alebo receptora azialoglykoproteínov hepatocytov.
Predmetom vynálezu je tiež akákoľvek farmaceutická kompozícia, ktorá obsahuje vyššie uvedený vektor. Tieto kompozície môžu byť formulované s ohľadom na topické, perorálne, parenterálne, intranasálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, intraokulárne a podobné podania. Výhodne kompozícia podľa vynálezu obsahuje farmaceutický prijateľné nosiče na injekovateľné formulácie. Môže ísť predovšetkým o roztoky solí (dihydrogénfosforečnan sodný, hydrogénfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý alebo chlorid horečnatý a podobne, alebo zmesi takýchto solí) v sterilnom a izotonickom stave alebo v suchej kompozícii, predovšetkým lyofilizované kompozície, ktoré po pridaní sterilizovanej vody alebo fyziologického roztoku umožňujú rekonštitúciu injikovateľných tekutín. Pokiaľ ide o retrovírusy, môže byť výhodné priamo použiť inkapsidačné bunky alebo bunky infikované ex vivo a reimplantované in vivo, prípadne vo forme neoorgánu.
Dávky vektora použité na injekciu môžu byť prispôsobené v závislosti od rôznych parametrov, predovšetkým v závislosti od použitého spôsobu podania, od liečenej patológie alebo tiež od požadovanej doby liečenia. Všeobecne sú rekombinantné vírusy podľa vynálezu formulované a podávané vo forme dávok pohybujúcich sa medzi 104 a 1014 pfu/ml. V prípade adeno-pridružených vírusov (AAV) a adenovírusov môžu byť taktiež použité dávky pohybujúce sa medzi 106 a 101Q pfu/ml. Výraz pfu (plaque forming unit) odpovedá infekčnej potencii suspenzie viriónov a je stanovená infekciou príslušného bunkového kmeňa a vyhodnotením (obvykle po 48 hodinách) počtu infikovaných bunkových plakov. Techniky stanovenia titra pfu vírusového roztoku sú v širokej miere dokumentované v literatúre.
Expresný systém podľa vynálezu a zodpovedajúce vektory sú obzvlášť vhodné na reguláciu expresie zainteresovaných génov v rámci bunkových a génových terapií. Tieto vektory môžu byť tiež použité na reguláciu expresie akejkoľvek zainteresovanej kódujúcej sekvencie, predovšetkým sekvencie kódujúcej terapeutický produkt, ktorým môže byť peptid, polypeptid, proteín ribonukleová kyselina a podobne. Génom je sekvencia DNA (cDNA, gDNA, syntetická, ľudská, zvieracia, rastlinná a podobná DNA) kódujúci proteínové produkty, akými sú napríklad enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF a podobne (FR 9203120), rastové faktory, neurotransmitery syntetické enzýmy, trofické GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 a ApoAIV, ApoE a podobne alebo ich prekurzory alebo faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, podobne, apolipoproteíny: ApoAI, (FR 93 05125), dystrofín alebo minidystrofín (FR 9111947), nádorovo-supresorové gény: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev a podobne (FR 93 04745), gény kódujúce faktory implikované v koagulácii: faktory VII, VIII, IX a podobne alebo tiež celok alebo časť prírodného alebo umelého imunoglobulínu (Fab, ScFv a podobne), RNA-ligand (WO91/19813) a podobne.
Zainteresovaným génom môže byť tiež antimediátorová sekvencia, ktorej expresia v cieľovej bunke umožňuje regulovať expresiu génov alebo transkripciu bunkových mRNA. Takéto sekvencie môžu byť napríklad prepísané do cieľovej bunky ako komplementárna RNA bunkových mRNA a môžu takto blokovať ich transláciu na proteín technikou opísanou v patentovom dokumente EP 140 308.
Vynález je obzvlášť vhodný na expresiu sekvencií kódujúcich toxické faktory. Predovšetkým môže ísť o bunkové jedy (difterický toxín, toxín pseudomonas, ricín A a podobne) a o produkty indukujúce senzibilitu na vnútorné činidlo (sebevražedné gény: tymidín-kináza, cytozín-deamináza a podobne) alebo tiež o vražedné gény schopné indukovať bunkovú smrť (Grb3—3 (PCT/FR94/00542), ScFv anti-ras (WO94/29446) a podobne) . Systém podľa vynálezu v skutočnosti umožňuje produkovať predovšetkým vírusové vektory obsahujúce tieto sekvencie, a to bez rizika otravy produkčnej bunky a potom indukovať expresiu týchto toxických molekúl, a to selektívne v cieľových bunkách majúcich požadovaný transaktivátor alebo transaktivačný komplex. Tento typ konštrukcie je teda obzvlášť vhodný na protinádorové terapeutické stratégie, ich cieľom je napríklad selektívne zničiť napadnuté bunky. Tento systém je taktiež obzvlášť zaujímavý pre expresiu cytokínov, interferónov, TNF, TGF, ktorých neregulovaná produkcia by mohla mať výrazné vedľajšie účinky.
Prehľad obrázkov na výkresoch
V nasledujúcich častiach opisu bude vynález detailnejšie opísaný pomocou príkladov jeho konkrétneho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú len ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne definovaný definíciou patentových nárokov.
Na pripojených výkresoch:
obr. 1 znázorňuje zobrazenie systému podmienenej expresie podľa vynálezu umožňujúci selektívne regrutovanie transaktivátora pomocou oligomeračnej oblasti (A) alebo
ScFv (B), obr. 2 znázorňuje zobrazenie systému podmienenej expresie podľa vynálezu umožňujúci selektívne regrutovanie transaktivačného komplexu, obr. 3 znázorňuje expresnú kazetu podľa vynálezu zahrňujúcu regulačnú sekvenciu Tetop7, minimálny promótor (box TATA) a gén (CAT), obr. 4 znázorňuje zobrazenie expresnej kazety podľa vynálezu zahrňujúcej regulačnú sekvenciu 0R3, minimálny promótor (box TATA) a gén (CAT), obr. 5 znázorňuje bišpecifické chimérické molekuly podľa vynálezu, obr. 6 znázorňuje sekvencie DNA kódujúce bišpecifické chimérické molekuly podľa vynálezu, obr. 7 znázorňuje chimérické kontrolné konštrukcie, obr. 8 znázorňuje štruktúru a funkciu vírusového vektora (retrovírus) podľa vynálezu, obr. 9 znázorňuje štúdiu interakcie medzi hybridnými molekulami podľa vynálezu a regulačnou sekvenciou, obr. 10 znázorňuje štúdiu interakcie medzi hybridnými molekulami podľa vynálezu a rôznymi formami proteínu p53, obr. 11 znázorňuje preukázanie aktivácie kazety Tet-Luc v bunkách SAOS-2, obr. 12 znázorňuje preukázanie aktivácie kazety Tet-Luc v bunkách H358.
Všeobecné techniky molekulárnej biológie
Klasické metódy molekulárnej biológie, medzi ktoré patrí predovšetkým centrifugácia plazmidovej DNA v systéme chlorid cézny-etídiumbromid, štiepenie reštrikčnými enzýmami, elektroforéza na géli, transformácia do E.coli, precipitácia nukleových kyselín a podobne, sú opísané v literatúre (Maniatis a kol., 1989).
Enzýmy boli poskytnuté firmou New-England Biolabs (Beverly, MA). S cieľom ligácie sú fragmenty DNA separované podľa ich veľkosti na 0,8 až 1,5 % agarózovom géli, purifikovaná metódou GeneClean (BI0101, LaJolla CA) a inkubované cez noc pri teplote 14 °C v pufri Tris-HCl, pH 7,4,50 mM, MgCl^ 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, v prítomnosti DNA-ligázy fágu T4.
Amplifikácia reakcií PCR (Polymerase Chain Reaction) bola taktiež uskutočnená podľa Maniatis-a a kol. (1989) pri dodržaní nasledujúcich podmienok:
- koncentrácia MgCl^ upravená na 8mM,
- denaturačná teplota 95 °C, hybridizačná teplota 55 °C, elongačná teplota 72 °C. Tento cyklus bol opakovaný 25krát v zariadení PE9600 Thermalcycler (Perkin Elmer, Norwalk CO) .
Oligonukleotidy sa syntetizujú za použitia chémie fosforamiditov chránených v polohe beta kyanoetylovou skupinou (Sinha a kol., 1984, Giles 1985) a automatického syntetizéru DNA Applied Biosystem model 394 (Applied Biosystem, Foster City CA) pri dodržaní odporúčania výrobcu.
Sekvenovanie bolo uskutočnené na dvojvláknových matriciach metódou terminácie reťazcov za použitia fluorescenčných značkovacích činidiel. Tu bola použitá sekvenovacia súprava Taq Sye Primer Kit dostupná u firmy Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) pri dodržaní pokynov výrobcu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Konštrukcia expresnej kazety zahrňujúcej regulačnú sekvenciu, minimálny transkripčný promótor a gén
1.1. Konštrukcia plazmidu pTETop7/CAT
Plazmid pTETop7/CAT obsahuje nasledujúce prvky (obr. 3):
- regulačnú sekvenciu tvorenú sekvenciou interakcie s tetracyklínovým supresorom tetR pozostávajúci zo siedmich opakovaných motívov Tetop (SEQ ID n° 1),
- minimálny promótor odvodený od promótora génu tymidín-kinázy (oblasť -37 až +19 nesúca box TATA),
- sekvenciu kódujúcu chloramfenikolacetyl-transferázu (CAT) pod kontrolou uvedeného minimálneho promótora.
Tento plazmid bol konštruovaný klonovaním fragmentu Smal-BglII plazmidu pUHD10-7 (WO94/29442) do plazmidu pKK232-8 (Pharmacia), ktorý bol predbežne štiepený reštrikčnými enzýmami Smal a BamHI.
1.2. Konštrukcia plazmidu pOR3/CAT
Plazmid pOR^/CAT obsahuje nasledujúce prvky (obr. 4):
- regulačnú sekvenciu tvorenú sekvenciou OR^ interakcie s represorom Cro (SEQ ID n° 2),
- minimálny promótor odvodený od promótora génu tymidín-kinázy (oblasť -37 až 19 nesúceí box TATA) ,
- sekvenciu kódujúcu chloramfenikolacetyl-transferázu (CAT) pod kontrolou uvedeného minimálneho promótora.
Tento plazmid bol konštruovaný nasledujúcim spôsobom: sekvencia 0R3 interakcie s represorom Cro bola syntetizovaná umelo. S tým cieľom boli syntetizované dva nasledujúce oligonukleotidy:
Oligo 5533 (SEQ ID n° 22): 5'-GATCCTATCACCGCAAGGGATAA-3'
Oligo 5534 (SEQ ID n° 23): 3'-GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA-5'.
Oba tieto oligonukleotidy boli potom hybridizované za účelom rekonštituovania dvojvláknovej sekvencie 0R3 ohraničenej sekvenciami umožňujúcimi jej klonovanie orientované nasledujúcim spôsobom:
CATCCTATCACCGCAAGGGATAA
GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA.
1.3
Konštrukcia expresnej kazety toxických génov
Expresné kazety opísaných plazmidov sekvenciou kódujúcou toxických génov sa získajú z vyššie (1.1 a 1.2) nahradením sekvencie CAT toxický produkt, výhodne gén Grb3-3 (PCT/FR94/00542) , gén tymidín-kinázy, gén kódujúci difterický toxín alebo pseudomonas a podobne.
Príklad 2
Konštrukcia špecifických jednovláknových protilátok pre p53
Táto jednovláknová protilátka sa konštruuje podľa nasledujúceho protokolu:
cDNA kódujúca oblasti VH a VL boli získané z hybridómu pAb421 produkujúceho protilátku anti-p53. S týmto cieľom boli extrahované a podrobené za použitia náhodných subjektov. Použitie tohto
Avšak v prípade, totálnych cDNA, totálne RNA uvedeného hybridómu inverznej transkripčnej reakcii hexamérov vo funkcii primárových typu primérového subjektu umožňuje vyvarovať sa použitia špecifických primérových subjektov imunoglobulínov. Získané klony cDNA majú dostatočnú dĺžku na klonovanie oblastí V.
že predstavujú malú frakciu z prítomných potom musí byť uskutočnená predbežná amplifikačná reakcia s cieľom produkovania množstva DNA dostatočného na klonovanie. S tým cieľom sa cDNA kódujúca oblasti VH a VL amplifikuje oddelene. Použitými primárovými subjektami sú oligonukleotidy hybridizujúce na úrovni opačných koncov variabilných oblastí každého reťazca (H a L). Amplifikačným produktom využívajúcim špecifické primérové subjekty ťažkých reťazcov je fragment obsahujúci asi 340 bázových párov. Amplifikačný produkt používajúci špecifické primérové subjekty ľahkých reťazcov je tvorený fragmentom obsahujúcim asi 325 bázových párov.
Po purifikácii sa cDNA kódujúca oblasť VH a VL protilátkami usporiada do jediného reťazca pomocou nukleotidového ramena (L). Toto nukleotidové rameno je konštruované takým spôsobom, že jeden z koncov sa viaže na koniec 3' cDNA kódujúci oblasť VH a druhý koniec sa viaže na koniec 5' cDNA kódujúci oblasť VL. Sekvencia ramena kóduje peptid SEQ ID n° 5. Zostavená sekvencia s asi 700 bázovými pármi obsahuje vo forme fragmentu Ncol-NotI reťazec VH-L-VL, ktorého sekvencia je reprezentovaná sekvenciou SEQ ID n° 4 (aminokyseliny 9 až 241). Táto sekvencia taktiež zahŕňa na konci C sekvenciu tag odvodenú od myc (zbytky 256 až 266).
Príklad 3
Konštrukcia sekvencií nukleových kyselín kódujúcich bišpecifické chimerické molekuly obsahujúce oblasť väzby k transaktivátoru tvorenú jednovláknovou protilátkou (ScFv)
3.1. Konštrukcia plazmidu obsahujúceho sekvenciu ScFv-myc
Hinge-TetR alebo Cro (obr. 5A a obr. 6)
Najskôr bol fragment Ncol-NotI obsahujúci cDNA kódujúci ScFv anti-p53 klonovaný do plazmidu typu pUC19. Potom sa za tento fragment vloží sekvencia kódujúca epitop VSV (SEQ ID n° 7) alebo myc (SEQ ID n° 8).
Sekvencie kódujúce proteíny TetR a Cro sa potom získajú nasledujúcim spôsobom:
-sekvencia kódujúca TetR bola získaná amplifikáciou z materinského plazmidu nesúceho sekvenciu TetR za použitia nasledujúcich oligonukleotidov:
Oligo 5474 (SEQ ID n° 10):
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCG
TGGATCCATGTCCAGATTAGATAAAAGTAAAG
Oligo 5475 (SEQ ID n° 11):
CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGGGACCCACTTTCACATTT
AAGTTG
Tieto oligoméry taktiež prinášajú sekvenciu kódujúcu peptidové rameno Hinge spájajúce obe funkčné oblasti molekúl.
Amplifikovaný fragment teda obsahuje sekvenciu kódujúcu peptidové rameno a oblasť väzby s DNA tetT. Tento fragment sa klonuje do miest Xbal-EcoRI získaného plazmidu s cieľom generovania plazmidu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu molekulu ScFv-myc-Hinge-TetR (obr. 6).
- sekvencia kódujúca Cro bola získaná amplifikáciou na DNA-matrici bakteriofága Lambda za použitia nasledujúcich oligonukleotidov:
Oligo 5531 (SEQ ID n° 12):
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCG
TGGATCCATGGAACAACGCATAACCCTGAAAG
Oligo 5532 (SEQ ID n° 13):
CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGTGCTGTTGTTTTTTTGTT
ACTCGG
Tieto oligonukleotidy prinášajú taktiež sekvenciu kódujúcu peptidové rameno Hinge spájajúce obe funkčné oblasti molekuly.
Amplifikovaný fragment teda obsahuje sekvenciu kódujúcu peptidové rameno a oblasť väzby s DNA Cro. Tento fragment bol klonovaný do miest Xbal-EcoRI vyššie uvedeného získaného plazmidu s cieľom generovania plazmidu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu molekulu ScFv-myc-Hinge-Cro (obr. 6).
3.2. Konštrukcia plazmidu obsahujúceho sekvenciu ScFvHinge-TetR alebo Cro (obr. 5B)
Tento príklad opisuje konštrukciu plazmidov nesúcich sekvenciu kódujúcu bišpecifickú chimerickú molekulu podľa vynálezu zbavenú sekvencie tag.
Tieto plazmidy boli získané z plazmidov opísaných v 3.1. štiepením enzýmov NotI a Xbal. Toto štiepenie umožňuje vyštiepiť fragment nesúci oblasť kódujúcu tag myc.
3.3. Konštrukcia plazmidu zahrňujúceho sekvenciu ScFv
TetR alebo Cro (obr. 5C)
Tento príklad opisuje konštrukciu plazmidov nesúcich sekvenciu kódujúcu bišpecifickú chimerickú molekulu podľa vynálezu nemajúcu rameno a sekvenciu tag.
Tieto plazmidy boli získané z plazmidov opísaných v 3.1. štiepením enzýmami Nôti a BamHl. Toto štiepenie umožňuje vyštiepiť fragment nesúci oblasť kódujúcu tag myc a peptidové rameno Hinge.
Príklad 4
Konštrukcia sekvencií nukleových kyselín kódujúcich bišpecifické chimerické molekuly obsahujúce oblasť väzby na transaktivátor tvorenú oligomeračnou oblasťou
4.1. Klonovanie oligomeračnej oblasti proteínu p53 (fragment 320-393) cDNA kódujúca oligomeračnú oblasť proteínu p53 (SEQ ID n° 3) bola získaná amplifikáciou reakciou PCR na plazmide nesúcom cDNA divokého ľudského p53 za použitia nasledujúcich oligonukleotidov:
Oligo 5535 (SEQ ID n° 14):
CAGGCCATGGCATGAAGAAACCACTGGATGGAGAA (podčiarknutá časť predstavuje miesto Ncol)
Oligo 5536 (SEQ ID n° 15):
CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCGTCTGAGTCAGGCCCTTC (podčiarknutá časť: miesto BamHl, dvakrát podčiarknutá časť: miesto Xbal, tučné napísaná časť: Nôti).
4.2. Plazmidy p53 320/393-myc-Hinge-TetR alebo Cro (obr. 5A) boli získané klonovaním vyššie uvedeného amplifikovaného fragmentu vo forme fragmentu
Ncol-NotI do miest zodpovedajúcich plazmidom opísaných v príklade 3.1. nahradením za oblasť kódujúcu ScFv.
4.3. Plazmidy p53 320/393-Hinge-TetR alebo Cro (obr. 5B) boli získané klonovaním amplifikovaného fragmentu z 4.1. vo forme fragmentu Ncol-Xbal do miest zodpovedajúcich plazmidom opísaným v 3.1. nahradením za oblasť kódujúcu ScFv a tag.
4.4. Plazmidy p53 320/393-TetR alebo Cro (obr. 5C) boli získané klonovaním fragmentu amplifikovaného v 4.1. vo forme fragmentu Ncol-BamHI do miest zodpovedajúcich plazmidom opísaným v príklade 3.1. nahradením za oblasť kódujúcu ScFv, tag a Hinge.
4.5. Plazmidy tetR alebo Cro- p53 320/393 (obr. 5D) alebo tetR alebo Cro-Hinge-p53 320/393 (obr. 5E) boli získané klonovaním fragmentov amplifikovaných reakciou PCR na plazmide nesúcom cDNA divokého ľudského p53 za použitia oligo 5537/5539 alebo 5538/5539 štiepených Xhol/EcoRI do plazmidov opísaných v 3.1., predbežne štiepených enzýmami Xhol/EcoRI.
Oligo 5537 (SEQ ID n° 16):
CAGGCTCGAGAAGAAACCACTGGATGGAGAA
Oligo 5538 (SEQ ID n° 17):
CAGGCTCGAGCCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAAAGA
AACCACTGGATGGAGAA
Oligo 5539 (SEQ ID n° 18):
GGTCGAATTCGGGCCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC
Príklad 5
Konštrukcia kontrolného plazmidu nesúceho sekvenciu kódujúcu chimérickú molekulu zahrňujúcu oblasť väzby na DNA (TetR alebo Cro) a transaktivátorovú oblasť proteínu p53 (oblasť 1-73)
Plazmidy p53 1/73-TetR alebo Cro s alebo bez tag (myc alebo VSV) a Hinge (obr. 7A, 7B a 7C) boli získané klonovaním fragmentov amplifikovaných reakciou PCR z plazmidu nesúceho cDNA divokého ľudského p53 za použitia oligo 3661/5662 a potom štiepených enzýmami Ncol/NotI, Ncol/Xbal, Ncol/BamHI do plazmidov opísaných v 3.1., predbežne štiepených enzýmami Ncol/NotI, Ncol/Xbal alebo Ncol/BamHI.
Oligo 5661 (SEQ ID n° 19):
CAGGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCC
Oligo 5662 (SEQ ID n° 20):
CGTCGGATCCTCTAGAŤGCGGCCGCCACGGGGGGAGCAGCCTC
TGG
Príklad 6
Konštrukcia expresných plazmidov rôznych hybridných molekúl podľa vynálezu
Plazmidy použité na expresiu hybridných molekúl boli získané klonovaním fragmentov obsahujúcich cDNA kódujúcu tieto molekuly do miest Ncol/EcoRI eukaryotického expresného vektora pcDNA3 (invitrogén). Takto boli uskutočnené rôzne nasledujúce konštrukcie:
-ScFv 421: SEQ ID n° 4,
-TET19: hybridný proteín obsahujúci reťazec ScFv421-VSV-HingeTetR opísaný na obr. 6 podľa príkladu 3.1.,
-ΤΕΤ02: hybridný proteín obsahujúci reťazec p53(320/393)-VSVHinge-TetR opísaný na obr. 5A podľa príkladu 4.3.,
-TET03: hybridný proteín obsahujúci reťazec p53(320/393)-Hinge TetR opísaný na obr. 5B podľa príkladu 4.4.,
-TET04: hybridný proteín obsahujúci reťazec p53(320/393)-TetR opísaný na obr. 5C podľa príkladu 4.4.,
-TET07: hybridný proteín obsahujúci reťazec p.53 (1/73 )-VSVHinge-TetR opísaný na obr. 7A podľa príkladu 5.
Príklad 7
Rozpoznanie dvoj vláknových sekvencii DNA hybridnými molekulami podľa vynálezu
7.1. Produkcia hybridných molekúl
Rôzne molekuly použité v tomto experimente boli získané translácíou in vitro v lyzáte retikulocytov molekúl opísaných v príklade 6 za použitia súpravy TNT Coupled Reticulocyte lysate Systems (Promega) a podľa experimentálneho protokolu opísaného dodávateľom pre celkový reakčný objem 50 mikrolitrov.
7.2. Konštrukcia špecifickej dvojvláknovej sekvencie DNA
Špecifická dvojvláknová sekvencia DNA použitá v tomto experimente je tvorená dvoma syntéznymi oligonukleotidmi majúcimi nasledujúce sekvencie:
Oligo 5997 (SEQ ID n° 24):
GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA
Oligo 5998 (SEQ ID n° 25):
AGCTTGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCG
Oba tieto syntézne oligonukleotidy boli označené fosforom 33 inkubáciou nasledujúcej zmesi po dobu 30 minút pri teplote 37 °C a za použitia 10 pmólov každého' z oligonukleotidov:
Tris-HCl pH 7,6 MgClz ditiotreitol Spermidín EDTA ATP-gama-33P(Amersham) T4-kináza (Boehringer) 50 10 5 100 100 50 10 mM mM mM
μΜ Ci/mmol)
μΜ
μθί (1000-3000
U.
Potom sa oba takto označené oligonukleotidy hybridizujú
za prítomnosti 400 mM NaCl s cieľom rekonštitúcie dvojvláknovej sekvencie TetO (SEQ ID n° 26): nasledujúcej
GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA
CTAGGCTCAAAGTGAAAAGAGATAGTGACTATCACTCACCATTTGAGT
7.3.
Rozpoznanie dvojvláknovej sekvencie TetO rôznymi hybridnými molekulami podľa vynálezu
Väzbová reakcia na DNA sa uskutočňuje v 50 μΐ reakčnej zmesi(Tris-HCl pH 7,4 10 mM, MgCl^ 10 mM, KCL 10 mM, betamerkaptoetanol 6 mM, EDTA 0,1 mM, BSA 0,5 mg/ml) pridaním sekvencie TetO (10~1θΜ) pripravené v príklade 7.2, 10 μΐ translačného produktu pripraveného podľa príkladu 7.1. a 10“eM studeného kompetičného oligonukleotidu AP2 (Promega) použitého na elimináciu nešpecifickej väzby. Špecifickosť interakcie sa overí posunutím rovnováhy pridaním 10 μΜ (Sigma) tetracyklínu k reakčnej zmesi. Reakčné zmesi sa potom inkubujú po dobu 15 minút pri pridá 10 μΐ 50 % glycerolu natívnej elektroforéze na 5 % sa migrácia uskutočňuje pri 200 V a 16 a podrobí autorádiografii.
teplote 20 °C, na čo sa k nej a finálne zmesi sa podrobia polyakrylamidovom géli, pričom
C. Gél sa potom vysuší
Výsledok tohto experimentu uskutočneného s hybridnými molekulami TET19, TET02 a TET07 je zobrazený na obr. 9. Za týchto podmienok možno pozorovať väzbu týchto troch molekúl na špecifickú dvojvláknovú DNA-sekvenciu TetO vzhľadom na migračné oneskorenie takto viazaných molekúl, pričom špecifickosť tejto interakcie je preukázaná· inhibíciou uvedeného migračného oneskorenia pridaním tetracyklínu.
Tento výsledok takto potvrdzuje skutočnosť, že hybridné molekuly podľa vynálezu sú schopné viazať sa špecifickým spôsobom na nukleotidovú sekvenciu TetO.
Príklad 8
Špecifická väzba hybridných molekúl podľa vynálezu k molekule majúcej transkripčnú transaktivačnú oblasť
8.1. Produkcia hybridných molekúl podľa vynálezu a molekúl majúcich alebo nemajúcich transkripčnú transaktivačnú oblasť
Na účel tohto experimentu boli hybridné molekuly podľa vynálezu ScFv 421, TET19 a TET02 podľa príkladu 6 produkované transláciou in vitro za použitia experimentálneho protokolu podľa príkladu 7.1. za prítomnosti 44 pci 3SS-metionínu (Amersham) (1175 Ci/mmol), pričom sa získajú rádioaktívne značené hybridné molekuly.
cDNA molekúl majúcich alebo nemajúcich transkripčnú transaktivačnú oblasť bola klonovaná do vektora pBlueBacIII (Invitrogen) v mieste BamHI. Z týchto vektorov boli produkované a purifikované rekombinantné baculovírusy podľa inštrukcií výrobcu. Uvedené molekuly sa produkujú infekciou rekombinantným baculovírusom hmyzích buniek sf9 podľa experimentálneho protokolu výrobcu. Pripravia sa proteínové extrakty s finálnou koncentráciou protokolu opísaného K-Ory-m a kol.
3496-3504, 1994). Týmito molekulami sú:
proteínu 10 mg/ml podľa (K. Ory, EMBO J., 13,
- ρ53(1/393): divoký proteín p53,
- p53(1/320): divoký proteín p53 obmedzený na aminokyselinovú sekvenciu 1 až 320, a teda zbavenú oligomeračnej oblasti a oblasti rozpoznateľnej monoklonovacou protilátkou pAb421.
8.2. Väzba hybridných molekúl podľa vynálezu k molekulám majúcim alebo nemajúcim transkripčnú transaktivačnú oblasť μΐ každého z translačných produktov pripravených podľa príkladu 8.1. sa inkubuje s 5 μΐ extraktu baculovírusu pripraveného podľa príkladu 8.1. a 2 μΐ monoklonovacej protilátky D01 (Oncogene Sciences), ktorá rozpoznáva N-terminálnu časť proteínu p53, po dobu 16 hodín pri teplote 4 °C v 100 μΐ modifikovaného pufra RIPA (K. Ory, EMBO J., 13, 3496-3504, 1994). Imunoprecipitácia sa uskutoční postupom opísaným K. Ory-m a kol. (K. Ory, EMBO J.,13,3496-3504, 1994). Komplexy zadržané protilátkou sa eluujú 10 minútovou inkubáciou pri teplote 80 °C za prítomnosti 30 μΐ migračného pufra (Laemmli U.K., Náture, 227, 680-685, 1970) a podrobia sa elektroforéze na 10 % polyakrylamidovom géli v denaturačnom prostredí pri 200 V podľa vyššie opísaného protokolu (Laemmli U.K., Náture, 227, 680-685, 1970). Gél sa potom vysuší a vyvolá pomocou instantného zobrazovača (Packard Instruments), ktorý umožňuje kvantitatívne stanoviť množstvo hybridných molekúl majúcich alebo nemajúcich transkripčnú transaktivačnú oblasť. Výsledky tohto pokusu sú zobrazené na obr. 10.
Za týchto podmienok sa jasne ukazuje, že hybridná molekula majúca ScFv 421 (TET19) rozpoznáva molekulu p53(1/393) rovnako dobre ako samotný ScFv 421 a že hybridná molekula majúca oblasť 320/393 (TET02) vykazuje rovnaké vlastnosti, avšak má výraznejšiu schopnosť retencie proteínu p53 (1/393). Okrem toho neprítomnosť signálu pozorovaného pri inkubácii s molekulou p53(1/320) ukazuje, že tieto interakcie sú skutočne špecifické a sú médiované C-terminálnou časťou proteínu p53 (aminokyseliny 320 až 393) ako bolo očakávané.
Tieto výsledky teda potvrdzujú skutočnosť, že hybridné molekuly podľa vynálezu sú naozaj schopné regrutovať transkripčnú transaktivačnú oblasť nesenou molekulou, ktorej sú špecifickými partnermi.
Príklad 9
Funkčné regrutovanie transkripčnej transaktivačnej oblasti hybridnými molekulami podľa vynálezu
Funkčné regrutovanie oblasti hybridnými molekulami v transaktivačnom systéme in transkripčnej transaktivačnej podľa vynálezu bolo vyhodnotené vivo v bunkách SAOS-2 (ľudský osteosarkóm) s deficitom oboch alel proteínu p53 v nádorovom bunkovom kmeni s deficitom oboch alel proteínu p53 (Maxwell Roth, Oncogene 8, 3421, 1993) a v nádorovom kmeni HT29 s deficitom jednej z oboch alel proteínu p53 a s jednou mutovanou alelou (mutácia H273). Tento systém je založený na použití reportérového génu, ktorý je stanoviteľný enzymaticky a vložený pod kontrolu promótora obsahujúceho nukleotidové motívy špecificky rozpoznateľné represorom Tet (operátor Tet).
V tomto teste sa reportérový gén LUC (luciferáza) vloží pod kontrolu operátora Tet a je obsiahnutý v plazmide pUHC13-3 (Gossen M. a Bujard H., Proc.Natol.Acad.Sci.USA, 89, 5547-5551, 1992).
9.1. Použité bunkové kmene a kultivačné podmienky
Bunkové kmene použité v týchto experimentoch, ako i ich genotyp pripojený k proteínu p53 a použité kultivačné podmienky pre ich rast sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
Tabuľka
Bunkové kmene
Kmeň p53 Kultivačné prostredie č. ATCC
SAOS Prostredie DMEM (Gibco BRL) HTB 85 obohatené 10 % fetálneho teľacieho séra (Gibco BRL)
H358 Prostredie RPMI1640 (Gibco BRL) obohatené 10 % fetálneho teľacieho séra (Gibco BRL)
HT29 -/H237 Prostredie DMEM (Gibco BRL) obohatené 10 % fetálneho teľacieho séra (Gibco BRL)
9.2. Expresné plazmidy molekúl majúcich transkripčnú
transaktivačnú oblasť
Molekulami s transkripčnou transaktivátorovou oblasťou použitými pri tomto experimente sú divoký proteín p53 (Wt) a mutanty G281 a H175 tohto proteínu. cDNA kódujúca tieto tri proteíny bola vložená do miest BamHI vektora pcDNA3 (introgén) .
9.3. Intracelulárna expresia hybridných molekúl podľa vynálezu
Hybridné molekuly podľa vynálezu sa exprimujú v bunkách bunkovej kultúry dočasnou transfekciou za použitia nasledujúceho protokolu:
Bunky (3,5.1Os) sa zaočkujú do šesťjamkových titračných platní obsahujúcich v jamke po 2 ml kultivačného prostredia a kultivujú cez noc v inkubátore pri teplote 37 °C s atmosfé40 rou obsahujúcou 5 % oxidu uhličitého. Transfektujú sa potom jednotlivé konštrukcie za použitia lipofektAMINu (Gibco BRL) vo funkcii transfekčného činidla, a to nasledujúcim spôsobom: 1,5 pg totálneho plazmidu sa inkubuje (z toho je 0,25 μg reportérového plazmidu) s 5 μΐ lipofektAMINu po dobu 30 minút s 2 ml kultivačného prostredia (transfekčná zmes). V priebehu tejto doby sa bunky dvakrát premyjú PBS a potom inkubujú po dobu 4 hodín pri teplote 37 °C s transfekčnou zmesou, na čo sa transfekčná zmes odsaje a nahradí 2 ml kultivačného prostredia obohateného 10 % fetálneho teľacieho séra inaktivovaného teplom a bunky sa kultivujú po dobu 48 hodín pri teplote 3 7 °C.
9.4. Detekcia aktivácie transkripcie
Aktivácia transkripcie spojená s funkčným regrutovaním transkripčného transaktivátora sa detekuje a kvantitatívne vyhodnotí zmeraním aktivity luciferázy kódovanej génom LUC za použitia súpravy Luciferase Assay System (Promega) podľa protokolu dodaného výrobcom.
9.5. Funkčné regrutovanie transkripčnej transaktivačnej oblasti molekulami podľa vynálezu
Tento experiment bol uskutočnený za použitia molekúl TET02, TET03 a TET07 podľa príkladu 6. Pri tomto experimente slúži molekula TET07 ako pozitívny kontrolný subjekt vzhľadom na to, že má svoju vlastnú transkripčnú transaktivátorovú oblasť.
Získané výsledky v bunkách SAOS-2, ktorú sú uvedené na obr. 11, ukazujú, že molekula TET07 je naozaj samostatne schopná aktivovať transkripciu génu LUC vloženého pod kontrolu operátora Tet, a to na rozdiel od konštrukcie TET02. To je v súlade so skutočnosťou, že tento bunkový kmeň neobsahuje endogénny proteín p53, ktorý takto teda nemôže byť regrutovaný molekulou TET02. Naopak, zavedenie divokého proteínu p53 alebo jeho mutantu, ktoré samy o sebe neprodukujú signál, je schopné generovať transkripčnú aktivitu v prítomnosti molekúl TET02. Taký výsledok nemožno pozorovať pri mutante H175, ktorý je v literatúre opísaný ako mutant majúci nefunkčnú transkripčnú transaktivačnú oblasť.
Tento výsledok získané v bunkovom kmeni SAOS-2 s molekulou TET02 mohol byť reprodukovaný v nádorovom bunkovom kmeni tiež neobsahujúci endogénny p53 (bunky H358) a mohol byť rozšírený aj na molekuly TET03 a TET04 (obr. 12).
S cieľom potvrdenia týchto výsledkov v kontexte rôznych bunkových kmeňov boli molekula TET02, ako i pozitívny kontrolný subjekt TET07 exprimované v bunkách HT29, ktoré majú mutantný endogénny proteín p53 (H273), zatiaľ čo negatívny kontrolný subjekt tohto experimentu spočíva v transfekcii prázdneho vektora pcDNA3. Výsledok tohto experimentu, uvedený v ďalej zaradenej tabuľke, ukazuje, že molekula TET02 je naozaj schopná regrutovať transkripčnú transaktivačnú oblasť endogénneho proteínu p53.
Tabuľka
Transkripčná aktivácia hybridných molekúl podľa vynálezu v bunkách HT29
pcDNA3 TET07 TET02
1 59 10
Súbor uvedených experimentov ukazuje, že hybridné
molekuly podľa vynálezu sú naozaj schopné viazať ako sekvencie dvojvláknovej DNA špecifického charakteru, tak aj proteíny majúce transkripčnú transaktivačnú oblasť a že tieto molekuly sú schopné podmienene indukovať expresiu zainteresovaných génov.
Zoznam sekvencii
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 1:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 19 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 1 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 1:
TCTCTATCAC TGATAGGGA 19
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 2:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 17 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 1 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 2:
TATCACCGCA AGGGATA 17
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 3:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 74 aminokyselín typ: aminokyselina počet vláken: 1 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: peptid
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 3:
Lys 1 Lys Pro Leu Asp Gly Glu 5 Tyr r Π S Thr io Leu Glrt 11 e Arg Gly 1 ó’ Arg
— u Aro Phe Glu *, Λ 4. Xe: Phe Aru Glu L. c U 2 5 Asn Glu Ala L·- ’ * Glu 39 l. e u Lys
r.Sp A1ä Gin Ale Gly Lys Glu Pro Giy Gly Ser Arg Ale 4 5 his Ser Ser
His Leu Lys Ξ0 Ser Lys Lys Gly Gin Ser Thr Ser A r g 60 His í. y s Lys u e u
Η— 7 Ρr.e Lys Thr Glu Glv Pre A.so Ser A.so ó 5 70
Informácia o sekvencii SEQ ID n“: 4: Charakteristika sekvencie: dĺžka: 768 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 1 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 4:
TTACTCGCGG CCCAGCCC-C-C CATC-CCCCAG GTC-CAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT 60
GTAAGGTCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGGTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC 1 20
TACTATATGC ACTGGGTGA-A GCAGAGGGCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGGATGGATT 1 SO
C-ATCCTAAGA ATGGTGATAC TGAATATGCC CCGAAGTTCC AGGGCAAGGC CACTATGACT 240
GCAGACACAT CCTGCA-ATAC AGCCTACCTG CAGCTCAGCA GCCTGGCATC TGAGGACACT 300
GCCGTGTATT TA i rT,'T'rn TTACGGGGAT GCTTTGGACT ATTGGGGCCA AGGGACCACG 360
GTCACCGTCT CCTCAGGTGG AGGCGGTTCA GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG TGGCGGATCG 420
GATGTTTTGA TGACCCAAAC TCCACTCACT TTGTCGGTTA CCATTGGACA ACCAGCCTCC 460
ATCTCTTGCA AGTCAAGTCA GA GCCmC^G GATAGTGATG GA-AAAACATA TTTGAATTGG 540
TTGTTACAGA GGCCAG«C\-A GTCTCCAAAG CGCCTAATCT ATCTGGTGTC TÄÄÄCTGGAC 600
TCTGGAGTGC CTGACAGGTT CACTGGGAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTTAAAATC 660
AACAC-AGTGG AGGCTGAGGA TTTGGGAGTT TATTATTGCT GGCAAGGTAC ACATTCTCCG 720
CTTACGTTCG GTGCTGGCAC CAAGCTGGAA ÄTTAAACGGG CGGCCGCA 7 6S
Informácia o sekvencií SEQ ID n°: 5:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 15 aminokyselín typ: aminokyselina počet vláken: 1 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: peptid
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 5:
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
Informácia o sekvencií SEQ ID n°: 6:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 30 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie : SEQ : id n°: 6:
CCC AAG CCC AGT ACC CCC CCA GGT TCT TCA 30
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser
1 5 10
Informácia o sekvencií SEQ ID n°: 7: Charakteristika sekvencie: dĺžka: 18 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 7:
ATG AAC CGG CTG GGC AAG
Met Asn Arg Leu Gly Lys 1 5
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 8: Charakteristika sekvencie: dĺžka: 33 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 8:
GAA CTIA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT Glu Gin Lys Leu íle Ser Glu Glu Asp Leu Asn
10
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 9: Charakteristika sekvencie: dĺžka: 7 aminokyselín typ: aminokyselina počet vláken: 1 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: peptid
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 9:
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
5
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 10: Charakteristika sekvencie: dĺžka: 66 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 10:
GGCTCTAGAC CCAJAGCCCAG TACCCCCCCA GGTTCTTCAA CGCG7GGATC CATGTCCAGA \ag;
G7AAAC
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 11:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 51 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 11:
CGTACGGAAT TCGGGCCCTT ACTCGAGGGA CCCACTTTCA CATTTAAGTT G 51
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 12:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 66 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 12:
GGCTCTAGAC CCAAGCCCAG TACCCCCCCA GGTTCTTCAA CGCGTGGATC CATGGAACAA
CGCATAACCC TGAAAG
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 13:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 51 bázových párov
4Ί typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 13:
CGTACGGAAT TCGGGCCCTT ACTCGAGTGC TGTTGTTTTT TTGTTACTCG G 51
Informácia o sekvencií SEQ ID n°: 14:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 35 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 14:
CAGGCCATGG CATGAAGAAA CCACTGGATG GAGAA 35
Informácia o sekvencií SEQ ID n°: 15:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 43 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 15:
CGTCGGATCC TCTAGATGCG GCCGCGTCTG AGTCAGGCCC TTC 43
Informácia o sekvencií SEQ ID n°: 16:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 31 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 16:
CAGGCTCGAG AAGAAACCAC TGGATGGAGA A
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 17:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 61 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 17:
CAC-GCTCGAC- CCCAAGCCCA GTACCCCCCC AGGTTCTTCA AAGAAACCAC TGGATGGAGA
A
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 18:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 37 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 18:
GGTCGAATTC GGGCCCTCAG TCTGAGTCAG GCCCTTC
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 19:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 29 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 19:
CAGGCCATGG AGGAGCCGCA GTCAGATCC 29
Informácia o sekvenčii SEQ ID n°: 20:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 46 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 20:
CGTCGGATCC TCTAGATGCG GCCGCCACGG GGGGAGCAGC CTCTGG 46
Informácia o sekvenčii SEQ ID n°: 21:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 66 aminokyselín typ: aminokyselina počet vláken: 1 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: peptid
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Pop: Ls sekv enc. ie: SEQ ID n°: : 21
Met Glu Gin Arg íle Thr Leu Lys Asp Tvr Ala Met Arg Fhe G1 v Gin
1 5 1Ó 1 5*
Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tvr Gin Ser Ala Zle Asn Lys
20 25 30
Ala íle His Ala Gly Arg Lys T T_Q ?he Leu Thr Zle Asn Ala Asp Gly
35 40 45
Ser Val Ty 50
o Ser Asr. Lys Lys Thr ČO
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 22:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 23 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 22:
GATCCTATCA CCGCAAGGGA TAA 23
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 23:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 23 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 23:
GATAGTGGCG TTCCCTATTT CGA 23
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 24:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 48 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 24:
GATCCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGTGAGTGG TAAACTCA 48
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 25:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 48 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 25:
AGCTTGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCG 48
Informácia o sekvencii SEQ ID n°: 26:
Charakteristika sekvencie:
dĺžka: 96 bázových párov typ: nukleotid počet vláken: 2 konfigurácia: lineárna
Typ molekuly: cDNA
Hypotetická: nie
Antimediátorová: nie
Popis sekvencie: SEQ ID n°: 26:
GATCCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGTGAGTGG TAAACTCACT AGGCTCAAAG ÓO
TGAAAAGAGA TAGTGACTAT CACTCACCAT TTGAGT

Claims (57)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Bišpecifická chimerická molekula obsahujúca oblasť schopnú selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu a detekčnú oblasť schopnú špecificky viazať transaktivátor alebo transrepresor alebo transaktivátorový alebo transrepresorový komplex, ktorý je charakteristický pre fyziologický alebo fyziopatologický stav.
  2. 2. Molekula podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu je odvodená od proteínu schopného interakcie s uvedenou DNA.
  3. 3. Molekula podľa nároku 2,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu je odvodená od eukaryotického proteínu.
  4. 4. Molekula podľa nároku 3,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu je odvodená od proteínov p53, STÄT a NFkB.
  5. 5. Molekula podľa nároku 2,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu je odvodená od prokaryotického proteínu.
  6. 6. Molekula podľa nároku 5,vyznačujúca sa tým, že prokrayotickým proteínom je bakteriálny represor.
  7. 7. Molekula podľa nároku 6,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu je odvodená od proteínu tetR.
  8. 8. Molekula podľa nároku 6,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu je odvodená od proteínu Cro.
  9. 9. Molekula podľa niektorého z nárokov 2 až 8, vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu obsahuje oblasť interakcie s DNA uvedeného proteínu.
  10. 10. Molekula podľa niektorého z nárokov 2 až 8, vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu je tvorená úplným proteínom.
  11. 11. Molekula podľa nároku 10,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu je tvorená proteínom tetR.
  12. 12. Molekula podľa nároku 10,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná selektívne viazať definovanú DNA-sekvenciu je tvorená proteínom Cro.
  13. 13. Molekula podľa nároku l,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná špecificky viazať transaktivátor alebo transrepresor alebo transaktivátorový alebo transrepresorový komplex je oligomeračnou oblasťou.
  14. 14. Molekula podľa nároku 13,vyznačujúca sa tým, že oligomeračnou oblasťou je leucínový zips, oblasť SH3 alebo oblasť SH2.
  15. 15. Molekula podľa nároku 13,vyznačujúca sa tým, že oligomeračná oblasť schopná špecificky viazať transaktivátor je tvorená C-terminálnou častou proteínu p53.
  16. 16. Molekula podľa nároku 15,vyznačujúca sa tým, že oligomeračná oblasť je tvorená C-terminálnou časťou proteínu p53 začínajúc zbytkom 320 a končiac zbytkom 393 (SEQ ID n° 3), alebo začínajúc zbytkom 302 a končiac zbytkom 360 alebo začínajúc zbytkom 302 a končiac zbytkom 390.
  17. 17. Molekula podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná špecifický viazať transaktivátor alebo transrepresor alebo transaktivátorový alebo transrepresorový komplex je syntetickou alebo prírodnou oblasťou, o ktorej je známe, že vstupuje do interakcie s uvedeným transaktivátorom alebo tranrepresorom alebo transaktivátorovým alebo transrepresorovým komplexom.
  18. 18. Molekula podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná špecificky viazať transaktivátor alebo transrepresor alebo transaktivátorový alebo transrepresorový komplex je protilátkou alebo fragmentom alebo derivátom protilátky, ktoré sú nasmerované proti uvedenému transaktivátoru alebo transrepresoru alebo transaktivátorovému alebo transrepresorovému komplexu.
  19. 19. Molekula podľa nároku 18,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná špecificky viazať transaktivátor alebo transaktivátorový komplex je tvorená fragmentom Fab alebo F(ab)'2 protilátky alebo oblasťou VH alebo VL protilátky.
  20. 20. Molekula podľa nároku 18,vyznačujúca sa tým, že oblasť schopná špecificky viazať transaktivátor alebo transaktivátorový komplex je tvorená jednovláknovou protilátkou (ScFv) obsahujúcou oblasť VH spojenú s oblasťou VL ramenom.
  21. 21. Molekula podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že oblasť väzby na DNA a oblasť väzby na transaktivátor sú vzájomne spojené prostredníctvom ramena.
  22. 22. Molekula podľa nároku 21, vyznačujúca sa tým, že rameno je tvorené peptidom obsahujúcim 5 až 30 aminokyselín, výhodne 5 až 20 aminokyselín.
  23. 23. Molekula podľa nároku 22,vyznačujúca sa tým, že rameno je zvolené z množiny zahrňujúcej peptidy so sekvenciami SEQ ID n° 5 a SEQ ID n° 6.
  24. 24. Molekula podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že oblasť väzby na DNA je situovaná v N-terminálnej polohe, zatiaľ čo oblasť väzby na transaktivátor je situovaná v C-terminálnej polohe.
  25. 25. Molekula podľa niektorého z nárokov 1 až 23, v y značujúca sa tým, že oblasť väzby na DNA je situovaná v C-terminálnej polohe, zatiaľ čo oblasť väzby na transaktivátor je situovaná v N-terminálnej polohe.
  26. 26. Bišpecifická chimerická molekula majúca štruktúru
    ScFv-VSV/myc-Hinge-TET alebo Cro (obr. 5A).
  27. 27. Bišpecifická chimerická molekula majúca štruktúru
    ScFv-Hinge-TET alebo Cro (obr. 5B).
  28. 28. Bišpecifická chimerická molekula majúca štruktúru ScFv-TET alebo Cro (obr. 5C).
  29. 29. Bišpecifická chimerická molekula majúca štruktúru TET alebo Cro-ScFv (obr. 5D).
  30. 30. Bišpecifická chimerická molekula majúca štruktúru TET alebo Cro-Hinge-ScFv (obr. 5E).
  31. 31. Bišpecifická chimerická molekula majúca štruktúru Oligom-VSV/myc-Hinge-TET alebo Cro (obr. 5A), Oligom-Hinge-TET alebo Cro (obr. 5B) alebo Oligom-TET alebo Cro (obr. 5C).
  32. 32. Sekvencia nukleovej kyseliny kódujúcej chimerickú molekulu podľa niektorého z nárokov 1 až 31.
  33. 33. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že ide o sekvenciu DNA.
  34. 34. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 32 alebo 33, vyznačujúca sa tým,že tvorí súčasť vektora.
  35. 35. Systém podmienenej expresie génov zahrňujúci:
    - chimerickú molekulu definovanú v nárokoch 1 až 31 a
    - expresnú kazetu obsahujúcu regulačnú sekvenciu, minimálny transkripčný promótor a uvedený gén.
  36. 36. Systém podmienenej expresie podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že oblasť väzby na DNA chimerickej molekuly je tvorená celkom alebo časťou TetR a regulačná sekvencia obsahuje sekvenciu SEQ ID np 1 alebo derivát tejto sekvencie, ktoré sa prípadne niekoľkokrát opakujú.
  37. 37. Systém podmienenej expresie podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že oblasť väzby na DNA chimerickej molekuly je tvorená celkom alebo časťou Cro a regulačná sekvencia obsahuje sekvenciu SEQ ID n° 2 alebo jej derivát, ktoré sa prípadne niekoľkokrát opakujú.
  38. 38. Systém podmienenej expresie podľa niektorého z nárokov 35 až 37,vyznačujúci sa tým, že minimálny promótor obsahuje box TATA alebo INR.
  39. 39. Systém podmienenej expresie podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že minimálny promótor je odvodený od promótora génu tymidín-kinázy.
  40. 40. Systém podmienenej expresie podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že minimálny promótor je tvorený nukleotidmi -37 až +19 promótora génu tymidín-kinázy.
  41. 41. Vektor obsahujúci:
    - sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúci chimerickú molekulu podľa niektorého z nárokov 1 až 31 a
    - expresnú kazetu obsahujúcu regulačnú sekvenciu, minimálny transkripčný promótor a zainteresovanú kódujúcu sekvenciu.
  42. 42. Vektor podľa nároku 41,vyznačujúci sa tým, že minimálny transkripčný promótor je definovaný v nárokoch 38 až 40.
  43. 43. Vektor podľa nároku 41,vyznačujúci sa tým, že oblasť väzby na DNA chimerickej molekuly je tvorená celkom alebo časťou TetR a regulačná sekvencia obsahuje sekvenciu SEQ ID n° 1 alebo jej derivát, ktoré sa prípadne niekoľkokrát opakujú.
  44. 44. Vektor podľa nároku 41,vyznačujúci sa tým, že oblasť väzby na DNA chimerickej molekuly je tvorená celkom alebo časťou Cro a regulačná sekvencia obsahuje sekvenciu SEQ ID n° 2 alebo jej derivát, ktoré sa prípadne niekoľkokrát opakujú.
  45. 45. Vektor podľa niektorého z nárokov 41 až 44, vyznačujúci sa tým, že zainteresovanou kódujúcou sekvenciou je sekvencia DNA kódujúca terapeutický produkt.
  46. 46. Vektor podľa nároku 45, vyznačujúci sa tým, že terapeutickým produktom je toxický peptid alebo polypeptid.
  47. 47. Vektor podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že toxický terapeutický produkt je zvolený z množiny zahrňujúcej difterický toxín, toxín pseudomonas, ricín A, tymidín-kinázu, cytozín-deaminázu, proteín Grb3 a ScFv Y28.
  48. 48. Vektor, podľa niektorého z nárokov 41 až 47, v y značujúci sa tým, že ide o plazmidový vektor.
  49. 49. Vektor podľa niektorého z nárokov 41 až 47, v y značujúci sa tým, že ide o vírusový vektor.
  50. 50. Vektor podľa nároku 49,vyznačujúci sa tým, že ide o defektný rekombinantný adenovírus.
  51. 51. Vektor podľa nároku 49,vyznačujúci sa tým, že ide o rekombinantný defektný retrovírus.
  52. 52. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje aspoň jeden vektor podľa niektorého z nárokov 41 až 51.
  53. 53. Nukleová kyselina obsahujúca sekvenciu SEQ ID n° 4.
  54. 54. Molekula podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že transaktivátorom charakteristickým pre fyziologický alebo fyziopatologický stav je proteín vírusového, parazitného, mykobakteriálneho alebo bunkového pôvodu majúci transkripčnú transaktivačnú aktivitu.
  55. 55. Molekula podľa nároku 54,vyznačujúca sa tým, že transaktivátorom je vírusový proteín zvolený z množiny zahrňujúcej proteín Tat vírusu HIV, proteíny E6/EZ vírusu papilomu a proteín EBNA vírusu Epsteina a Barrovej.
  56. 56. Molekula podľa nároku 54,vyznačujúca sa tým, že transaktivátorom je bunkový proteín, výhodne mutovaný alebo divoký proteín p53.
  57. 57. Molekula podľa nároku l,vyznačujúca sa tým, že transaktivátorom alebo transaktivátorovým komplexom charakteristickým pre fyziologický alebo fyziopatologický stav je proteín vyskytujúci sa v infikovanej alebo hyperproliferačnej bunke.
SK1311-97A 1995-03-31 1996-03-29 Conditional expression system SK131197A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9503841A FR2732348B1 (fr) 1995-03-31 1995-03-31 Systeme d'expression conditionnel
PCT/FR1996/000477 WO1996030512A1 (fr) 1995-03-31 1996-03-29 Systeme d'expression conditionnel

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK131197A3 true SK131197A3 (en) 1998-05-06

Family

ID=9477639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1311-97A SK131197A3 (en) 1995-03-31 1996-03-29 Conditional expression system

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0817845A1 (sk)
JP (1) JPH11503011A (sk)
KR (1) KR19980703439A (sk)
AU (1) AU716748B2 (sk)
BR (1) BR9607928A (sk)
CA (1) CA2214451A1 (sk)
CZ (1) CZ308097A3 (sk)
FR (1) FR2732348B1 (sk)
HU (1) HUP9801221A3 (sk)
IL (1) IL117713A0 (sk)
NO (1) NO974449D0 (sk)
SK (1) SK131197A3 (sk)
TW (1) TW496873B (sk)
WO (1) WO1996030512A1 (sk)
ZA (1) ZA962506B (sk)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0878546A1 (en) * 1997-04-15 1998-11-18 Leadd B.V. A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or apoptin
EP0872552A1 (en) * 1997-04-15 1998-10-21 Leadd B.V. A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or Apoptin
US6881571B1 (en) 1998-03-11 2005-04-19 Exonhit Therapeutics S.A. Qualitative differential screening
FR2775984B1 (fr) * 1998-03-11 2006-09-15 Bioscreen Therapeutics Sa Criblage differentiel qualitatif
FR2755144B1 (fr) 1996-10-29 1998-11-27 Rhone Poulenc Rorer Sa Fragments d'anticorps a chaine unique anti-p53 et utilisation
CA2292760A1 (en) 1997-06-04 1998-12-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector
US7276488B2 (en) 1997-06-04 2007-10-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
US6479653B1 (en) * 1997-08-26 2002-11-12 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Compositions and method for regulation of transcription
AU3587599A (en) * 1997-11-28 1999-06-16 Invitrogen Corporation Single chain monoclonal antibody fusion reagents that regulate transcript ion in vivo
FR2782732A1 (fr) * 1998-08-28 2000-03-03 Transgene Sa Systeme d'expression inductible
US7691370B2 (en) 1998-10-15 2010-04-06 Canji, Inc. Selectivity replicating viral vector
AU1290001A (en) 1999-11-18 2001-05-30 Oxford Biomedica (Uk) Limited Antibodies
GB0015090D0 (en) * 2000-06-20 2000-08-09 Implyx Ltd Gene-activating conjugates
WO2003045415A2 (en) * 2001-11-26 2003-06-05 University Health Network Self-assembling p53 peptides as gene delivery vehicles
AU2003229998A1 (en) * 2002-05-10 2003-11-11 Medical Research Council Activation induced deaminase (aid)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0454781B1 (en) * 1989-01-23 1998-12-16 Chiron Corporation Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof
EP0665883A1 (en) * 1992-08-26 1995-08-09 Dnx Corporation Tetracycline repressor-mediated binary regulation system for control of gene expression in transgenic animals
GB9224784D0 (en) * 1992-11-26 1993-01-13 Univ Dundee Cellular protein
CA2165162C (en) * 1993-06-14 2000-05-23 Hermann Bujard Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US5866755A (en) * 1993-06-14 1999-02-02 Basf Aktiengellschaft Animals transgenic for a tetracycline-regulated transcriptional inhibitor
FR2710074B1 (fr) * 1993-09-15 1995-12-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Gène GRB3-3, ses variants et leurs utilisations.

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9801221A3 (en) 1999-09-28
CZ308097A3 (cs) 1998-01-14
EP0817845A1 (fr) 1998-01-14
ZA962506B (en) 1996-10-01
KR19980703439A (ko) 1998-11-05
AU716748B2 (en) 2000-03-02
CA2214451A1 (fr) 1996-10-03
AU5402096A (en) 1996-10-16
NO974449L (no) 1997-09-26
TW496873B (en) 2002-08-01
BR9607928A (pt) 1998-06-09
IL117713A0 (en) 1996-07-23
JPH11503011A (ja) 1999-03-23
HUP9801221A2 (hu) 1998-08-28
NO974449D0 (no) 1997-09-26
WO1996030512A1 (fr) 1996-10-03
FR2732348A1 (fr) 1996-10-04
MX9706928A (es) 1997-11-29
FR2732348B1 (fr) 1997-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU752129B2 (en) Chimeric transcriptional activators and compositions and uses related thereto
AU716748B2 (en) Conditional expression system
CA2224907A1 (en) Methods and means for targeted gene delivery
US20050233963A1 (en) Heat shock response and virus replication
CZ298806B6 (cs) Použití slouceniny schopné alespon cástecne inhibovat onkogenní aktivitu, virální vektor obsahujícísekvenci nukleové kyseliny kódující tuto slouceninu a farmaceutická kompozice obsahující tuto slouceninu
KR19980703454A (ko) 바이러스 벡터 및 과다증식성 질환, 특히 재발협착증을치료하기 위한 이의 용도
KR100501881B1 (ko) 피53단백질변이체및이의치료적용도
WO1997046680A1 (en) Dna encoding dp. 75 and a process for its use
CN114560915B (zh) 一种改造的高滴度SARS-CoV-2假病毒
WO1997011972A1 (en) Chimeric dna-binding/dna methyltransferase nucleic acid and polypeptide and uses thereof
WO1997011972A9 (en) Chimeric dna-binding/dna methyltransferase nucleic acid and polypeptide and uses thereof
CZ145599A3 (cs) Způsob obnovení translační aktivity závislé na p53 v buňkách, jednořetězcové protilátky proti p53 a DNA, které je kódují, jejich použití a prostředky, které je obsahují
WO1999061034A1 (en) Improved vectors
US20020188103A1 (en) Chimeric dna-binding/dna methyltransferase nucleic acid and polypeptide and uses thereof
JP2005502343A (ja) ヒト化バキュロウィルス
SK56198A3 (en) Use of protein gax for treating cancer
MXPA97006928A (es) Sistema de expresion condicional
KR20020057975A (ko) 유전자 도입 방법
SK51199A3 (en) Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use
CZ291533B6 (cs) Deriváty proteinu p62, nukleové kyseliny kódující tyto deriváty a farmaceutické kompozice, které je obsahují
SK146998A3 (en) Derived tyrosine hydroxylase gene expression system