KR19980703439A - 조건 발현 시스템 - Google Patents

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KR19980703439A
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사비나자끄
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Abstract

해당 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역 및 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 감지 영역을 포함하는 이중특이적 키메라 분자의 생성 및 발현을 사용한, 신규한 유전자 조건 발현 시스템.

Description

조건 발현 시스템
유전자 및 세포 치료는 결실 또는 이상(돌연변이, 이상 발현 등등)을 고치는 것 또는 유전 정보를 세포 또는 결함있는 기관내로 도입함에 의해 해당 치료 단백질의 발현을 보장하는 것으로 이루어진다. 상기 유전 정보는, 기관으로부터 추출한 세포내로 생체밖 도입하고 이후, 변형된 세포를 체내로 재도입함에 의하거나(세포 치료) 적절한 조직으로 직접 생체내 도입함에 의하여(유전자 치료), 도입될 수 있다. 유전자를 도입하기 위한 다양한 기술들이 존재하는데, 이들 중에는 천연 또는 합성의 화학 또는 생화학 벡터, 예를 들면, DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체[참고문헌; Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], DNA 및 핵 단백질의 복합체[참고문헌; Kaneda et al., Science 243 (1989) 375], DNA 및 지질의 복합체[참고문헌; Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413], 리포좀의 사용[참고문헌; Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431], 양이온성 지질 등을 수반하는 다양한 형질감염 기술들이 있다. 또 다른 기술은, 유전자를 도입하기 위한 벡터로서 바이러스의 사용에 기초를 둔다. 이러한 점에서, 다양한 바이러스들이 일정 세포 군을 감염시킬 수 있는 능력이 있는지 시험되어왔다. 특히, 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노-수반 바이러스 및 아데노 바이러스가 시험되었다. 그러나, 이러한 유전자 및 세포 치료의 발전을 위한 큰 문제점 중의 하나는, 치료의 선택성에 있다. 적용에 따라서는, 도입되는 유전자에 좌우하여, 치료 효과를 집중시키고 전이 및 부작용을 제한하기 위하여 체내의 일정 조직 또는 일정 부분으로만 표적할 수 있는 것이 중요하다. 이러한 표적화는 주어진 세포에 특이성을 가지는 벡터를 사용함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 접근은 일정한 세포 유형에 특이적인 발현 시그널을 이용하는 것으로 이루어진다. 이러한 점에서, 소위 특이적 프로모터가 문헌에 기술되어왔는데, 상기는 피루베이트 키나아제, 빌린, GFAP를 암호화하는 유전자의 프로모터, 지방산-결합 장 단백질에 대한 프로모터, 평활근 세포의 α-액틴에 대한 프로모터 또는 apo-AI, apo-AII 및 인간 알부민 유전자의 프로모터 등이다. 그러나, 이들 프로모터들은 일정한 불리점을 가지고 있으며, 특히 그들은 독성 유전자의 발현에 대해 붕괴될 수 있는 전사 주변 효과를 가지며, 일부 세포에 한정되며, 따라서 임의의 적용에 사용될 수 없다.
본 발명은 특별히 선택적이고 효과적인 유전자 발현을 위한 새로운 조건 시스템을 기술한다. 본 발명의 시스템에서의 유리한 특징은 세포 유형에 따라서가 아니라, 특이적 세포내 요소 또는 특이적 생리학적 상황의 존재에 따라서 유전자를 발현하는 성능에 존재한다. 이 시스템은 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역(domain)과 트랜스활성제(transactivator) 및 트랜스활성 복합체(transactivating complex)에 특이적으로 결합할 수 있는 탐지 영역으로 이루어진 이중특이적 키메라 분자 (bispecific chimeric molecule)를 수반한다.
보다 상세하게, 본 발명의 첫째 특징은, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역과 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스 활성 또는 트랜스 억제 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 전형적인 영역으로 이루어진 이중특이적 키메라 분자의 창출과 발현에 있다.
본 발명의 또 다른 특징은 상기에서 정의된 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터의 임의의 발현으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 특징은, (i) 상기에서 정의된 키메라 분자 및 (ii) 조절 서열, 최소한의 프로모터(이의 활성은 트랜스활성제의 존재에 좌우된다.) 및 상기 유전자로 구성되는 발현 카세트로 이루어진 유전자의 발현을 위한 조건 시스템으로 이루어진다.
또한, 본 발명의 특징은 상기에서 정의된 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 상기 발현 카세트로 이루어진 발현 벡터로 이루어진다.
본 발명의 조건 발현 시스템은, 해당 유전자의 발현을 매우 선택적으로 표적화하기 위하여, 유전자 또는 세포 치료에서의 사용에서 특히 적절하다.
따라서, 본 발명의 시스템의 구성요소의 하나는 규정된 DNA 서열에 결합할 수 있는 영역 및 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 영역으로 이루어진 이중특이적 키메라 분자이다. 본 발명의 이중특이적은, 한 편으로는 규정된 DNA 서열(일반적으로 지정된 오퍼레이터 서열 또는 조절 서열)에 결합할 수 있는 그들의 능력 및, 다른 한편으로는, 유전자의 발현을 유도하거나 억제할 수 있는 트랜스활성 또는 트랜스억제 단백질을 특이적으로 회복(recruitment)할 수 있는 그들의 능력에 놓여 있다.
보다 상세하게, 본 발명은 활성 또는 불활성에 의해서 생리병리적 상황을 유도하는 임의의 전사 인자의 회복을 허용케하는, 이중특이적 키메라 분자의 개발에 관한 것이다. 이리하여, 본 발명의 이중특이적 키메라 분자는 생리병리적 상태에 특이적인 트랜스 전사 활성제의 선택적인 회복을 허용하고, 이들 전사 인자를 프로모터 근처에 위치한 규정된 DNA 서열과의 부착을 통해서 프로모터에 부착케 하고, 따라서 유전자의 조건 발현을 허용한다.
또한, 본 발명은 트랜스활성 영역을 나르는 분자가 아니라, 트랜스활성 전사 복합체를 나르는 분자, 즉, 세포내에 존재하는 표적 분자와 트랜스활성 영역을 나르는 분자 사이에 형성된 복합체(도 2)를 회복케하는 이중특이적 키메라 분자의 개발에도 관련된다. 이러한 경우에, 트랜스활성 복합체는 트랜스활성 영역 및 세포 분자에 결합하는 선택적 영역으로 구성된 이차 이중특이적 키메라 분자의 수단에 의해 바람직하게 형성된다. 이러한 이차 분자의 부착은 트랜스활성 전사 이원 복합체의 형성을 허락하며, 이후 이 복합체는 본 발명의 탐지 시스템에 의해 회복된다. 이렇게 해서, 프로모터 근처에서의 이러한 삼원 복합체의 부착은 유전자의 조절된 발현을 허락한다. 상기 유형의 작제물은 트랜스활성 영역이 결핍된 임의의 세포내 분자(내생 분자이든 감염원의 분자이든 관계없이)를 탐지하도록 본 발명의 시스템을 이용하는 조건을 유리하게도 연장시킬 수 있다.
이리하여, 본 발명의 시스템은 매우 선별적인 탐지 시스템(센서)에 의하여, 표적 단백질이 존재하는 경우에야만 해당 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. 이들은 생리적 또는 생리병리적 상황 동안에 나타나는 전사 인자일 수도 있고, 또는 예컨대 임의의 내생 분자이거나 임의의 감염원 분자일 수 있다. 더욱이, 본 발명의 시스템은, 유전자의 발현이 세포내 임의의 분자의 존재, 출현 또는 사라짐에 기초하도록 가능케하는 매우 민감하고 매우 선별적인 탐지 성분을 포함한다.
본 발명의 범주내에서, 트랜스활성제란 용어는 임의의 트랜스활성 전사 인자 또는 트랜스활성 전사 영역을 포함하는 임의의 단백질을 의미한다. 트랜스활성 복합체는 세포내 존재하는 분자와 트랜스활성 영역 및 상기 분자에 특이적으로 결합하는 영역을 포함하는 이중특이적 분자 사이에 형성되는 복합체를 의미한다. 본 발명의 발현 시스템은 임의의 트랜스활성 단백질 또는 트랜스활성 영역을 나르는 임의의 단백질을 회복하는데 사용될 수 있으며, 특히, 트랜스활성 전사 활성을 지닌 바이러스, 기생체, 미코박테리아 또는 세포 기원의 임의의 단백질을 회복하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 기원의 전사 인자 중에는, 특히 HIV 바이러스의 Tat 단백질, 파필로마 바이러스의 E6/E7 단백질 또는 엡스테인 바르 바이러스의 EBNA 단백질을 언급할 수 있다. 이들 단백질은 트랜스활성 전사 영역을 지니며, 이들 바이러스에 감염된 세포내에서만, 즉, 특별한 생리병리적 상황하에서만 존재한다. 본 발명에 따른 조건 발현 시스템은 편리하게도 생리적 상황의 탐지(바이러스 감염에 대해 특이적인 이들 트랜스활성제의 출현)를 허락하며, 주어진 유전자(들)의 선택적인 발현을 유도케한다. 세포성 단백질 중에는, 변이형 또는 야생형 p53 단백질이 바람직하게 언급될 수 있다. p53 단백질은 393개의 아미노산으로 구성된다. 이의 야생형은 세포 분열과 생장을 역으로 조절(즉, 억제)할 수 있는 종양 억제자이다. 이의 활성은 p53 단백질의 구조에서 N-말단 영역(대략 1-100 잔기)에 위치하는 트랜스활성 전사 영역의 존재에 연결된다. 특정 상황에서, 야생형 p53은 또한, 애팝토시스[참고문헌; Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991]를 유도할 수도 있다. 이들 성질들은 세포성 DNA의 상태가 위협받는 스트레스 상황에서 보여지는 것으로 주어져, p53은 게놈의 수호자로 제안되고 있다. 모든 유형을 망라하는 약 40%의 인간 종양에서의 돌연변이된 p53의 존재는 이들 유전자의 돌연변이가 종양 전개과정에서 아마도 중요한 역할을 하였을 것이라는 가설을 강화하며 강조한다[참고문헌; Montenarh, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3175, 1992; Zambetti and Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993]. 본 발명의 얼개내에서, p53 단백질의 트랜스활성 영역을 선택적으로 회복할 수 있고, 따라서, 이러한 단백질을 함유하는 세포내에서만 유전자(들)의 조절된 발현을 유도할 수 있다. 세포의 과다증식(암 유형)의 생리병리적 상황에서 존재하는, 상기에서 지적한 바와 같은 변형된 p53 단백질 유형을 특별히 회복하는 것이 본 발명의 특히 유리한 점이다. 이러한 표적화는 p53단백질의 변이된 형태에 대해 특이적인 결합 영역에 의해 바람직하게 이루어질 수 있다. 그러나, 야생형보다 더 긴 수명을 가지는 변이형의 축적이라는 실제적 특별성이 있다.
또한, 본 발명의 시스템은 세포에 존재하는 임의의 표적 분자를 탐지함으로써, 유전자(들)의 선택적 발현을 유도하는데 사용될 수도 있다. 탐지된 단백질은 바람직하게는 이상 상황(감염, 과다증식 등)에서 세포에 출현하는 단백질이다. 그들은 바이러스, 특히, HIV, 헤파티티스 또는 허프스 바이러스 등의 구조 또는 기능 단백질과 같은 특별한 바이러스성 단백질에 있을 수 있다. 또한, 그들은 특히, myc, fos 및 jun 단백질, 사이클린 등과 같이 세포의 과다증식 상태를 위한 특수한 단백질일 수도 있다.
따라서, 본 발명의 키메라 분자의 성질 중 하나는 특별한 DNA 부위(region)(작동 또는 조절 영역)에 결합할 수 있는 그들의 능력에 있다. 상기 결합은 트랜스활성 영역이 프로모터에 근접하도록 가능케하며, 그 결과 상기 프로모터의 조절하에 위치된 유전자의 발현을 활성화시킨다.
본 발명의 분자내에 존재하는 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역은 근본적으로 단백질 기원을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 영역은 DNA 서열과 상호작용할 수 있는 원핵 또는 진핵 세포 단백질로부터 유래된다. 수많은 유전적 및 구조적 연구에 의해 이중 가닥의 DNA 서열과 상호작용하는 단백질내에서 이러한 상호작용에 책임을 지는 영역을 자세하게 규명할 수 있었다.
이중 가닥의 DNA 서열과 상호작용하는 원핵 세포 단백질 중에는 특히 박테리아 억제제, 바람직하게는 E. coli의 테트라사이클린 억제제와 박테리아파지 람다의 Cro 억제제를 언급할 수 있다.
E. coli의 테트라사이클린 억제제(tetR)는 약 210개의 아미노산으로 이루어진 단백질이다. E. coli 내에서, tetR은 tet 오페론 내에서 이러한 항생물질에 대한 내성을 매개하는 유전자의 전사를 역으로 조절한다. 테트라사이클린의 부재에서, tetR 억제제는 특정 서열 레벨에서 DNA에 부착하며, 내성 유전자의 전사를 억제한다. 반대로, 테트라사이클린이 존재하는 경우에는, tetR 억제제는 더이상 tetop 작동 영역에 부착되지 않아서, 유전자의 계속적인 전사를 허용한다[참고문헌; Hillen, W. and Wissman, A. (1989) in Protein-Nucleic Acid Interaction. Topics in Molecular and Structural Biology. eds, Saenger, W. and Heinemann, U. (Macmillan, London), Vol. 10, pp. 143-162]. tetR 서열은 공개되었다[참고문헌; WO94/04682]. DNA(Tetop)로 tetR이 결합하기 위한 특정 이중 가닥 DNA 서열은 하기의 단위로 구성되어 있다:
TCTCTATCACTGATAGGGA (서열 번호. 1)
상기 단위는 본 시스템의 친화도 및 효율을 증가하기 위하여 여러 회 반복될 수 있다. 따라서, 조절 서열은 10 단위까지 포함할 수도 있고, 바람직하게는 2 단위(Tetop2) 또는 7 단위(Tetop7)를 포함한다(도 3).
Cro 단백질은 CI 억제제의 발현의 조절자로서 초기에 정의되었다[참고문헌; Eisen, H. et al (1970) PNAS 66, pp. 855]. cro 유전자의 클로닝은 66 아미노산의 단백질(서열 번호. 21)의 규명을 가능케한다[참고문헌; Roberts, T. et al (1977) Nature 270, pp. 274]. Cro는 람다 OR3오퍼레이터에 바람직하게 부착함으로써 생리적 역할을 수행한다.
DNA(OR3로 명명된 영역)로 Cro가 결합하기 위한 특정 이중 가닥 DNA 서열은 하기의 염기로 구성되어 있다:
TATCACCGCAAGGGATA (서열 번호. 2)
상기 영역은 또한, 본 시스템의 친화도 및 효율을 증가시키기 위하여 여러 회 반복될 수 있다(도 4).
이중 가닥 DNA 서열과 상호작용하는 진핵 세포 단백질중에서, STAT, p53 또는 NFkB 단백질로부터 유도된 단백질 또는 영역이 본 발명의 분자를 작제하는데 바람직하게 사용된다[참고문헌; Inoue et al., PNAS 89 (1992) 4333]. p53 단백질에 관하여, DNA-결합 영역은 단백질의 중심부에 자리잡으며, 보다 상세히는 아미노산 102번 및 292번 사이의 부위이다[참고문헌; Pavletich et al., Genes Dev. 7 (1993) 2556].
상기 지적한대로, 본 발명의 분자내에 존재하는 규정된 DNA 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 영역은 바람직하게, 이중 가닥의 DNA 영역과 상호작용할 수 있는 원핵 또는 진핵 세포 단백질로부터 유래된다. 본 발명의 분자를 작제하는데 사용되는 영역은 전체 단백질 또는 DNA와 상호작용할 수 있는 영역을 포함하는 이의 단편으로 구성될 수 있다. 상기 영역은 다양한 단백질 및 특히 TetR로 확인된다[참고문헌; Berens et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 1945]. 이는 또한, 이 단백질의 유도체 또는 보존된 DNA-결합 성질을 가진 단편으로 구성될 수도 있다. 상기 유도체는 특히, 하나 이상의 아미노산이 변형을 보이는 단백질이며, 예를 들면, 본 발명의 분자의 다른 영역과 융합하도록 하기 위하여, 통상의 분자 생물학적 기술에 따라 제조된다. TetR 및 Cro 단백질의 유도체는, 예를 들면, 점 돌연변이 및/또는 결실을 지닌 것으로 문헌에 기술되어 있다[참고문헌; Hecht et al., J. Bact. 175 (1993) p. 1206; Altschmied et al., EMBO J 7 (1988) 4011; Baumeister et al., Proteins 14 (1992) 168; Hansen et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 14030]. 규정된 DNA 서열에 결합하기 위한 이들 유도체의 능력은 유도체를 조절 서열과 함께 준비하여 배양하여, 복합체가 형성되는지를 탐지함에 의해 시험될 수 있다. 게다가, 유도체는 또한, 증가된 DNA-결합 성질(특히, 친화도 등)을 가지는 단백질일 수도 있다.
바람직한 양태에 따라, 본 발명의 분자내에 존재하는 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역은 원핵 세포 단백질로부터 유래된다. 상기 작제물의 유형은 특히, 비인간 기원의 단백질이기 대문에 유리하며, 적어도 14개의 핵산의 이중 가닥 DNA좌(site)를 인식한다. 인간 게놈 내에서 동일 서열을 찾을 가능성은 실제로 0이며, 따라서 수득된 발현 시스템은 더욱 선택적이다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 분자내에 존재하는 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역은 tetR 또는 Cro 단백질로부터 유래된다. 완전한 tetR 또는 Cro 단백질을 사용하는 것이 가장 유리하다.(서열 번호. 21)
본 발명의 분자내에 존재하는 트랜스 전사 활성제 또는 트랜스 전사 활성 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 영역은 다양한 유형일 수 있다. 이는 특히 올리고머 영역일 수 있으며, 이 경우 표적화된 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체는 또한 상기 영역을 포함한다. 이는 또한 상기 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체와 상호작용하는 것으로 알려진 임의의 합성 또는 천연 영역일 수도 있다. 대안적으로는, 이는 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체로 지향된 항체 또는 항체 단편 또는 유도체일 수도 있다.
본 발명의 범위내에서 사용될 수 있는 올리고머 영역중에는, 예를 들면, 류신 지퍼, SH2 영역 및 SH3 영역을 특히 언급할 수 있다. 류신 지퍼는 7개의 아미노산마다 4 또는 5 개의 류신을 포함하는 양방향 α 헬릭스 구조이다. 이런 주기성은 α 헬릭스 상의 거의 동일 위치에 류신을 배치시킬 수 있게 한다. 다이머화는 인접하는 두 개의 지퍼 영역의 양측 류신 체인간의 소수성 상호작용에 의해 유지된다[참고문헌; Vogt et al., Trends in Bioch. Science 14 (1989) 172]. SH2 영역은 타이로신의 인산화된 특이적 펩티드 서열과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. SH3 영역은 상응하는 프롤린-풍부 펩티드를 포함하는 임의의 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체와 함께 올리고머를 형성하는데 사용될 수 있다[참고문헌; Pawson et al., Current Biology 3 (1993) 434]. 또한, 올리고머화를 유도하는 것으로 알려진 단백질 부위, 예컨대 특히, p53 단백질의 C-말단 부위를 사용하는 것도 가능하다. 상기 부위를 사용함으로써, 세포내에 존재하는 p53 단백질를 선택적으로 회복하는 것이 가능하다. 320 내지 393(서열 번호. 3), 302 내지 360 또는 302 내지 290 사이의 p53 부위가 본 발명의 범주내에서 바람직하게 사용된다.
표적 트랜스활성 성분을 포함하는 분자와 상호작용하는 것으로 알려진 합성 또는 천연 영역중에는, p53 단백질과 상호작용하는 MDM2 단백질의 부위를 예로 언급할 수 있다. 이런 유형의 작제물은 p53 단백질의 야생형 또는 변이형을 트랜스활성제로서 회복할 수 있게 해준다.
본 발명의 트랜스 전사 활성제에 특이적으로 결합하는 바람직한 영역은 항체 또는 항체 단편 또는 유도체로 이루어진다. 항체 단편 또는 유도체는 예컨대, Fab 또는 F(ab)'2 단편, 항체의 VH 또는 VL 부위 또는 대안적으로는 VL 부위에 팔(arm)에 의해 연결된 VH 부위를 포함하는 단일 체인 항체(ScFv)이다. 이런 유형의 영역은 임의의 분자로 향해질 수 있기 때문에 특히 유리하다.
항체, 면역글로불린 상위계열의 분자는 상이한 영역(가변성 영역(V), 연결 영역(J), 등등)으로 이루어진 상이한 체인(2개의 헤비 체인(H) 및 2 개의 라이트 체인(L)으로 구성된다. 본 발명의 분자내에 존재하는 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체에 결합하는 영역은 적어도 항원 결합좌를 포함하는 항체 단편 또는 유도체로 이루어진다. 상기 단편은 라이트 체인의 가변성 영역(VL) 또는 헤비 체인의 가변성 영역(VH) 일 수 있으며, 임의로 Fab 또는 F(ab)'2 단편의 유형, 또는 바람직하게는 단일-체인 항체(ScFv)의 유형일 수 있다. 본 발명의 분자를 작제하는데 사용되는 단일-체인 항체는, 항체의 헤비 체인의 가변성 결합좌에 상응하는 펩티드에 펩티드 팔에 의해 연결된, 항체의 라이트 체인의 가변성 부위의 결합좌에 상응하는 펩티드로 이루어진다. 본 발명에 따라 변형된 항체를 암호화하는 핵산 서열의 작제물은 예를 들면, 미국 특허 4,946,778 또는 출원 WO94/02610, WO94/29446호에 기술되어 있다. 이는 예로 예시된다.
본 발명에 따른 바람직한 작제물은 p53 단백질에 결합할 수 있는 영역을 포함한다. 이는 더욱 바람직하게는, p53 단백질에 지향된 항체 유도체이다. 특이적인 양태는 p53에 지향된 단일-체인 항체로 이루어진다. 특이적 예에 따르면, 서열 번호. 4의 ScFv는 실시예에서 기술되는 작제물에 사용된다.
DNA 결합 영역 및 트랜스활성제-결합 영역은 일반적으로 팔을 통해 서로 연결된다. 이 팔은 자동적으로 기능하는 본 발명의 분자의 두 개의 영역을 위해 충분한 가요성을 제공하는 펩티드로 일반적으로 이루어진다. 이러한 펩티드는 일반적으로, 본 발명의 분자의 활성을 간섭하지 않는 비하전된 아미노산으로 이루어지는데, 예를 들면, 글리신, 세린, 트립토판, 리신 또는 프롤린이다. 팔은 일반적으로 5 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 20개의 아미노산으로 이루어진다. 본 발명의 분자의 작제물에 사용될 수 있는 펩티드 팔의 예로는,
-GGGGSGGGGSGGGGS (서열 번호. 5)
-PKPSTPPGSS (서열 번호. 6)이고, 후자를 암호화하는 서열은
CCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCA (서열 번호. 6)이다.
본 발명에 따른 분자의 바람직한 예는 특히 하기의 분자들이다:
a) ScFv-tag-Hinge-TET 또는 Cro (도 5a)
이 유형의 분자는,
단일-체인 항체를 구성하는 트랜스활성제에 결합하는 영역,
분자의 면역학적 탐지를 가능케하는 모노클론 항체에 의해 인식되는 tag 펩티드 서열을 포함한다. 이 서열은 예를 들면, MNRLGK 서열 (서열 번호. 7)(이를 암호화하는 서열은 ATGAACCGGCTGGGCAAG 서열 번호. 7)의 VSV 에피톱 또는 EQKLISEEDLN 서열(서열 번호. 8)(이를 암호화하는서열은GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT)의 모익(moic) 에피톱일 수 있고, 이는 9E10 항체에 의해 인식된다.
-서열 번호. 6(Hinge) 서열의 펩티드 팔 및
TET 또는 Cro 단백질로 이루어진 DNA-결합 영역. 바람직하게는, ScFv는 p53 단백질로 지향된다.
b) ScFv-Hinge-TET 또는 Cro (도 5b)
이 유형의 분자는 tag 서열이 부재한 것을 제외하고는 a) 분자와 동일한 요소로 이루어진다.
c) ScFv-TET 또는 Cro (도 5c)
이 유형의 분자는 단일-체인 항체로 이루어진 트랜스활성제 및 TET 또는 Cro 단백질로 이루어진 DNA-결합 영역에 결합하기 위한 영역을 단순히 포함한다. 이 분자는 팔(arm)과 택(tag) 서열 모두를 포함하지 않는다. 이러한 작제물에서, 트랜스활성제-결합 영역은 분자의 N-말단부내에 위치되며, DNA-결합 영역은 C-말단부내에 위치된다.
d) TET 또는 Cro-ScFv (도 5d)
이 유형의 분자는 상기 c) 유형과 유사하다. 차이점이라면, 본질적으로 영역의 배열에 있는데, 트랜스활성제-결합 영역은 분자의 C-말단부내에 위치되고, DNA-결합 영역은 N-말단부내에 위치된다.
e) TET 또는 Cro-Hinge-ScFv (도 5e)
이 유형의 분자는 상기 b) 분자와 같은 동일한 요소를 포함한다. 차이점이라면, 본질적으로 영역의 배열에 있는데, 트랜스활성제-결합 영역은 분자의 C-말단부내에 위치되고, DNA-결합 영역은 N-말단부내에 위치된다.
f) Oligom-tag-Hinge-TET 또는 Cro (도 5a)
이 유형의 분자는 서열 번호. 3의 p53 단백질로의 올리고머화를 위한 영역에 의해 치환된 트랜스활성제-결합 영역을 제외하고는 a) 유형과 유사하다. 이 분자는 종양 세포에서 출현하는 변이된 p53 단백질을 회복할 수 있다.
g) Oligom-Hinge-TET 또는 Cro (도 5b)
이 유형의 분자는 서열 번호. 3의 p53 단백질로의 올리고머화를 위한 영역에 의해 치환된 트랜스활성제-결합 영역을 제외하고는 b) 유형과 유사하다.
h) Oligom-TET 또는 Cro (도 5c)
이 유형의 분자는 서열 번호. 3의 p53 단백질로의 올리고머화를 위한 영역에 의해 치환된 트랜스활성제-결합 영역을 제외하고는 c) 유형과 유사하다.
i) TET 또는 Cro-Oligom (도 5d)
이 유형의 분자는 서열 번호. 3의 p53 단백질로의 올리고머화를 위한 영역에 의해 치환된 트랜스활성제-결합 영역을 제외하고는 d) 유형과 유사하다.
j) TET 또는 Cro-Hinge-Oligom (도 5e)
이 유형의 분자는 서열 번호. 3의 p53 단백질로의 올리고머화를 위한 영역에 의해 치환된 트랜스활성제-결합 영역을 제외하고는 e) 유형과 유사하다.
더군다나, 이 분자의 각각에서, 펩티드 팔은 (G4S)3 (서열 번호. 5) 서열에 의해 용이하게 치환될 수 있다.
본 발명의 또 다른 주제는 상기에서 언급한 바 있는 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열에 존재한다. DNA, 특히 cDNA 서열이 유리하다. 또한 RNA 일 수도 있다. 본 발명의 서열은 통상적인 분자 생물학 기술에 따라 다양한 영역을 암호화하는 서열을 클로닝 벡터내로 어셈블링함에 의해 일반적으로 작제될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 안정되고/거나 다기능적이고/거나 축소된 크기이고/거나 세포내 분획내에 그들의 위치를 촉진할 목적을 지니는 영역을 만들기 위해서, 화학적으로, 효소학적으로 또는 유전적으로 임의로 변형될 수 있다. 이리하여, 본 발명의 핵산 서열은 핵 위치 펩티드(NLS)를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 특히, 펩티드 서열이 PKKKRKV (서열번호. 9)인 SV40 바이러스 NLS를 암호화하는 서열을 본 발명의 서열내로 융합할 수 있다[참고문헌; Kalderon et al., Cell 39 (1984) 499].
본 발명에 따른 핵산 서열은 유리하게도 플라즈미드 또는 바이러스 특질일 수 있는 발현 벡터의 일부이다.
본 발명의 또 다른 주제는 펩티드 팔에 의해 임의로 연결되는 트랜스 전사 활성제 영역 및 해당 분자에 특이적으로 결합하는 영역, 뿐만 아니라, 상기 융합을 암호화하는 임의의 핵산 서열을 포함하는 융합 단백질에 있다. 트랜스활성제 영역은 p53, VP16, EBNA, Et/e7, Tat 등과 같은 임의의 트랜스 전사 활성제로부터 유도될 수 있다.
본 발명의 또 다른 주제는 상기에 정의된 키메라 분자, 및 조절 서열, 최소한의 전사 프로모터 및 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 유전자의 조건 발현 시스템으로 이루어진다.
발현 카세트는 이중특이적 분자에 의해 회복된 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체에 의해 유전자의 발현의 활성을 위해 필요한 성분을 함유한다. 이리하여, 조절 서열은 발현되는 키메라 분자의 DNA 결합 서열이다. 키메라 분자의 DNA-결합 영역이 TetR의 전부 또는 일부에 의해 표현될때, 조절 서열은 임의로 여러 회 반복된 서열 번호. 1 또는 이의 유도체 서열을 포함한다. 이는 바람직하게는 op2 (2회 반복된 Tetop 단위를 포함) 또는 Op7서열 (7회 반복된 Tetop 단위를 포함)이다[참고문헌; Weinmann et al., The Plant Journal 5 (1994) 559]. 유사하게, 키메라 분자의 DNA-결합 영역이 Cro의 전부 또는 일부로 표현될때, 조절 서열은 임의로 여러 회 반복된 서열 번호. 2 또는 이의 유도체 서열을 포함한다. 이는 바람직하게 OR3 서열이다. 서열 번호. 1 및 2의 서열의 유도체는 유전적 특질(돌연변이, 결실, 첨가, 반복 등)의 변형에 의해 수득되며 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 성능을 가지고 있는 임의의 서열일 수 있다. 이러한 유도체는 문헌[참고문헌; Baumeister et al., cited above, Tovar et al., Mol. Gen. Genet. 215 (1988) 76, WO94/04672]에 기술되어 있다.
최소한의 전사 프로모터에 관해서, 이의 활성은 트랜스활성제의 존재에 의해 좌우되는 프로모터이다. 그러하기 때문에, 키메라 분자의 분재하에서 프로모터는 불활성이며, 고로 유전자는 발현되지 않거나 아주 미미하게 발현된다. 반면에, 키메라 분자의 존재하에서는, 회복된 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체는 최소한의 프로모터의 활성을 유도시킬 수 있고 따라서, 해당 유전자의 발현을 가능케한다. 최소한의 프로모터는 일반적으로 INR 또는 TATA 박스로 이루어진다. 이들 구성 성분은 또한, 트랜스활성제의 존재하에서 유전자의 발현을 위해 필요한 최소한의 구성 성분이다. 최소한의 프로모터는 유전적 변형에 의해 임의의 프로모터로부터 제조될 수 있다. 후보 프로모터의 바람직한 예에 의하면, 티미딘 키나아제 유전자의 프로모터가 언급될 수 있다. 더 자세히는, -37 부터 +19 까지의 뉴클레오티드로 이루어진 TK 프로모터로부터 유도된 최소한의 프로모터로부터 유리한 결과가 수득된다. 최소한의 프로모터는 또한, 인간 CMV로부터 유도될 수 있다. 특히, CMV의 -53 부터 +75 또는 -31 부터 +75의 뉴클레오티드 단편으로 이루어질 수 있다. 하지만, 임의의 통상적인 프로모터, 예를 들면, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, β-갈락토시다아제 또는 대안적으로 루시퍼라아제를 암호화하는 유전자의 프로모터가 사용될 수 있다.
발현 카세트는 유리하게도 하기의 요소로 이루어진다:
-조절 서열로서, 임의로 여러 회 반복된 서열 번호. 1 또는 2 또는 이의 유도체 서열로 이루어진 서열,
-최소한의 프로모터로서, 티미딘 키나아제(TK) 유전자의 프로모터로부터 유도된 프로모터,
-해당물을 암호화하는 서열.
더욱 바람직하게는, 최소한의 프로모터는 티미딘 키나아제 유전자의 프로모터의 -37 부터 +19까지의 부위로 이루어진다.
유리하게도, 발현 카세트는 Tetop2. TK-유전자; Tetop7. TK-유전자 또는 OR3.TK-유전자 구조의 카세트로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 특징은 상기에서 정의된 키메라 분자 및 발현 벡터를 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 발현 벡터에 있다. 본 발명의 벡터에서, 키메라 분자 및 발현 카세트를 암호화하는 핵산 서열은 정방향 또는 역방향으로 삽입될 수 있다. 더군다나, 벡터는 플라즈미드 또는 바이러스 특질일 수 있다.
바이러스 벡터 중에서, 보다 특히 아데노바이러스, 레트로바이러스, 허프스 바이러스 또는 대안적으로 아데노-결합된 바이러스를 언급할 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스는 결함있는데, 즉, 표적 세포내에서 자동적으로 증식할 수 없다. 따라서, 일반적으로, 본 발명의 범주내에서 사용되는 결함있는 바이러스의 게놈은 감염 세포내에서의 상기 바이러스의 복제를 위해 적어도 필요한 서열을 가지고 있지 않다. 이들 부위는 특히 본 발명의 서열 및 기타 서열에 의해 제거(완전히 또는 부분적으로) 또는 비기능화 또는 치환될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 결함있는 바이러스는 바이러스 입자의 캡슐화를 위해 필요한 게놈 서열을 바람직하게 보존하고 있다.
보다 특히 아데노바이러스에 관해, 구조와 성질면에서 다소 차이있는 다양한 혈청형이 규명되어 있다. 이들 혈청형 중에서, 인간 아데노바이러스 2 또는 5 유형(Ad 2 또는 Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(참조; WO94/26914)의 사용이 본 발명의 범주내에서 바람직하다. 본 발명의 범주내에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중에는, 캐나인, 보바인, 뮤린[참조문헌; MAV1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81], 오바인, 포르사인, 아비안 또는 대안적으로 시미안(예: SAV)기원의 아데노바이러스가 언급될 수 있다. 동물 기원의 아데노바이러스는 캐나인 아데노바이러스가 바람직하고, CAV2 아데노바이러스[예: manhattan strain 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]가 보다 바람직하다. 바람직하게는, 인간 또는 캐나인 또는 혼합된 기원의 아데노바이러스가 본 발명의 범주내에서 사용된다.
바람직하게, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 게놈은 적어도 아데노바이러스의 ITRs 및 캡슐화 부위, 및 상기 정의된 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열 및 발현 카세트를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스 게놈내에서, 적어도 E1 부위는 비기능적이다. 고려되는 바이러스 유전자는 당업계에서 알려진 임의의 기술, 특히, 전체 억압, 치환(예를 들면, 본 발명의 서열에 의해), 부분 결실, 고려되는 유전자내에 한 두 개의 염기 첨가에 의해 비기능적으로 될 수 있다. 상기 변형은 시험관내에서(분리된 DNA 상에서) 또는 현장에서(in situ)에서 예를 들면, 유전공학기술 또는 대안적으로는 돌연변이약제의 처리에 의해 수득될 수 있다. 다른 부위, 특히 E3(WO95/02697), E2(WO94/28938), E4(WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) 및 L5(WO95/02697) 부위가 또한 변형될 수 있다. 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 또는 E4 부위내에 결실을 포함한다. 또 다른 양태에 따라, E4 부위 및 본 발명의 서열(참조; FR 94 13355)로 삽입되는 수준에서 E1 내에 결실을 포함한다.
본 발명에 따른 결함있는 재조합 아데노바이러스는 당업계에 알려진 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다[참고문헌; Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO. J. 3 (1984) 2917]. 특히, 그들은 아데노바이러스와 본 발명의 DNA 서열(키메라 분자를 암호화하는 서열 + 발현 카세트)을 운반하는 플라즈미드 사이의 알리아(alia)를 통해 동형 재조합에 의해 제조될 수 있다. 동형 재조합은 적절한 세포주내로 상기 아데노바이러스와 플라즈미드의 공-형질감염(co-transfection) 후에 일어난다. 사용되는 세포주는 바람직하게 (i) 상기 요소에 의해 형질 전환 가능하여야 하며, (ii) 결함있는 아데노바이러스 부분을 보충할 수 있는 서열을, 바람직하게는, 재조합의 위험을 피하기 위하여 일체된 형태로 포함하여야 한다. 상기 세포주의 예로는, 특히 게놈안에 Ad5 아데노바이러스의 좌측 부분 (12%)을 일체된 형태로 포함하는 인간 배아 키드니 세포주 293 (human embryonic kidney line 293)[참고문헌; Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59] 또는 특히 출원 No. WO 94/26914 또는 WO 95/02697에서 기술된 바 있는 E1 및 E4의 기능을 보충할 수 있는 세포주가 언급될 수 있다.
이후, 배가된 아데노바이러스는 실시예에 예시된 바와 같은 통상적인 분자생물학 기술에 따라 회수되고 정제된다.
아데노-결합된 바이러스(AAV)에 관해, 그들은 그들이 감염되는 세포의 게놈내로 안정되고 좌-특위적 방식으로 통합되는 상대적으로 작은 DNA 바이러스이다. 그들은 세포 생장, 형태 또는 분화에 임의적 효과를 유도함이 없이도 넓은 범주의 세포를 감염시킬 수 있다. 더군다나, 그들은 인간내에 병원성에 수반된 것으로 보이지는 않는다. AAV의 게놈은 클로닝되고, 서열화되고 규명되어있다. 이는 양쪽 말단에 바이러스의 복제원으로 이용되는 145 염기의 역전된 반복 서열(ITR)를 함유하는 대략 4700 염기를 포함한다. 게놈의 잔기는 캡슐화 기능을 수행하는 두 개의 본질적 부위로 나누어진다: 게놈의 좌측부는 바이러스의 복제 및 바이러스 유전자의 발현에 수반되는 rep 유전자를 포함하며, 게놈의 우측부는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다.
시험관내에서 및 생체내에서 유전자의 도입을 위한 AAV-유도된 벡터의 사용은 문헌[참고; WO91/18088, WO93/09329, US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528]에 기술되어 있다. 상기 출원들은 rep 및/또는 cap 유전자가 해당 유전자에 의해 결실되고 대치된, 다양한 AAV-유도된 작제물 및 상기 해당 유전자의 시험관내(배양액내의 세포상에서) 또는 생체내(기관내에서 직접) 도입을 위한 이들의 용도를 기술한다. 본 발명에 따른 결함있는 재조합 AAV는 인간 헬퍼 바이러스(예컨대, 아데노바이러스)에 의해 감염된 세포주내로, 두 개의 AAV 역전 반복 서열(ITR)에 의해 둘러싸인 본 발명의 핵산 서열(키메라 분자를 암호화하는 서열 + 발현 카세트)을 함유하는 플라즈미드 및 AAV 캡슐화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라즈미드의 공-형질전환에 의해 제조될 수 있다. 이렇게 해서 만들어진 재조합 AAV는 이후, 통상적인 기술에 의해 정제된다.
허프스 바이러스 및 레트로바이러스에 관해서는, 재조합 벡터의 작제물이 하기 문헌들에 넓게 기술되어 있다: Breakfield et al., Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BilTechnology 3, (1985) 689 등.
특히 레트로바이러스는 분열하는 세포에 선택적으로 감염되는 통합형 바이러스이다. 따라서, 그들은 암에의 적용을 위해 해당 벡터를 구성한다. 레트로바이러스의 게놈은 본질적으로 두 개의 LTR, 캡슐화 서열, 세 개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스로부터 유도된 재조합 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 전부 또는 일부 결실되며, 해당 이종좌 핵산 서열에 의해 대치된다. 이들 벡터는 특히 MoMuLV(murine molony leukemia virus, 또한 MoMLV로도 불린다.), MSV(murine molony sarcoma virus), HaSV(harvey sarcoma virus); SNV (spleen necrosis virus); RSV (Rous sarcoma virus) 또는 대안적으로 Friend's virus와 같은 다양한 유형의 레트로바이러스로부터 제조될 수 있다.
본 발명에 따라 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위하여, 특히 LTR, 캡슐화 서열 및 본 발명의 서열(키메라 분자를 암호화하는 서열 + 발현 카세트)을 함유하는 플라즈미드가 일반적으로 작제되며, 이후 플라즈미드에 결함있는 레트로바이러스의 기능을 트랜스로 제공할 수 있는 소위 캡슐화 세포주로 형질감염하는데 사용된다. 따라서, 일반적으로, 캡슐화 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 선행 기술에 기술된 상기 캡슐화 세포주는 특히, PA317 세포주 (US 4,861,719); PsiCRIP 세포주 (WO90/02806) 및 GP+envAm-12 세포주 (WO89/07150)이다. 더군다나, 재조합 아데노바이러스는 전사 활성 및 gag 유전자의 일부를 포함하는 연장된 캡슐화서열을 억제하기 위해 LTR내에 변형을 포함할 수 있다[참고문헌; Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639]. 이후, 만들어진 재조합 레트로바이러스는 통상적인 기술에 의해 정제된다.
본 발명에 따른 결함있는 재조합 바이러스의 작제물의 한 예가 도 8에 도시되어 있다. 이 도면은 캡슐화 세포주내에 해당 유전자의 발현의 부재하에서 구성되는 본 발명에 따른 작제물의 두 번째 잇점을 강조한다. 본 발명의 시스템에 의해 회복된 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체가 결핍된 이들 세포주에서, 프로모터는 불활성이며, 유전자는 생산 세포내에서 발현되지 않는다(도 8a). 바이러스가 표적세포에 효과적으로 감염될때만이, 즉, 세포내에 본 발명의 시스템에 의해 회복된 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체가 존재할때만이, 유전자가 효과적으로 발현된다(도 8b). 세포내에서 발현이 독성인 유전자(Grb3-3, IL-2 및 디프테리아 톡신 유전자 등)를 함유하는 바이러스의 작제물에 특히 유리하다.
본 발명의 이식을 위해, 결함있는 레트로바이러스 또는 아데노바이러스를 사용하는 것이 가장 특히 유리하다. 이들 벡터들은, 또한 종양세포로 유전자를 도입함에 있어 특히 유리한 성질을 지닌다.
또한, 다양한 유형의 비-바이러스성 벡터가 본 발명의 범주내에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 조건 발현 시스템은 또한, 진핵 세포내에서 핵산의 도입 및 발현을 촉진할 수 있는 비-바이러스성약제로 통합될 수도 있다. 화학적 또는 생화학적 벡터가 사용의 편의, 안전 및 도입될 DNA의 크기에 관한 이론적 제한의 부재에 기인하여 천연 바이러스의 편리한 대안이 된다.
이들 합성 벡터는 두 가지 주기능, 즉 도입될 핵산을 응축시키는 것 및 이를 세포에 부착하고 세포막 및 적절한 위치의 두 개의 핵막을 통해 통과시키는 기능을 가진다. 핵산의 다음이온성을 극복하기 위해서, 비-바이러스성 벡터는 모두 다가양이온전하를 가진다.
개발된 합성 벡터중에서, 폴리리신의 중합체, (LKLK)n, (LKKL)n, 폴리(에틸렌이민) 및 DEAD 덱스트란 유형 또는 대안적으로 양이온 지질 또는 리포펙턴트가 가장 유리하다. 그들은 ADN을 축합하고 세포막과의 결합을 촉진하는 성질을 가진다. 후자 중에는, 리포폴리아민(리포펙타민, 트랜스펙탐 등) 및 다양한 양이온성 또는 중성 지질(DOTMA, DOGS, DOPE 등)를 언급할 수 있다. 좀 더 최근에는, 양이온 중합체의 성질에 의해 DNA를 축합하는 반면에, 양이온 중합체, 및 그래프트되기에 바람직한 유형의 세포 표면에 존재하는 막수용체의 리간드 사이의 화학 연결에 의해 복합체를 막으로 부착하는 원리의 잇점을 가지는, 수용체에 의해 매개되는 표적 형질감염이란 개념이 개발되었다. 이리하여, 트랜스페린 또는 인슐린 수용체 또는 헤파토사이트의 아시알로글리코단백질에 대한 수용체에 대한 표적이 기술되었다.
또한, 본 발명의 주제는 상기에서 정의된 벡터를 포함하는 임의의 약학 조성물이다. 이들 조성물은 국소, 경구, 비경구, 내비, 정맥, 근육내, 피하 또는 내안 투여 등등을 위해 조성될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 조성물은 주입 조성에 약학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다. 이들은 등장의 멸균 식염수(인산제1나트륨, 인산제2나트륨, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등 및 이러한 염들의 혼합물), 또는 각 경우별로 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가에 의해 주입가능한 용액으로 가능케하는 건조, 특히 냉-건조 조성물일 수 있다. 레트로바이러스에 관해, 이는 세포 또는 생체밖 감염된 세포를 직접 캡슐화하고 생체내, 특히 신-기관의 형태로 재이식하도록 고안되는데 사용되는 유리할 수 있다(WO94/24298).
주입에 사용되는 벡터의 투여량은 다양한 변수, 특히 이용되는 투여 모드, 상대적 병원성 또는 대안적으로는 원하는 치료 기간에 따라 맞춰질 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 바이러스는 104내지 1014pfu/ml 의 투여량의 형태로 조성되며 투여된다. AAV 및 아데노바이러스의 경우는, 106내지 1010pfu/ml의 투여량이 사용될 수도 있다. pfu(플락(plaque) 형성 단위)는 비리온의 현탁액의 감염성에 상응하며, 적절한 세포 배양체에 감염시켜 보통 48 시간 후에 감염된 세포의 플락 수를 측정함으로써 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 적정을 조사하는 기술은 문헌에 자세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 발현 시스템 및 상응하는 벡터는 세포 또는 유전자 치료에서 해당 유전자의 발현을 조절하는데 특히 유용하다. 그래서, 그들은 해당물의 임의의 코딩 서열, 특히 치료 산물(펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 등)을 암호화하는 서열의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 보다 상세히, 유전자는 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인: 인터류킨, 인터페론, TNF 등(FR 9,203,120)과 같은 단백질 산물, 성장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NF, IGF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등; 전지질단백질: ApoAI, ApoAIV, ApoE 등(FR 93 05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 9,111,947), 종양 억제 유전자: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev 등(FR 93 04745), 응집에 관여하는 인자를 암호화하는 유전자: VII, VIII, IX 인자 등, 또는 대안적으로 천연 또는 인공 면역글로불린 (Fab, ScFv 등), RNA 리간드(WO91/19813)를 암호화하는 DNA 서열(인간, 동물, 식물 기원의 cDNA, gDNA, 합성 DNA 등)이다.
해당 유전자는 또한, 표적 세포내에서의 발현이 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절할 수 있는 안티센스 서열일 수도 있다. 상기 서열은 예를 들면, 유럽 특허 140 308에 기재된 기술에 따라서, 표적 세포내에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사되어서 이들 세포 mRNA의 단백질로의 해독을 차단할 수 있다.
본 발명은 독성 인자를 암호화하는 서열의 발현에 특히 조정된다. 그들은 세포에 특히 유독성(디프테리아 톡신, 슈도모나스 톡신, 리친 A 등)일 수 있으며, 생성물은 외성 인자(자살 유전자: 티미딘 키나아제, 사이토신 디아미나아제 등) 또는 대안적으로는 세포의 죽음을 초래하는 킬러 유전자(Grb3-3(PCT/FR94/00542), ScFv 항-ras(WO04/29446) 등)에 대한 민감도를 유도한다. 게다가, 본 발명의 시스템은 생성 세포에 대한 독성을 지니지 않고 이들 서열을 포함하는 벡터, 특히 바이러스 벡터를 생산할 수 있고, 다음 원하는 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체를 지닌 표적 세포내에서 이들 독성 분자들의 발현을 선택적으로 유도할 수 있다. 따라서, 이런 유형의 작제물은 예컨대, 손상입은 세포만 선택적으로 파괴하도록 하는 항암 치료에 특히 적절하다. 또한, 이 시스템은 예를 들면 비조절된 생산이 많은 부작용을 야기하는, 사이토카인, 인터페론, TNF 또는 TGF의 발현에도 특히 유리하다.
본 발명은 하기 실시예의 도움으로 더욱 더 자세하게 기술될 것이며, 이는 단지 예시이며 비-제한으로만 여겨져야한다.
본 발명은 유전자의 조건 발현을 위한 신규 시스템에 관한 것이다. 또한, 관심있는 해당 유전자의 발현을 매우 선택적으로 표적화하기 위한 유전자 또는 세포 치료에서의 상기 시스템의 사용에도 관련된다.
도 1 은 올리고머화 영역 (A) 또는 ScFv (B)에 의한 트랜스활성제의 선택적 회복을 허용하는, 본 발명에 따른 조건 발현 시스템의 대표도이다.
도 2 는 트랜스 활성 복합체의 선택적 회복을 허용하는, 본 발명에 따른 조건 발현 시스템의 대표도이다.
도 3 은 조절 서열 Tetop7, 최소한의 프로모터 (TATA 박스) 및 유전자(CAT)를 포함하는, 본 발명에 따른 발현 카세트의 대표도이다.
도 4 는 조절 서열 OR3, 최소한의 프로모터 (TATA 박스) 및 유전자(CAT)를 포함하는, 본 발명에 따른 발현 카세트의 대표도이다.
도 5 는 본 발명에 따른 이중특이적 키메라 분자의 대표도이다.
도 6 은 본 발명에 따른 이중특이적 키메라 분자를 암호화하는 DNA 서열의 작제물을 도시한다.
도 7 은 조절 키메라 작제물 대표도이다.
도 8 은 본 발명에 따른 바이러스 벡터(레트로바이러스)의 구조 및 기능을 도시한다.
도 9 는 본 발명의 하이브리드 분자와 조절 서열 사이의 상호작용에 대한 연구 결과를 도시한다.
도 10 은 본 발명의 하이브리드 분자와 다양한 형태의 p53 단백질 사이의 상호작용에 대한 연구 결과를 도시한다.
도 11 은 SAOS-2 세포내 Tet-Luc 카세트의 활성화를 나타낸다.
도 12 는 H358 세포내 Tet-Luc 카세트의 활성화를 나타낸다.
일반적인 분자 생물학 기술
세슘 클로라이드 에티디움 브로마이드 구배내 플라즈미드 DNA의 원심분리, 제한 효소로의 분해, 젤 전기영동,E. Coli에의 형질전환, 핵산 침전 등과 같은 일반적인 분자 생물학 방법이 문헌에 기재되어 있다[참고문헌; Maniatiset al., 1989].
효소는 New-England Biolabs (Beverly, MA)에 의해 제공된다. 결찰을 위해서, DNA 단편을 0.8 내지 1.5%의 아가로오스 젤에서 크기에 따라 분리하고, GeneClean (BIO101, LaJolla CA)에 의해 정제하고, 14℃에서 T4 파지 DNA 리가아제가 존재하는 pH 7.4의 50 mM tris HCL 완충액에서 오버나이트 배양한다.
또한, PCR (중합효소 체인 반응) 증폭을 문헌(Maniatis et al., 1989)에 따라 하기 조건하에서 수행한다:
-8 mM 농도에 맞춰진 MgCl2,
-95℃의 변성 온도,
-55℃의 하이브리드화 온도,
-72℃의 합성 온도,
-PE9600 Thermal cycler(Perkin Elmer, Norwalk CO)내에서 25회의 사이클.
올리고뉴클레오티드는 시아노에틸 그룹에 의해 β위치에서 보호되는 포스포아미디티(phosphoramidites)의 화학물질을 사용하여[참고문헌; Sinha et al., 1984, Giles 1985], 제조업자의 추천에 따라 응용된 바이오시스템 모델 394 자동 DNA 합성기(Applied Biosystem, Foster City CA)를 가지고 합성한다.
서열화는 형광 프라이머를 사용한 체인 종결 방법에 의해 이중 가닥 모형상에서 수행한다. 우리는 제조업자의 내역에 따라 Applied Biosystem으로부터 서열 Taq Dye Primer Kit를 사용한다.
실시예 1: 조절 서열, 최소한의 전사 프로모터 및 유전자를 포함하는 발현 카세트의 작제
1.1. 플라즈미드 pTETop7/CAT의 작제
플라즈미드 pTETop7/CAT는 하기의 구성 요소를 함유한다(도 3):
-7회 반복된 Tetop 모티프로 구성된 테트라사이클린 억제제 TetR과 상호작용하기 위한 서열로 이루어진 조절 서열(서열 번호. 1);
-티미딘 키나아제 유전자(TATA 박스를 나르는 -37 부터 +19 부위)로부터 유도된 최소한의 프로모터;
-상기 최소한의 프로모터 조절하에 놓이는, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT)를 암호화하는 서열.
상기 플라즈미드는 플라즈미드 pUHD10-7 (WO 94/29442)의 SmaI-BglII 단편을 SmaI 및 BamHI으로 이미 잘려진 플라즈미드 pKK232-8 (Pharmacia)내로 클로닝함에 의해 작제된다.
1.2. 플라즈미드 pOR3/CAT의 작제
플라즈미드 pOR3/CAT은 하기의 구성 요소를 함유한다(도 4):
-Cro 억제제와 상호작용하기 위한 서열 OR3로 이루어진 조절 서열(서열 번호. 2);
-티미딘 키나아제 유전자(TATA 박스를 나르는 -37 부터 +19 부위)로부터 유도된 최소한의 프로모터;
-상기 최소한의 프로모터 조절하에 놓이는, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT)를 암호화하는 서열.
상기 플라즈미드는 하기의 방식으로 작제된다: Cro 억제제와 상호작용하기 위한 서열 OR3는 인위적으로 합성된다. 가령, 하기의 두 개의 올리고뉴클레오티드가 합성된다:
올리고 5533 (서열 번호. 22): 5'-GATCCTATCACCGCAAGGGATAA-3'
올리고 5534 (서열 번호. 23): 3'-GATAGTGGCGTTCCCTATTTCCA-5'
이후, 이들 두 개의 올리고뉴클레오티드는 일부 서열에 의해 테를 두른 이중 가닥 서열 OR3를 재구성하기 위해서 혼성화되어, 하기와 같이 편향된 클로닝을 만들어낸다:
GATCCTATCACCGCAAGGGATAA
GATAGTGGCGTTCCCTATTTCCA
1.3. 독성 유전자의 발현을 위한 카세트의 작제
독성 유전자의 발현을 카세트는 상기 기술된 플라즈미드(1.1 및 1.2)의 CAT 서열을 독성 산물을 암호화하는 서열, 바람직하게는 Grb3-3 유전자 (PCT/FR94/00542), 티미딘 키나아제 유전자, 디프테리아 또는 슈도모나스 톡신을 암호화하는 유전자 등으로 대체함으로써 수득한다.
실시예 2: p53에 특이적인 단일-체인 항체의 작제
단일-체인 항체는 하기의 과정에 따라 작제된다:
-항-p53 항체를 생산하는 하이브리도마 pAb421로부터 VH 및 VL 부위를 암호화하는 cDNA를 수득한다. 예컨대, 하이브리도마로부터 전체 RNA를 추출한 후, 랜덤 육량체를 프라이머로 사용하여 역 전사 반응을 한다. 이런 유형의 프라이머를 사용함으로써 면역글로불린에 특이적인 프라이머의 사용을 피할 수 있다. 수득된 cDNA 클론은 V 부위를 클로닝하기 위한 충분한 길이를 가진다. 하지만, 그들은 전체 cDNA의 소량에 해당하기 때문에, 클로닝하기 위한 충분한 양의 DNA를 생산하기 위해서는 일차적 증폭 반응이 수행되어야 한다. 예컨대, VH 및 VL 부위를 암호화하는 cDNA는 개별적으로 증폭된다. 사용되는 프라이머는 각 체인(H 및 L)의 가변 부위의 반대쪽 말단의 수준에서 혼성화하는 올리고뉴클레오티드이다. 헤비 체인에 특이적인 프라이머를 사용하는 증폭 생성물은 약 340 염기쌍의 단편이다. 라이트 체인에 특이적인 프라이머를 사용하는 증폭 생성물은 약 325 염기쌍의 단편이다.
-항체의 VH 및 VL 부위를 암호화하는 cDNA의 정제 후에, 뉴클레오티드 팔(L)에 의해 단일 체인으로 어셈블링된다. 뉴클레오티드 팔은, 한 쪽 말단이 VH 부위를 암호화하는 cDNA의 3' 말단에 결합하고 다른 쪽 말단이 VL 부위를 암호화하는 cDNA의 5' 말단에 결합하도록 작제된다. 팔의 서열은 서열 번호. 5 의 펩티드를 암호화한다. 약 700 bp의 어셈블링된 서열은 NcoI-NotI 단편의 형태로, 서열 번호. 4 (9 내지 241의 아미노산)로 표현되는 서열을 지닌 VH-L-VL 체인을 포함한다. 이 서열은 또한, C-말단에 myc의 tag 서열(256 내지 266의 잔기)을 함유한다.
실시예 3: 단일-체인 항체(ScFv)로 이루어진 트랜스활성제에 결합하기 위한 영역을 함유하는 이중특이적 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열의 작제
3.1. ScFv-myc-Hinge-TetR 또는 Cro 서열을 포함하는 플라즈미드의 작제 (도 5a 및 6)
항-p53 ScFv를 암호화하는 cDNA를 함유한 NcoI-NotI 단편은 먼저, pUC19 유형의 플라즈미드내로 클로닝된다. VSV 에피톱을 암호화하는 서열(서열 번호. 7) 또는 myc 에피톱을 암호화하는 서열(서열 번호. 8)은 단편의 하부에 삽입된다(도 6).
이후, TetR 및 Cro 단백질를 암호화하는 서열은 하기와 같이 제조된다:
-TetR 서열을 나르는 모형 플라즈미드로부터 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭에 의해 TetR를 암호화하는 서열을 수득한다:
올리고 5474 (서열 번호. 10):
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACG
CGTGGATCCATGTCCAGATTAGATAAAAGTAAAG
올리고 5475 (서열 번호. 11):
CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGGGACCCACTTTCACATT
TAAGTTG
또한, 이들 올리고뉴클레오티드는 분자의 이중 기능성 영역을 연결하는 힌지 펩티드 팔을 암호화하는 서열을 제공한다.
따라서, 증폭된 단편은 펩티드 팔 및 tetR DNA에 결합하기 위한 영역을 암호화하는 서열을 포함한다. 이 단편을 ScFv-myc-Hinge-TetR 분자를 암호화하는 서열을 함유한 플라즈미드를 생성하기 위해서, 상기에서 수득된 플라즈미드의 XbaI-EcoRI 좌로 클로닝한다(도 6).
Cro를 암호화하는 서열은 람다 박테이로파지의 DNA 모형을 하기의 올리고뉴클레오티드에 의해서 증폭함에 의해 얻어진다:
올리고 5531 (서열 번호. 12):
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCG
TGGATCCATGGAACAACGCATAACCCTGAAAG
올리고 5532 (서열 번호. 13):
CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGTGCTGTTGTTTTTTTGTT
ACTCGG
또한, 이들 올리고뉴클레오티드는 분자의 두 개의 기능성 영역을 연결하는 힌지 펩티드 팔을 암호화하는 서열을 제공한다.
따라서, 증폭된 단편은 펩티드 팔 및 Cro DNA에 결합하기 위한 영역을 암호화하는 서열을 포함한다. 이 단편은 ScFv-myc-Hinge-TetR 분자를 암호화하는 서열을 함유한 플라즈미드를 생성하기 위해서, 상기에서 수득된 플라즈미드의 XbaI-EcoRI 좌로 클로닝된다.
3.2. ScFv-Hinge-TetR 또는 Cro 서열을 포함하는 플라즈미드의 작제 (도 5B).
본 실시예는 tag 서열이 결핍된, 본 발명에 따른 이중특이적 키메라 분자를 암호화하는 서열을 나르는 플라즈미드의 작제에 관한 것이다.
이들 플라즈미드는 상기 3.1.에 기술된 플라즈미드를 NotI 및 XbaI 효소로 분해함에 의해 유도된다. 이러한 분해에 의해 myc tag를 암호화하는 부위를 나르는 단편의 절개가 가능하다.
3.3. ScFv-TetR 또는 Cro 서열을 포함하는 플라즈미드의 작제 (도 5C).
본 실시예는 팔 및 tag 서열이 결핍된, 본 발명에 따른 이중특이적 키메라 분자를 암호화하는 서열을 나르는 플라즈미드의 작제에 관한 것이다.
이들 플라즈미드는 상기 3.1.에 기술된 플라즈미드를 NotI 및 BamHI 효소로 분해함에 의해 유도된다. 이러한 분해에 의해 myc tag 및 Hinge 펩티드 팔을 암호화하는 부위를 나르는 단편의 절개가 가능하다.
실시예 4: 올리고머화 영역으로 이루어진 트랜스활성제에 결합하기 위한 영역을 함유하는 이중특이적 키메라분자를 암호화하는 핵산 서열의 작제
4.1. p53 단백질의 올리고머화 부위의 클로닝 (320 부터 393까지의 단편).
인간 야생형 p53의 cDNA를 나르는 플라즈미드상에서 하기의 올리고뉴클레오티드의 도움으로 PCR 증폭에 의해서, p53 단백질(서열 번호. 3)의 올리고머화 영역을 암호화하는 cDNA를 수득한다:
올리고 5535 (서열 번호. 14):
CAGGCCATGGCATGAAGAAACCACTGGATGGAGAA
(밑줄 친 부분은 NcoI 좌를 나타낸다)
올리고 5536 (서열 번호. 15):
CGTCGGATCC TCTAGAT GCGGCCGC GTCTGAGTCAGGCCCTTC
(밑줄 친 부분: BamHI 좌; 진한 부분: XbaI 좌; 진하고 밑줄 친 부분: NotI 좌).
4.2. NcoI-NotI 단편의 형태로 상기에서 증폭된 단편을 실시예 3.1.에서 기술된 플라즈미드의 ScFv를 암호화하는 부위 대신 치환시켜 상응하는 좌내로 클로닝함에 의해, 플라즈미드 p53 320/393-myc-Hinge-TetR 또는 Cro (도 5a)를 수득한다.
4.3. NcoI-XbaI 단편의 형태로 4.1.에서 증폭된 단편을 실시예 3.1.에서 기술된 플라즈미드의 ScFv 및 tag를 암호화하는 부위 대신 치환시켜 상응하는 좌내로 클로닝함에 의해, 플라즈미드 p53 320/393-Hinge-TetR 또는 Cro (도 5b)를 수득한다.
4.4. NcoI-BamHI 단편의 형태로 4.1.에서 증폭된 단편을 실시예 3.1.에서 기술된 플라즈미드의 ScFv, tag 및 Hinge를 암호화하는 부위 대신 치환시켜 상응하는 좌내로 클로닝함에 의해, 플라즈미드 p53 320/393-TetR 또는 Cro (도 5c)를 수득한다.
4.5. 야생형 인간 p53에 대한 cDNA를 나르는 플라즈미드상에서 XhoI/EcoRI으로 분해된 올리고 5537/5539 또는 5538/5539의 도움으로 PCR에 증폭된 단편을 미리 XhoI/EcoRI으로 분해된 3.1.에 기술된 플라즈미드내로 클로닝함에 의해, 플라즈미드 tetR 또는 Cro-p53 320/393 (도 5d) 또는 tetR 또는 Cro-Hinge-p53 320/393 (도 5e)를 수득한다.
올리고 5537 (서열 번호. 16):
CAGGCTCGAGAAGAAACCACTGGATGGAGAA
올리고 5538 (서열 번호. 17):
CAGGCTCGAGCCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAAAGA
AACCACTGGATGGAGAA
올리고 5539 (서열 번호. 18):
GGTCGAATTCGGGCCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC
실시예 5: DNA 결합 영역 (TetR 또는 Cro) 및 p53 단백질의 트랜스활성제 영역 (1부터 73까지의 영역)을 포함하는 키메라 분자를 암호화하는 서열을 나르는 조절 플라즈미드의 작제
인간 야생형 p53에 대한 cDNA를 나르는 플라즈미드를 사용하여 증폭된 단편을 NcoI/NotI, NcoI/XbaI, NcoI/BamHI으로 분해시켜 NcoI/NotI, NcoI/XbaI 또는 NcoI/BamHI으로 미리 분해된 3.1.에 기술된 플라즈미드내로 클로닝함에 의해, tag (myc 또는 VSV) 및 Hinge 를 지니거나 지니지 않은 플라즈미드 p53 1/73-TetR 또는 Cro (도 7a, b 및 c)를 수득한다.
올리고 5661 (서열 번호. 19):
CAGGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCC
올리고 5662 (서열 번호. 20):
CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCCACGGGGGGAGCAGCCTC
TGG
실시예 6: 본 발명의 다양한 하이브리드 분자를 발현하기 위한 플라즈미드의 작제
하이브리드 분자를 암호화하는 cDNA를 함유한 단편을 진핵 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen)의 NcoI/EcoRI 좌내로 클로닝함에 의해, 하이브리드 분자의 발현에 사용되는 플라즈미드를 수득한다. 이리하여, 하기와 같이 다양한 작제물이 생성된다:
-ScFv 421: 서열 번호. 4
-TET19: 실시예 3.1에 따른 도 6에 도시된 ScFv421-VSV-Hinge-TetR 체인을 함유한 하이브리드 단백질
-TET02: 실시예 4.3에 따른 도 5a에 도시된 p53(320/393)-VSV-Hinge- TetR 체인을 함유한 하이브리드 단백질
-TET03: 실시예 4.4에 따른 도 5B에 도시된 p53(320/393)-Hinge-TetR 체인을 함유한 하이브리드 단백질
-TET04: 실시예 4.4에 따른 도 5c에 도시된 p53(320/393)-TetR 체인을 함유한 하이브리드 단백질
-TET02: 실시예 5에 따른 도 7a에 도시된 p53(1/73)-VSV-Hinge-TetR 체인을 함유한 하이브리드 단백질
실시예 7: 본 발명의 하이브리드 분자에 의한 특이적 이중-가닥 DNA서열의 인식
7.1. 하이브리드 분자의 생성
TNT Coupled Reticulocyte lysate System kit (Promega)를 사용하여 전체 반응 용적을 50 ㎕로 하여 제공자에 의해 기술된 실험 과정에 따라서, 실시예 6에 기술된 분자를 적혈구 용균물내에서 in vitro 해독함으로써, 본 실험에 사용되는 다양한 분자를 수득한다.
7.2. 특이적 이중-가닥 DNA 서열의 작제
본 실험에 사용되는 특이적 이중 가닥 DNA 서열은 하기와 같은 두 개의 합성 올리고뉴클레오티드로 이루어진다:
올리고 5997 (서열 번호. 24):
GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA
올리고 5998 (서열 번호. 25):
AGCTTGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCG
하기의 반응 매질 10㎕내에서 각각 10 pmol의 올리고뉴클레오티드를 37℃에서 10분간 배양함에 의해, 이들 두 개의 합성 올리고뉴클레오티드를 인-33으로 표지한다:
Tris-HCL pH 7.6 50 mM
MgCl210 mM
디티오트레이톨 5 mM
스퍼미딘 100 mM
EDTA 100 mM
[γ-33P]ATP (Amersham) 50 μCi (1000-3000 Ci/mmol)
T4 키나아제 (Boehringer) 10 U
이리하여, 표지된 두 개의 올리고뉴클레오티드는 400 mM NaCl의 존재하에서 혼성화되어, 하기의 이중-가닥 서열 TetO (서열 번호. 26)을 재구성한다:
GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA
CTAGGCTCAAAGTGAAAAGAGATAGTGACTATCACTCACCATTTGAGT
7.3. 본 발명의 다양한 하이브리드 분자에 의한 이중-가닥 서열 TetO의 작제.
50 ㎕의 반응 매질 (10 mM Tris-HCL pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM KCL, 6 mM β-머캡토에탄올, 0.1 mM EDTA, 0.5 mg/ml BSA)내에 실시예 7.2에 따라 제조된 TetO (10-10M) 서열, 실시예 7.1에 따라 제조된 해독 산물 10 ㎕ 및 비특이적 결합을 제거하고자 사용되는 콜드 경쟁자 올리고뉴클레오티드 AP2 (Promega) 10-8M를 가하여 DNA-결합 반응을 수행한다. 상호작용의 특이성을 반응매질에 테트라사이클린 (Sigma) 10 μM를 가해서 평형을 옮김으로써 체크한다. 반응 혼합물을 20℃에서 15분간 배양하고, 50% 글리콜 10㎕를 부가한 후, 16℃에서 200V의 순수 5% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 최종 혼합물을 이동시킨다.
TET19, TET02 및 TET07 하이브리드 분자와 함께 수행된 본 실험 결과는 도 9에 도시되어 있다. 이러한 조건 하에서, 후반의 이동이 지연된 것을 통해서 이들 세 분자가 특이적 이중-가닥 DNA 서열에 결합했음을 알 수 있으며, 이러한 상호작용의 특이성은 테트라사이클린의 첨가에 의해 이들 지연현상이 방해받는 것에 의해 표현된다.
따라서, 이러한 결과는 본 발명의 하이브리드 분자가 TetO 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 확신케한다.
실시예 8: 본 발명의 하이브리드 분자와 트랜스 전사 활성제 영역을 지닌 분자와의 특이적 결합
본 실험을 위해서, 실시예 6에 따른 본 발명의 ScFv 421, TET19 및 TET02의 하이브리드 분자를 35S-메티오닌 (Amersham)이 44 μCi의 존재하에서 실시예 7.1에 따른 실험 절차를 사용하여 실험실내 해독과정에 의해 생산함으로써, 이들의 방사상 표지된 하이브리드 분자를 생성한다.
트랜스 전사활성제 영역을 지니거나 지니지 않은 분자의 cDNA를 pBlueBacIII (Invitrogen) 벡터의 BamH1 좌내로 클로닝한다. 이들 벡터를 사용하여, 재조합 배큘로바이러스를 재조자의 지시에 따라 생산하고 정제한다. 재조합 배큘로바이러스로를 제조자의 실험 절차에 따라 sf9 곤충 세포에 감염시킴에 의해 이들 분자를 생산한다. 10 mg/mldml 최종 단백질 농도에서의 단백질 추출물을 K. Ory et al.에 의해 기술된 절차에 따라 제조한다[참고문헌; K. Ory, EMBO J., 13, 3496-3504, 1994]. 이들 분자들은 하기와 같다:
-p53 (1/393): 야생형 p53 단백질
-p53 (1/320): 야생형 p53 단백질로서, 올리고머화 영역 및 모노클로날 항체 pAb421에 의해 인식되는 영역이 결핍되어 있다.
8.2. 트랜스 전사활성제를 지니거나 지니지 않은 분자와 본 발명의 하이브리드 분자간의 결합
실시예 8.1에 따라 제조된 5㎕의 각각의 실험실내 해독 생성물을 실시예 8.1에 따른 배큘로바이러스 추출물 5㎕ 및 p53 단백질의 N-말단을 인식하는 모노클로날 항체 DO1 (Oncogene Science) 2㎍와 함께 4℃에서 16시간동안 변형된 RIPA 완충액 100㎕내에서 배양한다[참고문헌; K. Ory, EMBO J., 13, 3496-3504, 1994]. 항체에 의해 보유되는 복합체를 80℃에서 10분간 이동 완충액 30㎕의 존재하에서 배양함에 의해 용출하고[참고문헌; Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970] 200V에서 변성 매질내 10%의 폴리아크릴아미드 젤상에서 전기영동시킨다[참고문헌; Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970]. 이후, 젤을 건조시키고, 트랜스 전사 활성제를 지니거나 지니지 않은 분자와 결합한 하이브리드 분자의 양을 결정할 수 있게 하는 인스탠티매거(instantimager; Packard Instruments)에 의해 가시화한다. 실험 결과는 도 10에 도시되어 있다.
이러한 조건하에서, ScFv 421 (TET19)를 나타내는 하이브리드 분자가 단독의 ScFv 421과 동일한 방식으로 p53 분자(1/393)를 인식하며, 320/393 영역(TET02)를 나타내는 하이브리드 분자는 더 많은 p53 (1/393) 보유력을 제외하고는 동일한 성질을 보여줌이 자명하게 나타낸다. 더욱이, p53(1/320) 분자와의 배양동안 관찰된 시그널의 부재는, 이들의 상호작용이 기대했던대로 아주 특이적이며, p53 단백질(320부터 393까지의 아미노산)의 C-말단에 의해 매개되었음을 나타내준다.
따라서, 이러한 결과는 본 발명의 하이브리드 분자가 특이적 파트너인 분자에 의해 운반되는 트랜스 전사활성제를 상당히 회복할 수 있음을 확신케한다.
실시예 9: 본 발명의 하이브리드 분자에 의해 트랜스 전사 활성제 영역의 기능적 회복
본 발명의 하이브리드 분자에 의한 트랜스 전사 활성제 영역의 기능적 회복은 p53 단백질의 두 개의 대립형질에 대해 결함이 있는 SAOS-2 세포주 (인간 골육종(osteosarcoma)), p53 단백질의 두 개의 대립형질에 대해 결함이 있는 종양주 H358 및 p53 단백질의 두 개의 대립형질 중 하나에 결함이 있으며 하나의 변이된 대립형질 (H273 돌연변이)를 가진 종양주 HT29내에서 생체내 트랜스활성 시스템에서 측정된다. 이러한 시스템은, 효소학적으로 분석될 수 있으며 Tet 억제제에 의해 특이적 인식하기 위한 뉴클레오티드 단위를 함유하는 프로모터의 조절하에 놓이게 되는 리포터 유전자의 사용에 기초한다.
이 테스트에서, Tet 오퍼레이터의 조절하에 놓이는 LUC (루시퍼라아제) 리포터 유전자를 pUHC13-3 플라즈미드내에 함유한다[참고문헌; Gossen M. Bujard H., Proc. Nat1., Acad. Sci. USA, 89, 5547-5551, 1992].
9.1. 사용되는 세포주 및 배양 조건
p53 단백질에 연계된 유전형 및 배양에 사용되는 배양 매질 뿐만 아니라, 이러한 실험들에서 사용되는 세포주는 하기의 표 1에 나타나 있다.
세포주
세포주 p53 배양 매질 ATCC No.
SAOS-2 -/- 10%의 소 배아 혈청 (Gibco BRL)이 보충된DMEM 매질 (Gibco BRL) HTB 85
H358 -/- 10%의 소 배아 혈청 (Gibco BRL)이 보충된RPMI 1640 매질 (Gibco BRL)
HT29 -/H273 10%의 소 배아 혈청 (Giboc BRL)이 보충된DMEM 매질 (Gibco BRL)
9.2. 트랜스 전사 활성제 영역을 지닌 분자를 발현하는 플라즈미드
본 실험에 사용되는 트랜스 전사 활성제를 지닌 분자는 야생형(wt)의 p53 단백질 및 이 단백질의 변이형 G281 및 H175이다. 이들 세 개의 단백질을 암호화하는 cDNA를 pcDNA3 (Invitrogen) 벡터의 BamHI 좌에 삽입한다.
9.3. 본 발명의 하이브리드 분자의 세포내 발현
하기의 절차를 사용하여, 본 발명의 하이브리드 분자를 일시적인 형질감염에 의해 배양내 세포에서 발현한다:
세포 (3.5x105)를 배양 매질 2 ㎖이 함유된 6-웰 플레이트내로 접종시키고, 37℃의 CO2(5%) 배양기내에서 밤새 배양한다. 그리고나서, 형질감염제로 리포펙턴트AMINE (Gibco BRL)를 사용하여 하기의 방식으로 다양한 작제물을 형질감염시킨다: 전체 플라즈미드 1.5 ㎍을 2 ㎖의 비혈청 배양 매질(형질감염 혼합물)와 함께 30분간 5 ㎕의 리포펙턴트AMINE와 함께 배양한다( 0.25 ㎍의 리포터 플라즈미드를 포함한다). 이 기간동안, 세포를 PBS로 2회 세정하고, 형질감염 혼합물과 함께 37℃에서 4시간동안 배양하고, 뒤따라서 열에 의해 무기력화된 10%의 소 배아 혈청으로 보충된 2 ㎖의 배양 매질로 대체하여 세포를 37℃에서 48시간동안 다시 생장케 한다.
9.4. 전사 활성의 탐지
트랜스 전사 활성제의 기능적 회복에 연계된 전사의 활성화는, 제조자의 실험 절차에 따라 루시퍼라아제 분석 시스템 키트 (Promega)를 사용하여 LUC 유전자에 의해 암호화된 루시퍼라아제 활성을 측정함으로써 탐지되고 정량된다.
9.5. 본 발명의 분자에 의한 트랜스 전사 활성제의 기능적 회복
실시예 6의 TET02, TET03 및 TET07 분자를 사용하여 본 실험을 수행한다. 본 실험에서 TET07 분자는 그 자신의 트랜스 전사 활성 영역을 가지기 때문에 양성 조절 역할을 수행한다.
SAOS-2 세포내에서 얻어지며 도 11에 도시된 결과는 TET07 분자가 TET02 작제물과는 달리, Tet 오퍼레이터의 조절하에 놓이는 LUC 유전자의 전사를 자체로 활성화시킬 수 있음을 나타낸다. 이는, 이들 세포주가 TET02 분자에 의해 회복될 수 없는 내생 p53 단백질을 함유하지 않는다는 사실과 일치한다. 반면에, 야생형 p53 단백질 또는 그 자체내에 임의의 시그널도 생산하지 않는 이의 G281 변이형의 도입은 TET02 분자의 존재하에서 전사 활성을 발생시킬 수 있다. 이러한 결과는 비기능적 트랜스 전사 활성 영역을 지닌 것으로 문헌에 기재된 H175 변이형에서 관찰될 수 없다.
TET02 분자를 지닌 SAOS-2 세포주내에서 관찰되는 이러한 결과는 내생 p53 (H358 세포)를 함유하지 않은 종양 세포주내로 재생산될 수 없거나, TET03 및 TET04 분자에 연장될 수 없다(도 12).
상이한 세포 범주내에서의 이러한 결과를 확신케하는 목적을 가지고, 양성 조절 TET07 뿐만 아니라 TET02 분자는, 빈 pcDNA3 벡터를 형질감염하는것으로 이루어진 본 실험을 위한 음성 조절인 변이형 내생 p53 단백질(H273)을 발현하는 HT29 세포내에서 발현된다. 하기의 표에 나타난 본 실험 결과는 TET02 분자가 내생 p53 단백질의 트랜스 전사 활성 영역을 상당히 회복할 수 있음을 보여준다.
본 발명의 HT29 세포의 하이브리드 분자의 전사 활성
pcDNA3 TET07 TET02
1 59 10
따라서, 전체적으로 이들 실험은 본 발명의 하이브리드 분자가 이중 가닥 DNA 서열 및 트랜스 전사 활성 영역을 나타내는 단백질 모두에 상당히 잘 결합할 수 있음을 나타내며, 또한, 이들 분자들이 해당 유전자의 발현을 조건적으로 유도할 수 있음을 보여준다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인:
(A) 성명: 롱 프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 도시: 앙토니
(E) 국가: 프랑스
(F) 우편번호: 92165
(G) 전화: (1) 40.91.70.36
(H) 텔레팩스: 40.91.72.91
(ii) 발명의 명칭: 조건 발현 시스템
(iii) 서열수: 26
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체형: 테이프
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
(2) 서열 번호 1에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 19 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(xi) 서열 기술: 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 17 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(xi) 서열 기술: 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 74 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: 펩티드
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 3:
(2) 서열 번호 4에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 768 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 4:
(2) 서열 번호 5에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: 펩티드
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 5:
(2) 서열 번호 6에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(ix) 특징:
(A) 이름/키(key): CDS
(B) 위치: 1..30
(xi) 서열 기술: 서열 번호 6:
(2) 서열 번호 7에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(ix) 특징:
(A) 이름/키(key): CDS
(B) 위치: 1..18
(xi) 서열 기술: 서열 번호 7:
(2) 서열 번호 8에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 33 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(ix) 특징:
(A) 이름/키(key): CDS
(B) 위치: 1..33
(xi) 서열 기술: 서열 번호 8:
(2) 서열 번호 9에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 7 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: 펩티드
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 9:
(2) 서열 번호 10에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 66 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 10:
(2) 서열 번호 11에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 51 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 11:
(2) 서열 번호 12에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 66 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 12:
(2) 서열 번호 13에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 51 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 13:
(2) 서열 번호 14에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 35 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 14:
(2) 서열 번호 15에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 43 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 15:
(2) 서열 번호 16에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 31 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 16:
(2) 서열 번호 17에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 61 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 7:
(2) 서열 번호 18에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 37 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 18:
(2) 서열 번호 19에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 19:
(xi) 서열 기술: 서열 번호 18:
서열 18
(2) 서열 번호 20에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 46 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 20:
(2) 서열 번호 21에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 66 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 가닥형태: 단일
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: 펩티드
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 21:
(2) 서열 번호 22에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 22:
(2) 서열 번호 23에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 23 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 23:
(2) 서열 번호 24에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 48 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 24:
(2) 서열 번호 25에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 48 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 25:
(2) 서열 번호 26에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 96 염기쌍
(B) 유형: 뉴클레오티드
(C) 가닥형태: 이중
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 유형: cDNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술: 서열 번호 26:

Claims (57)

  1. 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역 및 생리적 또는 생리병리적 상태의 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스활성 또는 트랜스 억제 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 탐지 영역을 포함하는 이중특이적 키메라 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 DNA와 상호작용할 수 있는 단백질로부터 유도됨을 특징으로 하는 분자.
  3. 제 2 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 진핵 세포 단백질로부터 유도됨을 특징으로 하는 분자.
  4. 제 3 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 p53, STAT 또는 NFkB 단백질로부터 유도됨을 특징으로 하는 분자.
  5. 제 2 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 원핵 세포 단백질로부터 유도됨을 특징으로 하는 분자.
  6. 제 5 항에 있어서, 원핵 세포 단백질이 박테리아 억제제임을 특징으로 하는 분자.
  7. 제 6 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 tetR 단백질로부터 유도됨을 특징으로 하는 분자.
  8. 제 6 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 Cro 단백질로부터 유도됨을 특징으로 하는 분자.
  9. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 상기 단백질의 DNA와 상호작용하는 영역을 포함함을 특징으로 하는 분자.
  10. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 온전한 단백질로 이루어짐을 특징으로 하는 분자.
  11. 제 10 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 tetR 단백질로 이루어짐을 특징으로 하는 분자.
  12. 제 10 항에 있어서, 규정된 DNA 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 영역이 Cro 단백질로 이루어짐을 특징으로 하는 분자.
  13. 제 1 항에 있어서, 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스활성 또는 트랜스억제 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 영역이 올리고머화 영역임을 특징으로 하는 분자.
  14. 제 13 항에 있어서, 올리고머화 영역이 류신 지퍼, SH3 또는 SH2 영역임을 특징으로 하는 분자.
  15. 제 13 항에 있어서, 트랜스활성제에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고머화 영역이 p53 단백질의 C-말단부로 이루어짐을 특징으로 하는 분자.
  16. 제 15 항에 있어서, 올리고머화 영역이 320 부터 393(서열 번호. 3), 302 부터 360 또는 302 부터 390 잔기에 걸친 p53 단백질의 C-말단부로 이루어짐을 특징으로 하는 분자.
  17. 제 1 항에 있어서, 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스활성 또는 트랜스억제 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 영역이 상기 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스활성 또는 트랜스 억제 복합체와 상호작용하는 것으로 알려진 합성 또는 천연 영역임을 특징으로 하는 분자.
  18. 제 1 항에 있어서, 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스활성 또는 트랜스억제 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 영역이 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스활성 또는 트랜스억제 복합체로 지향된 항체 또는 항체 단편 또는 유도체임을 특징으로 하는 분자.
  19. 제 18 항에 있어서, 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스활성 또는 트랜스억제 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 영역이 항체의 Fab 또는 F(ab)'2 단편 또는 항체의 VH 또는 VL 부위로 이루어짐을 특징으로 하는 분자.
  20. 제 18 항에 있어서, 트랜스활성제 또는 트랜스억제제 또는 트랜스활성 또는 트랜스억제 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 영역이 팔에 의해 VL 부위에 연결되는 VH 부위를 포함하는 단일-체인 항체(ScFv)로 이루어짐을 특징으로 하는 분자.
  21. 제 1 항에 있어서, DNA-결합 영역 및 트랜스활성제-결합 영역이 팔을 통해 서로 연결됨을 특징으로 하는 분자.
  22. 제 21 항에 있어서, 팔이 5 내지 30 개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 20 개의 아미노산으로 구성된 펩티드로 이루어짐을 특징으로 하는 분자.
  23. 제 22 항에 있어서, 팔이 서열 번호. 5 또는 서열 번호. 6의 펩티드 서열로부터 선택됨을 특징으로 하는 분자.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-결합 영역이 N-말단 위치에 존재하고, 트랜스활성제-결합 영역이 C-말단 위치에 존재함을 특징으로 하는 분자.
  25. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA-결합 영역이 C-말단 위치에 존재하고, 트랜스활성제-결합 영역이 N-말단 위치에 존재함을 특징으로 하는 분자.
  26. ScFv-VSV/myc-Hinge-TET 또는 Cro (도 5A) 구조의 이중특이적 키메라 분자.
  27. ScFv-Hinge-TET 또는 Cro (도 5B) 구조의 이중특이적 키메라 분자.
  28. ScFv-TET 또는 Cro (도 5C) 구조의 이중특이적 키메라 분자.
  29. TET 또는 Cro-ScFv (도 5D) 구조의 이중특이적 키메라 분자.
  30. TET 또는 Cro-Hinge-ScFv (도 5E) 구조의 이중특이적 키메라 분자.
  31. Oligom-VSV/myc-Hinge-TET 또는 Cro (도 5A), Oligom-Hinge-TET 또는 Cro (도 5B) 또는 Oligom-TET 또는 Cro (도 5C) 구조의 이중특이적 키메라 분자.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열.
  33. 제 32 항에 있어서, DNA 서열임을 특징으로 하는 핵산 서열.
  34. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서, 벡터의 일부임을 특징으로 하는 핵산 서열.
  35. 제 1 항 내지 제 31 항에 따른 키메라 분자, 및
    조절 서열, 최소한의 전사 프로모터 및 유전자를 포함한 발현 카세트를 포함하는 유전자 조건 발현 시스템.
  36. 제 35 항에 있어서, 키메라 분자의 DNA-결합 영역이 TetR의 전부 또는 일부에 의해 표현되고, 조절 서열이 서열 번호. 1의 서열 또는 이의 유도체를 선택적으로 여러 회 반복하여 포함함을 특징으로 하는 조건 시스템.
  37. 제 35 항에 있어서, 키메라 분자의 DNA-결합 영역이 Cro의 전부 또는 일부에 의해 표현되고, 조절 서열이 서열 번호. 2의 서열 또는 이의 유도체를 선택적으로 여러 회 반복하여 포함함을 특징으로 하는 조건 시스템.
  38. 제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 최소한의 프로모터가 INR 또는 TATA 박스를 포함함을 특징으로 하는 조건 시스템.
  39. 제 38 항에 있어서, 최소한의 프로모터가 티미딘 키나아제 유전자의 프로모터로부터 유도됨을 특징으로 하는 조건 시스템.
  40. 제 39 항에 있어서, 최소한의 프로모터가 티미딘 키나아제의 -37 부터 +19 의 뉴클레오티드로 구성됨을 특징으로 하는 조건 시스템.
  41. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 따른 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열, 및
    조절 서열, 최소한의 전사 프로모터 및 해당 암호화 서열을 포함한 발현 카세트를 포함하는 벡터.
  42. 제 41 항에 있어서, 최소한의 전사 프로모터가 제 38 항 내지 제 40 항에 따라 한정됨을 특징으로 하는 벡터.
  43. 제 41 항에 있어서, 키메라 분자의 DNA-결합 영역이 TetR의 전부 또는 일부에 의해 표현되고, 조절 서열이 서열 번호. 1의 서열 또는 이의 유도체를 선택적으로 여러 회 반복하여 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  44. 제 41 항에 있어서, 키메라 분자의 DNA-결합 영역이 Cro의 전부 또는 일부에 의해 표현되고, 조절 서열이 서열 번호. 2의 서열 또는 이의 유도체를 선택적으로 여러 회 반복하여 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  45. 제 41 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 해당 암호화 서열이 치료 산물을 암호화하는 DNA 서열임을 특징으로 하는 벡터.
  46. 제 45 항에 있어서, 치료 산물이 독성 폴리펩티드 또는 펩티드임을 특징으로 하는 벡터.
  47. 제 46 항에 있어서, 독성 치료 산물이 디프테리아 톡신, 슈도모나스 톡신, 리친 A, 티미딘 키나아제, 사이토신 디아미나아제, Grb3-3 또는 ScFv Y28 단백질임을 특징으로 하는 벡터.
  48. 제 41 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 플라즈미드 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  49. 제 41 항 내지 제 47 항 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  50. 제 49 항에 있어서, 결함있는 재조합 아데노바이러스임을 특징으로 하는 벡터.
  51. 제 49 항에 있어서, 결손 재조합 레트로바이러스임을 특징으로 하는 벡터.
  52. 제 41 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 적어도 하나 포함하는 약학 조성물.
  53. 서열 번호. 4의 서열을 포함하는 핵산.
  54. 제 1 항에 있어서, 생리적 또는 생리병리적 상태의 트랜스활성제가 전사 트랜스활성화 활성을 지닌 바이러스, 기생충, 미코박테리아 또는 세포 기원의 단백질임을 특징으로 하는 분자.
  55. 제 54 항에 있어서, 트랜스활성제가 HIV 바이러스 Tat 단백질, 파필로마 바이러스 E6/E7 단백질 및 엡스테인-바르 바이러스 EBNA 단백질로부터 선택되는 바이러스 단백질임을 특징으로 하는 분자.
  56. 제 54 항에 있어서, 트랜스활성제가 세포 단백질, 바람직하게는, p-53 단백질의 변이형 또는 야생형임을 특징으로 하는 분자.
  57. 제 1 항에 있어서, 생리적 또는 생리병리적 상태의 트랜스활성제 또는 트랜스활성 복합체가 감염 또는 과다증식된 세포내에서 출현하는 단백질임을 특징으로 하는 분자.
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