SK56198A3 - Use of protein gax for treating cancer - Google Patents

Use of protein gax for treating cancer Download PDF

Info

Publication number
SK56198A3
SK56198A3 SK561-98A SK56198A SK56198A3 SK 56198 A3 SK56198 A3 SK 56198A3 SK 56198 A SK56198 A SK 56198A SK 56198 A3 SK56198 A3 SK 56198A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
gax
nucleotide sequence
protein
adenovirus
cell
Prior art date
Application number
SK561-98A
Other languages
Slovak (sk)
Inventor
Aude Leroux
Didier Branellec
Patrice Denefle
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer Sa filed Critical Rhone Poulenc Rorer Sa
Publication of SK56198A3 publication Critical patent/SK56198A3/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/10—Vectors comprising a non-peptidic targeting moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

The therapeutical use, particularly in cancer treatment, of a nu leic acid coding for all or part of protein GAX or a variant thereof, is disclosed.

Description

Oblasť’ technikyTechnique

Predložený vynález sa dotýka novej metódy liečenia rakoviny. Týka sa najmä metódy liečenia rakoviny blokovaním bunkovej proliferácie, ktorá môže byť deregulovaná v nádorových bunkách exprimujúcich taký onkogén, ktorý je mutovaný alebo nedostatočne vyvinutý ras pre tumor supresorový gén, ako je p53. Dotýka sa najmä použitia vektorov génovej terapie umožňujúcich regulovať tento proces a farmaceutických zlúčenín, ktoré tieto vektory obsahujú.The present invention relates to a novel method of treating cancer. In particular, it relates to a method of treating cancer by blocking cell proliferation that can be deregulated in tumor cells expressing an oncogene that is mutated or under-developed for a tumor suppressor gene such as p53. In particular, it relates to the use of gene therapy vectors for regulating this process and to the pharmaceutical compounds containing these vectors.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Produkty génov ras všeobecne označované ako proteíny p21, hrajú kľúčovú úlohu v riadení bunkového delenia vo všetkých eukaryotických organizmoch, v ktorých boli skúmané. Určité špecifické ..modifikácie týchto proteínov spôsobujú stratu ich normálnej kontroly, a tak spôsobujú, že tieto proteíny sa stanú onkogénne. Veľký počet ľudských nádorov bol spojovaný s prítomnosťou modifikovaných génov ras. Rovnako však silná expresia proteínov p21 môže viesť ku poruche bunkovejThe products of ras genes, commonly referred to as p21 proteins, play a key role in controlling cell division in all eukaryotic organisms in which they have been studied. Certain specific modifications of these proteins result in the loss of their normal control and thus cause these proteins to become oncogenic. A large number of human tumors have been associated with the presence of modified ras genes. However, strong expression of p21 proteins can also lead to cellular defects

I proliferácie.I proliferation.

V súvislosti s normálnymi bunkami, proliferácia onkogénov je pravdepodobne potlačená, aspoň čiastočne, generáciou génov nazvaných tumor supresory, ako je p53 a Rb. Vie sa, že proteín p53, aspoň vo svojej divej forme, je transkripčným faktorom, ktorý negatívne riadi bunkový rast a bunkové delenie, a ktorý v určitých situáciách je schopný indukovať apoptózu (Yonish-Rouach a kol., Náture, 352, 345-347, 1991:) . Kvôli týmto vlastnostiam prejavujúcim sa v stresovej situácii, keď je ohrozená neporušenosť bunkovej DNA, bol p53 nazvaný strážca genómu, Mechanizmus tejto bunkovej autoregulácie môžu narušiť určité javy á uprednostniť tak vývoj vytváraného novotvaru. Jeden z takýchto dejov spočíva v mutáciách na úrovni supresorových génov tumorov. Je to tiež preto, že inaktívne formy génu Rb boli zistené v rôznych tumoroch, menovite v retinoblastómoch alebo v rakovinách mezenchýmu, ako sú napríklad osteosarkómy, a tiež preto, že bola zaznamenaná prítomnosť mutovaných p53 v 40% ľudských tumorov, v každom spojenom type (pozri Montenarh, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992, Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992, Zambetti a Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993).In the context of normal cells, the proliferation of oncogenes is likely to be inhibited, at least in part, by the generation of genes called tumor suppressors such as p53 and Rb. It is known that the p53 protein, at least in its wild form, is a transcription factor that negatively controls cell growth and cell division and that is capable of inducing apoptosis in certain situations (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347 , 1991). Because of these characteristics manifested in a stressful situation where the integrity of cellular DNA is at risk, p53 has been called a genome guardian. The mechanism of this cellular self-regulation can disrupt certain phenomena and favor the development of the neoplasm being formed. One such event involves mutations at the level of tumor suppressor genes. This is also because inactive forms of the Rb gene have been detected in various tumors, namely retinoblastomas or mesenchymal cancers, such as osteosarcomas, and also because of the presence of mutated p53 in 40% of human tumors, in each associated type ( see Montenarh, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992; Zambetti and Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993).

Zistenie biologických látok schopných interferovať na poruchy tohto typu bunkovej proliferácie a/alebo schopných nahradzovať tento typ zníženia schopnosti v tumor supresorových génoch je teda hlavným záujmom v terapeutickom prístupe kancerogenézy.Thus, the discovery of biological agents capable of interfering with disorders of this type of cell proliferation and / or capable of replacing this type of impairment in tumor suppressor genes is a major concern in the therapeutic approach to cancerogenesis.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Predložený vynález sa dotýka zistenia, že proteín GAX obsahuje potenciálny inhibítor bunkovej proliferácie indukovanej proteínmi ras. Dotýka sa najmä zistenia, že deregulácia bunkovej proliferácie v nádorových bunkách môže byť obnovená, keď sa tam exprimuje proteín GAX.The present invention relates to the discovery that the GAX protein contains a potential inhibitor of cell proliferation induced by ras proteins. In particular, it concerns the discovery that deregulation of cell proliferation in tumor cells can be restored when the GAX protein is expressed there.

Proteín. GAX obsahuje 303 aminokyselín. Charakterizovaná bola jeho sekvencia a klonovaná jeho cDNA (Gorski a kol., Mol. Celí. Biol. 1993, 6, 3722-3733). Gén GAX (growth arrest specific homeobox) pochádza zo skupiny homeotických génov. Tieto gény kódujú transkripčné faktory, ktoré obsahujú zhodné sekvencie (alebo homeodomény) rozpoznávajúce špecifické oblasti DNA (alebo homeoboxy) (pozri Gehring a kol., Celí, 78, 211-223, 1994).Protein. GAX contains 303 amino acids. Its sequence was characterized and its cDNA cloned (Gorski et al., Mol. Cell. Biol. 1993, 6, 3722-3733). The growth arrest specific homeobox (GAX) gene is derived from a family of homeotic genes. These genes encode transcription factors that contain identical sequences (or homeodomains) recognizing specific regions of DNA (or homeoboxes) (see Gehring et al., Cell, 78, 211-223, 1994).

Homeodoména potkanieho proteínu gax sa nachádza medzi aminokyselinami 185 a 245. Tento gén má určité vlastnosti podobné génom gas a Gadd, pretože sa zdá, že riadi prechod G0/G1 bunkového cyklu. Hladiny mRNA gax sú takto znížené v CMLV potkana s faktorom 10 po dvoch hodinách expozície s PDGF (Gorski a kol., Mol. Celí. Biol. 1993, 6, 3722-3733). Expresia génu gax je teda potlačená počas mitogénovej odpovedi CMLV. Tieto pozorovania majú svoju protihodnotu in vivo, pretože vnútorná hyperplázia u potkanov, vyvolaná abráziou krčnej tepny, je spojená so silným poklesom expresie gax (Weir a kol., J. Biol. Chem. 1995, 270, 5457-5461).The homeodomain of the rat gax protein is located between amino acids 185 and 245. This gene has certain properties similar to the gas and Gadd genes because it appears to control the G0 / G1 cell cycle transition. Gax mRNA levels are thus reduced in factor 10 CMLV after two hours of PDGF exposure (Gorski et al., Mol. Cell. Biol. 1993, 6, 3722-3733). Thus, expression of the gax gene is suppressed during the CMLV mitogenic response. These observations have their value in vivo because internal rat hyperplasia induced by carotid artery abrasion is associated with a strong decrease in gax expression (Weir et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 5457-5461).

Expresia génu gax bola zistená v kardiovaskulárnom systéme, menovite v srdci a aorte, a až doteraz bolo obmedzené použitie tohto génu v génovej terapii na úrovni buniek, ktoré tento gén exprimuj ú.Expression of the gax gene has been detected in the cardiovascular system, namely the heart and the aorta, and until now the use of this gene in gene therapy has been limited at the level of the cells expressing the gene.

Predkladáte! neočakávane objavil, že by bolo možné výhodné zhodnotiť inhibičnú aktivitu proteínu GAX, pokiaľ ide o bunkovú proliferáciu v nádorových bunkách, teda v bunkách, ktoré neexprimujú gén gax endogénnym spôsobom.Submitting! has unexpectedly discovered that it would be advantageous to evaluate the inhibitory activity of the GAX protein with respect to cell proliferation in tumor cells, i.e. cells that do not express the gax gene in an endogenous manner.

Predložený vynález sa tiež dotýka nového prístupu účinného najmä na liečenie nádorov súvisiacich s poruchou bunkovej proliferácie, napr. tumorov pľúc nie malých buniek, karcinómu pankreasu a tračníku, osteosarkómu, atď.. iThe present invention also relates to a novel approach particularly effective for treating tumors associated with a cell proliferative disorder, e.g. non-small cell lung tumors, pancreatic and colon carcinoma, osteosarcoma, etc. i

Predložený vynález opisuje najmä účinné systémy umožňujúce in vivo vnesenie takýchto zlúčenín priamo do nádorov, a tak bojovať proti vývoju rakoviny.In particular, the present invention describes efficient systems enabling the in vivo delivery of such compounds directly to tumors, and thus combat cancer development.

Prvý predmet vynálezu spočíva teda v použití proteínu GAX alebo variantu tohto proteínu na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečbu rakoviny.Accordingly, a first object of the invention is the use of a GAX protein or variant thereof for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of cancer.

Použitie sa dotýka najmä nukleovej kyseliny kódujúcej celý proteín GAX alebo aspoň jeho časť, alebo variantu tohto proteínu na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečbu rakoviny.In particular, the use concerns a nucleic acid encoding all or at least a portion of the GAX protein, or a variant thereof, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of cancer.

Ako je už naznačené, môže ísť o gén kódujúci celý alebo časť proteínu GAX alebo varianty tohto proteínu. V zmysle predloženého vynálezu termín variant označuje každý mutant, fragment alebo peptid, ktorý ešte má biologickú vlastnosť proteínu GAX, rovnako ako každý homológ proteínu GAX získaný z iných druhov. Tieto fragmenty a varianty môžu byť získané všetkými technikami, ktoré sú známe odborníkom, menovite genetickou modifikáciou, chemickou modifikáciou alebo - enzýmovou modifikáciou, alebo tiež či klonovaním, expresiou umožňujúcou výber účinkom ich biologickej aktivity. Genetické hybridizáciou variantov s modifikácie zahŕňajú supresie, delécie, mutácie, atď. .As indicated above, it may be a gene encoding all or part of the GAX protein, or variants thereof. For the purposes of the present invention, the term variant refers to any mutant, fragment or peptide that still has the biological property of the GAX protein, as well as any homologue of the GAX protein obtained from other species. These fragments and variants can be obtained by any technique known to those skilled in the art, namely by genetic modification, chemical modification or enzyme modification, or also by cloning, expression allowing selection by the effects of their biological activity. Genetic hybridization of variants with modifications include suppression, deletion, mutation, etc. .

Nukleotidová sekvencia môže kódovať celok alebo časť potkanieho proteínu GAX alebo jeden z jeho variantov.The nucleotide sequence may encode all or part of the rat GAX protein or one of its variants.

Gén použitý v zmysle predloženého vynálezu je menovite gén kódujúci potkaní proteín GAX alebo jeho ľudský homológ. Môže menovite ísť o cDNA alebo gDNA.In particular, the gene used in the sense of the present invention is a gene encoding the rat GAX protein or a human homologue thereof. Namely, it may be cDNA or gDNA.

Nárokovaná nukleotidová sekvencia môže byť samotná injikovaná na úrovni miesta ošetrenia, alebo môže byť priamo inkubovaná s bunkami určenými na zničenie alebo na liečenie. Opísalo sa, že samotné nukleové kyseliny môžu penetrovať do buniek bez účasti vektora. Napriek tomu sa v rámci predloženého vynálezu uprednostňuje použitie podávaného vektora, umožňujúce zvýšiť (i) účinok bunkovej penetrácie, (ii) zacielenie, (iii) extra i vnútrobunkovú stabilitu.The claimed nucleotide sequence may itself be injected at the site of treatment, or may be directly incubated with cells to be destroyed or treated. It has been reported that nucleic acids alone can penetrate cells without the involvement of a vector. Nevertheless, it is preferred within the scope of the present invention to use the administered vector to enhance (i) the effect of cell penetration, (ii) targeting, (iii) extra and intracellular stability.

Použité môžu byť rôzne typy vektorov. Môže ísť o vektory vírusové alebo nevírusové.Different types of vectors can be used. These may be viral or non-viral vectors.

Vektor podlá vynálezu môže teda byť nevírusovým činiteľom, schopným podporovať prenos a expresiu nukleotidovej sekvencie v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Chemické alebo biochemické vektory predstavujú zaujímavú alternatívu voči prírodným vírusom, najmä z dôvodu jednoduchosti, bezpečnosti a tiež absencie teoretického limitu, čo sa týka veľkosti DNA na transfekciu.Thus, the vector of the invention may be a non-viral agent capable of promoting the transfer and expression of the nucleotide sequence in prokaryotic or eukaryotic cells. Chemical or biochemical vectors represent an interesting alternative to natural viruses, especially for reasons of simplicity, safety and also the absence of a theoretical limit on the size of DNA for transfection.

Tieto syntetické vektory majú dve základné funkcie, skondenzovať nukleovú kyselinu na transfekciu a podporovať jej bunkovú fixáciu, rovnako aj jej prechod cez plazmatickú membránu, a ak je treba, aj cez dve jadrové membrány. Na zmiernenie polyaniónovej povahy nukleových kyselín majú všetky nevírusové vektory náboje polykatiónové.These synthetic vectors have two basic functions, to condense a nucleic acid for transfection and to promote its cellular fixation, as well as its passage through the plasma membrane and, if necessary, through two nuclear membranes. To mitigate the polyanionic nature of nucleic acids, all non-viral charge vectors have polycationic charges.

Najviac účinné spomedzi synteticky pripravených vektorov sú katiónové polyméry polylyzínového typu, (LKLK)n, (LKKL)n, polyetylénimín a DEAE-dextrán alebo tiež katiónové lipidy alebo lipofektanty. Majú schopnosť kondenzovať DNA a podporovať jej spojenie s bunkovou membránou. Medzi týmito posledne menovanými sa môžu uviesť lipopolyamíny (lipofektamín, transfektám, atď.) a rôzne katiónové lipidy alebo neutrálne lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE, atď.) alebo lipozómy. Neskoršie bol vyvinutý koncept cielenej transfekcie, ktorý podľa návodu využíva princíp kondenzácie DNA vďaka katiónovému polyméru, ktorý riadi fixáciu komplexu na membránu vďaka chemickej väzbe medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora prítomným na povrchu bunkového typu, ktorý je potrebné očkovať. Bol tiež opísaný ciel receptorov transferínu, -inzulínu alebo receptorov asialoglykoproteínov hepatocytov.Among the synthetically prepared vectors, the most effective are cationic polymers of the polylysine type, (LKLK) n , (LKKL) n , polyethyleneimine and DEAE-dextran, or else cationic lipids or lipofectants. They have the ability to condense DNA and promote its association with the cell membrane. Among the latter, mention may be made of lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc.) and various cationic lipids or neutral lipids (DOTMA, DOGS, DOPE, etc.) or liposomes. Later, a concept of targeted transfection was developed which, according to the instructions, uses the principle of DNA condensation due to a cationic polymer that controls the fixation of the complex to the membrane due to the chemical bond between the cationic polymer and the membrane receptor ligand present on the cell type surface to be vaccinated. The target of transferrin, -insulin, or hepatocyte asialoglycoprotein receptors has also been described.

Nukleotidové sekvencie použité v predloženom vynáleze môžu byť pripravované z pohladu podávania, a to topikálne, orálne, parenterálne, intranasálne, intravenózne, intramuskulárne, podkožné, intraokulárne, transdermálne, atď.. Nukleotidová sekvencia je používaná najmä v injikovatelnej forme. Môže to byť teda zmes každého farmaceutický akceptovateľného prostriedku na injikovateľnú formu, predovšetkým na priamu injikáciu na úrovni miesta na ošetrenie. Môže ísť najmä o sterilné roztoky, izotonické roztoky alebo suché kompozície, konkrétne lyofilizované, ktoré po pridaní sterilnej vody alebo prípadne fyziologického séra, umožňujú prípravu injikovatelnej formy. Priama injikácia nukleotidovej sekvencie do nádoru pacienta je zaujímavá preto, lebo umožňuje sústrediť terapeutický účinok na úrovni postihnutého tkaniva. Dávky nukleotidovej sekvencie môžu byť prispôsobené funkcii rôznych parametrov, najmä funkcii vektora, spôsobu použitého podávania, patológii alebo tiež dĺžke predpokladaného liečenia.The nucleotide sequences used in the present invention can be prepared from the perspective of administration, namely, topically, orally, parenterally, intranasally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intraocularly, transdermally, etc. The nucleotide sequence is used in particular in an injectable form. Thus, it may be a mixture of any pharmaceutically acceptable composition for injectable form, in particular for direct injection at the site of treatment. In particular, they may be sterile solutions, isotonic solutions or dry compositions, in particular lyophilized, which, after addition of sterile water or, optionally, physiological serum, make it possible to prepare an injectable form. Direct injection of the nucleotide sequence into the patient's tumor is of interest because it allows to concentrate the therapeutic effect at the level of the affected tissue. The doses of the nucleotide sequence may be adapted to the function of the various parameters, in particular the function of the vector, the mode of administration used, the pathology or also the duration of the intended treatment.

Na uskutočnenie predloženého vynálezu je výhodné použiť predovšetkým defektný rekombinantný vírus.In particular, it is preferred to use a defective recombinant virus for carrying out the present invention.

Je teda možné použiť adenovírusy, herpesvírusy, retrovírusy a odnedávna tiež vírusy AAV. Tieto vektory sa javia výkonné najmä v prípade zamýšľanej transfekcie.Thus, it is possible to use adenoviruses, herpesviruses, retroviruses and, more recently, AAV viruses. These vectors appear particularly efficient in the case of the intended transfection.

Druhý predmet predloženého vynálezu sa dotýka defektného rekombinantného vírusu obsahujúceho celý alebo len časť proteínu GAX, alebo varianty tohto proteínu. Vynález tiež spočíva v použití takéhoto vírusu na liečenie rakoviny. Podľa vynálezu vložený gén, alebo prítomný gén vo vektoroch, môže byť fragmentom komplementárnej DNA (cDNA), genómovej DNA (gDNA) alebo hybridná konštrukcia zložená napríklad z cDNA, do ktorej je vložený jeden alebo viac intrónov. Môže takisto ísť o syntetické alebo semisyntetické sekvencie.A second object of the present invention relates to a defective recombinant virus comprising all or part of the GAX protein, or a variant thereof. The invention also resides in the use of such a virus for the treatment of cancer. According to the invention, the inserted gene, or the gene present in the vectors, can be a fragment of complementary DNA (cDNA), genomic DNA (gDNA) or a hybrid construct composed, for example, of a cDNA into which one or more introns are inserted. They may also be synthetic or semi-synthetic sequences.

Vložený gén všeobecne obsahuje tiež sekvencie umožňujúce jeho expresiu v infikovanej bunke. Môže ísť o sekvencie, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu vyššie uvedeného génu, keď sú tieto sekvencie schopné fungovať v infikovanej bunke. Môže tiež ísť o sekvencie odlišného pôvodu (zodpovedné za expresiu iných proteínov 'alebo rovnakých syntetických). Menovite môže ísť o sekvencie eukaryotických génov alebo vírusových génov, alebo o odvodené sekvencie, ktoré špecifickým alebo nešpecifickým spôsobom stimulujú alebo potláčajú transkripciu génov či už indukovatelným alebo neindukovatelným spôsobom. Napríklad môže ísť o sekvencie promótorov získané z genómu bunky, ktorá má byť infikovaná, alebo z genómu vírusov, menovite ide o promótory génov E1A, MLP z adenovírusu, promótor CMV, LTR-RSV, atď. Ako eukaryotické promótory môžu byť uvedené napríklad promótory ubikvitinov (HPRT, vimintín, aktín, tubulín, atď.) , promótory koncových produktov (desmín, nervové zakončenie, keratín, GFAP, á.tď.) , promótory terapeutických génov (typ MDR, CFTR, faktor VIII, atď.) , špecifické promótory tkanív (promótory aktínu buniek hladkého svalstva), promótory prednostne účinné v bunkovom delení alebo tiež promótory zodpovedajúce za stimuly (receptor steroidných hormónov, receptor retinovej kyseliny, atď.). Okrem toho, tieto sekvencie môžu byť modifikované adíciou aktivačných sekvencií, regulačných sekvencií, atď.. Na druhej strane, keď vložený gén neobsahuje expresné sekvencie, môže byť vložený do genómu defektného vírusu v smere takejto sekvencie.The inserted gene generally also contains sequences allowing its expression in an infected cell. These may be sequences which are naturally responsible for the expression of the aforementioned gene when these sequences are capable of functioning in the infected cell. They may also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins or the same synthetic). Namely, they may be sequences of eukaryotic genes or viral genes, or derived sequences which, in a specific or non-specific manner, stimulate or suppress the transcription of genes, whether in an inducible or non-inducible manner. For example, they may be promoter sequences obtained from the genome of the cell to be infected, or from the genome of viruses, namely the E1A, MLP from adenovirus, CMV, LTR-RSV promoters, and so on. As eukaryotic promoters, for example, ubiquitin promoters (HPRT, vimintine, actin, tubulin, etc.), end-product promoters (desmin, nerve endings, keratin, GFAP, etc.), therapeutic gene promoters (MDR type, CFTR, factor VIII, etc.), specific tissue promoters (smooth muscle actin promoters), promoters preferably effective in cell division, or also promoters responsible for stimuli (steroid hormone receptor, retinoic acid receptor, etc.). In addition, these sequences may be modified by the addition of activation sequences, regulatory sequences, etc. On the other hand, when the inserted gene does not contain expression sequences, it may be inserted into the genome of the defective virus downstream of such a sequence.

Opačne vložený gén obsahuje signálnu sekvenciu všeobecne proti smeru kódujúcej sekvencie, ktorá riadi polypeptid syntetizovaný v sekrečných cestách cieľovej bunky. Táto signálna sekvencia môže byť signálnou sekvenciou pôvodom z GAX proteínu, ale môže tiež ísť o každú inú funkčnú signálnu sekvenciu (napríklad signálna sekvencia génu tymidínkinázy) alebo o umelo vytvorenú signálnu sekvenciu.The reverse-inserted gene comprises a signal sequence generally upstream of the coding sequence that directs the polypeptide synthesized in the secretory pathways of the target cell. This signal sequence may be a signal sequence originating from a GAX protein, but may also be any other functional signal sequence (e.g., a thymidine kinase gene signal sequence) or an artificially generated signal sequence.

Vírusy podía predloženého vynálezu sú defektné, teda neschopné replikovať sa autonómnym spôsobom v cieľovej bunke. Všeobecne je genóm defektného vírusu, použitého v rámci predloženého vynálezu, zbavený sekvencií, ktoré sú nevyhnutné na replikáciu vyššie uvedeného vírusu : v infikovanej bunke. Tieto oblasti môžu byť buď vylúčené (úplne alebo čiastočne) alebo zbavené funkčnosti alebo nahradené inými sekvenciami, najmä vloženým génom. Defektný vírus má pritom zachované sekvencie svojho genómu, ktoré sú nevyhnutné na enkapsidáciu vírusových častíc.The viruses of the present invention are defective, i.e., unable to replicate autonomously in the target cell. In general, the genome of the defective virus used in the present invention is devoid of sequences which are necessary for the replication of the above virus : in the infected cell. These regions may either be excluded (wholly or partially) or devoid of functionality or replaced by other sequences, in particular the inserted gene. The defective virus retains the sequences of its genome which are essential for encapsidation of the virus particles.

Existujú rôzne sérotypy adenovírusov, ktorých štruktúra a vlastnosti sa dosť menia. V rámci predloženého vynálezu sa z takýchto sérotypov prednostne používajú ľudské adenovírusy typu 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovírusy zvieracieho pôvodu (pozri prihláška WO94/26914). V rámci predloženého vynálezu použiteľných adenovírusov zvieracieho pôvodu môžu byť uvedené adenovírusy psieho, hovädzieho, myšacieho pôvodu (napríklad: Mavl, Beard a koľ., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo tiež opičieho pôvodu (napríklad: SAV). Adenovírus zvieracieho pôvodu je výhodne psí adenovírus, menovite adenovírus CAV2 (napríklad souche manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800)). Adenovírusy, ľudského, psieho pôvodu (alebo ich zmes) sa výhodne používajú v rámci predloženého vynálezu.There are various serotypes of adenoviruses whose structure and properties vary quite a lot. Of the serotypes of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad2 or Ad5) or adenoviruses of animal origin are preferably used (see WO94 / 26914). Adenoviruses of canine, bovine, murine (e.g., Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), sheep, porcine, avian, or also monkey (e.g. SAV) adenoviruses of animal origin can be mentioned within the scope of the present invention. . The adenovirus of animal origin is preferably a canine adenovirus, namely a CAV2 adenovirus (e.g. Manhattan or A26 / 61 (ATCC VR-800)). Adenoviruses of human, canine origin (or mixtures thereof) are preferably used in the present invention.

Defektné adenovírusy predloženého vynálezu prednostne obsahujú ITR, sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu nukleovej kyseliny, ktorá je predmetom záujmu. Menovite v genóme adenovírusu podľa vynálezu je nefunkčná minimálne oblasť El. Uvažovaný vírusový gén môže byť zbavený funkčnosti technikami známymi všetkým odborníkom, predovšetkým úplnou supresiou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo viacerých báz v uvažovanom alebo uvažovaných génoch. Takéto modifikácie môžu byť získané in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ, napríklad prostredníctvom techník z odboru genetiky alebo tiež prostredníctvom mutagénnych činidiel. Modifikované môžu byť aj ďalšie oblasti, menovite oblasť E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697) . Podľa uprednostneného spôsobu uskutočnenia podľa vynálezu, adenovírus obsahuje deléciu v oblasti El a E4. Podľa iného spôsobu uprednostneného uskutočnenia, obsahuje deléciu v oblasti El na úrovni, do ktorej sú vložené oblasť E4 a sekvencia kódujúca GAX (pozri FR94 13355). Delécia v oblasti El vo vírusoch podlá vynálezu sa nachádza' konkrétne medzi nukleotidmi 455 až 3329 v sekvencií adenovírusu Ad5.The defective adenoviruses of the present invention preferably comprise an ITR, a sequence allowing encapsidation of the nucleic acid of interest. Namely, in the adenovirus genome of the invention, a minimal E1 region is non-functional. The viral gene contemplated may be rendered inoperative by techniques known to those skilled in the art, in particular by complete suppression, substitution, partial deletion or addition of one or more bases in the gene (s) under consideration. Such modifications may be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example by means of genetic engineering techniques or also by mutagenic agents. Other regions may also be modified, namely E3 (WO95 / 02697), E2 (WO94 / 28938), E4 (WO94 / 28152, WO94 / 12649, WO95 / 02697) and L5 (WO95 / 02697). According to a preferred embodiment of the invention, the adenovirus comprises a deletion in the E1 and E4 regions. According to another embodiment of the preferred embodiment, it comprises a deletion in the E1 region at the level into which the E4 region and the GAX coding sequence are inserted (see FR94 13355). The deletion in the E1 region of the viruses according to the invention is in particular between nucleotides 455 to 3329 in the Ad5 adenovirus sequence.

Defektné rekombinantné adenovírusy podľa predloženého vynálezu môžu byť pripravené známymi technikami pre všetkých odborníkov (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Môžu byť pripravené konkrétne všeobecnou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom nesúcim okrem iného aj sekvenciu, ktorá je predmetom záujmu. Všeobecná rekombinácia vzniká po kotransfekcii prispôsobenej bunkovej línie s. vyššie uvedeným adenovírusom a plazmidom. Použitá bunková línia byť (i) transformovatelná uvedenými elementmi, (ii) obsahovať sekvencie schopné doplniť časť genómu defektného adenovírusu, menovite v integrovanej forme, aby sa zabránilo nebezpečenstvu rekombinácie. Ako takáto línia sa môže použiť napríklad ľudská embryonálna obličková línia 293 (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje konkrétne ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12%) zahrnutú vo svojom genóme, alebo sa môže použiť línia schopná doplniť funkcie El a E4 tak, ako je to opísané v prihláške vynálezu WO94/26914 a WO95/02697.The defective recombinant adenoviruses of the present invention can be prepared by known techniques to all skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they may be prepared by general recombination between an adenovirus and a plasmid carrying, inter alia, a sequence of interest. General recombination occurs after cotransfection of the matched cell line with. by the above-mentioned adenovirus and plasmid. The cell line used may be (i) transformable with said elements, (ii) contain sequences capable of complementing a portion of the genome of the defective adenovirus, namely in integrated form, to avoid the risk of recombination. For example, the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), which contains specifically the left portion of the Ad5 adenovirus genome (12%) involved in its genome, may be used, or may use a line capable of complementing the E1 and E4 functions as described in WO94 / 26914 and WO95 / 02697.

Adenovírusy, ktoré sa namnožia, sa potom získajú a purifikujú pomocou klasických techník molekulárnej biológie.The adenoviruses that are multiplied are then recovered and purified using conventional molecular biology techniques.

Čo sa týka vírusov AAV, ide o DNA vírusy s relatívne malou veľkosťou, ktoré sa začleňujú do genómu buniek, ktoré infikujú stabilne a s miestnou špecificitou. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez toho, aby indukovali účinok na rast, morfológiu alebo bunkovú diferenciáciu. Na druhej strane, nezdá sa, že by boli patogénne pre ľudí. Genóm ΆΆ,ν bol klonovaný, sekvenovaný i charakterizovaný. Obsahuje okolo 4700 báz a na každom konci obsahuje oblasť obrátenej repetície (ITR) so 145 bázami, ktoré sú počiatkom replikácie pre vírus. Zvyšok genómu je rozdelený na dve oblasti, ktoré nesú funkcie enkapsidácie: ľavú časť genómu, ktorá obsahuje gén rep zahrnutý do vírusovej replikácie a expresie vírusových génov, a pravú časť genómu, ktorá obsahuje gén cap, ktorý kóduje kapsidové proteíny vírusu.As far as AAV viruses are concerned, they are DNA viruses of relatively small size, which are incorporated into the genome of cells that infect stably and with local specificity. They are capable of infecting a broad spectrum of cells without inducing an effect on growth, morphology or cell differentiation. On the other hand, they do not seem to be pathogenic to humans. The genome ΆΆ, ν has been cloned, sequenced and characterized. It contains about 4700 bases and contains, at each end, an inverted repeat region (ITR) of 145 bases, which is the origin of replication for the virus. The remainder of the genome is divided into two regions carrying the encapsidation functions: the left portion of the genome that contains the rep gene involved in viral replication and viral gene expression, and the right portion of the genome that contains the cap gene that encodes the capsid proteins of the virus.

Použitie vektorov odvodených od AAV na prenos génov in vitro a in vivo bolo opísané v literatúre (pozri konkrétne WO91/18088, WO93/09239, US5 139,941, EP 488 528). Tieto prihlášky vynálezov opisujú rôzne konštrukcie odvodené od AAV, v ktorých gény rep alebo cap sú deletované a nahradené génom, ktorý je predmetom záujmu a tiež opisujú ich použitie na prenos in vitro (do bunkovej kultúry) alebo in vivo (priamo v organizme) vyššie uvedeného génu záujmu. Defektné rekombinantné AAV podľa predloženého vynálezu môžu byť pripravené v infikovanej bunkovej línii pomocným ľudským vírusom (napríklad adenovírusom) kotransfekciou s plazmidom obsahujúcim požadovanú nukleotidovú tThe use of AAV-derived vectors for gene transfer in vitro and in vivo has been described in the literature (see in particular WO91 / 18088, WO93 / 09239, US5 139,941, EP 488 528). These inventions disclose various AAV-derived constructs in which the rep or cap genes are deleted and replaced by the gene of interest and also describe their use for transfer in vitro (into cell culture) or in vivo (directly in the organism) of the above. gene of interest. Defective recombinant AAVs of the present invention can be prepared in an infected cell line by helper human virus (e.g., adenovirus) by cotransfection with a plasmid containing the desired nucleotide t

sekvenciu ohraničenú dvoma oblasťami obrátenej repetície (ITR) AAV a plazmidom nesúcim gény enkapsidácie (gény rep a cap) AAV.a sequence flanked by two AAV reversed repeat regions (ITRs) and a plasmid carrying the AAV encapsidation genes (rep and cap genes).

Produkované rekombinantné vírusy sú ďalej purifikované klasickými technikami. Vynález sa teda dotýka tiež rekombinantných vírusov odvodených od AAV, ktorých genóm obsahuje sekvenciu kódujúcu proteín GAX ohraničenú s ITR vírusu AAV. Takýto plazmid môže byť použitý samotný na prenos sekvencie GAX, prípadne môže byť začlenený do lipozómového vektora (pseudovírus).The recombinant viruses produced are further purified by conventional techniques. Thus, the invention also relates to recombinant AAV-derived viruses whose genome comprises a sequence encoding the GAX protein flanked by the ITR of AAV. Such a plasmid may be used alone to transmit the GAX sequence, or may be incorporated into a liposome vector (pseudovirus).

Čo sa -týka retrovírusov, konštrukcie rekombinantných vektorov boli široko opísané v literatúre: pozri najmä EP 453242, EP 178220, Bernestein a kol., Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atď. Retrovírusy sú integratívne vírusy infikujúce deliace sa bunky. Genóm retrovírusov obsahuje konkrétne dve LTR, sekvenciu enkapsidácie a tri kódujúce oblasti (gag, pol, a env). V rekombinantných vektoroch odvodených z retrovírusov, gény gag, pol a env sú všeobecne deletované úplne alebo čiastočne, a nahradené heterológnou sekvenciou nukleovej kyseliny, ktorá je predmetom záujmu. Tieto vektory môžu byť odvodené z rôznych typov retrovírusov, ako sú konkrétne MoMuLV (murine moloney leukémia virus, tiež označený ako MoMLV), MSV (murine moloney sarcoma vírus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (rous sarcoma virus) alebo tiež z Friendovho vírusu.Regarding retroviruses, the construction of recombinant vectors has been widely described in the literature: see in particular EP 453242, EP 178220, Bernestein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, and the like. Retroviruses are integrative viruses infecting dividing cells. In particular, the retrovirus genome comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol, and env). In recombinant vectors derived from retroviruses, the gag, pol and env genes are generally deleted in whole or in part, and replaced by the heterologous nucleic acid sequence of interest. These vectors can be derived from various types of retroviruses such as, in particular, MoMuLV (murine moloney leukemia virus, also referred to as MoMLV), MSV (murine moloney sarcoma virus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV ( rous sarcoma virus) or also from Friend's virus.

Na konštrukciu rekombinantných retrovírusov obsahujúcich podlá vynálezu sekvenciu kódujúcu GAX, je všeobecne vytvorený plazmid, nesúci konkrétne LTR sekvenciu enkapsidácie a vyššie uvedenú kódujúcu sekvenciu, následne použitý na transfekciu tzv. enkapsidačnej bunkovej línie, ktorá je schopná priniesť v trans chybné funkcie do plazmidu. Enkapsidačné línie sú teda schopné exprimovať gény gag, pol a env. Takéto enkapsidačné línie boli opísané vo vedlajších odboroch, konkrétne línia PA317 (US4,861,719), línia PsiCRIP (W090/02806) a línia GP+envAm-12 (W089/07150). Rekombinantné vírusy môžu tiež obsahovať modifikácie na úrovni LTR na potlačenie transkripčnej aktivity, ako aj rozsiahle sekvencie enkapsidácie, ktoré obsahujú časť génu gag (Bender a kol., J. Virol. 61 (1987) 1639). Vyprodukované rekombinantné vírusy sú potom purifikované klasickými technikami.For the construction of recombinant retroviruses containing a GAX coding sequence according to the invention, a plasmid is generally generated, carrying a particular LTR encapsidation sequence and the above coding sequence, subsequently used for transfection of the so-called " an encapsidation cell line that is capable of delivering trans malfunctions into a plasmid. Thus, the encapsidation lines are capable of expressing the gag, pol and env genes. Such encapsidation lines have been described in the prior art, namely the PA317 line (US4,861,719), the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150). Recombinant viruses may also contain modifications at the LTR level to suppress transcriptional activity, as well as extensive encapsidation sequences that contain part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). The recombinant viruses produced are then purified by conventional techniques.

Na liečenie rakoviny je mimoriadne výhodné použiť defektný rekombinantný adenovírus. Je možné použiť relatívne malé množstvo účinnej látky (rekombinantný adenovírus), ktoré velmi rýchlo umožňuje zvýšenie jeho účinku na miestach ošetrenia. Adenovírusy podlá vynálezu sú tiež schopné exprimovať vysokú hladinu vloženého génu gax, ktorý spôsobuje zvýšený terapeutický účinok. Z dôvodu ich epizómového charakteru, adenovírusy podlá vynálezu majú limitovanú stabilitu v deliacich sa bunkách a majú teda dočasný účinok dokonale prispôsobený žiadanému terapeutickému účinku.For the treatment of cancer, it is particularly advantageous to use a defective recombinant adenovirus. A relatively small amount of the active ingredient (recombinant adenovirus) can be used which very rapidly allows its effect to be increased at the treatment sites. The adenoviruses of the invention are also capable of expressing a high level of the inserted gax gene which causes an enhanced therapeutic effect. Because of their episome nature, the adenoviruses of the invention have limited stability in dividing cells and thus have a temporary effect perfectly matched to the desired therapeutic effect.

Dávky vírusov použitých na injekciu môžu byť prispôsobené funkciám rôznych parametrov, konkrétne spôsobu použitého podávania a dĺžky požadovaného liečenia. Rekombinantné vírusy všeobecne podľa predloženého vynálezu sú formulované a podávané vo forme dávok medzi 104 až 1014 pfu/ml. Pre AAV a adenovírusy môže byť použitá dávka tiež od 106 do 1O10 pfu/ml. Termín pfu (plaque forming units) zodpovedá infekčnej schopnosti suspenzie viriónov a je daná infekciou príslušnej bunkovej kultúry a meraná po 48 hodinách počtom plakov infikovaných buniek. Techniky určenia veľkosti pfu vírusového roztoku sú dobre opísané v literatúre.The doses of viruses used for injection may be adapted to the functions of various parameters, namely the mode of administration used and the duration of treatment desired. The recombinant viruses generally of the present invention are formulated and administered in doses of between 10 4 to 10 14 pfu / ml. For AAV and adenoviruses, a dose of from 10 6 to 10 10 pfu / ml may also be used. The term pfu (plaque forming units) corresponds to the infectious ability of the virion suspension and is determined by infection of the respective cell culture and measured after 48 hours by the number of plaques of the infected cells. Techniques for determining the pfu size of a viral solution are well described in the literature.

Predložený vynález je výhodne použitý in vivo na deštrukciu buniek v hyperproliferácii (to znamená v nenormálnej proliferácii).The present invention is preferably used in vivo to destroy cells in hyperproliferation (i.e., abnormal proliferation).

Predložený vynález je tiež použiteľný na deštrukciu nádorových buniek. Je vhodný najmä na liečenie rakoviny, v ktorej je obsiahnutý aktívny onkogén. Napríklad sa môžu uviesť adenokarcinómy tračníka, rakovina štítnej žľazy, karcinómy plúc, myeloidná leukémia, rakovina prsníka, rakovina pľúc, rakovina žalúdka, rakovina pažeráka, lymfóm B, rakovina vaječníka, rakovina močového mechúra, atď..The present invention is also applicable to the destruction of tumor cells. It is particularly suitable for the treatment of cancer in which an active oncogene is contained. For example, colon adenocarcinomas, thyroid cancer, lung cancer, myeloid leukemia, breast cancer, lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, lymphoma B, ovarian cancer, bladder cancer, etc. may be mentioned.

Toto liečenie sa môže dotýkať ako človeka, tak aj každého zvieraťa, ako sú ovce, dobytok, domáce zvieratá (psy, mačky, atď.), kone, ryby, atď. .This treatment may affect both human and any animal, such as sheep, cattle, pets (dogs, cats, etc.), horses, fish, etc. .

Nasledujúce obrázky a príklady bližšie ilustrujú vynález, aj keď v žiadnom smere neobmedzujú jeho rozsah.The following figures and examples illustrate the invention in more detail, although they do not limit its scope in any way.

Prehľad obrázkov na výkresochBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Obrázok 1: Plazmid pCOl.Figure 1: Plasmid pCO1.

Obrázok 2: Plazmid pXL-CMV-GaxHA Figure 2: Plasmid pXL-CMV-Gax HA

Obrázok 3: Účinok expresie AdCMV gax na bunkovú proliferáciu ľudských nádorových buniek H460.Figure 3: Effect of AdCMV gax expression on cell proliferation of human H460 tumor cells.

Obrázok 4: Nádorové bunky H460 liečené adenovírusom AdCMV gax s M.O.I. 1000 (obrázok 4A) , M.O.I. 100 (obrázok 4B) a M.O.I. 1000 (obrázok 4C).Figure 4: H460 tumor cells treated with AdCMV gax adenovirus with M.O.I. 1000 (Figure 4A), M.O.I. 100 (Figure 4B) and M.O.I. 1000 (Figure 4C).

Obrázok 5: Účinok AdCMV gax na bunkovú proliferáciu ľudských nádorových buniek Saos.Obrázok 6: Účinok expresie AdCMV gax na bunkovú proliferáciu ľudských nádorových buniek H358.Figure 5: Effect of AdCMV gax on cell proliferation of human tumor cells Saos. Figure 6: Effect of AdCMV gax expression on cell proliferation of human tumor cells H358.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Všeobecné techniky molekulovej biológieGeneral techniques of molecular biology

Metódy klasicky používané v molekulárnej biológii, ako sú preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, centrifugácia plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza v agarózovom alebo polyakrylamidovom géli, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínov fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, zrážanie DNA etanolom alebo izopropanolom v prostredí soli, transformácia Escherichia coli, atď., sú odborníkom dobre známe metódy a sú široko opísané v odbornej literatúre (Maniatis T. a kol., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel F.M. a kol., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987) .Methods classically used in molecular biology such as preparative plasmid DNA extraction, cesium chloride gradient centrifugation of plasmid DNA, agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, purification of DNA fragments by electroelution, protein extraction with phenol or a mixture of phenol and ethanol, isopropanol precipitation salts, transformation of Escherichia coli, etc., are well known to those skilled in the art and are widely described in the literature (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, and Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982, Ausubel FM et al., (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987).

Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy série M13 sú komerčného pôvodu (Bethesda Research Laboratories).Plasmids of type pBR322, pUC and phages of the M13 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).

Na ligáciu môžu byť fragmenty DNA separované podľa ich veľkosti elektroforézou v agarózovom géli, extrahované fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, zrážané etanolom, následne inkubované v prítomnosti T4 DNA ligázy (Biolabs) podľa odporúčania dodávateľa.For ligation, DNA fragments can be separated according to their size by agarose gel electrophoresis, extracted with phenol or a mixture of phenol and chloroform, precipitated with ethanol, then incubated in the presence of T4 DNA ligase (Biolabs) as recommended by the supplier.

Doplňovanie prečnievajúcich 5' koncov môže byť uskutočnené Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podľa odporúčania dodávateľa. Odstránenie prečnievajúcich 3' koncov sa uskutočňuje v prítomnosti T4 DNA polymerázy I (Biolabs) podľa odporúčania výrobcu. Odstránenie prečnievajúceho 5' konca sa uskutočňuje pôsobením SI nukleázy.Addition of the overhanging 5 'ends can be performed with the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I (Biolabs) as recommended by the supplier. Removal of the protruding 3 'ends is performed in the presence of T4 DNA polymerase I (Biolabs) as recommended by the manufacturer. Removal of the protruding 5 'end is accomplished by treatment with SI nuclease.

In vitro riadená mutagenéza so syntetickými oligonukleotidmi môže byť uskutočnená podľa metódy vyvinutej Taylorom a kol. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) s použitím súpravy dodávanej firmou Amersham.In vitro directed mutagenesis with synthetic oligonucleotides can be performed according to the method developed by Taylor et al. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764) using the kit supplied by Amersham.

Enzýmová amplifikácia fragmentov DNA tzv. technikou PCR (Polymerase-catalysed Chain Reaction, Saiki R. K. a kol., Science 230 (1985) 1350-1354, Mullis K.B. a Faloona F.A., Meth. Enzým. 155 (1987) 335-350) môže byť uskutočnená s použitím DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) podľa odporúčania výrobcu.Enzymatic amplification of DNA fragments PCR technique (Polymerase-catalysed Chain Reaction, Saiki RK et al., Science 230 (1985) 1350-1354, Mullis KB and Faloona FA, Meth. Enzyme. 155 (1987) 335-350) can be performed using a DNA thermal cycler. (Perkin Elmer Cetus) as recommended by the manufacturer.

Overenie nukleotidových sekvencií môže byť uskutočnené metódou podľa Sangera a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) s použitím súpravy, ktorú dodáva firma Amersham.Verification of nucleotide sequences can be performed by the method of Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467) using a kit supplied by Amersham.

Príklad 1Example 1

I iI i

Konštrukcia vektora pXL-CMV-GaxHA nesúceho kódujúci proteín gax pod kontrolou CMV promótoraConstruction of pXL-CMV-GaxHA vector carrying the gax coding protein under the control of the CMV promoter

Tento príklad opisuje konštrukciu vektora obsahujúceho cDNA kódujúci proteín gax (druh: potkan) a adenovírusovú sekvenciu umožňujúcu rekombináciu. Epitop hemaglutinínu vírusu chrípky (druh HA1) obsahujúci 16 aminokyselín, je pridaný k N-koncu proteínu gax (Field a kol., Mol. Celí. Biol. 8: 2159-2165, 1988).This example describes the construction of a vector comprising a cDNA encoding a gax protein (species: rat) and an adenoviral sequence allowing recombination. The 16 amino acid influenza hemagglutinin epitope (HA1 species) is added to the N-terminus of the gax protein (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165, 1988).

Tento postup pridania epitopu umožňuje sledovať expresiu proteinu gax imunofluorescenčnými technikami pomocou špecifických protilátok proti epitopu HA1. Okrem svojej citlivosti, táto metóda umožňuje potlačiť šum pozadia, ktorý je výsledkom expresie endogénneho proteinu gax zároveň in vivo aj in vitro.This epitope addition procedure allows the expression of the gax protein by immunofluorescence techniques using specific antibodies against the HA1 epitope. In addition to its sensitivity, this method makes it possible to suppress background noise resulting from expression of the endogenous gax protein both in vivo and in vitro.

1.1. Konštrukcia plazmidu pCOl (obrázok 1)1.1. Construction of plasmid pCO1 (Figure 1)

A-Konštrukcia plazmidu pCEA-Construction of plasmid pCE

Fragment EcoRI-Xbal zodpovedajúci ľavému koncu genómu adenovirusu Ad5 sa naj-skôr naklonuje medzi miesta EcoRI a Xbal vektora pIC19H. Tým sa vytvorí plazmid pCA. Plazmid sa potom štiepi s Hinfl, jeho 5' prečnievajúce konce sa doplnia Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I E. coli, následne sa plazmid štiepi s EcoRI. Takto vytvorený fragment plazmidu pCA, ktorý obsahuje ľavý koniec genómu adenovirusu Ad5, sa následne klonuje medzi miesta EcoRI a Smal vektora pIC20H (Marsh a kol., Gene 32 (1984) 481).The EcoRI-XbaI fragment corresponding to the left end of the Ad5 adenovirus genome is first cloned between the EcoRI and XbaI sites of the vector pIC19H. This creates the plasmid pCA. The plasmid is then digested with Hinfl, its 5 'overhanging ends are complemented with a Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, followed by digestion with EcoRI. The pCA plasmid fragment thus formed, which contains the left end of the Ad5 adenovirus genome, is subsequently cloned between the EcoRI and SmaI sites of the vector pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481).

Tým sa vytvorí plazmid pCB. Plazmid pCB sa následne štiepi s EcoRI, jeho 5' prečnievajúce konce sa doplnia Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I E. coli a potom sa štiepi s BamHI. Takto vytvorený fragment plazmidu pCB, ktorý obsahuje lavý koniec genómu adenovirusu Ad5, sa potom klonuje medzi miesta Nrul a BglII vektora pIC20H. Tým sa vytvorí plazmid pCE, ktorého zaujímavou črtou je, že má 382 prvých párov báz adenovirusu Ad5 s nasledujúcim multiklonovacím miestom.This generates the plasmid pCB. Plasmid pCB is subsequently digested with EcoRI, its 5 'overhanging ends are complemented with a Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I and then digested with BamHI. The pCB plasmid fragment thus generated, which contains the left-hand end of the Ad5 genome, is then cloned between the Nrul and BglII sites of the vector pIC20H. This creates a plasmid pCE whose interesting feature is that it has 382 first base pairs of Ad5 adenovirus followed by a multicloning site.

B-Konštrukcia plazmidu pCDB-Construction of plasmid pCD

Fragment Sau3A (3346) - SstI (3645) a fragment SstI (3645)- NarI (5519) genómu adenovirusu Ad5 sa najprv spoja, klonujú medzi miesta Clal a BamHI vektora pIC20H, tým sa vytvorí plazmid pPY53. Fragment Sali - Taql z plazmidu pPY53, pripravený v súvislosti dam, ktorý obsahuje medzi miestami Sau3A (3346) a Taql (5207) časť genómu adenovirusu Ad5, sa potom klonuje medzi miesta Sali a Clal vektora pIC20H a tým, sa vytvorí plazmid pCA'.The Sau3A fragment (3346) - SstI (3645) and the SstI (3645) - NarI (5519) fragment of the Ad5 adenovirus genome were first spliced, cloned between the ClaI and BamHI sites of the pIC20H vector to create plasmid pPY53. The SalI-TaqI fragment from plasmid pPY53, prepared in connection with the dams, which contains a portion of the Ad5 adenovirus genome between Sau3A (3346) and Taql (5207), is then cloned between the SalI and ClaI sites of pIC20H vector to generate plasmid pCA '.

Fragment Taql (5207) - NarI (5519) genómu adenovírusu Ad5 pripravený v súvislosti dam a fragment Sali - Taql z plazmidu pCA' sa spojí a klonuje medzi miesta Sali a NarI vektora pIC20H. Tým sa vytvorí plazmid pCC' . Fragment NarI (5519) - Nrul (6316) genómu adenovírusu Ad5 pripraveného v súvislosti dam a fragment Sali - Nrul z plazmidu pCC' sa potom spoja a klonujú medzi miesta Sali a Nrul vektora pIC20R. Tým sa vytvorí plazmid pCD'.The Ad5 adenovirus genome of the Taq1 (5207) - NarI (5519) genome prepared in connection with the dams, and the SalI-TaqI fragment from plasmid pCA 'were joined and cloned between the SalI and NarI sites of the vector pIC20H. This generates the plasmid pCC '. The NarI (5519) - Nrul (6316) fragment of the Ad5 adenovirus genome prepared in dams and the SalI-Nrul fragment from plasmid pCC 'are then ligated and cloned between the SalI and Nrul sites of the vector pIC20R. This generates the plasmid pCD '.

C-Konštrukcia plazmidu pCOlC-Construction of plasmid pCO1

Čiastočným štiepením s Xhol a následným úplným štiepením so Sali sa z plazmidu pCD' vytvorí fragment, ktorý obsahuje sekvenciu adenovírusu Ad5, od miesta Sau3A (3446) po miesto Nrul .(6316) . Tento fragment sa klonuje do miesta Sali plazmidu pCE. Tým sa vytvorí plazmid pCOl (obrázok 1) , ktorý obsahuje ľavú časť adenovírusu Ad5 až po miesto Hinfl (382), multiklonovacie miesto a fragment Sau3A (3446) - Nrul (6316) z adenovírusu Ad5.By partial digestion with XhoI and subsequent complete digestion with SalI, the plasmid pCD 'is made into a fragment containing the Ad5 adenovirus sequence from the Sau3A site (3446) to the Nrul site (6316). This fragment was cloned into the SalI site of plasmid pCE. This creates a plasmid pCO1 (Figure 1) that contains the left portion of the Ad5 adenovirus up to the Hinf1 (382) site, the multicloning site, and the Sau3A (3446) - Nrul (6316) fragment from the Ad5 adenovirus.

1.2. Konštrukcia vektora pXL-CMV-Gax1^ (pozri obrázok 2) cDNA proteínu Gax sa klonuje medzi miesta Xbal - BamHI vektora pCGN (Tanaka a Herr, Celí 60: 375-386, 1990) . Vytvorený vektor pGCN-Gax obsahuje skorý promótor a sekvenciu leucínového zipsu cytomegalovírusu (CMV) (—522, +72, Boshart a kol., Celí,1.2. Construction of the vector pXL-CMV-Gax 1 (see Figure 2) The Gax protein cDNA is cloned between the XbaI-BamHI sites of the vector pCGN (Tanaka and Herr, Cell 60: 375-386, 1990). The generated pGCN-Gax vector contains the early promoter and cytomegalovirus (CMV) leucine zipper sequence (5222, +72, Boshart et al., Cell,

41: 521-530, 1985), vedúcu sekvenciu tymidínkinázy Herpes vírusu zahrňujúcu iniciačný kodón AUG ako aj prvé tri aminokyseliny (+55, +104, Rusconi a Yamamoto, EMBO J. 6: 1309-1315, 1987), sekvenciu kódujúcu epitop HA1, cDNA potkanieho proteínu gax a nakoniec polyadenylačnú sekvenciu génu β-globínu Lapin (Päbo a kol., 35: 445-453, 1983).41: 521-530, 1985), the Herpes virus thymidine kinase leader sequence including the AUG initiation codon as well as the first three amino acids (+55, +104, Rusconi and Yamamoto, EMBO J. 6: 1309-1315, 1987), a sequence encoding HA1 epitope , the rat gax protein cDNA, and finally the polyadenylation sequence of the β-globin Lapin gene (Päbo et al., 35: 445-453, 1983).

Vektor pCGN-Gax sa potom štiepi s XmnI a Sfil a získaný fragment, ktorý obsahuje promótor, cDNA a polyadenylačnú sekvenciu, sa doplní s Klenowovým fragmentom a vloží do EcoRV miesta kyvadlového vektora pCOl obsahujúceho adenovírusovú sekvenciu nevyhnutnú na rekombináciu. Získaný plazmid bol označený ako pXL-CMV-Gax^ (pozri obrázok 2).The pCGN-Gax vector is then digested with XmnI and SfiI and the resulting fragment containing the promoter, cDNA and polyadenylation sequence is complemented with the Klenow fragment and inserted into the EcoRV site of the pCO1 shuttle vector containing the adenoviral sequence necessary for recombination. The plasmid obtained was designated as pXL-CMV-Gax (see Figure 2).

Príklad 2Example 2

Konštrukcia rekombinantného adenovirusu Ad-CMV gaxConstruction of recombinant adenovirus Ad-CMV gax

Vektor pXL-CMV-GaxHA pripravený v príklade 1 je ďalej linearizovaný a použitý na kotransfekciu pomocných buniek (línia 293) , ktoré v trans nesú funkcie kódované oblasťami adenovirusu • E1 (E1A a E1B)r na rekombináciu s adenovírusovým chybným vektorom.The pXL-CMV-Gax HA vector prepared in Example 1 is further linearized and used to cotransfect helper cells (line 293) that, in trans, carry the functions encoded by the adenovirus • E1 regions (E1A and E1B) r for recombination with an adenoviral defective vector.

Adenovírus Ad-CMV gax sa získa všeobecnou rekombináciou in vivo medzi adenovírusom Ad.RSVβgal (Stratford-Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) a vektorom pXL-CMV-GaxHA podľa nasledovného protokolu: vektor pXL-CMV-GaxHA linearizovaný s enzýmom XmnI a adenovírus Ad.RSVPgal linearizovaný s Clal sa použijú na kotransfekciu línie 293 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého, aby sa umožnila všeobecná rekombinácia. Takto vytvorený rekombinantný adenovírus sa selektuje purifikáciou z plaku. Po izolácii sa rekombinantný adenovírus amplifikuje v bunkovej línii 293, čo vedie k vzniku kultúry, ktorá obsahuje nepurifikovaný rekombinantný defektný adenovírus, ktorý má koncentráciu okolo 1O10 pfu/ml.Ad-CMV gax adenovirus is obtained by general in vivo recombination between Ad.RSVβgal adenovirus (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) and the pXL-CMV-Gax HA vector according to the following protocol: pXL vector -CMV-Gax HA linearized with XmnI and Ad.RSVPgal Cla1 linearized adenovirus are used to cotransfect line 293 in the presence of calcium phosphate to allow general recombination. The recombinant adenovirus thus generated is selected by plaque purification. After isolation, the recombinant adenovirus is amplified in cell line 293, resulting in a culture that contains an unpurified recombinant defective adenovirus having a concentration of about 10 pfu / ml.

Vírusové častice sa purifikujú odstreďovaním v gradiente chloridu cézneho podľa známych techník (pozri konkrétne Graham a kol., Virology 52 (1973) 456). Adenovírus Ad-CMV gax sa uchováva pri -80 °C v 10% glycerole.Viral particles are purified by cesium chloride gradient centrifugation according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456). The Ad-CMV gax adenovirus is stored at -80 ° C in 10% glycerol.

Príklad 3Example 3

Riadenie expresie Ad-CMV gax v ľudských nádorových bunkáchControl of Ad-CMV gax expression in human tumor cells

H460H460

Ľudské nádorové bunky H4 60 odvodené z nie malých buniek rakoviny pľúc boli transdukované rekombinantným adenovírusom AdCMV gax a riadiacim vírusom exprimujúcim β-galaktozidázu (Ad-RSVβς^Ι) so stúpajúcou multiplicitou infekcie (M.O.I.) (obrázok 3). Po jeden a pol hodinovej inkubácii v prítomnosti adenovírusového roztoku sa obnoví kultivačné médium obsahujúce 10% fetálne sérum a bunky sa inkubujú počas jednej 48 hodinovej periódy. Životaschopnosť buniek sa kontroluje vylučovacím testom, ktorý určí počet živých buniek v každej jamke. Používajú sa dva podiely adenovírusu AdCMV gax, Ad-gax a Ad-gax(2), ktoré zodpovedajú dvom nezávislým produktom v bunkách 293. Aktivita týchto dvoch podielov sa javí ako porovnateľná a dobre odlíšiteľná od kontrolného adenovírusu Α1Ρ5νβ93ΐ.Human H460 tumor cells derived from non-small lung cancer cells were transduced with recombinant AdCMV gax adenovirus and a control virus expressing β-galactosidase (Ad-RSVβς ^ Ι) with increasing multiplicity of infection (M.O.I.) (Figure 3). After one and a half hour incubation in the presence of the adenovirus solution, the culture medium containing 10% fetal serum is recovered and the cells are incubated for one 48 hour period. Cell viability is checked by an exclusion assay to determine the number of viable cells in each well. Two portions of AdCMV gax, Ad-gax and Ad-gax (2) are used, which correspond to two independent products in cells 293. The activity of these two portions appears to be comparable and well distinguishable from the control adenovirus Α1Ρ5νβ93ΐ.

Použitie Ad-RSV^gal umožnilo predbežne ukázať zvýšenú schopnosť rekombinantných adenovírusov transdukovať bunky H4 60. Aktivita Pgal v jadre bola detegovaná vo viac ako 75% buniek liečených s Ad-RSV-^gal (M.O.I. 1000). Expresia proteínu gax bola súčasne dokázaná imunofluorescenčne v bunkách transdukovaných s Ad-CMV gax. Účinok transdukcie vírusu Ad-CMV gax a Ad-RSV-Pgal sa javí ako porovnateľný. Liečenie buniek H460 s Ad-CMV gax je spojené so zníženou bunkovou proliferáciou, ale tiež s vysokou cytotoxicitou detegovanou 48 hodín po transdukcii s adenovírusom (pozri obrázky 4A, 4B a 4C) . Takýto účinok nebol pozorovaný s kontrolným adenovírusom. To teda ukazuje, že silná expresia proteínu gax je sprevádzaná so zastavením rastu buniek H460.The use of Ad-RSV-gal enabled to show in advance the increased ability of recombinant adenoviruses to transduce H4 60 cells. Pgal activity in the nucleus was detected in more than 75% of cells treated with Ad-RSV-gal (M.O.I. 1000). The expression of the gax protein was simultaneously detected by immunofluorescence in cells transduced with Ad-CMV gax. The effect of transduction of Ad-CMV gax and Ad-RSV-Pgal appears to be comparable. Treatment of H460 cells with Ad-CMV gax is associated with decreased cell proliferation but also with high cytotoxicity detected 48 hours after transduction with adenovirus (see Figures 4A, 4B and 4C). Such an effect was not observed with the control adenovirus. Thus, it shows that strong expression of the gax protein is accompanied by arrest of H460 cell growth.

Je zaujímavé, že bunky H460 exprimujú mutovaný proteín ras (Ki-ras). Prekvapujúco to ukazuje na fakt, že expresia proteínu gax umožňuje obnoviť riadenie bunkovej proliferácie, ktorá je spočiatku deregulovaná s modifikovaným proteínom ras. Dominantný charakter faktoru gax vzhľadom na onkogénnu mutáciu proteínu ras, nie je obmedzený iba na karcinómy pľúc. Podobné výsledky, teda zastavenie rastu AdCMV gax, boli získané aj v bunkách HCT116, ktoré sú odvodené z karcinómu tračníka. V tejto bunkovej línii boli popísané mutácie onkogénu ras (G13C) a génu DCC (Brattain a kol., Cancer Research, 41: 1751-1756, 1981).Interestingly, H460 cells express a mutated ras protein (Ki-ras). Surprisingly, this suggests that expression of the gax protein makes it possible to restore control of cell proliferation, which is initially deregulated with the modified ras protein. The dominant character of gax with respect to oncogenic mutation of ras protein is not limited to lung carcinomas. Similar results, i.e., arrest of growth of AdCMV gax, were also obtained in colon-derived HCT116 cells. Mutations of the ras oncogene (G13C) and the DCC gene have been described in this cell line (Brattain et al., Cancer Research, 41: 1751-1756, 1981).

Príklad 5Example 5

Riadenie expresie Ad-CMV-gax v ľudských nádorových bunkách v prostredí p53.Control of Ad-CMV-gax expression in human tumor cells in p53 environment.

Bunky H358, odvodené z nie malých buniek karcinómu pľúc, tvoria model zníženia schopnosti pre proteín p53. Táto bunková línia predstavuje deléciu homozygoty génu p53 (Maxwell a Roth, Oncogene 8: 3421, 1993). Adenovírus Ad-gax výhodne a účinne .blokuje rast buniek H358 a vyvoláva 48 hodín po transdukcii s adenovírusom vysokú cytotoxicitu (obrázok 5) . Táto bunková smrť nie je detegovaná v prítomnosti kontrolného adenovírusu Ad-RSVPgal. To ukazuje na fakt, že silná expresia gax špecificky a účinne blokuje rast nádorových buniek odvodených z karcinómu pľúc. Tieto údaje neobmedzujú iba bunky odvodené z karcinómu pľúc. Rast ľudských buniek Saos, odvodených z osteosarkómu, je tiež blokovaný po pôsobení Ad-CMV gax. Bunky Saos tvoria bunkový model v prostredí p53 a pRb. Toto zastavenie rastu je závislé na koncentrácii použitých vírusov a nie je pozorované po transdukcii rakovinových buniek kontrolným vírusom (obrázok 6). Takisto viac ako 90% buniek Saos-2 je pozitívnych s aktivitou Pgal po indukcii AdRSV Pgal pri multiplicite infekcie 250. Za rovnakých experimentálnych podmienok (multiplicita infekcie 250), AdCMV gax znižuje životaschopnosť buniek na 70%. Predkladáte! prekvapivo zistil pri proteíne Gax, ktorý bol opísaný ako gén zastavenia rastu, že zastavenie rastu je nasledované smrťou bunky, javu podobnému apoptóze.H358 cells, derived from non-small lung carcinoma cells, form a model of impaired ability for the p53 protein. This cell line represents a deletion of the p53 gene homozygote (Maxwell and Roth, Oncogene 8: 3421, 1993). Ad-gax adenovirus advantageously and efficiently blocks the growth of H358 cells and induces high cytotoxicity 48 hours after transduction with adenovirus (Figure 5). This cell death is not detected in the presence of the control adenovirus Ad-RSVPgal. This suggests that strong gax expression specifically and effectively blocks the growth of lung cancer-derived tumor cells. These data are not limited to cells derived from lung cancer. The growth of human osteosarcoma-derived Saos cells is also blocked following treatment with Ad-CMV gax. Saos cells form a cell model in p53 and pRb environments. This growth arrest is dependent on the concentration of viruses used and is not observed after transduction of cancer cells with the control virus (Figure 6). Also, more than 90% of Saos-2 cells are positive with Pgal activity after induction of AdRSV Pgal at 250 multiplicity of infection. Under the same experimental conditions (250 multiplicity of infection), AdCMV gax reduces cell viability to 70%. Submitting! surprisingly, for the Gax protein, which has been described as a growth arrest gene, growth arrest is followed by cell death, an apoptosis-like phenomenon.

Protihodnota bunkovej smrti in vivo, vyvolaná silnou expresiou proteínu Gax, môže byť výhodne prijatá ako terapeutická výhoda pre pacientov s rakovinou.Advantageously, the in vivo cell death induced by strong Gax protein expression can be advantageously accepted as a therapeutic advantage for cancer patients.

Claims (13)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Použitie proteínu GÄX alebo variantu tohto proteínu na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakoviny.Use of a GαX protein or a variant thereof for the preparation of a pharmaceutical composition for treating cancer. 2. Použitie aspoň jednej nukleotidovej sekvencie kódujúcej celok alebo časť proteínu GAX alebo variantu tohto proteínu na prípravu kompozície určenej na liečenie rakoviny.Use of at least one nucleotide sequence encoding all or part of a GAX protein or variant thereof for the preparation of a composition for treating cancer. 3. Použitie podlá nároku 2, nukleotidovej sekvencie vo forme komplexu s DEAE-dextránom, s receptorovými proteínmi alebo s lipidmi alebo katiónovými polymérmi vo forme lipozómov alebo tiež iba jej samotnej.Use according to claim 2, the nucleotide sequence in the form of a complex with DEAE-dextran, with receptor proteins or with lipids or cationic polymers in the form of liposomes or even only thereof. 4. Použitie podlá nároku 2, nukleotidovej sekvencie tvoriacej časť rekombinantného vírusového vektora.Use according to claim 2, the nucleotide sequence forming part of the recombinant viral vector. 5. Použitie podľa nároku 4, nukleotidovej sekvencie tvoriacej časť vírusového vektora vybraného z adenovírusov, retrovírusov a AAV vírusov.The use of claim 4, the nucleotide sequence forming part of a viral vector selected from adenoviruses, retroviruses and AAV viruses. 6. Použitie podlá nároku 4 alebo 5, prednostne adenovírusu Ad5 alebo Ad2.Use according to claim 4 or 5, preferably Ad5 or Ad2. 7. Použitie piodľa nároku 4, 5 alebo 6, prednostne adenovírusu zvieracieho pôvodu, prednostne psieho pôvodu.Use according to claim 4, 5 or 6, preferably adenovirus of animal origin, preferably of canine origin. 8. Použitie podľa nárokov 2 až 7, nukleotidovej sekvencie kódujúcej celok alebo časť potkanieho proteínu GAX alebo variantu tohto proteínu.The use of claims 2 to 7, the nucleotide sequence encoding all or part of the rat GAX protein or variant thereof. 9. Použitie podľa nároku 8, nukleotidovej sekvencie kódujúcej potkaní proteín GAX alebo jeho ľudský homológ.The use of claim 8, the nucleotide sequence encoding the rat GAX protein or a human homologue thereof. 10. Použitie podľa nárokov 2 až 9, nukleotidovej sekvencie, ktorá je cDNA.The use according to claims 2 to 9, of a nucleotide sequence which is a cDNA. 11. Použitie podľa nárokov 2 až 9, nukleotidovej sekvencie, ktorá je gDNA.The use of claims 2 to 9, wherein said nucleotide sequence is gDNA. 12. Použitie podlá nárokov 4 až 11, nukleotidovej sekvencie obsahujúcej sekvencie umožňujúce jej expresiu v infikovanej bunke.Use according to claims 4 to 11, of a nucleotide sequence comprising sequences allowing its expression in an infected cell. 13. Použitie podlá nárokov 4 až 12, nukleotidovej sekvencie obsahujúcej signálnu sekvenciu riadiacu syntézu polypeptidu v sekrečných cestách cieľovej bunky.Use according to claims 4 to 12, a nucleotide sequence comprising a signal sequence directing the synthesis of the polypeptide in the secretory pathways of the target cell.
SK561-98A 1995-10-31 1996-10-28 Use of protein gax for treating cancer SK56198A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9512871A FR2740344B1 (en) 1995-10-31 1995-10-31 APPLICATION OF PROTEIN GAX TO THE TREATMENT OF CANCERS
PCT/FR1996/001690 WO1997016459A1 (en) 1995-10-31 1996-10-28 Use of protein gax for treating cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK56198A3 true SK56198A3 (en) 1998-11-04

Family

ID=9484112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK561-98A SK56198A3 (en) 1995-10-31 1996-10-28 Use of protein gax for treating cancer

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0858466A1 (en)
JP (1) JPH11514881A (en)
KR (1) KR19990067174A (en)
AU (1) AU730324B2 (en)
BR (1) BR9611206A (en)
CA (1) CA2233250A1 (en)
CZ (1) CZ131598A3 (en)
FR (1) FR2740344B1 (en)
HU (1) HUP9900011A3 (en)
NO (1) NO981822D0 (en)
SK (1) SK56198A3 (en)
WO (1) WO1997016459A1 (en)
ZA (1) ZA969147B (en)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2754822B1 (en) * 1996-10-18 1998-11-27 Rhone Poulenc Rorer Sa POLYPEPTIDES COMPRISING PROTEIN GAS DOMAINS, INVOLVED IN TRANSCRIPTION REPRESSION AND / OR INTERACTING WITH OTHER PROTEINS, CORRESPONDING NUCLEIC ACIDS AND USES THEREOF
WO2002000241A2 (en) * 2000-06-28 2002-01-03 Aventis Pharma S.A. Compositions and methods for regulating the cell cycle using a ki gene or polypeptide
JP5309159B2 (en) 2008-01-09 2013-10-09 コングク ユニバーシティ インダストリアル コーオペレーション コーポレーション Vaccine using baculovirus
KR101230913B1 (en) 2009-11-06 2013-02-07 중앙대학교 산학협력단 Nanoparticle-Based Gene Delivery Systems
KR101232123B1 (en) 2010-10-08 2013-02-12 연세대학교 산학협력단 Gene Delivery Systems Exhibiting Enhanced Tumor-Specific Expression with Recombinant Expression Control Sequence
EP2784155B1 (en) 2011-11-24 2018-06-13 Viromed Co. Ltd. Adenovirus producing novel cell line and the use thereof
KR101429696B1 (en) 2012-11-21 2014-08-13 국립암센터 Recombinant adenovirus with enhanced safety and anti-cancer activity and use thereof
WO2017065497A1 (en) 2015-10-12 2017-04-20 한양대학교 산학협력단 Adenovirus complex for gene transfer and gene therapy
WO2019117632A1 (en) 2017-12-13 2019-06-20 한양대학교 산학협력단 Recombinant adenoviruses and stem cells comprising same

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2705361B1 (en) * 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Viral vectors and use in gene therapy.
US5856121A (en) * 1994-02-24 1999-01-05 Case Western Reserve University Growth arrest homebox gene
FR2732357B1 (en) * 1995-03-31 1997-04-30 Rhone Poulenc Rorer Sa VIRAL VECTORS AND USE FOR THE TREATMENT OF HYPERPROLIFERATIVE DISORDERS, ESPECIALLY RESTENOSIS

Also Published As

Publication number Publication date
FR2740344B1 (en) 1997-11-21
CZ131598A3 (en) 1998-08-12
WO1997016459A1 (en) 1997-05-09
JPH11514881A (en) 1999-12-21
NO981822L (en) 1998-04-23
AU7498296A (en) 1997-05-22
AU730324B2 (en) 2001-03-01
FR2740344A1 (en) 1997-04-30
BR9611206A (en) 1999-03-30
HUP9900011A2 (en) 1999-04-28
ZA969147B (en) 1997-05-27
CA2233250A1 (en) 1997-05-09
NO981822D0 (en) 1998-04-23
HUP9900011A3 (en) 1999-11-29
EP0858466A1 (en) 1998-08-19
KR19990067174A (en) 1999-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Beyer et al. Oncoretrovirus and lentivirus vectors pseudotyped with lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein: generation, concentration, and broad host range
JP5807236B2 (en) Improved gene delivery system of tumor specific expression with recombined gene expression regulatory sequences
KR19980703454A (en) Viral vectors and their use for the treatment of hyperproliferative diseases, especially restenosis
US20080311608A1 (en) Antagonist of the oncogenic activity of the protein MDM2, and use thereof in the treatment of cancers
JP2001517452A (en) Retroviral vector containing a functional splice donor site and a functional splice acceptor site
AU728610B2 (en) Chimeric retrovirus/adenovirus system
US8921100B2 (en) Use of the adenoviral E2 late promoter
SK56198A3 (en) Use of protein gax for treating cancer
Arbuthnot et al. Hepatoma cell-specific expression of a retrovirally transferred gene is achieved by α-fetoprotein but not insulinlike growth factor II regulatory sequences
AU762973B2 (en) Methods and compositions for producing viral particles
WO1995027494A1 (en) DEFECTIVE HERPES AND DEFECTIVE ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTORS WITH p53 FOR THE TREATMENT OF CANCER
SK169898A3 (en) Circular replicative dna molecules, viral vector, cell modified by insertion of viral vector, pharmaceutical composition containing a viral vector, process for the preparation of circular replicative dna and use of viral vector
JP2004517610A (en) Self-rearranging DNA vector
MXPA98002924A (en) Application of the gax protein for the treatment of the cance
KR19990022193A (en) Delta pi62, variants thereof, nucleic acid sequences and uses
AU766153B2 (en) Use of negative regulation elements for nerve-specific expression of transgenes
US20040209240A1 (en) Anti-neoplastic viruses
WO2002064805A2 (en) Replication competent non-mammalian retroviral vectors
WO1996035455A1 (en) Gene therapy through transduction of oral epithelial cells