SK112996A3 - Firoblast growth factor-10 - Google Patents

Description

Fibroblastový rastový faktor-10

Oblasť techniky

Vynález sa týka novo identifikovaných polynukleotidov, polypeptidov kódovaných týmito polynukleotidmi, použitia týchto polynukleotidov a polypeptidov a výroby týchto polynukleotidov a polypeptidov. Polypeptidy podľa vyná< lezu sú konkrétne fibroblastový rastový faktor-10/heparín viažuci rastový faktor-IO, ďalej označované ako „FGF-10“. Vynález sa tiež týka inhibície pôsobenia týchto polypeptidov.

Doterajší stav techniky

Fibroblastové rastové faktory sú skupina proteinov, charakteristických väzbou na heparín, a preto sa tiež nazývajú heparín viažuce rastové faktory (F1BGF). Expresia rôznych týchto proteinov bola zistená v rôznych tkanivách a dochádza k nej pod zvláštnou časovou a priestorovou kontrolou. Tieto proteíny sú účinnými mitogénmi pre rôzne bunky mezodermálneho, ektodermálneho a endodermálneho pôvodu, zahrnujúce fibroblasty, korneálne a vaskulárne endoteliálne bunky, granulocyty, adrenálne kortikálne bunky, chondrocyty, myoblasty, bunky vaskulárneho hladkého svalstva, epiteliálne bunky šošovky, melanocyty, • * keratinocyty, oligodendrocyty, astrocyty, osteoblasty a hematopoietické bunky.

Každý z týchto proteinov má funkcie prekrývajúce sa s inými a tiež svoje jedinečné spektrum funkcií. Okrem schopnosti stimulovať proliferáciu vaskulárnych endoteliálnych buniek je ako FGF-1, tak FGF-2 chemotaktický pre endoteliálne bunky a u FGF-2 sa zistilo, že umožňuje endoteliálnym bunkám prenikať základovou membránou. V súlade s týmito vlastnosťami má FGF-1 i FGF-2 schopnosť stimulovať angiogenéziu. Ďalším významným rysom týchto rastových faktorov je ich schopnosť podporovať hojenie rán. Mnoho ďalších členov skupiny FGF zdieľa s FGF-1 a FGF-2 podobné účinky, ako je podpora angio2 genézie a hojenie rán. Ľ niektorých členov génovej rodiny FGF sa ukázalo, že indukujú tvorbu mezodermu a modulujú diferenciáciu neurónových buniek, adipocytov a buniek kostrového svalstva.

Okrem týchto biologických aktivít v normálnych tkanivách sa proteíny FGF zúčastňujú podpory tumorigenézie v karcinómoch a sarkómoch podporovaním vaskularizácie nádorov a ako transformujúce proteíny, ak je ich expresia de>.· regulovaná.

< Skupina FGF v súčasnej dobe pozostáva z ôsmych štruktúrne príbuzných polypeptidov. Gény pre každý z nich boli klonované a sekvenované. Dva z členov, FGF-1 a FGF-2, boli charakterizované pod rôznymi názvami, ale najčastejšie ako bázický, resp. kyslý fibroblastový rastový faktor. Normálne génové produkty ovplyvňujú všeobecnú proliferačnú schopnosť väčšiny buniek odvodených od mezodermu a neurocktodermu. Sú schopné indukovať angiogenéziu in vivo a môžu hrať významnú úlohu v rannom vývoji (Burgess, W.H. a Maciag, T., Annu. Rev. Biochem., 58:575-606 (1989)).

Eukaryotický expresný vektor, kódujúci vylučovanú formu FGF-1, bol zavedený génovým prenosom do prasačích tepien. Tento model definuje funkciu génu v arteriálnej stene in vivo. Expresia FGF-1 vyvolala v prasačích tepnách 21 dní po génovom prenose intimálne zosilnenie (Nabel, E.G., a d., Náture, 362:844-6 (1993)). Ďalej bolo demonštrované, že bázický fibroblastový rastový faktor môže regulovať rast a progresiu gliómov nezávisle na svojej úlohe pri angiogenézii nádorov a že toto pôsobenie môže vyžadovať uvoľňovanie alebo vylučovanie bázického fibroblastového rastového faktoru (Morrison, R.S. a d., J. Neurosci. Res., 34:502-9 (1993)).

Fibroblastové rastové faktory, ako je bázický FGF, sa ďalej zúčastňujú rastu buniek Kaposiho sarkómu in vitro (Huang, Y.Q., a d., J. Clin. Invest., 91:1191-7 (1993)). Ďalej bola sekvencia cDNA, kódujúca ľudský bázický fibroblastový rastový faktor, klonovaná za transkripčný promótor, rozpoznávaný RNA polymerázou bakteriofága T7. Bolo zistené, že takto získané bázické fibroblastové rastové faktory majú v testoch mitogenicity, syntézy plazminogé nového aktivátoru a angiogenézie biologickú aktivitu nerozlíšiteľnú od ľudského placentárneho fibroblastového rastového faktoru (Squires, C.H., a d., J. Biol. Chem. 263:16297-302 (1988)).

Patent US 5,155.214 opisuje v podstate čisté cicavčie bázické fibroblastové rastové faktory a ich výrobu. Je uvedená sekvencia aminokyselín hovädzieho a ľudského bázického fibroblastového rastového faktoru, rovnako ako sekvencia DNA, kódujúca polypeptid hovädzieho faktoru.

Polypeptid podľa vynálezu bol predbežne identifikovaný ako člen skupiny FGF v dôsledku homológie sekvencie aminokyselín s ostatnými členmi skupiny FGF.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú nové maturované polypeptidy, tvorené FGF-10 a jeho biologicky aktívnymi a diagnosticky alebo terapeuticky použiteľnými fragmentárni, analógmi a derivátmi. Polypeptidy podľa vynálezu sú ľudského pôvodu.

Predmetom vynálezu sú tiež izolované molekuly nukleových kyselín kódujúce FGF-10, zahrnujúce mRNA, DNA, cDNA, genómovú DNA a ich antimediátorové analógy a biologicky aktívne a diagnosticky alebo terapeuticky využiteľné fragmenty.

Ďalej je predmetom vynálezu spôsob výroby takéhoto polypeptidu rekombinačnými metódami s použitím rekombinačných vektorov, ako sú klonovacie a expresné plazmidy, použiteľné pri rekombinačnej výrobe proteínov FGF-10, a rekombinačných prokaryotických a/alebo eukaryotických hostiteľských buniek zahrnujúcich sekvenciu nukleovej kyseliny ľudského FGF-10.

Ďalej je predmetom vynálezu spôsob použitia takéhoto polypeptidu alebo polynuklcotidu kódujúceho taký peptid na terapeutické účely, napríklad na podporu hojenia rán, popálenín a vredov, na prevenciu neuronálneho poško denia v dôsledku neuronálnych porúch a na prevenciu starnutia pokožky a úbytku vlasov.

Ďalej sú predmetom vynálezu protilátky proti týmto polypeptidom.

Ďalej sú predmetom vynálezu antagonisti proti týmto polypeptidom, ktorých je možné použiť na inhibíciu pôsobenia takého polypeptidu, napríklad pri liečbe nádorov a hypervaskulárnych ochorení.

Ďalej sú predmetom vynálezu sondy nukleových kyselín, zahrnujúce molekuly nukleových kyselín s dostatočnou dĺžkou pre špecifickú hybridizáciu so sekvcnciami ľudského FGF-10.

Ďalej sú predmetom vynálezu diagnostické testy na detekciu ochorení alebo náchylnosti k ochoreniam, súvisiacich s mutáciami sekvencií nukleových kyselín FGF-10 alebo s hyperexpresiou polypeptidov kódovaných týmito sekvenciami.

Ďalej je predmetom vynálezu spôsob použitia týchto polypeptidov alebo polynukleotidov kódujúcich tieto polypeptidy pre. účely in vitro, súvisiace s vedeckým výskumom, syntézou DNA a výrobou vektorov DNA.

Vynález sa v jednom aspekte týka izolovaných molekúl nukleových kyselín (polynukleotidov), ktoré kódujú maturovaný polypeptid, ktorého odvodená sekvencia aminokyselín je zobrazená na obr. 1 (SEQ ID NO 2), alebo maturovaný polypeptid kódovaný cDNA klonu uloženého 4.3.1994 u ATCC pod číslom 75696.

Polynukleotid podľa vynálezu bol objavený najskôr v knižnici cDNA, odvodenej od Stýždňového ľudského tkaniva ranného štádia a potom bola nájdená cDNA s plnou dĺžkou v knižnici odvodenej od ľudskej mandle. Je štruktúrne príbuzný všetkým členom rodiny génov fibroblastového rastového faktoru a obsahuje otvorený čítací rámec kódujúci polypeptid so 18 1 aminokyselinami. Medzi vrcholné zhody patrí: 1) 37% identita a 67% sekvenčná podobnosť s FGF-9, izolovaným z mozgu, v úseku 129 aminokyselín; 2) 36% identita a 64% podob nosť s FGF-7 (keratinocytový rastový faktor) v oblasti 121 aminokyselín; 3) 33% identita a 55% podobnosť s FGF-1 (kyslý FGF) v úseku 1 10 aminokyselín. Okrem toho je v polypeptide podľa vynálezu zachovaná signatúra skupiny FGF/HBGF, tj. GXLX(S,T,A,G)X6(D,E)CXFXE (X znamená zvyšok ktorejkoľvek aminokyseliny, (D,E) znamená buď zvyšok D alebo E, X6 znamená 6 akýchkoľvek zvyškov aminokyselín).

Polynukleotid podľa vynálezu môže byť vo forme RNA alebo vo forme DNA, pričom DNA zahrnuje cDNA, genómovú DNA a syntetickú DNA. DNA môže byť dvojreťazcová alebo jednoreťazcová. Kódujúca sekvencia, ktorá kóduje maturovaný polypeptid, môže byť identická s kódujúcou sekvenciou uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO 1) alebo s kódujúcou sekvenciou uloženého klonu, alebo to môže byť odlišná kódujúca sekvencia v dôsledku repeticie alebo degenerácie genetického kódu, ktorá kóduje ten istý maturovaný polypeptid ako DNA na obr. 1 (SEQ ID NO 1) alebo uložená cDNA.

Polynukleotid, ktorý kóduje maturovaný polypeptid podľa obr. 1 (SEQ ID NO 2) alebo maturovaný polypeptid kódovaný uloženou cDNA, môže zahrňovať: iba kódujúcu sekvenciu pre maturovaný polypeptid; kódujúcu sekvenciu pre maturovaný polypeptid a ďalšiu kódujúcu sekvenciu, ako je vedúca alebo sekrečná sekvencia alebo sekvencia proproteínu; kódujúcu sekvenciu pre maturovaný polypeptid (a poprípade ďalšiu kódujúcu sekvenciu) a nekódujúcu sekvenciu, ako sú intróny alebo nekódujúce sekvencie 5’ a/alebo 3’ kódujúce sekvencie pre maturovaný polypeptid.

Výraz „polynukleotid kódujúci polypeptid“ zahrnuje polynukleotid, ktorý obsahuje iba kódujúcu sekvenciu pre polypeptid, rovnako ako polynukleotid, ktorý obsahuje ďalšiu kódujúcu a/alebo nekódujúcu sekvenciu.

Predmet vynálezu sa ďalej týka variantov vyššie opísaných polynukleotidov, ktoré kódujú fragmenty, analógy a deriváty polypeptidu, majúceho odvodenú sekvenciu aminokyselín podľa obr. 1 (SQ ID NO 2), alebo polypeptidu kódovaného cDNA uloženého klonu. Variantmi polynukleotidu môžu byť priro dzene sa vyskytujúce alelické varianty polynukleotidu alebo varianty polynukleotidu, prirodzene sa nevyskytujúce.

Vynález teda zahrnuje polynukleotidy kódujúce ten istý maturovaný polypeptid, aký je znázornený na obr. 1 (SEQ ID NO 2), alebo ten istý maturovaný polypeptid, aký je kódovaný cDNA uloženého klonu, rovnako ako varianty týchto polynukleotidov, ktoré kódujú fragment, derivát alebo analóg polypeptidu podľa obr. 1 (SEQ ID NO 2) alebo polypeptid kódovaný cDNA uloženého klonu. Také nukleotidové varianty zahrnujú delečné, substitučné a adičné alebo inzerčné varianty.

Ako je vyššie uvedené, polynukleotid môže mať kódujúcu sekvenciu, ktorou je prirodzene sa vyskytujúci alelický variant kódujúcej sekvencie znázornenej na obr. 1 (SEQ ID NO 1) alebo kódujúcej sekvencie uloženého klonu. Ako je známe, alelický variant je alternatívna forma polynukleotidovej sekvencie, ktorá môže mať substitúciu, deléciu alebo adíciu jedného alebo viac nukleotidov, ktorá podstatne nemení funkciu kódovaného polypeptidu.

Vynález zahrnuje tiež polynukleotidy, kde môže byť kódujúca sekvencia maturovaného polypeptidu fúzovaná v tom istom čítacom rámci s polynukleotidovou sekvenciou, ktorá napomáha expresii a sekrécii polypeptidu z hostiteľskej bunky, napríklad s vedúcou sekvenciou, ktorá funguje ako sekrečná sekvencia pre kontrolu transportu polypeptidu z bunky. Polypeptid majúci vedúcu sekvenciu je preproteín a jeho vedúca sekvencia môže byť odštiepená hostiteľskou bunkou za vzniku maturovanej formy polypeptidu. Polynukleotidy môžu tiež kódovať proproteín, ktorým je maturovaný protein plus pridané 5’-aminokyselinové zvyšky. Maturovaný protein, ktorý má prosekvenciu, je proproteín a jedná sa o inaktívnu formu proteínu. Akonáhle je prosekvencia odštiepená, zostáva aktívny maturovaný protein.

Polynukleotid podľa vynálezu teda napríklad môže kódovať maturovaný protein alebo protein s prosekvenciou alebo protein s prosekvenciou i presekvenciou (vedúcou sekvenciou).

P ο 1 y n u k 1 e o t i d y podľa vynálezu môžu mať tiež kódujúcu sekvenciu, fúzovanú v rámci s markerovou sekvenciou, ktorá umožňuje čistenie polypeptidu podľa vynálezu. Markerovou sekvenciou môže byť hexahistidínový úsek, dodaný vektorom pQE-9, umožňujúci čistenie maturovaného polypeptidu, fúzovaného s markerom, v prípade bakteriálneho hostiteľa, alebo napríklad môže byť markerovou sekvenciou hemaglutinínový (HA) úsek, ak sa používa cicavčí hostiteľ, napríklad bunky COS-7. Marker HA zodpovedá epitopu, odvodenému od proteínu chrípkového hemaglutinínu (Wilson, l., a d., Celí, 37:767 (1984)).

Vynález sa ďalej týka polynukieotidov, ktoré hybridizujú s vyššie opísanými sekvenciami, ak je medzi sekvenciami aspoň 50%, prednostne 70% identita. Vynález sa predovšetkým týka polynukieotidov, ktoré hybridizujú s vyššie opísanými polynukleotidmi pri striktných podmienkach. Výraz „striktné podmienky“ tu znamená, že k hybridizácii dôjde iba pri aspoň 95%, prednostne aspoň 97% identite medzi sekvenciami. Polynukleotidy, ktoré hybridizujú s vyššie opísanými polynukleotidmi vo výhodnom uskutočnení, si uchovávajú v podstate rovnakú biologickú funkciu alebo aktivitu, ako maturovaný polypeptid kódovaný cDNA podľa obr. 1 (SEQ ID NO 1) alebo uloženou cDNA.

Uvádzané uložené vzorky budú uchovávané podľa Budapeštianskej zmluvy o medzinárodnom uznávaní uloženia mikroorganizmov na účely patentového konania. Tieto vzorky sú uložené iba pre pohodlnosť a nepredstavujú pripustenie, že by uloženie bolo nutné podľa § 112 USC 35. Sekvencie polynukieotidov obsiahnutých v uložených materiáloch, rovnako ako sekvencie aminokyselín polypeptidov, ktoré sú nimi kódované, sú tu zahrnuté formou odkazu a sú rozhodujúce v prípade akéhokoľvek konfliktu s tu uvedeným popisom sekvencií. Na výrobu, použitie alebo predaj uložených materiálov môže byť vyžadovaná licencia a týmto sa žiadna taká licencia neudeľuje.

Vynález sa ďalej týka polypeptidu FGF-10, ktorý má odvodenú sekvenciu aminokyselín podľa obr. 1 (SEQ ID NO 2) alebo ktorý má sekvenciu aminokyselín kódovanú uloženou cDNA, rovnako ako fragmentov, analógov a derivátov takéhoto polypeptidu.

Výrazy „fragment“, „derivát“ a „analóg“ s odkazom na polypeptid podľa obr. 1 (SEQ JD NO 2) alebo polypeptid kódovaný uloženou cDNA znamenajú polypeptid, ktorý si uchováva v podstate rovnakú biologickú funkciu alebo aktivitu ako tento polypeptid. Analóg teda zahrnuje proproteín, ktorý môže byť aktivovaný odštiepením proproteínovej časti za vzniku aktívneho maturovaného polypeptidu.

Polypeptidom podľa vynálezu môže byť rekombinačný polypeptid, prírodný polypeptid alebo syntetický polypeptid, prednostne rekombinačný polypeptid.

Fragment, derivát alebo analóg polypeptidu podľa obr. 1 (SEQ ID NO 2) alebo polypeptidu kódovaného uloženou cDNA môže byť (i) taký, v ktorom je jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov nahradené konzervatívnym alebo nekonzervatívnvm aminokyselinovým zvyškom (prednostne konzervatívnym aminokyselinovým zvyškom) a týmto dosadeným aminokyselinovým zvyškom môže alebo nemusí byť zvyšok kódovaný genetickým kódom, alebo (ii) taký, v ktorom jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov obsahuje substituentovú skupinu, alebo (iii) taký, v ktorom je maturovaný polypeptid fúzovaný s inou zlúčeninou, ako je zlúčenina zvyšujúca polčas polypeptidu (napríklad polyetylénglykol), alebo (iv) taký, v ktorom sú k maturovanému peptidu fúzované ďalšie aminokyseliny, ako je vedúca alebo sekrečná sekvencia alebo sekvencia, ktorá sa používa na čistenie maturovaného polypeptidu alebo proproteínovej sekvencie. Tieto fragmenty, deriváty a analógy sa považujú za spadajúce do rozsahu znalostí odborníka na základe tu uvedených údajov.

Polypeptidy a polynukleotidy podľa vynálezu sa prednostne vyskytujú v izolovanej forme a prednostne sú čistené do homogenity.

Výraz „izolovaný“ znamená, že materiál je oddelený od svojho pôvodného prostredia (napríklad prirodzeného prostredia, ak sa vyskytuje prirodzene). Napríklad prirodzene sa vyskytujúci polynukleotid alebo polypeptid prítomný v živom živočíchovi sa neizoluje, ale ten istý polynukleotid alebo DNA alebo polypeptid, oddelený od niektorých alebo všetkých sprievodných materiálov v prirodzenom systéme, sa izoluje. Izoluje sa aj v prípade, že je polynukleotid súčasťou vektoru a/alebo keď je polynukleotid alebo polypeptid súčasťou zmesi, pretože taký vektor alebo zmes nie je súčasťou jeho prirodzeného prostredia.

Vynález sa týka tiež vektorov, ktorá zahrnujú polynukleotidy podľa vynálezu, hostiteľských buniek, ktoré sú podrobené genetickej manipulácii pomocou vektorov podľa vynálezu a výroby polypeptidov podľa vynálezu rekombinačnými metódami.

Hostiteľské bunky môžu byť podrobené genetickej manipulácii (transdukcii alebo transformácii alebo transfekcii) pomocou vektorov podľa vynálezu, ktorými môžu byť napríklad klonovacie vektory alebo expresné vektory. Vektor môže byť napríklad vo forme plazmidu, vírusovej častice, fága atď. Takto manipulované hostiteľské bunky môžu byť kultivované v konvenčnom živnom médiu, príslušne modifikovanom pre aktiváciu promótorov, selekciu transformantov alebo amplifikáciu génov FGF-10. Podmienky kultivácie, ako je teplota, pH apod., sú rovnaké, aké boli použité u hostiteľskej bunky zvolenej pre expresiu, a sú bežnému odborníkovi zrejmé.

Polynukleotid podľa vynálezu môže byť použitý na výrobu peptidu rekombinačnými metódami. Napríklad polynukleotidová sekvencia môže byť zahrnutá do jedného z rôznych expresných médií, predovšetkým vektorov alebo plazmidov pre expresiu polypeptidu. Tieto vektory zahrnujú chromozomálne, nechromozomálne a syntetické sekvencie DNA, napríklad deriváty SV40; bakteriálne plazmidy; fágovú DNA; kvasinkové plazmidy; vektory odvodené od kombinácií plazmidov a fágovej DNA, vírusovú DNA, ako je virus vakcinie, adenovírus, vírus hydinových kiahní a pseudorabies. Je však možné použiť aj akýkoľvek iný vektor alebo plazmid, pokiaľ sú v hostiteľovi replikovateľné a životaschopné.

Príslušné sekvencie DNA môžu byť do vektoru vložené rôznymi postupmi. Všeobecne sa sekvencia DNA vkladá známymi postupmi do príslušných miest reštrikčných endonukleáz. Tieto a ďalšie postupy spadajú do rozsahu znalostí odborníka.

Sekvencia DNA v expresnom vektore je operatívne naviazaná k príslušnej riadiacej sekvencii(iám) (promótoru) pre riadenie syntézy mRNA. Ako príklady takýchto promótorov je možné uviesť promótor LTR alebo SV40, lac alebo trp

E. coli, promótor Pi. fága lambda a ďalšie promótory, o ktorých je známe, že riadia expresiu génov v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách alebo ich vírusoch. Expresný vektor obsahuje tiež miesto väzby ribozómov pre iniciáciu translácie a terminátor transkripcie. Vektor môže tiež obsahovať príslušné sekvencie pre amplifikačnú expresiu.

Expresné vektory ďalej prednostne obsahujú gén poskytujúci fenotypický rys pre selekciu transformovaných hostiteľských buniek, ako je dihydrofolát reduktáza alebo neomycínová rezistencia pre eukaryotickú bunkovú kultúru alebo letracyklínová alebo ampicilínová rezistencia v E. coli.

Vektor, obsahujúci vyššie opísanú príslušnú sekvenciu DNA rovnako ako príslušný promótor alebo riadiacu sekvenciu, môže byť použitý na transformáciu vhodného hostiteľa, a tak umožniť expresiu proteínu hostiteľom. Ako príklady vhodných hostiteľov je možné uviesť bakteriálne bunky, ako je E. coli, Salmonella lyphimunum, Slreptomycex\ bunky pliesní, ako sú kvasinky; hmyzie bunky, ako je Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; zvieracie bunky, ako sú CHO, COS alebo Bowesov melanóm; adenovírusy, rastlinné bunky atď. Výber vhodného hostiteľa sa považuje za zrejmý pre odborníka na základe tu uvedených údajov.

Vynález konkrétne tiež zahrnuje rekombinačné konštrukty, zahrnujúce jednu alebo viac vyššie podrobne opísaných sekvencií. Konštrukty obsahujú vektor, ako je plazmid alebo vírusový vektor, do ktorého bola vložená sekvencia podľa vynálezu v priamej alebo spätnej orientácii. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu konštrukt ďalej obsahuje regulačné sekvencie, zahrnujúce napríklad promótor, operatívne viazaný k sekvencií. Odborníkovi sú známe a obchodne sú dostupné rôzne vhodné vektory a promótory. Ako príklady sa uvádzajú tieto vektory: Bakteriálne: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNHSa, pNHlóa, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTRC99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Phramacia). Eukaryotické: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Môžu však byť použité akékoľvek ďalšie vektory alebo plazmidy, pokiaľ sú v hostiteľovi replikovateľné a životaschopné.

Promótorové oblasti môžu byť z ktoréhokoľvek požadovaného génu selektované pomocou vektorov CAT (chloramfenikol transferáza) alebo iných vektorov so selektovateľnými markermi. Dvoma vhodnými vektormi sú pKK232-8 a pCM7. Konkrétne menovité bakteriálne promótory zahrnujú lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda Pr, Pi. a trp. Eukaryotické promótory zahrnujú bezprostredný ranný CMV, HSV tymidin kinázu, ranný a neskorý SV40, LTR z retrovírusov a myší metallotioneín-1. Voľba vhodného vektora a promótora spadá úplne do úrovne bežných znalostí v odbore.

V ďalšom uskutočnení sa vynález týka hostiteľských buniek obsahujúcich vyššie opísaný konštrukt. Hostiteľskou bunkou môže byť vyššia eukaryotická bunka, ako je cicavčia bunka, alebo nižšia eukaryotická bunka, ako je kvasinková bunka, alebo ňou môže byť prokaryotická bunka, ako je bakteriálna bunka. Zavedenie konštruktu do hostiteľskej bunky môže byť uskutočňované transfekciou fosforečnanom vápenatým, transfekciou sprostredkovanou DEAE-Dextranom alebo elektroporáciou (Davis, L., Dibner, M., Battey, 1., Basic Methods in Molecular Biology, 1986)).

Konštrukty v hostiteľských bunkách môžu byť použité bežným spôsobom na výrobu génového produktu kódovaného rekombinačnou sekvenciou. Alternatívne je možné polypeptidy podľa vynálezu vyrábať synteticky pomocou konvenčných peptidových syntetizátorov.

Maturované proteíny môžu byť exprimované v cicavčích bunkách, kvasinkách, baktériách alebo ďalších bunkách pod kontrolou príslušných promótorov. Na výrobu týchto proteínov môžu byť tiež použité bezbunkové translačné systémy s použitím RNA, odvodených od konštruktov DNA podľa vynálezu. Vhodné klonovacie a expresné vektory pre použitie v prokaryotických a eukaryotických hostiteľoch sú opísané v Sambrook a d., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydanie, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), táto publikácia je tu zahrnutá ako odkaz.

Transkripcia DNA, kódujúca polypeptidy podľa vynálezu, vyššími eukaryotmi, sa zvýši zavedením zosilňovacej (enhancerovej) sekvencie do vektoru. Enhancery sú elementy DNA, pôsobiace v polohe cis, obvykle o asi 10 až 300 bp, ktoré pôsobia na promótor za účelom zvýšenia jeho transkripcie. Ako príklady je možné uviesť enhancer SV40 na neskorej strane počiatku replikácie (bp 100 až 270), enhancer ranného promótoru cytomegalovírusu, polyomový enhancer na neskorej strane počiatku replikácie a adenovírusové enhancery.

Rekombinačné expresné vektory všeobecne obsahujú počiatok replikácie a selektovateľné markery, umožňujúce transformáciu hostiteľskej bunky, napríklad gén ampicilínovej rezistencie E. coli a gén S. cerevisiae TRPÍ, a promótor odvodený od vysoko exprimovaného génu na riadenie transkripcie štruktúrnej sekvencie v smere expresie. Také promótory môžu byť odvodené od operónov kódujúcich glykolytické enzýmy, ako je medzi inými 3-fosfoglycerát kináza (PGK), faktor a, kyslá fosfatáza alebo proteíny teplotného šoku. Heterológna štruktúrna sekvencia je nastavená do príslušnej fázy s translačnou, iniciačnou a terminačnou sekvenciou. Pripadne môže heterológna sekvencia kódovať fúzny proteín, zahrnujúci N-terminálny identifikačný peptid dodávajúci požadované charakteristiky, napríklad stabilizáciu alebo zjednodušené čistenie exprimovaného rekombinačného produktu.

Vhodné expresné vektory pre bakteriálne použitie sa konštruujú vložením štruktúrnej sekvencie DNA, kódujúcej požadovaný proteín, spolu s vhodnými translačnými, iniciačnými a terminačnými signálmi v operatívne čítacej fáze s funkčným promótorom. Vektor obsahuje jeden alebo viac fenotypických scleklovateľných markerov a počiatok replikácie, aby bolo zaistené zachovanie vektoru, a ak je to žiadúce, dosiahnutá amplifikácia v hostiteľovi. Vhodný prokaryotický hostitelia pre transformáciu zahrnujú E. coti, Bacillus subtilis, Salmonella lyphimurium a rôzne druhy rodov Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, avšak je možné podľa potreby voliť aj iné.

Ako neobmedzujúce príklady vhodných expresných vektorov pre bakteriálne použitie je možné uviesť vektory obsahujúce selektovateľný marker a bakteriálny počiatok replikácie, odvodené od komerčne dostupných plazmidov, zahrnujúcich genetické elementy známeho klonovacieho vektoru pBR.322 (ATCC 37017). Také komerčné vektory zahrnujú napríklad pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko) a GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA). Tieto „reťazcové“ sekcie pBR.322 sú kombinované s príslušným promótorom a štruktúrnou sekvenciou, ktorá má byť exprimovaná.

Po transformácii vhodného hostiteľského kmeňa a kultivácii hostiteľského kmeňa na príslušnú hustotu buniek sa zvolený promótor dereprimuje vhodnými prostriedkami (napríklad zmenou teploty alebo chemickou indukciou) a bunky sa ešte nejakú dobu kultivujú.

Bunky sa izolujú najčastejšie odstredením, rozrušia fyzikálnymi alebo chemickými prostriedkami a vzniknutý surový extrakt sa uchová pre ďalšie čistenie.

Mikrobiálne bunky, používané pri expresii proteínov, môžu byť rozrušené akoukoľvek bežnou metódou, napríklad cyklami zmrazovania a rozmrazovania, sonifikáciou, mechanickým rozrušením alebo použitím lyzačných prostriedkov.

Na expresiu rekombinačného proteínu môžu byť tiež použité rôzne cicavčie bunkové kultivačné systémy. Príklady cicavčích expresných systémov zahrnujú línie COS-7 opičích ľadvinových fibroblastov, opísané v Gluzman, Celí, 23:175 (1981), a ďalšie bunkové línie schopné expresie kompatibilného vektoru, napríklad bunkové línie C127, 3T3, CHO, HeLa a BHK. Cicavčie expresné vek tory obsahujú počiatok replikácie, vhodný promótor a enhancer a tiež všetky potrebné miesta väzby ribozómov, polyadenylačné miesto, miesta donorov a akceptorov zostrihu, terminačné sekvencie transkripcie a 5’-lemujúce neprepísané sekvencie. Na získanie požadovaných neprepísaných genetických elementov je možné použiť sekvenciu DNA, odvodenú od vírusového genómu SV40, napríklad počiatok SV40, ranný promótor, enhancer, zostrih a polyadenylačné miesta.

FGF-IO môže byť z rekombinačných bunkových kultúr izolovaný a čistený doposiaľ známymi metódami, zahrnujúcimi zrážanie síranom amónnym alebo etanolom, kyslú extrakciu, aniónovú alebo katiónovú výmennú chromatografiu, chromatografiu na fosfocelulóze, chromatografiu s hydrofóbnou interakciou, afinitnú chromatografiu, hydroxyapatitovú chromatografiu a lektínovú chromatografiu. Je možné použiť stupne opätovného skladania proteínu, ak je to nutné na kompletáciu konfigurácie maturovaného proteínu. Na konečné čistenie je možné použiť vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC).

Polypeptidy podľa vynálezu môžu predstavovať prirodzene čistený produkt alebo produkt chemických syntetických postupov alebo produkt získaný rekombinačnou technológiou z prokaryotického alebo eukaryotického hostiteľa (napríklad bakteriálnymi, kvasinkovými, vyššími rastlinnými, hmyzími a cicavčími bunkami v kultúre). V závislosti na hostiteľovi použitom v rekombinačnej produkčnej technológii môžu byť polypeptidy podľa vynálezu glykosylované cicavčími alebo inými eukaryotickými uhľohydrátmi alebo môžu byť neglykosylované. Polypeptidy podľa vynálezu môžu ďalej obsahovať počiatočný zvyšok aminokyseliny metionínu.

Polypeptid podľa vynálezu môže byť v dôsledku schopnosti stimulovať vaskulárny endoteliálny bunkový rast použitý pri ošetrení za účelom stimulácie revaskularizácie ischemických tkanív v prípade rôznych chorobných stavov, ako je trombóza, artérioskleróza a ďalšie kardiovaskulárne choroby.

FGF-IO môže byť tiež použitý na ošetrovanie rán v dôsledku poranení, popálenín, pooperačných opráv tkaniva a vredov, pretože má schopnosť mito génne pôsobiť na rôzne typy buniek, ako sú fibroblastové bunky a bunky kostrového svalstva.

FGF-10 môže byť použitý tiež na ošetrovanie a prevenciu neuronálneho poškodenia, ku ktorému dochádza pri určitých neuronálnych poruchách alebo neurovegetatívnych stavoch, ako je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a komplex súvisiaci s AIDS. FGF-10 má schopnosť stimulovať rast chondrocytov, a preto môže byť použitý na podporu regenerácie kostí a periodontu a pomáhať pri tkanivových transplantátoch a kostných štepoch.

FGF-10 môže byť tiež použitý na prevenciu starnutia pokožky v dôsledku opaľovania pomocou stimulácie rastu keratinocytov.

FGF-10 môže byť použitý aj na prevenciu úbytku vlasov, pretože aktivuje bunky vlasov a podporuje rast mclanocytov. Na rovnakom princípe stimuluje FGF-10 rast a diferenciáciu hematopoictických buniek a buniek kostnej drene, ak je použitý v kombinácii s ďalšími cytokinmi.

FGF-10 môže byť tiež použitý na uchovávanie orgánov pred transplantáciou alebo pre uchovávanie bunkovej kultúry primárnych tkanív.

Vynález sa ďalej týka spôsobu použitia týchto polypeptidov alebo polynukleotidov kódujúcich tieto polypeptidy na účely in vitro súvisiace s vedeckým výskumom, syntézou DNA, výrobou vektorov DNA a za účelom získavania diagnostických a terapeutických prostriedkov pre ošetrovanie ľudských ochorení.

Fragmenty plnej dĺžky génu FGF-10 môžu byť použité ako hybridizačná sonda pre knižnicu cDNA za účelom izolácie plnej dĺžky génu FGF-10 a na izoláciu ďalších génov, ktoré s ním majú vysokú sekvenčnú podobnosť alebo ktoré majú podobnú biologickú aktivitu. Sondy tohto typu majú obvykle aspoň 20 báz. Prednostne však sondy obsahujú aspoň 30 báz a obvykle nepresahujú 50 báz, i keď môžu mať i väčší počet báz. Sonda môže byť použitá tiež na identifikáciu klonu cDNA zodpovedajúceho plnej dĺžke transkriptu a genómického klonu alebo klonov, ktoré obsahujú kompletný gén FGF-10 vrátane regulačných a promótorových oblastí, exónov a intrónov. Príkladom screeningu je izolácia kódujúcej oblasti génu FGF-10 s použitím známej sekvencie DNA na syntézu oligonukleotidovej sondy. Značené oligonukleotidy, majúce komplementárnu sekvenciu k sekvencii génu podľa vynálezu, sa používajú na screening knižnice ľudskej cDNA, genómovcj DNA alebo mRNA za účelom zistenia, s ktorými členmi knižnice sonda hybridizuje.

Vynález poskytuje spôsob identifikácie receptorov pre polypeptid FGF-10. Gén kódujúci receptor môže byť identifikovaný rôznymi metódami známymi odborníkom, napríklad vyhľadávaním ligandov a triedením FACS (Coligan a d., Current Protocols in Immun., kapitola 5 (1991)). Ak sa pripravuje polyadenylovaná RNA z bunky zodpovedajúcej polypeptidom, používa sa prednostne expresné klonovanie a knižnica cDNA, vytvorená z tejto RNA, sa rozdelí do súborov a použije na transfekciu buniek COS alebo iných buniek, ktoré nezodpovedajú polypeptidom. Transfikované bunky, ktoré sa pestujú na sklenených podložných sklíčkach, sa vystavia značeným polypeptidom. Polypeptidy môžu byť značené rôznymi prostriedkami, zahrnujúcimi jodáciu alebo zabudovanie rozpoznávacieho miesta pre miestne špecifickú proteínkinázu. Po fixácii a inkubácii sa sklíčka podrobia autorádiografickej analýze. Identifikujú sa pozitívne súbory a pripravia sa podsúbory, ktoré sa retransfikujú s použitím procesu iteratívneho zoskupovania a resereeningu, čím sa nakoniec získa jednotlivý kloň, ktorý kóduje predpokladaný receptor.

Ako alternatívny prístup k identifikácii receptorov môžu byť značené polypeptidy fotoafinitne naviazané na bunkovú membránu alebo extraktové preparáty, ktoré exprimujú receptorovú molekulu. Zosietený materiál sa rozštiepi pomocou analýzy PAGE a vytaví rôntgenovcmu filmu. Značený komplex, obsahujúci receptory polypeptidov, môže byť vyrezaný, rozštiepený na peptidové fragmenty a podrobený mikrosekvenovaniu proteínov. Sekvencia aminokyselín, získaná mikrosekvenovaním, sa použije na konštrukciu sady degenerovaných oligonukleotidových sond pre screening knižnice cDNA za účelom identifikácie génov kódujúcich predpokladané receptory.

Vynález poskytuje spôsob screeningu za účelom identifikácie zlúčenín, ktoré modulujú pôsobenie FGF-10. Príklad takého testu zahrnuje kombináciu cicavčej fibroblastovej bunky, FGF-10, zlúčeniny podrobovanej screeningu a '[HJ-tymidínu za podmienok bunkovej kultivácie, za ktorých by fibroblastová bunka normálne proliferovala. Je možné uskutočniť kontrolný test v neprítomnosti zlúčeniny podrobovanej screeningu a porovnať s veľkosťou proliferácie fibroblastov v prítomnosti testovanej zlúčeniny za účelom stanovenia, či zlúčenina stimuluje proliferáciu keratinocytov stanovením príjmu ^J[H]tymidínu v oboch prípadoch.

Za účelom screeningu na antagonistov je možné pripraviť rovnaký test a meria sa schopnosť zlúčeniny brániť proliferácii fibroblastov a vykoná sa stanovenie antagonistických vlastností. Veľkosť proliferácie fibroblastových buniek sa meria kvapalnou scintilačnou chromatografiou, ktorou sa meria zabudovanie ' [Hjtymidínu.

V inej metóde sa cicavčia bunka alebo membránový preparát, exprimujúci receptor FGF-10, inkubuje so značeným FGF-10 v prítomnosti zlúčeniny. Potom je možné merať schopnosť zlúčeniny podporovať alebo blokovať túto interakciu. Alternatívne sa meria odpoveď druhého známeho messengerového systému po interakcii FGF-10 a receptoru a porovnáva sa v prítomnosti a neprítomnosti zlúčeniny. Takéto druhé messengerové systémy zahrnujú, bez toho, aby sa na ne obmedzovali, cAMP guanylátcyklázu, iónové kanáliky alebo hydrolýzu fosfoinositidu.

Ako príklady potenciálnych antagonistov FGF-10 je možné uviesť protilátku alebo v niektorých prípadoch oligonukleotid, ktorý sa viaže na polypeptid. Alternatívne môže byť potenciálnym antagonistom FGF-10 mutantná forma FGF10, ktorá sa viaže na receptory FGF-10, avšak nie je vyvolaná žiadna odpoveď druhého messengeru, a teda je účinok FGF-10 efektívne blokovaný.

Ďalším potenciálnym antagonistom FGF-10 je antimediátorový konštrukt, pripravený antimediátorovou technológiou. Antimediátorovou technológiu je možné použiť na kontrolu expresie génov prostredníctvom tvorby trojitej špirály alebo antimediátorovej DNA alebo R.NA, obe tieto metódy sú založené na väzbe polynukleotidu na DNA alebo RNA. Napríklad 5’-kódujúca časť polynuklcotidovej sekvencie, ktorá kóduje maturované polypeptidy podľa vynálezu, sa použije na konštrukciu antimediátorového oligonukleotidu RNA dĺžky asi 10 až 40 párov báz. Navrhne sa oligonukleotid DNA tak, aby bol komplementárny k oblasti génu, zúčastňujúcej sa transkripcie (trojitá špirála, viď Lee a d., Nucl. Acids Res., 6.3073 (1979), Cooney a d., Science, 241:456 (1988); a Dervan a d., Science, 251: 1360 (1991)), a tak bránil transkripcii a produkcii FGF-10. Antimediátorový oligonukleotid RNA hybridizuje in vivo s mRNA a blokuje transláciu molekuly mRNA do polypeptidu FGF-10 (proti zmyslu; Okano, J., Neurochem., 56:560 (1991);, Oligodeoxynucleotides as Antisense lnhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Vyššie opísané oligonukleotidy môžu byť tiež dodané do buniek tak, aby bola in vivo exprimovaná antimediátorová RNA alebo DNA na inhibíciu produkcie FGF-10.

Potenciálny antagonisti FGF-10 zahrnujú malé molekuly, ktoré sa viažu na väzbové miesta receptoru FGF-10 a okupujú ich, a tak spôsobujú neprístupnosť receptoru pre FGF-10, takže je zabránené normálnej biologickej aktivite. Príklady malých molekúl zahrnujú, avšak neobmedzujú sa na ne, malé peptidy alebo molekuly podobné peptidom.

Antagonisti FGF-10 sa môžu používať na inhibíciu rastu buniek a proliferačných účinkov FGF-10 na neoplastické bunky a tkanivá, a teda na rctardáciu alebo prevenciu abnormálneho rastu a proliferácie buniek, napríklad rastu nádorov.

Antagonisti FGF-10 sa môžu použiť tiež na prevenciu hypervaskulárnych ochorení a na prevenciu proliferácie epitel i ál nych buniek šošovky po chirurgii extrakapsulárnej katarakty.

Antagonisti sa môžu používať v zmesi s farmaceutický prijateľným nosičom, napríklad ďalej opísaným.

Polypeptidy, agonisti a antagonisti podľa vynálezu sa môžu používať v kombinácii s vhodným farmaceutickým nosičom vo forme farmaceutického prípravku. Také prípravky zahrnujú terapeuticky účinné množstvo polypeptidu, agonistov alebo antagonistov a farmaceutický prijateľný nosič alebo vehikulum. Takýto nosič zahrnuje, avšak neobmedzuje sa na ne, soľný roztok, pufrovaný soľný roztok, dextrózu, vodu, glycerol, etanol a ich kombinácie. Formulácia by mala zodpovedať spôsobu podávania.

Vynález poskytuje tiež farmaceutickú súpravu alebo kit, zahrnujúci jednu alebo viac nádobiek naplnených jednou alebo viac zložkami farmaceutických prípravkov podľa vynálezu. K tejto nádobke (nádobkám) môže byť pripojené oznámenie vo forme predpísanej vládnou agentúrou regulujúcou výrobu, používanie alebo predaj farmaceutických alebo biologických produktov, ktoré odráža súhlas tejto agentúry s výrobou, používaním alebo predajom pre humánne aplikácie. Okrem toho môžu byť polypeptidy, agonisti a antagonisti podľa vynálezu používané v spojení s ďalšími terapeutickými zlúčeninami.

Farmaceutické prípravky môžu byť podávané bežným spôsobom, napríklad orálnou, topickou, intravenóznou, intraperitoneálnou, intramuskulárnou, subkutánnou, intranasálnou alebo intradermálnou cestou. Farmaceutické prípravky sú podávané v množstvo, ktoré je účinné pri liečbe a/alebo profylaxii špecifickej indikácie. Všeobecne sa podávajú v množstve aspoň asi 10 pg/kg telesnej hmotnosti a vo väčšine prípadov sa podávajú v množstvo nepresahujúcom asi 8 mg/kg telesnej hmotnosti za deň. Vo väčšine prípadov je dávkovanie asi 10 pg/kg až asi 1 mg/kg telesnej hmotnosti denne s prihliadnutím k spôsobu podávania, symptómom atď. V konkrétnom prípade topickej aplikácie sa podávajú prednostne dávky asi 0,1 pg až 9 mg na cm².

Polypeptidy FGF-10 a agonisti a antagonisti, ktorí sú polypeptidmi, môžu byť tiež používané podľa vynálezu expresiou takého polypeptidu in vivo, ktorá sa často označuje ako „génová terapia“.

Tak môžu byť bunky napríklad podrobené génovej manipulácii s polynukleotidom (DNA alebo R.NA), kódujúcim polypeptid, ex vivo, a potom dodané pacientovi, ktorý má byť liečený týmto polypeptidom. Také metódy sú známe. Bunky môžu byť napríklad podrobené známym spôsobom manipulácii použitím retrovírusovej častice obsahujúcej RNA, kódujúcu polypeptid podľa vynálezu.

Podobne môžu byť bunky manipulované in vivo pre expresiu polypeptidu in vivo, napríklad známymi metódami. Ako je známe, za účelom manipulácie buniek in vivo a expresie polypeptidu in vivo môže byť podávaná pacientovi produkčná bunka pre produkciu retrovírusovej častice obsahujúcej RNA, kódujúcej polypeptid podľa vynálezu. Tieto a ďalšie spôsoby podávania polypeptidu podľa vynálezu sú pre odborníka zrejmé z údajov tohto popisu. Napríklad expresné vehikulum pre manipuláciu buniek môže byť iné než retrovírusové častice, napríklad adenovírus, ktorý môže byť použitý na manipuláciu buniek in vivo v kombinácii s vhodným nosným vehikulom.

Vynález sa tiež týka použitia génu FGF-10 ako súčasti diagnostického testu na detekciu ochorení alebo náchylnosti k ochoreniam súvisiacim s prítomnosťou mutácii v sekvencií nukleových kyselín FGF-10.

Jednotlivci nesúci mutácie v géne FGF-10 sa môžu detekovať na úrovni DNA rôznymi metódami. Nukleové kyseliny pre diagnózu môžu byť získané z buniek pacienta, napríklad z krvi, moču, slín, materiálu tkaninovej biopsie a autopsie. Genómová DNA môže byť použitá priamo na detekciu alebo môže byť pred analýzou enzymaticky amplifikovaná pomocou PCR (Saiki a d., Náture, 324:163-166 (1986)). Na rovnaký účel môže byť tiež použitá RNA alebo cDNA. Ako príklad môžu byť priméry PCR komplementárne k nukleovej kyseline, kódujúce FGF-10, použité na identifikáciu a analýzu mutácií FGF-10. Delécia a inzercia môžu byť napríklad detekované na základe zmeny veľkosti amplifikovaného produktu oproti normálnemu genotypu. Bodové mutácie môžu byť identifikované hybridizáciou amplifikovanej DNA s RNA rádioznačeného FGF-10 alebo alternatívne s antimediátorovými sekvenciami DNA rádioznačeného FGF-10. Dokonale súhlasiace sekvencie môžu byť od chybných duplexov odlíšené digesciou s RNasou A alebo na základe rozdielu teplôt topenia.

Genetické testovanie na základe rozdielov sekvencii DNA môže byť uskutočňované detekciou alebo zmenou elektroforetickej mobility fragmentov DNA v géloch denaturačnými činidlami alebo bez nich. Malé delécie a inzercie v sekvenciách môžu byť vizualizované pomocou gélovej elektroforézy vysokého rozlíšenia. Fragmenty DNA s rôznymi sekvenciami môžu byť rozlíšené na géloch s gradientom denaturujúceho formamidu, na ktorých je mobilita rôznych fragmentov DNA v géle spomalená v rôznych polohách podľa ich konkrétnej teploty topenia alebo čiastočného topenia (viď napríklad Myers a d., Science, 230:1242 (1985)).

Zmeny sekvencie v konkrétnych miestach je možné tiež odhaliť pomocou testov nukleázovej ochrany, napríklad ochrany RNázy a SI, alebo metódou chemického štiepenia (napríklad Cotton a d., PNAS, USA, 85:4397-4401 (1985)).

Detekciu konkrétnej sekvencie DNA je teda možné uskutočňovať metódami, ako je hybridizácia, ochrana RNázy, chemické štiepenie, priame sekvenovanie DNA alebo použitie reštrikčných enzýmov (napríklad metóda polymorfizmov dĺžok reštrikčných fragmentov, FRLP) a' Southernov blotting genómovej DNA

Okrem bežnejších metód gélovej elektroforézy a sekvenovania DNA je možné mutácie tiež detekovať analýzou in situ.

Vynález sa tiež týka diagnostického testu na detekciu pozmenených hladín proteínu FGF-10 v rôznych tkanivách, pretože hyperexpresia proteínov v porovnaní s normálnymi kontrolnými tkanivovými vzorkami môže detekovať prítomnosť ochorení alebo náchylnosti k ochoreniu, napríklad k nádoru. Testy, používané na detekciu hladiny proteínu FGF-10 vo vzorke získanej od hostiteľa sú odborníkom známe a zahrnujú rádioimunoanalýzu, testy kompetitívnej väzby, analýzou westernovým prenosom, testy ELISA a „sendvičové“ testy. Test EL1SA (Coligan a d., Current Protocols in Immunoiogy, 1(2), kapitola 6, (1991)) zahrnuje najprv prípravu protilátky špecifickej voči antigénu FGF-10, prednostne monoklonálnej protilátky. Ďalej sa pripraví reporterová protilátka k monoklo nálnej protilátke. K reportérovej protilátke sa naviaže detekovateľné činidlo, napríklad rádioaktívne, fluorescenčné alebo v tomto príklade enzým chrenová peroxidáza. Z hostiteľa sa odoberie vzorka a inkubuje sa na pevnom nosiči, napríklad na polystyrénovej miske, ktorá viaže proteiny vo vzorke. Všetky volné väzbové miesta proteínov na miske sa potom pokryjú inkubáciou s nešpecifickým proteínom, ako je bovinný sérový albumín. Potom sa v miske inkubuje monoklonálna protilátka, v priebehu tejto doby sa monoklonálne protilátky naviažu na všetky proteiny FGF-10, naviazané na polystyrénovú misku. Zvyšná nenaviazaná monoklonálna protilátka sa odstráni premytím pufrom. Do misky sa teraz vloží reporterová protilátka, naviazaná na chrenovú peroxidázu, čo vedie k naviazaniu reportérovej protilátky na všetku monoklonálnu protilátku naviazanú na FGF-10. Nenaviazaná reporterová protilátka sa odstráni premytím. Potom sa k miske pridajú peroxidázové substráty a množstvo sfarbenia, vyvinuté za danú dobu, je pri porovnaní so štandardnou krivkou mierou množstva proteínu FGF-10 prítomného v danom objeme pacientovej vzorky.

Je možné použiť kompetitívny test, pri ktorom sa protilátky špecifické k FGF-10 naviažu na pevný nosič a cez pevný nosič sa vedie značený FGF-10 a vzorka získaná od hostiteľa a detekované množstvo’ značky, napríklad kvapalnou scintilačnou chromatografiou, môže byť korelované s množstvom FGF-10 vo vzorke.

Testu ELISA je podobný „sendvičový“ test. V “sendvičovom“ teste sa FGF-10 vedie cez pevný nosič a viaže sa na protilátku naviazanú na pevný nosič. Na FGF-10 sa potom naviaže druhá protilátka. Potom sa cez pevný nosič vedie tretia protilátka, ktorá je značená a je špecifická k druhej protilátke a ktorá sa viaže na druhú protilátku, a potom je možné kvantifikovať množstvo.

Sekvencie podľa vynálezu sú cenné tiež pre identifikáciu chromozómov. Sekvencia je špecificky cielená na konkrétnu polohu na jednotlivom ľudskom chromozóme a môže s ňou hybridizovať. Naviac existuje v súčasnosti potreba identifikácie konkrétnych miest na chromozóme. Pre označenie polohy na chromozóme je v súčasnosti k dispozícii málo činidiel založených na skutočných sek venčných dátach (polymorfizmy rcpetícii). Mapovanie DNA do chromozómov podľa vynálezu je dôležitým prvým stupňom v korelácii týchto sekvencii s génmi spojenými s určitým ochorením,

Stručne povedané môžu byť sekvencie mapované do chromozómov tak, že sa z cDNA pripravia priméry PCR (prednostne 15 až 25 bp). Použije sa komputerová analýza 3 ’-nepreloženej oblasti na rýchly výber primérov, ktoré nepresahujú viac než jeden exón v genómovej DNA, a tak komplikujú proces amplifikácie. Tieto priméry sa potom použijú na PCR screening hybridov somatických buniek obsahujúcich jednotlivé ľudské chromozómy. Iba hybridy, obsahujúce ľudský gén zodpovedajúci priméru, poskytnú amplifikovaný fragment.

PCR mapovanie hybridov somatických buniek je rýchly postup na priradenie konkrétnej DNA ku konkrétnemu chromozómu. Použitím vynálezu pre rovnaké oligonukleotidové priméry je možné analogickým spôsobom uskutočniť sublokalizáciu s panelmi fragmentov zo špecifických chromozómov alebo súbory veľkých genómických klonov. Ďalšie stratégie, ktoré je možné použiť podobne na mapovanie do chromozómu, zahrnujú hybridizáciu in situ, prescreening so značenými prietokovo triedenými chromozónmi a hybridizačnú preselekciu na konštrukciu knižníc chromozómovo špecifických cDNA.

Na získanie presnej polohy na chromozóme v jednom stupni je možné použiť fluorescenčnú hybridizáciu in situ (FISH) klonu cDNA s metafázovým rozšírením chromozómu. Túto metódu je možné použiť už pri dĺžke cDNA iba 500 alebo 600 báz; klony väčšie než 2000 bp však majú vyššiu pravdepodobnosť väzby k jedinej chromozomálnej polohe s dostatočnou intenzitou signálu pre jednoduchú detekciu. FISH vyžaduje použitie klonov, od ktorých bol odvodený úsek expresnej sekvencie (fragment génu podľa vynálezu), a čim dlhších, tým lepšie. Na získanie dobrých výsledkov v rozumnej dobe napríklad stačí 2000 bp, 4000 bp je lepších a viac než 4000 bp pravdepodobne nie je nutných. Popis tejto metódy je možné nájsť vo Verma a d., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergarnon Press, New York (1988).

Akonáhle sa sekvencie priradia presnej polohe na chromozóme, je možné fyzickú polohu sekvencie na chromozóme korelovať s údajmi genetickej mapy. (Také údaje sú uvedené napríklad v V. McKusick, Mendelian Inheritancc in Man (dostupné on line prostredníctvom John Hopkins University Welch Medical Library)). Vzťah medzi génmi a ochoreniami, ktoré boli mapované do tej istej chromozomálnej oblasti, sa potom identifikuje väzbovou analýzou (spoludedenie fyzicky susediacich génov).

Ďalej je nutné stanoviť rozdiely cDNA alebo genómickej sekvencie medzi postihnutými a nepostihnutými jedincami. Ak je u niektorých alebo všetkých postihnutých jedincov pozorovaná mutácia, ktorá však nie je pozorovaná u žiadneho normálneho jedinca, potom je mutácia pravdepodobne pôvodcom ochorenia.

Pri súčasnom rozlíšení metód fyzikálneho a genetického mapovania môže byť cDNA, presne lokalizovaná do oblasti chromozómu, spojená s ochorením, jedným z 50 až 500 potenciálnych vyvolávajúcich génov. (Z toho vyplýva mapovacie rozlíšenie 1 megabáza a jeden gén na 20 kb.)

Polypeptidy, ich fragmenty alebo iné deriváty alebo ich analógy alebo bunky ich exprimujuce môžu byť použité ako imunogény na vyvolanie tvorby protilátok. Tieto protilátky môžu byť napríklad polyklonálne alebo monoklonálne. Vynález zahrnuje tiež chimerické, jcdnoreťazcové a humanizované protilátky, rovnako ako fragmenty Fab alebo produkt expresnej knižnice Fab. Ma získanie týchto protilátok a fragmentov je možné použiť rôzne známe postupy.

Protilátky vytvorené proti polypeptidom, zodpovedajúcim sekvencii podľa vynálezu, môžu byť získané priamou injekčnou aplikáciou polypeptidov živočíchovi alebo podaním polypeptidov živočíchovi, prednostne inému než človeku. Takto získaná protilátka potom sama viaže tieto polypeptidy. Týmto spôsobom je možné použiť i sekvencie, kódujúce iba fragment polypeptidov, na vytvorenie protilátok, viažucich celé natívne polypeptidy. Tieto protilátky potom môžu byť použité na izoláciu polypeptidu z tkaniva, ktoré ho exprimuje.

Na prípravu monoklonálnych protilátok je možné použiť akúkoľvek metódu, ktorá poskytuje protilátky produkované kontinuálnymi kultúrami bunkových línii. Príklady techník na získanie monoklonálnych protilátok zahrnujú metódu hybridomov (Kobier a Milstein, 1975, Náture, 256:495-497), metódu triomov, metódu hybridomov ľudských B-buniek (Kozbor a d., 1983, Immunology Today 4:72) a metódu EBV-hybridomov na získanie ľudských monoklonálnych protilátok (Cóle a d., 1985, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77-96).

Opísané metódy produkcie jednoreťazcových protilátok (patent US 4,946.778) môžu byť upravené na získanie jednoreťazcových protilátok k imunogénnyrn polypeptidickým produktom podľa vynálezu. Na expresiu humanizovaných protilátok k imunogénnym polypeptidickým produktom podľa vynálezu môžu byť tiež použité transgénne myši.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Vynález je bližšie opísaný v súvislosti s pripojenými výkresmi, ktoré predstavujú konkrétne uskutočnenie vynálezu, avšak neobmedzujú jeho rozsah.

Obr. 1 - zobrazuje sekvenciu cDNA a zodpovedajúcu odvodenú sekvenciu aminokyselín FGF-10. Znázornená sekvencia aminokyselín reprezentuje maturovanú formu proteínu. Sú použité štandardné jednopísmenové skratky aminokyselín. Sekvenčné nepresnosti sú spoločným problémom pri stanovovaní polynukleotidových sekvencií. Sekvenovanie bolo vykonané pomocou automatického sekvenátoru DNA 373 (Applied Biosystems, Inc.). Sekvenčná presnosť sa predpokladá vyššia než 97 %.

Obr. 2 - znázorňuje homológiu sekvencií aminokyselín medzi FGF-10 a ostatnými členmi skupiny FGF. Konzervatívne aminokyseliny sú vyznačené hrubo.

Obr. 3 - znázorňuje gél SDS-PAGE po transkripcii/translácii proteínu FGF-10.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález je osvetlený na príkladoch uskutočnenia, ktoré ho však nijako neobmedzujú. Všetky diely a množstvá, pokiaľ nie je uvedené inak, sú myslené hmotnostne.

Na uľahčenie pochopenia príkladov sa uvádzajú niektoré často sa vyskytujúce metódy a/alebo výrazy.

„Plazmidy“ sa označujú malým písmenom p, pred ktorým a/alebo za ktorým sú uvedené veľké písmená a/alebo číslice. Tu použité východzie plazmidy sú buď komerčne dostupné, verejne neobmedzene prístupné alebo môžu byť konštruované z dostupných plazmidov publikovanými postupmi. Okrem toho sú v odbore známe a odborníkom sú zrejmé ekvivalentné plazmidy „Digescia“ DNA označuje katalytické štiepenie DNA reštrikčným enzýmom, ktorý pôsobí iba v niektorých sekvenciách v DNA. Rôzne tu použité réštrikčné enzýmy sú komerčne dostupné a boli použité reakčné podmienky, kofaktory a ďalšie požiadavky, ktoré sú bežnému odborníkovi známe. Na analytické účely sa typicky použije 1 μg plazmidu alebo fragmentu DNA s asi 2 jednotkami enzýmu v asi 20 μΙ tlmivého roztoku. Za účelom izolácie fragmentov DNA pre konštrukciu plazmidu sa typicky digeruje 5 až 50 μg DNA s 20 až 250 jednotkami enzýmu vo väčšom objeme. Vhodné pufry a množstvo substrátu pre konkrétne reštrikčné enzýmy uvádza výrobca. Obyčajne sa používa doba inkubácie asi 1 h pri 37 °C, ale podľa pokynov dodávateľa sa môže meniť. Po digescii sa reakčná zmes priamo podrobí elektroforéze na polyakrylamidovom géle za účelom izolácie požadovaného fragmentu.

Delenie odštiepených fragmentov podľa veľkosti sa robí použitím 8 % polyakrylamidového gélu, opísaného v Goeddei, D., a d., Nucleic Acids R.es., 8:4057 (1980).

Výraz „oligonukleotidy“ sa vzťahuje buď na jednoreťazcový polydeoxynukleotid alebo na dva komplementárne polydeoxynukleotidové reťazce, ktoré môžu byť syntetizované chemicky. Tieto syntetické oligonukleotidy nemajú 5’ fosfát, a teda sa neviažu k inému oligonukleotidu bez prídavku fosfátu s ATP v prítomnosti kinázy. Syntetický oligonukleotid sa viaže k fragmentu, ktorý nebol defosforylovaný.

„Ligácia“ označuje proces vytvárania fosfodiesterových väzieb medzi dvoma dvoj vláknovými fragmentárni nukleovej kyseliny (Maniatis, T., a d., tam isto, str. 146). Ak nie je uvedené inak, je možné ligáciu uskutočniť použitím známych pufrov a známych podmienok s 1 0 jednotkami ligázy T4 DNA („ligasa“) na 0,5 μβ približne ekvimolárneho množstva spojovaných fragmentov DNA.

Ak nie je uvedené inak, bola transformácia uskutočňovaná spôsobom opísaným v Graham, F., a Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).

Príklad 1

Tkanivová distribúcia inRNA FGF-10 v dospelých ľudských tkanivách

Pre analýzu expresie mRNA FGF-10 bola vykonaná northernová analýza s 2 μg poly A⁴ mRNA z rôznych dospelých ľudských tkanív použitím rádioaktívne značenej celej cDNA FGF-10 ako sondy. Výsledky ukazujú, že 1,4 kb informácie je exprimovaná najhojnejšie v kostrovom svale, na strednej úrovni v srdci, mozgu, placente, ľadvine a pankrease a na nižšej úrovni v pečeni. V srdci sú prítomné 3 ďalšie fragmenty o veľkosti 4,4 kb, 2,4 kb a 0,5 kb. Je pravdepodobné, že tieto rôzne veľkosti mRNA v srdci sú výsledkom alternatívneho zostrihu. V mozgu je tiež prítomná 4,4 kb mRNA. Nylonový blot s 2 pg poly A mRNA z niekoľkých dospelých ľudských tkanív, naviazaný na membránu, bol získaný od Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA. Tento blot bol hybridizovaný s celou cDNA FGF-10, značenou náhodne iniciovaným značením rádioaktívnym dCTP. Hybridizácia bola uskutočňovaná cez noc pri 65 °C v 7 % SDS, 0,5 M NaPO<i, pH 7,2 a 1 % BSA. Po 2x 30 min premytí v 0,2 x SSC, 0,1 % SDS pri 65 °C bol blot cez noc vystavený rontgenovému filmu s intenzifikačnou clonou.

Príklad 2

Expresia FGF-10 transkripciou a transláciou in vitro cDNA FGF-10, ATCC ti 75696, bola podrobená transkripcii a translácii in vitro za účelom stanovenia veľkosti prepísateľného polypeptidu kódovaného úplnou a čiastočnou cDNA FGF-10. Úplné a čiastočné inzerty cDNA FGF-10 vo vektore pBluescript SK boli amplifikované pomocou PCR s tromi dvojicami primérov: 1) spätný a priamy primér M13, 2) spätný primér ΜΊ3 a FGF primér P20, 3) spätný primér Ml 3 a FGF primér P22. Sekvencie týchto primérov sú nasledujúce:

Spätný primér M 1 3-2:

5’-ATGCTTCCGGCTCGTATG-3 ’ (SEQ 1D NO 3)

Táto sekvencia je umiestnená pred 5’-koncom inzertu cDNA FGF-10 vo vektore pBluescript a má orientáciu proti smeru cDNA. Medzi týmto primérom a cDNA FGF-10 je umiestená sekvencia promótoru T3.

Priamy primér M13-2:

5’-GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ (SEQ ID NO 4)

Táto sekvencia je umiestnená za 3’-koncom inzertu cDNA FGF-10 vo vektore pBluescript a má orientáciu proti smeru inzertu cDNA.

FGF primér P20:

5’-GTGAGATCTGAGGGAAGAAGGGGA-3’ (SEQ ID NO 5)

Sekvencia 15 bp tohto priméru na 3’-konci je proti smeru sekvencie cDNA FGF-10 bp 780 až 766, ktorá je umiestená 12 bp za stop kodónom.

FGF primér P22:

5’-CCACCGATAATCCTCCTT-3’ (SEQ ID NO 6)

Táto sekvencia je umiestená v cDNA FGF-10 v protismernej orientácii a je asi 2 13 bp za stop kodónom.

Reakcie PCR sa všetkými tromi dvojicami primérov produkujú amplifikované produkty so sekvenciou promótoru T3 pred inzertom cDNA. Všetky tri dvojice primérov produkujú produkty PCR, ktoré kódujú plnú dĺžku polypeptidu FGF-10.

Na transkripciu/transláciu in vilro bolo použité približne 1 μβ produktu PCR z prvej dvojice primérov, 0,3 μβ z druhej dvojice primérov a 0,3 μβ z tretej dvojice primérov. Transkripčná/translačná reakcia in vilro bola uskutočňovaná v objeme 25 μΐ použitím systémov spojeného retikulocytového lyzátu T_NT^IM (Promega, č. kat. L4950). Konkrétne reakčná zmes obsahuje 12,5 μΙ lyzátu králičích retikulocytov TNT, 2 μΙ reakčného pufru TNT, 1 μΙ polymerázy T3, 1 μΐ 1 mM zmesi aminokyselín (mínus metionín), 4 μΐ '⁵S-metionínu (> 1000 Ci/mmol, 10 mCi/ml), 1 μΐ 40 U/μΙ inhibítoru ribonukleázy RNasin a 0,5 alebo 1 μβ produktov PCR. Objem bol doplnený H2O bez obsahu nukleázy na 25 μΙ. Reakčná zmes bola ínkubovaná 2 h pri 30 °C. 5 μΐ reakčného produktu bolo analyzované na gradiente 4-20 % gélu SDS-PAGE. Po fixácii v 25% isópropanole a 10% kyseline octovej bol gél vysušený a vystavený cez noc pri 70 °C róntgenovému filmu.

Ako je znázornené na obr. 3, produkty PCR obsahujúce plnú dĺžku cDNA FGF-10 a cDNA s chýbajúcimi približne 340 bp a približne 140 bp v 3’-neprepísanej oblasti (3’-UTR) produkovali tú istú dĺžku prepísaných produktov, ktorých molekulová hmotnosť sa odhaduje na asi 19 kD (pruhy 2 až 4).

Na základe vyššie uvedených údajov je možné vynález rôzne modifikovať a obmieňať, a preto ho je možné v rozsahu pripojených nárokov uskutočňovať inak než bolo konkrétne opísané.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE (i) PRIHLASOVATEĽ: HU A D.

(ii) NÁZOV VYNÁLEZU: FIBROBLASTOVÝ RASTOVÝ FAKTOR-10 (iii) POČET SEKVENCIÍ: 6 (i v) KOREŠPONDENČNÁ ADRESA:

(A) ADRESÁT: CARELLA, BYRNE, BAIN, G1LFILLAN, CECCH1,

STEWART & OLSTE1N ' (B) ULICA: 6 BECKER FARM ROAD (C) MESTO: ROSELAND (D) ŠTÁT: NEW JERSEY •;(E)ZEM:USA (F) PÔŠT. KÓD: 07068 (v) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: DISKETA 3,5 (B) POČÍTAČ: IBM PS/2 (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: MS-DOS (D) SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1 (vi) ÚDAJE O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:

(B) DÁTUM PODANIA: SÚČASNE (C) KLASIFIKÁCIA:

(vii) ÚDAJE O SKORŠEJ PRIHLÁŠKE:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: 08/207,412 (B) DÁTUM PODANIA: 8. MAREC 1994 (viii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI/AGENTOVI:

(A) MENO: FERRARO, GREGORY D.

(B) REGISTRAČNÉ ČÍSLO: 36,134 (C) ZNAČKA/ČÍSLO SPISU: 325800-347 (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:

(A) TELEFÓN: 201-994-1700 (B) TELEFAX: 201-994-1744 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1121 PÁROV BÁZ (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLÓGIA: LINEÁRNA (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 1:

GGCAAAGTGG GATGATCTGT CTG CAG CTT C CAGACCCAGG GATTGGCTTC CCAGäŤTTGG GAACTTCCCA GCACTCGAAA TTGTGACAAG GTTATTCAG C TTGATGGGAC CAAGGACGAA TGCGTGTAGT GGCCATCCAA GCTATCTCTA CAGTTCAGAT AAAACTACTA TGTGATCTAT GGTTTCTGGG ACTCAATAAA AGCCCTCATC ACATTTTGTA TACATGAAAT TGGAGAAAAA ATGGAGGCAA AGTTGTGAAT TCTCATCCCT TCCCCTTCCC AAGGAGAGGA ÄÄATAAAATG T.CTTCCTTTG TGTAGGACAA AATTCACGTT CACAAAGATT

ATAAATATTA AACTAAACTG ATAAAGGTGA AATAAACTTA

CACTACACCT GCAGCACCAC AAGCCTGAGG GGAAGGAAGG GAATCTGAAG CGGGCCCACA GGGACCGAAA TGGAGAGCAA CAGCAGGGAT ACTTCCTGCA AACAGCGACT ACACTCTCTT GGAGTGAAGG CTAGCCTCTA GTTTTCACTC CAGAATGCÄA TCTTCCACAC TGTACCGCCA GAAGGTCAAA TTATGAÄGGG CCGAAACCTA TTGAAGTGTG CAAGGGCGTT CAAGGAAAAG CAAGATTCAA CATAGCTGAG TTCCTTCCCA TTTACCCATT ACAACGCAAG CACCTAGTGG GAAAATTGAA CCAAÄGCTTG ATCACACTTA AAAGCAAAGG

TATTGTTATT AGTAGAAGGC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

GCTCGGAGGA CAGCTCCTGC ÄAGTACGGGC GAAATCATCA TCTTCCGGCC AACTTCCATT AGAACCCCAG CTCAAAGGGA GATGCACCCA GATGGTACCA CAATCTAATT CCCGTGGGCC TGTGGCCATG AATGGTGAAG ATTCAAGGAA TCTGTGTTTG GCAAGAATCA GGCCGAGCTT GAACAGAGTG AAGAAAACCA TATGTACAGA GAACCATCGC TTCTGGAACA CCAACCATGA AACTCTCCCC TTCTTCCCTC TCCTTCCAGT AAATCCACCC CTAAGATTCT GCACTCAAAA CTTGTTGCAA TGTTGTAGAA AAAAAATAAA TCAGAACTCC

TAATTGTAAT GAAGACATTA Ä

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660

720

780

840

900

960 1020

1080

1121 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 181 AMINOKYSELÍN (B) TYP: AMINOKYSELINA (C) VLÁKNO:

(D) TOPOLÓGIA: LINEÁRNA (ii) TYP MOLEKULY: PROTEIN (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 2:

Met Glu Ser Lys Glu 5

Pro

Gin Leu Lys Gly íle Val Thr Arg Leu

10

15

Phe

Ser

Gin

Gin

Gly Tyr

Phe

Leu

Gin

Met

His

Pro

Asp

Gly

Thr

20

25

30

íle

Asp

Gly Thr

Lys

Asp

Glu

Asn

Ser

Asp

Tyr

Thr

Leu

Phe

Asn

35

40

45

Leu

íle

Pro

Val

Gly

Leu

Arg

Val

Val

Ala

íle

Gin

Gly

Val

Lys

50

55

60

Ala

Ser

Leu

Tyr

Val

Ala

Met

Asn

Gly

Glu

Gly

Tyr

Leu

Tyr

Ser

65

70

75

Ser

Asp

Val

Phe

Thr

Pro

Glu

Cys

Lys

Phe

Lys

Glu.

Ser

Val

Phe

80

85

90

Glu

Asn

Tyr

Tyr

Val

íle

Tyr

Ser

Ser

Thr

Leu

Tyr Arg

Gin

Gin

95

100

105

Glu

Ser

Gly Arg

Ala

Trp

Phe

Leu

Gly

Leu

Asn

Lys

Glu

Gly

Gin

*

110

115

120

íle

Met

Lys

Gly

Asn

Arg

Val

Lys

Lys

Thr

Lys

Pro

Ser

Ser

His

125

130

135

Phe

Val

Pro

Lys

Pro

íle

Glu

Val

Cys

Met

Tyr

Arg

Glu

Pro

Ser

140

145

150

Leu

His

Glu

íle

Gly

Glu

Lys

Gin

Gly Arg

Ser

Arg

Lys

Ser

Ser

155

160

165

(2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 PÁROV BÁZ (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLÓGIA: LINEÁRNA (ii) TYP MOLEKULY: Oligonukleotid (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 3:

ATGCTTCCGG CTCGTATG (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 PÁROV BÁZ (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLÓGIA: LINEÁRNA (ii) TYP MOLEKULY: Oligonukleotid (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 4:

GGGTTTTCCC AGTCACGAC (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 PÁROV BÁZ (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLÓGIA: LINEÁRNA (ii) TYP MOLEKULY: Oligonukleotid (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 5:

GTGAGATCTG AGGGAAGAAG GGGA 24 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 PÁROV BÁZ (B) TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA (C) VLÁKNO: JEDNODUCHÉ (D) TOPOLÓGIA: LINEÁRNA (ii) TYP MOLEKULY: Oligonukleotid (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO 6:

CCACCGATAATCCTCCTT

Claims (24)

1. PATENTOVÉNÁROKY

   1. Izolovaný polynukleotid, vybraný zo skupiny tvorenej

   a) polynukleotidom kódujúcim polypeptid s odvodenou sckvenciou aminokyselín SEQ ID NO 2 alebo fragment, analóg alebo derivát tohto polypeptidu,

   b) polynukleotidom kódujúcim polypeptid so sekvenciou aminokyselín kódovanou cDNA, uloženou v ATCC pod č. 75696, alebo fragment, analóg alebo derivát tohto polypeptidu.
2. 2. Polynukleotid podľa nároku l, ktorým je DNA.
3. 3. Polynukleotid podľ.a nároku 1, ktorým je RNA.
4. 4. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorým je genómová DNA.
5. 5. Polynukleotid podľa nároku 2, ktorý kóduje polypeptid s odvodenou sekven- ciou aminokyselín SEQ ID NO 2.
6. 6. Polynukleotid podľa nároku 2, ktorý kóduje polypeptid kódovaný cDNA, ulo- ženou v ATCC pod č. 75696.
7. 7. Polynukleotid podľa nároku 1, majúci kódujúcu sekvenciu uvedenú ako SEQ ID NO 1.
8. 8. Polynukleotid podľa nároku 2, majúci kódujúcu sekvenciu polypeptidu, ulo- ženú v ATCC pod č. 75696.
9. 9. Vektor obsahujúci DNA podľa nároku 2.
10. 10. Hostiteľská bunka, geneticky manipulovaná vektorom podľa nároku 9.
11. 11. Spôsob výroby polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že z hostiteľskej bunky podľa nároku 10 exprimuje polypeptid kódovaný uvedenou DNA.
12. 12. Spôsob výroby buniek schopných exprimovať polypeptid, vyznačujúci sa tým, že sa bunky geneticky manipulujú vektorom podľa nároku 9.
13. 13. Izolovaná DNA, hybridizovateľná s DNA podľa nároku 2 a kódujúca polypeptid majúci aktivitu FGF-10.
14. 14. Polypeptid zvolený zo skupiny tvorenej (i) polypeptidom s odvodenou sekvenciou aminokyselín SEQ ID NO 2 a jeho fragmenty, analógy alebo deriváty a (ii) polypeptidom kódovaným cDNA, uloženou v ATCC pod č. 75696, a fragmenty, analógy alebo deriváty tohto polypeptidu.
15. 15. Polypeptid podľa nároku 14, ktorým je FGF-10 s odvodenou sekvenciou aminokyselín SEQ ID NO 2.
16. 16. Protilátka proti polypeptidu podľa nároku 14.
17. 17. Zlúčenina účinná ako agonista k polypeptidu podľa nároku 14.
18. 18. Zlúčenina účinná ako antagonista proti polypeptidu podľa nároku 14.
19. 19. Spôsob ošetrovania pacienta potrebujúceho FGF-10, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi podáva terapeuticky účinné množstvo polypeptidu podľa nároku 14.
20. 20. Spôsob ošetrovania pacienta spotrebou inhibície FGF-10, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi podáva terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podľa nároku 18.
21. 21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že terapeuticky účinné množstvo polypeptidu sa podáva poskytovaním DNA kódujúcej uvedený polypeptid pacientovi a expresiou uvedeného polypeptidu in vivo.
22. 22. Spôsob identifikácie zlúčenín účinných ako agonisti a antagonisti FGF-10, vyznačujúci sa tým, že (a) sa za podmienok, keď sú bunky normálne stimulované FGF-10, uvedie do styku FGF-10, zlúčenina podrobovaná screeningu a reakčná zmes obsahujúca bunky, pričom uvedená reakčná zmes obsahuje značku zabudovávanú do buniek pri ich proliferácii, a (b) sa stanoví rozsah proliferácie buniek za účelom identifikácie, či je zlúčenina účinným agonistom alebo antagonistom.
23. 23. Spôsob diagnostiky ochorení alebo náchylnosti k ochoreniu súvisiaceho so zníženou exprcsiou polypeptidu podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že sa stanoví mutácia v sekvencii nukleovej kyseliny kódujúcej tento polypeptid.
24. 24. Spôsob diagnostiky, vyznačujúci sa týin, že sa vzorka získaná od hostiteľa analyzuje na prítomnosť polypeptidu podľa nároku 14.