CZ260696A3 - Fibroplastic growth factor-10 - Google Patents

Description

Vynález se týká nově identifikovaných polynukleotidů, polypeptidů kódovaných těmito polynukleotidy, použití těchto polynukleotidů a polypeptidů a výroby těchto polynukleotidů a polypeptidů. Polypeptidy podle vynálezu jsou konkrétně fibroblastový růstový faktor-10/heparin vázající růstový faktor-10, dále označované jako „FGF-10. Vynález se rovněž týká inhibice působení těchto polypeptidů.

Dosavadní stav techniky

Fibroblastové růstové faktory jsou skupina proteinů, charakteristických vazbou na heparin, a proto se také nazývají heparin vázající růstové faktory (HBGF). Exprese různých těchto proteinů byla zjištěna v různých tkáních a dochází k ní pod zvláštní časovou a prostorovou kontrolou. Tyto proteiny jsou účinnými mitogeny pro různé buňky mesodermálního, ektodermálního a endodermálního původu, zahrnující fibroblasty, korneální a vaskulární endotheliální buňky, granulocyty, adrenální kortikální buňky, chondrocyty, myoblasty, buňky vaskulárního hladkého svalstva, epiteliální buňky čočky, melanocyty, keratinocyty, oligodendrocyty, astrocyty, osteoblasty a hematopoietické buňky.

Každý z těchto proteinů má funkce překrývající se s jinými a rovněž své jedinečné spektrum funkcí. Kromě schopnosti stimulovat proliferaci vaskulárních endotheliálních buněk je jak FGF-1, tak FGF-2 chemotaktický pro endotheliální buňky a u FGF-2 se zjistilo, že umožňuje endotheliálním buňkám pronikat základovou membránou.

v souladu s těmito vlastnostmi má FGF-1 i FGF-2 schopnost stimulovat angiogenesi. Dalším významným rysem těchto růstových faktorů je jejich schopnost podporovat hojení ran. Mnozí další členové skupiny FGF sdílejí s FGF-1 a FGF-2 podobné účinky, jako je podpora angiogenese a hojení ran. U některých členů genové rodiny FGF se ukázalo, že indukují tvorbu mesodermu a modulují diferenciaci neuronových buněk, adipocytů a buněk kosterního svalstva.

Kromě těchto biologických aktivit v normálních tkáních se proteiny FGF účastní podpory tumorigenese v karcinomech a sarkomech podporováním vaskularízace nádorů a jako transformující proteiny, je-li jejich exprese deregulována.

Skupina FGF v současné době sestává z osmi strukturně příbuzných polypeptidů. Geny pro každý z nich byly klonovány a sekvenovány. Dva ze členů, FGF-1 a FGF-2, byly charakterizovány pod různými názvy, ale nejčastěji jako bazický, resp. kyselý fibroblastový růstový faktor. Normální genové produkty ovlivňují obecnou proliferační schopnost většiny buněk odvozených od mesodermu a neuroektodermu. Jsou schopny indukovat angiogenesi in vivo a mohu hrát významno roli v raném vývoji (Burgess, W.H. a Maciag, T., Annu. Rev. Biochem., 58:575-606 (1989)).

Eukaryotický expresní vektor, kódující vylučovanou formu FGF-1, byl zaveden genovým přenosem do prasečích tepen. Tento model definuje funkci genu v arteriální stěně in vivo. Exprese FGF-1 vyvolala v prasečích tepnách 21 dní po genovém přenosu intimální zesílení (Nabel, E.G., a d., Nátuře, 362:844-6 (1993)). Dále bylo demonstrováno, že bazický fibroblastový růstový faktor může regulovat růst a progresi gliomů nezávisle na své roli při angiogenesi nádorů a že toto působení může vyžadovat uvolňování nebo vylučování bazického fibroblastového růstového faktoru (Morrison, R.S. ad., J. Neurosci. Res., 34:502-9 (1993)).

bazické fibroblastové mitogenicity, syntézy

Fibroblastové růstové faktory, jako je bazický FGF, se dále účastní růstu buněk Kaposiho sarkomu in vitro (Huang, Y.Q., a d., J. Clin. Invest,, 91:1191-7 (1993)). Dále byla sekvence cDNA, kódující lidský bazický fibroblastový růstový faktor, klonována za transkripční promotor, rozpoznávaný RNA polymerasou bakteriofága T7. Bylo zjištěno, že takto získané růstové faktory plasminogenového angiogenese biologickou aktivitu nerozlišitelnou od lidského placentárního fibroblastového růstového faktoru (Squires, C.H., a d., J. Biol. Chem. 263:16297-302 (1988)).

mají v testech aktivátoru a

Patent US 5,155.214 popisuje v podstatě čisté savčí bazické fibroblastové růstové faktory a jejich výrobu. Je uvedena sekvence aminokyselin hovězího a lidského bazického fibroblastového růstového faktoru, stejně jako sekvence DNA, kódující polypeptid hovězího faktoru.

Polypeptid podle vynálezu byl předběžně identifikován jako člen skupiny FGF v důsledku homologie sekvence aminokyselin s ostatními členy skupiny FGF.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou nové maturované polypeptidy, tvořené FGF-10 a jeho biologicky aktivními a diagnosticky nebo terapeuticky použitelnými fragmenty, analogy a deriváty. Polypeptidy podle vynálezu jsou lidského původu.

Předmětem vynálezu jsou rovněž izolované molekuly nukleových kyselin kódující FGF-10, zahrnující mRNA, DNA, cDNA, genomovou DNA a jejich antimediátorové analogy a biologicky aktivní a diagnosticky nebo terapeuticky využitelné fragmenty.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby takovéhoto polypeptidu rekombinačními metodami s použitím rekombinačních v

vektorů, jako jsou klonovací a expresní plasmidy, použitelné při rekombinační výrobě proteinů FGF-10, a rekombinačních prokaryotických a/nebo eukaryotických hostitelských buněk zahrnujících sekvenci nukleové kyseliny lidského FGF-10.

Dále je předmětem vynálezu způsob použití takovéhoto polypeptidu nebo polynukleotidu kódujícího takový peptid k terapeutickým účelům, například k podpoře hojení ran, popálenin a vředů, k prevenci neuronálního poškození v důsledku neuronálních poruch a k prevenci stárnutí pokožky a úbytku vlasů.

Dále jsou předmětem vynálezu protilátky proti těmto polypeptidům.

Dále jsou předmětem vynálezu antagonisté proti těmto polypeptidům, kterých je možno použít k inhibici působení takového polypeptidu, například při léčbě nádorů a hyperyaskulárních onemocnění.

Dále jsou předmětem vynálezu sondy nukleových kyselin, zahrnující molekuly nukleových kyselin o dostatečné délce pro specifickou hybridizaci se sekvencemi lidského FGF-10.

Dále jsou předmětem vynálezu diagnostické testy pro detekci onemocnění nebo náchylnosti k onemocněním, souvisejícím s mutacemi sekvencí nukleových kyselin FGF-10 nebo s hyperexpresí polypeptidu kódovaných těmito sekvencemi.

Dále je předmětem vynálezu způsob použití těchto polypeptidu nebo polynukleotidu kódujících tyto polypeptidy pro účely in vitro, související s vědeckým výzkumem, syntézou DNA a výrobou vektorů DNA.

Vynález se v jednom aspektu týká izolovaných molekul nukleových kyselin (polynukleotidu), které kódují maturovaný polypeptid, jehož odvozená sekvence aminokyselin je zobrazena na obr. 1 (SEQ ID NO 2), nebo maturovaný polypeptid kódovaný cDNA klonu uloženého 4.3.1994 u ATCC pod číslem 75696.

Polynukleotid podle vynálezu byl objeven nejdříve v knihovně cDNA, odvozené od Qtýdenní lidské tkáně časného stadia a pak byla nalezena cDNA plné délky v knihovně odvozené od lidské mandle. Je strukturně příbuzný všem členům rodiny genů fibroblastového růstového faktoru a obsahuje otevřený čtecí rámec kódující polypeptid o 181 aminokyselinách. Mezi vrcholné shody patří: 1) 37% identita a 67% sekvenční podobnost s FGF-9, izolovaným z mozku, v úseku 129 aminokyselin; 2) 36% identita a 64% podobnost s FGF-7 (keratinocytový růstový faktor) v oblasti 121 aminokyselin; 3) 33% identita a 55% podobnost s FGF-1 (kyselý FGF) v úseku 110 aminokyselin. Kromě toho je v polypeptidů podle vynálezu zachována signatura skupiny FGF/HBGF, tj. GXLX(S,T,A,G)X6(D,E)CXFXE (X znamená zbytek kterékoli aminokyseliny, (D,E) znamená buď zbytek D nebo E, X6 znamená 6 jakýchkoli zbytků aminokyselin).

Polynukleotid podle vynálezu může být ve formě RNA nebo ve formě DNA, přičemž DNA zahrnuje cDNA, genomovou DNA a syntetickou DNA. DNA může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová. Kódující sekvence, která kóduje maturovaný polypeptid, může být identická s kódující sekvencí uvedenou na obr. 1 (SEQ ID NO 1) nebo s kódující sekvencí uloženého klonu, nebo to může být odlišná kódující sekvence v důsledku repetice nebo degenerace genetického kódu, která kóduje tentýž maturovaný polypeptid jako DNA na obr. 1 (SEQ ID NO 1) nebo uložená cDNA.

Polynukleotid, který kóduje maturovaný polypeptid podle obr. 1 (SEQ ID NO 2) nebo maturovaný polypeptid kódovaný uloženou cDNA, může zahrnovat: pouze kódující sekvenci pro maturovaný polypeptid; kódující sekvenci pro maturovaný polypeptid a další kódující sekvenci, jako je vedoucí nebo sekreční sekvence nebo sekvence proproteinu; kódující sekvenci pro maturovaný polypeptid (a popřípadě další kódující sekvenci) a nekódující sekvenci, jako jsou introny nebo nekódující sekvence 5' a/nebo 3' kódující sekvence pro maturovaný polypeptid.

Výraz „polynukleotid kódující polypeptid zahrnuje polynukleotid, který obsahuje pouze kódující sekvenci pro polypeptid, stejně jako polynukleotid, který obsahuje další kódující a/nebo nekódující sekvenci.

Předmět vynálezu se dále týká variant výše popsaných polynukleotidů, které kódují fragmenty, analogy a deriváty polypeptidů, majícího odvozenou sekvenci aminokyselin podle obr. 1 (SQ ID NO 2), nebo polypeptidů kódovaného cDNA uloženého klonu. Variantami polynukleotidu mohou být přirozeně se vyskytující alelické varianty polynukleotidu nebo varianty polynukleotidu, přirozeně se nevyskytující.

Vynález tedy zahrnuje polynukleotidy kódující tentýž maturovaný polypeptid, jaký je znázorněn na obr. 1 (SEQ ID NO

2), nebo tentýž maturovaný polypeptid, jaký je kódován cDNA uloženého klonu, stejně jako varianty těchto polynukleotidů, které kódují fragment, derivát nebo analog polypeptidů podle obr. 1 (SEQ ID NO 2) nebo polypeptid kódovaný cDNA uloženého klonu. Takové nukleotidové varianty zahrnují deleční, substituční a adiční nebo inserční varianty.

Jak výše uvedeno, polynukleotid může mít kódující sekvenci, kterou je přirozeně se vyskytující alelická varianta kódující sekvence znázorněné na obr. 1 (SEQ ID NO 1) nebo kódující sekvence uloženého klonu. Jak známo, alelická varianta je alternativní forma polynukleotidové sekvence, která může mít substituci, deleci nebo adici jednoho nebo více nukleotidů, která podstatně nemění funkci kódovaného polypeptidů.

Vynález zahrnuje rovněž polynukleotidy, kde může být kódující sekvence maturovaného polypeptidů fúzována v tomtéž čtecím rámci s polynukleotidovou sekvencí, která napomáhá expresi a sekreci polypeptidů z hostitelské buňky, například s vedoucí sekvencí, která funguje jako sekreční sekvence pro kontrolu transportu polypeptidu z buňky. Polypeptid mající vedoucí sekvenci je preprotein a jeho vedoucí sekvence může být odštěpena hostitelskou buňkou za vzniku maturované formy polypeptidu. Polynukleotidy mohou rovněž kódovat proprotein, kterým je maturovaný protein plus přidané 5'-aminokyselinové zbytky. Maturovaný protein, který má prosekvenci, je proprotein a jedná se o inaktivní formu proteinu. Jakmile je prosekvence odštěpena, zbývá aktivní maturovaný protein.

Polynukleotid podle vynálezu tedy například může kódovat maturovaný protein nebo protein s prosekvenci nebo protein s prosekvenci i presekvencí (vedoucí sekvencí).

Polynukleotidy podle vynálezu mohou mít rovněž kódující sekvenci, fúzovanou v rámci s markerovou sekvencí, která umožňuje čištění polypeptidu podle vynálezu. Markerovou sekvencí může být hexahistidinový úsek, dodaný vektorem pQE9, umožňující čištění maturovaného polypeptidu, fúzovaného s markérem, v případě bakteriálního hostitele, nebo například může být markerovou sekvencí hemaglutininový (HA) úsek, používá-li se savčí hostitel, například buňky COS-7. Markér HA odpovídá epitopu, odvozenému od proteinu chřipkového hemaglutininu (Wilson, I., a d., Cell, 37:767 (1984)).

50%, přednostně polynukleotidů, polynukleotidy podmínky” zde „striktní pouze při

Vynález se dále týká polynukleotidů, které hybridizují s výše popsanými sekvencemi, je-li mezi sekvencemi alespoň 70% identita. Vynález se zejména týká které hybridizují s výše popsanými za striktních podmínek. Výraz znamená, že k hybridizaci dojde alespoň 95%, přednostně alespoň 97% identitě mezi sekvencemi. Polynukleotidy, které hybridizují s výše popsanými polynukleotidy ve výhodném provedení, si uchovávají v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako maturovaný polypeptid kódovaný cDNA podle obr. 1 (SEQ ID NO 1) nebo uloženou cDNA.

Uváděné uložené vzorky budou uchovávány podle Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložení mikroorganismů k účelům patentového řízení. Tyto vzorky jsou uloženy pouze pro pohodlnost a nepředstavují připuštění, že by uložení bylo nutné podle § 112 USC 35. Sekvence polynukleotidů obsažených v uložených materiálech, stejně jako sekvence aminokyselin polypeptidů, které jsou jimi kódovány, jsou zde zahrnuty formou odkazu a jsou rozhodující v případě jakéhokoli konfliktu se zde uvedeným popisem sekvencí. K výrobě, použití nebo prodeji uložených materiálů může být vyžadována licence a tímto se žádná taková licence neuděluj e.

Vynález se dále týká polypeptidů FGF-10, který má odvozenou sekvenci aminokyselin podle obr. 1 (SEQ ID NO 2) nebo který má sekvenci aminokyselin kódovanou uloženou cDNA, stejně jako fragmentů, analogů a derivátů takovéhoto polypeptidů.

Výrazy „fragment, „derivát a „analog s odkazem na polypeptid podle obr. 1 (SEQ ID NO 2) nebo polypeptid kódovaný uloženou cDNA znamenají polypeptid, který si uchovává v podstatě stejnou biologickou funkci nebo aktivitu jako tento polypeptid. Analog tedy zahrnuje proprotein, který může být aktivován odštěpením proproteinové části za vzniku aktivního maturovaného polypeptidů.

Polypeptidem podle vynálezu může být rekombinační polypeptid, přírodní polypeptid nebo syntetický polypeptid, přednostně rekombinační polypeptid.

Fragment, derivát nebo analog polypeptidů podle obr. 1 (SEQ ID NO 2) nebo polypeptidů kódovaného uloženou cDNA může být (i) takový, v němž je jeden nebo více aminokyselinových zbytků nahrazeno konzervativním nebo nekonzervativním aminokyselinovým zbytkem (přednostně konzervativním aminokyselinovým zbytkem) a tímto dosazeným aminokyselinovým zbytkem může nebo nemusí být zbytek kódovaný genetickým kódem, nebo (ii) takový, v němž jeden nebo více aminokyselinových zbytků obsahuje substituentovou skupinu, nebo (iii) takový, v němž je maturovaný polypeptid fúzován s jinou sloučeninou, jako je sloučenina zvyšující poločas polypeptidu (například polyethylenglykol), nebo (iv) takový, v němž jsou k maturovanému peptidu fúzovány další aminokyseliny, jako je vedoucí nebo sekreční sekvence nebo sekvence, která se používá pro čištění maturovaného polypeptidu nebo proproteinové sekvence. Tyto fragmenty, deriváty a analogy se považují za spadající do rozsahu znalostí odborníka na základě zde uvedených údajů.

Polypeptidy a polynukleotidy podle vynálezu se přednostně vyskytují v izolované formě a přednostně jsou čištěny do homogenity.

Výraz „izolovaný znamená, že materiál je oddělen od svého původního prostředí (například přirozeného prostředí, vyskytuje-li se přirozeně). Například přirozeně se vyskytující polynukleotid nebo polypeptid přítomný v živém živočichovi se neizoluje, ale tentýž polynukleotid nebo DNA nebo ' polypeptid, oddělený od některých nebo všech doprovodných materiálů v přirozeném systému, se izoluje. Izoluje se i v případě, že je polynukleotid součástí vektoru a/nebo když je polynukleotid nebo polypeptid součástí směsi, protože takový vektor nebo směs není součástí jeho přirozeného prostředí.

Vynález se týká rovněž vektorů, která zahrnují polynukleotidy podle vynálezu, hostitelských buněk, které jsou podrobeny genetické manipulaci pomocí vektorů podle vynálezu a výroby polypeptidu podle vynálezu rekombinačními metodami.

Hostitelské buňky mohou být podrobeny genetické manipulaci (transdukci nebo transformaci nebo transfekci) pomocí vektorů podle vynálezu, kterými mohou být například klonovací vektory nebo expresní vektory. Vektor může být

1ο například ve formě plasmidu, virové částice, fága atd. Takto manipulované hostitelské buňky mohou být kultivovány v konvenčním živném médiu, příslušně modifikovaném pro aktivaci promotorů, selekci transformantú nebo amplifikaci genů FGF-10. Podmínky kultivace, jako je teplota, pH apod., jsou stejné, jaké byly použity u hostitelské buňky zvolené pro expresi, a jsou běžnému odborníkovi zřejmé.

Polynukleotíd podle vynálezu může být použit pro výrobu peptidu rekombinačními metodami. Například může být polynukleotidové sekvence zahrnuta do jednoho z různých expresních médií, zejména vektorů nebo plasmidů pro expresi polypeptidu. Tyto vektory zahrnují chromosomální, nechromosomální a syntetické sekvence DNA, například deriváty SV40; bakteriální plasmidy; fágovou DNA; kvasinkové plasmidy; vektory odvozené od kombinací plasmidů a fágové DNA, virální DNA, jako je virus vakcinie, adenovirus, virus drůbežích neštovic a pseudorabies. Je však možno použít i jakéhokoli jiného vektoru nebo plasmidu, pokud jsou v hostiteli replikovatelné a životaschopné.

Příslušné sekvence DNA mohou být do vektoru vloženy různými postupy. Obecně se sekvence DNA vkládá známými postupy do příslušných míst restrikčních endonukleas. Tyto a další postupy spadají do rozsahu znalostí odborníka.

Sekvence DNA v expresním vektoru je operativně navázána k příslušné řídící sekvenci(ím) (promotoru) pro řízení syntézy mRNA. Jako příklady takovýchto promotorů je možno uvést promotor LTR nebo SV40, lac nebo trp E. coli, promotor P_L fága lambda a další promotory, o nichž je známo, že řídí expresi genů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách nebo jejich virech. Expresní vektor obsahuje také místo vazby ribosomů pro iniciaci translace a terminátor transkripce. Vektor může rovněž obsahovat příslušné sekvence pro amplifikační expresi.

Expresní vektory dále přednostně obsahují gen poskytující fenotypický rys pro selekci transformovaných hostitelských buněk, jako je dihydrofolát reduktasa nebo neomycinová rezistence pro eukaryotickou buněčnou kulturu nebo tetracyklinová nebo ampicilinová rezistence v E. coli.

Vektor, obsahující výše popsanou příslušnou sekvenci DNA stejně jako příslušný promotor nebo řídící sekvenci, může být použit k transformaci vhodného hostitele, a tak umožnit expresi proteinu hostitelem. Jako příklady vhodných hostitelů je možno uvést bakteriální buňky, jako je E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces; buňky plísní, jako jsou kvasinky; hmyzí buňky, jako je Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; zvířecí buňky, jako jsou CHO, COS nebo Bowesův melanom; adenoviry, rostlinné buňky atd. Výběr vhodného hostitele se považuje za zřejmý pro odborníka na základě zde uvedených údajů.

Vynález konkrétně rovněž zahrnuje rekombinační konstrukty, zahrnující jednu nebo více výše podrobně popsaných sekvencí. Konstrukty obsahují vektor, jako je plasmid nebo virální vektor, do něhož byla vložena sekvence podle vynálezu v přímé nebo zpětné orientaci. Ve výhodném provedení vynálezu konstrukt dále obsahuje regulační sekvence, zahrnující například promotor, operativně vázaný k sekvenci. Odborníkovi jsou známy a obchodně jsou dostupné různé vhodné vektory a promotory. Jako příklady se uvádějí tyto vektory: Bakteriální: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTRC99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Phramacia). Eukaryotické: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Mohou však být použity jakékoli další vektory nebo plasmidy, pokud jsou v hostiteli replikovatelné a životaschopné.

Promotorové oblasti mohou býl z kteréhokoli požadovaného genu selektovány pomocí vektorů CAT (chloramfenikol

ΊΖ·' transferasa) nebo jiných vektorů se selektovatelnými markéry. Dvěma vhodnými vektory jsou pKK232-8 a pCM7. Konkrétní jmenovité bakteriální promotory zahrnují lad, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, P_L a trp. Eukaryotické promotory zahrnují bezprostřední časný CMV, HSV thymidin kinasu, časný a pozdní SV40, LTR z retrovirů a myší metallothionein-I. Volba vhodného vektoru a promotoru spadá zcela do úrovně běžných znalostí v oboru.

V dalším provedení se vynález týká hostitelských buněk obsahujících výše popsaný konstrukt. Hostitelskou buňkou může být vyšší eukaryotická buňka, jako je savčí buňka, nebo nižší eukaryotická buňka, jako je kvasinková buňka, nebo jí může být prokaryotická buňka, jako je bakteriální buňka. Zavedení konstruktu do hostitelské buňky může být prováděno transfekcí fosforečnanem vápenatým, transfekcí zprostředkovanou DEAEDextranem nebo elektroporací (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986)) .

Konstrukty v hostitelských buňkách mohou být použity běžným způsobem k výrobě genového produktu kódovaného rekombinační sekvencí. Alternativně je možno polypeptidy podle vynálezu vyrábět synteticky pomocí konvenčních peptidových syntetizátorů.

Maturované proteiny mohou být exprimovány v savčích buňkách, kvasinkách, bakteriích nebo dalších buňkách pod kontrolou příslušných promotorů. K výrobě těchto proteinů mohou být rovněž použity bezbuněčné translační systémy s použitím RNA, odvozených od konstruktů DNA podle vynálezu. Vhodné klonovací a expresní vektory pro použití v prokaryotických a eukaryotických hostitelích jsou popsány v Sambrook a d., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), kterážto publikace je zde zahrnuta jako odkaz.

Transkripce DNA, kódující polypeptidy podle vynálezu, vyššími eukaryoty, se zvýší zavedením zesilovací <5 (enhancerové) sekvence do vektoru. Enhancery jsou elementy DNA, působící v poloze cis, obvykle o asi 10 až 300 bp, které působí na promotor za účelem zvýšení jeho transkripce. Jako příklady je možno uvést enhancer SV40 na pozdní straně počátku replikace (bp 100 až 270), enhancer časného promotoru cytomegaloviru, polyomový enhancer na pozdní straně počátku replikace a adenovirové enhancery.

Rekombinační expresní vektory obecně obsahují počátek replikace a selektovatelné markéry, umožňující transformaci hostitelské buňky, například gen ampícilinové rezistence E. coli a gen S. cerevisiae TRPÍ, a promotor odvozený od vysoce exprimovaného genu k řízení transkripce strukturní sekvence po směru exprese. Takové promotory mohou být odvozeny od operonů kódujících glykolytické enzymy, jako je mezi jinými

3-fosfoglycerát kinasa (PGK), faktor a, kyselá fosfatasa nebo proteiny teplotního šoku. Heterologní strukturní sekvence je nastavena do příslušné fáze s translační, iniciační a terminační sekvencí. Případně může heterologní sekvence kódovat fúzní protein, zahrnující N-terminální identifikační peptid dodávající požadované charakteristiky, například stabilizaci nebo zjednodušené čištění exprimovaného rekombinačního produktu.

Vhodné expresní vektory pro bakteriální použití se konstruují vložením strukturní sekvence DNA, kódující požadovaný protein, spolu s vhodnými translačními, iniciačními a terminačními signály v operativně čtecí fázi s funkčním promotorem. Vektor obsahuje jeden nebo více fenotypických selektovatelných markérů a počátek replikace, aby bylo zajištěno zachování vektoru, a je-li to žádoucí, dosaženo amplifikace v hostiteli. Vhodní prokaryotičtí hostitelé pro transformaci zahrnují E. coii, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium a různé druhy rodů Pseudomonas, Streptomyces a Staphylococcus, avšak je možno podle potřeby volit i jiné.

Jako neomezující příklady vhodných expresních vektorů pro bakteriální použití je možno uvést vektory obsahující selektovatelný markér a bakteriální počátek replikace, odvozené od komerčně dostupných plasmidu, zahrnujících genetické elementy známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC 37017). Takové komerční vektory zahrnují například pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švédsko) a GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Tyto „řetězcové sekce pBR322 jsou kombinovány v příslušným promotorem a strukturní sekvencí, která má být exprimována.

Po transformaci vhodného hostitelského kmene a kultivaci hostitelského kmene na příslušnou hustotu buněk se zvolený promotor dereprimuje vhodnými prostředky (například změnou teploty nebo chemickou indukcí) a buňky se ještě nějakou dobu kultivuj í.

Buňky se izolují nejčastěji odstředěním, rozruší fyzikálními nebo chemickými prostředky a vzniklý surový extrakt se uchová pro další čištění.

Mikrobiální buňky, používané při expresi proteinů, mohou být rozrušeny jakoukoli běžnou metodou, například cykly zmrazování a rozmrazování, sonifikací, mechanickým rozrušením nebo použitím lyzačních prostředků.

K expresi rekombinačního proteinu mohou být rovněž použity různé savčí buněčné kultivační systémy. Příklady savčích expresních systémů zahrnují linie COS-7 opičích ledvinových fibroblastů, popsané v Gluzman, Cell, 23:175 (1981), a další buněčné linie schopné exprese kompatibilního vektoru, například buněčné linie C127, 3T3, CHO, HeLa a BHK. Savčí expresní vektory obsahují počátek replikace, vhodný promotor a enhancer a také veškerá potřebná místa vazby ribosomů, polyadenylační místo, místa donorů a akceptorů sestřihu, terminační sekvence transkripce a 5'-Lemující nepřepsané sekvence. K získání požadovaných nepřepsaných genetických elementů je možno použít sekvenci DNA, odvozenou

ΊΓ od virálního genomu SV40, například počátek SV40, časný promotor, enhancer, sestřih a polyadenylační místa.

FGF-10 může být z řekombinačních buněčných kultur izolován a čištěn dosud známými metodami, zahrnujícími srážení síranem amonným nebo ethanolem, kyselou extrakci, aniontově nebo kationtově výměnnou chromatografii, chromatografii na fosfocelulóze, chromatografii s hydrofobní interakcí, afinitní chromatografii, hydroxyapatitovou chromatografii a lektinovou chromatografii. Je možno použít stupňů opětného skládání proteinu, je-li to nutné pro komplětaci konfigurace maturovaného proteinu. Pro konečné čištění je možno použít vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC).

Polypeptidy podle vynálezu mohou představovat přirozeně čištěný produkt nebo produkt chemických syntetických postupů nebo produkt získaný řekombinační technologií z prokaryotického nebo eukaryotického hostitele (například bakteriálními, kvasinkovými, vyššími rostlinnými, hmyzími a savčími buňkami v kultuře). V závislosti na hostiteli použitém v řekombinační produkční technologii mohou být polypeptidy podle vynálezu glykosylovány savčími nebo jinými eukaryotickými uhlohydráty nebo mohou být neglykosylované. Polypeptidy podle vynálezu mohou dále obsahovat počáteční zbytek aminokyseliny methioninu.

Polypeptid podle vynálezu může být v důsledku schopnosti stimulovat vaskulární endotheliální buněčný růst použit při ošetření za účelem stimulace revaskularizace ischemických tkání v případě různých chorobných stavů, jako je trombóza, arterioskleróza a další kardiovaskulární choroby.

FGF-10 může být rovněž použit k ošetřování ran v důsledku poranění, popálenin, pooperačních oprav tkáně a vředů, poněvadž má schopnost mitogenně působit na různé typy buněk, jako jsou fibroblastové buňky a buňky kosterního svalstva.

FGF-10 může být použit rovněž k ošetřování a prevenci neuronálního poškození, ke kterému dochází při určitých néuronálních poruchách nebo neurovegetativních stavech, jako je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a komplex související s AIDS. FGF-10 má schopnost stimulovat růst chondrocytů, a proto může být použit k podpoře regenerace kostí a periodontu a napomáhat při tkáňových transplantátech a kostních štěpech.

FGF-10 může být rovněž použit k prevenci stárnutí pokožky v důsledku opalování pomocí stimulace růstu keratinocytů.

FGF-10 může být použit i k prevenci úbytku vlasů, poněvadž aktivuje buňky vlasů a podporuje růst melanocytů. Na stejném principu stimuluje FGF-10 růst a diferenciaci hematopoietických buněk a buněk kostní dřeně, je-li použit v kombinaci s dalšími cytokiny.

FGF-10 může být rovněž použit k uchovávání orgánů před transplantací nebo pro uchovávání buněčné kultury primárních tkání.

Vynález se dále týká způsobu použití těchto polypeptidů nebo polynukleotidů kódujících tyto polypeptidy pro účely in vitro související s vědeckým výzkumem, syntézou DNA, výrobou vektorů DNA a pro účel získávání diagnostických a terapeutických prostředků pro ošetřování lidských onemocnění.

Fragmenty plné délky genu FGF-10 mohou být použity jako hybridizační sonda pro knihovnu cDNA za účelem izolace plné délky genu FGF-10 a k izolaci dalších genů, které s ním mají vysokou sekvenční podobnost nebo které mají podobnou biologickou aktivitu. Sondy tohoto typu mají obvykle alespoň 20 bází. Přednostně však sondy obsahují alespoň 30 bází a obvykle nepřesahují 50 bází, i když mohou mít i větší počet bází. Sonda může být použita také k identifikaci klonu cDNA odpovídajícího plné délce transkriptu a genomického klonu nebo klonů, které obsahují kompletní gen FGF-10 včetně regulačních a promotorových oblastí, ezonu a intronu. Příkladem screeningu je izolace kódující oblasti genu FGF-10 s použitím známé sekvence DNA k syntéze oligonukleotidové sondy. Značené oligonukleotIdy, mající komplementární sekvenci k sekvenci genu podle vynálezu, se používají ke screeningu knihovny lidské cDNA, genomové DNA nebo mRNA za účelem zjištění, s kterými členy knihovny sonda hybridizuje.

Vynález poskytuje způsob identifikace receptorů pro polypeptid FGF-10. Gen kódující receptor muže být identifikován různými metodami, známými odborníkům, například vyhledáváním ligandů a tříděním FACS (Coligan a d., Current Protocols in Immun., kapitola 5 (1991)). Jestliže se připravuje polyadenylovaná RNA z buňky odpovídající polypeptidům, používá se přednostně expresní klonování a knihovna cDNA, vytvořená z této RNA, se rozdělí do souborů a použije k transfekci buněk COS nebo jiných buněk, které neodpovídají polypeptidům. Transfikované buňky, které se pěstují na skleněných podložních sklíčkách, se vystaví značeným polypeptidům. Polypeptidy mohou být značeny různými prostředky, zahrnujícími jodaci nebo zabudování rozpoznávacího místa pro místně specifickou proteinkinasu. Po fixaci a inkubaci se sklíčka podrobí autoradiografické analýze. Identifikují se pozitivní soubory a připraví se podsoubory, které se retransfikuji s použitím procesu iterativního seskupování a rescreeningu, čímž se nakonec získá.jednotlivý klon, který kóduje přepokládaný receptor.

Jako alternativní přístup k identifikaci receptorů mohou být značené polypeptidy fotoafinitně navázány na buněčnou membránu nebo extraktové preparáty, které exprimují receptorovou molekulu. Zesítěný materiál se rozštěpí pomocí analýzy PAGE a vytaví rentgenovému filmu. Značený komplex, obsahující receptory polypeptidu, může být vyříznut, rozštěpen na peptidové fragmenty a podroben mikrosekvenování proteinů. Sekvence aminokyselin, získaná mikrosekvenováním, se použije ke konstrukci sady degenerovaných oligonukleotidových sond pro screening knihovny cDNA za účelem identifikace genů kódujících předpokládané receptory.

Vynález poskytuje způsob screeningu za účelem identifikace sloučenin, které modulují působení FGF-10. Příklad takového testu zahrnuje kombinaci savčí fibroblastové buňky, FGF-10, sloučeniny podrobované screeningu a ³[H]~ thymidinu za podmínek buněčné kultivace, za nichž by fibroblastové buňka normálně proliferovala. Je možno provést kontrolní test v nepřítomnosti sloučeniny podrobované screeningu a porovnat s velikostí proliferace fibroblastů v přítomnosti testované sloučeniny za účelem stanovení, zda sloučenina stimuluje proliferaci keratinocytů stanovením příjmu ³[H]thymidinu v obou případech.

Za účelem screeningu na antagonisty je možno připravit stejný test a měří se schopnost sloučeniny bránit proliferaci fibroblastů a provede se stanovení antagonistických vlastností. Velikost proliferace fibroblastových buněk se měří kapalnou scintilační chromatografií, jíž se měří zabudování ³[H]thymidinu.

V jiné metodě se savčí buňka nebo membránový preparát, exprimující receptor FGF-10, inkubuje se značeným FGF-10 v přítomnosti sloučeniny. Pak je možno měřit schopnost sloučeniny podporovat nebo blokovat tuto interakci. Alternativně se měří odpověď druhého známého messengerového systému po interakci FGF-10 a receptoru a porovnává se v přítomnosti a nepřítomnosti sloučeniny. Takovéto druhé messehgerové systémy zahrnují, aniž by se na ně omezovaly, cAMP guanylátcyklasu, iontové kanálky nebo hydrolýzu fosfoinositidu.

Jako příklady potenciálních antagonistů FGF-10 je možno uvést protilátku nebo v některých případech oligonukleotid, který se váže na polypeptid. Alternativně může být potenciálním antagonistou FGF-10 mutantní forma FGF-10, která se váže na receptory FGF-10, avšak není vyvolána žádná odpověď druhého messengeru, efektivně blokován.

tudíž je účinek FGF-10

Dalším potenciálním antimediátorový konstrukt, antagonistou FGF-10 je připravený antimediátorovou

5'-kóduj ící maturované technologií. Antimediátorovou technologii je možno použít ke kontrole exprese genů prostřednictvím tvorby trojité spirály nebo antimediátorové DNA nebo RNA, kteréžto obě metody jsou založeny na vazbě polynukleotidu na DNA nebo RNA. Například část polynukleotidové sekvence, která kóduje polypeptidy podle vynálezu, se použije ke konstrukci antimediátorového oligonukleotidu RNA o délce asi 10 až 40 párů bází. Navrhne se oligonukleotid DNA tak, aby byl komplementární k oblasti genu, účastnící se transkripce (trojitá spirála, viz Lee a d., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney a d., Science, 241:456 Science, 251: 1360 produkci FGF-10.

1988); a Dervan a d., (1991)), a tak bránil transkripci a Antimediátorový oligonukleotid RNA hybridizuje in vivo s mRNA a blokuje translaci molekuly mRNA do polypeptidu FGF-10 (proti smyslu; Okano, J., Neurochem., 56:560 (1991);, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boča Raton, FL (1988)). Výše popsané oligonukleotidy mohou být rovněž dodány do buněk tak, aby byla in vivo exprimována antimediátorová RNA nebo DNA k inhibici produkce FGF-10.

Potenciální antagonisté FGF-10 zahrnují malé molekuly, které se vážou na vazebná místa receptoru FGF-10 a okupují je, a tak způsobují nepřístupnost receptoru pro FGF-10, takže je zabráněno normální biologické aktivitě. Příklady malých molekul zahrnují, avšak neomezují se na ně, malé peptidy nebo molekuly podobné peptidům.

Antagonistů FGF-10 je možno používat k inhibici růstu buněk a proliferačních účinků FGF-10 na neoplastické buňky a tkáně, a tudíž k retardaci nebo prevenci abnormálního růstu a proliferace buněk, například růstu nádorů.

Ί-ο

Antagonistů FGF-10 je možno použít rovněž k prevenci hypervaskulárních onemocnění a k prevencí proliferace epiteliálních buněk čočky po chirurgii extrakapsulární katarakty.

Antagonisté mohou být používáni ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem, například dále popsaným.

Polypeptidy, agonisté a antagonisté podle vynálezu mohou být používáni v kombinaci s vhodným farmaceutickým nosičem ve formě farmaceutického přípravku. Takové přípravky zahrnují terapeuticky účinné množství polypeptidu, agonisty nebo antagonisty a farmaceuticky přijatelný nosič nebo vehikulum. Takovýto nosič zahrnuje, avšak neomezuje se na ně, solný roztok, pufrovaný solný roztok, dextrózu, vodu, glycerol, ethanol a jejich kombinace. Formulace by měla odpovídat způsobu podávání.

Vynález poskytuje rovněž farmaceutickou soupravu nebo kit, zahrnující jednu nebo více nádobek naplněných jednou nebo více složkami farmaceutických přípravků podle vynálezu. K této nádobce (nádobkám) může být připojeno oznámení ve formě předepsané vládní agenturou regulující výrobu, používání nebo prodej farmaceutických nebo biologických produktů, které odráží souhlas této agentury s výrobou, používáním nebo prodejem pro humánní aplikaci. Kromě toho mohou být polypeptidy, agonisté a antagonisté podle vynálezu používáni ve spojení s dalšími terapeutickými sloučeninami.

Farmaceutické přípravky mohou být podávány běžným způsobem, například orální, topickou, intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární, subkutánní, intranasální nebo intradermální cestou. Farmaceutické přípravky jsou podávány v množství, které je účinné při léčbě a/nebo profylaxi specifické indikace. Obecně se podávají v množství alespoň asi 10 gg/kg tělesné hmotnosti a ve většině případů se podávají v množství nepřesahujícím asi 8 mg/kg tělesné hmotnosti za den. Ve většině případů činí dávkování asi 10 'f gg/kg až asi 1 mg/kg tělesné hmotnosti denně s přihlédnutím ke způsobu podávání, symptomům atd. V konkrétním případě topické aplikace se podávají přednostně dávky asi 0,1 pg až 9 mg na cm².

Polypeptidy FGF-10 a agonisté a antagonisté, kteří jsou polypeptidy, mohou být rovněž používáni podle vynálezu expresí takového polypeptidu in vivo, která se často označuje jako „genová terapie.

Tak mohou být buňky například podrobeny genové manipulaci s polynukleotidem (DNA nebo RNA), kódujícím polypeptid, ex vivo, a pak dodány pacientovi, který má být léčen tímto polypeptidem. Takové metody jsou známy. Buňky mohou být například podrobeny známým způsobem manipulaci s použitím retrovirální částice obsahující RNA, kódující polypeptid podle vynálezu

Podobně mohou být buňky manipulovány in vivo pro expresi polypeptidu in vivo, například známými metodami. Jak je známo, za účelem manipulace buněk in vivo a exprese polypeptidu in vivo může být podávána pacientovi produkční buňka pro produkci retrovirální částice obsahující RNA, kódující polypeptid podle vynálezu. Tyto a další způsoby podávání polypeptidu podle vynálezu jsou pro odborníka zřejmé z údajů tohoto popisu. Například expresní vehikulum pro manipulaci buněk může být jiné než retrovirální částice, například adenovirus, který může být použit k manipulaci buněk in vivo v kombinaci s vhodným nosným vehikuiem.

Vynález se rovněž týká použití genu FGF-10 jako součásti diagnostického testu pro detekci onemocnění nebo náchylnosti k onemocněním souvisejícím s přítomností mutací v sekvenci nukleových kyselin FGF-10.

Jednotlivci nesoucí mutace v genu FGF-10 mohou být detekováni na úrovni DNA různými metodami. Nukleové kyseliny pro diagnózu mohou být získány z buněk pacienta, například

11z krve, moči, slin, materiálu tkáňové biopsie a autopsie. Genomová DNA může být použita přímo pro detekci nebo může být před analýzou enzymaticky amplifikována pomocí PCR (Saiki a d., Nátuře, 324:163-166 (1986)). Pro stejný účel může být rovněž použita RNA nebo cDNA. Jako příklad mohou být primery PCR komplementární k nukleové kyselině, kódující FGF-10, použity k identifikaci a analýze mutací FGF-10. Delece a inserce mohou být například detekovány na základě změny velikosti amplifikovaného produktu oproti normálnímu genotypu. Bodové mutace mohou být identifikovány hybridizací amplifikované DNA s RNA rádioznačeného FGF-10 nebo alternativně s antimediátorovými sekvencemi DNA radioznačeného FGF-10. Dokonale souhlasící sekvence mohou být od chybných duplexů odlišeny digescí s RNasou A nebo na základě rozdílu teplot tání.

Genetické testování na základě rozdílů sekvencí DNA může být prováděno detekcí nebo změnou elektroforetické mobility fragmentů DNA v gelech s denaturačními činidly nebo bez nich. Malé delece a inserce v sekvencích mohou být visualizovány pomocí gelové elektroforézy vysokého rozlišení. Fragmenty DNA s různými sekvencemi mohou být rozlišeny na gelech s gradientem denaturujícího formamidu, na nichž je mobilita různých fragmentů DNA v gelu zpomalena v různých polohách podle jejich konkrétní teploty tání nebo částečného tání (viz například Myers a d., Science, 230:1242 (1985)).

Změny sekvence v konkrétních místech je možno rovněž odhalit pomocí testů nukleasové ochrany, například ochrany RNasy a Sl, nebo metodou chemického štěpení (například Cotton ad., PNAS, USA, 85:4397-4401 (1985)).

Detekci konkrétní sekvence DNA je tedy možno provádět metodami, jako je hybridizace, ochrana RNasy, chemické štěpení, přímé sekvenování DNA nebo použití restrikčních enzymů (například metoda polymorfismů délek restrikčních fragmentů, FRLP) a Southernuv blotting genomové DNA.

Kromě běžnějších metod gelové elektroforézy a sekvenování DNA je možno mutace také detekovat analýzou in sítu.

Vynález se rovněž týká diagnostického testu pro detekci pozměněných hladin proteinu FGF-10 v různých tkáních, poněvadž hyperexprese proteinů v porovnání s normálními kontrolními tkáňovými vzorky může detekovat přítomnost onemocnění nebo náchylnosti k onemocnění, například k nádoru. Testy, používané k detekci hladiny proteinu FGF-10 ve vzorku získaném od hostitele jsou odborníkům známy a zahrnují radioimunoanalýzu, testy kompetitivní vazby, analýzou westernovým přenosem, testy ELISA a „sendvičové testy. Test ELISA (Coligan a d., Current Protocols in Immunology, 1(2), kapitola 6, (1991)) zahrnuje nejprve přípravu protilátky specifické vůči antigenu FGF-10, přednostně monoklonální protilátky. Dále se připraví reporterová protilátka k monoklonální protilátce. K reportérové protilátce se naváže detekovatelné činidlo, například radioaktivní, fluorescenční nebo v tomto příkladu enzym křenová peroxidasa. Z hostitele se odebere vzorek a inkubuje se na pevném nosiči, například na polystyrénové misce, která váže proteiny ve vzorku. Veškerá volná vazebná místa proteinů na misce se pak pokryjí inkubací s nespecifickým proteinem, jako je bovinní sérový albumin. Pak se v misce inkubuje monoklonální protilátka, během kteréžto doby se monoklonální protilátky navážou na všechny proteiny FGF-10, navázané na polystyrénovou misku. Zbylá nenavázaná monoklonální protilátka se odstraní promytím pufrem. Do misky se nyní vloží reporterová protilátka, navázaná na křenovou peroxidasu, což vede k navázání reportérové protilátky na veškerou monoklonální protilátku navázanou na FGF-10. Nenavázaná reporterová protilátka se odstraní promytím. Pak se k misce přidají peroxidasové substráty a množství zbarvení, vyvinuté za danou dobu, je při porovnání se standardní křivkou mírou množství proteinu FGF10, přítomného v daném obejmu pacientova vzorku.

ΖΛ

Je možno použít kompetitivní test, při němž se protilátky specifické k FGF-10 navážou na pevný nosič a přes pevný nosič se vede značený FGF-10 a vzorek získaný od hostitele a detekované množství značky, například kapalnou scintilační chromatografií, muže být korelováno s množstvím FGF-10 ve vzorku.

Testu ELISA je podobný „sendvičový test. V sendvičovém testu se FGF-10 vede přes pevný nosič a váže se na protilátku navázanou na pevný nosič. Na FGF-10 se pak naváže druhá protilátka. Pak se přes pevný nosič vede třetí protilátka, která je značená a je specifická k druhé protilátce a která se váže na druhou protilátku, a pak je možno kvantifikovat množství.

Sekvence podle vynálezu jsou cenné rovněž pro identifikaci chromosomů. Sekvence je specificky cílena na konkrétní polohu na jednotlivém lidském chromosomů a může s ní hybridizovat. Navíc existuje v současnosti potřeba identifikace konkrétních míst na chromosomů. Pro označení polohy na chromosomů je v současnosti k dispozici málo činidel založených na skutečných sekvenčních datech (polymorfismy repetic). Mapování DNA do chromosomů podle vynálezu je důležitým prvním stupněm v korelaci těchto sekvencí s geny spojenými s určitým onemocněním.

Stručně řečeno mohou být sekvence mapovány do chromosomů tak, že se z cDNA připraví primery PCR (přednostně 15 až 25 bp) . Použije se komputerová analýza 3'-nepřeložené oblasti k rychlému výběru primerů, které nepřesahují více než jeden exon v genomové DNA, a tak komplikují proces amplifikace. Tyto primery se pak použijí pro PCR screening hybridů somatických buněk obsahujících jednotlivé lidské chromosomy. Pouze hybridy, obsahující lidský gen odpovídající primeru, poskytnou amplifikovaný fragment.

PCR mapování hybridů somatických buněk je rychlý postup pro přiřazení konkrétní DNA ke konkrétnímu chromosomů.

S použitím vynálezu pro stejné oligonukleotidové primery je možno analogickým způsobem provést sublokalizaci s panely fragmentů ze specifických chromosomů nebo soubory velkých genomických klonů. Další strategie, které je možno použít podobně k mapování do chromosomů, zahrnují hybridizaci in šitu, prescreening se značenými průtokově tříděnými chromosomy a hybridizační preselekci pro konstrukci knihoven chromosomově specifických cDNA.

K získání přesné polohy na chromosomů v jednom stupni je možno použít fluorescenční hybridizace in šitu (FISH) klonu cDNA s metafázovým rozšířením chromosomů. Tuto metodu lze použít již při délce cDNA pouze 500 nebo 600 bází; klony větší než 2000 bp však mají vyšší pravděpodobnost vazby k jediné chromosomální poloze s dostatečnou intenzitou signálu pro jednoduchou detekci. FISH vyžaduje použití klonů, od nichž byl odvozen úsek expresní sekvence (fragment genu podle vynálezu), a čím delších, tím lépe. K získání dobrých výsledků v rozumné době například stačí 2000 bp, 4000 bp je lepších a více než 4000 bp pravděpodobně není nutných. Popis této metody je možno najít v Verma a d., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).

Jakmile se sekvence přiřadí přesné poloze na chromosomů, je možno fyzickou polohu sekvence na chromosomů korelovat s údaji genetické mapy. (Takové údaje jsou uvedeny například v V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (dostupné in line prostřednictvím John Hopkins University Welch Medical Library)). Vztah mezi geny a onemocněními, které byly mapovány do téže chromosomální oblasti, se pak identifikuje vazebnou analýzou (spoludědění fyzicky sousedících genů).

Dále je nutno stanovit rozdíly cDNA nebo genomické sekvence mezi postiženými a nepostiženými jedinci. Je-li u některých nebo všech postižených jedinců pozorována mutace, která však není pozorována u žádného normálního jedince, pak je mutace pravděpodobně původcem onemocnění.

7/ W - 1(0),

Při současném rozlišení metod fyzikálního a genetického mapování může být cDNA, přesně lokalizovaná do oblasti chromosomu, spojené s onemocněním, jedním z 50 až 500 potenciálních vyvolávajících genů. (Z toho vyplývá mapovací rozlišení 1 megabáze a jeden gen na 20 kb.)

Polypeptidy, jejich fragmenty nebo jiné deriváty nebo jejich analogy nebo buňky je exprimující mohou být použity jako imunogen k vyvolání tvorby protilátek. Tyto protilátky mohou být například polyklonální nebo monoklonální. Vynález zahrnuje také chimérické, jednořetězcové a humanizované protilátky, stejně jako fragmenty Fab nebo produkt expresní knihovny Fab. Pro získání těchto protilátek a fragmentů je možno použít různé známé postupy.

Protilátky vytvořené proti polypeptidům, odpovídajícím sekvenci podle vynálezu, mohou být získány přímou injekční aplikací polypeptidů živočichovi nebo podáním polypeptidů živočichovi, přednostně jinému než člověku. Takto získaná protilátka pak sama váže tyto polypeptidy. Tímto způsobem je možno použít i sekvence, kódující pouze fragment polypeptidů, k vytvoření protilátek, vázajících celé nativní polypeptidy. Tyto protilátky pak mohou být použity k izolaci polypeptidů z tkáně, která jej exprimuje.

Pro přípravu monoklonálních protilátek je možno použít jakoukoli metodu, která poskytuje protilátky produkované kontinuálními kulturami buněčných linií. Příklady technik pro získání monoklonálních protilátek zahrnují metodu hybridomů (Kohler a Milstein, 1975, Nátuře, 256:495-497), metodu triomů, metodu hybridomů lidských B-buněk (Kozbor a d., 1983, Immunology Today 4:72) a metodu EBV-hybridomů pro získání lidských monoklonálních protilátek (Cole a d., 1985, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., str. 77-96).

Metody popsané pro produkci jednořetězcových protilátek (patent US 4,946.778) mohou být upraveny pro získání njednořetězcových protilátek k imunogenním polypeptidickým produktům podle vynálezu. K expresi humanizovaných protilátek k imunogenním polypeptidickým produktům podle vynálezu mohou být rovněž použity transgenní myši.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález je blíže popsán v souvislosti s připojenými výkresy, které představují konkrétní provedení vynálezu, avšak neomezují jeho rozsah.

Obr. 1 zobrazuje sekvenci cDNA a odpovídající odvozenou sekvenci aminokyselin FGF-10. Znázorněná sekvence aminokyselin reprezentuje maturovanou formu proteinu. Jsou použity standardní jednopísměnové zkratky aminokyselin. Sekvenční nepřesnosti jsou společným problémem při stanovování polynukleotidových sekvencí. Sekvenování bylo provedeno pomocí automatického sekvenátoru DNA 373 (Applied Biosystems, lne.). Sekvenční přesnost se předpokládá vyšší než 97 %.

Obr. 2 znázorňuje homologii sekvencí aminokyselin mezi FGF-10 a ostatními členy skupiny FGF. Konzervativní aminokyseliny jsou vyznačeny tučně.

Obr. 3 znázorňuje gel SDS-PAGE po transkripci/translaci proteinu FGF-10.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je osvětlen na příkladech provedeni, které jej však nijak neomezují. Všechny díly a množství, není-li uvedeno jinak, jsou myšleny hmotnostně.

Pro usnadnění pochopení příkladů se uvádějí některé často se vyskytující metody a/nebo výrazy.

2% „Plasmidy se označuji malým písmenem p, před nímž a/nebo za nímž jsou uvedena velká písmena a/nebo číslice. Zde použité výchozí plasmidy jsou buď komerčně dostupné, veřejně neomezeně přístupné nebo mohou být konstruovány z dostupných plasmidu publikovanými postupy. Kromě toho jsou v oboru známy a odborníkům jsou zřejmé ekvivalentní plasmidy.

„Digesce DNA označuje katalytické štěpení DNA restrikčním enzymem, který působí pouze v některých sekvencích v DNA. Různé zde použité restrikční enzymy jsou komerčně dostupné a byly použity reakční podmínky, kofaktory a další požadavky, které jsou běžnému odborníkovi známé. Pro analytické účely se typicky použije 1 pg plasmidu nebo fragmentu DNA s asi 2 jednotkami enzymu v asi 20 μΐ tlumivého roztoku. Za účelem izolace fragmentů DNA pro konstrukci plasmidu se typicky digeruje 5 až 50 μg DNA s 20 až 250 jednotkami enzymu ve větším objemu. Vhodné pufry a množství substrátu pro konkrétní restrikční enzymy uvádí výrobce. Obyčejně se používá doba inkubace asi 1 h při 37 °C, ale podle pokynů dodavatele se může měnit. Po digesci se reakční směs přímo podrobí elektroforéze na polyakrylamidovém gelu za účelem izolace požadovaného fragmentu.

Dělení odštěpených fragmentů podle velikosti se provádí s použitím 8 % polyakrylamidového gelu, popsaného v Goeddel,

D., a d., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980).

Výraz „oligonukleotidy se vztahuje buď na jednořetězcový polydeoxynukleotid nebo na dva komplementární polydeoxynukleotidové řetězce, které mohou být syntetizovány chemicky. Tyto syntetické oligonukleotidy nemají 5'-fosfát, a tudíž se nevážou k jinému oligonukleotidu bez přídavku fosfátu s ATP v přítomnosti kinasy. Syntetický oligonukleotid se váže k fragmentu, který nebyl defosforylován.

„Ligace označuje proces vytváření fosfodiesterových vazeb mezi dvěma dvouvláknovými fragmenty nukleové kyseliny (Maniatis, T., a d., tamtéž, str. 146) . Není-li uvedeno iq jinak, je možno ligaci uskutečnit s použitím známých pufru známých podmínek s 10 jednotkami ligasy T4 DNA („ligasa) na 0,5 μg přibližně ekvimolárních množství spojovaných fragmentů DNA.

Není-li uvedeno jinak, byla transformace prováděna způsobem popsaným v Graham, F., a Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973) .

Příklad 1

Tkáňová distribuce mRNA FGF-10 v dospělých lidských tkáních

Pro analýzu exprese mRNA FGF-10 byla provedena northernová analýza s 2 μg póly A' mRNA z různých dospělých lidských tkání s použitím radioaktivně značené celé cDNA FGF10 jako sondy. Výsledky ukazují, že 1,4 kb informace je exprimována nejhojněji v kosterním svalu, na střední úrovni v srdci, mozku, placentě, ledvině a pankreatu a na nižší úrovni v játrech. V srdci jsou přítomny 3 další fragmenty o velikosti 4,4 kb, 2,4 kb a 0,5 kb. Je pravděpodobné, že tyto různé, velikosti mRNA v srdci jsou výsledkem alternativního sestřihu. V mozku je také přítomna 4,4 kb mRNA. Nylonový blot s 2 μg póly A⁺ mRNA z několika dospělých lidských tkání, navázaný na membránu, byl získán od Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA. Tento blot byl hybridizován s celou cDNA FGF-10, značenou náhodně iniciovaným značením radioaktivním dCTP. Hybridizace byla prováděna přes noc při 65 °C v 7 % SDS, 0,5 M NaPO₄, pH 7,2 a 1 % BSA. Po 2x 30 min promytí v 0,2 x SSC, 0,1 % SDS při 65 °C byl blot přes noc vystaven rentgenovému filmu s intensifikační clonou.

Příklad 2

Exprese FGF-10 transkripcí a translací in vitro cDNA FGF-10, ATCC # 75696, byla podrobena transkripci a translaci in vitro za účelem stanovení velikosti přepsatelného polypeptidu kódovaného úplnou a částečnou cDNA FGF-10. Úplné a částečné inserty cDNA FGF-10 ve vektoru pBluescript SK byly amplifikovány pomocí PCR se třemi dvojicemi primerů: 1) zpětný a přímý primer M13, 2) zpětný primer M13 a FGF primer P20, 3) zpětný primer M13 a FGF primer P22. Sekvence těchto primerů jsou následující:

Zpětný primer M13-2:

5'-ATGCTTCCGGCTCGTATG-3' (SEQ ID NO 3)

Tato sekvence je umístěna před 5'-koncem insertu cDNA FGF-10 ve vektoru pBluescript a má orientaci proti směru cDNA. Mezi tímto primerem a cDNA FGF-10 je umístěna sekvence promotoru T3.

Přímý primer M13-2:

5'-GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (SEQ ID NO 4)

Tato sekvence je umístěna za 3'-koncem insertu cDNA FGF10 ve vektoru pBluescript a má orientaci proti směru insertu CDNA.

FGF primer P20:

5'-GTGAGATCTGAGGGAAGAAGGGGA-3' (SEQ ID NO 5)

Sekvence 15 bp tohoto primerů na 3'-konci je proti směru sekvence cDNA FGF-10 bp 780 až 766, která je umístěna 12 bp za stop kodonem.

FGF primer P22:

5'-CCACCGATAATCCTCCTT-3' (SEQ ID NO 6)

Tato sekvence je umístěna v cDNA FGF-10 v protisměrné orientaci a je asi 213 bp za stop kodonem.

Reakce PCR se všemi třemi dvojicemi primerú produkují amplifikované produkty se sekvencí promotoru T3 před insertem cDNA. Všechny tři dvojice primerú produkují produkty PCR, které kódují plnou délku polypeptidu FGF-10.

Pro transkripci/translaci in vitro bylo použito přibližně 1 μς produktu PCR z první dvojice primerú, 0,3 μς z druhé dvojice primerú a 0,3 μς ze třetí dvojice primerú. Transkripční/translační reakce in vitro byla prováděna v objemu 25 μΐ s použitím systému spojeného rétikulocytového lyzátu T_NT™ (Promega, č. kat. L4950). Konkrétně reakční směs obsahuje 12,5 μΐ lyzátu králičích retikulocytů T_NT, 2 μΐ reakčního pufru T_NT, 1 μΐ polymerasy T3, 1 μΐ 1 mM směsi aminokyselin (minus methionin), 4 μΐ ³⁵S-methioninu (> 1000 Ci/mmol, 10 mCi/ml), 1 μΐ 40 U/μΙ inhibitoru ribonukleasy RNasin a 0,5 nebo 1 pg produktů PCR. Objem byl doplněn H₂0 bez obsahu nukleasy na 25 μΐ. Reakční směs byla inkubována 2 h při 30 °C. 5 μΐ reakčního produktu bylo analyzováno na gradientu 4-20 % gelu SDS-PAGE. Po fixaci v 25% isopropanolu a 10% kyselině octové byl gel vysušen a vystaven přes noc při 70 °C rentgenovému filmu.

Jak je znázorněno na obr. 3, produkty PCR obsahující plnou délku cDNA FGF-10 a cDNA s chybějícími přibližně 340 bp a přibližně 140 bp ve 3'-nepřepsané oblasti (3'-UTR) produkovaly tutéž délku přepsaných produktů, jejichž molekulová hmotnost se odhaduje na asi 19 kD (pruhy 2 až 4).

Na základě výše uvedených údajů je možno vynález různě modifikovat a obměňovat, a proto je možno jej v rozsahu připojených nároků uskutečňovat jinak než bylo konkrétně popsáno.

Claims (20)

1. Izolovaný polynukleotid, vybraný ze skupiny tvořené

a) polynukleotidem kódujícím polypeptid s odvozenou sekvencí aminokyselin SEQ ID NO 2 nebo fragment, analog nebo derivát tohoto polypeptidu,

b) polynukleotidem kódujícím polypeptid se sekvencí aminokyselin kódovanou cDNA, uloženou v ATCC pod č. 75696, nebo fragment, analog nebo derivát tohoto polypeptidu.

2. Polynukleotid podle nároku 1, kterým je DNA.

3. Polynukleotid podle nároku 1, kterým je RNA.

4. Polynukleotid podle nároku 1, kterým je genomová DNA.

5. Polynukleotid podle nároku 2, který kóduje polypeptid s odvozenou sekvencí aminokyselin SEQ ID NO 2.

6. Polynukleotid podle nároku 2, který kóduje polypeptid

kódovaný cDNA, uloženou v ATCC pod č. 75696. 7. Polynukleotid podle nároku 1, mající kódující sekvenci uvedenou jako SEQ ID : NO 1. 8. Polynukleotid podle nároku 2, mající kóduj ící sekvenci polypeptidu, uloženou v ATCC pod č. 75696.

9. Vektor, obsahující DNA podle nároku 2.

10. Hostitelská buňka, geneticky manipulovaná vektorem podle nároku 9.

11. Způsob výroby polypeptidu, vyznačuj ící se tím, že z hostitelské buňky podle nároku 10 exprimuje polypeptid kódovaný uvedenou DNA.

12. Způsob výroby buněk schopných exprimovat polypeptid, vyznačující se tím, že se buňky geneticky manipulují vektorem podle nároku 9.

13. Izolovaná DNA, hybridizovatelná s DNA podle nároku 2 a kódující polypeptid mající aktivitu FGF-10.

14. Polypeptid, zvolený ze skupiny tvořené (i) polypeptidem s odvozenou sekvencí aminokyselin SEQ TD NO 2 a jeho fragmenty, analogy nebo deriváty a (ii) polypeptidem kódovaným cDNA, uloženou v ATCC pod č. 75696, a fragmenty, analogy nebo deriváty tohoto polypeptidu.

15. Polypeptid podle nároku 14, kterým je FGF-10 s odvozenou sekvencí aminokyselin SEQ ID NO 2.

16. Protilátka proti polypeptidu podle nároku 14.

17. Sloučenina, účinná jako agonista k polypeptidu podle nároku 14.

18. Sloučenina, účinná polypeptidu podle nároku 14.

— ~- — — · - *U 2' < TJ r- X) > Ct £ O n ^c 0 ako < šfnt a

QO/

O o

czx

P^oti

19. Použití polypeptidu podle nároku 14 k výrobě léčiva pro léčbu nebo prevenci onemocnění nebo fyzických poruch zmírňovaných působením FGF-10.

20. Použití sloučeniny podle nároku 18 k výrobě léčiva pro léčbu nebo prevenci onemocnění nebo fyzických poruch vznikajících působením FGF-10.

21. Způsob identifikace sloučenin účinných jako agonisté a antagonisté FGF-10, vyznačující se tím, sz ze (a) se za podmínek, kdy jsou buňky normálně stimulovány FGF-10, uvede do styku FGF-10, sloučenina podrobovaná screeningu a reakčni směs obsahující buňky, přičemž uvedená reakčni směs obsahuje značku, zabudovávanou do buněk při jejich proliferaci, a (b) stanoví se rozsah proliferace buněk za účelem identifikace, zda je sloučenina účinným agonistou nebo antagonistou.

22. Způsob diagnostiky onemocnění nebo náchylnosti k onemocnění souvisejícího se sníženou expresí polypeptidu podle nároku 14, vyznačující se tím, že se stanoví mutace v sekvenci nukleové kyseliny kódující tento polypeptid, přičemž se tento způsob provádí in vitro.