HUT77578A - A 10-es számú fibroblaszt növekedési faktor (FGF-10) - Google Patents
A 10-es számú fibroblaszt növekedési faktor (FGF-10) Download PDFInfo
- Publication number
- HUT77578A HUT77578A HU9602434A HU9602434A HUT77578A HU T77578 A HUT77578 A HU T77578A HU 9602434 A HU9602434 A HU 9602434A HU 9602434 A HU9602434 A HU 9602434A HU T77578 A HUT77578 A HU T77578A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- polypeptide
- fgf
- polynucleotide
- dna
- cells
- Prior art date
Links
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 title claims abstract description 88
- 102000004864 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 138
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 137
- 102100028412 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 20
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 60
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 60
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 60
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 47
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 10
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 claims 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims 1
- 101000917237 Homo sapiens Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 abstract description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 5
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 5
- 102000057243 human FGF10 Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000003644 lens cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 abstract 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 abstract 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 abstract 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 9
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 8
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 8
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 8
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 8
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 3
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 3
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 208000012124 AIDS-related disease Diseases 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 101100238293 Arabidopsis thaliana MOR1 gene Proteins 0.000 description 1
- HPSVTWMFWCHKFN-GARJFASQSA-N Arg-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O HPSVTWMFWCHKFN-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N Asp-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- BPAUXFVCSYQDQX-JRQIVUDYSA-N Asp-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O BPAUXFVCSYQDQX-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101001051969 Bos taurus Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000209202 Bromus secalinus Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- CYHMMWIOEUVHHZ-IHRRRGAJSA-N Cys-Met-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CYHMMWIOEUVHHZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 1
- 108050002085 Fibroblast growth factor 20 Proteins 0.000 description 1
- 102100031361 Fibroblast growth factor 20 Human genes 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000367 Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100037665 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- RDDSZZJOKDVPAE-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RDDSZZJOKDVPAE-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ISXJHXGYMJKXOI-GUBZILKMSA-N Glu-Cys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ISXJHXGYMJKXOI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N Glu-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XMPAXPSENRSOSV-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- GWCRIHNSVMOBEQ-BQBZGAKWSA-N Gly-Arg-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GWCRIHNSVMOBEQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DWUKOTKSTDWGAE-BQBZGAKWSA-N Gly-Asn-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DWUKOTKSTDWGAE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IUZGUFAJDBHQQV-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IUZGUFAJDBHQQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- OCRQUYDOYKCOQG-IRXDYDNUSA-N Gly-Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OCRQUYDOYKCOQG-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102100031000 Hepatoma-derived growth factor Human genes 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101001083798 Homo sapiens Hepatoma-derived growth factor Proteins 0.000 description 1
- NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N Ile-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O NKRJALPCDNXULF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- LPFBXFILACZHIB-LAEOZQHASA-N Ile-Gly-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N LPFBXFILACZHIB-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- ZUPJCJINYQISSN-XUXIUFHCSA-N Ile-Met-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N ZUPJCJINYQISSN-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- ZGKVPOSSTGHJAF-HJPIBITLSA-N Ile-Tyr-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N ZGKVPOSSTGHJAF-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- KXODZBLFVFSLAI-AVGNSLFASA-N Leu-His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 KXODZBLFVFSLAI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N Leu-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 1
- LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N Leu-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O LVTJJOJKDCVZGP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- BIZNDKMFQHDOIE-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIZNDKMFQHDOIE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PAMDBWYMLWOELY-SDDRHHMPSA-N Lys-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O PAMDBWYMLWOELY-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N Lys-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PLDJDCJLRCYPJB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ACYHZNZHIZWLQF-BQBZGAKWSA-N Met-Asn-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O ACYHZNZHIZWLQF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HLQWFLJOJRFXHO-CIUDSAMLSA-N Met-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HLQWFLJOJRFXHO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ULLIQRYQNMAAHC-RWMBFGLXSA-N Met-His-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N ULLIQRYQNMAAHC-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N Phe-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WLYPRKLMRIYGPP-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- SHUFSZDAIPLZLF-BEAPCOKYSA-N Phe-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O SHUFSZDAIPLZLF-BEAPCOKYSA-N 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N Pro-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N Ser-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NADLKBTYNKUJEP-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 206010042496 Sunburn Diseases 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- VFEHSAJCWWHDBH-RHYQMDGZSA-N Thr-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VFEHSAJCWWHDBH-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZSPQUTWLWGWTPS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- PCMDGXKXVMBIFP-VEVYYDQMSA-N Thr-Met-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PCMDGXKXVMBIFP-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- PWPJLBWYRTVYQS-PMVMPFDFSA-N Trp-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWPJLBWYRTVYQS-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002556 adrenal cortex cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011243 crosslinked material Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150056310 gem1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010249 in-situ analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 108010057952 lysyl-phenylalanyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001020 neural plate Anatomy 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 150000003906 phosphoinositides Chemical class 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 108010000998 wheylin-2 peptide Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
A 10-es számú fibroblaszt-növekedési faktor
A találmány tárgyát újonnan azonosított polinukleotidok, az ilyen polinukleotidok által kódolt polipeptidek, az ilyen polinukleotidok és polipeptidek alkalmazása, valamint azok előállítási eljárása képezi.
Közelebbről, a találmány tárgyát a 10-es számú fibroblaszt-növekedési faktor / 10-es számú heparinkötő növekedési faktor (a továbbiakban FGF-10) elnevezésű polipeptidek és az ilyen polipeptidek hatásának gátlását célzó eljárások képezik, továbbá a találmány szerinti polipeptideket kódoló polinukleotidok, a találmány szerinti polipeptidek elleni antitestek, a találmány szerinti polipeptidek agonistái és antagonistái, a találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó vektorok, az ilyen vektorokkal manipulált gazdasejtek, valamint eljárás a találmány szerinti polipeptidek előállítására, eljárás FGF-10 működését, illetve gátlását igénylő páciensek kezelésére, eljárás az FGF-10 agonistáinak és antagonistáinak azonosítására, eljárás a találmány szerinti polipeptidekkel összefüggő betegség diagnosztizálására és diagnosztikai eljárás a találmány szerinti polipeptid jelenlétének kimutatására.
Aktaszámunk: 84373-7177/PÁ
A találmány szerinti polipeptidek előnyösen alkalmazhatók új erek képződésének serkentésére irányuló kezelésekre, sérülések, égések, fekélyek, sebek, idegsejtkárosodások kezelésére és megakadályozására, a bőr öregedésének megakadályozására, valamint hajhullás megelőzésére.
A fibroblaszt növekedési faktorok a proteinek olyan családját képezik, amelyek képesek a heparin megkötésére (emiatt ezeket a proteineket heparinkötő növekedési faktoroknak (HBGF) is nevezik. E proteincsalád különböző tagjainak expressziója különféle szövetekben megfigyelhető, és időbeli és térbeli szabályozás alatt állnak. Ezek a proteinek számos mezodermális, ektodermális és endodermális eredetű sejt (köztük a fibroblasztok, a szaruhártya és az érfal endotélsejtjei, a granulociták, a mellékvesekéregsejtek, a chondrociták, a mioblasztok, az érfali símaizomsejtek, a szemlencse epithelsejtjei, a melanociták, keratinociták, oligodendrociták, asztrociták, oszteoblasztok és vérképző sejtek) hatásos mitogénjei.
A fibroblaszt növekedési faktor család minden tagjának működése átfedő a család többi tagjának működésével, de mindegyiknek megvan egyedi funkciója is. Az érfali endotélsejtek proliierációjának serkentésén kívül mind az FGF-1, mind az FGF-2 kemotaxist gyakorol az endotélsejtekre, és az FGF-2-ről kimutatták, hogy meggátolja az endotélsejtek alapmembránon történő áthatolását. E tulajdonságoknak megfelelően az FGF-1 és FGF-2 egyaránt képes az angiogenezis serkentésére. E növekedési faktorok egy másik lényeges jellemzője, hogy képesek a sebgyógyulás elő• · • · · · · segítésére. Az FGF-család számos más tagja hasonló tulajdonságokkal rendelkezik, mint az FGF-1 és FGF-2 (pl. az angiogenezis és a sebgyógyulás serkentése). Az FGFgéncsalád több tagjáról kimutatták, hogy indukálják a mezodermaképződést, és modulálják az idegsejtek, adipociták és vázizomsejtek differenciálódását.
A normális szövetekben kifejtett biológiai működéseken kívül az FGF-proteinek karcinomákban és szarkomákban a tumor vaszkularizációjának elősegítésével, továbbá, (szabályozás nélküli expressziójuk esetében) transzformáló proteinekként - a tumorképződés serkentésében is szerepet j átszanak.
Az FGF-család jelenlegi ismereteink szerint nyolc szerkezetileg rokon - polipeptidből áll. Mind a nyolc polipeptid génjét klónozták és szekvenálták. Az FGF-l-et és FGF-2-t számos néven jellemezték, de leggyakrabban a savas, illetve bázisos fibroblaszt növekedési faktor elnevezés használatos. A normális géntermékek befolyásolják az mezoderma- és neuroektoderma-eredetű sejtek többségének általános ploriferációs képességét. Ezek a polipeptidek képesek az angiogenezis (érképződés) in vivő indukálására, és lényeges szerepet játszhatnak a korai fejlődésben [ Burgess, W.H. és Maciag, T.: Annu. Rév. Biochem. 58, 575 (1989)] .
Az FGF-1 egy szekretált alakját kódoló eukarióta expressziós vektort génbevitellel sertésartériákba juttattak be. Ez a modell definiálja az artéria falában megfigyelhető in vivő génfunkciót. A sertésartériákban az FGF-1expresszió - 21 nappal a génbevitel után - vékonyította az ··· · ·· · ····· ér belhártyáját [Nabel, E.G. és mtsai.: Natúré 3 62, 844 (1993)] . Kimutatták továbbá, hogy a bázikus fibroblaszt növekedési faktor - tumor angiogenezisben betöltött szerepétől függetlenül - irányíthatja a gliomanövekedést és progressziót, és hogy az ilyen működésekhez a bázikus fibroblaszt növekedési faktor felszabadulására vagy szekréciójára lehet szükség [Morrison, R.S. és mtsai.: J.
Neurosci. Rés. 34, 502 (1993)] .
A fibroblaszt növekedési faktorok - mint pl . a bázikus FGF - szerepet játszanak a Kaposi-szarkómasejtek in vitro növekedésében is [ Huang, Y.Q. és mtsai.: J. Clin.
Invest. 91, 1191 (1993)] . Az emberi bázikus fibroblaszt növekedési faktort kódoló cDNS-szekvenciát - a T7-bakteriofág RNS-polimeráza által felismert - transzkripciós promótertől
3' -irányban klónozták. Az így kapott bázikus fibroblaszt növekedési faktorokról kimutatták, hogy a mitogénaktivitás, a plazminogén-aktivátor-szintézis és az angiogenezis vizsgálataiban az emberi méhlepény eredetű fibroblaszt növekedési faktortól megkülönböztethetetlen biológiai aktivitást mutatnak [Squires, C.H. és mtsai.: J. Bioi. Chem. 263,
16297 (1988)] .
Az 5,155,214 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban lényegében tiszta emlős bázikus fibroblaszt növekedési faktorokat, valamint előállítási eljárásukat írják le. Feltárják a szarvasmarha és az emberi bázikus fibroblaszt növekedési faktor aminosav-szekvenciáját, valamint a szarvasmarha polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát.
A találmány szerinti polipeptidet - az FGF-család más tagjaival mutatott aminosavszekvencia-homológia alapján - az FGF-család tagjaként azonosítottuk.
A találmány tárgyát érett polipeptidek képezik. Ezek a polipeptidek az FGF-10, valamint annak biológiailag aktív és diagnosztikai vagy terápiás szempontból hasznos fragmensei, analógjai és származékai. A találmány szerinti polipeptidek emberi eredetűek.
A találmány tárgyát képezik továbbá az emberi FGF10-et kódoló, izolált nukleinsav-molekulák, amelyek közé mRNS-ek, DNS-ek, genomi eredetű DNS, valamint ezek antiszensz analógjai és biológiailag aktív, illetve diagnosztikai vagy terápiás szempontból hasznos fragmensei tartoznak .
Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás a találmány szerinti polipeptidek rekombináns technikákkal történő előállítására, melynek során rekombináns vektorokat, például - az FGF-10 rekombináns módszerekkel történő előállítására előnyösen alkalmazható klónozó és expressziós plazmidokat, továbbá - emberi FGF-10-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó - rekombináns prokarióta és/vagy eukarióta gazdasejteket alkalmazunk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti polipeptid vagy az azt kódoló polinukleotid terápiás célokra (pl. sebek, égések és fekélyek gyógyulásának elősegítésére, idegszöveti rendellenességeknek köszönhető idegrendszeri károsodás megelőzésére, valamint a bőr öregedésének és a hajhullás megakadályozására) történő alkalmazására.
Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti polipeptidek elleni antitestek.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti polipeptidek antagonistái, amelyek az ilyen polipeptidek működésének gátlására (pl. daganatok és túlzott érképződéssel kapcsolatos betegségek kezelésére) alkalmazhatók .
A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan nukleinsav-próbák, amelyek elegendő hosszúságú nukleinsavmolekulákat tartalmaznak ahhoz, hogy specifikusan hibridizálódjanak az emberi FGF-10 szekvenciájával.
Szintén a találmány tárgyát képezik diagnosztikai vizsgálatok az FGF-10-nukleinsav-szekvenciák mutációival vagy az ilyen szekvenciák által kódolt polipeptidek túlzott expressziójával kapcsolatos betegségek (vagy az ilyen betegségekre való hajlam) kimutatására.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti polipeptidek vagy - az ilyen polipeptideket kódoló - polinukleotidok tudományos kutatási célokkal, DNS-szintézissel és DNS-vektorok előállításával kapcsolatos in vitro alkalmazására.
A találmány szerinti megoldás fent említett és további részletei a leírásban adott kitanítás alapján szakember számára világossá válnak.
• · · · • · · · • · · • · · · · · • ·
Ί
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük; az ábrákat a találmány specifikus megvalósítási módjainak szemléltetése, és semmi esetre sem az igényelt oltalmi kör bárminemű korlátozása céljából mutatjuk be.
Az 1. ábrán az FGF-10 cDNS-szekvenciája, valamint a cDNS-nek megfelelő, leszármaztatott aminosav-szekvenciája látható. A bemutatott aminosav-szekvencia a protein érett alakját reprezentálja. Az ábrán az aminosavak hagyományos egy betűs rövidítését alkalmazzuk. A polinukleotidszekvenciák meghatározásának megkísérlése során a szekvenálási pontatlanságok általános problémát jelentenek. A szekvenálást 373 Automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc.) alkalmazásával végeztük. A szekvenálás pontosságát 97 %-nál nagyobbnak ítéljük meg.
A 2. ábrán Az FGF-10 és az FGF-család egyéb tagjai közötti aminosavszekvencia-homológiát mutatjuk be. Az konzervált aminosavakat félkövér betűtípussal szedtük.
A 3. ábrán az in vitro transzkripció és transzláció után kapott FGF-10-protein SDS-PAGE-analízisének eredményét mutatjuk be.
A találmány tárgyát olyan izolált nukleinsavmolekulák (polinukleotidok) képezik, amelyek az 1. ábrán bemutatott leszármaztatott aminosav-szekvenciát (2. azonosítószámú szekvencia) tartalmazó érett polipeptidet, vagy az ATCC 75696 deponálási számon 1994. március 4-én letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt érett polipeptidet kódolják.
A találmány szerinti polinukleotidot először egy nyolc hetes, korai stádiumú emberi szövetből származó cDNSkönyvtárban fedeztük fel, majd később a teljes hosszúságú cDNS-t emberi Amygdala-ból származó könyvtárban találtuk meg. Ez a polinukleotid szerkezeti rokonságot mutat a fibroblaszt növekedési faktor géncsalád valamennyi tagjával, és 181 aminosavas polipeptidet kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmaz. Az FGF-10 FGF-család többi tagjával mutatott főbb egyezések a következők: 1) az agyból izolált FGF-9 szekvenciájával - 129 aminosavas régióban - 37 %-os azonosság és 67 %-os hasonlóság; 2) az FGF-7 (keratinocita növekedési faktor) szekvenciájával - 121 aminosavas régióban - 36 %-os azonosság és 64 %-os hasonlóság; 3) az FGF-1 (savas FGF) szekvenciájával - 110 aminosavas régióban - 33 %-os azonosság és 55 %-os hasonlóság. Ezenfelül, a találmány szerinti polipeptidben az FGF/HBGF-család jellemző szekvenciája [ GXLX (S, T, A, G) X6 (D, E) CXFXE] konzervált [ X jelentése bármilyen aminosav; (D,E) jelentése D vagy E aminosav; X6 jelentése hat bármilyen aminosav] .
A találmány szerinti polinukleotid lehet RNS vagy DNS (cDNS, genomi eredetű DNS vagy szintetikus DNS). A DNS lehet kétszálú vagy egyszálú. Az érett polipeptidet kódoló szekvencia azonos lehet az 1. ábrán bemutatott kódolószekvenciával (1. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett klón kódolószekvenciájával, illetve - a genetikai kód degeneráltsága miatt - ugyanolyan érett polipeptidet kódolhat, mint az 1. ábrán bemutatott DNS (1. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS.
• · · • · ·
Az 1. ábrán bemutatott, érett polipeptidet (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS által kódolt érett polipeptidet kódoló polinukleotid a következőket tartalmazhatja: csal az érett polipeptid kódolószekvenciáját; az érett polipeptid kódolószekvenciáját és egy további kódolószekvenciát, például egy vezető- vagy szekréciós szekvenciát vagy egy pro-proteinszekvenciát; az érett polipeptid kódolószekvenciáját (és adott esetben egy másik kódolószekvenciát), valamint nem kódoló szekvenciát, például intronokat vagy az érett polipeptid kódolószekvenciájától 5' - és/vagy 3' -irányban lévő nem kódoló szekvenciát.
Ennek megfelelően, az egy polipeptidet kódoló polinukleotid kifejezés egyaránt vonatkozik az olyan polinukleotidra, amely csak a polipeptid kódolószekvenciáját tartalmazza, valamint olyan polinukleotidra, amely további kódoló és/vagy nem kódoló szekvenciákat is tartalmaz.
Szintén a találmány tárgyát képezik a fentebb említett polinukleotidok olyan változatai, amelyek az 1. ábrán bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát (2.
azonosítószámú szekvencia) tartalmazó polipeptid fragmenseit, analógjait vagy származékait, vagy a letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt polipeptidet kódolják. A polinukleotid-változatok a polinukleotid természetben előforduló allélváltozatai, illetve a polinukleotid nem természetes változatai egyaránt lehetnek.
- 10 Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezik azok a polinukleotidok, amelyek az 1. ábrán bemutatott érett polipeptiddel (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt érett polipeptiddel azonos polipeptidet kódolnak; továbbá az ilyen polinukleotidok változatai, amelyek az 1. ábrán bemutatott polipeptid (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt polipeptid fragmensét, származékát vagy analógját kódolják. Az ilyen polinukleotid-változatok közé deléciós, szubsztitúciós, addíciós és inszerciós változatok tartoznak.
Ahogy azt fentebb említettük, a találmány szerinti polinukleotid tartalmazhat olyan kódolószekvenciát, amely az 1. ábrán bemutatott kódolószekvencia (1. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett klón kódolószekvenciájának természetben előforduló allélváltozata. Ahogy az ismeretes, az allélváltozat a polinukleotidszekvencia egy olyan alakja, amely egy vagy több nukleotidot érintő szubsztitúciót, deléciót vagy addíciót tartalmaz, melyek a kódolt polipeptid működését alapvetően nem változtatják meg.
Szintén a találmány tárgyát képezik az olyan polinukleotidok, amelyekben az érett polipeptid kódolószekvenciája - azonos leolvasási keretben - egy olyan polinukleotid-szekvenciához kapcsolódik, amely elősegíti a polipeptid expresszióját és gazdasejtből történő szekrécióját; az ilyen polinukleotid-szekvencia például kódolhat egy vezetőszekvenciát, amely szekréciós szekvenciaként egy
- 11 polipeptid sejtből történő transzportjának irányítására szolgál. A vezetőszekvenciát tartalmazó polipeptid egy preprotein, amelyről a vezetőszekvenciát a gazdasejt - a polipeptid érett alakját létrehozva - lehasíthatja. A találmány szerinti polinukleotidok kódolhatnak pro-proteint is, amely az érett proteinből és 5' -irányban további aminosavakból áll. A pro-szekvenciát tartalmazó érett proteint pro-proteinnek nevezzük, amely a protein inaktív alakja. A pro-szekvencia lehasítása után az érett, aktív proteint kapjuk.
Ennek megfelelően, a találmány szerinti polinukleotid kódolhat érett proteint, pro-szekvenciát tartalmazó proteint vagy pro- és pre-szekvenciát (vezetőszekvenciát) egyaránt tartalmazó proteint.
A találmány szerinti polinukleotidok a kódolószekvenciát - azonos leolvasási keretben - egy markerszekvenciához kapcsolva is tartalmazhatják, ami lehetővé teszi a találmány szerinti polipeptid tisztítását. A markerszekvencia lehet egy pQE-9-vektorból származó hexahisztidin-toldalék, amely - baktérium gazdasejt alkalmazása esetén - lehetővé teszi a markerszekvenciához kapcsolt érett polipeptid tisztítását. Markerszekvenciaként emlős gazdasejt (pl. COS-7-sejtek) esetében - hemagglutinin (HA) toldalék is alkalmazható. A HA-toldalék az influenzahemagglutinin-proteinből származó epitópnak felel meg [ Wilson, I. és mtsai.: Cell 37, 767 (1984)] .
A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan polinukleotidok, amelyek a hibridizálódnak a fentebb leírt • * V
- 12 szekvenciákkal, amennyiben a szekvenciák között legalább 50 %-os, előnyösen 70 %-os azonosság van. Szintén a találmány tárgyát képezik azok a polinukleotidok, amelyek szigorú feltételek mellett hibridizálódnak a fentebb leírt polinukleotidokkal. Ahogy itt használjuk, a szigorú feltételek kifejezés azt jelenti, hogy a hibridizáció csak abban az esetben következik be, ha a szóban forgó szekvenciák között legalább 95 %-os, előnyösen legalább 97 %-os azonosság van. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint azok a polinukleotidok, amelyek a fentebb leírt polinukleotidokkal hibridizálódnak, olyan proteineket kódolnak, amelyek lényegében azonos biológiai működésűek vagy aktivitásúak, mint az 1. ábrán bemutatott cDNS (1.
azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS által kódolt érett polipeptid.
A leírásban említett letétbe helyezett klónokat a Budapest Szerződésben foglaltaknak megfelelően tartják fenn. A kiónokat csupán a könnyű hozzáférhetőség céljából helyeztük letétbe, és ez nem jelenti annak elismerését, hogy a letétbe helyezés a 35. U.S.C. 112. paragrafusa alapján elengedhetetlen lenne. A letétbe helyezett anyagokban lévő polinukleotidok szekvenciáját, valamint a polinukleotidok által kódolt polipeptidek aminosavszekvenciáját a kitanítás részének kell tekinteni, és a leírásban a szekvenciák ismertetésével kapcsolatos bármilyen ellentmondás esetén a letétbe helyezett anyagokban lévő szekvenciákat kell figyelembe venni. A letétbe helyezett anyagok előállításához, alkalmazásához vagy értékesítéséhez • · ·
- 13 engedélyre van szükség, amit ezennel semmi esetre sem adunk meg.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy FGF-10polipeptid, amely az 1. ábrán bemutatott leszármaztatott aminosav-szekvenciát (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS- által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazza. A találmány tárgyát képezik az ilyen polipeptid fragmensei, analógjai és származékai is.
A fragmens, származék és analóg kifejezések amennyiben az 1. ábrán bemutatott polipeptidre (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS által kódolt polipeptidre vonatkoznak - olyan polipeptidet jelentenek, amely lényegében azonos biológiai működésű vagy aktivitású, mint az említett polipeptidek. Ennek megfelelően egy analóg lehet egy pro-protein, amely a pro-szekvencia lehasításával aktiválható, miáltal aktív, érett polipeptid j ön létre.
A találmány szerinti polipeptid rekombináns, természetes vagy szintetikus polipeptid, előnyösen rekombináns polipeptid lehet.
Az 1. ábrán bemutatott polipeptid (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS által kódolt polipeptid fragmense, származéka vagy analógja lehet (a) olyan szekvencia, amelyben egy vagy több aminosav konzervált vagy nem konzervált aminosavval - előnyösen konzervált aminosavval - van helyettesítve (és az ilyen helyettesített aminosav a genetikai kód által vagy nem a genetikai kód által kódolt aminosav lehet); (b) olyan szekvencia, • ·
- 14 amelyben egy vagy több aminosav szubsztituens csoportot
tartalmaz; | (c) | olyan | szekvencia, | amelyben az érett |
polipeptid | egy | másik | vegyülethez | kapcsolódik, például |
olyanhoz, | amely | növeli | a polipeptid | felezési idejét (pl- |
polietilén· | -glikolhoz); | vagy (d) olyan | szekvencia, amelyben |
az érett polipeptidhez további aminosavak vannak kapcsolva, mint pl. vezetőszekvencia vagy szekréciós szekvencia, vagy az érett polipeptid vagy a pro-protein tisztítására alkalmazható szekvencia. Az ilyen fragmensek, származékok és analógok - a kitanítás alapján - szakember számára megvalósíthatók .
A találmány szerinti polipeptidek és polinukleotidok előnyösen izolált alakban vannak, és előnyösen homogén állapot eléréséig vannak tisztítva.
Az izolált kifejezés azt jelenti, hogy az anyag el van távolítva eredeti környezetéből (például., természetben előforduló anyag esetében a természetes környezetéből). Például, az élő állatban lévő, természetesen előforduló polinukleotid vagy polipeptid nincs izolálva, de ugyanezt a polinukleotidot, DNS-t, vagy polipeptidet, amely a természetes rendszerben vele együtt előforduló anyagok némelyikétől vagy mindegyikétől el van különítve, izoláltnak tekintjük. Az ilyen polinukleotid képezheti egy vektor részét, és/vagy az ilyen polinukleotid vagy polipeptid képezheti egy készítmény részét, és ebben az esetben is izoláltnak tekinthető (amennyiben az ilyen vektor vagy készítmény nem képezi természetes környezetének részét).
• ·
Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti polinukleotidokat tartalmazó vektorok; az ilyen vektorokkal génsebészetileg manipulált gazdasejtek; valamint a találmány szerinti polipeptidek rekombináns technikák alkalmazásával történő előállítási eljárása.
A találmány szerinti vektorokkal (például, klónozóvektorral vagy expressziós vektorral) a gazdasejtek génsebészeti módszerekkel manipulálhatók (transzdukálhatók, transzformálhatok vagy transzfektálhatók). Vektorként plazmidot, vírusrészecskét, fágot és hasonlókat alkalmazhatunk. A manipulált gazdasejtek hagyományos - a promóterek aktiválása, a transzformánsok szelektálása vagy az FGF-10gének amplifikálása céljából megfelelően módosított - tápközegben tenyészthetők. A tenyésztéshez ugyanolyan feltételeket (hőmérséklet, pH, stb.) alkalmazunk, mint az expresszáltatásra kiválasztott gazdasejt esetében. Az ilyen tenyésztési feltételek szakember számára kézenfekvők.
A találmány szerinti polinukleotidot egy polipeptid
- rekombináns módszerekkel történő - előállítására alkalmazhatjuk. Ilyenformán, a polinukleotid-szekvenciát, például, a különböző expressziós hordozók valamelyikébe (elsősorban polipeptid expresszáltatására alkalmas vektorokba vagy plazmidokba) foglalhatjuk. Az ilyen vektorok közé kromoszómális, nem kromoszómális és szintetikus DNSszekvenciák tartoznak; ilyenek például az SV40 származékai, a bakteriális plazmidok, a fág-DNS, az élesztőplazmidok, a plazmidok és fág-DNS kombinálásából származó vektorok, valamint a virális DNS-ek (vaccinia, adenovírus, ···· ····
- 16 baromfihimlő-vírus és pseudorabies) , azonban bármilyen más vektor vagy plazmid is alkalmazható, amennyiben a gazdasejtben replikádé-, illetve életképesek.
A megfelelő DNS-szekvenciát számos eljárással inszertálhatjuk a vektorba. A DNS-szekvenciát általában ismert eljárások alkalmazásával - megfelelő restrikciós endonukleázos helyre inszertáljuk. Az ilyen és egyéb eljárások szakember számára kézenfekvők.
Az expressziós vektorban lévő DNS-szekvenciát működőképesen - az mRNS-szintézis irányítása érdekében - megfelelő expressziós irányítószekvenciá(k)hoz (promóter) kapcsoljuk. Az ilyen promóterek jellemző példáiként a következők említhetők: LTR- vagy SV4 0-promóter; az E. coli lacvagy trp-promótere; a λ-fág PL-promótere; valamint egyéb promóterek, melyekről ismert, hogy prokarióta vagy eukarióta sejtekben, illetve vírusaikban gének expresszióját irányítják. Az expressziós vektor - a transzláció beindítására szolgáló - riboszómakötő-helyet, valamint transzkripciós terminátort is tartalmaz. A vektor az expresszió fokozására alkalmas szekvenciákat is tartalmazhat .
Ezen túlmenően, az expressziós vektorok előnyösen tartalmaznak egy olyan gént is, amely a transzformált gazdasejtek szelektálása céljából fenotípusos jellemvonást biztosít. Ilyen génként - eukarióta sejttenyészet esetében - dihidrofolát-reduktáz- vagy neomicinrezisztencia-gén, E. coli esetében pedig tetraciklin- vagy ampicillinrezisztencia-gén alkalmazható.
- 17 A fentebb leírt, megfelelő DNS-szekvenciát, valamint megfelelő promótert vagy irányítószekvenciát tartalmazó vektor alkalmas gazdasejt transzformálására alkalmazható, melynek eredményeként a gazda a kívánt proteint expresszálja. Az alkalmas gazdák jellemző példái közé tartoznak a baktériumsejtek (pl. E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces); gombasejtek, pl. élesztősejtek; rovarsejtek, pl. Drosophila S2- és Spodoptera Sf9-sejtek; állati sejtek, pl. CHO-, COS- vagy Bowes melanomasejtek; adenovírusok; növényi sejtek, stb. Az alkalmas gazda kiválasztása - a találmány leírása alapján - szakember számára nem okoz gondot.
Szintén a találmány tárgyát képezik az olyan rekombináns konstrukciók, amelyek a fentebb leírt szekvenciák közül egyet vagy többet tartalmaznak. A találmány szerinti konstrukciók egy vektort (pl. plazmidot vagy virális vektort) tartalmaznak, amelybe - szabályos vagy fordított orientációban - egy találmány szerinti szekvencia van inszertálva. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a konstrukció regulatorszekvenciákat is tartalmaz, például - a szekvenciához működőképesen kapcsolódó promótert. Számos alkalmas vektor és promóter ismeretes, melyek kereskedelmi forgalomban beszerezhetők. Példaként a következő vektorokat említjük: bakteriális vektorok: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) ; pBS, phagescript-vektor, psiX174,
pBluescript-SK, pBsKS, | pNHÖa, pNHl6a, pNHlöa, | pNH46a |
(Stratagene); pTRO99A, | pKK223-3, pKK233-3, pDR540, | pRIT5 |
(Pharmacia); eukarióta | vektorok: pWLneo, pSV2cat, | pOG44, |
- 18 pXTl, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); azonban bármilyen más vektor vagy plazmid is alkalmazható, amennyiben a gazdasejtben replikáció-, illetve életképesek.
Promóterrégiók - CAT- (kloramfenikol-transzferáz) vektorok vagy más, szelektálható markert tartalmazó vektorok alkalmazásával - bármely kívánt génből kiválaszthatók. Két alkalmas vektor a pKK232-8 és a pCM7. Az alkalmas bakteriális promóterek közé tartozik a lacl-, lacZ-, T3-, T7-, gpt-, lambda-PR-, lambda-PL- és trp-promóter. Az eukarióta promóterek közé tartozik a CMV közvetlen korai promótere, a HSV-timidin-kináz promótere, a korai és kései SV40promóter, a retrovirusból származó hosszú terminális ismétlődések (LTR-ek) és az egér metallothionenin-I. A megfelelő vektor és promóter kiválasztása szakember feladata.
Szintén a találmány tárgyát képezik a fentebb leírt konstrukciókat tartalmazó gazdasejtek. A gazdasejt lehet magasabb rendű eukarióta sejt, például emlőssejt; lehet alacsonyabb rendű eukarióta sejt, mint pl. élesztősejt; illetve lehet prokarióta sejt is, például baktériumsejt. A gazdasejtbe a konstrukciót kalcium-foszfátos transzfekcióval, DEAE-dextrán közvetítésével végzett transzfekcióval vagy elektroporációval vihetjük be [ Davis, L., Dibner, M., Battey, I.: Basic Methods in Molecular Biology (1986)] .
A gazdasejtekben a konstrukciókat - hagyományos módon - a rekombináns szekvencia által kódolt géntermék előállítására alkalmazhatjuk. Más módon, a találmány szerinti polipeptidek - hagyományos peptidszintetizáló berendezések • · alkalmazásával - szintetikus úton is előállíthatok.
Az érett proteinek emlős-, élesztő-, baktériumvagy egyéb sejtekben megfelelő promóterek irányítása alatt expresszáltathatók. Az ilyen proteinek előállítására sejtmentes transzlációs rendszerek is alkalmazhatók; ilyen esetben a találmány szerinti DNS-konstrukciókból származó
RNS-eket alkalmazzuk. A prokarióta és eukarióta gazdasejtekben alkalmazható klónozó és expressziós vektorok leírását ld. Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. kiadás, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni.
A találmány szerinti polipeptideket kódoló DNS magasabb rendű eukariótákban lejátszódó transzkripcióját úgy fokozhatjuk, ha a vektorba erősítőszekvenciát (enhancer ) inszertálunk. Az erősítőszekvenciák a DNS cis-működésű rendszerint 10-300 bázispár hosszúságú - elemei, amelyek úgy hatnak a promóterre, hogy fokozzák annak transzkripcióját. Az erősítőszekvenciák példái közé tartozik a replikációs kezdőhely kései oldalán lévő SV40erősítőszekvencia (100-270 bp) , a citomegalovírus korai promóterének erősítőszekvenciája, a replikációs kezdőhely kései oldalán lévő polioma-erősítőszekvencia, valamint az adenovírus erősítőszekvenciái.
A rekombináns expressziós vektorok általában olyan replikációs kezdőhelyet és szelektálható markereket tartalmaznak, amelyek elősegítik a gazdasejt transzformálását (ilyen pl. az E. coli ampicillinrezisztencia-génje, és a S.
- 20 cerevisiae TRPl-génje), továbbá tartalmaznak egy magas szinten expresszált génből származó promótert, amely egy 3' -irányban lévő strukturális szekvencia transzkripcióját irányítja. Az ilyen promóterek - többek között glikolízises enzimeket [pl. 3-foszfo-glicerát-kinázt (PGK)] , α-faktort, savas foszfatázt vagy hősokk-proteineket kódoló operonokból származhatnak. A heterológ eredetű strukturális szekvenciát - megfelelő leolvasási keretben transzlációs, iniciációs és terminációs szekvenciákkal kapcsoljuk össze. A heterológ szekvencia - adott esetben - fúziós proteint is kódolhat (pl. egy N-terminális azonosító pepiidet, amely kívánt tulajdonságokat biztosít, pl. az expresszáltatott rekombináns termék stabilizálását vagy egyszerűbb tisztítását.
A bakteriális gazdasejtekben előnyösen alkalmazható expressziós vektorokat úgy állítjuk elő, hogy a kívánt proteint kódoló strukturális DNS-szekvenciát - egy funkcionális promóterrel működőképes leolvasási keretben - alkalmas transzlációs, iniciációs és terminációs szignálszekvenciákkal kapcsoljuk össze. A vektor egy vagy több - fenotípusos jellemzők alapján szelektálható - markert és replikációs kezdőhelyet tartalmaz, amely biztosítja a vektor fennmaradását és - kívánt esetben - a gazdán belüli amplifikációt. A transzformálásra alkalmas prokarióta gazdasejtek közé tartozik az E. coli, Bacillus subtilis , Salmonella typhimurium, valamint a Pseudomonas, Streptomyces és Staphylococcus nemzetség különböző fajai, de egyéb gazdasejtek is alkalmazhatók.
- 21 Jellemző - de nem korlátozó - példaként megemlítjük, hogy a bakteriális gazdasejtekben előnyösen alkalmazható expressziós vektorok tartalmazhatnak olyan szelektálható markert és bakteriális replikációs kezdőhelyet, amelyek kereskedelmi forgalomban beszerezhető - a jól ismert pBR322-klónozóvektor (ATCC 37017) genetikai elemeit tartalmazó - plazmidokból származnak. Az ilyen szokványos vektorok közé tartozik, például, a pKK223-3 (Pharmacia Fine
Chemicals, Uppsala, Svédország) és a GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) . Az ilyen pBR322 gerinc-szakaszokat megfelelő promóterrel, és az expresszáltatni kívánt strukturális szekvenciával kapcsoljuk össze.
Az alkalmas gazdatörzs transzformálása és megfelelő sejtsűrűség eléréséig történő szaporítása után a kiválasztott promótert alkalmas módon indukáljuk (pl. hőmérsékletváltoztatással vagy kémiai indukcióval), és a sejteket tovább tenyésztjük.
A sejteket rendszerint centrifugálással gyűjtjük be, majd fizikai vagy kémiai eljárással feltárjuk, és a kapott nyers kivonatot további tisztításnak vetjük alá.
A proteinek expresszáltatására alkalmazott mikrobiális sejteket bármilyen alkalmas eljárással (pl. fagyasztás és felolvasztás váltakoztatásával, ultrahangkezeléssel, mechanikai feltárással vagy sejtemésztő reagensek alkalmazásával) feltárhatjuk.
Rekombináns protein expresszáltatására különböző emlős sejttenyészeti rendszerek is felhasználhatók. Az emlős expressziós rendszerek példái közé tartoznak a majomve-22 -
se-fibroblasztok COS-7 sejtvonalai [ Gluzman: Cell 23, 175 (1981)] , valamint a kompatibilis vektorokat expresszálni képes egyéb sejtvonalak (C127, 3T3, CHO, HeLa és BHK). Az emlős gazdasejtekben alkalmazható expressziós vektorok replikációs kezdőhelyet, megfelelő promótert és erősítőszekvenciát, továbbá riboszómakötő-helyet, poliadenilációs helyet, splice-donort, akceptor-helyeket, transzkripciós terminációs szekvenciákat, és 5' -szegélyező, nem átíródó szekvenciákat. A nem átíródó genetikai elemek biztosítása céljából SV40-genomból származó DNS-szekvenciák (pl. SV40kezdőhely, korai promóter, erősítőszekvencia, splicedonor és poliadenilációs helyek) alkalmazhatók.
Az FGF-10 rekombináns sejttenyészetekből történő kinyerését és tisztítását ismert eljárásokkal végezzük, például ammónium-szulfátos vagy etanolos kicsapással, savas extrakcióval, anion- vagy kationcserélő kromatográfiával, foszfocellulóz-kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatási kromatográfiával, affinitáskromatográfiával, hidroxiapatit-kromatográfiával és lektin-kromatográfiával. Az érett protein konfigurációjának kialakítása céljából, szükség esetén, protein-refolding lépések alkalmazhatók. A végleges tisztításra nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) alkalmazható.
A találmány szerinti polipeptidek lehetnek természetes módon tisztított termékek, kémiai szintézissel előállított termékek, valamint - rekombináns eljárások alkalmazásával - prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben (pl. tenyésztett baktérium- és élesztősejtekben, magasabb rendű • ·
- 23 • · · · · növényi sejtek, rovar- és emlőssejtekben) előállított termékek. A rekombináns eljárással végzett előállítás során alkalmazott gazdasejttől függően a találmány szerinti polipeptidek emlős vagy más eukarióta szénhidrátokkal lehetnek glikozilálva, illetve lehetnek glikozilálatlanok is.
A találmány szerinti polipeptidek a kezdő metionint is magukban foglalják.
A találmány szerinti polipeptidek - érfali endotélsejtek növekedését serkentő képességüknek köszönhetően - előnyösen alkalmazhatók különböző betegségek, például trombózis, arterioszklerózis és más szív- és érrendszeri rendellenességek következtében helyi vértelenségben szenvedő (isémiás) szövetekben új erek képződésének serkentésére irányuló kezelésben.
Az FGF-10 sérülések, égések, műtét utáni szövethelyreállítás és fekélyek következtében kialakult sebek kezelésére is alkalmazható, mivel a különböző sejttípusok (pl. fibroblasztsejtek és vázizomsejtek) mitogén ágenseként képes működni.
Az FGF-10 alkalmas a bizonyos idegi rendellenességek vagy idegdegenerációs állapotok (mint pl. az Alzheimerkór, Parkinson-kór, AIDS-szel kapcsolatos betegségkomplexum) következtében kialakuló idegsejt-károsodások kezelésére és megakadályozására is.
Az FGF-10 - keratinociták szaporodását serkentő hatásának köszönhetően - felhasználható a bőr (napon történő lesülés okozta) öregedésének megakadályozására is.
• · · · · · ··· · ·· · ·· ...
Az FGF-10 alkalmazható hajhullás megelőzésére is, mivel aktiválja a hajképző sejteket, és elősegíti a melanociták szaporodását. Az FGF-10 - más citokinekkel együtt alkalmazva - serkenti a vérképző sejtek és a csontvelősejtek szaporodását és differenciálódását.
Az FGF-10 felhasználható továbbá a szervek transzplantáció előtti fenntartására és az elsődleges szövetek sejttenyészetének fenntartására.
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti polipeptidek (vagy az azokat kódoló polinukleotidok) - tudományos kutatással, DNS-szintézissel vagy DNS-vektorok előállításával kapcsolatos - in vitro célokra, valamint emberi betegségek kezelésében diagnosztikai és terápiás célokra történő alkalmazási eljárása is.
A teljes hosszúságú FGF-10-gén fragmensei - teljes hosszúságú FGF-10-gén izolálása és egyéb, az FGF-10-génhez nagyon hasonló (illetve hasonló biológiai aktivitású) gének izolálása érdekében - cDNS-könyvtár hibridizációs próbájaként alkalmazhatók. Az ilyen típusú próbák rendszerint legalább 20 bázist, azonban legalább 30, és általában nem több, mint 50 bázist tartalmaznak, de tartalmazhatnak ennél több bázist is. A próbák egy teljes hosszúságú transzkriptumnak megfelelő cDNS-klón, valamint a teljes
FGF-10-gént (regulátor- és promóterrégiókkal, exonokkal és intronokkal együtt) tartalmazó genomi klón vagy kiónok azonosítására is alkalmazhatók. A szkrínelés egyik példája szerint az FGF-10-gén kódolórégióját úgy izoláljuk, hogy oligonukleotid-próba szintetizálására az ismert DNS• ·
- 25 szekvenciát alkalmazzuk. A találmány szerinti gén szekvenciájával komplementer szekvenciát tartalmazó, jelölt oligonukleotidokat emberi cDNS-, genomi eredetű DNS- vagy mRNS-könyvtár szkrínelésére alkalmazzuk, hogy meghatározzuk, vajon a próba a könyvtár mely tagjaihoz hibridizálódik.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás az FGF-1O-polipeptid receptorainak azonosítására. A receptort kódoló gén számos - szakember számára ismert - eljárással azonosítható, például ligandum-panning eljárással vagy FACS-osztályozással [Coligan és mtsai.: Current Protocols in Immun. 1(2), 5. fejezet (1991)] . Erre a célra előnyösen expressziós klónozást alkalmazunk, melynek során a polipeptidekre érzékeny sejtekből poliadenilált RNS-t állítunk elő, és az ebből az RNS-ből készített cDNS-könyvtárat több - elvileg egymástól nem különböző - részre (poolokra) osztjuk, és ezeket COS-sejtek vagy más - a polipeptidekre nem érzékeny - sejtek transzfektálására alkalmazzuk. A tárgylemezeken szaporított transzfektált sejteket a jelölt polipeptidekkel érintkeztetjük. A polipeptidek különböző eljárásokkal - például jódozással vagy egy helyspecifikus protein-kináz felismerési helyének beiktatásával - jelölhetők. A tárgylemezeket - fixálás és inkubálás után - autoradiográfiás analízisnek vetjük alá, melynek során azonosítjuk a alállományokat készítünk, pozitív állományokat, ezeket - ismétlődő, es alállományokra történő bontás és újraszkrínelés alkalmazásával - újratranszfektáljuk, miáltal egyetlen olyan kiónt kapunk, amely a feltételezett receptort kódolja.
A receptor azonosításának egy másik lehetősége szerint a jelölt polipeptideket fényaffinitás-kötéssel sejtmembránhoz vagy olyan kivonatkészítményekhez kapcsoljuk, amelyek expresszálják a receptormolekulát. PAGE-analízissel felbontjuk a keresztkötött anyagot, és röntgenfilmre exponáljuk. A polipeptidek receptorait tartalmazó jelölt komplexet kivágjuk, peptidfragmensekre bontjuk, és proteinmikroszekvenálásnak vetjük alá. A mikroszekvenálással kapott aminosav-szekvenciát - a feltételezett receptorokat kódoló gének azonosítása érdekében cDNS-könyvtár szkrínelésére alkalmas - degenerált oligonukleotid-próbák sorozatának megtervezésére alkalmazhatjuk.
Szintén a találmány tárgyát képezi a vegyületek olyan vizsgálati eljárása, amellyel azonosítható, hogy mely vegyületek módosítják az FGF-10 működését. Az ilyen vizsgálat során, például, egy emlős fibroblasztsejtét, az FGF-10et, a vizsgálandó vegyületet es [ H] -timidint olyan sejttenyésztési feltételek mellett elegyítünk, amely lehetővé teszi a fibroblasztsejtek normális proliierációját. A vizsgálni kívánt vegyület nélkül kontrollvizsgálatot végzünk, és a vegyület jelenlétében megfigyelt fibroblasztproliferáció mértékét összehasonlítjuk a kontroll eredményeivel, hogy - meghatározzuk, vajon a vizsgált vegyület serkenti-e a keratinociták proliierációját (a proliferáció mértékét minden esetben a 3[ H] -timidin felvétele alapján határozzuk meg).
- 27 Az antagonisták szkrínelése érdekében azonos vizsgálatot végezhetünk, melyben mérjük a vizsgálandó vegyület fibroblaszt-prolíferációt gátló hatását, és meghatározzuk az antagonista-képességet. A fibroblaszt-proliferáció mértékét folyadékszcintillációs kromatográfia alkalmazásával, a [ H] -timidin felvételének mérésével határozzuk meg.
Egy másik eljárás szerint egy - FGF-10-receptort expresszáló - emlőssejtet vagy membránkészítményt a tesztelni kívánt vegyület jelenlétében jelölt FGF-10-zel inkubálunk. A tesztelt vegyület jelölt FGF-10 és FGF-10receptor közötti kölcsönhatást gátló hatását mérjük. Más módon, az FGF-10 és receptora közötti kölcsönhatás után egy ismert második hírvivőrendszer reakcióját mérjük, és összehasonlítjuk a tesztelt vegyület jelenlétében, illetve hiányában kapott eredményeket. Második hírvivőrendszerként, többek között, cAMP-guanilát-ciklázt, ioncsatornákat vagy foszfo-inozidit-hidrolízist alkalmazhatunk.
A potenciális FGF-1O-antagonisták példái az antitestek, vagy néhány esetben a polipeptidhez kötődő oligonukleotidok. Más lehetőség szerint, potenciális FGF1O-antagonista lehet az FGF-10 mutáns alakja, amely FGF-10receptorokhoz kötődik, azonban második hírvivőreakciót nem vált ki, ezáltal az FGF-10 működése hatásos blokkolás alá kerül.
Egy további potenciális FGF-10-antagonista az antiszensz technológia alkalmazásával előállított antiszensz konstrukció. Az antiszensz technológia - tripla hélix vagy antiszensz DNS vagy RNS kialakításával - a • · ·
- 28 génexpresszió szabályozására alkalmazható; mindkét eljárás egy polinukleotid DNS-hez vagy RNS-hez történő kapcsolásán alapul. Például, a találmány szerinti érett polipeptideket kódoló polinukleotid-szekvencia 5' -végi kódoló szakaszát kb. 10-40 bp-os antiszensz RNS-oligonukleotid megtervezésére alkalmazzuk. DNS-oligonukleotidot úgy tervezünk, hogy az a 'gén transzkripcióban szerepet játszó régiójával komplementer legyen [ tripla hélix; ld. Lee és mtsai.: Nucl. Acids Rés. 6_, 3073 (1979); Cooney és mtsai.: Science 241, 456 (1988) ; és Dervan és mtsai. : Science 251, 1360 (1991)] , megakadályozva ezáltal az FGF-10 transzkripcióját és termelődését. Az antiszensz RNS-oligonukleotid in vivő az mRNShez hibridizálódik, és meggátolja az mRNS-molekula FGF-10polipeptiddé történő transzlációját [Okano: J. Neurochem.
56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression CRC Press, Boca Raton, FL (1988)] . Az fenti oligonukleotidok úgy is bejuttathatok a sejtekbe, hogy az antiszensz RNS vagy DNS in vivő expresszálódjon, gátolva ezáltal az FGF-10 termelődését.
A potenciális FGF-10-antagonisták közé kisméretű molekulák tartoznak, amelyek az FGF-10-receptor kötőhelyéhez kötődnek és elfoglalják azt, ezáltal a receptort hozzáférhetetlenné teszik az FGF-10 számára, megakadályozva ezáltal normális biológiai aktivitását. Az ilyen kisméretű molekulák, többek között, kis peptidek vagy peptidszerű molekulák lehetnek.
Az FGF-10-antagonisták a sejtnövekedés gátlására és az FGF-10 - daganatos sejtekre és szövetekre gyakorolt • ·· ··«
- 29 proliferációs hatásának gátlására (következésképpen, az abnormális sejtnövekedés és -proliferáció, például a tumornövekedés visszatartására és gátlására) is alkalmazhatók .
Az FGF-10 antagonisták túlzott érképződéssel kapcsolatos betegségek megelőzésére, valamint extrakapszuláris hályogműtét után - az epitheliális szemlencse-sejtek proliferációjának megakadályozására is alkalmazhatók .
Az antagonisták gyógyászati szempontból elfogadható hordozóval együtt előállított készítményben is alkalmazhatók .
A találmány szerinti polipeptidek, agonisták és antagonisták megfelelő gyógyászati hordozóval együtt, gyógyászati készítmény részeként alkalmazhatók. Az ilyen készítmények a találmány szerinti polipeptid, agonista vagy antagonista terápiás szempontból hatásos mennyiségét, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozót és kötőanyagot tartalmaznak. Az alkalmas hordozók közé tartozik, többek között, a sóoldat, puffereit sóoldat, dextróz, víz, glicerin, etanol és ezek kombinációi. Az alkalmazott készítményt a beadási módnak megfelelően kell kiválasztani.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy gyógyászati reagenskészlet, amely - a találmány szerinti gyógyászati készítmények egy vagy több alkotórészét tartalmazó - egy vagy több edényt tartalmaz. Az ilyen edény(ek)hez mellékelhető egy - a gyógyászati vagy biológiai termékek gyártását, alkalmazását és forgalmazását szabályozó hivatalos szerve- 30 zet által előírt - tanúsítvány, amely a termék emberi beadás céljára történő gyártására, alkalmazására vagy forgalmazására vonatkozó jóváhagyást igazolja. Ezenfelül, a találmány szerinti polipeptidek, agonisták és antagonisták más terápiás vegyületekkel együtt is alkalmazhatók.
A gyógyászati készítmények hagyományos módokon, például, szájon keresztül, helyileg, intravénásán, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, szubkután, orron keresztül vagy intradermálisan adhatók be. A gyógyászati készítményeket az adott betegség vagy rendellenesség kezelésére és/vagy megelőzésére hatásos mennyiségben adjuk be. A készítményeket általában legalább naponta kb. 10 gg/testtömeg-kilogramm mennyiségben, leginkább nem több, mint naponta kb. 8 mg/testtömeg-kilogramm mennyiségben adagoljuk. Az adagolás - a beadás módjától, a tünetektől és hasonló tényezőktől függően - leggyakrabban napi kb. 10 gg/testtömeg-kilogrammtól és kb. 1 mg/testtömeg-kilogrammig terjed. A helyi alkalmazás speciális esetében a készítményeket előnyösen 0,1 ^ig/cm2 és 9 mg/cm2 közötti mennyiségben adagoljuk.
A találmány szerinti megoldás értelmében az FGF-10polipeptidek, azok agonistái és antagonistái (amelyek szintén polipeptidek) in vivő expresszáltatás útján is alkalmazhatók, amit gyakran génterápiának nevezünk.
Ennek megfelelően, a sejtek például - ismert eljárásokkal - ex vivő a polipeptidet kódoló polinukleotiddal (DNS-sel vagy RNS-sel) manipulálhatók. Egy páciens sejtjeinek in vivő manipulálása és a találmány szerinti polipeptid
- 31 in vivő expresszáltatása céljából egy találmány szerinti polipeptidet kódoló RNS-t tartalmazó retrovírus-részecskét termelő sejtet adhatunk be a páciensnek. A találmány szerinti polipeptid beadásának fenti és egyéb eljárásai a találmány leírása alapján szakember számára nyilvánvalóak. A sejtek manipulálására szolgáló expressziós hordozóként nemcsak retrovírus-részecskét, hanem - például - adenovírust is felhasználhatunk, amely megfelelő hordozó vektorral végzett egyesítés után a sejtek in vivő manipulálására alkalmazható .
A találmány tárgyát képezi az FGF-10-gén diagnosztikai vizsgálat részeként történő alkalmazása az FGF-10nukleinsav-szekvenciákban lévő mutációkkal összefüggő betegségek (vagy az ilyen betegségekre való érzékenység) kimutatására .
Az FGF-10-génben mutációkat hordozó egyéneket
DNS-szinten - különböző technikák alkalmazásával azonosíthatjuk. A diagnózishoz szükséges nukleinsavakat a beteg sejtjeiből (pl. vérből, vizeletből, nyálból, szövetbiopsziából és boncolási anyagból) nyerjük ki. A genomi eredetű DNS detektálásra közvetlenül alkalmazható vagy a vizsgálat előtt - polimeráz láncreakció alkalmazásával [ Saiki és mtsai. : Natúré 324, 163 (1986)] enzimatikusan amplifikálható. Ilyen célra RNS vagy cDNS is alkalmazható. Például, az FGF-1O-mutációk azonosítására és vizsgálatára FGF-10-et kódoló nukleinsavval komplementer PCR-láncindítók alkalmazhatók. A deléciók és inszerciók, például, az amplifikált termék méretének - normális genotí- 32 pushoz viszonyított - változása alapján mutathatók ki. A pontmutációk az amplifikált DNS radioaktívan jelölt FGF-10RNS-hez (vagy más módon, radioaktívan jelölt antiszensz
FGF-10-DNS-szekvenciákhoz) történő hibridizálásával mutathatók ki. A pontosan illeszkedő szekvenciák a hibás bázispárosodású duplexektől RN-áz-A-emésztéssel vagy az olvadáspontok különbségei alapján különböztethetők meg.
A DNS-szekvencia-különbségeken alapuló genetikai tesztelés a DNS-fragmensek - denaturáló ágenseket tartalmazó vagy azok nélküli - géleken mutatott elektroforetikus mobilitása változásának kimutatásával valósítható meg. A kis szekvenciadeléciók és -inszerciók nagy felbontású gélelektroforézissel tehetők láthatóvá. A különböző szekvenciák DNS-fragmensei denaturáló formamid-gradiens gélen különböztethetők meg egymástól, amelyben a különböző DNSfragmensek - specifikus olvadáspontjuknak vagy részleges olvadáspontjuknak megfelelően - különböző mobilitással mozognak [ ld. pl. Myers és mtsai.: Science 230, 1242 (1985)] .
A specifikus helyeken lévő szekvenciaváltozások nukleáz-védelmi vizsgálatokkal (pl. RN-áz- vagy Slvédelemmel, illetve kémiai hasítási eljárással is kimutathatók [ Cotton és mtsai.: PNAS, USA 85, 4397 )1985)] .
A fentieknek megfelelően, egy specifikus DNSszekvencia, például, hibridizációval, RN-áz-védelemmel, kémiai hasítással, közvetlen DNS-szekvenálással, restrikciós enzimek alkalmazásával (pl. restrikciós fragmenshosszúság polimorfizmus; RFLP) vagy genomi eredetű DNS Southernblot-analízisével mutatható ki.
»4·· ···« ··* · ··· • ·· ·*·
- 33 A mutációk - a hagyományos gélelektroforézisen és
DNS-szekvenáláson kívül - in situ analízissel is kimutathatók .
A találmány tárgyát képezi továbbá egy diagnosztikai vizsgálat az FGF-10-protein megváltozott szintjének különböző szövetekben történő kimutatására. A proteinek (normál kontroll szövetben tapasztalható szinthez viszonyított) túlzott expressziója betegségre - pl. daganatos betegségre - vagy betegségre való fogékonyságra utalhat. Az FGF-10-protein gazdaszervezetből származó mintában történő kimutatási eljárásai jól ismertek; ezek közé tartoznak a radioimmunvizsgálatok, a kompetitív kötődési vizsgálatok, a western-blot-analízis, az ELISA-vizsgálatok és az ún.
sandwich-vizsgálat. Az ELISA-vizsgálat során [Coligan és mtsai.: Current Protocols in Immunology 1(2), 6. fejezet (1991)] először egy FGF-10-antigénre specifikus antitestet (előnyösen monoklonális antitestet) állítunk elő, majd egy monoklonális antitest elleni - riporter-antitestet is előállítunk. A riporter-antitestet detektálható reagenssel jelöljük (pl. radioaktív izotóppal, fluoreszcens anyaggal vagy - esetünkben - tormaperoxidáz enzimmel). A páciensből mintát veszünk, amelyet - a mintában lévő proteineket megkötő - szilárd felületen (pl- polisztirol csészében) inkubálunk. Ezután a csészében lévő szabad proteinkötőhelyeket nem specifikus proteinnel, például szarvasmarha szérumalbuminnal végzett inkubálással befedjük. Ezt követően a monoklonális antitesteket annyi ideig inkubáljuk a csészében, amely elegendő ahhoz, azok a polisztirol csészé- 34 • · · · • · · · • · » · · · · · hez kapcsolódott FGF-10-proteinekhez kötődjenek. A nem kötődött monokionális antitesteket pufferrel leöblítjük. A tormaperoxidázhoz kapcsolt riporter-antitestet ekkor adjuk a csészéhez, és a riporter-antitest az FGF-10-hez kötődött monokionális antitestekhez kapcsolódik. A nem kapcsolódott riporter-antitesteket mosással eltávolítjuk, majd a csészébe peroxidáz-szubsztrátokat adunk, és a páciensből vett mintában lévő FGF-10-protein mennyiségét az adott idő alatt kifejlődött szín intenzitása alapján - standard görbéhez viszonyítva - határozzuk meg.
Az FG-10-protein kimutatására alkalmazott kompetíciós vizsgálat során FGF-10-re specifikus antitesteket szilárd hordozóhoz kapcsolunk, és jelölt FGF-10-et, valamint a páciensből származó mintát átengedjük a szilárd hordozón, és a - például folyadékszcintillációs kromatográfiával - detektált jelölőanyag mennyiségéből a mintában lévő FGF-10 mennyiségére következtetünk.
A sandwich-vizsgálat hasonló az ELISAvizsgálathoz; ennek során az FGF-10-et szilárd hordozón engedjük át, és a protein a szilárd hordozóhoz kapcsolt antitestekhez kötődik. Ezután egy második antitestet kapcsolunk az FGF-10-hez, és a szilárd hordozón egy harmadik - a második antitestre specifikus - jelölt antitestet engedünk át, amelynek második antitesthez történő kötődése alapján meghatározható az FGF-10 mennyisége.
A találmány szerinti szekvenciák kromoszómák azonosítására is alkalmasak. A szekvencia egy emberi kromoszóma adott helyét célozza meg, és azzal hibridizálódik. Ezen • · · ·· ···
- 35 túlmenően, szükség van a kromoszóma adott helyeinek azonosítására is. A kromoszómák helyeinek megjelölésére jelenleg kevés - tényleges szekvenciaadatokon alapuló - kromoszómajelölő reagens áll rendelkezésre. A DNS-ek kromoszómákon történő - találmány szerinti - térképezése lényeges kiindulási lépése a betegséggel kapcsolatos gének és az ilyen szekvenciák közötti összefüggés megállapításának.
A szekvenciák kromoszómákon történő térképezése során cDNS-ből polimeráz láncreakcióhoz alkalmazható (előnyösen 15-25 bp-os) láncindítókat készítünk. A 3' -végi transzlálatlan régió számítógépes analízisével olyan láncindítókat választunk ki, amelyek a genomi eredetű DNS egy exonjánál nem nagyobb szakaszt ívelnek át (ami bonyolultabbá tenné az amplifikációt) . Ezeket a láncindítókat egyedi kromoszómákat tartalmazó szomatikus hibrid sejtek PCRszkrínelésére alkalmazzuk. Csak azok a hibridek eredményeznek amplifikált fragmenst, amelyek az alkalmazott láncindítónak megfelelő emberi gént tartalmaznak.
A szomatikus sejthibridek PCR-térképezése gyors eljárás, amellyel egy adott DNS adott kromoszómához rendelhető. A találmány szerinti megoldással, azonos láncindító oligonukleotidok alkalmazásával - specifikus kromoszómákból vagy nagy genomi kiónok állományaiból (pool) származó fragmensekkel szublokalizációt végezhetünk. Egy adott szekvencia kromoszómájára történő térképezésének egyéb eljárásai közé tartozik az in situ hibridizáció, a jelzett, áramoltatva osztályozott (flow sorted) kromoszómákkal végzett előzetes szkrínelés és a kromoszómaspecifikus cDNS• ·
- 36 könyvtárak előállítása céljából hibridizációval végzett előzetes szelekció.
Egy cDNS-klón metafázisos kromoszómakenethez történő fluoreszcens in situ hibridizációja (FISH) a pontos kromoszómális elhelyezkedés egylépéses meghatározására alkalmazható. Ez a technika mindössze 500-600 bázisból álló cDNS-ek esetében is alkalmazható, azonban a 2000 bp-nál hosszabb kiónok esetében nagyobb a valószínűsége annak, hogy a klón - az egyszerűbb kimutatás érdekében - megfelelő szignálintenzitással egy egyedi kromoszómahelyhez kapcsolódjon. A FISH-eljáráshoz olyan kiónok alkalmazására van szükség, amelyekből az expresszált szekvenciatoldalék (a találmány szerinti gén egy fragmense) származik. A hosszabb kiónok előnyösebbek; például, a 2000 bp-os hosszúság jó, a 4000 bp-os hosszúság még jobb. 4000 bp-nál nagyobb hosszúságra valószínűleg nincs szükség ahhoz, hogy nagy arányban jó eredményeket kapjunk. E technika leírását ld. Verma és mtsai.: Humán Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Miután egy szekvenciát a kromoszóma egy pontos helyére sikerült térképezni, a kromoszómán a szekvencia fizikai elhelyezkedését a genetikai térkép adataival hozhatjuk összefüggésbe (ilyen adatok találhatók pl.: V. McKusick:
Mendelian Inheritance in Mán; hálózaton elérhető a Johns
Hopkins University Welch Medical könyvtáron keresztül). A térképezéssel azonos kromoszómarégión meghatározott gének és betegségek közötti összefüggés kapcsoltsági analízissel határozható meg (fizikailag szomszédos gének együttes örök• ·
- 37 lődése).
Szükség van az érintett, illetve egészséges egyének cDNS- vagy genomi szekvenciája közötti különbségek feltárására is. Ha valamennyi vagy néhány érintett egyén esetében olyan mutáció figyelhető meg, amely az egészséges egyének egyikében sem található, valószínű, hogy a mutáció a betegség okozója.
A fizikai és genetikai térképezési technikák jelenlegi felbontóképességével egy, a betegséggel összefüggő kromoszómarégión pontosan lokalizált cDNS 50-500 potenciális betegségokozó gén egyike lehet (ez 1 megabázisos térképezési felbontást és 20 kb-onként egy gént feltételez).
A találmány szerinti polipeptidek, fragmenseik vagy egyéb származékaik és analógjaik, valamint az ezeket expresszáló sejtek immunogénként ellenük irányuló antitestek előállítására alkalmazhatók. Az antitestek lehetnek, például, poliklonálisak vagy monoklonálisak. A találmány tárgyát képezik a kiméra, egyláncú és humanizált antitestek, a Fab-fragmensek, valamint a Fab expressziós könyvtár terméke. Az ilyen antitestek és antitest-fragmensek előállítására számos eljárás ismert.
A találmány szerinti szekvenciának megfelelő polipeptidek elleni antitestek előállíthatok oly módon, hogy a polipeptideket közvetlenül egy állatba injektáljuk vagy beadjuk egy állatnak (előnyösen nem embernek). Az így kapott antitest ezután önmagától a polipeptidekhez kötődik. Ezen a módon a polipeptidek csupán egy fragmensét kódoló szekvenciát is felhasználhatjuk az antitestek előállításá• · • · · • · · · · · ··· · ·· ······
- 38 ra, mely antitestek az egész polipeptidet megkötik. Az ilyen antitestek a polipeptid - polipeptidet expresszáló szövetből történő - izolálására alkalmazhatók.
A monoklonális antitestek előállítására bármilyen folyamatos sejtvonal-tenyészet által termelt antitesteket biztosító - eljárás alkalmazható. Az ilyen eljárások példái közé tartozik a hibridóma-technika [Kohler és Milstein:
Natúré 256, 495 (1975)] , a trióma-technika, az emberi Bsejt-hibridóma-technika [ Kozbor és mtsai.: Immunology Today ^4, 72 (1983)] , valamint az emberi monoklonális antitestek előállítására szolgáló EBV-hibridóma-technika [ Colé és mtsai.: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alán R.
Liss, Inc., 77-96. old. (1985)] .
Az egyláncú antitestek előállítási eljárásai (4,946,778 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) alkalmazhatók a találmány szerinti immunogén polipeptidek elleni egyláncú antitestek előállítására is. Az ilyen immunogén polipeptidek elleni humanizált antitestek expresszáltatására transzgénikus egerek alkalmazhatók.
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban kísérleti példákon keresztül fogjuk szemléltetni, melyekkel nem szándékozzuk a találmány oltalmi körét korlátozni. A példákban megadott százalékértékek tömeg%-ot jelentenek.
A példák jobb megértésének elősegítése érdekében megadjuk néhány gyakrabban előforduló kifejezés jelentését.
A plazmidokat kis p betűvel jelöljük, amely előtt és/vagy után nagybetűk és/vagy számok állnak. Kiindulási plazmidként kereskedelmi forgalomban beszerezhető
• ·
- 39 plazmidot, szabadon hozzáférhető plazmidot, vagy ismert eljárásokkal előállított plazmidot alkalmazhatunk. Ezenkívül, a leírt plazmidokkal egyenértékű plazmidok szakember számára ismertek.
A DNS-emésztés kifejezés a DNS olyan restrikciós enzimmel végzett katalitikus hasítását jelenti, amely csak a DNS adott szekvenciáinál hasít. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során kereskedelmi forgalomban beszerezhető restrikciós enzimeket alkalmazunk, melyek reakciófeltételei, kofaktorai és alkalmazásuk egyéb feltételei szakember számára kézenfekvők. Analitikai célokra kb.
μΐ pufferoldatban kb. 2 egység enzimmel rendszerint 1 μg plazmidot vagy DNS-fragmenst alkalmazunk. A plazmidok előállítása érdekében DNS-fragmensek izolálása céljából nagyobb térfogatban 20-250 egység enzimmel jellemzően 5-50 μg DNS-t emésztünk. Az egyes restrikciós enzimek esetében alkalmazható puffereket és szubsztrátmennyiségeket a gyártó adja meg. Az inkubálást általában kb. egy órán át 37 °C-on végezzük, de ezek az értékek a forgalmazó útmutatásai függvényében változhatnak. Az emésztés után a reakció termékeit a kívánt fragmens izolálása érdekében - közvetlenül poliakril-amid-gélen elektroforizáljuk.
A hasított fragmensek méret szerinti elválasztását %-os poliakril-amid-gél alkalmazásával, Goeddel, D. és mtsai. leírása szerint végezzük [ Nucleic Acids Rés. 8, 4057 (1980)] .
Az oligonukleotid kifejezés egyszálú polidezoxinukleotidokra vagy két komplementer
- 40 polidezoxinukleotid szálra vonatkozik, amelyek kémiai úton szintetizálhatok. Az ilyen szintetikus oligonukleotidok 5' végükön nem tartalmaznak foszfátcsoportot, így - kináz és ATP jelenlétében - foszfát hozzáadása nélkül nem ligálódnak más oligonukleotiddal. A szintetikus oligonukleotid olyan fragmenshez ligálódik, amely előzőleg nem volt defoszforilálva.
A ligálás kifejezésen két kétszálú nukleinsavfragmens között foszfodiészter-kötések kialakulásának folyamatát értjük [Maniatis, T. és mtsai. Id., 146. old.] . Ha másképpen nem jelezzük, a ligálás ismert pufferek és feltételek alkalmazásával - a hozzávetőleg ekvimoláris mennyiségű, ligálni kívánt DNS-fragmensek 0,5 pg-jára vonatkoztatva - 10 egység T4-DNS-ligázzal hajtható végre.
Ha másképpen nem jelezzük, a transzformációt Graham, F. és Van dér Eb, A. leírása szerint végeztük [Virology 52, 456 (1973)] .
1. példa
Az FGF-10-mRNS eloszlása felnőtt emberi szövetekben
Az FGF-10-mRNS expressziójának vizsgálata érdekében különböző felnőtt emberi szövetekből származó 2 pg poli-A+mRNS-sel - próbaként radioaktívan jelölt teljes FGF-10-cDNS alkalmazásával - northern-analízist végeztünk. A kapott eredmények azt mutatják, hogy egy 1,4 kb-os mRNS leggyakrabban a vázizmokban, közepes szinten a szívben, agyban, méhlepényben, vesében és hasnyálmirigyben, alacsonyabb szinten pedig a májban expresszálódik. A szívben három má- 41 sik fragmens (4,4 kb; 2,4 kb és 0,5 kb) szintén megtalálható. Valószínű, hogy ezek a szívben található különböző méretű mRNS-ek alternatív splicing eredményei. Az agyban szintén jelen van egy 4,4 kb-os mRNS-fragmens. A Clontech Laboratories, Inc.-tói (Palo Alto, CA) beszereztünk egy több felnőtt emberi szövetből származó 2 pg poli-A*-RNS-t membránhoz kötve tartalmazó - nylonmembrán-lenyomatot (nylon biot) . A lenyomatot - radioaktív dCTP-vel jelölt teljes FGF-10-cDNS-sel hibridizáltűk. A hibridizációt éjszakán át 7% SDS, 0,5 M NaPCh (pH=7,2) és % BSA elegyében, 65 °C-on egy végeztük. 0,2xSSC és 0,1 % SDS elegyében, 65 °C-on kétszer 30 percig végzett mosás után a lenyomatot erősítőernyő alkalmazásával - egy éjszakán át röntgenfilmre exponáltuk.
2. példa
Az FGF-10 expresszáltatása in vívó transzkripció és transzláció alkalmazásával
Az FGF-10 cDNS-t (ATCC 75696) in vitro transzkripciónak és transzlációnak vetettük alá, hogy meghatározzuk a teljes hosszúságú és részleges FGF-10-cDNS által kódolt polipeptid hosszúságát. Az FGF-10 - pBluescript-SKvektorban lévő - teljes hosszúságú és részleges szakaszait polimeráz-láncreakcióval, három pár láncindító alkalmazásával amplifikáltuk. A láncindító-párok a következők voltak:
1) fordított és normális M13-láncindító; 2) fordított M13láncindító és FGF-20-láncindító; és 3) fordított M13láncindító és FGF-P22-láncindító. E láncindítók szekvenciája a következő:
• · · · ·
- 42 Fordított M13-2-láncindító: 5' -ATGCTTCCGGCTCGTATG3' (3. azonosítószámú szekvencia).
Ez a szekvencia a pBluescript-vektorban az FGF-10-cDNSinszert 5' -végén, 5' -irányban található, és a cDNS-hez viszonyítva antiszensz orientációban helyezkedik el. E láncindító és az FGF-10-cDNS között a T3-promóter található.
M13-2 láncindító: 5' -GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (4. azonosítószámú szekvencia).
Ez a szekvencia a pBluescript-vektorban az FGF-10-cDNSinszert 3' -végén, 3' -irányban található, és a cDNS-hez viszonyítva antiszensz orientációban helyezkedik el.
FGF-P20-láncindító: 5' -GTGAGATCTGAGGGAAGAAGGGGA-3' (5. azonosítószámú szekvencia).
E láncindító 3' oldali 15 bp-os szekvenciája az FGF-10cDNS-szekvencia 780-766. nukleotidjaiból álló szakaszhoz viszonyítva antiszensz orientációjú, és kb. 12 bp távolságra helyezkedik el a stopkodontól.
FGF-P22-láncindító : 5' -CCACCGATAATCCTCCTT-3' (6. azonosítószámú szekvencia).
Ez a szekvencia az FGF-10-cDNS-ben antiszensz orientációban, a stopkodontól kb. 213 bp távolságra helyezkedik el.
A három láncindító-párral végzett polimerázláncreakciók olyan amplifikált termékeket eredményeztek, amelyek a cDNS-inszert előtt T3-promóterszekvenciát tartalmaztak, és amelyek a teljes hosszúságú FGF-10-polipeptidet kódolták.
Az ín vitro transzkripció és transzláció céljára az első láncindító-párral kapott PCR-termék hozzávetőleg 1 ^ig• · · ·· · ·· ··· ját, illetve a második és harmadik láncindító-párral kapott PCR-termék 0,3-0,3 gg-ját alkalmaztuk. Az in vitro transzkripciós és transzlációs reakciót 25 μΐ reakciótérfogatban, TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega; katalógusszám: L4950) alkalmazásával végeztük. A reakcióelegy 12,5 μΐ TNT-nyúlretikulocita-lizátumot, 2 μΐ TNTreakciópuffért, 1 μΐ T3-polimerázt, 1 μΐ 1 mM aminosavelegyet (metionin nélkül), 4 μΐ 35S-metionint (>1000 Ci/mmól, 10 mCi/ml), 1 μΐ (40 E/ml koncentrációjú) RN-azin ribonukleáz-inhibitort, és 0,5 μg vagy 1 μg PCR-terméket tartalmazott. A reakcióelegy térfogatát nukleázmentes vízzel 25 μΙ-re egészítettük ki. A reakcióelegyet 30 °C-on 2 óra hosszat inkubáltuk. A reakciótermék 5 μΙ-ét 4-2 % gradiens SDS-PAGE gélen analizáltuk. A gélt - 25 %-os izopropanolban és 10 % ecetsavban végzett fixálás után megszárítottuk és 70 °C-on egy éjszakán át röntgenfilmre exponáltuk.
Ahogy a 3. ábrán látharó, a teljes hosszúságú FGF10-cDNS-t, valamint az olyan cDNS-t tartalmazó PCRtermékek, amely cDNS 3' -transzlálatlan régiójában (3' -UTR) kb. 340 bp, illetve kb. 140 bp hiányzik, azonos hosszúságú transziáit terméket eredményeztek. A termékek molekulatömegét kb. 19 kD-nak becsültük (2-4. oszlopok).
A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában különböző változtatások hajthatók végre, anélkül, hogy eltérnénk a találmányi gondolattól. Az ilyen megoldások az igényelt oltalmi körön belül maradnak.
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1121 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGCAAAGTGG | GATGATCTGT | CACTACACCT | GCAGCACCAC | GCTCGGAGGA | CAGCTCCTGC | 60 |
CTGCAGCTTC | CAGACCCAGG | AAGCCTGAGG | GGAAGGAAGG | AAGTACGGGC | GAAATCATCA | 120 |
GATTGGCTTC | CCAGATTTGG | GAATCTGAAG | CGGGCCCACA | TCTTCCGGCC | AACTTCCATT | 180 |
GAACTTCCCA | GCACTCGAAA | GGGACCGAAA | TGGAGAGCAA | AGAACCCCAG | CTCAAAGGGA | 240 |
TTGTGACAAG | GTTATTCAGC | CAGCAGGGAT | ACTTCCTGCA | GATGCACCCA | GATGGTACCA | 300 |
TTGATGGGAC | CAAGGACGAA | AACAGCGACT | ACACTCTCTT | CAATCTAATT | CCCGTGGGCC | 360 |
TGCGTGTAGT | GGCCATCCAA | GGAGTGAAGG | CTAGCCTCTA | TGTGGCCATG | AATGGTGAAG | 420 |
GCTATCTCTA | CAGTTCAGAT | gttttcactc | CAGAATGCAA | ATTCAAGGAA | TCTGTGTTTG | 480 |
AAAACTACTA | TGTGATCTAT | TCTTCCACAC | TGTACCGCCA | GCAAGAATCA | GGCCGAGCTT | 540 |
GGTTTCTGGG | ACTCAATAAA | GAAGGTCAAA | TTATGAAGGG | GAACAGAGTG | AAGAAAACCA | 600 |
AGCCCTCATC | ACATTTTGTA | CCGAAACCTA | TTGAAGTGTG | TATGTACAGA | feAACCATCGC | 660 |
TACATGAAAT | TGGAGAAAAA | CAAGGGCGTT | CAAGGAAAAG | TTCTGGAACA | CCAACCATGA | 720 |
ATGGAGGCAA | AGTTGTGAAT | CAAGATTCAA | CATAGCTGAG | AACTCTCCCC | TTCTTCCCTC | 780 |
TCTCATCCCT | TCCCCTTCCC | TTCCTTCCCA | TTTACCCATT | TCCTTCCAGT | AAATCCACCC | 840 |
AAGGAGAGGA | AAATAAAATG | ACAACGCAAG | CACCTAGTGG | CTAAGATTCT | GCACTCAAAA | 900 |
TCTTCCTTTG | TGTAGGACAA | GAAAATTGAA | CCAAAGCTTG | CTTGTTGCAA | TGTTGTAGAA | 960 |
AATTCACGTT | CACAAAGATT | ATCACACTTA | AAAGCAAAGG | AAAAAATAAA | TCAGAACTCC | 1020 |
ATAAATATTA | AACTAAACTG | TATTGTTATT | AGTAGAAGGC | TAATTGTAAT | GAAGACATTA | 108C |
ATAAAGGTGA | AATAAACTTA | AAAAAAAAAA | AAAAAAAAAA | A | 1121 |
- 45 A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 181 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ:
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met | Glu Ser Lys Glu Pro Gin Leu Lys Gly | Ile | Val | Thr | Arg | Leu 15 | ||||||||
5 | 10 | |||||||||||||
Phe | Ser | Gin | Gin | Gly | Tyr | Phe | Leu | Gin | Met | His | Pro | Asp | Gly | Thr |
20 | 25 | 30 | ||||||||||||
Ile | Asp | Gly | Thr | Lys | Asp | Glu | Asn | Ser | Asp | Tyr | Thr | Leu | Phe | Asn |
35 | 40 | 45 | ||||||||||||
Leu | Ile | Pro | Val | Gly | Leu | Arg | Val | Val | Alá | Ile | Gin | Gly | Val | Lys |
50 | 55 | 60 | ||||||||||||
Alá | Ser | Leu | Tyr | Val | Alá | Met | Asn | Gly | Glu | Gly | Tyr | Leu | Tyr | Ser |
65 | 70 | 75 | ||||||||||||
Ser | Asp | Val | Phe | Thr | Pro | Glu | Cys | Lys | Phe | Lys | Glu | Ser • | Val | Phe |
80 | 85 | 90 | ||||||||||||
Glu | Asn | Tyr | Tyr | Val | Ile | Tyr | Ser | Ser | Thr | Leu | Tyr | Arg | Gin | Gin |
95 | 100 | • | 105 | |||||||||||
Glu | Ser | Gly | Arg | Alá | Trp | Phe | Leu | Gly | Leu | Asn | Lys | Glu | Gly | Gin |
110 | 115 | 120 | ||||||||||||
Ile | Met | Lys | Gly | Asn | Arg | Val | Lys | Lys | Thr | Lys | Pro | Ser | Ser | His |
125 | 130 | 135 | ||||||||||||
Phe | Val | Pro | Lys | Pro | Ile | Glu | Val | Cys | Met | Tyr | Arg | Glu | Pro | Ser |
140 | 145 | 150 | ||||||||||||
Leu | His | Glu | Ile | Gly | Glu | Lys | Gin | Gly | Arg | Ser | Arg | Lys | Ser | Ser |
155 | 160 | 165 | ||||||||||||
Gly | Thr | Pro | Thr | Met | Asn | Gly | Gly | Lys | Val | Val | Asn | Gin | Asp | Ser |
170 175 180
Thr • ·
- 46 A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: oligonukleotid
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATGCTTCCGG CTCGTATG 18
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 19 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: oligonukleotid
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGGTTTTCCC AGTCACGAC 19
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: oligonukleotid • · ·· · ·· ···
- 47 AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGAGATCTG AGGGAAGAAG GGGA
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: oligonukleotid
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCACCGATAA TCCTCCTT
Claims (21)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Izolált polinukleotid, amely (a) a 2. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát vagy annak fragmensét, analógját vagy származékát kódoló polinukleotid; vagy (b) az ATCC 75696 deponálási számon letétbe helyezett klón bán található cDNS által kódolt aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet vagy annak fragmensét,
analógj át 2 . vagy Az származékát i kódoló polinukleotid. 1 . igénypont szerinti polinukleotid, amely DNS . 3 . Az 1 . igénypont szerinti polinukleotid, amely RNS . 4 . Az 1 . igénypont szerinti polinukleotid, amely genomi eredetű DNS.5. A 2. igénypont szerinti polinukleotid, amely a - 2. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódolja.
- 6. A 2. igénypont szerinti polinukleotid, amely az ATCC 75696 deponálási számon letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt polipeptidet kódolja.
- 7. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, amely az1. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott kódolószekvenciát tartalmazza.
- 8. A 2. igénypont szerinti polinukleotid, amely azATCC 75696 deponálási számon letétbe helyezett polipeptid kódolószekvenciáját tartalmazza.• · · · · · · » · · · · ·« • · · · * ««· · ·* ·*»···- 49
- 9. Vektor, amely 2. igénypont szerinti DNS-t tartalmaz .
- 10. Gazdasejt, amely génsebészeti módszerek alkalmazásával 9. igénypont szerinti vektorral van manipulálva.
- 11. Eljárás polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti sejttel a vektorban található kódoló DNS által kódolt polipeptidet expresszáltatjuk.
- 12. Eljárás polipeptidet expresszálni képes sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy sejteket 9. igénypont szerinti vektorral, génsebészeti módszerek alkalmazásával manipulálunk.
- 13. Izolált DNS, amely 2. igénypont szerinti DNSsel hibridizálódni képes, és FGF-10-aktivitású polipeptidet kódol.
- 14. Polipeptid, amely (a) a 2. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptid vagy annak fragmense, analógja vagy származéka; vagy (b) az ATCC 75696 deponálási számon letétbe helyezett kiónban található cDNS által kódolt polipeptid vagy annak fragmense, analógja vagy származéka.
- 15. A 14. igénypont szerinti polipeptid, amely a 2.azonosítószámú szekvenciaként bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát tartalmazó FGF-10-polipeptid.
- 16. Antitest, amely a 14. igénypont szerinti polipeptid ellen irányul.• · · « r · · • · λ , · · « • · · · · ··· * · η ·'····- 50
- 17. Vegyület, amely a 14. igénypont szerinti polipeptid agonistájaként hatásos.
- 18. Vegyület, amely a 14. igénypont szerinti polipeptid antagonistájaként hatásos.
- 19. Eljárás FGF-10 beadására szoruló páciens kezelésére, azzal jellemezve, hogy a páciensnek 14 . igénypont szerinti polipeptid hatásos mennyiségét beadjuk.
- 20. Eljárás FGF-10 gátlására szoruló páciens kezelésére, azzal jellemezve, hogy a páciensnek 18. igénypont szerinti vegyület gyógyászati szempontból hatásos mennyiségét beadjuk.
- 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid gyógyászati szempontból hatásos mennyiségét a polipeptidet kódoló DNS beadásával és a polipeptid in vivő expresszáltatásával biztosítjuk.
- 22. Eljárás az FGF-10 agonistájaként vagy antagonistajaként aktív vegyületek azonosítására, azzal jellemezve, hogy (i) FGF-10-et, a vizsgálni kívánt vegyületet és sejteket tartalmazó reakcióelegyet (amely reakcióelegy olyan jelölőanyagot tartalmaz, amely a sejtek proliterációja során a sejtekbe épül) olyan körülmények között elegyítünk, melyek között az FGF-10 normálisan stimulálja a sejteket; és (ii) meghatározzuk a sejtek proliferációjának mértékét, miáltal azonosítható, hogy a vizsgált vegyület hatásos agonista vagy antagonista-e.* · ·· · ·· ···- 51
- 23. Eljárás a 14. igénypont szerinti polipeptid alacsony szintű expressziójával kapcsolatos betegség vagy ilyen betegségre való fogékonyság diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciában meghatározunk egy mutációt.
- 24. Diagnosztikai eljárás, azzal jellemezve, hogy egy gazdaszervezetből származó mintában vizsgáljuk a 14. igénypont szerinti polipeptid jelenlétét.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/207,412 US5817485A (en) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | Nucleic acids and cells for recombinant production of fibroblast growth factor-10 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9602434D0 HU9602434D0 (en) | 1996-11-28 |
HUT77578A true HUT77578A (hu) | 1998-06-29 |
Family
ID=22770445
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9602434A HUT77578A (hu) | 1994-03-08 | 1995-03-08 | A 10-es számú fibroblaszt növekedési faktor (FGF-10) |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5817485A (hu) |
EP (2) | EP1380594A1 (hu) |
JP (2) | JPH09510103A (hu) |
CN (1) | CN1150804A (hu) |
AT (1) | ATE251637T1 (hu) |
AU (1) | AU1986195A (hu) |
CA (1) | CA2183961A1 (hu) |
CZ (1) | CZ260696A3 (hu) |
DE (1) | DE69531892T2 (hu) |
DK (1) | DK0750628T3 (hu) |
ES (1) | ES2208676T3 (hu) |
FI (1) | FI963475A (hu) |
HU (1) | HUT77578A (hu) |
IL (1) | IL112878A0 (hu) |
MX (1) | MX9603897A (hu) |
NO (1) | NO963728L (hu) |
PL (1) | PL316202A1 (hu) |
PT (1) | PT750628E (hu) |
SK (1) | SK112996A3 (hu) |
WO (1) | WO1995024414A1 (hu) |
ZA (1) | ZA951886B (hu) |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6734285B2 (en) | 1994-03-08 | 2004-05-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 proteins and compositions |
US7109308B1 (en) | 1994-03-08 | 2006-09-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to human vascular endothelial growth factor 2 |
US7186688B1 (en) | 1994-03-08 | 2007-03-06 | Human Genome Sciences, Inc. | Methods of stimulating angiogenesis in a patient by administering vascular endothelial growth factor 2 |
US5932540A (en) | 1994-03-08 | 1999-08-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
US7153827B1 (en) | 1994-03-08 | 2006-12-26 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 and methods of use |
US6608182B1 (en) | 1994-03-08 | 2003-08-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Human vascular endothelial growth factor 2 |
ATE309360T1 (de) | 1994-03-08 | 2005-11-15 | Human Genome Sciences Inc | Vaskularer endothelialer wachstumsfaktor 2 |
US6040157A (en) | 1994-03-08 | 2000-03-21 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
US5693775A (en) * | 1995-05-12 | 1997-12-02 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Fibroblast growth factor homologous factor-1 (FHF-1) and methods of use |
EP0832216A4 (en) * | 1995-06-05 | 1999-06-16 | Human Genome Sciences Inc | FIBROBLAST GROWTH FACTOR 15 |
US5773252A (en) | 1995-06-05 | 1998-06-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Fibroblast growth factor 15 |
US6020189A (en) * | 1996-08-30 | 2000-02-01 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Fibroblast growth factor homologous factors (FHFs) and methods of use |
US6812327B1 (en) | 1996-10-25 | 2004-11-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Neutrokine-alpha polypeptides |
US8212004B2 (en) | 1999-03-02 | 2012-07-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Neutrokine-alpha fusion proteins |
JPH10279501A (ja) * | 1997-02-10 | 1998-10-20 | Rohto Pharmaceut Co Ltd | 育毛剤 |
US6335317B1 (en) * | 1998-04-10 | 2002-01-01 | Emory University | Use of gut-trophic growth factors to improve oxidative status |
US7223724B1 (en) | 1999-02-08 | 2007-05-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Use of vascular endothelial growth factor to treat photoreceptor cells |
AU5440800A (en) * | 1999-05-21 | 2000-12-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Fibroblast growth factor 10 |
CA2407910C (en) | 2000-06-16 | 2013-03-12 | Steven M. Ruben | Antibodies that immunospecifically bind to blys |
US7879328B2 (en) | 2000-06-16 | 2011-02-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator |
NZ518077A (en) | 2000-08-04 | 2003-11-28 | Human Genome Sciences Inc | Biologically active fragments, analogues and derivatives of VEGF-2 for the treatment of peripheral artery diseases such as critical limb ischemia and coronary disease |
US20030091565A1 (en) | 2000-08-18 | 2003-05-15 | Beltzer James P. | Binding polypeptides and methods based thereon |
US7402312B2 (en) | 2001-04-13 | 2008-07-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to vascular endothelial growth factor 2 (VEGF-2) |
WO2002083704A1 (en) | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
US20060183712A1 (en) * | 2005-02-17 | 2006-08-17 | The Texas A&M University System | Affinity purified heparin/heparan sulfate for controlling the biological activity of the FGF receptor |
US9168286B2 (en) | 2005-10-13 | 2015-10-27 | Human Genome Sciences, Inc. | Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease |
US8211649B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-07-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma |
KR101187871B1 (ko) | 2009-09-23 | 2012-10-05 | (주)케어젠 | Fgf10-유래 펩타이드 및 그의 용도 |
CA2808644A1 (en) * | 2010-11-23 | 2012-05-31 | Kci Licensing Inc. | Devices and methods for the diagnosis and treatment of wounds using biomarkers |
CN103169658A (zh) * | 2012-10-26 | 2013-06-26 | 温州医学院 | 成纤维细胞生长因子-10脂质体制备及在毛发再生中的应用 |
EP4183796A1 (en) | 2021-11-19 | 2023-05-24 | Enantis s.r.o. | Thermostable fgf10 polypeptide or fragment thereof use thereof |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5155214A (en) * | 1984-03-05 | 1992-10-13 | The Salk Institute For Biological Studies | Basic fibroblast growth factor |
US4868113A (en) * | 1986-03-03 | 1989-09-19 | Rorer Biotechnology, Inc. | Recombinant DNA vector encoding human endothelial cell growth factor |
JP3303211B2 (ja) * | 1991-04-26 | 2002-07-15 | 武田薬品工業株式会社 | bFGFムテインおよびその製造法 |
AU4995193A (en) * | 1992-08-04 | 1994-03-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of enhancing differentiation and survival of neuronal precursor cells |
-
1994
- 1994-03-08 US US08/207,412 patent/US5817485A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-03-03 IL IL11287895A patent/IL112878A0/xx unknown
- 1995-03-07 ZA ZA951886A patent/ZA951886B/xx unknown
- 1995-03-08 MX MX9603897A patent/MX9603897A/es unknown
- 1995-03-08 DK DK95912829T patent/DK0750628T3/da active
- 1995-03-08 PL PL95316202A patent/PL316202A1/xx unknown
- 1995-03-08 AU AU19861/95A patent/AU1986195A/en not_active Abandoned
- 1995-03-08 CA CA002183961A patent/CA2183961A1/en not_active Abandoned
- 1995-03-08 CN CN95192340A patent/CN1150804A/zh active Pending
- 1995-03-08 EP EP03022286A patent/EP1380594A1/en not_active Withdrawn
- 1995-03-08 SK SK1129-96A patent/SK112996A3/sk unknown
- 1995-03-08 HU HU9602434A patent/HUT77578A/hu unknown
- 1995-03-08 JP JP7523645A patent/JPH09510103A/ja not_active Ceased
- 1995-03-08 PT PT95912829T patent/PT750628E/pt unknown
- 1995-03-08 DE DE69531892T patent/DE69531892T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-08 ES ES95912829T patent/ES2208676T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-08 CZ CZ962606A patent/CZ260696A3/cs unknown
- 1995-03-08 WO PCT/US1995/002950 patent/WO1995024414A1/en active IP Right Grant
- 1995-03-08 AT AT95912829T patent/ATE251637T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-03-08 EP EP95912829A patent/EP0750628B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-05 FI FI963475A patent/FI963475A/fi not_active Application Discontinuation
- 1996-09-06 NO NO963728A patent/NO963728L/no unknown
-
2001
- 2001-07-12 US US09/902,773 patent/US20020034787A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-03-05 JP JP2002058893A patent/JP2002335982A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE251637T1 (de) | 2003-10-15 |
HU9602434D0 (en) | 1996-11-28 |
IL112878A0 (en) | 1995-06-29 |
EP0750628B1 (en) | 2003-10-08 |
US20020034787A1 (en) | 2002-03-21 |
WO1995024414A1 (en) | 1995-09-14 |
ZA951886B (en) | 1996-09-09 |
FI963475A0 (fi) | 1996-09-05 |
NO963728D0 (no) | 1996-09-06 |
AU1986195A (en) | 1995-09-25 |
DE69531892D1 (de) | 2003-11-13 |
JP2002335982A (ja) | 2002-11-26 |
EP0750628A4 (en) | 1997-06-11 |
PL316202A1 (en) | 1996-12-23 |
EP0750628A1 (en) | 1997-01-02 |
CN1150804A (zh) | 1997-05-28 |
EP1380594A1 (en) | 2004-01-14 |
PT750628E (pt) | 2004-03-31 |
CZ260696A3 (en) | 1997-05-14 |
DE69531892T2 (de) | 2004-07-22 |
ES2208676T3 (es) | 2004-06-16 |
JPH09510103A (ja) | 1997-10-14 |
US5817485A (en) | 1998-10-06 |
CA2183961A1 (en) | 1995-09-14 |
NO963728L (no) | 1996-11-07 |
DK0750628T3 (da) | 2004-02-02 |
MX9603897A (es) | 1997-07-31 |
FI963475A (fi) | 1996-11-05 |
SK112996A3 (en) | 1997-01-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HUT77578A (hu) | A 10-es számú fibroblaszt növekedési faktor (FGF-10) | |
JP4439490B2 (ja) | 血管内皮細胞増殖因子2 | |
US6521227B1 (en) | Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides | |
US5780263A (en) | Human CCN-like growth factor | |
US7741055B2 (en) | Prostatic growth factor | |
AU697535B2 (en) | Haemopoietic maturation factor | |
US20020076748A1 (en) | Fibroblast growth factor 15 | |
US6342370B1 (en) | Human slit polypeptide and polynucleotides encoding same | |
EP1217067A2 (en) | Connective tissue growth factor-2 | |
WO1996018730A1 (en) | Prostatic growth factor | |
US20030208043A1 (en) | Human genes, sequences and expression products | |
US6358702B1 (en) | Polynucleotides encoding human Hox C10 | |
AU710568B2 (en) | Human vascular IBP-like growth factor | |
JPH11506919A (ja) | 繊維芽細胞増殖因子15 | |
EP0913472A2 (en) | Human LIG-1 Homolog (HLIG-1) | |
US20020049304A1 (en) | Human CCN-like growth factor | |
WO1996011259A1 (en) | TGF-β1, ACTIVIN RECEPTORS 1 AND 3 | |
MXPA96003897A (en) | Factor 10 of fibroblas growth | |
US20040038873A1 (en) | Polypeptide-calcitonin 11 and the polynucleotide encoding it | |
JP2002247983A (ja) | ヒト血管ibp様成長因子 | |
MXPA97008493A (en) | Factor 15 of fibroblas growth | |
AU2005200547A1 (en) | Vascular Endothelial Growth Factor 2 | |
CA2206640A1 (en) | Human vascular ibp-like growth factor | |
JP2002325590A (ja) | ケラチノサイト増殖因子−2 | |
AU1247800A (en) | Fibroblast growth factor 15 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |