SK10395A3 - Polypeptide and its using - Google Patents
Polypeptide and its using Download PDFInfo
- Publication number
- SK10395A3 SK10395A3 SK103-95A SK10395A SK10395A3 SK 10395 A3 SK10395 A3 SK 10395A3 SK 10395 A SK10395 A SK 10395A SK 10395 A3 SK10395 A3 SK 10395A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- cys
- polypeptide
- lys
- ala
- cells
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/06—Antiarrhythmics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Polypeptid so sekvenciou aminokyselín zodpovedajúci SEQ ID NO: 1 HiN-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Val-Lys-Cys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-De-Ala-Met-Asp-Asn-Cys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe431y-Thr-Cys-Asp-Arg-Leu-Lys-Pro a farmaceutický vhodné soli blokujú vápnikové kanáliky v bunkách, vrátane neurónových a svalových buniek rôznych organizmov vrátane bezstavcov a stavovcov. Opísaná je izolácia uvedeného polypeptidu z jedu pavúka Agelenopsis aperta a sekvenovanie polypeptidu.
402 Polypeptid a jeho použitie
Oblasť techniky
Vynález sa týka polypeptidu, ktorý je obsiahnutý v jedu pavúka Agelenopsis aperta a polypeptidu, ktorý má v podstate rovnakú sekvenciu aminokyselín a v podstate rovnakú účinnosť ako polypeptid uvedený hore. Tieto polypeptidy a ich farmaceutický vhodné soli blokujú vápnikové kanálky v bunkách, vrátane neurónových a svalových buniek rôznych organizmov vrátane bezstavovcov a stavovcov. Vynález sa tiež týka aplikácie týchto polypeptidov a ich solí pre blokovanie vápnikových kanálkov v bunkách, ako sú bunky nervového a svalového systému organizmov a ďalej tiež využitia tejto aplikácie pri liečbe chorôb a stavov cicavcov, ktoré sú sprostredkované vápnikovými kanálkami a pri potlačovaní bezstavcových škodcov. Vynález sa tiež týka prostriedkov obsahujúcich tieto polypeptidy a ich soli.
Doterajší stav techniky
Zlúčeniny, ktoré sú účinné ako antagonisti vápnika, nachádzajú rôzne aplikácie. Dajú sa použiť pri liečbe takých stavov a chorôb, ako je mi. angína, hypertenzia, kardiomyopatia, supraventrikulárna arytmia, aesophogeálna achalázia, predčasná príprava k pôrodu a Raynaudova choroba (viď W. G. Nayler, Calcium Antagonists, Academic Press, Harcourt Brače Jovanovich Publishiers, New York, NY 1988). Hore uvedená publikácia je tu uvedená náhradou za prenesenie celého jej obsahu do popisu tohto vynálezu. Tieto zlúčeniny sú ďalej užitočné pri štúdiu fyziológie takých buniek, ako sú neuróny a svalové bunky.
Iné polypeptidy izolované z Agelenopsis aperta sú zverejnené v US patente č. 5 122 596.
Podstata vynálezu
Ako už bolo uvedené hore, týka sa vynález polypeptidu, ktorý je obsiahnutý v jedu pavúka Agelenopsis aperta Polypeptid a frakcia, v ktorej je prítomný, podlá vynálezu, sú charakterizované ďalej.
Peptid J2 Agelenopsis má nasledujúcu sekvenciu aminokyselín (SEQ ID NO: 1)
H2N-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-VaľLysCys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-Ile-Ala-Met-Asp-AsnCys-VaľCys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys-AspArg-Leu-Lys-Pro
Polypeptid podlá vynálezu blokuje vápnikové kanálky v bunkách. V dôsledku toho je tento polypeptid užitočný pri blokovaní vápnikových kanálkov v bunkách, ako takom, a tiež je užitočný pri potlačovaní bezstavcových škodcov a pri liečbe chorôb a stavov cicavcov, ktoré sú sprostredkované funkciou vápnikových kanálkov v bunkách.
Do rozsahu vynálezu spadajú tiež polypeptidy, ktoré majú v podstate rovnakú sekvenciu aminokyselín a v podstate rovnakú účinnosť pri blokovaní vápnikových kanálkov, ako polypeptid opísaný hore.
Predmetom vynálezu sú tiež farmaceutické prostriedky obsahujúce hore uvedené polypeptidy a spôsoby podávania týchto polypeptidov.
Nasleduje podrobný popis tohto vynálezu.
Jed sa získava odberom z pavúka Agelenopsis aperta po jeho elektrickej stimulácii v zhode s štandardnými postupmi, ktoré sú odborníkom v tomto odboru známe. Prednostne sa používajú postupy, ktoré zaručujú, že nedôjde ku kontaminácii jedu abdominálnym regurgitantom (vratným prúdom) alebo hemolymfou. Také postupy sú odborníkom v tomto odboru dobre známe. Takto získaný celý jed sa uskladňuje v zmrazenom stave pri teplote asi -78°C až do jeho použitia pri purifikácii opísanej ďalej. Purifikácia zložiek z celého jedu sa vykonáva vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) s reverznými fázami na rôznych preparatívnych alebo semipreparatívnych stĺpcoch, ako je stĺpec C-4 a C-18 Vydac^R^ (Rainin Inštrument Co. Inc., Mack Road, Woburn, Massachusetts 01801, USA). Detekcia pikov sa vykonáva monochromaticky pri 220 až 230 nm. Ďalšia analýza frakcií sa napríklad môže uskutočniť na základe polychrómnych UV dát získaných pomocou detektoru so sústavou diód (Waters 990) (Millipore Corporation Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757, USA). Frakcie zo stĺpcov sa zberajú známymi postupmi, ako napríklad pri použití zberače frakcií ISCO/FOXY a pikového detektoru ISCO 2159 (ISCO,
4700 Superior, Lincoln, Nebraska, 68504, USA). Frakcie sa zberajú do nádob vhodnej veíkosti, napríklad do sterilných polyetylénových laboratórnych nádob. Skoncentrovanie frakcií sa potom vykoná lyofilizáciou z eluátu, po ktorej nasleduje lyofilizácia z vody. Čistota výsledných zložkových frakcií sa potom môže stanoviť chromatografickou analýzou pri použití analytického stĺpca s gradientovým systémom, ktorý je izokratičtejší než systém použitý pri finálnej purifikácii týchto frakcií.
Polypeptid podía vynálezu je možné známymi metódami sekvenovať. Všeobecná stratégia pre stanovenie základnej štruktúry zahŕňa napríklad tieto stupne:
1) Redukcia a S-pyridylácia disulfidom premostených cysteínových zvyškov za účelom zvýšenia susceptibility substrátu k enzymatiokému napadnutiu,
2) Regulované jednostupňové alebo viacstupňové štepenie peptidu enzýmom.
3) Izolácia a purifikácia fragmentov peptidu vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) s reverznými fázami.
4) Charakterizácia fragmentov peptidu pomocou N-terminálneho sekvenovania a hmotnostnej spektrometrie ion-spray.
S-pyridyletylácia cysteínových zvyškov študovaných polypeptidov sa napríklad môže vykonávať v roztoku a po tejto operácii nasleduje sekvenovanie polypeptidov. Jeden zo spôsobov S-pyridyletylácie, ktorý je možné použiť, je opísaný ďalej.
Asi 1 až 10 μg polypeptidu sa rozpustí v 50 μΐ tlmivého roztoku pripraveného zmiešaním 1 dielu IM TrisHCl s pH 8,5 s obsahom EDTA (4mM) a 3 dielov 8M hydrochloridu guanidínu, alebo sa týmto tlmivým roztokom na objem 50 μΐ zriedi. Pridá sa 2,5 μΐ 10% vodného 2-merkaptoetanolu a zmes sa inkubuje pri teplote miestnosti v temne pod argónovou atmosférou 2 hodiny. Po inkubácii sa pridajú 2 μΐ 4-vinylpyridínu (čerstvé reakčné činidlo skladované pod argónovou atmosférou pri -20°C) a výsledná zmes sa ďalšie 2 hodiny inkubuje pri teplote miestnosti v temne pod argónovou atmosférou. Potom sa zmes odsolí, prednostne chromatograficky na krátkom stĺpci s reverznými fázami.
Získaný alkylovaný polypeptid sa potom známymi metódami sekvenuje.
Vďaka vynálezu, ktorý je charakterizovaný v tomto popise, sa peptid prítomný vo frakcii J2 jedu z Agelenopsis aperta môže získať tiež inými metódami ako izoláciou a purifikáciou z celého jedu. Polypeptidy podlá vynálezu je teda tiež možné vyrobiť pri použití rekombinantných DNA techník pomocou klonovania kódujúcej sekvencie pre tieto polypeptidy alebo ich časti. Tak napríklad je možné, s využitím informácie so známou sekvenciou aminokyselín týchto polypeptidov, použiť hybridizačné sondy pre klonovanie kódujúcej sekvencie pre celý polypeptid, čo sa vykonáva spôsobmi dobre známymi odborníkom v tomto odboru. Pri výrobe polypeptidov podlá vynálezu sa tiež môžu použiť kombinácie rekombinantných DNA techník s in vitro syntézou proteínu. Ako neobmedzujúci príklad metódy in vitro syntézy proteínu je možné uviesť metódu uskutočňovanú v syntetizátoru peptidov v pevnej fáze ABI 430A (Applied Biosystems Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404, USA), pri ktorej sa používa štandardná Merrifieldova chémia alebo iné chémie pre postup v pevnej fáze, ktoré sú dobre známe odborníkom v tomto odboru.
V tomto odboru je dobre známe, že v polypeptidoch je možné vykonávať určité substitúcie aminokyselín, ktoré neovplyvňujú alebo v podstate neovplyvňujú funkcie týchto poly peptidov. Špecifické substitúcie, ktoré sú možné, sa menia od polypeptidu k polypeptidu. Stanovenie prípustných substitúcií sa uskutočňuje postupmi, ktoré sú v tomto odboru dobre známe. Do rozsahu tohto vynálezu teda spadajú všetky polypeptidy, ktoré majú v podstate rovnakú sekvenciu aminokyselín a v podstate rovnakú účinnosť pri blokovaní vápnikových kanálkov.
Polypeptidy podlá vynálezu blokujú vápnikové kanálky obsiahnuté v rôznych bunkách, ako sú napríklad bunky nervového systému a svalového systému bezstavovcov a stavovcov.
Schopnosť polypeptidov podlá vynálezu blokovať vápnikové kanálky je možné demonštrovať nasledujúcim postupom.
Z cerebela osemdenných potkanov sa získajú cerebelárne granulárne bunky (Wilkin et al., Brain Res., 115, 181 až 199,
1976). Štvorce (1 cm2) z Aclaru (Proplastics Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, NJ, 07719, USA) sa potiahnu poly-Llyzínom a umiestnia do 12-jamkových misiek obsahujúcich 1 ml Eaglova bazálneho média. Bunky sa disociujú a do každej jamky obsahujúcej štvorec Aclaru sa pridá alikvotná časť obsahur júca 6,25 x 10 buniek. Po 24 hodinách sa pridá cytozin-betaD-arabinofuranozid (koncová koncentrácia ΙΟμΜ). Bunky sa používajú pre fura2 analýzu u 6-, 7-a 8-dennej kultúry. Bunky (pripojené k Aclarovým štvorcom) sa prevedú do 12-jamkovéj misky obsahujúcej 1 ml 2μΜ fura2/AM (Molecular Probes Inc. , Eugene, OR 97402, USA) v tlmivom roztoku HEPES (s obsahom hovädzieho sérového albumínu 0,01 % a dextrózy 0,01 %; pH 7,4, bez horčíka). Bunky sa inkubujú počas 40 minút pri 37°C a potom sa tlmivý roztok obsahujúci fura2/AM odstráni a nahradí 1 ml rovnakého tlmivého roztoku bez fura2/AM. Do kyvety z kremenného skla sa predloží 2,0 ml predhriateho (37°C) tlmivého roztoku. Do kyvety sa pridajú bunky na Aclaru, kyveta sa vloží do termostatovaného (37°C) držiaku vybaveného magnetickým miešadlom a pomocou fluorescenčného spektrofotometru (Biomedical Inštrument Group, University of Pennsylvania, USA) sa merí fluorescencia. Fluorescenčný signál sa nechá stabilizovať asi 2 minúty. Potom sa do kyvety pridá 5 až 20 μΐ rezervného roztoku študovanej zlúčeniny v roztoku chloridu sodného tlmeného fosforečnanom (PBS, pH 7,4) s vhodnou koncentráciou. Kalibrácia fluorescenčných signálov a oprava úniku fura2/AM sa vykonáva zavedenými postupmi (Nemeth et al., J. Biol. Chem. 262, 5188 (1987)) na záver každej skúšky. Maximálna hodnota fluorescencie (Fmax) sa stanoví prídavkom iónomycínu (35μΜ) a minimálna hodnota (Fmin) sa stanoví nasledujúcim prídavkom EGTA (12μΜ) za účelom chelatizácie vápnika. Pri použití hore opísaného postupu sa zistí, že dochádza k blokovaní vápnikových kanálkov študovaným polypeptidom, čo sa prejaví poklesom fluorescencie po pridaní tohto polypeptidu. Pri tejto skúške vykazuje polypeptid podľa tohto vynálezu nízke hodnoty IC5Q, pod 200 nm, pri blokovaní vápnikových kanálkov.
Pre porovnanie je možné uviesť, že dva známe obchodne dostupné antagonisti vápnikových kanálkov, Nifedipine a Verapamil, vykazujú hodnotu IC50 33 nm a 4 800 nm.
Polypeptidy podľa tohto vynálezu sú užitočné pri blokovaní vápnikových kanálkov v bunkách, ako takom. Vdaka tomu sú polypeptidy tiež užitočné pri potlačovaní bezstavcových škodcov a pri liečbe chorôb a stavov sprostredkovaných funkciou vápnikových kanálkov v bunkách cicavcov, ako je mi. angína, hypertenzia, kardiomyopatia, supraventrikulárna arytmia, aesophogeálna achalázia, predčasná príprava k pôrodu a Raynaudova choroba. Ďalej sú tieto polypeptidy užitočné pri štúdiu fyziológie buniek, pričom ako neobmedzujúce príklady buniek prichádzajúcich do úvahy, je možné uviesť bunky nervového a muskulárneho systému.
Do rozsahu tohto vynálezu spadajú tiež farmaceutický vhodné soli polypeptidov podľa vynálezu. Tieto soli sa vyrábajú spôsobmi, ktoré sú v tomto odboru známe. Tak napríklad soli polypeptidov s bázami je možné vyrobiť konvenčnými metódami.
Pri podávaní polypeptidov podľa vynálezu cicavcom je možné tieto látky podávať buď samotné alebo v kombinácii s farmaceutický vhodnými nosičmi alebo riedidlami, v podobe farmaceutických prostriedkov, ako je to obvyklé v štandardnej farmaceutickej praxi. Polypeptidy je možné podávať orálne alebo parenterálne, pričom parenterálnemu spôsobu podávania sa venuje prednosť. Parenterálne podávanie zahŕňa intravenózne, intramuskulárne, intraperitoneálne, subkutánne a topické podávanie.
Pokial sa polypeptidy podlá vynálezu podávajú orálne, môžu sa na tieto účely používať prostriedky vo forme tabliet alebo kapsúl alebo vodných roztokov alebo suspenzií.
Ako vhodné nosiče, ktoré sa obyčajne používajú v tabletách pre orálne podávanie, je možné uviesť laktózu a kukuričný škrob Ďalej sa k takým tabletám pridávajú obyčajne lubrikačné činidlá, ako je stearan horečnatý. Ako vhodné riedidlá pre prípravky v podobe kapsúl je možné uviesť laktózu a sušený kukuričný škrob. Pokial sa majú vyrobiť vodné suspenzie pre orálne podávanie, mieša sa účinná prísada s emulgačnými a suspenznými činidlami. Keď je to žiadúce, môžu sa tiež pridávať určité sladidlá a/alebo aromatizačné látky.
Pre intramuskulárne, intraperitoneálne, subkutánne a intravenózne podávanie sa môžu vyrábať sterilné roztoky účinnej prísady. Hodnota pH týchto roztokov sa účelne nastavuje alebo tlmí. Pri roztokoch určených pre intravenózne podávanie je potrebné dbať o nastavenie celkovej koncentrácie rozpustených látok, aby bol prípravok izotonický.
Pokial sa polypeptid alebo jeho sol podlá vynálezu bude podávať humánnemu pacientovi, stanoví dennú dávku obyčajne ošetrujúci lekár. Dávkovanie bude závislé od veku, hmotnosti a odpovedi konkrétneho pacienta a od závažnosti symptómov choroby a účinnosti podávanej zlúčeniny.
Pokial sa polypeptid alebo jeho sol podlá vynálezu bude používať pri potlačovaní bezstavových škodcov, bude sa týmto bezstavovcom podávať polypeptid priamo alebo sa bude aplikovať na prostredie, v ktorom sa bezstavovci vyskytujú.
Tak napríklad sa môže zlúčenina podlá vynálezu aplikovať na bezstavovce vo forme postreku roztokom tejto zlúčeniny.
Množstvo zlúčeniny potrebné pre potlačenie bezstavovcov sa bude menit v závislosti od druhu bezstavovcov a podmienok prostredia. Toto množstvo stanoví osoba vykonávajúca aplikáciu
Pokial sa polypeptid alebo jeho soli podlá vynálezu budú používať pri štúdiu fyziológie buniek, bude sa tento polypeptid podávať bunkám metódami, ktoré sú známe odborníkom v tomto odboru. Polypeptid je napríklad možné bunkám podávať vo vhodnom fyziologickom tlmivom roztoku. Vhodná koncentrácia polypeptidu podlá vynálezu pri použití v takých štúdiách je 200μΜ. Koncentrácia polypeptidu pri týchto štúdiách však môže byť i vyššia alebo podstatne nižšia než 200μΜ. Množstvo podávaného polypeptidu stanoví odborník v tomto odboru známymi metódami.
Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch uskutočňovania. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohlade neobmedzujú.
Príklady predvedenia vynálezu
Príkladl
A. Surový jed z Agelenopsis aperta (asi 40 μΐ) sa nanesie na stĺpec HPLC s reverznými fázami [VYDAC^R^ C-18,
300 Ä (30 nm), 22 x 250 mm], ktorý sa uskutočňuje pri použití programu s dvojfázovým lineárnym gradientom od zloženia 95 % zložky A a 5 % zložky B do zloženia 80 % zložky A a 20 % zložky B (30 minút) a ďalej do zloženia 30 % zložky A a 70 % zložky B (25 minút), kde zložkou A je 0,1% kyselina trifluóroctová a zložkou B je acetonitril, pričom detekcia sa vykonáva pri 220 nm a prietoková rýchlosť je 15 ml/min. Požadovaná frakcia sa zberá v dobe v rozmedzí od 38,3 do 38,7 minúty. Rovnaké frakcie z rôznych pokusov sa spoja a skoncentrujú lyofilizáciou.
B. Látka získaná frakcionáciou podía stupňa A. (z 100 μΐ surového jedu) sa nanesie na stĺpec HPLC s reverznými fázami [VYDAc/R) C-18, 300 Ä (30 nm), 22 x 250 mm], ktorý sa uskutočňuje pri použití programu s lineárnym gradientom od zloženia 77 % zložky A a 23 % zložky B do zloženia 70 % zložky A a 30 % zložky B (25 minút), kde zložkou A je 0,1% kyselina trifluóroctová a zložkou B je acetonitril, pričom detekcia sa vykonáva pri 220 nm a prietoková rýchlosť je 12 ml/min. Požadovaná frakcia sa zberá v dobe v rozmedzí od 17,3 do 17,7 minúty. Rovnaké frakcie z rôznych pokusov sa spoja a skoncentrujú lyofilizáciou.
Štruktúra peptidu J2 sa stanoví a overí nasledujúcimi metódami. Vykoná sa analýza aminokyselín PTC pri použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocou systému Waters Pico-Tag. N-terminálne sekvenovanie sa vykoná v pulznom kvapalinovom sekvenátoru (ABI) ako na natívnom, tak na redukovanom/pyridyletylovanom peptide. Základná štruktúra polypeptidu sa zistí pri použití automatizovaného pulzného kvapalinového sekvenátoru (Applied Biosystems, model 473A). Údaje hmotnosťnej spektrálnej analýzy sa získajú z hodnôt doby desorpcie plazmy BIO-ION pri použití hmotnosťného spektrometru (flight mass) .
Pyridyletylovaný derivát peptidu J2, ktorý sa hodí pre N-terminálne sekvenovanie, sa vyrobí nasledujúcim spôsobom. Peptid J2 (50 mg) sa rozpustí v 10 μΐ tlmivého roztoku (zmes IM Tris, pH 8,4, 4 μΜ EDTA-dvojsýtnej a 8M hydrochloridu guanidínu v pomeru 1 : 3) a k vzniknutému roztoku sa pridajú 2 μΐ 0,454M (10% - objemovo) roztoku 2-merkaptoetanolu v tlmivom roztoku, potom sa vzniknutá zmes 3 hodiny udržuje pri teplote miestnosti v temne. Potom sa k reakčnej zmesi pridajú 2 μΐ 0,456M roztoku 4-vinylpyridínu v tlmivom roztoku a zmes sa 18 hodín udržuje v temne pri teplote mies11 tnosti. Vzniknutá reakčná zmes sa zriedi 90 μΐ vody a 40 μΐ acetonitrilu a nanesie na stĺpec HPLC (Baker WPC-18, 4,6 x 250 mm), ktorý sa uskutočňuje pri použití programu s dvojfázovým lineárnym gradientom. Najprv sa pracuje pri zložení 80 % zložky A a 20 % zložky B (5 minút), potom sa zloženie mení od zloženia 80 % zložky A a 20 % zložky B do zloženia 50 % zložky A a 50 % zložky B (30 minút), kde zložkou A je 0,1% kyselina trifluóroctová a zložkou B je acetonitril, pričom detekcia sa vykonáva pri 220 nm a prietoková rýchlosť je 1,0 ml/min. Požadovaná frakcia sa zberá v dobe v rozmedzí od 20,8 do 21,3 minúty a skoncentruje sa lyofilizáciou.
Zistené údaje spoločne potvrdzujú štruktúru peptidu J2, ktorá je charakterizovaná ďalej.
SEQ ID NO: 1, 48 zvyškov, 10 cysteínov, 5 disulfidových väzieb Vypočítaná molekulová hmotnosť = 5474,4 Nalezená molekulová hmotnosť = 5474 Odhadnutý pl = 7,98
Záznam o sekvencii (1) Všeobecné informácie (i) PRIHLASOVATEĽ (A) MENO:
(B) ULICA:
(C) MESTO:
(D) ŠTÁT:
(E) KRAJINA:
(F) POŠTOVÉ (G) TELEFÓN:
(H) TELEFAX:
Pfizer Inc.
235 East 42nd Street New York
New York USA
SMEROVACIE ČÍSLO (ZIP): 10017 (203) 441-4905 (203) 441-5221
| (A) | MENO: | NPS Pharmaceuticals, |
| (B) | ULICA: | 420 Chipeta Way |
| (C) | MESTO: | Sált Lake City |
| (D) | ŠTÁT: | Utah |
| (E) | KRAJINA: | USA |
| (F) | POŠTOVÉ | SMEROVACIE ČÍSLO (ZIP |
| (G) | TELEFÓN: | (801) 583-4939 |
| (H) | TELEFAX: | (801) 583 4961 |
84108 (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Polypeptid z Agelenopsis Aperta blokujúci vápnikové kanálky (iii) POČET SEKVENCIÍ: 1 (iv) STROJNE ČITATEĽNÁ FORMA:
(A) TYP NOSIČA: floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Releasa #1.0, verzia # 1.25 (EPO) (vi) ÚDAJE O PREDOŠLEJ PRIHLÁŠKE:
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: US 07/919538 (B) DÁTUM PODANIA: 27. júli 1992 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DÉŽKA: 48 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZOVOSŤ: jednoduchá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín
| (vi) | PÔVODNÝ ZDROJ: (A) ORGANIZMUS: | Agelenopsis jed | aperta | ||
| (F) TYP | TKANIVA: | ||||
| (xi) | POPIS SEKVENCIE: | SEQ ID NO: : | 1: | ||
| Glu | Ala Cys Ala | Gly Ala | Tyr Lys | Ser Cys Asp | Lys Val Lys Cys |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||
| Cys | His Asp Arg | Arg Cys | Arg Cys | Asn íle Ala | Met Asp Asn Cys |
| 20 | 25 | 30 | |||
| Val | Cys Lys Leu | Phe Tyr | Cys Glu | Leu Phe Gly | Thr Cys Asp Arg |
| 35 | 40 | 45 | |||
| Leu | Lys Pro |
Claims (4)
1. V podstate čistý polypeptid so sekvenciou aminokyselín zodpovedajúci SEQ ID NO: 1
H2N-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Val-LysCys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-Ile-Ala-Met-Asp-AsnCys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys-AspArg-Leu-Lys-Pro alebo polypeptid s v podstate rovnakou sekvenciou aminokyselín a v podstate rovnakou účinnosťou pri blokovaní vápnikových kanálkov, ako má hore uvedený polypeptid, a ich farmaceutický vhodné soli.
2. V podstate čistý polypeptid podlá nároku 1 so sekvenciou aminokyselín zodpovedajúci SEQ ID NO: 1 alebo jeho farmaceutický vhodná sol.
3. Spôsob blokovania vápnikových kanálkov v bunke, vyznačujúci sa tým, že sa tejto bunke podá polypeptid podlá nároku 1 v množstve blokujúcom vápnikové kanálky.
4. Spôsob podlá nároku 3, vyznačujúci sa t ý m, že bunka sa nachádza v nervovom systému cicavca.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US91953892A | 1992-07-27 | 1992-07-27 | |
| PCT/US1993/005392 WO1994002511A1 (en) | 1992-07-27 | 1993-06-10 | Calcium channel blocking polypeptide from agelenopsis aperta |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK10395A3 true SK10395A3 (en) | 1995-06-07 |
Family
ID=25442279
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK103-95A SK10395A3 (en) | 1992-07-27 | 1993-06-10 | Polypeptide and its using |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5599559A (sk) |
| EP (1) | EP0656905B1 (sk) |
| JP (1) | JP2571197B2 (sk) |
| KR (1) | KR950702577A (sk) |
| CN (1) | CN1086824A (sk) |
| AT (1) | ATE157672T1 (sk) |
| AU (1) | AU662066B2 (sk) |
| BR (1) | BR9306796A (sk) |
| CA (1) | CA2139947C (sk) |
| CZ (1) | CZ281539B6 (sk) |
| DE (1) | DE69313650T2 (sk) |
| DK (1) | DK0656905T3 (sk) |
| ES (1) | ES2105284T3 (sk) |
| FI (1) | FI933349A (sk) |
| GR (1) | GR3024637T3 (sk) |
| HR (1) | HRP931050B1 (sk) |
| HU (1) | HU213353B (sk) |
| IL (1) | IL106424A0 (sk) |
| MX (1) | MX9304497A (sk) |
| MY (1) | MY131356A (sk) |
| NZ (1) | NZ253611A (sk) |
| PL (1) | PL307258A1 (sk) |
| RU (1) | RU2104286C1 (sk) |
| SK (1) | SK10395A3 (sk) |
| TW (1) | TW271442B (sk) |
| WO (1) | WO1994002511A1 (sk) |
| YU (1) | YU51593A (sk) |
| ZA (1) | ZA935370B (sk) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5407820A (en) * | 1988-04-04 | 1995-04-18 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Calcium channel α-2 subunit DNAs and cells expressing them |
| US20040018510A1 (en) | 1990-11-08 | 2004-01-29 | Merck & Co., Inc. | Human calcium channel compositions and methods |
| US5876958A (en) * | 1988-04-04 | 1999-03-02 | Sibia Neurosciences, Inc. | Assays of cells expressing human calcium channels containing α1 β subunits |
| US6387696B1 (en) | 1988-04-04 | 2002-05-14 | Merck & Co., Inc. | Human calcium channel compositions and methods |
| US5846757A (en) * | 1988-04-04 | 1998-12-08 | Sibia Neurosciences, Inc. | Human calcium channel α1, α2, and β subunits and assays using them |
| US5874236A (en) * | 1988-04-04 | 1999-02-23 | Sibia Neurosciences. Inc. | DNA encoding human calcium channel α-1A, β1, β-2, and β-4 subunits, and assays using cells that express the subunits |
| US6096514A (en) * | 1988-04-04 | 2000-08-01 | Sibia Neurosciences, Inc. | Human calcium channel compositions and methods |
| US6653097B1 (en) | 1991-08-15 | 2003-11-25 | Merck & Co., Inc. | Human calcium channel compositions and methods |
| AU3548089A (en) * | 1988-04-04 | 1989-11-03 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc., The | Calcium channel compositions and methods |
| US6090623A (en) * | 1993-08-11 | 2000-07-18 | Merck & Co., Inc. | Recombinant human calcium channel β4 subunits |
| ES2075796B1 (es) * | 1993-08-17 | 1996-03-01 | Pfizer | Polipeptido de la agelenopsis aperta bloqueante de los canales de ca lcio |
| CA2230957A1 (en) | 1995-09-29 | 1997-04-10 | Universita'degli Studi Di Siena | Regulated genes and uses thereof |
| WO1998007832A1 (en) | 1996-08-23 | 1998-02-26 | Ludwig Institute For Cancer Research | Recombinant vascular endothelial cell growth factor d (vegf-d) |
| US6528630B1 (en) | 1997-12-03 | 2003-03-04 | Merck & Co., Inc. | Calcium channel compositions and methods |
| IL140665A0 (en) * | 1998-07-10 | 2002-02-10 | Novartis Ag | Antihypersensitive combination of valsartan and calcium channel blocker |
| US8299211B2 (en) * | 2005-09-30 | 2012-10-30 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Peptides and regulation of calcium channels |
| CN103768469A (zh) * | 2012-10-23 | 2014-05-07 | 葛继云 | 一种治疗妇科炎症的中药组合物及其制备方法和用途 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925664A (en) * | 1986-10-20 | 1990-05-15 | University Of Utah | Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function |
| US5196204A (en) * | 1986-10-20 | 1993-03-23 | University Of Utah Research Foundation | Spider toxins and methods for their use as blockers of calcium channels and amino acid receptor function |
| US5064657A (en) * | 1986-10-20 | 1991-11-12 | University Of Utah | Spider toxins and methods for their use as blockers of amino acid receptor function |
| US5122596A (en) * | 1989-09-29 | 1992-06-16 | Pfizer Inc. | Polypeptides useful as blockers of calcium channels |
-
1993
- 1993-06-10 RU RU95105340A patent/RU2104286C1/ru active
- 1993-06-10 WO PCT/US1993/005392 patent/WO1994002511A1/en active IP Right Grant
- 1993-06-10 KR KR1019950700305A patent/KR950702577A/ko active IP Right Grant
- 1993-06-10 CZ CZ95200A patent/CZ281539B6/cs unknown
- 1993-06-10 DK DK93914406.9T patent/DK0656905T3/da active
- 1993-06-10 SK SK103-95A patent/SK10395A3/sk unknown
- 1993-06-10 DE DE69313650T patent/DE69313650T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-10 EP EP93914406A patent/EP0656905B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-10 BR BR9306796A patent/BR9306796A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-06-10 CA CA002139947A patent/CA2139947C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-10 US US08/379,550 patent/US5599559A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-10 ES ES93914406T patent/ES2105284T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-10 PL PL93307258A patent/PL307258A1/xx unknown
- 1993-06-10 NZ NZ253611A patent/NZ253611A/en unknown
- 1993-06-10 AT AT93914406T patent/ATE157672T1/de active
- 1993-06-10 JP JP6503990A patent/JP2571197B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-10 AU AU44078/93A patent/AU662066B2/en not_active Ceased
- 1993-06-14 TW TW082104717A patent/TW271442B/zh active
- 1993-07-14 HR HR07/919,538A patent/HRP931050B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1993-07-20 IL IL106424A patent/IL106424A0/xx unknown
- 1993-07-26 YU YU51593A patent/YU51593A/sh unknown
- 1993-07-26 CN CN93109154A patent/CN1086824A/zh active Pending
- 1993-07-26 FI FI933349A patent/FI933349A/fi not_active Application Discontinuation
- 1993-07-26 ZA ZA935370A patent/ZA935370B/xx unknown
- 1993-07-26 HU HU9302158A patent/HU213353B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-07-26 MX MX9304497A patent/MX9304497A/es unknown
- 1993-07-27 MY MYPI93001472A patent/MY131356A/en unknown
-
1997
- 1997-09-04 GR GR970402275T patent/GR3024637T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK10395A3 (en) | Polypeptide and its using | |
| JPH09118690A (ja) | 興奮性アミノ酸神経伝達物質の拮抗物質として、および／またはカルシウムチャンネルの遮断剤として有用なポリペプチド | |
| CA2026418C (en) | Polypeptides useful as blockers of calcium channels | |
| EP0672056B1 (en) | Calcium channel blocking polypeptides from filistata hibernalis | |
| US5627154A (en) | Calcium channel blocking polypeptides from Heteropoda venatoria | |
| EP0668872B1 (en) | Calcium channel blocking polypeptides from theraphosidae aphonopelma |