CZ281539B6 - Polypeptid a jeho použití - Google Patents

Abstract

V podstatě čistý polypeptid se sekvencí aminokyselin odpovídající SEQ ID NO: 1 H.sub.2.n.N-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Val-Lys-Cys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-Ile-Ala-Met-Asp-Asn-Cys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys-Asp-Arg-Leu-Lys-Pro nebo polypeptid s v podstatě stejnou sekvencí aminokyselin a v podstatě stejnou účinností při blokování vápníkových kanálků, jako má výše uvedený polypeptid, a jejich farmaceuticky vhodné soli blokují vápníkové kanálky v buňkách, včetně neuronových a svalových buněk různých organismů včetně bezobratlých a obratlovců, a mohou být využity při léčbě chorob a stavů savců, které jsou zprostředkovány vápníkovými kanálky a při potlačování bezobratlých škůdců. ŕ

Description

Polypeptid pro blokování vápníkových kanálků v buňce

Oblast techniky

Vynález se týká polypeptidu, který je obsažen v jedu pavouka Agelenopsis aperta. Tento polypeptid a jeho farmaceuticky vhodné soli blokují vápníkové kanálky v buňkách, včetně neuronových a svalových buněk různých organismů včetně bezobratlých a obratlovců. Vynález se také týká aplikace tohoto polypeptidu a jeho solí pro blokování vápníkových kanálků v buňkách, jako jsou zejména buňky nervového systému.

Dosavadní stav techniky

Sloučeniny, které jsou účinné jako antagonisty vápníku, nalézají různé aplikace. Je jich možno použít při léčbě takových stavů a chorob, jako je mj. angína, hypertense, kardiomyopathie, supraventrikulární arrhytmie, aesophogeální achalasie, předčasná práce k porodu a Raynaudova choroba (viz W. G. Nayler, Calcium Antagonists, Academie Press, Harcourt Brace Jovanovich Publishiers, New York, NY 1988). Výše uvedená publikace je zde uvedena náhradou za přenesení celého jejího obsahu do popisu tohoto vynálezu. Tyto sloučeniny jsou dále užitečné při studii fyziologie takových buněk, jako jsou neurony a svalové buňky.

Jiné polypeptidy izolované z Agelenopsis aperta jsou zveřejněny v US patentu č. 5 122 596.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je polypeptid se sekvencí aminokyselin odpovídající SEQ ID NO: 1

H^N-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Val-Lys-Cys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-Ile-Ala-Met-Asp-Asn-Cys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys-Asp-Arg-Leu-Lys-Pro a jeho farmaceuticky vhodné soli pro blokování vápníkových kanálků v buňce.

Jak již bylo uvedeno výše, tento polypeptid, je obsažen v jedu pavouka Agelenopsis aperta (peptid J₂). Polypeptid podle vynálezu a frakce, v níž je přítomen, jsou chrakterizovány dále.

Polypeptid podle vynálezu blokuje vápníkové kanálky, v buňkách. V důsledku toho je tento polypeptid užitečný při blokování vápníkových kanálků v buňkách, jako takovém, a také je užitečný při potlačování bezobratlých škůdců a při léčbě chorob a stavů savců, které jsou zprostředkovány funkcí vápníkových kanálků v buňkách.

Následuje podrbbný popis tohoto vynálezu.

-1CZ 281539 B6

Jed se získává odběrem z pavouka Agelenopsis aperta po jeho, elektrické stimulaci ve shodě se standardními postupy, které jsou odborníkům v tomto oboru známy. Přednostně se používá postupů, které zaručují, že nedojde ke kontaminaci jedu abdominálním regurgitantem (vratným proudem) nebo hemolymfou. Takové postupy jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy. Takto získaný celý jed se uskladňuje ve zmrazeném stavu při teplotě asi -78 ’C až do jeho použití při purifikaci popsané dále. Purifikace složek z celého jedu se provádí vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s reversními fázemi na různých preparativních nebo semipreparativních sloupcích, jako je sloupec C-4 a C-18 Vydac(^R) (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn, Massachusetts 01801, USA). Detekce píku se provádí monochromaticky při 220 až 230 nm. Další analýza frakcí se například může provádět na základě polychromních UV dat získaných pomocí detektoru se soustavou diod (Waters 990) (Millipore Corporation Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Frakce ze sloupců se sbírají známými použiti sběrače frakcí ISCO/FOXY”

Massachusetts 01757, USA), postupy, jako například za a píkového detektoru ISCO 2159 (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska, 68504, USA). Frakce se sbírají do nádob vhodné velikosti, například do sterilních polyethylenových laboratorních nádob. Zkoncentrování frakcí se potom provede lyofilizací z eluátu, po niž následuje lyofilizace z vody. Čistota výsledných složkových frakcí se potom může stanovit chromatografickou analýzou za použití analytického sloupce s gradientovým systémem, který je isokratičtéjší než systém použitý při finální purifikaci těchto frakcí.

Polypeptid podle vynálezu je možno známými metodami sekvenovat. Obecná strategie pro stanoveni základní stuktury zahrnuje například tyto stupně

1) Redukci a S-pyridylaci disulfidem přemostěných cysteinových zbytků za účelem zvýšení suceptibility substrátu k enzymatickému napadení,

2) Regulované jednostupňové nebo vícestupňové štěpení peptidu enzymem.

3) Isolace a purifikace fragmentů peptidu vysoce účinnou kapalinovu chromatografií (HPLC) s reversními fázemi.

4) Charakterizace fragmentů peptidu pomoci N-terminálního sekvenování a hmotnostní spektrometrie ion-spray.

S-pyridylethylace cysteinových zbytků studovaných polypeptidů se například může provádět v roztoku a po této operaci následuje sekvenování polypeptidů. Jeden ze způsobů S-pyridylethylace, kterého je možno použít, je popsán dále.

Asi 1 až 10 ug polypeptidů se rozpustí v 50 μΐ pufru připraveného smícháním 1 dílu 1M TrisHCl o pH 8,5 s obsahem EDTA (4mM) a 3 dílů 8M hydrochloridu guanidinu, nebo se tímto pufrem na objem 50 μΐ zředí. Přidá se 2,5 μΐ 10% vodného 2-merkaptoethanolu a směs se inkubuje při teplotě místnosti v temnu pod argonovou atmosférou po dobu 2 hodin. Po inkubaci se přidají 2 μΐ 4-vinyl

-2CZ 281539 B6 pyridinu (čerstvé reakční činidlo skladované pod argonovou atmosférou při -20 °C) a výsledná směs se další 2 hodiny inkubuje při teplotě místnosti v temnu pod argonovou atmosférou. Potom se směs odsolí, přednostně chromatograficky na krátkém sloupci s reversními fázemi. Získaný alkylovaný polypeptid se potom známými metodami sekvenuje.

Díky vynálezu, který je charakterizován v tomto popisu, se peptid přítomný ve frakci J₂ jedu z Agelenopsis aperta může získat také jinými metodami než izolací a púrifikací z celého jedu. Polypeptid podle vynálezu je tedy také možno vyrobit za použití rekombinantních DNA technik pomoci klonování kódující sekvence pro tento polypeptid nebo jejich části. Tak například je možno, s využitím informace o známé sekvenci aminokyselin tohoto polypeptid, použít hybridizačnich prób pro klonování kódující sekvence pro celý polypeptid, což se provádí způsoby dobře známými odborníkům v tomto oboru. Při výrobě polypeptidu podle vynálezu se také může použít kombinace rekombinantních DNA technik s in vitro syntézou proteinu. Jako neomezující příklad metody in vitro syntézy proteinu je možno uvést metodu prováděnou v syntetizátoru peptidů v pevné fázi ABI 430A (Applied Biosystems lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404, USA), při níž se používá standardní Merrifieldovy chemie nebo jiných chemií pro postup v pevné fázi, které jsou dobře známé odborníkům v tomto oboru.

Polypeptidy podle vynálezu blokuje vápníkové kanálky obsažené v různých buňkách, jako jsou například buňky nervového systému a svalového systému bezobratlých a obratlovců.

Schopnost polypeptidu podle vynálezu blokovat vápníkové kanálky je možno demonstrovat následujícím postupem. Z cerebella osmidenních krys se získají cerebelární granulární buňky (Wilkin et al., Brain Res., 115, 181 až 199, 1976). Čtverečky (1 cm²) z Aclaru (Proplastics lne., 5033 Industrial Ave., Wall, NJ, 07719, USA) se potáhnou poly-L-lysinem a umístí do 12-jamkových misek obsahujících 1 ml Eaglova bazálního média. Buňky se disociují a do každé jamky obsahující čtvereček Aclaru se přidá alikvotní část obsahující 6,25 χ 10⁶ buněk. Po 24 hodinách se přidá cytosin-beta-D-arabinofuranosid (koncová koncentrace 10 μΜ). Buněk se používá pro fura2 analýzu u 6-, 7- a 8-denní kultury. Buňky (připojené k Aclarovým čtverečkům) se převedou do 12-jamkové misky obsahující 1 ml 2μΜ fura2/AM (Molecular Probes lne., Eugene, OR 97402, USA) v pufru HEPES (s obsahem hovězího sérového albuminu 0,01 % a dextrosy 0,01 %; pH 7,4, bez hořčíku). Buňky se inkubují po dobu 40 minut při 37 C a potom se pufr obsahující fura2/AM odstraní a nahradí 1 ml stejného pufru bez fura2/AM. Do kyvety z křemenného skla se předloží 2,0 ml předehřátého (37 °C) pufru. Do kyvety se přidají buňky na Aclaru, kyveta se vloží do termostatovaného (37 ’C) držáku vybaveného magnetickým míchadlem a pomocí fluorescenčního spektrofotometru (Biomedical Instrument Group, University of Pennsylvania, USA) se měří fluorescence. Fluorescenční signál se nechá stabilizovat po dobu asi 2 minut. Potom se do kyvety přidá 5 až 20 μΐ zásobního roztoku studované sloučeniny v roztoku chloridu sodného pufrovaném fosforečnanem (PBS, pH 7,4) o vhodné koncentraci. Kalibrace fluorescentních signálů a oprava úniku fura2/AM se provede zave

-3CZ 281539 B6 děnými postupy (Nemeth et al., J. Biol. Chem. 262, 5188 (1987)) na závěr každé zkoušky. Maximální hodnota fluorescence (Fmax) se stanoví přídavkem ionomycinu (35 μΜ) a minimální hodnota (Fmin) se stanoví následujícím přídavkem EGTA (12 μΜ) za účelem chelatáce vápníku. Za použití výše popsaného postupu se zjistí, že dochází k blokování vápníkových kanálků studovaným polypeptidem, což se projeví poklesem fluorescence po přidání tohoto polypeptidu. Při této zkoušce vykazuje polypeptid podle tohoto vynálezu nízké hodnoty Ι0_ςη, pod 200 nm, při blokování vápníkových kanálků.

Pro srovnání je možno uvést, že dva známé obchodně dostupné antagonisty vápníkových kanálků, Nifedipine a Verapamil, vykazují hodnotu IC₅₀ 33 nm a 4 800 nm.

Polypeptidy podle tohoto vynálezu jsou užitečné při blokování vápníkových kanálků v buňkách, jako takovém. Díky tomu je tento polypeptid také užitečný při potlačování bezobratlých škůdců a při léčbě chorob a stavů zprostředkovaných funkcí vápníkových kanálků v buňkách savců, jako je mj. angína, hypertense, kardiomyopathie, supraventrikulární arrhytmie, aesophogeální achalasie, předčasná práce k porodu a Raynaudova choroba. Dále je tento polypeptid užitečný při studii fyziologie buněk, přičemž jako neomezující příklady buněk přicházejících v úvahu, je možno uvést buňky nervového a muskulárniho systému.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také farmaceuticky vhodné soli polypeptidu podle vynálezu. Tyto soli se vyrábějí způsoby, které jsou v tomto oboru o sobě známé. Tak například soli polypeptidu s bázemi je možno vyrobit konvenčními metodami.

Při podávání polypeptidu podle vynálezu savcům je možno tuto látku podávat budf samotnou nebo v kombinaci s farmaceuticky vhodnými nosiči nebo ředidly, v podobě farmaceutických prostředků, jak je to obvyklé ve standardní farmaceutické praxi. Polypeptid je možno podávat orálně nebo parenterálné, přičemž parenterálnímu způsobu podávání se dává přednost. Patenterální podávání zahrnuje intravenosní, intramuskulární, intraperitoneální, subkutánní a topické podávání.

Pokud se polypeptid podle vynálezu podává orálně, může se k tomuto účelu používat prostředků ve formě tablet nebo kapslí nebo vodných roztoků nebo suspenzí. Jako vhodné nosiče, kterých se obvykle používá v tabletách pro orální podávání, je možno uvést laktosu a kukuřičný škrob. Dále se k takovým tabletám přidávají obvykle lubrikačni činidla, jako je stearan hořečnatý. Jako vhodná ředidla pro přípravky v podobě kapslí je možno uvést laktosu a sušený kukuřičný škrob. Pokud se mají vyrobit vodné suspenze pro orální podávání, míchá se účinná přísada s emulgačními a suspenzními činidly. Je-li to žádoucí, mohou se též přidávat určitá sladidla a/nebo aromatizačni látky.

Pro intramuskulární, intraperitoneální, subkutánní a intravenosní podávání se mohou vyrábět sterilní roztoky účinné přísady. Hodnota pH těchto roztoků se účelně nastavuje nebo pufruje. U roztoků určených pro intravenosní podávání je třeba dbát na nastavení celkové koncentrace rozpuštěných látek, aby byl přípravek isotonický.

-4CZ 281539 B6

Pokud se polypeptid nebo jeho sůl podle vynálezu bude podávat humánnímu pacientovi, stanoví denní dávku obvykle ošetřující lékař. Dávkování bude závislé na věku, hmotnosti a odpovědi konkrétního pacienta a na závažnosti symptomů choroby a účinnosti podávané sloučeniny.

Pokud se polypeptidů nebo jeho soli podle vynálezu bude používat při potlačování bezobratlých škůdců, bude se těmto bezobratlým podávat polypeptid přímo nebo se bude aplikovat na prostředí, v němž se bezobratlí vyskytují. Tak například se může sloučenina podle vynálezu aplikovat na bezobratlé ve formě postřiku roztokem této sloučeniny. Množství sloučeniny potřebné pro potlačení bezobratlých se bude měnit v závislosti na druhu bezobratlých a podmínkách prostředí. Toto množství stanoví osoba provádějící aplikaci.

Pokud se polypeptidů nebo jeho soli podle vynálezu bude používat při studii fyziologie buněk, bude se tento polypeptid podávat buňkám metodami, které jsou známé odborníkům v tomto oboru. Polypeptid je například možno buňkám podávat ve vhodném fyziologickém pufru. Vhodná koncentrace polypeptidů podle vynálezu při použití v takových studiích je 200 μΜ. Koncentrace polypeptidů při těchto studiích však může být i vyšší nebo podstatně nižší než 200 μΜ. Množství podávaného polypeptidů stanoví odborník v tomto oboru známými metodami.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

A. Surový jed z Agelenopsis aperta (asi 40 μΐ) se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi [VYDAC^^R^ C-18, 300 (30 nm), 22 x 250 mm], který se provozuje za použití programu s dvoufázovým lineárním gradientem od složení 95 % složky A a 5 % složky B do složení 80 % složky A a 20 % složky B (30 minut) a dále do složení 30 % složky A a 70 % složky B (25 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 15 ml/min. Požadovaná frakce se sbírá v dobé v rozmezí od 38,3 do 38,7 minuty. Stejné frakce z různých pokusů se spoji a zkoncentrují lyofilizací.

B. Látka získaná frakcionací podle stupně A. (ze 100 μΐ surového jedu) se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi [VYDAc(^R) C-18, 300 (30 nm), 22 x 250 mm], který se provozuje za použiti programu s lineárním gradientem od složení 77 % složky A a 23 % složky B do složeni 70 % složky A a 30 % složky B (25 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 12 ml/min. Požadovaná frakce se sbírá v době

-5CZ 281539 B6 v rozmezí od 17,3 do 17,7 minuty. Stejné frakce z různých pokusů se spojí a zkoncentrují lyofilizací.

Struktura peptidu J₂ se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidu. Základní struktura polypeptidu se zjistí za použití automatizovaného pulsního kapalinového sekvenátoru (Applied Biosystems, model 473A). Data hmotnostní spektrální analýzy se získají z hodnot doby desorpce plasmy BIO-ION za použití hmotnostního spektrometru (flight mass).

Pyridylethylovaný derivát peptidu J₂, který se hodí pro N-terminálni sekvenování, se vyrobí následujícím způsobem. Peptid J₂ (50 mg) se rozpustí v 10 μΐ pufru (smés 1M Tris, pH 8,4, 4 μΜ EDTA-dvojsytné a 8M hydrochloridu guanidinu v poměru 1 : 3) a ke vzniklému roztoku se přidají 2 μΐ 0,454M (10 % - objemové) roztoku 2-merkaptoethanolu v pufru, načež se vzniklá směs 3 hodiny udržuje při teplotě místnosti v temnu. Potom se k reakční směsi přidají 2 μΐ 0,456M roztoku 4-vinylpyridinu v pufru a směs se 18 hodin udržuje v temnu při teplotě místnoti. Vzniklá reakční smés se zředí 90 μΐ vody a 40 μΐ acetonitrilu a nanese na sloupec HPLC (Baker WPC-18, 4,6 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s dvoufázovým lineárním gradientem. Nejprve se pracuje při složení 80 % složky A a 20 % složky B (5 minut), potom se složení mění od složení 80 % složky A a 20 % složky B do složení 50 % složky A a 50 % složky B (30 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 1,0 ml/min. Požadovaná frakce se sbírá v době v rozmezí od 20,8 do 21,3 minuty a zkoncentruje se lyofilizací.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidu J₂, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO: 1, 48 zbytků, 10 cysteinů, 5 disulfidových vazeb Vypočtená molekulová hmotnost = 5474,4 Nalezená molekulává hmotnost = 5474 Odhadnutý pl = 7,98

Záznam o sekvenci (1) Obecné informace (i) PŘIHLAŠOVATEL (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G)

JMÉNO: Pfizer lne.

ULICE: 235 East 42nd Street

MĚSTO: New York

STÁT: New York

ZEMÉ: USA

POŠTOVNÍ SMĚROVACÍ ČÍSLO (ZIP): 10017

TELEFON: (203) 441-4905 (H) TELEFAX:

(203) 441-5221

-6CZ 281539 B6

	(A)	JMÉNO:	NPS Pharmaceuticals, lne.
	(B)	ULICE:	420 Chipeta Way
	(C)	MĚSTO:	Salt Lake City
	(D)	STÁT:	Utah
	(E)	ZEMĚ:	USA
	(F)	POŠTOVNÍ	SMĚROVACÍ ČÍSLO (ZIP): 84108
	(G)	TELEFON:	(801) 583-4939
	(H)	TELEFAX:	(801) 583 4961
(ii)	NÁZEV	VYNÁLEZU	: Polypeptid z Agelenopsis Aperta
			blokující vápníkové kanálky
(iii)	POČET	SEKVENCÍ:	1

(iv) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP NOSIČE:

(B) POČÍTAČ:

(C) OPERAČNÍ (D) SOFTWARE:

floppy disk

IBM PC kompatibilní SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS Patentln Release #1.0, verze # 1.25 (EPO) (vi) DATA O DŘÍVĚJŠÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 07/919538 (B) DATUM PODÁNÍ: 27. července 1992 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) DÉLKA:	48 aminokyselin
	(B) TYP:	aminokyselina
	(C) ŘETÉZOVOST:	j ednoduchá
	(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP MOLEKULY:	protein
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A) ORGANISMUS:	Agelenopsis aperta
	(F) TYP TKÁNĚ:	jed
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEQ ID NO: 1:

Glu

Ala

Cys

Ala

Gly

Ala

Tyr

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Val

Lys

Cys

1

5

10

15

Cys

His

Asp

Arg

Arg

Cys

Arg

Cys

Asn

Ile

Ala

Met

Asp

Asn

Cys

20

25

30

Val

Cys

Lys

Leu

Phe

Tyr

Cys

Glu

Leu

Phe

Gly

Thr

Cys

Asp

Arg

35

40

45

Leu Lys Pro

-7CZ 281539 B6

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid se sekvencí aminokyselin odpovídající SEQ ID NO: 1 ř^N-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Val-Lys-Cys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-Ile-Ala-Met-Asp-Asn-Cys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys-Asp-Arg-Leu-Lys-Pro a jeho farmaceuticky vhodné soli pro blokování vápníkových kanálků v buňce.
2. 2. Polypeptid a jeho farmaceuticky vhodné soli podle nároku 1 pro blokování vápníkových kanálků v buňce, která se nalézá v nervovém systému savce.