DE69313650T2 - Calcium-kanal blockierende polypeptide aus agelenopsis aperta - Google Patents
Calcium-kanal blockierende polypeptide aus agelenopsis apertaInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, das sich im Gift der Spinne Agelenopsis aperta findet, und ein Polypeptid mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im wesentlichen der gleichen Aktivität, wie dieses Polypeptid. Die Polypeptide und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon blockieren Calciumkanäle in Zellen, einschließlich Nerven- und Muskelzellen verschiedener Organismen, einschließlich wirbellosen Tieren und Wirbeltieren. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Polypeptide und ihrer Salze zur Blockierung von Calciumkanälen in Zellen, wie Zellen im Nerven- und Muskelsystem eines Organismus an sich und die Behandlung von durch Calciumkanäle vermittelten Krankheiten und Zuständen bei einem Säugetier. Außerdem betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, die diese Polypeptide undsalze davon umfassen.
- Verbindungen, die Calcium-Antagonisten sind, haben vielfachen Nutzen. Calcium-Antagonisten finden klinische Anwendung bei der Behandlung solcher Zustände wie unter anderem Angina, Bluthochdruck, Kardiomyopathien, supraventrikulären Arrythmien, Ösophagusachalasie, vorzeitigen Wehen und der Raynaud- Krankheit. Siehe W.G. Nayler, Calcium Antagonists, Acacemic Press, Harcourt Brace Jovanovich Publishers, New York, NY 1988, deren Lehren hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Außerdem sind solche Verbindungen nützlich für die Untersuchung der Physiologie von Zellen, wie Nerven- und Muskelzellen.
- Andere Polypeptide, die aus Agelenopsis aperta isoliert wurden, sind in US-Patent Nr. 5,122,596 offenbart.
- Die Erfindung betrifft ein Polypeptid, das im Gift der Spinne Agelenopsis aperta gefunden wird. Das Polypeptid der Erfindung und die erfindungsgemäße Fraktion, in der es vorhanden ist, sind die folgenden.
- Agelenopsis-Peptid-J&sub2; hat die folgende Aminosäuresequenz, SEQ ID Nr. 1:
- Das Polypeptid der Erfindung blokiert Calciumkanäle in Zellen. Somit ist das Polypeptid nützlich zur Blockierung von Calciumkanälen in Zellen an sich. Dieses Polypeptid ist auch nützlich zur Bekämpfung bzw. Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen bei einem Säugetier, die durch die Calciumkanal-Funktion in Zellen vermittelt werden.
- Im Schutzbereich der Erfindung liegen auch Polypeptide mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz, wie oben beschrieben, bei denen aber bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind, ohne die Calciumkanal blockierende Aktivität des Polypeptids zu beeinflussen.
- Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Polypeptide umfassen, und Methoden zur Verabreichung der Polypeptide.
- Das Gift wird aus der Spinne Agelenopsis aperta mit einem Verfahren erhalten, bei dem durch elektrische Stimulation mit dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Standardmethoden gemolken wird. Es ist bevorzugt, daß das angewendete Verfahren eines ist, das das gesamte Gift vor einer Kontamination durch abdominalen Rückfluß oder Hämolymphe schützt. Solche Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt. Das gesamte so erhaltene Gift wird in gefrorenem Zustand bei etwa -78ºC aufbewahrt, bis es zur Reinigung, wie unten beschrieben, verwendet wird. Die Reinigung der Bestandteile aus dem gesamten Gift wird erreicht mit Reverse Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) auf einer Vielzahl präparativer und semipräparativer Säulen, wie C-4- und C-18-Vydac -Säulen (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachusetts 01801). Der Nachweis der Peaks erfolgt monochromatisch bei 220 bis 230 nm. Eine weitere Analyse der Fraktionen kann z.B. mit polychromen UV-Daten, die mit einem Waters 990 Diodenarray- Detektor (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757) gesammelt wurden, durchgeführt werden. Die Fraktionen aus der Säule werden mit bekannten Methoden gesammelt, z.B. unter Verwendung eines ISCO/"FOXY"-Fraktionssammlers und eines ISCO 2159 Peakdetektors (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Die Fraktionen werden in Gefäßen geeigneter Größe gesammelt, z.B. steriler Polyethylen-Laborware. Das Einengen der Fraktionen wird dann durch Lyophilisierung aus dem Elutionsmittel nach einer Lyophilisierung aus Wasser erreicht. Die Reinheit der entstehenden Fraktionen kann dann durch chromatographische Analyse unter Verwendung einer analytischen Säule mit einem Gradientensystem, das isokratischer ist als das für die endgültige Reinigung der Fraktionen verwendete System, bestimmt werden.
- Das erfindungsgemäße Polypeptid kann mit bekannten Methoden sequenziert werden. Eine allgemeine Strategie zur Bestimmung der Primärstruktur schließt z.B. die folgenden Stufen ein. 1) Reduktion und S-Pyridylierung von durch Disulfidbindung verbrückten Cysteinresten, um die Empfindlichkeit des Substrats für einen enzymatischen Angriff zu erhöhen. 2) Kontrollierte Spaltung des Peptids durch einstufigen oder mehrstufigen enzymatischen Verdau. 3) Isolierung und Reinigung von Peptidfragmenten über Reverse Phase-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). 4) Kennzeichnung der Peptidfragmente durch N-terminale Sequenzierung und Ionenzerstäubungs-Massenspektrometrie.
- Die S-Pyridylethylierung von Cysteinresten der zu untersuchenden Polypeptide kann z.B. in Lösung durchgeführt werden, wobei sich eine Aminosäure-Sequenzierung der Polypeptide anschließt. Ein solches Verfahren zur S-Pyridylethylierung kann wie unten beschrieben durchgeführt werden.
- Etwa 1 bis 10 µg Polypeptid werden in bis zu 50 µl eines Puffers gelöst oder verdünnt, der hergestellt wird, indem ein Teil 1 M Tris-HCl, pH 8,5, der 4 mM EDTA enthält, und 3 Teile 8 M Guanidin HCl vermischt werden. 2,5 µl 10%iges wäßriges 2-Mercaptoethanol werden zugegeben und die Mischung wird bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Argon 2 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation werden 2 µl 4-Vinylpyridin (frisches Reagenz, aufbewahrt unter Argon bei -20ºC) zugegeben und die Mischung wird weitere 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in Dunkeln unter Argon inkubiert. Die Mischung wird dann entsalzt, bevorzugt durch Chromatographie auf einer kurzen Reverse Phase-Säule. Das gewonnene alkylierte Polypeptid wird dann nach bekannten Methoden sequenziert.
- Mit dem Vorteil der hier im Hinblick auf das Peptid, das in der Fraktion J&sub2; des Giftes von Agelenopsis aperta vorhanden ist, gegebenen Offenbarung ist es nun möglich, das Peptid mit anderen Methoden als durch Isolierung/Reinigung aus dem gesamten Gift zu erhalten. Die Polypeptide der Erfindung können hergestellt werden unter Verwendung von Gentechnik durch die Klonierung einer kodierenden Sequenz für die Polypeptide oder Teile davon. Zum Beispiel können Hybridisierungssonden, bei denen die nun bekannte Information über die Aminosäuresequenz des Polypeptids vorteilhaft eingesetzt werden kann, angewendet werden in den dem Fachmann wohlbekannten Methoden, um eine kodierende Sequenz für das gesamte Polypeptid zu klonieren. Eine Kombination aus rekombinanten DNA-Techniken und in vitro Proteinsynthese kann auch angewendet werden, um die erfindungsgemäßen Polypeptide herzustellen. Solche in vitro Protein-Synthesemethoden schließen die Verwendung eines ABI 430A-Festphasenpeptid-Syntheseautomaten (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, Kalifornien 94404) unter Anwendung der Standard-Merrifield-Chemie oder einer anderen, dem Fachmann wohlbekannten Festphasen- Chemie ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
- Es ist im Stand der Technik wohlbekannt, daß bestimmte Aminosäure-Substitutionen bei Polypeptiden gemacht werden können, die die Funktion der Polypeptide nicht oder nicht wesentlich beeinflussen. Die genauen Substitutionen, die möglich sind, variieren von Polypeptid zu Polypeptid. Die Bestimmung zulässiger Substitutionen wird mit dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Verfahren erreicht. Daher liegen alle Polypeptide mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz und im wesentlichen der gleichen Calciumkanal blockierenden Aktivität im Schutzbereich der Erfindung.
- Die erfindungsgemäßen Polypeptide blockieren Calciumkanäle, die in einer Vielzahl von Zellen vorhanden sind, z.B. Zellen des Nerven- und Muskelsystems von wirbellosen Tieren und Wirbeltieren.
- Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide, Calciumkanäle zu blockieren, wird mit dem folgenden Verfahren gezeigt. Kleinhirn-Zellgranula werden aus dem Kleinhirn von 8 Tage alten Ratten (Wilkin et al., Brain Res. 115, 181-199, 1976) präpariert. Quadrate (1 cm²) aus Aclar (Proplastics Inc., 5033 Industrial Ave., Wall, NJ 07719) werden mit Poly-L-Lysin beschichtet und in Schälchen mit 12 Näpfen gegeben, die 1 ml Eagles-Basalmedium enthalten. Die Zellen werden getrennt und Aliquots, die 6,25 x 10&sup6; Zellen enthalten, werden jedem Napf, der die Aclar-Quadrate enthält, zugegeben.
- Cytosin-beta-D-arabinofuranosid (Endkonzentration 10 µM) wird 24 Stunden nach dem Plattieren zugegeben. Die Zellen werden für eine fura2-Analyse an den Tagen 6, 7 und 8 der Kultur verwendet. Die Zellen (gebunden an die Aclar-Quadrate) werden in Schälchen mit 12 Näpfen überführt, die 1 ml 2 µM fura2/AM (Molecular Probes Inc., Eugene, OR 97402) in HEPES-Fuffer (der 0,01 % Rinderserumalbumin, 0,01 % Dextrose, pH 7,4, magnesiumfrei) enthält, überführt. Die Zellen werden 40 Minuten bei 37ºC inkubiert, der fura2/AM-haltige Puffer wird entfernt und durch 1 ml des gleichen Puffers ohne fura2/AM ersetzt. In eine Quarzküvette werden 2,0 ml vorgewärmter (37ºC) Puffer gegeben. Die Zellen auf Aclar werden in die Küvette gegeben und die Küvette wird in einen thermostatisierten (37ºC) Halter eingesetzt, der mit einem Magnetrührer ausgestattet ist, und die Fluoreszenz wird mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer (Biomedical Instrument Group, Universität von Pennsylvania) gemessen. Das Fluoreszenzsignal wird etwa 2 Minuten lang sich stabilisieren gelassen. Dann werden 5 bis 20 µl einer Vorratslösung der zu untersuchenden Verbindung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) in einer geeigneten Konzentration der Küvette zugegeben. Die Kalibrierung der Fluoreszenzsignale und der fura2/AM-Streukorrektur wird durchgeführt unter Verwendung der eingeführten Verfahren von Nemeth et al., J. Biol. Chem., 262, 5188 (1987) am Ende jedes Tests. Der maximale Fluoreszenzwert (Fmax) wird bestimmt durch Zugabe von Ionomycin (35 µM) und der minimale Fluoreszenzwert (Fmin) wird bestimmt durch anschließende Zugabe von EGTA (12 mM) um Calcium zu komplexieren. Unter Anwendung des vorhergehenden Verfahrens wird gezeigt, ob die Calcium-Kanalblockierung bei einem entsprechenden Polypeptid auftritt, wenn die Fluoreszenz bei Zugabe des jeweiligen Polypeptids abnimmt. Das Polypeptid der Erfindung hat niedrige IC&sub5;&sub0;-Werte, unter 200 nM, zur Blockierung der Calciumkanäle, wenn dieser Test verwendet wird. Zum Vergleich haben zwei bekannte im Handel erhältliche Calciumkanal-Antagonisten, Nifedipin und Verapamil, IC&sub5;&sub0;-Werte von 33 nM bzw. 4800 nM.
- Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind nützlich als Calciumkanal-Blockierer in Zellen an sich. Als solche sind diese Polypeptide auch nützlich zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen bei Säugetieren, die durch Calciumkanal-Funktionen in Zellen vermittelt werden, z.B. Angina, Bluthochdruck, Kardiomyopathien, supraventrikuläre Arrythmien, Ösophogusachalasie, vorzeitige Wehen und Raynaud-Krankheit. Außerdem sind diese Polypeptide nützlich zur Untersuchung der Physiologie von Zellen, einschließlich von Zellen des Nerven- und Muskelsystems, ohne darauf beschränkt zu sein.
- Im Schutzbereich der Erfindung liegen auch pharmazeutisch annehmbare Salze der erfindungsgemäßen Polypeptide. Solche Salze werden mit dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannten Methoden gebildet. Zum Beispiel können basische Salze der Polypeptide mit üblichen Methoden hergestellt werden.
- Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid an ein Säugetier verabreicht werden soll, kann es allein oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln in einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß pharmazeutischer Standard-Praxis verabreicht werden. Die Polypeptide können oral oder parenteral verabreicht werden, wobei der parenterale Verabreichungsweg für Polypeptide bevorzugt ist. Die parenterale Verabreichung schließt die intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane und topische Verabreichung ein.
- Für die orale Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids kann die Verbindung z.B. in Form von Tabletten oder Kapseln oder als wäßrige Lösung oder Suspension verabreicht werden.
- Im Fall von Tabletten für die orale Verwendung schließen Träger, die üblicherweise verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein und Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, werden üblicherweise zugegeben. Für die orale Verabreichung in Kapselforn sind nützliche Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke. Wenn wäßrige Suspensionen für die orale Verwendung erforderlich sind, wird der aktive Inhaltsstoff mit Emulsions- und Suspensionsmitteln vereinigt. Falls erwünscht, können Süßstoffe und/oder Aromastoffe zugegeben werden.
- Für die intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane und intravenöse Verwendung werden gewöhnlich sterile Lösungen des aktiven Inhaltsstoffs hergestellt und der pH der Lösungen sollte geeigneterweise eingestellt und gepuffert werden. Für die intravenöse Verwendung sollte die Gesamt-Konzentration der gelösten Stoffe kontrolliert werden, um das Präparat isotonisch zu machen.
- Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon für einen Menschen verwendet wird, wird die tägliche Dosierung normalerweise durch den verschreibenden Arzt bestimmt. Außerdem wird die Dosierung nach Alter, Gewicht und Ansprechvermögen des einzelnen Patienten variieren, ebenso wie mit der Schwere der Symptome des Patienten und der Wirksamkeit der jeweilig verabreichten Verbindung.
- Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon zur Bekämpfung von wirbellosen Schädlingen verwendet wird, wird das Polypeptid direkt an die wirbellosen Tiere verabreicht oder der Umgebung der wirbellosen Tiere zugeführt. Zum Beispiel kann eine Verbindung der Erfindung als Lösung auf die wirbellosen Tiere aufgesprüht werden. Die zur Bekämpfung der Wirbellosen notwendige Menge der Verbindung variiert abhängig von dem wirbellosen Tier und den Umgebungsbedingungen und wird von der die Verbindung anwendenden Person bestimmt.
- Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Salz davon zur physiologischen Untersuchung von Zellen verwendet wird, wird das Polypeptid den Zellen mit dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Methoden zugeführt. Zum Beispiel kann das Polypeptid den Zellen in einem geeigneten physiologischen Puffer zugeführt werden. Eine geeignete Konzentration eines erfindungsgemäßen Polypeptids für die Verwendung in solchen Untersuchungen ist 200 µM. Jedoch kann die Konzentration des Polypeptids in solchen Untersuchungen größer oder viel kleiner als 200 µM sein. Die Menge des zu verabreichenden Polypeptids wird vom Fachmann mit wohlbekannten Methoden bestimmt.
- a. Rohes Agelenopsis aperta-Gift ( 40 µl) wurde auf eine Reverse Phase HPLC-Säule (VYDAC C-18, 300 Å, 22 x 250 mm) aufgetragen, die unter Verwendung eines biphasischen linearen Gradienten-Programms von 95 % A und 5 % B bis 80 % A und 20 % B 30 Minuten lang, dann 30 % A und 70 % B 25 Minuten lang betrieben wurde (A = 0,1 % Trifluoressigsäure und B = CH&sub3;CN), wobei bei 220 nm detektiert wurde und bei einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute. Die gewünschte Fraktion wurde nach 38,3 bis 38,7 Minuten gesammelt. Gepoolte gleiche Fraktionen aus einzelnen Durchläufen wurden durch Lyophilisierung eingeengt.
- B. Das Material aus der Fraktionierung von Stufe A, oben, das aus 100 µl rohem Gift stammte, wurde auf eine Reverse Phase-HPLC-Säule aufgetragen (Vydac , C-18, 300 Å, 22 x 250 mm), die unter Verwendung eines linearen Gradienten- Programms von 77 % A und 23 % B bis 70 % A und 30 % B 25 Minuten lang betrieben wurde (A = 0,1 % Trifluoressigsäure und B = CH&sub3;CN), wobei bei 220 nm detektiert wurde und bei einer Druckflußrate von 12 ml pro Minute. Die gewünschte Fraktion wurde nach 17,3 bis 17,7 Minuten gesammelt. Gepoolte gleiche Fraktionen aus einzelnen Durchläufen wurden durch Lyophilisierung eingeengt
- Die Struktur des Peptids J&sub2; wurde mit den folgenden Methoden bestimmt und verifiziert. Eine PTC-Aminosäureanalyse wurde 3fach an 1 bis 10 nmol durchgeführt unter Verwendung des Waters Pico-Tag-Systems. Die N-terminale Sequenzierung wurde durchgeführt an einem Puls-Flüssigkeits-Sequenator (ABI), sowohl an dem nativen als auch an dem reduzierten/pyridylethylierten Peptid. Die Primärstruktur des Polypeptids wurde erhalten unter Verwendung eines automatisierten gepulsten Flüssigkeits-Sequenz-Automaten (Applied Biosystems, Modell 473A). Die Daten der Massen-Spektralanalyse wurden erhalten an einem BIO-ION-Plasma-Desorptions-Laufzeitmassenspektrometer.
- Ein pyridylethyliertes Derivat des Peptids J&sub2;, das für die N-terminale Sequenzierung geeignet war, wurde auffolgende Weise hergestellt. Peptid J&sub2; (50 mg) wurde in 10 µl Puffer (Verhältnis 1:3 von 1 M Tris, pH 8,4, 4 µM EDTA-dibasisch und 8 M Guanidinhydrochlond) gelöst und mit 2 µl einer 0,454 M (10 % V/V) Lösung von 2-Mercaptoethanol in Puffer versetzt und drei Stunden in Dunkeln auf Raumtemperatur gehalten. Die Reaktionsmischung wurde dann mit 2 µl einer 0,456 M Lösung von 4-Vinylpyridin in Puffer versetzt und im Dunkeln 18 Stunden lang auf Raumtemperatur gehalten. Die Reaktionsmischung wurde mit 90 µl Wasser und 40 µl Acetonitril verdünnt und auf eine HPLC-Säule (Baker WPC-18, 4,6 x 250 mm) aufgetragen, die unter Verwendung eines biphasischen linearen Gradienten-Programms von 80 % A und 20 % B 5 Minuten lang und anschließend 80 bis 50 % A und 29 bis 50 % B 30 Minuten lang betrieben wurde (A = 0,1 % Trifluoressigsäure, B = CH&sub3;CN), wobei bei 220 nm detektiert wurde und bei einer Durchflußrate von 1,0 ml pro Minute. Die gewünschte Fraktion wurde nach 20,8 bis 21,3 Minuten gesammelt und durch Lyophilisierung eingeengt.
- Die Daten bestätigen zusammen die Struktur des Peptids J&sub2;, wie unten gezeigt.
- SEQ ID Nr. 1, 48 Reste, 10 Cysteine, 5 Disulfid-Bindungen.
- Berechnete Masse = 5474,4.
- Beobachtete Masse = 5474.
- Geschätzter pI = 7,98.
Claims (5)
1. Im wesentlichen reines Polypeptid mit der
Aminosäuresequenz
oder ein Polypeptid, wie oben definiert, worin bestimmte
Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind, ohne
die Calciumkanal blockierende Aktivität dieses
Polypeptids zu beeinflussen, oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz davon.
2. Im wesentlichen reines Polypeptid mit der in Anspruch 1
definierten Aminosäuresequenz oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz davon.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid
nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zusammen mit einem
pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger.
4. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder
Anspruch 2, um Calciumkanäle in Zellen zu blockieren,
und zur Behandlung von durch Calciumkanäle vermittelte
Krankheiten bei einem Säugetier.
5. Verwendung nach Anspruch 4, worin die Zellen im
Nervensystem eines Säugetiers sind.
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