SK10022002A3 - Farmaceutický prostriedok a jeho použitie - Google Patents

Description

Tento vynález sa týka farmaceutického prípravku. Konkrétne sa tento vynález týka farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje istú zlúčeninu v množstve, ktoré poskytuje dávku, ktorá nie je väčšia než 200 pg/deň. Touto zlúčeninou je cyklická zlúčenina, ktorá obsahuje kruhový systém a sulfamátovú skupinu. Tento vynález sa tiež týka použitia tohto prípravku pri terapeutických aplikáciách.

Doterajší stav techniky

Estrogény hrajú hlavnú úlohu pri hormonálnej antikoncepcii, pri menopauzovej hormonálnej substitučnej terapii (HST) a pri liečení gynekologických chorôb (napríklad rakovina prsníka) a andrologických chorôb (napríklad rakovina prostaty). Pri HST a antikoncepcii sa estrogény používajú hlavne spolu s gestagénom, napríklad ako je levonorgestrel, desogestrel, noretisterón, cyproterón acetát, chlormadinón acetát, dienogest.

Keď sa používajú pri antikoncepcii, sú estrogény potrebné na bezpečné potlačenie dozrievania folikuiu a ovulácie, ale okrem toho nahradzujú endogénnu vaječníkovú sekréciu estradiolu, ktorá je vo veľkom rozsahu potlačená. Toto nahradenie je dôležité na udržanie umelého menštruačného cyklu a iných pohlavných funkcií, čo by sa nedalo dosiahnuť v dostatočnom rozsahu len pomocou použitia gestagénu. '

Okrem toho vykonávajú endogénne a exogénne estrogény dôležité funkcie centrálneho nervového systému a metabolické funkcie ženského organizmu: normálne estrogénové hladiny tvoria rozhodujúci príspevok k dobrej pohode ženy. Ich prítomnosť v systéme pôsobí proti rozvoju kardiovaskulárnych chorôb pomocou rôznych mechanizmov; generovaním „priaznivého lipoproteínového obrazu v krvi, inhibíciou ukladania lipidov na stenách krvných ciev, zníženie tlaku krvi pomocou priaznivého ovplyvnenia cievneho tonusu, zníženie perfúznej odolnosti v esenciálnych vaskulárnych sektoroch, zoslabenie kontraktilných podnetov vo

-2vaskulárnych svaloch. Vnútorná vrstva cievnej steny, keď je ovplyvnená pomocou estragónov, uvoľňuje faktory, ktoré pôsobia proti tvorbe trombov. Estragóny sú tiež nepostrádateľné na ochranu štruktúry kostí u žien. Ich neprítomnosť môže viesť k deštrukcii kostí (osteoporóza). Tieto posledne uvedené centrálne nervové a metabolické účinky estragónov sú hlavným aspektom HST. Môže sa uvažovať, že estragóny majú analogické funkcie v mužskom organizme a že ich úbytok vedie k podobným poruchám ako u žien. Rozdiel medzi pohlaviami je v tom, že produkcia hormónov u mužov prestáva menej pravidelne a v neskoršom veku než u žien.

Ale napriek všetkým pozitívnym aspektom estrogénovej terapie existujú tiež nevyriešené problémy, ktoré obmedzujú terapeutické použitie estragónov, alebo spôsobujú nežiadúce účinky.

Známe estragóny vykazujú farmakokinetické nedostatky. Prirodzené estragóny (estradiol, estrón, estrón sulfát, estery estradiolu, estriol), ked sa berú orálne, stávajú sa biodostupné len vo veľmi nízkom stupni. Tento stupeň sa môže meniť od osoby k osobe tak veľmi, že nemôžu byť dané všeobecné dávkové odporúčania. Rýchle odstránenie týchto látok z krvi je ďalším problémom. Nahrádzanie estragónov pri HST často musí byť nastavené individuálne.

To isté platí pre syntetické estragóny. Najdôležitejší synteticky zmenený estrogénový steroid je etinyl-estradiol (EE). Tento estragón je dominantný pri orálnej hormonálnej antikoncepcii. Okrem EE sa v malom počte prípadov používa mestranol; je to prekurzor, ktorý sa v organizme metabolizuje na EE. Keď sa aplikuje orálne ľuďom, má EE oveľa lepšiu biodostupnosť ako prirodzené estragóny zmienené vyššie, ale jeho orálna biodostupnosť sa mení vo veľkom rozsahu od jedinca k jedincovi. Toto uvádzajú viacerí autori ako aj fakt, že koncentrácie zistené v krvi, sú po orálnej aplikácii tejto látky veľmi nepravidelné (Goldzieher, J. W. 1989, Goldzieher, J.W. 1990, Humpel, M. 1987, Kuhnz, 1993).

Okrem toho známe estragóny vykazujú farmakodynamické nedostatky. Po resorpcii z intestinálneho lúmenu orálne aplikované aktívne zložky vstupujú do organizmu cez pečeň. Tento fakt má špecifický význam pre estrogénové činidlá, pretože pečeň je cieľový orgán pre estragóny; orálny príjem estragónov spôsobuje silné estrogénové účinky na pečeň. Sekrečná aktivita, ktorá je riadená pomocou estragónov v ľudskej pečeni zahrnuje syntézu prenosových proteínov CBG, SHBG,

-3TBG, angiotenzinogénu, viacerých faktorov, ktoré sú dôležité pre fyziológiu zrážania krvi, a lipoproteínov. Ak sú prirodzené estrogény zavedené do organizmu žien, pričom sa vynechá prechod cez pečeň (napríklad pomocou transdermálnej aplikácie), zmienené funkcie pečene zostávajú virtuálne nezmenené. Terapeuticky ekvivalentné dávky prirodzených estrogénov (pozri definíciu uvedenú vyššie), keď sa aplikujú orálne, spôsobia jasnú odozvu hepatických parametrov: vzrast SHRO, CBG, angiotenzinogénu, HDL (lipoproteín s vysokou hustotou). Tieto hepatické účinky estrogénov sú jasne silnejšie vtedy, keď sa namiesto prirodzených estrogénov používajú konské estrogénové prípravky (takzvané konjugované estrogény) (Campbell, S: a spol., 1981). Etinyl-estradiol a DES majú ešte väčšiu hepatickú estrogénicitu.

Vzhľadom na antigonadotropné vlastnosti je EE asi 4 až 18 krát v pečeni estrogénovejší, než sú orálne aplikované prirodzené estrogény (Campbell, S. a spol., 1981). To je veľmi nepriaznivé rozloženie vlastností.

Tieto nedostatky majú značný klinický význam vtedy, keď sa majú aplikovať známe prirodzené a syntetické estrogény.

Známou komplikáciou, ktorá sa môže vyskytnúť po aplikovaní vysokej dávky estrogénov mužom trpiacim rakovinou prostaty, je fatálna tvorba trombov v žilách. Schopnosť EE spôsobiť vedľajšie účinky v pečeni určuje, hoci v trochu oslabenej forme, stratégiu orálnej hormonálnej antikoncepcie. Vzhľadom na požadované antikoncepčné účinky a udržanie menštruačného procesu na jednej strane, a potrebu brať do úvahy potenciál pre značné vedľajšie účinky na druhej strane, riadenie EE hladiny v krvi môže byť porovnávané s chodením po lane. Je dosť pravdepodobné, , že veľké percento žien nemôže používať orálne antikoncepčné prostriedky, buď pre abnormálne menštruačné krvácanie alebo pre vedľajšie účinky presahujúce tolerančný prah spojené s estragónmi.

Existujú dôkazy, ktoré potvrdzujú, že estrogény sú hlavné mitogény zahrnuté v podpore rastu tumorov v endokrinne-závislých tkanivách, ako napríklad prsníkoch a sliznici maternice. Hoci plazmové estrogénové koncentrácie sú podobné u žien s rakovinou prsníka alebo bez nej, estrónové a estradiolové hladiny tumoru prsníka sú významne vyššie než v normálnom tkanive prsníka alebo v krvi. Uvažuje sa, že in situ syntéza estrogénov tvorí dôležitý príspevok ku vysokej

-4hladine estrogénov v tumoroch a preto inhibítory, konkrétne špecifické inhibítory, estrogénovej biosyntézy, majú potenciálnu hodnotu pri liečení endokrinne-závislých tumorov.

Počas uplynulých dvoch dekád bol značný záujem o rozvoj inhibítorov aromatázového mechanizmu, ktorý konvertuje androgénový prekurzor androstendión na estrón. Teraz však existuje dôkaz, že estrón-sulfatázový (E1-STS) mechanizmus, t.j. hydrolýza estrón-sulfátu na estrón (E1S na E1), ako náprotivok ku aromatázovému mechanizmu, je hlavný zdroj estragónu v tumoroch prsníka. Táto teória je podporovaná miernym znížením plazmovej estrogénovej koncentrácie u žien v postmenopauze s rakovinou prsníka liečených pomocou aromatázových inhibítorov, ako napríklad aminoglutetimid a 4-hydroxyandrostendión, a tiež skutočnosťou, že plazmová E1S koncentrácia u týchto aromatázovými inhibítormi liečených pacientov zostáva relatívne vysoká. Dlhý polčas rozpadu E1S v krvi (10 až 12 hodín) v porovnaní s nekonjugovanými estragónmi (20 minút) a vysoké hladiny steroid-sulfatázovej aktivity v pečeni a normálnych a malignantných tkanivách prsníka tiež podporujú túto teóriu.

PCT/GB92/01587 ukazuje nové inhibítory steroid-sulfatázy a farmaceutické prípravky, ktoré ich obsahujú, určené na použitie pri liečení od estrónu závislých tumorov, zvlášť rakoviny prsníka. Tieto inhibítory steroid-sulfatázy sú sulfamátové estery, ako napríklad A/,/\/-dimetyl-estrón-3-sulfamát a výhodne estrón-3-sulfamát (inak známy ako látka ΈΜΑΤΕ). Ďalšie sulfamátové estery sú opísané v dokumentoch WO 96/05216 a WO 96/05217. Tieto sulfamátové estery zahrnujú estradiol-3-sulfamát (označovaný v tomto dokumente ako J995).

EMATE (estrón-3-O-sulfamát) - má nasledujúci vzorec

Je známe, že látka EMATE je silný E1-STS inhibitor, pretože vykazuje viac než 99% inhibíciu E1-STS aktivity pri intaktných MCF-7 bunkách pri koncentrácii

-50,1 mmol/l. Látka EMATE tiež inhibuje E1-STS enzým časovo- a koncentračnezávislým spôsobom, čo naznačuje, že pôsobí ako aktívny miestne smerovaný inaktivátor. Hoci látka EMATE bola pôvodne určená na inhibíciu E1-STS, tiež inhibuje dehydroepíandrosterón-sulfatázu (DHA-STS), ktorá je enzýmom považovaný za enzým, ktorý má vedúcu úlohu pri regulovaní biosyntézy estrogénového steroidného androsténdiolu. Teraz tiež existuje dôkaz, ktorý podporuje to, že androsténdiol môže mať ešte väčší význam ako aktivátor rastu tumoru prsníka. Látka EMATE je tiež aktívna in vivo pre takmer úplnú inhibíciu aktivít pečene potkana E1-STS (99 %) a DHA-STS (99 %) v dôsledku toho, že sa podáva buď orálne alebo subkutánne. Okrem toho sa ukázalo, že látka EMATE má u potkanov účinky na zlepšenie pamäti. Štúdie na myšiach potvrdili spojenie medzi DHA-STS aktivitou a reguláciou časti imunitnej odozvy. Existuje domnienka, že sa to môže tiež vyskytnúť u ľudí. Môstikový O-atóm sulfamátovej skupiny v látke EMATE je dôležitý pre inhibičnú aktivitu. Teda, keď sa 3-O-atóm nahradí inými heteroatómami, ako v estrón-3-A/-sulfamáte a estrón-3-S-sulfamáte, tieto analógy sú slabšie časovo-nezávislé inaktivátory.

Hoci optimálna schopnosť inhibície E1-STS sa môže dosiahnúť u látky EMATE, je možné, že estrón sa môže uvoľniť počas inhibície sulfatázy a že látka EMATE a jej estradiolová obdoba môže mať estrogénovú aktivitu.

Ahmed a spol. (Biochem Biophys Res Commun 1999 Jan 27; 254(3): 811 5) uvádzajú štúdiu vzťahu štruktúra - aktivita u steroidných a nesteroidných inhibítorov STS.

Preto je cieľom tohto vynálezu poskytnúť nové prípravky vhodné na orálnu antikoncepciu, hormonálnu substitučnú terapiu, inhibíciu E1-STS, ako aj na iné terapeutické aplikácie.

Podstata vynálezu

Tento vynález je založený na prekvapivom zistení, že prípravky poskytujúce cyklickú zlúčeninu, kde táto cyklická zlúčenina obsahuje kruhový systém a sulfamátovú skupinu (sulfamátová zlúčenina), v množstve, ktoré poskytuje dávku, ktorá nie je väčšia než 200 gg/deň, môžu poskytnúť orálnu antikoncepciu,

-6hormonálnu substitučnú terapiu a/alebo inhibíciu E1-STS. Pri dávke poskytovanej prípravkom podľa tohto vynálezu, dodávané zlúčeniny vykazujú priaznivejší vzťah medzi požadovanými a terapeuticky nežiadúcimi účinkami.

Sulfamátové zlúčeniny obsahujú najmenej jednu kruhovú zložku. Táto kruhová zložka obsahuje najmenej 4 atómy v kruhu. Typicky budú týmito 4 atómami uhlíkové atómy. Teda typicky touto kruhovou zložkou bude hyd roka rbylová skupina. Táto cyklická zlúčenina tiež zahrnuje sulfamátovú skupinu ako ďalší substituent(ty) na kruhovom systéme. Sulfamátová skupina je substltuent na kruhovej zložke.

Podstatou vynálezu je teda farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje (i) zlúčeninu všeobecného vzorca I

kde X je hydrokarbylový kruh, ktorý má najmenej 4 atómy v kruhu; K je hydrokarbylová skupina; R^s je sulfamátová skupina;

(ii) voliteľne zmiešanú s farmaceutický prijateľným nosičom, zrieďovadlom, vehikulom alebo adjuvansom, kde zlúčenina je prítomná v množstve poskytujúcom dávku, ktorá nie je väčšia než 200 pg/deň.

V alternatívnom uskutočnení tento vynález poskytuje farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje zlúčeninu, kde zlúčenina je prítomná vtákom množstve, že zlúčenina opísaná vyššie alebo jej metabolit je poskytovaný do krvnej plazmy liečeného subjektu v množstve, ktoré nie je väčšie než 200 pg/deň.

Vyššie uvedené maximálne dávky a všetky dávky uvádzané v tomto opise vynálezu sa vzťahujú na dávku pre 70 kg subjekt, ak to nie je vyznačené inak. Osoby skúsené v tomto odbore techniky by mali byť ľahko schopné modifikovať uvedené dávky pre subjekt, ktorý má hmotnosť inú než 70 kg.

Dávka na deň je vypočítaná pomocou rozdelenia dávky podávanej subjektu počas predpokladanej dávkovej periódy za deň. Predpokladaná dávková perióda bude typicky perióda pred ďalším podávaním, perióda, počas ktorej má dávka účinok alebo perióda, počas ktorej sa požaduje, aby dávka mala účinok.

Ďalej vynález poskytuje prípravok podľa tohto vynálezu na použitie v

-Ί medicíne.

Ešte ďalej vynález poskytuje použitie prípravku podľa tohto vynálezu na výrobu liekov určených na použitie v orálnej antikoncepcii.

Ďalej vynález poskytuje použitie prípravku podľa tohto vynálezu na výrobu .1 liekov určených na použitie v hormonálnej substitučnej terapii.

Ďalej vynález poskytuje použitie prípravku podľa tohto vynálezu na výrobu liekov určených na použitie v terapii stavov alebo chorôb spojených s STS.

Ďalej vynález poskytuje použitie zlúčeniny podľa tohto vynálezu na výrobu liekov určených na použitie v terapii stavov alebo chorôb spojených s nepriaznivými STS hladinami.

Ďalej vynález poskytuje spôsob liečenia subjektu, ktorý obsahuje podávanie tomuto subjektu zlúčeniny podľa tohto vynálezu v množstve, ktoré nie je väčšie než 200 pg/deň.

Na ľahké posúdenie sú tieto a ďalšie aspekty tohto vynálezu teraz diskutované v príslušne označených sekciách. Vysvetlenia v týchto sekciách však nie sú nevyhnutne obmedzené na konkrétnu sekciu.

Výhodné uskutočnenia vynálezu

Výhodne je zlúčenina prítomná v prípravku v takom množstve, ktoré poskytne dávku od 10 do 200 pg/deň.

Výhodne je zlúčenina prítomná v prípravku v takom množstve, ktoré poskytne dávku od 50 do 200 pg/deň.

Výhodne je zlúčenina . prítomná v prípravku v takom množstve, ktoré poskytne dávku od 20 do 50 pg/deň.

' ^{1 1}

V ďalšom uskutočnení je táto zlúčenina prítomná v prípravku v takom množstve, ktoré poskytne dávku, ktorá nie je väčšia alebo menej než 100 μg/deň.

Tento prípravok môže byť pripravený tak, že podávanie denne, týždenne alebo mesačne bude poskytovať požadovanú dennú dávku. Napríklad, tento vynález môže poskytovať farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje sulfamátovú zlúčeninu v množstve, ktoré nie je väčšie ako 200 pg/dávka (pre dennú dávku), nie väčšie než 1,4 mg/dávka (týždenná dávka) alebo nie väčšie než 5 mg/dávka

-8(mesačná dávka). Možno si všimnúť, že tento farmaceutický prípravok môže tiež byť upravený na podávanie viac alebo menej často než denne, týždenne alebo mesačne.

Výhodne X v kombinácii s K napodobuje steroidnú štruktúru.

Výhodne je K cyklická skupina.

Výhodne je X šesťčlenný kruh.

Výhodne má kruh X šesť uhlíkových atómov v kruhu.

Výhodne má zlúčenina všeobecného vzorca I vzorec uvádzaný ako vzorec

II, kde každý z R^s, X a K má vyššie zmienený význam.

(N)

Výhodne budú skupina K a kruh X spolu obsahovať, včítane všetkých substituentov, maximálne asi 50 uhlíkových atómov, obvyklejšie nie viac než asi 30 až 40 uhlíkových atómov.

Výhodne je X v kombinácii s K steroidnou kruhovou štruktúrou.

Výhodne sú skupina K a kruh X steroidnou kruhovou štruktúrou alebo jej substituovaným derivátom.

Výhodne je R^s skupina v polohe 3 kruhu X.

Výhodne je R^s je sulfamátová skupina.

Výhodne má zlúčenina všeobecný vzorec III

kde X, K a R^s sú určené vyššie; a kde R^h1 je voliteľná halogénová skupina; R^h2 je voliteľná halogénová skupina; prítomná je najmenej jedna z R^h1 a R^h2.

Výhodne je R^h1 v polohe 2 kruhu X.

Výhodne je R^h2 v polohe 4 kruhu X.

-9Pre niektoré aplikácie výhodne nemajú zlúčeniny žiaden alebo minimálny estrogénový účinok.

Pre niektoré aplikácie výhodne tieto zlúčeniny majú estrogénový účinok.

V jednom uskutočnení sú farmaceutické prípravky podľa tohto vynálezu užitočné pri liečení rakoviny prsníka.

Niektoré výhody

Kľúčové výhody tohto vynálezu zahrnujú zlepšenú farmakokinetiku a farmakodynamiku farmaceutického prípravku podľa tohto vynálezu.

Jedna kľúčová výhoda tohto vynálezu je v tom, že pri podávanej dávke majú sulfamátové zlúčeniny nízky hepatický metabolizmus. Predpokladá sa, že zlúčeniny podľa tohto vynálezu, ako napríklad látka EMATE a J995, majú vysokú afinitu ku erytrocytom, až do 99 % zlúčeniny v krvi je viazané. Prechod zlúčeniny pečeňou v tomto úseku bráni extrakcii, metabolizmu a hepatickému prvotnému účinku. Teda dodávané sulfamátové zlúčeniny majú a vysokú biodostupnosť.

Ďalšia kľúčová výhoda tohto vynálezu je v tom, že sulfamátové zlúčeniny vykazujú nízke rozdiely v koncentráciách v plazme medzi jednotlivcami. Zníženie rozdielov medzi jednotlivcami v estrogénových hladinách v krvi zvlášť umožňuje používanie monoproduktu aj pre hysterektomizované aj nehysterektomizované subjekty bez potreby vývoja zvláštnych produktov.

Ďalšia kľúčová výhoda tohto vynálezu je v tom, že sulfamátové zlúčeniny vykazujú pomalé vylúčenie zo subjektu. Farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu poskytuje stále plazmové hladiny estrónu (E1) a estradiolu (E2).

Jedna z kľúčových výhod tohto vynálezu je v tom, že pri podávanej dávke majú sulfamátové zlúčeniny nízke hormonálne pôsobenie. Preto je riziko hlbokej žilnej trombózy znížené.

Jedna z kľúčových výhod tohto vynálezu je v tom, že pri podávanej dávke sa poskytuje ochrana kostí, pričom dávka je ešte pod prahom proliferácie/stimulácie maternicovej sliznice. Ako je opísané vyššie, estrogény sú nepostrádateľné na ochranu kostnej štruktúry u žien. Ich neprítomnosť môže spôsobiť deštrukciu kostí (osteoporóza). Pri typickej HST sa však estrón podáva v takej dávke, že sa dosahujú aj priaznivé účinky, aj proliferuje sliznica maternice. Farmaceutický

-10prípravok podlá tohto vynálezu poskytujú hormonálnu substitučnú terapiu ochrany kostí bez stimulácie sliznice maternice.

Teda dálší aspekt tohto vynálezu poskytuje použitie zlúčeniny definovanej v tomto dokumente, výhodne farmaceutický prípravok definovaný v tomto dokumente, na výrobu liekov na ochranu kostí hormonálnou substitučnou terapiou bez stimulácie sliznice maternice.

Ďalšia výhoda je v tom, že farmaceutický prípravok môže byť pripravený bez začlenenia progestínov.

Ďalšia výhoda je v tom, že farmaceutický prípravok môže byť pripravený bez začlenenia gestagénov.

Ďalšia výhoda je v tom, že niektoré zo zlúčenín nemusia byť schopné metabolizovať sa na zlúčeniny, ktoré vykazujú alebo indukujú hormonálnu aktivitu.

Niektoré zo zlúčenín tohto vynálezu sú tiež výhodné tým, že môžu byť orálne aktívne.

Niektoré zo zlúčenín podľa tohto vynález môžu byť užitočné pri liečení rakoviny, ako je napríklad rakovina prsníka, ako aj (alebo v alternatíve) nemalígne stavy, ako napríklad prevenciu autoimunitných chorôb, zvlášť keď sa farmaceutiká majú podávať od skorého veku.

Niektoré zo zlúčenín podľa tohto vynálezu sa teda tiež považujú za také, že majú iné terapeutické použitie než pri liečení endokrinné závislých rakovín, ako je napríklad liečenie autoimunitných chorôb.

Hormonálna substitučná terapia

Farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu môže byť pripravený tak, že poskytne hormonálnu substitučnú terapiu. Farmaceutický prípravok bude pripiravený tak, aby obsahoval sulfamátovú zlúčeninu v takom množstve, že sa v závislosti od predpísanej frekvencie podávania poskytuje požadovaná denná dávka sulfamátovej zlúčeniny.

V jednom uskutočnení farmaceutický prípravok bude pripravený tak, že umožní denné podávanie. Táto farmaceutický prípravok môže byť pripravený v kombinácii s progestínmi.

Vo všetkých uskutočneniach tohto vynálezu, vrátane denného orálneho

-11 podávania, sa dosiahne hormonálna substitučná terapia spôsobom vhodnejším než aplikácia transdermálnou náplasťou, čo je typický spôsob podávania pri HST.

Denne

Ak sa používa denný režim, napríklad ak sa podáva 100 pg/deň, pozorujú sa zvlášť nasledujúce kľúčové výhody

- zníženie variácii estrogénových hladín v krvi subjektov medzi jednotlivcami

- stabilné plazmové hladiny E1 a E2.

Ak sa používa denný režim pri podávaní 20 až 50 gg/deň, zvlášť sa pozorujú nasledujúce kľúčové výhody:

- nepozoruje sa maternicové krvácanie

- nie je žiaden dopad na mliečne žľazy

Týždenne

Pri jedom aspekte bude farmaceutický prípravok pripravený tak, aby umožnil týždenné podávanie. Môže sa používať týždenná dávka 0,5 až 2 mg/týždeň, napríklad 1 mg/týždeň.

Týždenná dávka bude výhodná z dôvodu pohodlia aj oproti náplastiam aj oproti dennému podávaniu farmaceutického prípravku podľa tohto vynálezu.

Mesačne

Uvažuje sa aj o mesačnej HST farmaceutického prípravku podľa tohto vynálezu, v ktorom sa poskytuje jediná mesačná dávka zlúčeniny 2 až 4 mg, alebo aždo 5 mg/dávku.

» J

Ďalej sa farmaceutické prípravky, ktoré obsahujú zlúčeniny podľa tohto vynálezu, môžu používať na liečenie zápalu maternicovej sliznice a na terapiu estrogénovo-závislých tumorov. V tomto ohľade je kľúčová výhoda tohto vynálezu v tom, že sulfamátové zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu pôsobiť ako inhibítory steroid-sulfatázy.

Steroid-sulfatáza

Steroid-sulfatáza, ktorá sa niekedy označuje ako steroidná sulfatáza alebo

-12steryl-sulfatáza alebo skrátene STS“ - hydrolyzuje viaceré sulfatované steroidy, ako napríklad estrón-sulfát, dehydroepiandrosterón-sulfát a cholesterol-sulfát. STS má pridelené enzýmové číslo EC 3.1.6.2.

STS bola klonovaná a exprimovaná. Napríklad pozri Stein a spol. (J. Biol. Chem. 264:13865 -13872 (1959)) a Yen a spol. (Celí 49: 443 - 454 (1987)).

STS je enzým, ktorý bol priradený k početným chorobným stavom.

Napríklad, autori tohto vynálezu zistili, že úplný nedostatok STS spôsobuje ichtyózu. Podľa niektorých autorov je nedostatok STS značne rozšírený v Japonsku. Tí istí autori (Sakura a spol., J Inherit Metab Dis 1997 Nov; 20(6): 807 - 10) tiež uvádzajú, že alergické choroby - ako napríklad bronchiálna astma, alergická rinitída, alebo atopická dermatitída - môžu byť spojené s nedostatkom steroid-sulfatázy.

Okrem chorobných stavov, ktoré sú spôsobované úplným nedostatkom STS aktivity, zvýšená hladina STS aktivity môže tiež spôsobiť chorobné stavy. Ako príklad a ako je uvedené vyššie, existuje silný dôkaz podporujúci úlohu STS pri raste metastáz rakoviny prsníka.

STS sa tiež priraďuje k iným chorobným stavom. Napríklad Le Roy a spol. (Behav Genet 1999 marec; 29(2): 131 - 6) určili, že môže existovať genetická korelácia medzi koncentráciou steroid-sulfatázy a začatím útočného správania sa u myší. Autori uzatvárajú, že suifatácia steroidov môže byť hlavným činiteľom komplexnej siete (systému), vrátane génov uvádzaných ako tie, čo sa zúčastňujú pri agresii mutagenézou.

STS inhibícia

Predpokladá sa, že niektoré chorobné stavy spojené s STS aktivitou sú dôsledkom konverzie neaktívneho, sulfátovaného estrónu na aktívny, nesulfátovaný estrón. V chorobných stavoch spojených s STS aktivitou, by bolo žiadúce inhibovať STS aktivitu.

Pojem inhibovať v tomto dokumente zahrnuje zmenšenie a/alebo elimináciu a/alebo maskovanie a/alebo bránenie nepriaznivému pôsobeniu STS.

STS inhibítor

Podľa tohto vynálezu je zlúčenina podľa tohto vynálezu schopná pôsobiť

-13ako STS inhibítor.

Pojem „inhibítor, ako používa v tomto dokumente vzhľadom na zlúčeninu podľa tohto vynálezu, znamená zlúčeninu, ktorá môže inhibovať STS aktivitu - ako napríklad zmenšiť a/alebo eliminovať a/alebo maskovať a/alebo . brániť nepriaznivému pôsobeniu STS. STS inhibítor môže pôsobiť ako antagonistická látka.

Schopnosť týchto zlúčenín inhibovať estrón-sulfatázovú aktivitu môže byť vyhodnotená buď na intaktných MCF-7 bunkách rakoviny prsníka alebo na placentových mikrozómoch. Okrem toho sa môže použiť zvierací model. Detaily o vhodných skúšobných postupoch sú uvádzané v nasledujúcich sekciách. Treba poznamenať, že by sa mohli použiť áj iné skúšky na určenie STS aktivity a teda STS inhibície. Môže sa napríklad tiež uviesť odkaz na zistenia WO-A-99/50453.

Pre niektoré aplikácie je výhodne táto zlúčenina ďalej charakterizovaná tým, že ak je sulfamátová skupina substituovaná sulfátovou skupinou, čím sa tvorí sulfátový derivát, potom sulfátový derivát môže byť hydrolyzovateľný pomocou enzýmu, ktorý má steroid-sulfatázovú (E.C. 3.1.6.2) aktivitu - t.j. ked sa inkubuje so steroid-sulfatázou EC 3.1.6.2 pri pH 7,4 a 37 °C.

V jednom výhodnom uskutočnení, ak sa sulfamátová skupina tejto zlúčeniny nahrádza so sulfátovou skupinou, čím tvorí sulfátovú zlúčeninu, potom táto sulfátová zlúčenina môže byť hydrolyzovateľné pomocou enzýmu, ktorý má steroid-sulfatázovú (E.C. 3.1.6.2) aktivitu a môže poskytnúť Km hodnotu menej než 200 mmol/l,' výhodne menej než 150 mmol/l, výhodne menej než 100 mmol/l, výhodne menej než 75 mmol/l, výhodne menej než 50 mmol/l, keď sa inkubuje so steroid-sulfatázou EC 3.1.6.2 pri pH 7,4 a 37 °C.

Vo výhodnom uskutočnení nie je zlúčenina podľa tohto vynálezu hydrolyzovateľná pomocou enzýmu, ktorý má steroid-sulfatázovú (E.C. 3.1.6.2) aktivitu.

Pre niektoré aplikácie má výhodne zlúčenina podľa tohto vynálezu najmenej asi 100 násobnú selektivitu pre požadovaný cieľ (napríklad STS), výhodne najmenej asi 150 násobnú selektivitu pre požadovaný cieľ, výhodne najmenej asi 200 násobnú selektivitu pre požadovaný cieľ, výhodne najmenej asi 250 násobnú selektivitu pre požadovaný cieľ, výhodne najmenej asi 300 násobnú selektivitu pre požadovaný cieľ, výhodne najmenej asi 350 násobnú selektivitu pre požadovaný

-14cieľ.

Treba poznamenať, že zlúčenina podľa tohto vynálezu môže mať iné užitočné vlastnosti okrem svojej schopnosti inhibovať STS aktivitu alebo alternatívne k nej.

Skupina K

Skupina K by nemala mať cyklickú štruktúru. V tomto zmysle môže skupina K byť lineárna štruktúra, ktorá môže mať schopnosť tvoriť kruhu podobnú štruktúru, keď je in vivo.

Vo výhodnom uskutočnení je skupina K cyklická - čím tvorí cyklickú skupinu K.

Cyklická skupina K nemusí nevyhnutne byť kondenzovaná na kruh X. Z tohto hľadiska, môže byť oddelená pomocou vhodnej oddeľovacej skupiny ktorou môže byť hydrokarbylová skupina.

Vo výhodnom uskutočnení je cyklická skupina K kondenzovaná na kruh X.

Skupinou K môže byť polycyklická skupina, ktorou nemusí byť kondenzovaný polycyklus.

Teda vo výhodnom uskutočnení skupina K a kruh X vytvárajú polycyklickú zlúčeninu. Ako je uvedené v tomto dokumente, pojem „polycyklická“ zahrnuje kondenzovanú a nekondenzovanú kruhovú štruktúru vrátane ich kombinácií.

Najmenej jedna cyklická skupina K a X môže byť heterocyklická skupina (heterocyklus) alebo neheterocyklická skupina.

Najmenej jedna cyklická skupina K a X môže mať nasýtenú kruhovú štruktúru alebo nenasýtenú kruhovú štruktúru (ako napríklad arylová skupina).

Výhodne je najmenej jedna z cyklických skupín arylový kruh.

Ak cyklická skupina je polycyklická, niektoré alebo všetky kruhové zložky tejto zlúčeniny môžu byť spolu kondenzované alebo môžu byť spojené pomocou jednej alebo viacerých vhodných oddeľovacích skupín.

Polycyklická zlúčenina môže obsahovať početné kondenzované kruhy.

V tomto aspekte kondenzované kruhy môžu obsahovať akúkoľvek kombináciu kruhov rôznej veľkosti, ako napríklad 3 šesťčlenné kruhy (6,6,6), a šesťčlenný kruh, a sedemčlenný kruh a šesťčlenný kruh (6,7,6), a šesťčlenný kruh a dva osemčlenné

-15kruhy (6,8,8) atď.

V jednom uskutočnení sa tento vynález týka zlúčeniny, kde polycyklické zlúčeniny sú iné než (6,6,7) kruhy. V ďalšom aspekte sa tento vynález týka zlúčeniny, kde polycyklické zlúčeniny obsahujú len kruhy, ktoré majú iný počet než 7 členov.

Výhodne bude polycyklická zlúčenina obsahovať, vrátane všetkých substituentov, nie viac než asi 50 uhlíkových atómov, obvyklejšie nie viac než asi 30 až 40 uhlíkových atómov.

Polycyklická zlúčenina môže obsahovať najmenej dve kruhové zložky alebo najmenej tri kruhové zložky, alebo najmenej štyri kruho.vé zložky.

Výhodne polycyklická zlúčenina obsahuje štyri kruhové zložky.

Výhodné majú polycyklické zlúčeniny steroidnú kruhovú zložku, alebo jej bio-izostéry.

Hyd rokarbylový radikál

Pojem hydrokarbylová skupina, ako sa používa v tomto dokumente, znamená skupinu, ktorá obsahuje najmenej C a H a môže voliteľne obsahovať jeden alebo viaceré iné vhodné substituenty. Príklady takýchto substituentov môžu zahrnovať halogén, alkoxyl, nitroskupinu, alkylovú skupinu, cyklickú skupinu atď. Okrem možnosti, že substituenty sú cyklickou skupinou, môže cyklickú skupinu tvoriť kombinácia substituentov. Ak hydrokarbylová skupina obsahuje viac než jeden C, potom tieto uhlíky nemusia nevyhnutne byť navzájom prepojené. Napríklad najmenej dva uhlíky môžu byť spojené pomocou vhodného prvku alebo skupiny. Hydrokarbylová skupina teda môže obsahovať heteroatómy. Vhodné heteroatómy budú zrejmé odborníkom v tejto oblasti a zahrnujú napríklad: síru, dusík a kyslík. Neobmedzujúcim príkladom hydrokarbylovej skupiny je acylová skupina.

Typickou hydrokarbylovou skupinou je uhľovodíková skupina. Tu pojem uhľovodík“ znamená ktorúkoľvek alkylovú skupinu, alkenylovú skupinu, alkinylovú skupinu, pričom tieto skupiny môžu byť lineárne, rozvetvené alebo cyklické, alebo arylové skupiny. Pojem „uhľovodík“ tiež zahrnuje tieto skupiny, ktoré môžu byť voliteľne substituované. Ak je „uhľovodík“ rozvetvená štruktúra, ktorá má na sebe substituent(ty), potom substitúcia môže byť buď na uhľovodíkovom skelete alebo na

-16rozvetvení; alternatívne môže substitúcia byť na uhľovodíkovom skelete a na rozvetvení.

Sulfamátová skupina l . ·

V jednom uskutočnení má kruh X ako substituent sulfamátovú skupinu. Pojem sulfamát, ako sa používa v tomto dokumente, zahrnuje ester kyseliny sulfámovej alebo ester /V-substituovaného derivátu kyseliny sulfámovej, alebo jej soli.

Ak R^s je sulfamátová skupina, potom zlúčenina podľa tohto vynálezu je označovaná ako sulfamátová zlúčenina.

Typicky má sulfamátová skupina vzorec:

(R¹)(R²)N-S(O)(O)-Okde sú výhodne R¹ a R² nezávisle vybrané zo skupiny H, alkyl, cykloalkyl, alkenyl a aryl, alebo ich kombinácií, alebo spolu predstavujú alkylén, kde každý alkyl alebo cykloalkyl alebo alkenyl voliteľne obsahuje jeden alebo viaceré heteroatómy alebo skupiny.

Keď sú substituované, /V-substituované zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu obsahovať jeden alebo dva /V-alkylové, /V-alkenylové, /V-cykloalkylové alebo /V-arylové substituenty, výhodne obsahujúci alebo obsahujúce maximálne 10 uhlíkových atómov. Keď R¹ a/alebo R² je alkyl, výhodnými hodnotami sú tie hodnoty, kde R¹ a R² sú každý nezávisle vybraný z nižších alkylových skupín, ktoré obsahujú od 1 do 6 uhlíkových atómov, teda metyl, etyl, propyl atď. R¹ a R² môžu oba byť metyl. Keď R¹ a/alebo R² je aryl, typické hodnoty sú fenyl a tolyl (PhCHa; o). Kde R¹ a R² predstavujú cykloalkyl, typické hodnoty sú cyklopropyl, cyklopentyl, cyklohexyl atď. Keď R¹ a R² sú spolu spojené, typicky predstavujú alkylénovú skupinu poskytujúcu reťazec 4 až 6 uhlíkových atómov, voliteľne prerušený jedným alebo viacerými heteroatómami alebo skupinami, napríklad tak, aby sa poskytol

5-členný heterocyklus, napríklad morfolinoskupina, pyrolidinoskupina alebo piperidinoskupina.

V hodnotách alkyl, cykloalkyl, alkenyl a aryl, sú zahrnuté substituované skupiny, ktoré obsahujú ako substituenty jednu alebo viaceré skupiny, ktoré

-17neinterferujú so sulfatázovou inhibičnou aktivitou sledovanej zlúčeniny. Príklady neinterferujúcich substituentov zahrnujú hydroxyl, aminoskupinu, halogén, alkoxyl, alkyl a aryl.

V niektorých uskutočneniach sulfamátová skupina môže tvoriť kruhovú štruktúru pomocou toho, že je kondenzovaná na (alebo spojená s) jeden alebo viaceré atómy v skupine alebo na skupine X.

V niektorých uskutočneniach, môže byť viac než jedna sulfamátová skupina. Napríklad, tam môžu byť dve sulfamátové skupiny (t.j. bis-sulfamátové zlúčeniny). Ak sú tieto zlúčeniny založené na steroidnom jadre, výhodne druhá (alebo najmenej jedna dodatočná) sulfamátová skupina je umiestnená v polohe 17 steroidného jadra. Tieto skupiny nemusia byť rovnaké.

V niektorých výhodných uskutočneniach najmenej jeden z R¹ a R² je H.

V niektorých ďalších výhodných uskutočneniach každý R¹ a R² je H.

Napodobenie

V jednom aspekte X a K môžu byť napodobením steroidnej kruhovej štruktúry.

Pojem „napodobenie“, ako sa používa v tomto dokumente, znamená to, že máme podobnú alebo odlišnú štruktúru, ktorá ale má podobný funkčný účinok. Inými slovami, skupina K a kruh X spolu môžu byť bio-izostérne kruhy steroidu alebo jeho aktívnej časti.

Vo výhodnom aspekte skupina K a kruh X spolu môžu byť bio-izostérne kruhy estrónu alebo jeho časti.

Steroidná kruhová štruktúra

V jednom výhodnom aspekte X a K tvoria steroidnú kruhovú štruktúru - teda cyklopentánfenantrénový skelet alebo jeho bio-izoestery.

Ako je dobre známe v tomto odbore, klasická steroidná kruhová štruktúra má generický vzorec

Vo vyššie uvedenom vzorci sa kruhy označujú konvenčným spôsobom. Príkladom bio-izostérnej štruktúry je štruktúra, keď jeden alebo viaceré kruhy A, B, C a D sú heterocyklické kruhy a/alebo keď jeden alebo viaceré kruhy A, B, C a D sú substituované a/alebo keď jeden alebo viaceré kruhy A, B, C a D sú modifikované; ale kde bio-izostérna štruktúra v neprítomnosti sulfamátovej skupiny má steroidné vlastnosti.

V tomto ohľade štruktúru výhodnej polycyklickej štruktúry môže predstavovať:

kde každý kruh A', B’, C' a D' nezávisle predstavuje heterocyklický kruh alebo neheterocyklický kruh, pričom tieto kruhy môžu byť nezávisle substituované alebo nesubstituované, nasýtené alebo nenasýtené.

Napríklad jeden alebo viaceré kruhy A', B', C' a D' môžu byť nezávisle substituované s vhodnými skupinami - ako napríklad alkylovou skupinou, arylovou skupinou, hydroxýlovou skupinou, halogénovou skupinou, hydrokarbylovou skupinou, oxyhydrokarbylovou skupinou atď.

Príkladom D' je päť alebo šesť členný neheterocyklický kruh, ktorý má, najmenej jeden substituent.

V jednom výhodnom uskutočnení je kruh D’ substituovaný s etinylovou skupinou.

Ak je jedným z kruhov A', B', C' a D' heterocyklický kruh, potom výhodne tento heterocyklický kruh obsahuje kombináciu C atómov a najmenej jeden N atóm a/alebo najmenej jeden O atóm. V kruhu môžu byť prítomné iné heterocyklické atómy.

-19Príklady vhodných výhodných steroidných jadier A’ až D' zlúčeniny podľa tohto vynálezu zahrnujú kruhy A až D dehydroepiandrosterónu a estragónov, vrátane estrónu. Výhodné estragóny zahrnujú prirodzené estragóny, ako napríklad estrón, estradiol, estratriol, epi-estriol a konjugované estragóny (ekvilenínové deriváty).

V jednom aspekte tohto vynálezu je výhodné, ak zlúčenina podľa tohto vynálezu je prekurzorom prirodzeného estragónu, výhodne prirodzeného estragónu vybraného z estrónu, estradiolu, estratriolu a epi-estriolu.

Výhodné steroidné kruhové jadrá A' až D' zlúčenín podľa tohto vynálezu zahrnujú kruhy A až D zo skupiny:

Estróny a substituované estróny;

estrón

4-OH-estrón

6a-OH-estrón

7a-OH-estrón

16a-OH-estrón

Ιββ-ΟΗ-estrón

17-deoxyoestrón estrón

Estradioiy a substituované estradioly

4-OH-^-estradiol

6a-0H-17p-estradiol

7a-OH-17a-estradiol

4-OH-17a-estradiol

6a-0H-17a-estradiol

7a-0H-17a-estradiol

16a-0H-17a-estradiol

16a-0H-17p-estradiol

16β-ΟΗ-17a-estradiol

- 20 16β-ΟΗ-17p-estradiol

17a-estradiol

17p-estradiol

17a-etinyl-17p-estradiol

17p-etinyl-17a-estradiol

17-deoxyestradiol

Estrioly a substituované estrioly estriol

4-OH-estriol

6a-OH-estriol

7a-OH-estriol-17-deoxyestriol

Dehydroepiandrosteróny a substituované dehydroepiandrosteróny;

dehydroepiandrosteróny

6a-OH-dehydroepiandrosterón

7a-OH-dehydroepiandrosterón

16a-OH-dehydroepiandrosterón

16p-OH-dehydroepiandrosterón

Vo všeobecnosti kruhový systém A'B'C'D' môže obsahovať rôzne neinter-. ferujúce substituenty. Konkrétne môže kruhový systém A'B'C'D' obsahovať jeden alebo viaceré hydroxyly, alkyl zvlášť nižší (Οι-Οθ) alkyl, napríklad metyl, etyl, npropyl, izopropyl, n-bútyl, sek-butyl, ŕerc-butyl, n-pentyl a iné pentylové izoméry, a n-hexyl a iné hexylové izoméry, alkoxyl zvlášť nižší (CrC₆) alkoxyl, napríklad metoxyl, etoxyl, propoxyl atď., alkinyl, napríklad etinyl alebo halogén, napríklad fluórované substituenty.

Vo veľmi výhodnom uskutočnení je steroidná kruhová štruktúra kombinovaná s výhodnými substituentmi podľa tohto vynálezu tak, že zlúčenina podľa tohto vynálezu je vybraná zo zlúčenín vzorcov

Nesteroidné štruktúry

V alternatívnom uskutočnení, zlúčenina podľa tohto vynálezu nemusí obsahovať alebo byť založená na steroidnom jadre. Z tohto hľadiska, polycyklická zlúčenina môže obsahovať alebo byť založená na nesteroidnom kruhovom systéme - ako napríklad dietylstilbestrol, stilbestrol, kumaríny, flavonoidy, kombrestatíny a iné kruhové systémy. Iné vhodné nesteroidné zlúčeniny určené na použitie alebo ako farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu sa môžu nájsť v US-A-5567831.

Iné substituenty

Zlúčenina podľa tohto vynálezu môže mať substituenty iné než R^h1, R^h2 a

R^s. Napríklad týmito inými substituentmi môže byť jedna alebo viaceré zo skupín:

jedna alebo viaceré sulfamátová(vé) skupina(ny), jedna alebo viaceré fosfonátová(vé) skupina(ny), jedna alebo viaceré tiofosfonátová(vé) skupina(ny),

-22jedna alebo viaceré sulfonátová(vé) skupina(ny), jedna alebo viaceré sulfónamidová(vé) skupina(ny), jedna alebo viaceré halogénové skupiny, jedna alebo viaceré O skupiny, jedna alebo viaceré hydroxylové skupiny, jedna alebo viaceré aminoskupiny, jedna alebo viaceré síru obsahujúce skupin(ny), jedna alebo viaceré hydrokarbylové skupina(ny) - ako napríklad oxyhydrokarbylová skupina.

Oxyhydrokarbyl

Pojem „oxyhydrokarbylová skupina, ako sa používa v tomto dokumente, znamená skupinu, ktorá obsahuje najmenej C, H a O a môže voliteľne obsahovať jeden alebo viaceré iné vhodné substituenty. Príklady takýchto substituentov môžu zahrnovať halogén, alkoxyskupinu, nitroskupinu, alkylovú skupinu, cyklickú skupinu atď. Okrem možnosti keď substituenty sú cyklickou skupinou, môže tvoriť cyklickú skupinu kombinácia substituentov. Ak oxyhydrokarbylová skupina obsahuje viac než jeden C, potom tieto uhlíky nemusia nevyhnutne byť navzájom spojené. Napríklad najmenej dva z uhlíkov môžu byť spojené cez vhodný prvok alebo skupinu. Teda oxyhydrokarbylová skupina môže obsahovať heteroatómy. Vhodné heteroatómy budú zrejmé odborníkom v tejto oblasti a zahrnujú napríklad síru a dusík.

V jednom uskutočnení tohto vynálezu je oxyhydrokarbylovou skupinou oxyuhľovodíková skupina.

Pojem „oxyuhľovodík“ znamená jednu z alkoxylových skupín, oxyalkenylovú skupinu, oxyalkinylovú skupinu, tieto skupiny môžu byť lineárne, rozvetvené alebo cyklické, alebo oxyarylovú skupinu. Pojem oxyuhľovodík tiež zahrnuje tieto skupiny, kde tieto skupiny sú voliteľne substituované. Ak oxyuhľovodík má rozvetvenú štruktúru, na ktorej je(sú) substituent(ty), potom substitúcia môže byť buď na uhľovodíkovom skelete alebo na rozvetvení; alternatívne substitúcia môže byť na uhľovodíkovom skelete a na rozvetvení.

Typicky má oxyhydrokarbylová skupina vzorec Ci.₆O (ako napríklad C1-3O).

Skúšky na určenie STS aktivity použitím rakovinových buniek (postup 1)

Inhibícia steroid-sulfatázovej aktivity v MCF-7 bunkách

-23Steroid-sulfatázová aktivita sa meria in vitro použitím intaktných buniek MCF-7 ľudskej rakoviny prsníka. Tento hormonálne závislý bunkový kmeň sa široko používa na štúdium kontroly rastu buniek ľudskej rakoviny prsníka. Má značnú steroid-sulfatázovú aktivitu (Maclndoe a spol. Endocrinology, ,123, 1281 - 1287 (1988); Purohit & Reed, Int. J. Cancer, 50, 901 - 905 (1992)) a je dostupný v U.S.A. z American Type Culture Collection (ATCC) a v U.K. (napríklad z The Imperiál Cancer Research Fund).

Bunky sa udržiavali v prostredí „Minimal Essential Médium“ (MEM) (Flow Laboratories, Irvine, Scotiand), ktoré obsahovalo 20 mmol/l HEPES, 5 % hmotnostných fetálneho teľacieho séra, 2 mmol/l glutamínu, neesenciálne aminokyseliny a 0,075 % hmotnostného hydrogénuhličitanu sodného. Do 30 replikačných 25 cm² kultivačných baniek sa naočkovalo približne 1x10⁵ buniek/banku použitím vyššie uvedeného média. Bunky sa pestovali na 80 % zlievanie a kultivačné prostredie sa menilo každý tretí deň.

Intaktné monovrstvy MCF-7 buniek v troch 25 cm² tkanivových kultivačných bankách sa premyli Earleovým vyváženým soľným roztokom (EBSS od ICN Flow, High Wycombe, U.K.) a inkubovali sa počas 3 až 4 hodín pri 37 °C s 5 pmol (7x10⁵ dpm) [6,7-³H]estrón-3-sulfát (špecifická aktivita 2,22.10¹² Bq/mmol (60 Ci/mmol) od New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) v bezsérovom MEM (2,5 ml) spolu s estrón-3-sulfamátom (11 koncentrácií: 0; 1 fmol/l; 0,01 pmol/l; 0,1 pmol/l; 1 pmol/l; 0,01 nmol/l; 0,1 nmol/l; 1 nmol/l; 0,01 mmol/l; 0,1 mmol/l; 1 mmol/l). Po inkubácii sa banky ochladili a kultivačné prostredie (1 ml) sa pipetovalo do samostatných skúmaviek, ktoré obsahovali [¹⁴C]estrón (7x10³ dpm) (špecifická aktivita 3,59.10¹² Bq/mmol (97 Ci/mmol) od Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.). Zmes sa pretrepávala dôkladne počas 30 sekúnd s toluénom (5 ml). Experimenty ukázali, že >90 % [¹⁴C]estrónu a <0,1 % [³H]estrón-3-sulfátu sa odstránilo z vodnej fázy pomocou tohto spracovania. Odobral sa podiel (2 ml) organickej fázy, odparil sa a obsah ³H a ¹⁴C zvyšku sa určil pomocou scintilačnej spektrometrie. Hmotnosť hydrolyzovaného estrón-3-sulfátu sa vypočítala zo získaného ³H signálu (korigovaného na objemy kultivačného prostredia a použitej organickej fázy, a na výťažok pridaného [¹⁴C] estrónu) a špecifickej aktivity substrátu. Každá dávka experimentov zahrnuje inkubácie mikrozómov pripravených

-24zo sulfatázovo pozitívnej ľudskej placenty (pozitívna kontrolná vzorka) a banky bez buniek (na vyhodnotenie zdanlivej neenzymatickej hydrolýzy substrátu). Počet bunkových jadier na banku sa určil použitím zariadenia Coulter Counter po opracovaní bunkovej monovrstvy Zaponínom. Jedna banka v každej dávke sa používala na vyhodnotenie stavu bunkovej membrány a životnosti použitím metódy vylúčenia Trypan Blue (Phillips, H.J. (1973) In: Tissue culture and applications, [ed: Kruse, D.F. & Patterson, M.K.J; str. 406 - 408; Academic Press, New York).

Výsledky pre steroid-sulfatázovú aktivitu sú vyjadrené ako priemer ±1 S.D. z celkového produktu (estrón + estradiol) tvoreného počas inkubačnej doby (20 hodín) vypočítanej pre 10⁶ buniek a pre hodnoty vykazujúce štatistickú významnosť, ako percento zníženia (inhibícia) pre inkubácie neobsahujúce estrón-3-sulfamát. Na testovanie štatistickej významnosti výsledkov používal nepárový Študentov t-test.

Skúška určenia STS aktivity použitím placentových mikrozómov (postup 2)

Inhibícia steroid-sulfatázovej aktivity v placentových mikrozómoch

Sulfatázovo-pozitívna ľudská placenta z normálne trvajúcich tehotenstiev sa dôkladne nasekala nožnicami a premyla sa raz so studeným fosfátovým pufrom (pH

7,4, 50 mmol/l), potom sa resuspendovala v studenom fosfátovom pufri (5 ml/g tkaniva). Homogenizácia sa uskutočnila homogenizátorom Ultra-Turrax, použitím troch 10 sekundových impulzov oddelených 2 minútovými periódami chladenia v ľade. Jadrá a bunkové zlomky sa odstránili pomocou centrifugovania (4 °C) pri 2000 g počas 30 minút a podiely (2 ml) supernatantu sa uskladnili pri 20 °C. Koncentrácie proteínu v supernatantoch sa určili pomocou spôsobu od Bradforda (Anal. Biochem., 72, 248 - 254 (1976)).

Inkubácia vzoriek (1 ml) sa vykonávala použitím proteínovej koncentrácie 100 mg/ml, substrátovej koncentrácie 20 mmol/l [6,7-³H]estrón-3-sulfátu (špecifická aktivita 2,22.10¹² Bq/mmol (60 Ci/mmol) od New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) a doby inkubácie 20 minút pri 37 °C. Ak je to potrebné, používa sa osem koncentrácií zlúčenín: 0 (t.j. kontrolná vzorka); 0,05 mmol/l; 0,1 mmol/l; 0,2 mmol/l; 0,4 mmol/l; 0,6 mmol/l; 0,8 mmol/l; 1,0 mmol/l. Po inkubácii sa každá vzorka ochladila a kultivačné prostredie (1 ml) sa odpipetovalo do samostatných

-25skúmaviek, ktoré obsahujú [¹⁴C]estrón (7x10³ dpm) (špecifická aktivita 3,59.10¹² Bq/mmol (97 Ci/mmol) od Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.). Zmes sa pretrepávala dôkladne počas 30 sekúnd s toluénom (5 ml). Experimenty ukázali, že sa pomocou tohto spracovania odstránilo z vodnej fázy >90 % [¹⁴C]estrónu a <0,1% [³H]estrón-3-sulfátu. Odobral sa podiel (2 ml) organickej fázy, odparil sa a obsah ³H a ¹⁴C zvyšku sa určil pomocou scintilačnej spektrometrie. Hmotnosť hydrolyzovaného estrón-3-sulfátu sa vypočítala zo získanej ³H početnoti impulzov (korigovanej na objemy použitého kultivačného prostredia a organickej fázy, a na výťažok pridaného [¹⁴C]estrónu) a zo špecifickej aktivity substrátu.

Skúška na určenie STS aktivity na modeli na zvieratách (postup 3)

Inhibícia estrón-sulfatázovej aktivity in vivo

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa môžu študovať použitím modelu na zvieratách, konkrétne na potkanoch po odstránení vaječníkov. V tomto modeli zlúčeniny, ktoré sú estrogénové stimulujú rast maternice.

Zlúčenina (0,1 mg/kg/deň počas päť dní) sa orálne podávala potkanom, pričom ďalšia skupina zvierat prijímala len vehikulum (propylénglykol). Na konci štúdie sa získali vzorky tkaniva pečene a aktivita estrón-sulfatázy sa hodnotila použitím ³H estrón-sulfátu ako substrátu, ako je opísané skôr (pozri PCT/GB95/02638).

Skúška na určenie estrogénovej aktivity na modeli na zvieratách (postup 4)

Chýbajúca in vivo estrogénicita

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa môžu študovať použitím modelu na zvieratách, konkrétne na potkanoch po odstránení vaječníkov. V tomto modeli zlúčeniny, ktoré sú estrogénové stimulujú rast maternice.

Zlúčenina (0,1 mg/kg/deň počas päť dní) sa podávala orálne potkanom, pričom iná skupina zvierat prijímala len vehikulum (propylénglykol). Na konci štúdie sa odobrali maternice a zvážili sa pričom výsledky sa vyjadrili ako maternicová

-26hmotnosť/celková telesná hmotnosť x 100.

Zlúčeniny, ktoré nemali význačný účinok na rast maternice, nie sú estrogénové.

Biotechnologické skúšky na určenie STS aktivity (postup 5)

Schopnosť zlúčenín inhibovať estrón-sulfatázovú aktivitu sa môže tiež vyhodnocovať použitím aminokyselinových sekvencií alebo nukleotidových sekvencií kódujúcich STS alebo ich aktívne fragmenty, deriváty, homológy alebo varianty, napríklad pri vysoko-kapacitnom skríningu.

Jeden alebo viaceré z vhodných cieľov - ako napríklad aminokyselinová sekvencia a/alebo nukleotidová sekvencia - sa môže používať na identifikovanie činidiel schopných modulovať STS v niektorej z rozmanitých techník skríningu liečiv. Cieľ použitý v takomto teste môže byť voľne v roztoku, zafixovaný na tuhý nosič, nanesený na bunkovom povrchu, alebo umiestnený intracelulárne. Môže sa merať odstránenie aktivity cieľa alebo tvorba komplexov viazania medzi cieľom a činidlom, ktoré sa testuje.

Skúška podľa tohto vynálezu môže byť triediacou metódou, čím sa testujú mnohé činidlá. V jednom aspekte je skúšobná metóda podľa tohto vynálezu vysoko výkonnou triediacou metódou.

Technika triedenia liečiv môže byť založená na spôsobe opísanom vGeysen, Európska patentová prihláška 84/03564, publikovaná 13. septembra 1984. Súhrnne, veľký počet rôznych malých peptidových testovaných zlúčenín sa syntetizoval na tuhom substráte, ako napríklad plastové špendlíky alebo nejaký iný povrch. Peptidové testované zlúčeniny reagujú s vhodným cieľom alebo jeho fragmentom a premyjú sa. Naviazané jednotky sa potom detegujú - napríklad pomocou vhodnej adaptácie spôsobov dobre známych v tomto odbore. Čistený cieľ môže tiež byť pokrytý priamo na platne určené na použitie v technike skríningu liečiv. Alternatívne sa môžu použiť na zachytenie peptidov a ich imobilizovanie na tuhom nosiči neneutralizované protilátky.

Tento vynález tiež uvažuje použitie konkurenčnej skríningovej skúšky liečiv, v ktorej špecificky konkurujú neutralizované protilátky schopné viazať cieľ testovanej zlúčenine pri jej viazaní na cieľ.

-27Iná technika skríningu poskytuje vysoko výkonnú skríningovú metódu (HTS) činidiel, ktoré majú vhodnú afinitu viazania na tieto látky a je založená na spôsobe opísanom podrobne v WO 84/03564

Očakáva sa, že skúšobné metódy podľa tohto vynálezu budú vhodné aj pre skríning v malom rozsahu testovaných zlúčenín, ako aj v kvantitatívnych skúškach.

V jednom výhodnom aspekte sa tento vynález týka spôsobu identifikovania činidiel, ktoré selektívne modulujú STS, pričom tieto zlúčeniny majú vzorec (la).

Indikátory

V skúšobných metódach podľa tohto vynálezu (ako aj ako skríningových metódach) sa môžu používať rozmanité indikátory, pričom výhodné indikátory poskytujú pohodlne detegovateľné signály (napríklad pomocou spektroskopie). Napríklad, indikátorový gén môže kódovať enzým, ktorý katalyzuje reakciu, ktorá mení vlastnosti absorpcie svetla.

Iné postupy zahrnujú skúšku s enzýmovo-viazaným imunosorbentom (ELISA), radioimunoanalýzu (RIA) a triedenie fluorescenčné aktivovaných buniek (FACS). Môžu sa ešte použiť dvoj-miestové monoklonálne imunoskúšky používajúce monoklonálne protilátky reaktívne na dvoch neinterferujúcich epitopoch. Tieto a iné skúšky sú opísané, okrem iných miest, v Hampton R. a spol. (1990, Serological Metods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) a Maddox DE a spol. (1983, J Exp Med 15 8: 1211).

Príklady indikátorových molekúl zahrnujú látky, ale nie sú na ne obmedzené, β-galaktozidáza, invertáza, zelený fluorescenčný protein, luciferáza, chloramfenikol, acetyltransferáza, glukuronidáza, exo-glukanáza a glukoamyláza. Alternatívne môžu byť rádioaktívne označené alebo fluorescenčnou skupinou označené nukleotidy začlenené do tvoriacich sa kópií, ktoré sa potom identifikujú, ked sa naviažu na oligonukleotidové sondy.

Ako ďalšie príklady, mnohé podniky, ako napríklad Pharmacia Biotech (Piecataway, NJ), Promega (Madison, Wl) a US Biochemical Corp (Cleveland, OH), dodávajú komerčné kity a postupy pre skúšobné procedúry. Vhodné indikátorové molekuly alebo značky zahrnujú tieto rádionuklidy, enzýmy, fluorescenčné, chemiluminescenčné, alebo chromogénne činidlá, ako aj substráty, kofaktory,

-28inhibítory, magnetické častice a podobne. Patenty ukazujúce použitie takýchto značiek zahrnujú US-A-3817837; US-A-3860752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-AA275149 a US-A-4366241.

Hostiteľské bunky

Pojem hostiteľská bunka - vo vzťahu k tomuto vynálezu zahrnuje akékoľvek bunky, ktoré by mohli obsahovať cieľ pre činidlo podľa tohto vynálezu.

Ďalšie uskutočnenie tohto vynálezu teda poskytuje hostiteľské bunky transformované alebo transfekované s polynukleotidom, ktorý je cieľovou skupinou alebo exprimuje cieľovú skupinu podľa tohto vynálezu. Výhodne je tento polynukleotid nesený vo vektore replikácie a expresie polynukleotidov, ktoré majú byť cieľovou skupinou alebo exprimujú cieľovú skupinu. Tieto bunky sa vyberajú tak, aby boli kompatibilné s uvedeným vektorom a môžu byť napríklad prokaryotické (napríklad bakteriálne), plesňové, kvasinkové alebo rastlinné bunky.

Gram-negatívne baktérie E. coli sa široko používajú ako hostiteľské bunky pre heterológnu génovú expresiu. Avšak, veľké množstvo heterológnych proteínov má sklon akumulovať sa vo vnútri bunky. Následné čistenie požadovaného proteínu od masy E.coil vnútrobunkových proteínov môže niekedy byť ťažké.

Oproti E.coli, baktérie z rodu Bacillus sú veľmi vhodné ako heterológne hostiteľské bunky pre ich schopnosť vylučovať proteíny do kultivačného prostredia. Iné baktérie vhodné ako hostiteľské bunky sú baktérie z druhov Streptomyces a Pseudomonas.

V závislosti od povahy polynukleotidu kódujúceho polypeptidy podľa tohto vynálezu, a/alebo od vhodnosti pre ďalšie spracovanie exprimovaného proteínu, môžu byť výhodné eukaryotické hostiteľské bunky, ako napríklad kvasinky alebo iné plesne. Vo všeobecnosti sú kvasinkové bunky výhodnejšie ako bunky plesní, pretože sa ľahšie manipulujú. Niektoré proteíny sú však z kvasinkových buniek buď slabo vylučované, alebo v niektorých prípadoch nie sú vhodne spracovávané (napríklad hyperglykozylácia v kvasinkách). V týchto prípadoch by sa mali vybrať iné hubové hostiteľské organizmy.

Príklady vhodných exprimujúcich hostiteľských buniek v rozsahu tohto vynálezu sú huby, ako napríklad druhy Aspergilius (ako napríklad druhy opísané

-29ν ΕΡ-Α-0184438 a EP-A-028460S) a druhy Trichoderma·, baktérie ako napríklad druhy Bacillus (ako napríklad druhy opísané v EP-A-0134048 a EP-A-0253455), druhy Streptomyces a druhy Pseudomonas·, kvasinky ako napríklad druhy Kluyveromyces (ako napríklad druhy opísané v EP-A-0096430 a EP-A-0301670) a druhy Saccharomyces. Typické exprimujúce hostiteľské bunky môžu byť napríklad vybrané z Aspergillus niger; Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtills, Bacillus lichenfformis, Bacillus amyloilquefaciens, Kluyveromyces lactis a Sacoharomyces cerevisiae.

Použitie vhodných hostiteľských buniek - ako napríklad kvasiniek, húb a rastlinných hostiteľských buniek - môže poskytovať post-translačné modifikácie (napríklad myristoyláciu, glykozyláciu, skrátenie, lapidáciu a tyrozínovú, serínovú alebo treoninovú fosforyláciu), čo môže byť potrebné na udelenie optimálnej biologickej aktivity u rekombinantných exprimovaných produktov podľa tohto vynálezu.

Organizmy

Pojem „organizmus“ vo vzťahu ku tomuto vynálezu zahrnuje akékoľvek organizmy, ktoré by mohli obsahovať cieľovú skupinu podľa tohto vynálezu a/alebo z nich získané produkty. Príklady organizmov môžu zahrnovať huby, kvasinky alebo rastlinné bunky.

Pojem „transgénové organizmy vo vzťahu k tomuto vynálezu zahrnuje akýkoľvek organizmus, ktorý obsahuje cieľovú skupinu podľa tohto vynálezu a/alebo z nej získané produkty.

I

Transformácia hostiteľských buniek/hostiteľských organizmov

Ako je uvedené skôr, hostiteľskými organizmami môžu byť prokaryotické alebo eukaryotické organizmy. Príklady vhodných prokaryotických hostiteľských buniek zahrnujú E. coli a Bacillus subtills. Spôsoby transformácie prokaryotických hostiteľských buniek sú dobre dokumentované v tomto odbore, napríklad pozri Sambrook a spol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, 1989, Studenom Spring Harbor Laboratory Press) a Ausubel a spol.: Current Protocols in

-30Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Ak sa používajú prokaryotické hostiteľské bunky, potom môže byť potrebné vhodne modifikovať nukleotidovú sekvenciu pred transformáciou - napríklad pomocou odstránenia intrónov.

V inom uskutočnení transgénovými organizmami môžu byť kvasinky. Z tohto hľadiska sa kvasinky tiež často široko používajú ako vehikulum pre heterológnu génovú expresiu. Druh Saccharomyces cerevisiae má dlhú históriu priemyselného použitia, vrátane jeho použitia na heterológnu génovú expresiu. Prehľad expresie heterológnych génov v Saccharomyces cerevisiae bol urobený vGoodey a spol. (1987, Yeast Biotechnology, D.R. Berry a spol., editor, str. 401 429, Alien a Unwin, London) a King a spol. (1989, Molecular and Celí Biology of Yeast, E.F. Walton a G. T. Yarronton, ed., str. 107 - 133, Blackie, Glasgow).

Z viacerých dôvodov je Saccharomyces cerevisiae vhodný pre heterológnu génovú expresiu. Po prvé, je nepatogénny pre ľudí a je neschopný produkovať určité endotoxíny. Po druhé, má dlhú históriu bezpečného použitia po storočia komerčného využitia na rozličné účely. To viedlo k širokej verejnej akceptovateľnosti. Po tretie, extenzívne komerčné použitie a výskum venovaný týmto organizmom poskytli bohaté znalosti o ich genetike a fyziológii, ako aj o charakteristikách veľko-kapacitnej fermentácie Saccharomyces cerevisiae.

Prehľad princípov heterológnej génovej expresie v Sacoharomyces cerevisiae a vylučovania génových produktov je daný E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993, Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes, Yeasts, Voi.

5. Anthony H. Rose a J. Stuart Harrison, ed., 2. vydanie, Academic Press Ltd.).

Sú dostupné viaceré typy kvasinkových vektorov, vrátane sceľovacích vektorov, ktoré vyžadujú rekombináciu s hostiteľským genómom na ich pestovanie, a autonómne sa replikujúcich plazmidových vektorov.

Na prípravu transgénových Saccharomyces sa expresné konštrukty pripravujú pomocou inzercie nukleotidovej sekvencie do konštruktu určeného na expresiu v kvasinkách. Boli vyvinuté viaceré typy konštruktov používané pre heterológnu expresiu.

Konštrukty obsahujú promótor aktívny v kvasinkách zapojený do nukleotidovej sekvencie. Obvykle sa používa promótor kvasinkového pôvodu, ako

-31 napríklad GAL1 promótor. Obvykle sa používa signálna sekvencia kvasinkového pôvodu, ako napríklad sekvencia kódujúca SUC2 signálny peptid. Terminátorová aktívna skupina v kvasinkách zakončuje expresný systém.

Na transformáciu kvasiniek boli vyvinuté viaceré transformačné postupy.

Transgénové Saccharomyces podľa tohto vynálezu môžu byť napríklad pripravené pomocou nasledujúcich zistení Hinnen a spol. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J. D. (1978, Náture, London, 275, 104); a Ito, H. a spol. (1953, J. Bacteriology 153, 163 - 168).

Transformované kvasinkové bunky sa vyberajú použitím rôznych selektívnych markerov. Medzi markermi používanými na transformáciu sú mnohé auxotrofné markery, ako napríklad LEU2, HIS4 a TRP1, a dominantné markery antibiotickej rezistencie, ako napríklad aminoglykozidové antibiotické markery, napríklad G418.

Ďalšími hostiteľskými organizmami sú rastlinné bunky. Základným princípom pri konštrukcii geneticky modifikovaných rastlín je inzercia genetickej informácie v rastlinnom genóme, aby sa tak získalo stabilné pestovanie vloženého genetického materiálu. Existujú viaceré techniky vloženia genetickej informácie, dva hlavné princípy sú priame zavedenie genetickej informácie a zavedenie genetickej informácie pomocou použitia vektorového systému. Prehľad všeobecných techník sa nachádza v článkoch Potrykus (Annu Rev Plánt Physiol Plánt Mol Biol [1991] 42: 205 - 225) a Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17 - 27). Ďalšie vysvetlenia transformácie rastlín sa môžu nájsť v EPA-0449375.

Tento vynález teda tiež poskytuje spôsob transformovania hostiteľských buniek s nukleotidovou sekvenciou, ktorá má byť cieľovou skupinou alebo má exprimovať cieľovú skupinu. Hostiteľské bunky transformované s nukleotidovou sekvenciou môžu byť kultivované za podmienok vhodných na expresiu kódovaného proteínu. Proteín produkovaný rekombinantnými bunkami sa môže prejavovať na povrchu bunky. Ak sa to požaduje, a ako porozumie odborník v tomto odbore, vektory expresie, ktoré obsahujú kódovanie sekvencii, môžu byť skonštruované so signálnou sekvenciou, ktorá priamo vylučuje kódujúce sekvencie cez membránu konkrétnych prokaryotických alebo eukaryotických buniek. Iné rekombinantné konštrukcie môžu spojiť kódujúcu sekvenciu na nukleotidovú sekvenciu kódujúcu

-32polypeptidovú doménu, čo uľahčí čistenie rozpustných proteínov (Kroll D.J. a spol. (1993) DNA Call Biol 12: 441 - 53).

Varianty/homológy/deriváty

Okrem špecifických aminokyselinových sekvencií a nukleotidóvých sekvencií zmienených v tomto dokumente tento vynález tiež zahrnuje použitie ich variantov, homológov a derivátov. Pojem „homológ“ môže byť v tomto dokumente priradený pojmu „identita.

V tomto kontexte sa homologická sekvencia berie tak, že zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá môže byť najmenej na 75, 85 alebo 90 % identická, výhodne najmenej na 95 alebo 98 % identická. Hoci homológia môže tiež byť uvažovaná v zmysle podobnosti (t.j. aminokyselinových zvyškov, ktoré majú podobné chemické vlastnosti/funkcie), v kontexte tohto vynálezu je výhodné vyjadrovať homológiu v zmysle sekvenčnej identity.

Porovnania homológie môžu byť robené od oka, alebo obvyklejšie pomocou ľahko dostupných programov na porovnávanie sekvencií. Tieto komerčné dostupné počítačové programy môžu počítať % homológie medzi dvoma alebo viacerými sekvenciami.

% homológie môže byť vypočítané pre súvisiace sekvencie, t.j. jedna sekvencia je spojená s inou sekvenciou a každá aminokyselina v jednej sekvencií sa priamo porovnáva so zodpovedajúcou aminokyselinou v inej sekvencií, po jednom zvyšku. Toto sa nazýva zoradenie bez medzery. Typicky sa takéto zoskupenia bez medzier uskutočňujú len v relatívne malom počte zvyškov.

Hoci toto je veľmi jednoduchá a konzistentná metóda, treba zobrať do /

úvahy, že napríklad v inak identickom páre sekvencií, jedno vloženie alebo odstránenie skupiny spôsobí, že nasledujúce aminokyselinové zvyšky vypadávajú z priradenia, spôsobí to teda potenciálne veľké zníženie v % homológie, keď sa uskutočňuje globálne priradenie. V dôsledku toho, väčšina sekvenčných porovnávacích metód je zostavená tak, aby viedla k optimálnym porovnaniam, ktoré berú do úvahy možné vloženia a odstránenia skupín bez penalizácie chybného skóre celkovej homológie. Toto sa dosiahne pomocou vloženia „medzier“ v sekvenčnom priraďovaní s cieľom maximalizovať lokálnu homológiu.

-33Tieto zložitejšie spôsoby však priraďujú penalty za medzery ku každej medzere, ktorá sa vyskytne pri zoskupovaní, takže pre rovnaký počet identických aminokyselín, priradenie sekvencii s najnižším možným počtom medzier odrážajúc vyššiu príbuznosť medzi dvoma porovnanými sekvenciami - dosiahne vyššie skóre než priradenie s mnohými medzerami. „Afinované medzerové náklady sa typicky používajú na priradenie relatívne vysokej hodnoty pri existencii medzery a menšiu penaltu pre každý nasledujúci zvyšok v medzere. Toto je najbežnejšie používaný systém medzerového skóre. Vysoké medzerové penalty budú samozrejme produkovať optimalizované priradenie s menej medzerami. Väčšina priradzovacích programov umožňuje modifikovanie medzerových penált. Výhodné je použitie predvolených hodnôt, ked sa na sekvenčné porovnania používa takýto softvér. Napríklad keď sa používa GCG Wisconsin Bestfit programový balík (pozri nižšie), predvolená medzerová penalta pre aminokyselinové sekvencie je -12 pre medzeru a -4 pre každé rozšírenie.

Výpočet maxima % homológie preto najprv vyžaduje urobiť optimálne priradenie, pričom sa berú do úvahy medzerové penalty. Vhodným počítačovým programom na uskutočnenie takéhoto zoskupenia je GCG Wisconsin Besifit programový balík (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux a spol., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Príklady iných softvérov, ktoré môžu vykonávať sekvenčné porovnania zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, BLAST programový balík (pozri Ausubel a spol., 1999 ibid - Kapitola 18), FASTA (Atschul a spol., 1990, J. Mol. Biol., 403 - 410) a GENEWORKS sada porovnávacích nástrojov. Aj BLAST aj FASTA sú dostupné pre offline a online prieskum (pozri Ausubel a spol., 1999 ibid, strany 7-58 až 7-60). Výhodné je však použitie GCG Bestfit programu.

Ďalší užitočný odkaz sa nachádza v FEMS Mikrobial Lett 1999 15. máj; 174(2): 247 - 50 (a publikovaná oprava vyšla v FEMS Mikrobiol Lett 1999 1. august; 177(1): 187-8).

Hoci konečné % homológie môže byť merané v zmysle identity, proces priraďovania samotný nie je typicky založený na všetko-alebo-nič párovom porovnaní. Namiesto toho sa všeobecne používa matica škálovaného skóre podobnosti, ktorá priraďuje skóre každému párovému porovnaniu založenému na chemickej podobnosti alebo evolučnej vzdialenosti. Príklad takejto bežne

-34používanej matice je BLOSUM62 matica - predvolená matica pre BLAST sadu programov. GCG Wisconsin programy všeobecne používajú buď obecné predvolené hodnoty alebo porovnávaciu tabuľku zákazníckych symbolov, ak je dodaná (ďalšie podrobnosti pozri užívateľský manuál). Výhodné je použitie obecných predvolených hodnôt pre GCG programový balík, alebo v prípade iného softvéru, predvolenej matice, ako napríklad BLOSUM62.

Keď softvér urobí optimálne priradenie, je možné počítať % homológie, výhodne % sekvenčnej identity. Softvér to typicky robí ako časť sekvenčného porovnania a generuje numerický výsledok.

Sekvencie môžu tiež obsahovať vymazané časti, vložené časti alebo nahradené časti aminokyselinových zvyškov, čo spôsobuje latentnú zmenu a vedie k funkčne ekvivalentnej látke. Úmyselné aminokyselinové substitúcie môžu byť urobené na základe podobnosti v polarite, náboji, rozpustnosti, hydrofóbicite, hydrofilicite, a/alebo amfipatickej povahy zvyškov, pričom sa zachová sekundárna väzbová aktivita látky. Napríklad, negatívne nabité aminokyseliny zahrnujú kyselinu asparágovú a kyselinu glutámovú; pozitívne nabité aminokyseliny zahrnujú lyzín a arginín; a aminokyseliny s nenabitými polárnymi vedúcimi skupinami, ktoré majú podobné hodnoty hydrofilnosti, zahrnujú leucín, izoleucín, valín, glycín, alanín, asparagín, glutamín, serín, treonín, fenylalanín a tyrozín.

Môžu sa urobiť mierne substitúcie, napríklad podľa tabuľky uvedenej nižšie. Aminokyseliny v rovnakom bloku v druhom stĺpci a výhodne v rovnakom riadku v treťom stĺpci sa môžu navzájom substituovať:

Alifatické	Nepolárna	GAP
Ί LV
Polárna - nenabitá	CSTM
NQ
Polárna - nabitá	D E
KR
Aromatické		H FWY

-35Vektory expresie

Nukleotidová sekvencia používaná ako cieľová skupina alebo exprimujúca cieľovú skupinu môže byť začlenená do rekombinantného replikovateľného vektora. Tento vektor sa môže používať na replikovanie a expresiu nukleotidovej sekvencie v a/alebo z kompatibilných hostiteľských buniek. Expresia môže byť riadená použitím riadiacich vzoriek sekvencii, ktoré zahrnujú promótory/zosilňovače a iné regulačné signály expresie. Môžu sa používať prokaryotické promótory a promótory funkčné v eukaryotických bunkách. Môžu sa používať tkanivovo špecifické alebo na podnety špecifické promótory. Môžu sa tiež používať chimérické promótory, ktoré obsahujú sekvenciu prvkov z dvoch alebo viacerých rôznych promótorov opísaných vyššie.

Próteín produkovaný hostiteľskými rekombinantnými bunkami pomocou expresie nukleotidovej sekvencie môže byť vylučovaný alebo môže byť obsiahnutý vnútrobunkovo v závislosti od použitej sekvencie a/alebo vektora. Kódujúce sekvencie môžu byť zložené zo signálnych sekvencii, ktoré priamo vylučujú látku kódujúcu sekvencie cez membránu konkrétnych prokaryotických alebo eukaryotických buniek.

Fúzne proteíny

Cieľová aminokyselinová sekvencia môže byť produkovaná ako fúzne proteíny, aby sa napríklad pomohlo extrakcii a čisteniu. Príklady fúznych proteínových partnerov zahrnujú glutatión-S-transferázu (GST), 6xHis, GAL4 (DNA domény viazania a/alebo transkripčnej aktivácie) a gaiaktozidázu. Môže tiež byť vhodné zahrnúť proteolytické štiepne miesto medzi fúzny proteín a danú proteínovú sekvenciu tak, aby sa umožnilo odstránenie sekvéncií fúzneho proteínu. Výhodne nebude fúzny proteín prekážať aktivite cieľovej skupiny.

Fúzne proteíny môžu obsahovať antigén alebo antigénový determinant kondenzovaný na látku podľa tohto vynálezu. V tomto uskutočnení, fúznym proteínom môže byť prirodzene sa nevyskytujúci fúzny proteín, ktorý obsahuje látku, ktorá môže pôsobiť ako adjuvans v zmysle poskytovania všeobecnej stimulácie imunitného systému. Antigén alebo antigénový determinant môže byť pripojený buď na amino-zakončenie alebo karboxy-zakončenie látky.

-36V inom uskutočnení vynálezu môže byť aminokyselinová sekvencia naviazaná na heterológnu sekvenciu, čím sa kóduje fúzny proteín. Napríklad pre skríning peptidových knižníc činidiel schopných ovplyvniť aktivitu tejto látky, môže byť užitočné kódovať chimerické látky, ktoré exprimujú heterológny epitop, ktorý sa rozpoznáva pomocou komerčne dostupných protilátok.

Terapia

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa môžu používať ako terapeutické činidlá t.j. v terapeutických aplikáciách.

Pojem terapia zahrnuje liečebné účinky, zmierňujúce účinky a profylaktické účinky.

Terapia môže byť určená pre ľudí alebo zvieratá, výhodne samičky, výhodnejšie pre ženy.

Farmaceutické prípravky

Tento vynález poskytuje farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje zlúčeninu podľa tohto vynálezu a voliteľne farmaceutický prijateľný nosič, zriedovadlo alebo vehikulum (vrátane ich kombinácií).

Farmaceutické prípravky môžu byť určené na použitie pre ľudí alebo zvieratá v humánnej a veterinárnej medicíne a budú typicky obsahovať jedno alebo viaceré farmaceutický prijateľné zried’ovadlá, nosiče alebo vehikulá. Prijateľné nosiče alebo zried’ovadlá na terapeutické použitie sú dobre známe v farmaceutickej oblasti a sú opísané napríklad v Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Výber farmaceutického nosiča, vehikulá alebo zried’ovadlá môže byť urobený s ohľadom na zamýšľaný spôsob podávania a štandardnú farmaceutickú prax. Farmaceutické prípravky môžu obsahovať okrem nosiča, vehikulá alebo zried’ovadlá akékoľvek vhodné spojivo(vá), lubrikant(ty), suspenzačné činidlo(činidlá), činidlo(činidlá) na potiahnutie povrchu, solubilizačné činidlo(činidlá).

Vo farmaceutickom prípravku sa môžu používať konzervačné látky, stabilizátory, farbivá a ešte ochucujúce činidlá. Príklady konzervačných látok zahrnujú benzoát sodný, kyselinu sorbovú a estery kyseliny p-hydroxybenzoovej.

-37Môžu sa tiež používať antioxidanty a suspenzačné činidlá.

Na farmaceutický prípravok/prípravky môžu byť rôzne požiadavky závislé od rôznych systémov dodávania. Napríklad farmaceutické prípravky podľa tohto vynálezu môžu byť upravené na podávanie použitím mini-pumpy alebo spôsobom na sliznicu, napríklad ako nosný sprej alebo aerosól na inhaláciu alebo vstrebateľný roztok, alebo parenterálne, pričom farmaceutický prípravok je upravený ako injektovateľná forma na podávanie napríklad pomocou intravenózneho, intramuskulárneho alebo subkutánneho spôsobu. Alternatívne môže byť prípravok zostavený na podávanie pomocou oboch spôsobov.

Ak sa činidlo má podávať sliznicou cez gastrointestinálnu sliznicu, malo by byť schopné zostať stabilné počas prechodu cez gastrointestinálny trakt; napríklad by malo byť odolné ku proteolytickej degradácii, stabilné pri kyslom pH a odolné ku detergentným účinkom žlče.

Ak je to vhodné, farmaceutické prípravky sa môžu podávať pomocou inhalácie, vo forme čapikov alebo pesarov, ako vnútromaternicový systém, topikálne vo forme lotionu, roztoku, krému, masti alebo prášku, použitím náplasti na pokožku, orálne vo forme tabliet, ktoré obsahujú vehikulá, ako je napríklad škrob alebo laktóza, alebo v kapsulách alebo ovuliach, buď samotné alebo v zmesi s vehikulami, alebo vo forme elixírov, roztokov alebo suspenzií, ktoré obsahujú príchute alebo farbiace činidlá, alebo môžu byť injektované parenterálne, napríklad intravenózne, intramuskulárne alebo subkutánne. Pri parenterálnom podávaní môžu byť farmaceutické prípravky najlepšie používané vo forme sterilného vodného roztoku, ktorý môže obsahovať iné látky, napríklad dostatok solí alebo monosacharidov, na vytvorenie roztoku izotonického s krvou. Na bukálne alebo sublingválne podávanie sa farmaceutické prípravky môžu podávať vo forme tabliet alebo pastiliek, ktoré môžu byť pripravené konvenčným spôsobom.

Kombinácia farmaceutík

Zlúčenina podľa tohto vynálezu môže byť používaná v kombinácii s jedným alebo viacerými inými aktívnymi činidlami, ako napríklad jedným alebo viacerými inými farmaceutický aktívnymi činidlami.

Napríklad sa zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu používať v kombinácii s

-38inými STS inhibítormi a/alebo inými inhibítormi, ako sú napríklad inhibítor aromatázy (ako je napríklad, 4-hydroxyandrosténdión (4-OHA)) a/alebo steroidmi - ako sú napríklad prirodzene sa vyskytujúce sterneurosteroidy, dehydroepiandrosterónsulfát (DHEAS) a pregnenolon-sulfát (PS) a/alebo iné štrukturálne podobné organické zlúčeniny.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa môžu používať samotné alebo v kombinácii s progestínom. Výhodne sa zlúčeniny podľa tohto vynálezu používajú v neprítomnosti progestínu. Teda, vo výhodnom aspekte je farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu v podstate bez progestínov.

Okrem toho alebo alternatívne sa zlúčenina podľa tohto vynálezu môže používať v kombinácii s modifikátorom biologickej odozvy.

Pojem modifikátor biologickej odozvy („BRM) zahrnuje cytokíny, imunitné modulátory, rastové faktory, hematopoetické regulačné faktory, kolónie stimulujúce faktory, chemotaktické, hemolytické a trombolytické faktory, receptory bunkového povrchu, ligandy, molekuly leukocytovej adhézie, monoklonálne protilátky, preventívne a terapeutické vakcíny, hormóny, zložky extracelulárnej matrice, fibronektín, atď. Pre niektoré aplikácie sú výhodne modifikátormi biologickej odozvy cytokíny. Príklady cytokínov zahrnujú: interleukíny (IL) - ako napríklad IL-1, IL-2, IL3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-19; faktor nekrotizujúci tumory (TNF) - ako napríklad TNF-α; Interferón alfa, beta a gama; TGF-β. Pre niektoré aplikácie je výhodne cytokínom faktor nekrotizujúci tumory (TNF). Pre niektoré aplikácie môže TNF byť ktoréhokoľvek z typov TNF - ako napríklad TNF-a, TNF-β, vrátane ich derivátov alebo zmesí. Výhodnejšie je cytokínom TNF-α. Opis TNF sa môže nájsť v tomto odbore - ako napríklad WO-A-98/08870 a WO-A98/13348.

Podávanie

Typicky bude lekár určovať aktuálnu dávku, ktorá bude najvhodnejšia pre konkrétny subjekt a bude sa meniť s vekom, hmotnosťou a odozvou konkrétneho pacienta. Dávky uvedené nižšie sú príkladom pre priemerný prípad. Môžu samozrejme existovať individuálne prípady, kde sa používajú vyššie alebo nižšie dávkové rozsahy.

-39Farmaceutické prípravky podľa tohto vynálezu sa môžu podávať pomocou priamej injekcie. Farmaceutický prípravok môže byť upravený na parenterálne podávanie, podávanie sliznicou, intramuskulárne, intravenózne, subkutánne, intraokulárne alebo transdermálne podávanie.

Špecifická dávková hladina a frekvencia dávok pre konkrétneho pacienta sa môže meniť a bude závisieť od rozličných faktorov, vrátane aktivity špecifickej použitej zlúčeniny, metabolickej stability a dĺžky pôsobenia tejto zlúčeniny, veku, telesnej hmotnosti, všeobecného zdravia, pohlavia, stravy, spôsobu a času podávania rýchlosti vylučovania, kombinácie liečiv, rozsahu konkrétneho stavu a terapie, ktorou prechádza pacient.

Vedľa typických spôsobov podávania - ako je uvedené vyššie - pojem podávanie tiež zahrnuje podávanie pomocou techník, ako sú napríklad lipidmi sprostredkovaná transfekcia, lipozómy, imunolipozómy, lipofektín, katiónové lícne amfifily (OFAS) a ich kombinácie. Spôsoby pre takéto mechanizmy podávania zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, podávanie sliznicou, nazálny, orálny, parenterálny, gastrointestinálny, topikálny alebo sublingválny spôsob.

Pojem podávanie zahrnuje, ale nie je na ne obmedzené, podávanie pomocou podávania sliznicou, napríklad ako nazálny sprej alebo aerosól na inhaláciu alebo ako vstrebateľný roztok; parenterálny spôsob, kde podávanie je pomocou injektovateľnej formy, ako je napríklad intravenózny, intramuskulárny alebo subkutánny spôsob.

Teda na farmaceutické podávanie môžu byť STS inhibítory podľa tohto vynálezu pripravené akýmkoľvek vhodným spôsobom, ktorý používa konvenčné farmaceutické techniky a farmaceutické nosiče, adjuvansy, vehikulá, zrieďovadlá atď. obvyklé na parenterálne podávanie. Dávky sa môžu podávať v režime jedinej , dávky, v režime rozdelenej dávky a/alebo v režime mnohonásobnej dávky, trvajúcom počas viacerých dní. Na orálne podávanie môžu byť upravené v tabletách, kapsulách, roztokoch alebo suspenziách. Alternatívne budú tieto zlúčeniny upravené na parenterálne podávanie vo vhodnom parenterálne podávateľnom nosiči a poskytujú jednodielnu dennú dávku. Účinná denná dávka sa však bude meniť v závislosti od vlastnej aktivity aktívnej zložky a od telesnej hmotnosti pacienta, takéto variácie odborne posúdi lekár.

-40Cyklovanie buniek

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri spôsoboch liečenia porúch cyklovania buniek.

Ako je diskutované v Molecular Celí Biology“, 3. vydanie, Ed. Lodish a spol. strany 177 až 181, rôzne eukaryotické bunky môžu rásť a deliť sa s dosť odlišnými rýchlosťami. Kvasinkové bunky sa môžu napríklad deliť každých 120 minút a prvé delenie oplodnených vajíčok v embryonálnych bunkách morskej ježovky a hmyzu trvá len 1530 minút, pretože sa delí jedna veľká už existujúca bunka. Avšak, väčšina buniek rastlín a zvierat rastie na dvojnásobný počet 10 až 20 hodín a niektoré sa zdvojnásobujú s oveľa nižšou rýchlosťou. Mnoho buniek v dospelosti, ako napríklad nervové bunky a bunky priečne pruhovaného svalstva, sa nedelia úplne; iné, ako napríklad fibroblasty, ktoré sa zúčastňujú pri liečení poranení, rastú na výzvu, ale inak sú pokojné.

Každá eukaryotická bunka, ktorá sa delí musí byť pripravená darovať rovnaký genetický materiál, čím poskytne dve dcérske bunky. DNA syntéza v eukaryotoch sa nevyskytuje počas bunkového cyklu delenia, ale je obmedzená na jeho časť pred bunkovým delením.

Vzťah medzi eukaryotickou DNA syntézou a bunkovým delením bol dôkladne analyzovaný na kultúrach buniek cicavcov, ktoré boli všetky schopné rastu a delenia. Oproti baktériám sa zistilo, že eukaryotické bunky spotrebujú len časť svojho času na DNA syntézu a je dokončená niekoľko hodín pred bunkovým delením (mitóza). Po DNA syntéze a teda pred bunkovým delením sa vyskytuje časová medzera; zistilo sa, že ďalšia medzera je po delení a pred nasledujúcim kolom DNA syntézy. Táto analýza vedie ku záveru, že cyklus eukaryotických buniek pozostáva z M (mitotickej) fázy, Gi fázy (prvá medzera), S (DNA' syntéza) fázy, G₂ fázy (druhá medzera) a späť ku M. Tieto fázy medzi mitózou (G₁₍ S a G₂) sú spolu známe ako interfáza.

Mnohé nedeliace sa bunky v tkanivách (napríklad, všetky pokojné fibroblasty) prerušujú tento cyklus po mitóze a tesne pred DNA syntézou; takéto odpočívajúce bunky sa volajú bunky s ukončeným bunkovým cyklom a sú v Go stave.

Je možné identifikovať bunky, keď sú v jednej z troch interfázových štádií

-41 bunkového cyklu, použitím fluorescenčne-aktivovaného triediča buniek (FACS), čím sa meria ich relatívny DNA obsah: bunka, ktorá je v Gi (pred DNA syntézou) má definované množstvo x DNA; počas S (DNA replikácia), má medzi x a 2x; a keď je v G₂ (alebo M), má 2x DNA.

Štádiá mitózy a cytokinézy vo zvieracích bunkách sú nasledujúce:

(a) Interfáza. G₂ stupeň interfázy bezprostredne predchádza začiatok mitózy. Chromozómová DNA sa replikovala a naviazala na proteín počas S fázy, ale chromozómy ešte nevidno ako zreteľné štruktúry. Jadrom je jediná jadrová subštruktúra, ktorá je viditeľná v optickom mikroskope. V diploidnej bunke pred DNA replikáciou existujú dva morfologické chromozómy každého typu a bunka sa volá 2n. V G₂ po DNA replikácii je bunka 4n. Existujú štyri kópie každej chromozómovej DNA. Pretože sesterské chromozómy neboli doteraz navzájom oddelené, nazývajú sa sesterské chromatidy.

(b) Skorá profáza. Centrioly, každá s novo tvorenou dcérskou centriolou, sa začnú pohybovať smerom k protiľahlým pólom bunky; chromozómy vidno ako dlhé vlákna. Membrána jadra sa začína rozpadať na malé mechúriky.

(c) Stredná a neskorá profáza. Kondenzácia chromozómov je úplná; každá viditeľná chromozómová štruktúra je zložená z dvoch chromatidov držiacich spolu pri ich centroméroch. Každý chromatid obsahuje jednu z dvoch novo replikovaných dcérskych DNA molekúl. Mikrotubulárne vreteno sa začína rozbiehať z oblasti tesne spojenej k centriolám, ktoré sa pohybujú smerom bližšie ku ich pólom. Niektoré vretenové vlákna dosahujú od pólu k pólu; väčšina ide do chromatidov a pripevňujú sa na kinetochory.

(d) Metafáza. Chromozómy sa pohybujú smerom k rovníku bunky, kde sa zarovnávajú v rovníkovej rovine. Sesterské chromatidy doteraz neboli rozdelené.

(e) Anafáza. Dva sesterské chromatidy sa separujú na nezávislé chromozómy. Každý obsahuje centromér, ktorý sa viaže pomocou vretenovitého vlákna na jeden pól, ku ktorému sa pohybuje. Teda jedna kópia každého chromozómu je darovaná každej dcérskej bunke. Simultánne sa bunky predlžujú, čím tvoria vretená od pólu k pólu. Cytokinéza sa začína, keď sa začne tvoriť štiepna ryha.

(f) Telofáza. Nové membrány sa tvoria okolo dcérskych jadier; chromozómy sa odvíjajú a stávajú sa menej zreteľné, jadro sa stáva znova viditeľné, a okolo

-42každého dcérskeho jadra sa tvorí jadrová membrána. Cytokinéza je takmer úplná a vretená zmiznú ako mikrorúrky a iné vlákna depolymerizujú. V priebehu mitózy „dcérska“ centriola pri každom póle rastie, kým nemá plnú dĺžku. V telofáze je duplikácia každej z pôvodných centriol úplná a nové dcérske centrioly sa budú generovať počas nasledujúcej interfázy. ¹ (g) Interfáza. Po dokončení cytokinézy bunka vstupuje do Gi fázy bunkového cyklu a postupuje znova v cykle.

Možno si všimnúť, že bunkové cyklovanie je extrémne dôležitý bunkový proces. Odchýlky od normálneho bunkového cyklu môžu spôsobiť mnohé medicínske poruchy. Zvýšené a/alebo neobmedzené bunkové cyklovanie môže spôsobiť rakovinu. Potlačené bunkové cyklovanie môže spôsobiť degeneratívne stavy. Použitie zlúčeniny podľa tohto vynálezu môže poskytovať prostriedok na liečenie takýchto porúch a stavov.

Zlúčenina podľa tohto vynálezu môže teda byť vhodná na použitie pri liečení porúch bunkového cyklovania, ako napríklad rakoviny, vrátane hormonálne závislých a hormonálne nezávislých rakovín.

Okrem toho, zlúčenina podľa tohto vynálezu môže byť vhodná pri liečení rakovín, ako napríklad rakoviny prsníka, rakoviny vaječníkov, rakoviny maternicovej sliznice, sarkómov, melanómov, rakoviny prostaty, rakoviny pankreasu atď. a iných solídnych tumorov.

Pre niektoré aplikácie sa bunkové cyklovanie inhibuje a/alebo sa mu bráni a/alebo sa zastaví, výhodne sa bunkovému cyklovaniu bráni a/alebo je zastavené. V jednom aspekte bunkové cyklovanie môže byť inhibované a/alebo sa mu bráni a/alebo sa zastaví v G₂/M fáze. V jednom aspekte sa bunkovému cyklovaniu môže ireverzibilné brániť a/alébo inhibovať a/alebo sa môže zastaviť, výhodne sa môže bunkovému cyklovaniu ireverzibilné brániť a/alebo sa môže zastaviť.

Pojmom ireverzibilné brániť a/alebo inhibovať a/alebo zastaviť sa rozumie tak, že po aplikácii zlúčeniny podľa tohto vynálezu po odstránení zlúčeniny, účinky zlúčeniny, menovite bránenie a/alebo inhibícia a/alebo zastavenie bunkového cyklovania, sú ďalej pozorovateľné. Konkrétnejšie sa pojmom ireverzibilné brániť a/alebo inhibovať a/alebo zastaviť mieni, že keď sa testuje podľa postupu skúšky bunkového cyklovania, ktorý je uvádzaný v tomto dokumente, bunky opracované

-43s danou zlúčeninou vykazujú menší rast po Stupni 2 postupu I než kontrolná vzorka buniek. Detaily tohto postupu sú uvádzané nižšie.

Tento vynález teda poskytuje zlúčeniny, ktoré: Spôsobujú inhibíciou rastu pre estrogénový receptor pozitívnych (ER+) a ER negatívnych (ER-) buniek rakoviny prsníka in vitro zabránením a/alebo inhibovaním a/alebo zastavením bunkového cyklovania; a/alebo spôsobia regresiu nitrózo-metylmočovinou (NMU)indukovaných tumorov prsnej žľazy u intaktných zvierat (t.j. bez odstránenia vaječníkov), a/alebo zabránia a/alebo inhibujú a/alebo zastavia bunkové cyklovanie v rakovinových bunkách; a/alebo pôsobením in vivo zabránia a/alebo inhibujú a/alebo zastavia bunkové cyklovanie a/alebo pôsobia ako antagonistická látka bunkového cyklovania.

Test bunkového cyklovania (Postup 6)

Postup

Stupeň 1

Bunky MCF-7 rakoviny prsníka sa očkovali na mnohokalíškové kultivačné platne s hustotou 10⁵ buniek/kalíšok. Bunky sa ponechali pripojiť a rásť na asi 30 % zlievanie, keď sa opracovali nasledujúcim spôsobom:

Kontrolná vzorka - bez Spracovania

Sledovaná zlúčenina (COI) 20 gmol/l

Bunky sa pestovali počas 6 dní v rastovom kultivačnom prostredí, ktoré obsahovalo COI s výmenou kultivačnej zmesi prostredie/COl. každé 3 dni. Na konci tejto doby sa bunky spočítali použitím zariadenia Coulter celí counter.

Stupeň 2

Po spracovaní buniek počas 6-dňovej periódy s COI sa bunky preočkovali s hustotou 10⁴ buniek/kalíšok. Nepridala sa žiadna ďalšia látka na opracovanie.

Bunky sa ponechali pokračovať v rásť počas ďalších 6 dní v prítomnosti rastového kultivačného prostredia. Na konci tejto doby sa bunky znova spočítali.

-44Rakovina

Ako je naznačené, zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri liečení porúch bunkového cyklovania. Konkrétnou poruchou bunkového cyklovania je rakovina.,

Rakovina zostáva hlavnou príčinou úmrtnosti vo väčšine západných krajín. Doteraz vyvinuté terapie rakoviny zahrnujú blokovanie pôsobenia alebo syntézy hormónov na inhibovanie rastu od hormónov závislých tumorov. Avšak v súčasnosti sa na liečenie od hormónov závislých tumorov používa agresívnejšia chemoterapia.

Teda, rozvoj farmaceutík určených na protirakovinové liečenie hormónovo závislých a/alebo hormónovo nezávislých tumorov, naviac bez niektorých alebo všetkých vedľajších účinkov spojených s chemoterapiou, by predstavoval hlavnú terapeutickú výhodu.

Je známe, že estrogény podliehajú po ich syntéze početným hydroxylačným a konjugačným reakciám. Donedávna sa myslelo, že takéto reakcie sú časťou metabolického procesu, čo koniec-koncov udržuje estrogény rozpustné vo vode a zvyšuje ich elimináciu z tela. Teraz je evidentné, že niektoré hydroxylové metabolity (napríklad 2-hydroxy- a 16-alfa-hydroxy-) a konjugáty (napríklad estrón-sulfát, E1S) sú dôležité pri riadení určitého komplexného pôsobenia estrogénov v tele.

Autori tohto vynálezu skúmali tvorbu 2- a 16-hydroxylovaných estrogénov vo vzťahu ku stavom, ktoré menia riziko rakoviny prsníka. Teraz existuje dôkaz, že faktory, ktoré zvyšujú 2-hydroxylázovú aktivitu sú spojené so zmenšením rizika rakoviny, kým tie, ktoré zvyšujú 16-alfa-hydroxyláciu môžu zvýšiť riziko rakoviny prsníka. Ďalší záujem o biologickú úlohu estrogénových metabolitov bol stimulovaný r ’ ¹ , , , rastom množstva dôkazov, že 2-metoxyestradiol je endogénny metabolit s antimitotickými vlastnosťami. 2-metoxyestrón-3-O-sulfamát (2-MeOE2) sa tvorí z 2hydroxy-estradiolu (2-OHE2) pomocou katechol-estrogén-metyl-transferázy, enzýmu, ktorý je široko distribuovaný po tele.

Autori tohto vynálezu ukázali, že in vivo 2-MeOE2 inhibuje rast tumorov vznikajúcich zo subkutánnej injekcie Meth A sarkómu, B16 melanómu alebo buniek rakoviny prsníka MDA-MB-435 estrogénový receptor negatívnych (ER-). To tiež inhibuje endotelovú bunkovú proliferáciu a migráciu, a in vitro angiogenézu. Navrhlo

-45sa, že schopnosť 2-MeOE2 inhibovať rast tumoru in vivo môže byť spôsobená ich schopnosťou inhibovať tumorom indukovanú angiogenézu skôr než priamou inhibíciou proliferácie tumorových buniek.

Mechanizmus, pomocou ktorého 2-MeOE2 vykonáva svoje silné antimitogenické a anti-angiogenické účinky, je už vysvetlený. Existuje dôkaz, že pri vysokej koncentrácii môže inhibovať mikrorúrkovú polymerizáciu a pôsobí ako slabý inhibítor kolchicínového viazania na tubulín. Nedávno sa však zistilo, že pri koncentrácii, ktorá blokuje mitózu, tubulínové vlákna v bunkách neboli depolymerizované, ale majú identickú morfológiu, ako vidno po opracovaní taxolom. Je preto možné, že podobne ako taxol, liečivo, ktoré sa používa na terapiu rakoviny prsníka a vaječníkov, 2-MeOE2, pôsobí pomocou stabilizácie mikrorúrkovej dynamiky.

Kým identifikácia 2-MeOE2 ako novej terapie pre rakovinu predstavuje dôležitý pokrok, biodostupnosť orálne podávaných estrogénov je slabá. Môžu ďalej podliehať extenzívnemu metabolizmu počas ich prechodu cez pečeň. Ako súčasť výskumného programu vývoja inhibítora steroid-sulfatázy na terapiu rakoviny prsníka, bol identifikovaný estrón-3-O-sulfamát (EMATE) ako silný na aktívne miesto zameraný inhibítor. Neočakávane sa potvrdilo, že látka EMATE má silné estrogénové vlastnosti, pričom jeho orálna uterotropná aktivita u potkanov je 100krát vyššia než aktivita estradiolu. Predpokladá sa, že jeho zvýšená estrogenicita je výsledok jeho absorpcie červenými krvinkami (rbcs), čo ho chráni pred inaktiváciou počas jeho prechodu cez pečeň a čo pôsobí ako rezervoár pre jeho pomalé uvoľňovanie počas predĺženej doby. Syntetizovali sa a testovali početné A-kruhové modifikované analógy, vrátane 2-metoxyoestrón-3-O-sulfamátu. Kým táto zlúčenina mala rovnakú účinnosť ako látka EMATE akó inhibítor steroid-sulfatázy, nemá estrogenicitu.

Veríme, že zlúčenina podľa tohto vynálezu poskytuje prostriedok pri liečení rakovín a zvlášť rakoviny prsníka.

Okrem toho alebo alternatívne zlúčenina podľa tohto vynálezu môže byť užitočná pri blokovaní rastu rakovín, vrátane leukémie a tuhých tumorov, ako napríklad tumorov prsníka, sliznice maternice, prostaty, vaječníkov a pankreasu.

-46Terapia týkajúca sa estrogénu

Predpokladáme, že niektoré zo zlúčenín podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri kontrole estrogénovej hladiny v tele - konkrétne u žien. Niektoré zo zlúčenín teda môžu byť užitočné ako prostriedok na kontrolu plodnosti - ako napríklad orálne antikoncepčné tablety, pilulky, roztoky alebo pastilky. Alternatívne by táto zlúčenina mohla byť vo forme implantátu alebo ako náplasť.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu teda môžu byť užitočné na liečenie hormonálnych stavov spojených s estrogénom, konkrétne na liečenie hormonálnych stavov spojených s estrogénovým nedostatkom.

Okrem toho alebo alternatívne zlúčenina podľa tohto vynálezu môže byť užitočná na liečenie hormonálnych stavov, okrem stavov spojených s estrogénom. Zlúčenina podľa tohto vynálezu teda môže tiež byť schopná ovplyvniť hormonálnu aktivitu a môže tiež byť schopná ovplyvniť imunitné odozvy.

Neurodegeneratívne choroby

Veríme, že niektoré zo zlúčenín podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri liečení neurodegeneratívnych chorôb a podobných stavov.

Napríklad sa predpokladá, že STS inhibítory môžu byť užitočné na zlepšenie funkcie pamäti pacientov trpiacich takými chorobami, ako je napríklad amnézia, poranenia hlavy, Alzheimerova choroba, epileptická demencia, predsenilná demencia, post-traumatická demencia, senilná demencia, vaskulárna demencia a post-mŕtvicová demencia, alebo jednotlivcov inak sa snažiacich o zlepšenie pamäti.

TH1

Predpokladáme, že niektoré zo zlúčenín podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri TH1 podozreniach.

Napríklad sa predpokladá, že prítomnosť STS inhibítorov v makrofágoch alebo iných antigén prezentujúcich bunkách môže viesť ku poklesu schopnosti senzibilizovaných T buniek spustiť TH1 (vysoký IL-2, IFNy nízky IL-4) odozvu.

Normálny regulačný vplyv iných steroidov, ako napríklad glukokortikoidov, by preto prevládol.

-47Zápalové stavy

Predpokladáme, že niektoré zo zlúčenín podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné na liečenie zápalových stavov - ako napríklad stavov spojených s jedným alebo viacerými javmi: autoimunita, vrátane napríklad reumatickej artritídy, typ I a II cukrovky, systemický lupus erythematosus, roztrúsená skleróza, ťažká myasténia, tyroiditída, vaskulitída, ulcerózna kolitída a Crohnova choroba, poruchy kože napríklad psoriáza a kontaktná dermatitída; choroba štep versus hostiteľ; ekzém: astma a odvrhnutie orgánu po transplantácii.

Napríklad sa predpokladá, že STS inhibítory môžu brániť normálnemu fyziologickému účinku DHEA alebo príbuzných steroidov na imunitnú a/alebo zápalovú odozvu.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné na výrobu medikamentov na odkrytie endogéneho glukokortikoidom podobného účinku.

Iné terapie

Je tiež treba rozumieť, že zlúčenina/farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu môže mať iné dôležité medicínske aplikácie.

Napríklad, zlúčenina alebo farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri liečení porúch uvedených v dokumente WO-A-99/52890.

Okrem toho alebo alternatívne zlúčenina alebo farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri liečení porúch uvedených v dokumente WO-A-98/05635. Pre jednoduchosť odvolávky, časť tohto zoznamu je uvedená teraz: rakovina, zápal alebo zápalové choroby, dermatologické poruchy, horúčka, kardiovaskulárne efekty, hemoragia, koagulačná a akútna fázová odozva, kachexia, , anorexia, akútna infekcia, HlV infekcia, šokové stavy, reakcie štep-verzus-hostiteľ, autoimunitné choroby, reperfúzne poranenia, meningitída, migréna a od aspirínu závislá anti-trombóza; rast, invázia a rozšírenie tumoru, angiogenéza, metastázy, malígnita, ascites (brušná vodnatieľka) a malígny pleurálny výpotok; cerebrálna ischemia, ischemická choroba srdca, osteoartritída, reumatická artritída, osteoporóza, astma, roztrúsená skleróza, neurodegenerácia, Alzheimerova choroba, ateroskleróza, mŕtvica, vaskulitída, Crohnova choroba a ulcerózna kolitída; periodontitída, gingivitída; psoriáza, atopická dermatitída, chronické vredy,

-48pľuzgierikovitá epidermolýza; zvredovatenie rohovky, retinopatia a liečenie chirurgických rán; rinitída, alergická konjunktivitída, ekzém, anafylaxia; restenóza, kongestívne zlyhanie srdca, endometritída, ateroskleróza alebo endoskleróza.

Okrem toho alebo alternatívne zlúčenina alebo farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri liečení alebo poruchách uvedených v dokumente WO-A-98/07559. Pre jednoduchosť odvolávky, časť tohto zoznamu je uvedená teraz: cytokínová a bunková proliferačná/diferenciačná aktivita; imunosupresívna alebo imunostimulačná aktivita (napríklad pri liečení imunitnej nedostatočnosti, vrátane infekcie vírusom ľudskej imunitnej nedostatočnosti; regulácia rastu lymfocytov; liečenie rakoviny a mnohých autoimunitných chorôb, a na zabránenie odvrhnutia transplantátov alebo indukovanej tumorovej imunity); regulácia krvotvorby, napríklad liečenie myeloidných alebo lymfoidných chorôb; podpora rastu kostí, chrupaviek, šliach, väzov a nervového tkaniva, napríklad pri liečení rán, liečenie spálenín, vredov a chorôb periodontu a neurodegenerácia; inhibícia alebo aktivácia folikul-stimulujúcich hormónov (úprava plodnosti); chemotaktická/chemokinetická aktivita (napríklad na mobilizovanie špecifických bunkových typov na miesta poranenia alebo infekcie); hemostatická a trombolytická aktivita, napríklad pri liečení hemofílie a mŕtvice); protizápalové aktivita (pri liečení napríklad septického šoku alebo Crohnovej choroby); ako antimikrobiáfne látky; modulátory napríklad metabolizmu alebo správania sa; ako analgetiká; liečenie porúch špecifickej nedostočnosti; na liečenie napríklad psoriázy, v humánnej alebo veterinárnej medicíne.

Okrem toho alebo alternatívne farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné na liečenie porúch uvedených v dokumente WO-A98/09985. Pre jednoduchosť odvolávky, časť tohto zoznamu je uvedená teraz: makrofágová inhibičná a/alebo T bunková inhibičná aktivita a teda proti-zápalová aktivita; anti-imunitná aktivita, t.j. inhibičné účinky proti bunkovej a/alebo humorálnej imunitnej odozve, vrátane odozvy nespojenej so zápalom; inhibícia schopnosti makrofágov a T buniek prilipnúť na zložky extracelulárnej matrice a fibronektín, ako aj nad-regulovaná expresia „fas“ receptora v T bunkách; inhibícia neočakávanej imunitnej reakcie a zápalu vrátane artritídy, vrátane reumatickej artritídy, zápal spojený s hypersenzitivitou, alergické reakcie, astma, systemický lupus

-49erythematosus, kolagénové choroby a iné autoimunitné choroby, zápal spojený s aterosklerózou, artérioskleróza, aterosklerotická choroba srdca, reperfúzne poranenie, zástava srdca, infarkt myokardu, vaskulárne zápalové poruchy, syndróm respiračnej tiesne alebo iné srdcovo-pľúcne choroby, zápal spojený s peptickým vredom žalúdka, ulcerózna kolitída a iné choroby gastrointestinálneho traktu, hepatická fibróza, cirhóza pečene alebo iné hepatické choroby, tyroiditída alebo iné choroby žliaz, glomerulonefritída alebo iné obličkové a urologické choroby, otitída alebo iné oto-rinolaryngologické choroby, dermatitída alebo iné kožné choroby, choroby periodontu alebo iné dentálne choroby, orchitída alebo epididymoorchitída, neplodnosť, úraz semeníkov alebo iné s imunitou spojené testikulárne choroby, placentová dysfunkcia, placentová nedostatočnosť, obvyklý potrat, eklampsia, pre-eklampsia a iné imunitné a/alebo so zápalmi spojené gynekologické choroby, zadná uveitída, stredná uveitída, predná uveitída, konjunktivitida, chorioretinitída, uveoretinitída, zápal zrakového nervu, vnútroočný zápal, napríklad retinitída alebo cystoidný makulárny edém, „súcitná“ oftalmia, zápal bielka, pigmentová degenerácia sietnice, imunitné a zápalové zložky degeneratívnej choroby očného pozadia, zápalové zložky pri poranení oka, očný zápal spôsobený infekciou, proliferatívne ochorenia sklovca a sietnice, akútna ischemická optická neuropatia, neprimerané zjazvenie, napríklad po glaukómovej filtračnej operácii, imunitná a/alebo zápalová reakcia proti očným implantátom a iné imunitné a so zápalmi spojené očné choroby, zápal spojený s autoimunitnými chorobami alebo stavmi alebo poruchami, kde aj v centrálnom nervovom systéme (CNS) alebo v akomkoľvek inom orgáne, by bolo priaznivé potlačenie imunity a/alebo zápalu, Parkinsonová choroba, komplikácie a/alebo vedľajšie účinky liečenia Parkinsonovej choroby, s AIDS-spojená komplexná demencia, s HlV-spojená encefalopatia, Devicova choroba, Sydenhamova chorea, Alzheimerova choroba a iné degeneratívne choroby, stavy alebo poruchy CNS, zápalové zložky mŕtvice, postpoliomyelitický syndróm, imunitné a zápalové zložky psychiatrických porúch, myelitída, encefalitída, subakútna sklerotizujúca pan-encefalitída, encefalomyelitída, akútna neuropatia, subakútna neuropatia, chronická neuropatia, syndróm GuillaimBarre, Sydenhamova chorea, ťažká myasténia, nepravý nádor mozgu, Downov syndróm, Huntingtonova choroba, amyotrofická laterálna skleróza, zápalová zložka

-50CNS stlačenia alebo úraz CNS alebo infekcie CNS, zápalová zložka svalových atrofií a dystrofii, a s imunitou a zápalom spojené choroby, stavy alebo poruchy centrálneho a periférneho nervového systému, post-traumatický zápal, septický šok, infekčné choroby, zápalové komplikácie alebo vedľajšie účinky pri chirurgii, transplantácii kostnej drene alebo iných transplantačných komplikáciách a/alebo vedľajších účinkoch, zápalových a/alebo imunitných komplikáciách a vedľajších účinkoch génovej terapie, napríklad v dôsledku infekcie s vírusovým nosičom, alebo zápal spojený s AIDS, potlačenie alebo inhibovanie humorálnej a/alebo bunkovej imunitnej odozvy, liečenie alebo zlepšenie monocytovej alebo leukocytovej proiiferatívnej choroby, napríklad leukémie, pomocou zníženia množstva monocytov alebo lymfocytov, prevencia a/alebo liečenie odvrhnutia štepu v prípadoch transplantácie prirodzených alebo umelých buniek, tkaniva a orgánov, ako je napríklad rohovka, kostná dreň, orgány, šošovky, srdcové stimulátory, prírodné alebo umelé kožné tkanivo.

Príprava zlúčeniny

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť pomocou reagovania príslušného alkoholu s vhodným chloridom. Napríklad, sulfamátové zlúčeniny podľa tohto vynálezu môže byť pripravené pomocou reakcie príslušného alkoholu s vhodným sulfamoyl-chloridom vzorca R¹R²NSO₂CI.

Typické podmienky na uskutočnenie reakcie sú nasledujúce.

Hydrid sodný a sulfamoyl-chlorid sa pridávajú do premiešavaného roztoku alkoholu v bezvodom dimetylformamide pri 0 °C. Následne sa reakčná zmes ponechá zahriať sa na laboratórnu teplotu, po čom premiešavanie pokračuje počas ďalších 24 hodín. Reakčná zmes sa vyleje na studený nasýtený roztok hydrogenuhličitanu sodného a výsledná vodná fáza sa extrahuje s dichlórmetánom. Spojené organické extrakty sa vysušia nad bezvodým MgSO₄. Filtrácia, po ktorej nasleduje odparenie rozpúšťadla za vákua a spolu-odparenie s toluénom, čím sa poskytuje surový zvyšok, ktorý sa ďalej čistí pomocou rýchlej chromatografie.

Výhodne je alkohol derivatizovaný, ak je to potrebné, pred reakciou so sulfamoyl-chloridom. Kde je to potrebné, funkčné skupiny alkoholu môžu byť chránené známym spôsobom a ochranná skupina alebo skupiny sa odstránia na

-51 konci reakcie.

Výhodne sa sulfamátové zlúčeniny pripravujú podľa vysvetlení Page a spol. (1990 Tetrahedron 46; 2059 - 2068). Alternatívne môže byť sulfamát zlúčeniny pripravený podľa dokumentov WO 96/05216 alebo WO 96/05217.

Zhrnutie

V sume tento vynález poskytuje nové farmaceutické prípravky vhodné na orálnu antikoncepciu, hormonálnu substitučnú terapiu, inhibíciu E1-STS, ako aj na iné terapeutické aplikácie.

Tento vynález bude teraz opísaný pomocou príkladov s odkazom na sprevádzajúce nákresy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 predstavuje blokovú schému - hlavné spôsoby biotransformácie estradiol-valerátu oproti estradiol-sulfamátu (J995).

Obrázok 2 je graf, ktorý znázorňuje priebeh plazmového estrónu u žien po menopauze (n = 6) po jednorázovej orálnej dávke 1 mg estradiol-sulfamátu (J995).

Obrázok 3 je graf, ktorý znázorňuje priebeh plazmového estrónu u žien po menopauze (n = 6) po jednorázovej orálnej dávke 4 mg estradiol-sulfamátu (J995).

Obrázok 4 je graf, ktorý znázorňuje individuálne variácie plazmovej hladiny po jednorázovej dávke (50 pg) etinylestradiolu danej za rigorózne štandardných podmienok.

Obrázok 5 je graf, ktorý znázorňuje hladiny plazmového estrón-sulfátu u žien po menopauze: porovnanie medzi jednorazovou dávkou 2 mg estradiolsulfamátu (J995) a viacnásobnej orálnej dávky 2 mg estradiol-valerátu (E₂V).

Obrázok 6 je graf, ktorý znázorňuje priebeh plazmového estrón-sulfátu u žien po menopauze (n = 6) po rôznych orálnych dávkach estradiol-sulfamátu (J995) a 2 mg estradiol-valerátu (E2V).

Obrázok 7 sú grafy, ktoré znázorňujú priebeh plazmového estrónu a estradiolu u žien po menopauze (n = 6) po jednorázovej orálnej dávke 2 mg estradiol-sulfamátu (J995) a 2 mg estradiol-valerátu (E₂V).

-52Obrázok 8 sú grafy, ktoré znázorňujú priebeh plazmového estrónu a estradiolu u žien po menopauze (n = 6) po jednorazovej orálnej dávke placebo, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg, 8 mg estradiol-sulfamátu (J995).

Obrázok 9 je graf, ktorý znázorňuje priebeh plazmového estrón-sulfátu (E1S) u žien po menopauze (n = '6) po viacnásobnej orálnej dávke 100 pg estradiolsulfamátu (J995).

Obrázok 10 je graf, ktorý znázorňuje priebeh plazmového estrón-sulfátu u žien po menopauze (n = 6) po jednorázovej orálnej dávke 2 mg estradiol-sulfamátu (J995).

Obrázok 11 sú grafy, ktoré znázorňujú odhad orálnej biodostupnosti estradiol-sulfamátu (J995) pri jednorázovej orálnej dávke 0,5 mg.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Bola pripravená nasledujúca zlúčenina(ny) podľa tohto vynálezu.

Príprava estrón-3-sulfamátu

Hydrid sodný (60 % disperzia; 2 ekvivalenty) a sulfamoylchlorid (2 ekvivalenty) sa pridali do premiešavaného roztoku estrónu (1 ekvivalent) v bezvodom dimetylformamide pri 0 °C. Následne sa reakčná zmes nechala zahriať sa na laboratórnu teplotu, po čom premiešavanie pokračovalo počas ďalších 24 hodín.

Reakčná zmes sa vyliala do studeného nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a výsledná vodná fáza sa extrahovala dichlórmetánom. Spojené organické extrakty sa vysušili nad bezvodým MgSO₄. Filtrácia, po ktorej nasledovalo odparenie rozpúšťadla za vákua a spolu-odparenie s toluénom, čím sa poskytol surový zvyšok, ktorý sa ďalej čistil pomocou rýchlej chromatografie.

Analýza vykázala nasledujúce údaje:

δ ¹H (270 MHz; CD₃OD): 0,91 (s, 3H, Ci₈-Me), 1,40 - 2,55 (séria m, 13H), 2,90 2,92 (m, 2H), 7,04 (široký d, 2H, J = 10,44 Hz), 7,33 (široký d, 1H, J = 8,42 Hz), δ ¹³C (67,8 MHz; CD₃OD): 14,53 (q, Ci₈-Me), 22,80 (t), 27,24 (t), 27,73 (t), 30,68 (t),

33,05 (t), 37,01 (t), 39,76 (d), 45,73 (s, C₁₈), 51,86 (d), 120,76 (d), 123,54 (d),

127,89 (d), 139,83 (s), 150,27 (s), 223,87 (s, C=O).

-53m/z(%): 349 (9) (m⁺), 270 (100), 213 (26), 155 (43), 172 (31), 159 (21), 146 (36),91 (33), 69 (37), 57 (73), 43 (56), 29 (24).

Elementárna analýza:

CHN

Očakávané: 61,87% 6,63% 4,01%

Nájdené: 61,90%6,58% 3,95%

Štúdie s estradiol-sulfamátom (J995)

Technológia

Estradiol-sulfamát (J995) sa skúmal vzhľadom na jeho hormonálne vlastnosti in vitro a in vivo. In vitro štúdie zahrnovali vyhodnotenie jeho špecifického viazania na estrogénové receptory použitím cytosolových prípravkov maternicového tkaniva potkanov a myší MCF-7 tumorových buniek. In vivo štúdie sa vykonali na viacerých druhoch zvierat, vrátane intaktných potkanov a potkanov po odstránení vaječníkov a opíc cynomolgus. Tieto druhy slúžili na podrobné farmakodynamické a farmakokinetické štúdie pri parenterálnom a orálnom podávaní zlúčeniny.

Štúdie na ľuďoch sa vykonali s orálnym podávaním zlúčeniny u žien po menopauze. Vyhodnocovali sa viaceré dávky pri jednorázovom a viacnásobnom podávaní. In vitro štúdie sa vykonali s roztokmi v olejovom vehikule na parenterálne podávanie. Orálne liečenie sa vykonalo so suspenziami kryštalickej látky J995 vo vodnom vehikule. Klinické štúdie sa vykonali s amorfnou liečivovou látkou galenicky upravenou so zmesou konvenčných zložiek ako kapsule alebo tablety.

In vitro štúdie odhalili, že látka J995 samotná nemá afinitu ku estrogénovému receptoru. Nepozorovalo sa špecifické viazanie rádioaktívne označenej J995 na estrogénový receptor myší, potkanov a ľudí. Obrovský prebytok J995 nebol schopný nahradiť špecificky viazaný rádioaktívne označený estradiol. Obe zistenia sú silný dôkaz toho, že J995 má estrogénové účinky po transformácii z hormonálne inaktívnej do hormonálne aktívnej molekuly. Prekurzor látky J995, alebo jeho hlavný metabolit estrón-sulfamát (EMATE), sa hydrolyzuje na kyselinu sulfámovú a prirodzené estrogénové hormóny estradiol a estrón (Obr. 1).

V dôsledku preferenčného transportu v erytrocytoch má prekurzor a J995

-54podivné farmakokinetické vlastnosti. J995 necirkuluje v plazmovej frakcii krvi, v ktorej cirkulujú konvenčné estrogény, ale množstvo 98 až 99 % látky J995 cirkuluje v erytrocytovom podiele. Tento erytrocytový transport vedie k veľmi zníženému pôsobeniu hepatických hormónov a extrakcii pri prvom prechode pečeňou a ku dlhotrvajúcemu uvoľneniu J995 z erytrocytov, ktoré fungujú ako zásobáreň.

Výhody látky J995 vzhľadom na orálnu estrogénovú terapiu:

• Zníženie individuálnych variácií hladín v krvi (Obr. 2 a 3):

Zlatým štandardom orálnej estrogénovej terapie je etinyl-estradiol. Táto zlúčenina nevedie k dobre definovanej hladine v krvi (Obr. 4). Nevýhodou tejto individuálnej variácie je potreba podávať vyššie dávky než je potrebné pre väčšinu jednotlivcov, aby sa dosiahol prijateľný rozsah úspešného liečenia.

• Zníženie estrogénovej dávky a ukladanie aktívnych metabolitov, ktoré sú podozrivé, že podporujú rast niektorých hormonálne závislých tumorov.

Konvenčná orálna estrogénová substitučná terapia s takzvanými konjugovanými estrogénmi, estradiolmi, estradiol-valerátom alebo estrón-sulfátom vedú ku veľkému množstvu estrón-sulfátu v obehu. Hydrolýza niektorých z týchto metabolitov vedie ku terapeuticky relevantným hladinám estrónu a estradiolu v krvi. Avšak, estrón-sulfát má nevýhodu v tom, že je zvlášť aktívne hydrolyzovaný sulfatázou v tkanive tumoru prsníka, čo môže generovať potenciálny rast podporujúcich estrogénov. Látka J995 vo vzťahu ku jej dávke, vedie ku vyšším a oveľa dlhšie trvajúcim estradiolovým hladinám než estradiol-valerát pri rovnakej dávke. (Obr. 6, 7). Ďalej vznikajúci metabolit estrón-sulfát je prítomný najmenej s faktorom 10 nižším, než pri liečení estradiol-valerátom (Obr. 5).

• Zníženie hepatických estrogénových účinkov:

Vysoká dávka estrogénov je podstatná pre konvenčné orálne estrogénové terapie, aby sa kryli podstatné hepatické straty hormónu. Nedostatkom tejto vysokej dávky je nepriaznivý účinok na estragónom regulované hepatické funkcie. Tieto zahrnujú účinok na faktory hemostatického systému a s tým spojené tromboembolické poruchy, zvýšenie angiotenzinogénu v obehu a následné účinky na nadobličkové, obličkové a vaskulárne funkcie, zmeny vo vylučovaní žlče, a lipidový

- 55metabolizmus. Pečeň obchádzajúci mechanizmus pôsobenia J995 a stratégia ultranízkej dávky podľa tohto vynálezu zabráni zodpovedajúcim nežiadúcim účinkom klimakterického estrogénového liečenia. Orálne podávaná látka J1995 dosahuje erytrocytové množstvo takmer 100 %. Ďaleko viac než 50 % tohto prekurzora sa dostane ako estrón a estradiol do obehu (Obr. 11). To dovoľuje veľké zmenšenie dávky v porovnaní s konvenčnou orálnou estrogénovou terapiou za časovú jednotku.

• Dosiahnutie konštantnej hladiny v krvi:

Hladiny estragónov v krvi fluktuujú zo dňa na deň pri konvenčnom dennom orálnom estrogénovom liečení (Obr. 5, 6, 7), kým látka J995 vedie ku veľmi konštantným, dlhotrvajúcim hladinám v krvi (Obr. 5, 6, 7, 8, 9,10). Obrázok 9 vykazuje takmer konštantnú estrón-sulfátovú hladinu, ktorá odráža skoršiu generáciu estradiolu a estrónu po 14 dňoch liečenia s J995 pri veľmi nízkej dávke 100 pg na deň vo vymývacej fáze po 144 hodinách.

• Účinky estradiol-sulfamátu na estrogénovo deficitné kosti:

Konštantné a dobre definované hladiny v krvi, ako je opísané v tomto dokumente, sa nemôžu dosiahnuť s už zavedenými orálnymi estrogénovými terapiami. Látka J995 umožňuje presné osteoprotektívne liečenie tesne pod prahom, ktorý vedie ku endometriálnemu rastu. Neprítomnosť účinku na maternicovú sliznicu dovoľuje vo výhodnom aspekte použitie J995 bez simultánneho podávania progestínov.

Zlepšenia, ktoré sa môžu dosiahnuť pri prípravkoch len s estragónom pri estrogénovej substitučnej terapii založenej na J995 • Terapia bez krvácania:

Logika spojeného estrogén/progestín liečenia je v riadení proliferácie maternicovej sliznice, ktorá predstavuje riziko vývoja rakoviny maternicovej sliznice. Cena za tento ochranný podstatný účinok je dosť značná. Aj cyklické aj kontinuálne spojené liečenie vedie ku maternicovým krvácaniam, ktoré sú pravdepodobne najdôležitejším dôvodom prerušiť estrogénovú substitučnú terapiu.

• Účinky na pocit pohody:

Ďalším známym negatívnym aspektom tohto liečenia je zhoršenie pozitívnych účinkov, ktoré estragóny dávajú k pocitu pohody klimakterických žien.

-56• Prsník:

Vznikajú otázky vzhľadom na proliferatívne účinky progestínov v prsníku v analógii ku účinkom progesterónu pri tehotenstve. Záujem o tieto účinky je spojený s ich potenciálnou úlohou v rozvoju rakoviny prsnej žľazy.

• Vedľajšie účinky na metabolizmus:

Progestíny, ako progesterón samotný, majú dôležité účinky na široké spektrum metabolických funkcií. Tieto zahrnujú vylučovanie inzulínu a inzulínovú rezistenciu, ktorá je zmenšená, a účinky na metabolizmus lipidov. Zodpovedajúce účinky predstavujú nežiadúce efekty v kontexte estrogénovej substitučnej terapie.

Význam estrogénovej substitučnej terapie:

Ženy majú konštantnú stratu kostnej hmoty po prerušení vaječnikovej estrogénovej sekrécie po menopauze. Vzhľadom na fakt, že pravdepodobná dĺžka života žien je veľmi vysoká a stále rastie, je povinnosť brániť kostnej strate a výslednej krehkosti kostry. To je zďaleka najdôležitejší rizikový faktor pre invaliditu a tiež pre chorobnosť a úmrtnosť vo vysokom veku.

Všetky publikácie a patenty zmienené vo vyššie uvedenom opise vynálezu sú v tomto dokumente začlenené ako odkaz.

Rôzne modifikácie a variácie tohto vynálezu budú zrejmé odborníkom v tejto oblasti bez odchýlenia sa od rozsahu a ducha vynálezu. Hoci vynález bol opísaný v spojení so špecifickými výhodnými uskutočneniami, treba rozumieť, že vynález, tak ako je v nárokoch, by nemal byť príliš obmedzený na takéto špecifické uskutočnenia. Preto sú rôzne modifikácie opísaných spôsobov uskutočnenia vynálezu, ktoré sú zrejmé odborníkom v chémii, biológii alebo príbuzných oblastiach, mienené tak, že sú v rozsahu nasledujúcich nárokóv.

Claims (23)

1. Farmaceutický prípravok v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že obsahuje (i) zlúčeninu všeobecného vzorca I

R

K

O) kde X je hydrokarbylový kruh, ktorý má najmenej 4 atómy v kruhu; K je hydrokarbylová skupina; R^s je sulfamátová skupina;

(ii) voliteľne zmiešanú s farmaceutický prijateľným nosičom, zried’ovadlom, vehikulom alebo adjuvansom, kde zlúčenina je prítomná v takom množstve, ktoré poskytne dávku, ktorá nie je väčšia než 200 pg/deň.

2. Farmaceutický prípravok podľa nároku l.vyznačujúci sa tým, že zlúčenina je prítomná v takom množstve, ktoré poskytne dávku od 10 do 200 pg/deň.

3. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m, že zlúčenina je prítomná v takom množstve, ktoré poskytne dávku od 50 do 200 pg/deň.

4. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa t ý m, že zlúčenina je prítomná v takom množstve, ktoré poskytne dávku od 20 do 50 pg/deň.

5. Farmaceutický prípravok podľa nároku l.vyznačujúci sa tým, že zlúčenina je prítomná v množstve nie väčšom než 200 pg/dávku.

6. Farmaceutický prípravok podľa nároku l.vyznačujúci sa tým, že zlúčenina je prítomná v množstve nie väčšom než 1 mg/dávku.

-58I. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že zlúčenina je prítomná v množstve nie väčšom než 4 mg/dávku.

8. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, žeXv kombinácii s K napodobňuje steroidnú štruktúru.

9. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že K je cyklická skupina.

10. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že X je šesťčlenný kruh.

II. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že kruh X má šesť uhlíkových atómov v kruhu.

12. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že zlúčenina má všeobecný vzorec II (II) kde R^s, X a K sú určené v nároku 1.

13. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým.žeXv kombinácii s K je steroidná kruhová štruktúra.

14. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že skupina K a kruh X sú a steroidná kruhová štruktúra alebo jej substituovaný derivát.

-5915. Farmaceutický prípravok podľa nároku 14, vyznačujúci sa t ý m, že R^s skupina je v polohe 3 kruhu X.

16. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že R^s je sulfamátová skupina.

17. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci.sa tým, že zlúčenina má všeobecný vzorec III kde X, K a R^s sú určené v nároku 1; a kde R^h1 je voliteľná halogénová skupina; R^h2 je voliteľná halogénová skupina; prítomný je najmenej jeden z R^h1 a R^h2.

18. Farmaceutický prípravok podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m, že R^h1 je v polohe 2 kruhu X.

19. Farmaceutický prípravok podľa nároku 17 alebo 18, vyznačujúci sa t ý m, že R^h2 je v polohe 4 kruhu X.

20. Farmaceutický prípravok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že zlúčenina všeobecného vzorca I je vybraná zo zlúčenín

17p-estradiol-3-sulfamát

17a-etinyl-173-estradiol-3-sulfamát

-60ΟΗ

I ο

17a-estradiol-3-sulfamát estrón-3-sulfamát (ΕΜΑΤΕ)

ΟΗ ,ΟΗ estriol-3-sulfamát

21. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na použitie v medicíne.

22. Použitie farmacetického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20 na výrobu lieku na orálnu antikoncepciu.

23. Použitie farmaceutického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20 na výrobu lieku na hormonálnu substitučnú terapiu.

24. Použitie farmaceutického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20 na výrobu lieku na ochranu kostí, hormonálnu substitučnú terapiu bez stimulácie sliznice maternice.

25. Použitie farmaceutického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20 na výrobu lieku na liečenie stavov alebo chorôb spojených s STS.

26. Použitie farmaceutického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20 na výrobu lieku na liečenie stavov alebo chorôb spojených s nepriaznivými STS hladinami.