HRP20020665A2 - Composition - Google Patents

Description

Polje izuma

Ovaj se izum odnosi na smjesu.

Osobito, ovaj se izum odnosi na farmaceutsku smjesu koja sadrži spoj u količini da osigura doziranje ne veće od 200μg dnevno. Spoj je ciklički spoj koji sadrži prstenasti sustav i sulfamat grupu. Ovaj se izum također odnosi na upotrebu smjese u terapijskim primjenama.

Pozadina izuma

Estrogeni igraju glavnu ulogu u hormonalnoj kontracepciji, u nadomjesnoj hormonskoj terapiji menopauze (HRT), te za liječenje ginekoloških bolesti (npr. karcinom dojke) i androloških bolesti (npr. karcinom prostate). Za HRT i kontracepciju, estrogeni se uglavnom koriste zajedno s gestagenom, npr. levonorgestrel, desogestrel, noretisteron, ciproteron acetat, klormadinon acetat, dienogest.

Kada se koriste za kontracepciju, estrogeni su potrebni za sigurno potiskivanje sazrijevanja folikula i ovulacije, ali dodatno oni zamjenjuju endogenu ovarijsku sekreciju estradiola koja je potisnuta do najvećeg opsega. Ta zamjena je važna za održavanje umjetnog menstrualnog ciklusa i ostalih genitalnih funkcija, što se ne može izvesti nimalo zadovoljavajuće korištenjem samo gestagena.

Dodatno, endogeni i egzogeni estrogeni ispunjavaju važne funkcije središnjeg živčanog sustava i metabolizma u ženskih organizama: normalne razine estrogena čine odlučujući doprinos ženskoj dobrobiti. Njihova prisutnost u sistemu djeluje protiv razvoja kardiovaskularnih bolesti kroz razne mehanizme: stvaranje "dobrih" lipoproteinskih uzoraka u krvi, inhibiciju odlaganja lipida na stijenke krvnih žila, redukciju krvnog tlaka povoljno utječući na vaskularni tonus, smanjivanje perfuzijskog otpora u esencijalnim vaskularnim sektorima, smanjivanje kontraktilnih podražaja kod vaskularnih mišića. Tunicae intimatae, kada na njih utječu estrogeni, otpuštaju faktore koji djeluju protiv formiranja tromba. Estrogeni su također nezamjenjivi za očuvanje strukture kosti kod žena. Njihova odsutnost može rezultirati razaranjem kostiju (osteoporoza). Ova zadnja "centralno živčana" i "metabolička" djelovanja estrogena su glavni aspekt HRT-a. Može se smatrati da estrogeni imaju analognu funkciju kod muškog organizma, te da njihovo povlačenje rezultira sličnim poremećajima kao i kod žena. Jedna razlika između dva spola je da proizvodnja hormona kod muškaraca prestaje manje pravilno i u većoj starosti nego kod žena.

Ali usprkos svim pozitivnim aspektima estrogenske terapije postoje neriješeni problemi, također, koji ograničavaju terapeutsku upotrebu estrogena ili imaju za nužnu posljedicu neželjene učinke.

Poznati estrogeni pokazuju farmakokinetičke nedostatke. Prirodni estrogeni (estradiol, estron, estron sulfat, esteri estradiola, estriol) postaju biodostupni samo u vrlo malom stupnju kada su uzeti oralno. Taj stupanj može toliko varirati od osobe do osobe da se općenite preporuke za doziranje ne mogu dati. Brza eliminacija tvari iz krvi je drugi problem. Estrogenski nadomjestak u okviru HRT često treba biti podešen za pojedinca.

Isto je sa sintetičkim estrogenima. Najvažniji sintetički preinačen estrogenski steroid je etinil estradiol (EE). Taj estrogen je dominantan u oralnoj hormonalnoj kontracepciji. Pored EE, mestranol se koristi u par slučajeva; to je "preteča" koja se metabolizira do EE u organizmu. Kada se primjenjuje oralno kod ljudi, EE ima puno bolju biodostupnost od prirodnih estrogena spomenutih gore, ali njegova biodostupnost varira u širokom opsegu od pojedinca do pojedinca. Mnogi su autori ukazali na to kao i na činjenicu da je dokazano da su koncentracije u krvi bile vrlo nepravilne nakon oralne primjene te tvari (Goldzieher, J. W. 1989, Goldzieher, J. W. 1990, Humpel, M. 1987, Kuhnz, 1993).

Dodatno, poznati estrogeni pokazuju farmakodinamičke nedostatke. Nakon resorpcije iz intestinalnog lumena, oralno primijenjeni djelatni sastojci ulaze u organizam kroz jetru. Ta je činjenica od specifične važnosti za estrogenska sredstva pošto je jetra ciljni organ za estrogene; oralni unos estrogena rezultira jakim estrogenskim učincima u jetri. Sekrecijsko djelovanje koje je kontrolirano estrogenima u humanoj jetri uključuje sintezu transfer proteina CBG, SHBG, TBG, angiotenzinogena, nekoliko faktora koji su važni za fiziologiju grušanja krvi, te lipoproteina. Ako su prirodni estrogeni uvedeni u ženski organizam zaobilazeći prolaz kroz jetru (npr. transdermalnom primjenom), spomenute funkcije jetre ostaju prividno nepromijenjene. Terapeutski ekvivalentne doze prirodnih estrogena (pogledaj definiciju gore), kada su primijenjene oralno, rezultiraju jasnim odgovorima hepatičkih parametara: povećanje SHBG, CBG, angiotenzinogena, HDL (lipoprotein visoke gustoće). Ti hepatički učinci estrogena su jasno jači kada se, umjesto prirodnih estrogena, koriste formulacije konjskog estrogena (takozvani konjugirani estrogeni)(Campbell, S. et al., 1981). Etinil estradiol i DES imaju još jači hepatički estrogenicitet.

Što se tiče antigonadotropnih značajki, EE je približno četiri do 18 puta više estrogeničan u jetri nego što su oralno primijenjeni prirodni estrogeni (Campbell, S. et al., 1981). To je vrlo nepovoljna raspodjela značajki.

Ti nedostaci su od znatne kliničke važnosti kada se trebaju primjeniti poznati prirodni i sintetski estrogeni.

Poznata komplikacija koja se može dogoditi nakon primjenjivanja visokih doza estrogena muškarcima koji pate od karcinoma prostate je fatalna tromboembolija. Potencijal EE-a da poluči popratne učinke u jetri određuje, iako u donekle oslabljenom obliku, strategiju oralne hormonske kontracepcije. U pogledu željenih kontraceptivnih učinaka i održavanja menstrualnog procesa s jedne strane, te potrebu uzimanja u obzir potencijala znatnih popratnih učinaka s druge, kontroliranje razina EE-a u krvi može se usporediti s hodom po konopcu. Sasvim je moguće da veliki postotak žena ne može primijeniti oralne kontraceptive jer ili nepravilnost menstrualnog krvarenja ili popratni učinci povezani s estrogenom prelaze prag tolerancije.

Dokaz sugerira da su estrogeni glavni mitogeni uključeni u promicanje rasta tumora u endokrino-zavisnim tkivima, kao što su dojke i endometrij. Premda su koncentracije estrogena u plazmi slične kod žena sa ili bez raka dojke, razine estrona i estradiola tumora dojke su značajno više nego u normalnom tkivu dojke ili krvi. Misli se da In situ sinteza estrogena čini važan doprinos visokim razinama estrogena u tumorima te su stoga inhibitori, osobito specifični inhibitori, biosinteze estrogena od potencijalne vrijednosti za tretman endokrino-zavisnih tumora.

Kroz zadnje dvije dekade postojao je znatan interes u razvoju inhibitora aromataza puta - koji prevodi androgeni prekursor androstendion u estron. Ipak, sada postoji dokaz da je estron sulfataza (E1-STS) put, i.e. hidroliza estron sulfata do estrona (E1S do E1), suprotno od aromataza puta, glavni izvor estrogena u tumorima dojke. Ta je teorija podržana umjerenim smanjivanjem koncentracije estrogena u plazmi kod žena u postmenopauzi s rakom dojke tretiranim inhibitorima aromataze, kao što je aminoglutetimid i 4-hidroksiandrostendion, te također činjenicom da koncentracija E1S u plazmi kod tih pacijenata tretiranih inhibitorom aromataze ostaje relativno visoka. Dugi poluvijek E1S u krvi (10-12 sati) u u sporedbi s nekonjugiranim estrogenima (20 minuta) te visoke razine djelovanja steroid sulfataze u jetri i, normalna i maligna tkiva dojke, također pruža podršku ovoj teoriji.

PCT/GB92/01587 poučava nove inhibitore steroid sulfataze i farmaceutske smjese koje ih sadrže za upotrebu u tretmanu estron-zavisnih tumora, posebno raka dojke. Ti inhibitori steroid sulfataze su esteri sulfamata, kao što je N,N-dimetil estron-3-sulfamat i, preferira se, estron-3-sulfamat (drugačije znan kao "EMAT"). Dalji esteri sulfamata su objavljeni u WO 96/05216 i WO 96/05217. Ti esteri sulfamata uključuju estradiol-3-sulfamat (ovdje označen kao J995)

EMAT (estron-3-O-sulfamat) - ima slijedeću strukturu:

[image]

Poznato je da je EMAT snažan inhibitor E1-STS pošto pokazuje 99%-tnu inhibiciju djelovanja E1-STS u intaktnim MCF-7 stanicama pri 0.1 mM. EMAT također inhibira E1-STS enzim na način ovisan o vremenu i koncentraciji, što pokazuje da djeluje kao inaktivator usmjeren na djelatno mjesto. Makar je EMAT izvorno bio namijenjen za inhibiciju E1-STS, on također inhibira dehidroepiandrosteron sulfatazu (DHA-STS), koja je enzim za koji se vjeruje da ima glavnu ulogu u reguliranju biosinteze estrogenskog steroida androstendiola. Također, sada postoji dokaz za sugeriranje da androstendiol može imati čak i veću važnost kao promotor rasta tumora dojke. EMAT je također djelatan in vivo pošto je gotovo potpuna inhibicija djelovanja E1-STS iz štakorove jetre (99%) i DHA-STS (99%) bila rezultat njegovog bilo oralnog bilo subkutanog davanja. Dodatno, EMAT je bio pokazao da ima učinak poboljšanja memorije kod štakora. Studije kod miševa su bile sugerirale povezanost između DHA-STS djelovanja i regulacije dijela imunološkog odgovora. Smatra se da se to može također dogoditi kod ljudi. Premošćujući O atom sulfamatnog dijela u EMAT-u je važan za inhibitorno djelovanje. Stoga, kada je 3-O-atom zamijenjen drugim heteroatomima kao kod estron-3-N-sulfamata i estron-3-S-sulfamata, ti analozi su slabiji o vremenu neovisni inaktivatori.

Premda se optimalna moć inhibicije E1-STS mogla postići EMAT-om, moguće je da se estron može otpustiti za vrijeme inhibicije sulfataze te da EMAT i njegov srodnik estradiol mogu posjedovati estrogensko djelovanje.

Ahmed et al (Biochem Biophys Res Commun 1999 Jan 27;254(3):811-5) izvještavaju o studiji odnosa strukture i djelovanja steroidnih i nesteroidnih inhibitora STS-a.

Stoga je cilj ovog izuma pružiti nove smjese prikladne za oralnu kontracepciju, nadomjesnu hormonsku terapiju, inhibiciju E1-STS-a kao i za druge terapeutske primjene.

Sažeti aspekti ovog izuma

Ovaj je izum baziran na iznenađujućem nalazu da smjese koje pružaju ciklički spoj, a koji ciklički spoj sadrži prstenasti sistem i sulfamat grupu ("sulfamat spoj"), u količini da osigura doziranje ne veće od 200μg dnevno, može pružiti oralnu kontracepciju, nadomjesnu hormonsku terapiju i/ili inhibiciju E1-STS-a. U obliku doze pružene ovim izumom, isporučeni spojevi pokazuju povoljniji odnos između željenih i terapeutski neželjenih učinaka.

Sulfamat spojevi sadrže najmanje jednu prstenastu komponentu. Ta prstenasta komponenta sadrži najmanje četiri atoma u prstenu. Tipično, ta četiri atoma će biti ugljikovi atomi. Stoga će, tipično, ta prstenasta komponenta biti hidrokarbil grupa. Ciklički spoj također uključuje sulfamat grupu kao daljnji (daljnje) supstituent(e) u prstenastom sistemu. Sulfamat grupa je supstituent na prstenastoj komponenti.

Detaljni aspekti ovog izuma

U skladu s jednim aspektom ovog izuma, pružena je farmaceutska smjesa koja sadrži

(i) spoj formule (I)

[image] Formula I

gdje: X je hidrokarbil prsten koji ima najmanje četiri atoma u prstenu; K je hidrokarbil grupa; Rs je sulfamat grupa;

(ii) opcionalno pomiješanu s farmaceutski prihvatljivim prijenosnikom, diluentom, ekscipijentom ili adjuvantom,

gdje je spoj prisutan u količini da osigura dozu ne veću od 200 μg dnevno.

U alternativnom aspektu ovaj izum pruža farmaceutsku smjesu koja sadrži spoj, gdje je spoj prisutan u takvoj količini da je spoj opisan gore ili njegov metabolit pružen krvnoj plazmi subjekta koji se tretira u količini ne većoj od 200μg dnevno.

Gornje najveće doze i sve doze na koje se odnosi u ovoj specifikaciji se odnose na doze za subjekt mase 70 kg, osim ako nije drugačije naznačeno. Iskusna stručna osoba bi bila lako sposobna modificirati deklamirane doze za subjekt koji nema masu 70 kg

Dnevna doza je izračunata dijeljenjem doze koja se daje subjektu predviđenim periodom doziranja u danima. Predviđeni period doziranja će tipično biti period do slijedećeg davanja, period kroz koji doza djeluje, ili period kroz koji bi doza trebala imati učinak.

U skladu s jednim aspektom ovog izuma, pružena je smjesa u skladu s ovim izumom za upotrebu u medicini.

U skladu s jednim aspektom ovog izuma, pružena je upotreba smjese u skladu s ovim izumom u proizvodnji medikamenta za upotrebu u oralnoj kontracepciji.

U skladu s jednim aspektom ovog izuma, pružena je upotreba smjese u skladu s ovim izumom u proizvodnji medikamenta za upotrebu u nadomjesnoj hormonskoj terapiji.

U skladu s jednim aspektom ovog izuma, pružena je upotreba smjese u skladu s ovim izumom u proizvodnji medikamenta za upotrebu u terapiji stanja ili bolesti povezanih s STS-om.

U skladu s jednim aspektom ovog izuma, pružena je upotreba spoja u skladu s ovim izumom u proizvodnji medikamenta za upotrebu u terapiji stanja ili bolesti povezanih s štetnim razinama STS-a.

U skladu s jednim aspektom ovog izuma, pružena je metoda tretiranja subjekta koja sadrži davanje rečenom subjektu spoja u skladu s ovim izumom u količini ne većoj od 200μg dnevno.

Za olakšavanje reference, ovi i dalji aspekti ovog izuma su sada raspravljeni pod prikladnim naslovima odlomaka. Ipak, poučavanja pod svakim poglavljem nisu nužno ograničena na svako određeno poglavlje.

Preferirani aspekti

Preferira se da je spoj prisutan u smjesi u količini da osigura dozu od 10 do 200 μg dnevno.

Preferira se da je spoj prisutan u smjesi u količini da osigura dozu od 50 do 200 μg dnevno.

Preferira se da je spoj prisutan u smjesi u količini da osigura dozu od 20 do 50 μg dnevno.

U daljem aspektu, spoj je prisutan u smjesi u količini da osigura dozu ne veću ni manju nego 100 μg dnevno.

Smjesa može biti tako formulirana da će dnevno, tjedno, ili mjesečno davanje pružiti željenu dnevnu dozu. Na primjer, ovaj izum može pružiti smjesu koja sadrži sulfamat spoj u količini ne većoj od 200μg po dozi (za dnevne doze), ne većoj od 1.4 mg po dozi (tjedne doze) ili ne većoj od 5 mg po dozi (mjesečna doza). Uvažiti će se da smjesa može također biti formulirana za davanje rjeđe ili češće nego dnevno, tjedno ili mjesečno.

Preferira se da X u kombinaciji s K oponaša steroidnu strukturu.

Preferira se da je K ciklička grupa.

Preferira se da je X šesteročlani prsten.

Preferira se da prsten X ima šest ugljikovih atoma u prstenu.

Preferira se da spoj formule I ima formulu predstavljenu kao formula II gdje svaki Rs, X i K imaju gore spomenuta značenja.

[image] Formula II

Preferira se da će grupa K i prsten X zajedno sadržavati, uključujući sve supstituente, najviše približno 50 ugljikovih atoma, uobičajenije ne više od približno 30 do 40 ugljikovih atoma.

Preferira se da je X u kombinaciji s K prstenasta steroidna struktura.

Preferira se da su grupa K i prsten X prstenasta steroidna struktura ili njihovi supstituirani derivati.

Preferira se da je Rs grupa na poziciji 3 u prstenu X.

Preferira se da je Rs sulfamat grupa.

Preferira se da je spoj ima formulu III

[image] Formula III

gdje su X, K i Rs kao što su definirani gore; te gdje Rh1 je opcionalno halo grupa; Rh2 je opcionalno halo grupa; barem jedan od Rh1 i Rh2 je prisutan

Preferira se da je Rh1 na poziciji 2 prstena X.

Preferira se da je Rh2 na poziciji 4 prstena X.

Za neke primjene, preferira se da spojevi nemaju ili imaju minimalno estrogenski učinak.

Za neke primjene, preferira se da spojevi imaju estrogenski učinak.

U jednom aspektu, smjesa ovog izuma su korisne za liječenje raka dojke.

NEKE PREDNOSTI

Ključne prednosti ovog izuma uključuju poboljšanu farmakokinetiku i farmakodinamiku smjese ovog izuma.

Jedna ključna prednost ovog izuma je ta da pri isporučenoj dozi sulfamat spojevi imaju niski hepatički metabolizam. Vjeruje se da spojevi ovog izuma, kao što je EMAT i J995, imaju visoki afinitet za eritrocite, do 99% spoja u krvi je tako vezan. Prolaz spoja kroz jetru u ovom odjeljku izbjegava ekstrakciju, metabolizam i djelovanje hepatičkog prvog prolaza. Stoga isporučeni sulfamat spojevi imaju visoku biodostupnost.

Daljnja ključna prednost ovog izuma je ta da sulfamat spojevi pokazuju nisko variranje u koncentraciji u plazmi među pojedincima. Smanjenje variranja razina estrogena u krvi među pojedincima osobito omogućuje opskrbljivanje monoproizvoda za histrektomirane kao i za nehistrektomirane subjekte bez potrebe razvijanja odvojenih proizvoda.

Daljnja ključna prednost ovog izuma je ta da sulfamat spojevi pokazuju sporu eliminaciju iz subjekta. Smjesa ovog izuma osigurava stabilne razine estrona (E1) i estradiola (E2) u plazmi.

Jedna ključna prednost ovog izuma je ta da pri isporučenoj dozi sulfamat spojevi imaju nisko hormonsko djelovanje. Stoga je rizik od tromboze dubokih vena smanjen.

Jedna ključna prednost ovog izuma je ta da je pri isporučenoj dozi osigurana zaštita kostiju, usprkos tome što je doza ispod endometrijskog praga proliferacije/stimulacije. Kao što je opisano gore, estrogeni su nezamijenjivi za očuvanje strukture kosti kod žena. Njihovo odsustvo može rezultirati u razaranju kosti (osteoporoza). Ipak, u tipičnoj HRT estron se daje u takvoj dozi da, kao što ima i povoljnih učinaka, endometrij proliferira. Smjesa ovog izuma pruža nadomjesnu hormonsku terapiju za zaštitu kosti bez endometrijske stimulacije.

Stoga u daljem aspektu ovaj izum pruža upotrebu spoja kako je definirana ovdje, preferira se smjese kako je definirana ovdje, u izradi medikamenta za nadomjesnu hormonsku terapiju za zaštitu kosti bez endometrijske stimulacije.

Slijedeća je prednost da smjesa može biti formulirana bez ugrađivanja progestina.

Slijedeća je prednost da smjesa može biti formulirana bez ugrađivanja gestagena.

Slijedeća je prednost da neki spojevi ne mogu biti metabolizirani do spojeva koji pokazuju ili potiču hormonalno djelovanje.

Neki od spojeva ovog izuma su također prednosni po tome što mogu biti oralno djelatni.

Neki od spojeva ovog izuma mogu biti korisni za tretman raka, kao što je rak dojke, kao i (ili alternativno) nemalignih stanja, kao što je prevencija autoimunih bolesti, osobito kada može biti potrebno da se farmaceutici davaju od mlađe dobi.

Stoga se za neke spojeve ovog izuma također vjeruje da imaju druge terapeutske primjene osim za tretman endokrino-zavisnih rakova, kao što je tretman autoimunih bolesti.

NADOMJESNA HORMONSKA TERAPIJA

Smjesa ovog izuma se može formulirati da pruži nadomjesnu hormonsku terapiju. Smjesa će biti formulirana da sadrži sulfamat spoj u takvoj količini da je, zavisno o prepisanoj učestalosti davanja, pružena tražena dnevna doza sulfamat spoja.

U jednom aspektu smjesa će biti formulirana da omogući dnevno doziranje. Ta smjesa može biti formulirana u kombinaciji s progestinima.

U svim aspektima ovog izuma, uključujući dnevno oralno davanje, nadomjesna hormonska terapija je postignuta na prikladniji način nego primjena transdermalnog flastera, što je jedan tipični put davanja HRT-a.

DNEVNO

Kada se pruža dnevni režim, na primjer, davanja 100 μg dnevno, primijećene su osobito slijedeće ključne prednosti

smanjivanje u variranju razina estrogena u krvi subjekta među pojedincima

stabilne razine E1 i E2 u plazmi

Kada se pruža dnevni režim davanja 20 do 50 μg dnevno, primijećene su osobito slijedeće ključne prednosti

nije primijećeno krvarenje iz uterusa

nema utjecaja na mliječnu žlijezdu

TJEDNO

U jednom aspektu će smjesa biti formulirana da omogući tjedno davanje. Tjedna doza od 0.5 do 2 mg tjedno, na primjer 1 mg tjedno se može pružiti.

Tjedna će doza biti prednosna zbog praktičnosti naprema flastera kao i dnevnog davanja smjese ovog izuma.

MJESEČNO

Također je predviđena mjesečna HRT smjesa ovog izuma u kojoj je pružena jedinična mjesečna doza spoja od 2 do 4 mg, ili do 5 mg po dozi.

Nadalje, farmaceutska smjesa koja sadrži spojeve u skladu s izumom može se koristiti za tretman endometrioza te za terapiju estrogen-zavisnih tumora. S obzirom na to, jedna ključna prednost ovog izuma je ta da sulfamat spojevi ovog izuma mogu djelovati kao inhibitori steroid sulfataze.

STEROID SULFATAZA

Steroid sulfataza - na koju se ponekad upućuje kao na steroid sulfatazu ili steril sulfatazu ili, kraće, "STS" - hidrolizira nekolicinu sulfoniranih steroida, kao što je estron sulfat, dehidroepiandrosteron sulfat i kolesterol sulfat. STS-u je bio dodijeljen enzimski broj EC 3.1.6.2.

STS je bio kloniran i ekspresiran. Na primjer pogledaj Stein et al (J. Biol. Chem. 264:13865-13872 (1989)) i Yen et al (Cell 49:443-454(1987)).

STS je enzim koji je bio umješan u brojna oboljenja.

Primjerice, istraživači su pronašli da potpuni manjak STS-a dovodi do ihtioze. U skladu s nekim istraživaćima, manjak STS-a prilično prevladava u Japanu. Isti istraživači (Sakura et al, J Inherit Metab Dis 1997 Nov;20(6):807-10) su također izvijestili da alergijske bolesti - kao što je bronhijalna astma, alergički rinitis ili atopični dermatitis - mogu biti povezane s manjkom steroid sulfataze.

Dodatno oboljenjima do kojih dolazi kroz potpuno odsustvo STS djelovanja, povećana razina STS djelovanja može također dovesti do oboljenja. Primjerice, te kako je naznačeno gore, postoji čvrsti dokaz koji podržava ulogu STS-a u rastu raka dojke i metastazama.

STS je također bio uključen u druga oboljenja. Primjerice, Le Roy et al (Behav Genet 1999 Mar;29(2):131-6) su odredili da može postojati genetička korelacija između koncentracije steroid sulfataze te začinjanja napadačkog ponašanja kod miševa. Autori zaključuju da sulfatacija steroida može biti pokretač kompleksne mreže, uključujući gene za koje je pokazano da su uključeni u agresiju mutagenezom.

INHIBICIJA STS-a

Vjeruje se da neka oboljenja povezana s djelovanjem STS-a nastaju zbog pretvaranja nedjelatnog, sulfatiranog, estrona u djelatni, nesulfatirani estron. Kod oboljenja povezanih s djelovanjem STS-a, bilo bi poželjno inhibirati djelovanje STS-a.

Ovdje pojam "inhibirati" uključuje smanjiti i/ili eliminirati i/ili maskirati i/ili spriječiti štetno djelovanje STS-a.

INHIBITOR STS-a

U skladu s ovim izumom, spoj ovog izuma je sposoban djelovati kao inhibitor STS-a.

Ovdje pojam "inhibitor" kako se ovdje koristi s obzirom na spoj ovog izuma znači spoj koji može inhibirati djelovanje STS-a - kao npr. smanjiti i/ili eliminirati i/ili maskirati i/ili spriječiti štetno djelovanje STS-a. Inhibitor STS-a može djelovati kao antagonist.

Sposobnost spojeva da inhibiraju djelovanje estron sulfataze može se ocijeniti korištenjem ili intaktnih MCF-7 stanica raka dojke ili mikrosoma placente. Dodatno, može se koristiti životinjski model. Detalji o prikladnim analitičkim protokolima su predstavljeni u slijedećim poglavljima. Treba zamijetiti da se druge analize mogu koristiti za određivanje djelovanja STS-a pa stoga i inhibicije STS-a. Na primjer može se uputiti također na poučavanje WO-A-99/50453.

Preferira se, za neke primjene, da je spoj dalje karakteriziran značajkom da ako bi sulfamat grupe bile supstituirane sulfat grupom kako bi se oblikovao derivat sulfata, tada bi derivat sulfata mogao biti hidroliziran enzimom koji ima djelovanje steroid sulfataze (E.C.3.1.6.2) - i.e. kada bi bio inkubiran sa steroid sulfatazom EC 3.1.6.2 pri pH 7.4 i 37°C.

U jednom preferiranom aspektu, ako bi sulfamat grupa spoja bila zamijenjena sulfat grupom da oblikuje sulfat spoj, tada bi taj sulfat spoj mogao biti hidroliziran enzimom koji ima djelovanje steroid sulfataze (E.C.3.1.6.2), te bi prinjeo Km vrijednost manju od 200 mmolarne, preferira se manje od 150 mmolarne, preferira se manje od 100 mmolarne, preferira se manje od 75 mmolarne, preferira se manje od 50 mmolarne, kada bi bio inkubiran sa steroid sulfatazom EC 3.1.6.2 pri pH 7.4 i 37°C.

U preferiranom aspektu, spoj ovog izuma se ne može hidrolizirati enzimom koji ima djelovanje steroid sulfataze (E.C.3.1.6.2).

Za neke primjene, preferira se da spoj ovog izuma ima najmanje približno stostruku selektivnost za željeni cilj (e.g. STS), preferira se najmanje približno stopedeseterostruku selektivnost za željeni cilj, preferira se najmanje približno dvjestostruku selektivnost za željeni cilj, preferira se najmanje približno dvjestopedeseterostruku selektivnost za željeni cilj, preferira se najmanje približno tristostruku selektivnost za željeni cilj, preferira se najmanje približno tristopedeseterostruku selektivnost za željeni cilj.

Treba zamijetiti da spoj ovog izuma može imati druge blagotvorne značajke dodatno ili alternativno svojoj sposobnosti inhibiranja djelovanja STS-a.

GRUPA K

Grupa K ne treba biti ciklička struktura. S obzirom na to, grupa K može biti linearna struktura koja može, in vivo, imati sposobnost konformacije u strukturu nalik prstenu.

U preferiranom aspektu, grupa K je ciklička - takva kao da oblikuje cikličku grupu K.

Ciklička grupa K ne mora nužno biti fuzionirana u prsten X. S obzirom na to, one mogu biti odvojene odgovarajućom grupom poveznikom (spacer)- koja može biti hidrokarbil grupa.

U preferiranom aspektu ciklička grupa K je fuzionirana na prsten X.

Grupa K može biti policiklička grupa, što ne mora biti fuzionirani policikl.

Stoga, u preferiranom aspektu, grupa K i prsten X tvore policiklički spoj. Kao što je naznačeno, ovdje pojam "policiklički" uključuje fuzionirane i nefuzionirane prstenaste strukture uključujući njihove kombinacije.

Najmanje jedna od cikličkih grupa K i X mogu biti heterociklička grupa (heterocikl) ili neheterociklička grupa.

Najmanje jedna od cikličkih grupa K i X mogu biti zasićena prstenasta struktura ili nezasićena prstenasta struktura (kao što je aril grupa).

Preferira se da je najmanje jedna od cikličkih grupa aril prsten.

Ako je ciklička grupa policiklička, neke ili sve komponente prstena spoja mogu biti fuzionirane zajedno ili združene preko jedne ili više prikladnih grupa poveznika.

Policiklički spoj može sadržavati brojne fuzionirane prstene. U tom aspektu fuzionirani prsteni mogu sadržavati bilo koju kombinaciju prstena različitih veličina, kao što je tri šesteročlana prstena (6,6,6), šesteročlani prsten, sedmeročlani prsten i šesteročlani prsten (6,7,6), šesteročlani prsten i dva osmeročlana prsena (6,8,8) itd.

U jednom aspektu ovaj izum se odnosi na spojeve gdje policiklički spojevi nisu (6,6,7) prsteni. U daljem aspektu, ovaj izum se odnosi na spojeve gdje policiklički spojevi sadrže samo prstene koji nemaju sedam članova.

Preferira se da će policiklički spojevi sadržavati uključujući sve supstituente ne više od 50 približno ugljikovih atoma, uobičajenije ne više od približno 30 do 40 ugljikovih atoma.

Policiklički spojevi mogu sadržavati najmanje dvije prstenaste komponente, ili najmanje tri prstenaste komponente, ili najmanje četiri prstenaste komponente.

Preferira se da policiklički spojevi sadrže četiri prstenaste komponente.

Preferirani policiklički spojevi imaju steroidnu prstenastu komponentu, ili njihove bio-izostere.

HIDROKARBIL

Pojam "hidrokarbil grupa" kako se ovdje koristi znači grupu koja sadrži barem C i H te može opcionalno sadržavati jedan ili više drugih prikladnih supstituenata. Primjeri takvih supstituenata mogu uključiti halo, alkoksi, nitro, alkil grupu, cikličku grupu itd. Dodatno mogućnosti supstituenata da budu ciklička grupa, kombinacija supstituenata može oblikovati cikličku grupu. Ako hidrokarbil grupa sadrži više od jednog C, onda ti ugljici ne moraju nužno biti vezani jedan za drugi. Na primjer, najmanje dva ugljika mogu biti vezani preko prikladnog elementa ili grupe. Tako hidrokarbil grupa može sadržavati heteroatome. Priladni heteroatomi će biti očiti iskusnim stručnjacima te uključuju, na primjer, sumpor, dušik i kisik. Neograničavajući primjer hidrokarbil grupe je acil grupa.

Tipična hidrokarbil grupa je ugljikovodična grupa. Ovdje pojam "ugljikovodik" znači bilo koju alkil grupu, alkenil grupu, alkinil grupu, a koje grupe mogu biti ravnolančane, razgranate ili cikličke, ili aril grupu. Pojam ugljikovodik također uključuje ove grupe osim gdje su one bile opcionalno supstituirane. Ako je ugljikovodik razgranata struktura koja ima na sebi supstituent(e), tada supstitucija može biti na glavnom ugljikovodičnom lancu kao i na postranom; alternativno supstitucije mogu biti na glavnom ugljikovodičnom lancu i na postranom.

SULFAMAT GRUPA

U jednom aspektu, prsten X ima sulfamat grupu kao supstituent. Pojam "sulfamat" kako se ovdje koristi uključuje ester amidosulfonske kiseline ili ester N-supstituiranog derivata amidosulfonske kiseline, ili njegovu sol.

Ako je Rs sulfamat grupa tada se na spoj ovog izuma upućuje kao na sulfamat spoj.

Tipično, sulfamat grupa ima formulu:

(R1)(R2)N-S(O)(O)-O-

gdje, preferira se, R1 i R2 su nezavisno odabrani među: H, alkil, cikloalkil, alkenil i aril, ili njihova kombinacija, ili zajedno predstavljaju alkilen, gdje ili svaki alkil ili cikloalkil ili alkenil ili opcionalno sadrži jedan ili više heteroatoma ili grupa.

Kada su supstituirani, N-supstituirani spojevi ovog izuma mogu sadržavati jedan ili dva N-alkil, N-alkenil, N-cikloalkil ili N-aril supstituenta, koji, preferira se, sadrže ili svaki sadrži najviše 10 ugljikovih atoma. Kada je R1 i/ili R2 alkil, preferirane vrijednosti su one gdje su R1 i R2 svaki nezavisno odabrani među nižim alkil grupama koje sadrže od jednog do šest ugljikovih atoma, recimo metil, etil, propil itd. R1 i R2 mogu oba biti metil. Kada R1 i/ili R2 je aril, tipične vrijednosti su fenil i tolil (PhCH3; o). Gdje R1 i R2 predstavljaju cikloalkil, tipične vrijednosti su ciklopropil, ciklopentil, cikloheksil itd. Kada su združeni zajedno R1 i R2 tipično predstavljaju alkilen grupu koja pruža lanac od četiri do šest ugljikovih atoma, opcionalno prekinut jednim ili s više heteroatoma ili grupa, npr. da pruži peteročlani heterocikl, npr. morfolino, pirolidino ili piperidino.

Unutar vrijednosti alkil, cikloalkil, alkenil i aril su uključene supstituirane grupe koje u tome sadrže kao supstituente jednu ili više grupa koje ne interferiraju s djelovanjem inhibiranja sulfataze od strane spoja o kojem se radi. Primjeri neinterferirajućih supstituenata uključuju hidroksi, amino, halo, alkoksi, alkil i aril.

U nekim aspektima, sulfamat grupa može oblikovati prstenastu strukturu fuzioniranjem na (ili združivanjem s) jednim ili više atoma u ili na grupi X.

U nekim aspektima može biti više od jedne sulfamat grupe. Primjerice, mogu postojati dva sulfamata (i.e bis-sulfamat spojevi). Ako su ti spojevi bazirani na steroidnoj jezgri, preferira se da je druga (ili barem jedna od dodatnih) sulfamat grupa locirana na poziciji 17 steroidne jezgre. Te grupe ne moraju biti iste.

U nekim preferiranim aspektima, najmanje jedna od R1 i R2 je H.

U nekim dalje preferiranim aspektima, svaka od R1 i R2 je H.

OPONAŠANJE

U jednom aspektu, X i K mogu oponašati steroidnu prstenastu strukturu.

Pojam "oponašanje" kako se ovdje koristi znači posjedovanje slične ili različite strukture ali također posjedovanje sličnog funkcionalnog učinka. Drugim riječima, grupa K i prsten X zajedno mogu biti bio-izoster prstenova steroida, ili njihov djelatni dio.

U preferiranom aspektu, grupa K i prsten X zajedno mogu biti bio-izoster prstenova estrona, ili njegov dio.

STEROIDNA PRSTEN STRUKTURA

U jednom preferiranom aspektu, X i K čine steroidnu prstenastu strukturu - što bi rekli ciklopentanofenantren kostur, ili njegove bio-izostere.

Kao što je dobro poznato u struci, klasična steroidna prstenasta struktura ima generičku formulu:

[image]

U gornjoj formuli, prsteni su označeni na konvencionalni način.

Primjer bio-izostera je kada bilo jedan bilo više prstena A, B, C i D je heterociklički prsten i/ili kada bilo jedan bilo više prstena A, B, C i D je bio supstituiran i/ili kada bilo jedan bilo više prstena A, B, C i D je bio modificiran; osim gdje bio-izoster u odsustvu sulfamat grupe ima steroidne značajke.

S obzirom na to, struktura preferirane policikličke strukture se može presdstaviti kao:

[image]

gdje svaki prsten A', B', C' i D' nezavisno predstavlja heterociklički prsten ili neheterociklički prsten, a koji prsteni mogu biti nezavisno supstituirani ili nesupstituirani, zasićeni ili nezasićeni.

Primjerice, bilo jedan bilo više prstena A', B', C' i D' mogu biti nezavisno supstituirani prikladnim grupama - kao što je alkil grupa, aril grupa, hidroksi grupa, halo grupa, hidrokarbil grupa, oksihidrokarbil grupa itd.

Primjer za D' je je petero- ili šesteročlani neheterociklički prsten koji ima najmanje jedan supstituent.

U jednom preferiranom aspektu, prsten D' je supstituiran etinil grupom.

Ako je bilo koji od prstena A', B', C' i D' heterociklički prsten, tada se preferira da taj heterociklički prsten sadržava kombinaciju C atoma te najmanje jedan N atom i/ili najmanje jedan O atom. Ostali heterociklički atomi mogu biti prisutni u prstenu.

Primjeri prikladnih, preferiranih prstena steroidne jezgre A'-D' spojeva ovog izuma uključuju prstene A-D dehidroepiandrosterona i estrogena uključujući estron. Preferirani estrogeni uključuju prirodne estrogene kao što je estron, estradiol, estratriol, epi-estriol; te konjugirane estrogene (derivati ekvilenina).

U jednom aspektu ovog izuma, preferira se da spoj ovog izuma je preteča prirodnog estrogena, preferira se da je prirodni estrogen odabran među: estron, estradiol, estratriol i epi-estriol.

Preferirani prsteni steroidne jezgre A'-D' spojeva ovog izuma uključuju prstene A-D slijedećih spojeva:

estroni i supstituirani estroni, viz:

estron

4-OH-estron

6α-OH-estron

7α-OH-estron

16α-OH-estron

16β-OH-estron

17-deoksiestron

estron

estradioli i supstituirani estradioli, viz:

4-OH-17β-estradiol

6α-OH-17β-estradiol

7α-OH-17β-estradiol

4-OH-17α-estradiol

6α-OH-17α-estradiol

7α-OH-17α-estradiol

16α-OH-17α-estradiol

16α-OH-17β-estradiol

16β-OH-17α-estradiol

16β-OH-17β-estradiol

17α-estradiol

17β-estradiol

17α-etinil-17β-estradiol

17β-etinil-17α-estradiol

17-deoksiestradiol

estrioli i supstituirani estrioli, viz:

estriol

4-OH-estriol

6α-OH-estriol

7α-OH-estriol

17-deoksiestriol

dehidroepiandrosteroni i supstituirani dehidroepiandrosteroni, viz:

dehidroepiandrosteroni

6α-OH-dehidroepiandrosteron

7α-OH-dehidroepiandrosteron

16α-OH-dehidroepiandrosteron

16β-OH-dehidroepiandrosteron

Općenito, sistem prstena A'B'C'D' može sadržavati razne neinterferirajuće supstituente. Osobito, sistem prstena A'B'C'D' može sadržavati jedan ili više hidroksi, alkil posebno niži (C1-C6) alkil, e.g. metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, sec-butil, tert-butil, n-pentil i ostalih izomera pentila, te n-heksil i ostalih izomera heksila, alkoksi posebno niži (C1-C6) alkoksi, e.g. metoksi, etoksi, propoksi itd., alkinil, e.g. etinil, ili halogen, e.g. fluoro supstituente.

U visoko preferiranom aspektu steroidna prsten struktura je kombinirana s preferiranim supstituentima ovog izuma tako da je spoj ovog izuma odabran među spojevima formula:

[image] [image]

17α etinil 17β estradiol-3-sulfamat 17β estradiol-3-sulfamat

[image] [image]

17α estradiol-3-sulfamat estron-3-sulfamat (EMAT)

[image]

estriol-3-sulfamat

NESTEROIDNE STRUKTURE

U alternativnom aspektu, spoj ovog izuma ne može sadržavati ili biti baziran na steroidnoj jezgri. S obzirom na to, policiklički spoj može sadržavati ili biti baziran na nesteroidnom prstenastom sistemu - kao što je dietilstilboestrol, stilboestrol, kumarini, flavonoidi, kombrestatin i ostali prstenasti sistemi. Ostali prikladni nesteroidni spojevi za upotrebu u ili kao smjesa ovog izuma mogu se naći u US-A-5567831

OSTALI SUPSTITUENTI

Spoj ovog izuma može imati druge supstituente pored Rh1, Rh2 i Rs. Primjerice ti drugi supstituenti mogu biti jedan ili više od: jedna ili više sulfamat grupa, jedna ili više fosfonat grupa, jedna ili više tiofosfonat grupa, jedna ili više sulfonat grupa, jedna ili više sulfonamid grupa, jedna ili više halo grupa, jedna ili više O grupa, jedna ili više hidroksi grupa, jedna ili više amino grupa, jedna ili više grupa koje sadrže sumpor, jedna ili više hidrokarbil grupa - kao što je oksihidrokarbil grupa.

OKSIHIDROKARBIL

Pojam "oksihidrokarbil" grupa kako se ovdje koristi znači grupa koja sadrži barem C, H i O te može opcionalno sadržavati jedan ili više drugih prikladnih supstituenata. Primjeri takvih supstituenata mogu uključiti halo-, alkoksi-, nitro-, alkil grupa, ciklička grupa itd. Dodatno mogućnosti supstituenata da budu ciklička grupa, kombinacija supstituenata može oblikovati cikličku grupu. Ako oksihidrokarbil grupa sadrži više od jednog C tada ti ugljici ne moraju nužno biti vezani jedan za drugoga. Na primjer, barem dva ugljika mogu biti vezani preko prikladnog elementa ili grupe. Tako oksihidrokarbil grupa može sadržavati heteroatome. Prikladni heteroatomi će biti očiti iskusnim stručnjacima te uključuju, na primjer, sumpor i dušik.

U jednom aspektu ovog izuma, oksihidrokarbil grupa je oksiugljikovodična grupa.

Ovdje pojam "oksiugljikovodik" znači bilo koju alkoksi grupu, oksialkenil grupu, aksialkinil grupu, a koje grupe mogu biti ravnolančane, razgranate ili cikličke, ili oksiaril grupu. Pojam oksiugljikovodik također uključuje one grupe osim gdje su bile opcionalno supstituirane. Ako je oksiugljikovodik razgranata struktura koja ima na sebi supstituent(e), tada supstitucija može biti ili na glavnom ugljikovodičnom lancu ili na postranom lancu; alternativno supstitucije mogu biti na glavnom ugljikovodičnom lancu i na postranom lancu.

Tipično, oksihidrokarbil grupa je formule C1-6O (kao što je C1-3O).

ANALIZA ZA ODREĐIVANJE DJELOVANJA STS-A KORIŠTENJEM STANICA RAKA (PROTOKOL 1)

Inhibicija djelovanja steroid sulfataze kod MCF-7 stanica

Djelovanje steroid sulfataze je mjerena in vitro korištenjem intaktnih MCF-7 stanica humanog raka dojke. Ta o hormonu zavisna stanična linija se naveliko koristi za studiju kontrole rasta stanica humanog raka dojke. Posjeduje značajno djelovanje steroid sulfataze (MacIndoe et al. Endocrinology, 123, 1281-1287 (1988); Purohit & Reed, Int. J. Cancer, 50, 901-905 (1992)) te je dostupna u U.S.A. od American Type Culture Collection (ATCC) te u U.K. (e.g. od The Imperial Cancer Research Fund).

Stanice su održavane u minimalnom esencijalnom mediju (MEM) (Flow Laboratoires, Irvine, Scotland) koji sadrži 20 mM HEPES, 5% fetalnog goveđeg seruma, 2 mM glutamina, neesencijalne aminokiseline te 0.075% natrijevog bikarbonata. Do 30 tikvica za kulturu tkiva od 25cm2 su nacijepljenje s približno 1 x 105 stanica po tikvici korištenjem gornjeg medija. Stanice su uzgajane do 80%-tnog stapanja, a medij je mijenjan svaki treći dan.

Intaktni monoslojevi MCF-7 stanica u po tri tikvice za kulturu tkiva od 25 cm2 su oprani s Earle's Balanced Salt Solution (EBSS od ICN Flow, High Wycombe, U.K.) te su inkubirane tri-četiri sata pri 37°C s 5 pmol (7 x 105 dpm) [6,7-3H]estron-3-sulfata (specifična aktivnost 60 Ci/mmol od New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) u MEM-u bez seruma (2.5 ml) zajedno s estron-3-sulfamatom (11 koncentracija: 0; 1fM; 0.01pM; 1pM; 0.01nM; 0.1nM; 1 nM; 0.01 mM; 0.1mM; 1mM). Nakon inkubacije je svaka tikvica ohlađena, a medij (1 ml) je pipetiran u odvojene cijevi koje sadrže [14C]estron (7 x 103 dpm) (specifična aktivnost 97 Ci/mmol od Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.). Smjesa je potpuno protresana 30 sekundi s toulenom (5 ml). Eksperimenti su bili pokazali da >90% [14C]estrona i <0.1% [3H]estron-3-sulfata je uklonjeno iz vodene faze tim postupkom. Dio (2 ml) organske faze je uklonjen, evaporiran, a sadržaj 3H i 14C u talogu je određen scintilacijskom spektrometrijom. Masa hidroliziranog estron-3-sulfata je izračunata iz dobivene 3H vrijednosti (ispravljene za volumene medija i organske faze koji su se koristili, te za dodani [14C] estron) i specifične aktivnosti supstrata. Svaka je serija eksperimenata uključivala inkubacije mikrosoma pripravljenih iz humane placente pozitivne na sulfatazu (pozitivna kontrola) i tikvice bez stanica (za procjenu očite neenzimatske hidrolize supstrata). Broj staničnih jezgra po tikvici je određen upotrebom Coulter brojača nakon tretiranja staničnog monosloja Zaponinom. Jedna je tikvica u svakoj seriji korištena za procjenu statusa stanične membrane i viabilnosti upotrebom metode Trypan plavo isključivanja (Phillips, H.J. (1973) u: Tissue culture and applications, [urednici: Kruse, D.F. & Patterson, M.K.]; pp. 406-408; Academic Press, New York).

Rezultati za djelovanje steroid sulfataze su izraženi kao srednja vrijednost ± 1 S.D. ukupno formiranog proizvoda (estron + estradiol) za vrijeme perioda inkubacije (20 sati) izračunata za 106 stanica i, za vrijednosti koje pokazuju statistički značaj, kao postotak redukcije (inhibicije) nad inkubacijama koje nisu sadržavale estron-3-sulfamat. Nespareni Student's t-test je bio korišten za testiranje statističkog značaja rezultata.

ANALIZA ZA ODREĐIVANJE DJELOVANJA STS-A KORIŠTENJEM PLACENTALNIH MIKROSOMA (PROTOKOL 2)

Inhibicija djelovanja steroid sulfataze kod placentalnih mikrosoma

Humane placente pozitivne na sulfatazu iz trudnoća normalnog trajanja su potpuno usitnjene škarama te oprane jednom hladnim fosfatnim puferom (pH 7.4, 50 mM) tada resuspendirane u hladnom fosfatnom puferu (5 ml/g tkiva). Homogenizacija je postignuta pomoću Ultra-Turrax homogenizatora, tri puta po 10 sekundi s dvominutnim pauzama za hlađenje u ledu. Jezgre i stanični ostaci su uklonjeni centrifugom (4°C) pri 2000g 30 minuta, a dijelovi (2 ml) supernatanta su pohranjeni pri 20°C. Koncentracija proteina u supernatantu je određena metodom Bradford-a (Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)).

Inkubacije (1ml) su provedene korištenjem koncentracija proteina od 100mg/ml, koncentracijama supstrata od 20 mM [6,7-3H]estron-3-sulfata (specifična aktivnost 60 Ci/mmol od New England Nuclear, Boston, Mass., U.S.A.) te inkubacijskog vremena od 20 minuta pri 37°C. Ako je neophodno, uključeno je osam koncentracija spojeva: 0 (i.e. kontrola); 0.05mM; 0.1mM; 0.2mM; 0.4mM; 0.6mM; 0.8mM;1.0mM. Nakon inkubacije svaki je uzorak ohlađen a medij (1 ml) je pipetiran u odvojene cijevi koje sadrže [14C]estron (7 x 103 dpm) (specifična aktivnost 97 Ci/mmol od Amersham International Radiochemical Centre, Amersham, U.K.). Smjesa je potpuno protresana 30 sekundi s toulenom (5 ml). Eksperimenti su bili pokazali da >90% [14C]estrona i <0.1% [3H]estron-3-sulfata je uklonjeno iz vodene faze tim postupkom. Dio (2 ml) organske faze je uklonjen, evaporiran, a sadržaj 3H i 14C u talogu je određen scintilacijskom spektrometrijom. Masa hidroliziranog estron-3-sulfata je izračunata iz dobivene 3H vrijednosti (ispravljene za volumene medija i organske faze koji su se koristili, te za dodane [14C] estrone) i specifične aktivnosti supstrata.

ANALIZA NA ŽIVOTINJSKOM MODELU ZA ODREĐIVANJE DJELOVANJA STS-A (PROTOKOL 3)

Inhibicija djelovanja estron sulfataze in vivo

Spojevi ovog izuma se mogu proučavati korištenjem životinjskog modela, posebno kod štakora kojima je učinjena ovariektomija. U tom modelu spojevi koji su estrogenski stimuliraju uterini rast.

Spoj (0.1 mg/Kg/danu kroz pet dana) je bio davan oralno štakorima dok je druga grupa životinja primala samo podlogu (propilen glikol). Na kraju proučavanja dobiveni su bili uzorci tkiva jetre, a djelovanje estron sulfataze analizirano korištenjem 3H estron sulfata kao supstrata kako je prethodno opisano (pogledaj PCT/GB95/02638).

ANALIZA NA ŽIVOTINJSKOM MODELU ZA ODREĐIVANJE ESTROGENSKOG DJELOVANJA (PROTOKOL 4)

Nedostatak in vivo estrogeniciteta

Spojevi ovog izuma se mogu proučavati korištenjem životinjskog modela, posebno kod štakora kojima je učinjena ovariektomija. U tom modelu spojevi koji su estrogenski stimuliraju uterini rast.

Spoj (0.1 mg/Kg/danu kroz pet dana) je bio davan oralno štakorima dok je druga grupa životinja primala samo podlogu (propilen glikol). Na kraju proučavanja dobivene su bile maternice te su izvagane, dok su rezultati bili prikazani kao težina maternice/težina cijelog tijela x 100.

Spojevi koji nemaju značajnog učinka na uterini rast nisu estrogenski.

BIOTEHNOLOŠKA ANALIZA ZA ODREĐIVANJE DJELOVANJA STS-A (PROTOKOL 5)

Sposobnost spojeva da inhibiraju djelovanje estron sulfataze također se može ocijeniti koristeći aminokiselinske sekvence ili nukleotidne sekvence koje kodiraju STS, ili djelatne fragmente, derivate, homologe ili njihove varijante u, na primjer, pregledima velikog kapaciteta (high-through put screens, HTS).

Bilo jedan bilo više prikladnih meta - kao što je aminokiselinska sekvenca i/ili nukleotidna sekvenca - može se upotrijebiti za identificiranje sredstva sposobnog da modulira STS u bilo kojoj od širokog raspona tehnika za "screening" lijekova. Meta koja se koristi u takvom testu može biti slobodna u otopini, vezana za kruti nosač, nošena na staničnoj površini, ili smještena intracelularno. Prestanak djelovanja mete ili formiranje veznih kompleksa između mete i sredstva koje se ispituje se može izmjeriti.

Analiza ovog izuma može biti pregled (screen), čime se ispituju brojna sredstva. U jednom aspektu, metoda analize ovog izuma je pregled velikog kapaciteta.

Tehnike za "screening" lijekova mogu biti bazirane na metodi opisanoj u Geysen, European Patent Application 84/03564, objavljenoj 13. rujna 1984. U kratko, veliki broj raznih malih peptidnih test spojeva su sintetizirani na krutom supstratu, kao što su plastične pribadaće ili neke druge površine. Peptidni test spojevi su reagirani s prikladnom metom ili njenim fragmentom i oprani. Vezane jedinice su tada detektirane - npr. prikladno prilagođenim u struci dobro poznatim metodama. Pročišćena meta može također biti presvućena neposredno na posude za upotrebu u tehnikama za "screening" lijekova. Alternativno, neneutralizirajuća antitijela se mogu upotrijebiti za hvatanje peptida i njegovo imobiliziranje na kruti nosač.

Ovaj izum također razmatra korištenje kompetitivnih "screening" analiza za lijekove u kojima se neutralizirajuća antitijela sposobna za vezanje na metu specifično natječu s test spojem za vezanje na metu.

Slijedeća tehnika za "screening" pruža pregled visokog kapaciteta (HTS) sredstava koja imaju prikladne afinitete vezanja na tvari te je bazirana na metodi detaljno opisanoj u WO 84/03564.

Očekuje se da će metode analize ovog izuma biti prikladne za "screening" malih i velikih količina test spojeva kao i za kvantitativne analize.

U jednom preferiranom aspektu, ovaj izum se odnosi na metodu za identificiranje sredstava koja selektivno moduliraju STS, a koji spojevi imaju formulu (Ia).

REPORTERI

Mnogo raznih reportera se može koristiti u metodama analize (kao i pregleda) ovog izuma uz to da preferirani reporteri pružaju pogodne detektabilne signale (e.g. spektroskopijom). Primjerice, gen reporter može kodirati enzim koji katalizira reakciju koja preinačuje značajke apsorpcije svjetla.

Ostali protokoli uključuju enzim-vezanu imunosorbentnu analizu (ELISA), radioimunoanalizu (RIA) te fluorescentno aktivirano sortiranje stanica (FACS). Još se može koristiti na monoklonu bazirana imunoanaliza dva mjesta koja koristi monoklonalna antitijela reaktivna na dva neinterferirajuća epitopa. Ove i druge analize su opisane, među ostalim i u Hampton R et al (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) i Maddox DE et al (1983, J Exp Med 15 8:121 1).

Primjeri reporter molekula uključuju, ali nisu time ograničene (β-galaktozidaza, invertaza, zeleni fluorescentni protein, luciferaza, kloramfenikol, acetiltransferaza, (-glukuronidaza, egzo-glukanaza i glukoamilaza. Alternativno, radiooznačeni ili fluorescentno označeni nukleotidi mogu biti uključeni u nastajuće transkripte koji su tada identificirani kada su vezani na oligonukleotidne sonde.

Daljnjim primjerima, brojne kompanije kao što je Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), te US Biochemical Corp (Cleveland, OH) isporučuju komercijalne komplete i protokole za analitičke postupke. Prikladne reporter molekule ili oznake uključuju one radionuklide, enzime, fluorescente, kemoluminiscente ili kromogena sredstva kao i supstrate, kofaktore, inhibitore, magnetske čestice i slično. Patenti koji poučavaju upotrebu takvih oznaka uključuju US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 i US-A-4366241.

STANICE DOMAĆINI

Pojam "stanice domaćini" - u odnosu na ovaj izum uključuje svaku stanicu koja bi mogla sadržavati metu za sredstvo ovog izuma.

Stoga dalji aspekt ovog izuma pruža stanice domaćine tramsformirane ili trasfektirane polinukleotidom koji je sam meta ovog izuma, ili ekspresira metu ovog izuma. Preferira se da rečeni polinukleotid je nošen vektorom za replikaciju i ekspresiju polinukleotida koji bi bili meta ili bi ekspresionirali metu. Stanice će biti odabrane da budu kompatibilne s rečenim vektorom te mogu, na primjer biti prokariotske (na primjer bakterijske), stanice gljiva, kvasaca ili biljne stanice.

Gram negativna bakterija E. coli se uvelike koristi kao domaćin za heterologne ekspresije gena. Ipak, velike količine heterolognih proteina imaju tendenciju nakupljanja u stanici. Pročišćavanje željenog proteina, koje slijedi, iz gužve intracelularnih proteina E. coli može ponekad biti teško.

Za razliku od E coli, bakterije iz roda Bacillus su vrlo prikladne kao heterologni domaćini zbog njihove sposobnosti da izlučuju proteine u medij kulture. Ostale bakterije prikladne kao domaćini su one roda Streptomyces i Pseudomonas.

Zavisno o prirodi polinukleotida koji kodira polipeptid ovog izuma, i/ili želje za daljnjom preradom ekpresiranog proteina, eukariotski domaćini kao što su kvasci ili druge gljive se mogu preferirati. Općenito, stanice kvasaca se preferiraju nad stanicama gljiva jer se njima lakše manipulira. Ipak, neki se proteini ili slabo izlučuju iz stanice kvasca ili u nekim slučajevima nisu odgovarajuće prerađeni (e.g. hiperglikolizacija kod kvasca). Za te se slučajeve treba odabrati drugi domaćinski organizam gljive.

Primjeri prikladnih domaćina za ekspresiju unutar područja ovog izuma su gljive kao što su vrste roda Aspergillus (kao one opisane u EP-A-0184438 i EP-A-0284603) te vrste roda Trichoderma; bakterije kao što su vrste roda Bacillus (kao one opisane u u EP-A-0134048 i EP-A-0253455), vrste rodova Streptomyes i Pseudomonas; te kvasci kao što su vrste roda Kluyveromyes (kao one opisane u EP-A-0096430 i EP-A-0301670) i vrste roda Saccharomyes. Primjerice, tipični domaćini za ekspresiju mogu biti odabrani među: Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis i Saccharomyces cerevisiae.

Korištenje prikladnih stanica domaćina - kao što je kvasac, domaćinska stanica gljive ili biljke - mogu pružiti post-translacijske modifikacije (e.g. miristoilacija, glikozilacija, skračivanje, lapidacija, te tirozin, serin ili treonin fosforilacija) kakve mogu biti potrebne kako bi se dala optimalna biološka djelovanja rekombinantnim proizvodima ekspresije iz ovog izuma.

ORGANIZAM

Pojam "organizam" u odnosu na ovaj izum uključuje svaki organizam koji bi mogao sadržavati metu u skladu s ovim izumom i/ili proizvode dobivene od njih. Primjeri organizama mogu uključivati gljivu, kvasac ili biljku.

Pojam "transgenični organizam" u odnosu na ovaj izum ukjlučuje svaki organizam koji sadržava metu u skladu s ovim izumom i/ili dobivene proizvode.

TRANSFORMACIJA STANICA DOMAĆINA/ORGANIZAMA DOMAĆINA

Kao što je ranije naznačeno, organizam domaćin može biti prokariotski ili eukariotski organizam, Primjeri prikladnih prokariotskih domaćina uključuju E. coli i Bacillus subtilis. Poučavanje o transformaciji prokariotskih domaćina je dobro dokumentirano u struci, na primjer pogledaj Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Ako se koristi prokariotski domaćin, tada je moguće potrebno prikladno modificirati nukleotidnu sekvencu prije transformacije - kao npr. uklanjanjem introna.

U drugom aspektu transgenični organizam može biti kvasac. S obzirom na to, kvasac je također bio uvelike korišten kao podloga za ekspresije heterolognih gena. Vrsta Saccharomyces cerevisiae ima dugu povijest industrijske upotrebe, uključujući njegovu upotrebu za ekspresiju heterolognih gena. Prikaz o ekspresiji heterolognih gena kod Saccharomyces cerevisiae dali su Goodey et al (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al, urednici, pp 401-429, Allen and Unwin, London) te King et al (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, urednici, pp 107-133, Blackie, Glasgow).

Zbog mnogih je razloga Saccharomyces cerevisiae vrlo prikladan za ekspresiju heterolognih gena. Prvo, ljudima je nepatogen te nije sposoban proizvesti određene endotoksine. Drugo, ima dugu povijest sigurne upotrebe koja je slijedila stoljeća komercijalnog iskorištavanja za različite svrhe. To je bilo dovelo do široke javne prihvatljivosti. Treće, raširena komercijalna upotreba i istraživanje posvećeno organizmu rezultirali su obiljem znanja o genetici i fiziologiji kao i opsežnim karakteristikama fermentacije organizma Saccharomyces cerevisiae.

Pregled principa ekspresije heterolognih gena kod Saccharomyces cerevisiae kao i sekrecija proizvoda gena je dan od E Hinchckiffe E Kenny (1983, “Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, urednici, 2nd edition, Academic Press Ltd.).

Nekoliko tipova kvasaca vektora je dostupno, uključujući integrativne vektore, koji zahtijevaju rekombinaciju s genomom domaćina za svoje održavanje, te autonomno replicirajuće plazmid vektore.

S ciljem pripravljanja transgeničnog Saccharomyces, konstrukti ekspresije su pripravljeni insertiranjem nukleotidne sekvence u konstrukt namijenjen za ekspresiju u kvasca. Bili su razvijeni različiti tipovi konstrukata korištenih za heterolognu ekpresiju.

Konstrukti sadrže promotor djelatan kod kvasca fuzioniran na nukleotidnu sekvencu, obično je korišten promotor porijeklom iz kvasca, kao što je GAL1 pomotor. Obično je korištena signalna sekvenca porijeklom iz kvasca, kao što je sekvenca koja kodira SUC2 signalni peptid. Terminator kodon djelatan kod kvasca završava sustav ekspresije.

Za transformaciju kvasca bilo je razvijeno nekoliko transformacijskih protokola. Na primjer, transgenični Saccharomyces u skladu s ovim izumom može biti pripravljen slijedećim poučavanjima od strane Hinnen et al (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); te Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

Transformirane stanica kvasca su selekcionirane korištenjem raznih selektivnih markera. Među markerima korištenima za transformaciju su i brojni auksotrofni markeri kao što je LEU2, HIS4 i TRP1, te dominantni markeri rezistencije na antibiotike kao što su aminoglikozid antibiotik markeri, eg G418.

Slijedeći organizam domaćin je biljka. Osnovni princip stvaranja genetički modificiranih biljaka je insertiranje genetičke informacije u biljni genom tako da se postigne stabilno održavanje insertiranog genetičkog materijala. Postoji nekoliko tehnika za insertiranje genetičke informacije, pri čemu su dva glavna principa neposredno uvođenje genetičke informacije te uvođenje genetičke informacije korištenjem vektorskog sustava. Pregled općih tehnika se može naći u člancima od Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) te Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27). Daljnja učenja o biljnoj transformaciji se mogu naći u EP-A-0449375.

Tako ovaj izum također pruža metodu transformiranja stanice domaćina nukleotidnom sekvencom koja bi trebala biti meta ili bi trebala ekpresirati metu. Stanice domaćini transformirani nukleotidnom sekvencom mogu biti postavljeni u kulturu pod uvjetima prikladnim za ekspresiju kodiranog proteina. Protein koji je proizvela rekombinantna stanica može biti izložen na staničnoj površini. Ako je željeno, te kako će biti shvaćeno od strane iskusnih stručnjaka, ekspresijski vektori koji sadrže kodirajuće sekvence mogu biti izvedene sa signalnim sekvencama koje usmjeruju sekreciju kodirajućih sekvenca kroz određenu prokariotsku ili eukariotsku staničnu membranu. Ostale rekombinantne konstrukcije se mogu pridružiti kodirajućoj sekvenci nukleotidne sekvence koja kodira polipeptidnu domenu koja će olakšati pročišćavanje topivih proteina (Kroll DJ et al (1993) DNA Cell Biol 12:441-53).

VARIJANTE/HOMOLOZI/DERIVATI

Dodatno specfičnim aminokiselinskim sekvencama i nukleotidnim sekvencama koje su ovdje spomenute, ovaj izum također obuhvaća korištenje njihovih varijanata, homologa i derivata. Ovdje se pojam “homologija” može izjednačiti s “istovjetnost”.

U ovom kontekstu, homologna sekvenca je uzeta da uključuje aminokiselinsku sekvencu koja može biti barem 75, 85 ili 90% istovjetna, preferira se barem 95 ili 98% istovjetna. Premda se homologija može promatrati u smislu sličnosti (i.e. aminokiselinski ostaci imaju slične kemijske značajke/funkcije), u kontekstu ovog izuma preferira se izražavati homologiju u smislu istovjetnosti sekvenca.

Usporedbe homologija se mogu provesti vizualno, ili uobičajenije, uz pomoć lako dostupnih programa usporedbe sekvence. Ti komercijalno dostupni kompjuterski programi mogu izračunati % homologije između dvije ili više sekvenca.

% homologije može biti izračunat za bliske sekvence, i.e. jedna je sekvenca poravnata s drugom sekvencom te je svaka aminokiselina u jednoj sekvenci neposredno uspoređena s odgovarajućom aminokiselinom u drugoj sekvenci, jedan po jedan ostatak. To se zove poravnanje "bez prekida". Tipično, takva poravnanja bez prekida su izvedena samo za relativno kratak broj ostataka.

Premda je ovo vrlo jednostavna i dosljedna metoda, propušta uzeti u obzir da, na primjer, u inače istovjetnih sekvenca, jedna insercija ili delecija će uzrokovati slijedeće aminokiselinske ostatke da budu izbačeni iz poravnanja, što potencijalno rezultira velikim smanjenjem postotka homologije kada se izvodi globalno poravnanje. Kao posljedica toga, većina metoda usporedbe sekvenca su zamišljene da proizvedu optimalna poravnanja koja uzimaju u obzir moguće insercije i delecije bez da neopravdano smanjuje ukupni rezultat homologije. To se postiže insertiranjem "prekida" u poravnanje sekvenca kako bi se pokušalo maksimalizirati lokalnu homologiju.

Kako god, te kompleksnije metode dodijeljuju "kvantitativne vrijednosti nesparivanja" (gap penalties) za svaki prekid koji se pojavi u poravnanju, tako da će, za isti broj istovjetnih aminokiselina, poravnanje sekvenca sa što je manje moguće prekida - što odražava veći stupanj srodnosti među dvama uspoređenim sekvencama - postignuti bolji rezultat nego kod onog s puno prekida. "Preciznije vrijednosti nesparivanja" su tipično korištene da dodijeljuju relativno visoke vrijednosti za postojanje prekida, te manje vrijednosti za svaki slijedeći ostatak u prekidu. To je najuobičajenije korišteni sustav ocjenjivanja prekida. Visoke vrijednosti nesparivanja će, dakako, proizvesti optimizirana poravnanja s manje prekida. Većina programa za poravnanje omogućuju da se vrijednosti nesparivanja modificiraju. Ipak, preferira se koristiti predviđene ("default") vrijednosti kada se koristi takav software za usporedbe sekvenca. Na primjer kada se koristi GCG Wisconsin Bestfit paket (pogledaj dolje) predviđena kvantitativna vrijednost nesparivanja za aminokiselinske sekvence je -12 za prekid i -4 za svaki nastavak.

Izračunavanje najvećeg % homologije stoga prvo zahtijeva proizvodnju optimalnog poravnanja, uzimajući u obzir kvantitativne vrijednosti nesparivanja. Prikladni kompjuterski program za izvođenje takvog poravnanja je GCG Wisconsin Bestfit paket (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acid Research 12:387). Primjeri drugog software-a koji može izvesti usporedbu sekvenca uključuju, ali nisu time ograničeni, BLAST paket (pogledaj Ausubel et al, 1999 ibid - Chapter 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) te GENEWORKS garnitura alata za usporedbu. I BLAST i FASTA su dostupni za “offline” i “online” istraživanja (pogledaj Ausubel et al., 1999 ibid, str. 7-58 do 7-60). Ipak se preferira koristiti GCG Bestfit program.

Daljnja korisna referenca je nađena u FEMS Microbiol Lett 1999 May 15;174(2):247-50 (a objavljeni popis tiskarskih pogrešaka se pojavljuje u FEMS Microbiol Lett 1999 Aug 1;177(1):187-8).

Premda se konačni % homologije može izmjeriti u smislu istovjetnosti, sami postupak poravnanja se tipično ne zasniva na usporedbi parova po principu “sve ili ništa”. Umjesto toga, općenito se koristi matrica rangiranih rezultata sličnosti koja pripisuje rezultate svakoj usporedbi para koja se osniva na kemijskoj sličnosti ili evolutivnoj udaljenosti. Primjer takve uobičajeno korištene matrice je BLOSUM62 matrica - predviđena matrica za BLAST garnituru programa. GCG Wisconsin programi općenito koriste ili javne predviđene vrijednosti ili uobičajenu tablicu usporedbe simbola ako je priložena (pogledaj priručnik za korisnike za daljnje detalje). Preferira se koristiti javne predviđene vrijednosti za GCG paket, ili u slučaju drugog software-a, predviđenu matricu, kao što je BLOSUM62.

Kada je software jednom proizveo optimalno poravnanje, moguće je izračunati % homologije, preferira se % istovijetnosti sekvenca. Software tipično to radi kao dio usporedbe sekvenca te generira numerički rezultat.

Sekvence mogu također imati delecije, insercije ili supstitucije aminokiselinskih ostataka što proizvodi tihu promjenu te rezultira funkcionalno ekvivalentnom supstancom. Promišljene supstitucije aminokiselina se mogu učiniti na osnovi sličnosti u polarnosti, naboju, topivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatske priode ostataka sve dok je sekundarno djelovanje vezanja tvari zadržana. Na primjer, negativno nabijene aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu; pozitivno nabijene aminokiseline uključuju lizin i arginin; a aminokiseline s nenabijenim polarnim grupama koje imaju slične hidrofilne vrijednosti uključuju leucin, izoleucin, valin, glicin, alanin, asparagin, glutamin, serin, treonin, fenilalanin i tirozin.

Konzervativne se supstitucije mogu učiniti, na primjer u skladu s tablicom dolje. Aminokiseline u istom odjeljku u drugom stupcu te preferirano u istom redu u trećem stupcu mogu se supstituirati jedne drugima:

[image]

EKSPRESIJSKI VEKTORI

Nukleotidna sekvenca za upotrebu kao meta ili za ekspresiju mete može biti uključena u rekombinantni vektor koji se može replicirati. Vektor se može upotrijebiti za repliciranje i ekspresiju nukleotidne sekvence u i/ili iz kompatibilne stanice domaćina. Ekspresija se može kontrolirati upotrebom kontrolnih sekvenca koje uključuju promotore/pojačivaće i ostale signale za regulaciju ekspresije. Prokariotski promotori i promotori funkcionalni u eukariotskoj stanici se mogu koristiti. Promotori specifični za tkivo ili specifični za podražaje se mogu koristiti. Također se mogu koristiti kimerni promotori koji sadrže elemente sekvence iz dva ili više gore opisanih promotora.

Protein proizveden od strane rekombinante stanice domaćina ekspresijom nukleotidne sekvence može se izlučiti ili se može zadržati intracelularno ovisno o sekvenci i/ili vektoru koji se koristio. Kodirajuće se sekvence mogu oblikovati sa signalnim sekvencama koje usmjeruju izlučivanje sekvenca koje kodiraju tvar kroz određenu prokariotsku ili eukariotsku staničnu membranu.

FUZIJSKI PROTEINI

Aminokiselinska sekvenca meta može se proizvesti kao fuzijski protein, na primjer da bi pomogao kod ekstrakcije i pročišćavanja. Primjeri uzoraka fuzijskih proteina uključuju glutation-S-transferazu (GST), 6xHis, GAL4 (domene DNA vezanja i pokretanja transkipcije) i (-galaktozidazu. Može također biti zgodno uključiti mjesto za proteolitičko otcjepljivanje između partnera fuzijskog proteina i proteinske sekvence od interesa kako bi se omogučilo uklanjanje sekvenca fuzijskog proteina. Preferira se da fuzijski protein neće spriječiti djelovanje mete.

Fuzijski protein može sadržavati antigen ili determinantu antigena fuzioniranu na tvar ovog izuma. U tom aspektu, fuzijski protein može biti sintetski fuzijski protein koji sadži tvar koja može djelovati kao adjuvant u smislu pružanja poopćene stimulacije imunološkog sustava. Antigen ili determinanta antigena mogu biti vezani ili na amino ili na karboksi kraj tvari.

U drugom aspektu izuma, sekvenca aminokiselina može biti povezana na heterolognu sekvencu da kodira fuzijski protein. Na primjer, za “screening” peptidnih biblioteka za sredstva koja su sposobna utjecati na djelovanje tvari, može biti korisno kodirati kimernu tvar koja ekpresira heterologni epitop koji je prepoznat od komercijalno dostupnih antitijela.

TERAPIJA

Spojevi ovog izuma mogu se koristiti kao terapeutska sredstva - i.e. kod terapijskih primjena.

Pojam “terapija” uključuje ljekovite učinke, učinke poboljšanja i profilaktičke učinke.

Terapija može biti na ljudima ili na životinjama, preferira se na ženkama, a bolje je na ženama.

FARMACEUTSKE SMJESE

Ovaj izum pruža farmaceutsku smjesu, koja sadrži spoj u skladu s ovim izumom te opcionalno farmaceutski prihvatljiv prijenosnik, razrjeđivač ili ekscipijent (uključujući njihove kombinacije).

Farmaceutske smjese mogu biti za upotrebu kod ljudi ili kod životinja u ljudskoj ili veterinarskoj medicini te će tipično sadržavati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razrjeđivača, prijenosnika ili ekscipijenata. Prihvatljivi prijenosnici ili razrjeđivači za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj struci, te su opisani, na primjer, u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro urednik 1985). Izbor farmaceutskih prijenosnika, ekcipijenata ili razrjeđivača može se učiniti s obzirom na namjeravani način davanja i standardnu farmaceutsku praksu. Farmaceutske smjese mogu sadržavati kao - ili njima dodatno - prijenosnik, ekscipijent ili razrjeđivač bilo koje prikladno vezivo (veziva), lubrikant(e), sredstvo (sredstva) za suspendiranje, sredstvo (sredstva) za presvlačenje, sredstvo (sredstva) za otapanje.

Konzervansi, stabilizatori, bojila pa čak i sredstva za poboljšanje okusa mogu biti pruženi u farmaceutskoj smjesi. Primjeri konzervanasa uključuju natrijev benzoat, sorbinsku kiselinu i estere p-hidroksibenzojeve kiseline. Također se mogu koristiti antioksidanti i sredstva za suspendiranje.

Mogu postojati razni zahtjevi na smjesu/formulaciju ovisni o raznim sustavima isporuke. Primjerice, farmaceutska smjesa ovog izuma se može formulirati da bude isporučena upotrebom mini-pumpe ili putem sluznice, na primjer, kao nazalni sprej ili aerosol za inhalaciju ili probavljiva otopina, ili parenteralno pri čemu je smjesa formulirana injektibilnim oblikom, za isporuku, pomoću, na primjer, intravenoznog, intramuskularnog ili subkutanog puta. Alternativno, formulacija se može kreirati tako da se isporučuje obim putevima.

Gdje će se sredstvo davati preko sluznice kroz gastrointestinalnu sluznicu, trebalo bi biti sposobno ostati stabilno za vrijeme prolaska kroz gastrointestinalni trakt; na primjer, treba biti otporno na proteolitičko razlaganje, stabilno pri kiselom pH te otporno na detergentne učinke žuči.

Gdje je to odgovarajuće, farmaceutske smjese se mogu davati inhalacijom, u obliku supozitorija ili pesara, kao interuterini sustav, lokalno u obliku losiona, otopine, kreme, pomasti ili praška za prašenje, upotrebom kožnog flastera, oralno u obliku tableta koje sadrže ekscipijente kao što je škob ili laktoza, ili u kapsulama ili ovulama, bilo same bilo u primjesi s ekscipijentima, ili u obliku eliksira, otopina ili suspenzija koje sadrže sredstva za poboljšanje okusa ili za bojanje, ili mogu biti injektirani parenteralno, na primjer intravenozno, intramuskularno ili subkutano. Za parenteralno davanje, smjese se mogu najbolje koristiti u obliku sterilne vodene otopine koja može sadržavati druge tvari, na primjer dovoljno soli ili monosaharida da učine otopinu izotoničnom sa krvlju. Za bukalno i sublingvalno davanje smjese se mogu davati u obliku tableta ili pastila koje mogu biti fomulirane na konvencionalni način.

FARMACEUTSKA KOMBINACIJA

Spoj ovog izuma se može koristiti u kombinaciji s jednim ili više drugih djelatnih sredstava, kao što je jedno ili više farmaceutski djelatnih sredstava.

Primjerice, spojevi ovog izuma se mogu koristiti u kombinaciji s ostalim STS inhibitorima i/ili ostalim inhibitoima kao što je inhibitor aromataze (kao što je na primjer, 4hidroksiandrostenedion (4-OHA)) i/ili steroidi - kao što su prirodni neurosteroidi dehidroepiandrosteron sulfat (DHEAS) i pregnenolon sulfat (PS) i/ili drugi strukturno slični organski spojevi.

Spojevi u skladu s izumom se mogu koristiti sami ili u kombinaciji s progestinom. Preferira se da spojevi u skladu s izumom se koriste u odsustvu progestina. Tako, u preferiranom aspektu smjesa ovog izuma je u osnovi bez progestina.

Dodatno, ili alternativno, spojevi ovog izuma se mogu koristiti u kombinaciji s modifikatorima biološkog odgovora.

Pojam “modifikator biološkog odgovora” uključuje citokine, imunološke modifikatoe, faktore rasta, faktore regulacije hematopoeze, faktore stimulacije kolonije, kemotaktične, hemolitičke i trombolitičke faktore, površinske stanične receptore, ligande, adhezijske molekule leukocita, monoklonalna antitijela, konzervanse i terapeutska cjepiva, hormone, komponente ekstracelularnog matriksa, fibronektin itd. Za neke primjene, preferira se, modifikator biološkog odgovora je citokin. Primjeri citokina uključuju: interleukine (IL) - kao što su IL-1, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-19, faktor nekroze tumora (TNF) - kao što je TNF-α; interferon alfa, beta i gama, TGF-β. Za neke primjene se preferira da je citokin faktor nekroze tumora (TNF). Za neke primjene, TNF može biti bilo koji tip TNF-a - kao što je TNF-α, TNF-β, uključujući njihove derivate i smjese. Više se preferira da je citokin TNF-α. Učenja o TNF-u se mogu pronaći u struci - kao što je WO-A-98/08870 i WO-A-98/13348.

DAVANJE

Tipično, liječnik će odrediti aktualnu dozu koja će biti najprikladnija za individualni subjekt te će varirati sa starošću, težinom i odgovoru određenog pacijenta. Doljnje doze su primjer prosječnih slučajeva. Mogu, također postojati slučajevi kada vrijede viši ili niži rasponi doza.

Smjese ovog izuma se mogu davati neposrednim injektiranjem. Smjesa može biti formulirana za parenteralno, kroz sluznicu, intrauskularno, intravenozno, subkutano, intraokularno ili transdermalno davanje.

Specifična razina doze i frekvencija doziranja za svakog određeno pacijenta može se varirati te će zavisiti o raznim činiocima uključujući djelovanje određenog spoja koji je uključen, metaboličkoj stabilnosti i trajanju djelovanja tog spoja, starosti, težini tijela, općem stanju zdravlja, spolu, prehrani, načinu i vremenu davanja, brzini izlučivanja, kombinaciji lijekova, ozbiljnosti određenog stanja, te terapiji koja je u tijeku kod domaćina.

Pored tipičnih načina davanja - naznačenih gore - pojam “davan” također uključuje isporuku tehnikama kao što je lipidima posredovana transfekcija, liposomi, imunoliposomi, lipofektin, kationski facijalni amfifili (CFA) i njihove kombinacije. Putevi takvih mehanizama isporuke uključuju, ali nisu time ograničeni, kroz sluznicu, nazalni, oralni, parenteralni, gastointestinalni, lokalni, ili sublingvalni put.

Pojam “davan” uključuje, ali nije time ograničen, isporuku putem kroz sluznicu, na primjer, kao nazalni sprej ili aerosol za inhalaciju ili kao probavljiva otopina; parenteralni put gdje je isporuka injektabilnim oblikom, kao što je, na primjer, intravenozni, intramuskularni ili subkutani put.

Tako, za farmaceutsko davanje, STS inhibitori ovog izuma se mogu formulirati na bilo koji prikladni način koji koristi konvencionalne tehnike farmaceutske formulacije i farmaceutske prijenosnike, adjuvante, ekscipijente, razrijeđivače itd. te obično za parenteralno davanje. Dozirati se može u režimu jedinične doze, režimima podijeljene doze i/ili režimima višetrukih doza koji traju preko nekoliko dana. Za oralno davanje oni mogu biti formulirani u tablete, kapsule, otopine ili suspenzije. Alternativno spojevi će biti formulirani za parenteralno davanje u prikladnom prijenosniku koji se može davati parenteralno te pružajući tempo dnevnih jediničnih doza. Djelotvorne dnevne doze će, ipak, varirati ovisno o svojstvenom djelovanju djelatnog sastojka te o tjelesnoj težini pacijenta, pri čemu su takva variranja unutar iskustva i procjene liječnika.

STANIČNI CIKLUS

Spojevi ovog izuma mogu biti korisni u metodi tretiranja poremećaja staničnog ciklusa.

Kao što je raspravljeno u “Molecular Cell Biology” 3rd Ed. Lodish et. al. stranice 177-181, različite eukariotske stanice mogu rasti i dijeliti se pri prilično različitim brzinama. Stanice kvasca, na primjer, se mogu podijeliti svakih 120 min., a prve diobe oplođenih jaja u embrionskih stanica morskog ježinca i kukaca traju samo 1530 min. jer je jedna velika pred-postoječa stanica podpodijeljena. Ipak, većina rastućih biljnih i životinjskih stanica treba 10-20 sati da im se udvostruči broj, a neke se podvostručuju pri mnogo sporijoj brzini. Mnoge stanice odraslih, kao što su živčane stanice i stanice poprečno prugastih mišića, se uopće ne dijele; druge, kao fibroblasti koji pomažu u liječenju rana, rastu na zahtjev, ali inače su u mirovanju.

Ipak, svaka eukariotska stanica koja se dijeli mora biti spremna da donira jednaki genetički materijal dvama stanicama kćeri. DNA sinteza kod eukariota se ne događa kroz cijeli ciklus stanične diobe nego je ograničena na njegov dio prije stanične diobe.

Odnos između sinteze eukariotske DNA i stanične diobe je bio potpuno analiziran u kulturama stanica sisavaca koje su sva bile sposobne za rast i diobu. Za razliku od bakterija, nađeno je, eukariotske stanice provode samo dio svog vremena u sintezi DNA, te je ona završena satima prije stanične diobe (mitoze). Stoga se pojavljuje pauza nakon sinteze DNA i prije stanične diobe; nađeno je da se druga pauza pojavljuje nakon diobe i prije slijedećeg kruga sinteze DNA. Ta je analiza dovela do zaključka da se eukariotski stanični ciklus sastoji od M (mitotičke) faze, G1 faze (prva pauza), S (sinteza DNA) faze, G2 faze (druga pauza), te ponovno M. Faze između mitoza (G1, S, i G2) su skupno znane kao interfaza.

Mnoge stanice u tkivima koje se dijele (na primjer, svi mirujući fibroblasti) odgađaju ciklus nakon mitoze i prije same DNA sinteze; za takve “mirujuće” stanice se kaže da su izašle iz staničnog ciklusa te da su u G0 stanju.

Moguće je identificirati stanice kada su u jednom od tri stadija interfaze staničnog ciklusa, korištenjem sortera za fluorescentno aktivirane stanice (FACS) za mjerenje njihovog relativnog sadržaja DNA: stanica koja je u G1 (prije sinteze DNA) ima definiranu količinu x DNA; za vrijeme S (replikacija DNA), ima između x i 2x; a kada je u G2 (ili M), ima 2x DNA.

Stadiji mitoze i citokineze u životinjskoj stanici su kako slijedi

(a) interfaza. G2 stadij interfaze neposredno prethodi početku mitoze. Kromosomalna DNA je bila replicirana i vezana za protein za vrijeme S faze, ali kromosomi se još ne vide kao odvojene strukure. Nukleolus je jedina podstruktura jezgre koja je vidljiva pod svjetlosnim mikroskopom. U diploidnoj stanici prije replikacije DNA postoje dva morfološka komosoma svakog tipa, a za stanicu se kaže da je 2n. U G2 nakon replikacije DNA, stanica je 4n. Postoje četiri kopije svake kromosomske DNA. Pošto se sestrinski kromosomi nisu još odijelili jedan od drugoga, zovemo ih sestrinjske kromatide.

(b) Rana profaza. Centrioli, svaki s novostvorenim sestrinskim centriolom, se počinju pomicati prema suprotnim polovima stanice; kromosomi se mogu vidjeti kao duga vlakna. Jezgrina membrana se počinje dezagregirati u male vezikule.

(c) Srednja i kasna profaza. Kondenzacija kromosoma je završena; svaka vidljiva struktura kromosoma je sastavljena od dvije kromatide koje se drže zajedno kod njihovih centromera. Svaka kromatida sadrži jednu od dvije nanovo replicirane molekule DNA kćeri. Mikrotubularno vreteno počinje se zrakasto širiti iz regija neposedno uz centriole, koji se pomiču bliže svojim polovima; većina ide do kromatida i pričvršćuje se kod kinetohora.

(d) Metafaza. Kromosomi se pomiču prema ekvatoru stanice, gdje bivaju poravnati u ekvatorijalnu ravninu. Sestrinske se kromatide nisu još odijelile.

(e) Anafaza. Dvije sestrinske kromatide odvajaju se u nezavisne kromosome. Svaki sadrži centromeru koja je vezana vlaknom vretena za jedan pol prema kojem se pomiče. Tako je jedna kopija svakog kromosoma donirana svakoj stanici kćeri. U isto vrijeme, stanica se produžuje, kao i vretena od pola do pola. Citokineza počinje kada se počne oblikovati diobena brazda.

(f) Telofaza. Nove se membrane oblikuju oko jezgra kćeri; kromosomi se odmataju i postaju manje odvojeni, nukleolus postaje ponovno vidljiv, a jezgrina se ovojnica oblikuje oko svake jezgre kćeri. Citokineza je skoro potpuna, a vreteno nestaje pošto se mikrotubuli i ostala vlakna depolimeriziraju. Kroz cijelu mitozu, centriol “kćer” na svakom polu raste do njegove konačne veličine. U telofazi je duplikacija svakog izvornog centriola završena, a novi centrioli kćeri će biti stvoreni za vrijeme slijedeće interfaze.

(g) Interfaza. Nakon završetka citokineze, stanica ulazi u G1 fazu staničnog ciklusa i nastavlja opet u ciklus.

Smatrati će se vrijednim da je stanični ciklus izuzetno važan stanični proces. Odstupanja od normalnog staničnog ciklusa može rezultirati brojnim medicinskim poremećajima. Pojačani ili neograničeni stanični ciklus može rezultirati rakom. Smanjeni stanični ciklus može rezultirati degenerativnim stanjima. Korištenje spoja ovog izuma može pružiti načine tretiranja takvih poremećaja i stanja.

Stoga, spoj ovog izuma može biti prikladan za upotrebu u tretmanu poremećaja staničnog ciklusa kao što je rak, uključujući rakove ovisne o hormonima i rakove neovisne o hormonima.

Dodatno, spoj ovog izuma može biti prikladan za tretman rakova kao što je rak dojke, rak jajnika, endometrijski rak, sarkomi, melanomi, rak prostate, rak pankreasa itd. i ostalih krutih tumora.

Za neke primjene, stanični je ciklus inhibiran i/ili spriječen i/ili zaustavljen, preferira se gdje je stanični ciklus spriječen i/ili zaustavljen. U jednom aspektu stanični ciklus može biti inhibiran i/ili spriječen i/ili zaustavljen u G2/M fazi. U jednom aspektu stanični ciklus može biti ireverzibilno spriječen i/ili inhibiran i/ili zaustavljen, preferira se gdje je stanični ciklus ireverzibilno spriječen i/ili zaustavljen.

Pojmom “ireverzibilno spriječen i/ili inhibiran i/ili zaustavljen” se misli da nakon primjene spoja ovog izuma, pri uklanjanju spoja, učinci spoja, riječima sprječavanje i/ili inhibicija i/ili zaustavljanje staničnog ciklusa, se još uvijek mogu zamijetiti. Određenije pojmom “ireverzibilno spriječen i/ili inhibiran i/ili zaustavljen” se misli da kada se analizira u skladu s protokolom za analizu staničnog ciklusa koji je ovdje predstavljen, stanice tretirane spojem od interesa pokazuju manji rast nakon stadija 2 protokola I nego kontrolne stanice. Detalji o tom protokolu su predstavljeni dolje.

Stoga, ovaj izum pruža spojeve koji: uzrokuju in vivo inhibiciju rasta i onih stanica raka dojke koje su pozitivne na estrogenski receptor (ER+) i onih koje su ER negativne (ER-) spriječavanjem i/ili inhibiranjem i/ili zaustavljanjem staničnog ciklusa; i/ili uzrokuju regresiju nitrozo-metil urea (NMU)-induciranih tumora sisa u intaktnih životinja (i.e. kojima nije učinjena ovariektomija), i/ili spriječavaju i/ili inhibiraju i/ili zaustavljaju stanični ciklus u stanicama raka; i/ili djeluju in vivo spriječavajući i/ili inhibirajući i/ili zaustavljajući stanični ciklus i/ili djeluju kao agonisti staničnog ciklusa.

ANALIZA STANIČNOG CIKLUSA (PROTOKOL 6)

Postupak

Stadij 1

MCF-7 stanice raka dojke su nacijepljene u posude za kulturu s više bazena u gustoći od 105 stanica po bazenu. Stanice su puštene da se pričvrste i rastu do približno 30%-tnog sjedinjenja kada su tretirane kako slijedi:

Kontrola - bez tretmana

Spoj od interesa (COI) 20μM

Stanice su uzgajane šest dana u mediju za rast koji sadrži COI uz mijenjanje medija/COI svakih tri dana. Na kraju tog perioda brojevi stanica su bili izbrojani pomoću Coulter brojača stanica.

Stadij 2

Nakon tretmana stanica u šestodnevnom periodu s COI stanice su ponovno nacijepljene u gustoći od 104 stanica po bazenu. Nije dodan nikakav dalji tretman. Stanice se puste da nastave rasti slijedećih šest dana u prisustvu medija za rast. Na kraju tog perioda broj stanica je ponovno brojan.

RAK

Kao što je naznačeno, spojevi ovog izuma mogu biti korisni u tretiranju poremećaja staničnog ciklusa. Osobit poremećaj staničnog ciklusa je rak.

Rak ostaje glavni razlog smrtnosti u većini zapadnih zemalja. Do sada razvijene tarapije raka uključivale su blokiranje djelovanja ili sinteze hormona kako bi se inhibirao rast tumora zavisnih o hormonima. Kako god, agresivnija kemoterapija se trenutno koristiti za tretman tumora nezavisnih o hormonima.

Stoga bi razvoj farmaceutika za tretman protiv raka za tumore koji su zavisni o hormonima i/ili za one tumore koji nisu zavisni o hormonima, još k tome koji nema neki ili niti jedan od popratnih učinaka povezanih s kemoterapijom, predstavljao golemu terapeutsku prednost.

Poznato je da estrogeni prolaze brojne reakcije hidroksilacije i konjugacije nakon svoje sinteze. Sve do nedavno, mislilo se da su takve reakcije bile dio metaboličkih procesa koji su učinili estrogene topivima u vodi i poboljšali njihovu eliminaciju uz tijela. Sada je jasno da neki hidroksi metaboliti (e.g. 2-hidroksi i 16alfa-hidroksi) i konjugati (e.g. estron sulfat, E1S) su važni u određivanju nekih od kompleksnih djelovanja koji estrogeni imaju u tijelu.

Istraživaći su ispitali stvaranje 2- i 16-hidroksiliranih estrogena u odnosu na uvjete koji mijenjaju rizik od raka dojke. Sada postoji dokaz da su činioci koji povečavaju djelovanje 2-hidroksilaze povezani sa smanjenim rizikom od raka, dok oni koji povečavaju 16alfa-hidroksilaciju mogu povećati rizik od raka dojke. Daljnji interes za biološku ulogu metabolita estrogena bio je stimuliran rastućim skupom dokaza da je 2-metoksiestradiol endogeni metabolit s antimitotičkim značajkama. 2-metoksiestron-3-O-sulfamat (2-MeOE2) se formira iz 2-hidroksi estradiola (2-OHE2) katehol estrogen metil transferazom, emzimom koji je široko raspoređen po cijelom tijelu.

Istraživaći su pokazali da in vivo 2-MeOE2 inhibira rast tumora koji nastaju od subkutanog injektiranja Meth A sarkoma, B16 melanoma ili MDA-MB-435 stanica raka dojke negativnih na receptor estrogena (ER-). On također inhibira proliferaciju i migraciju endotelnih stanica, i in vitro angiogenezu. Predloženo je da sposobnost 2-MeOE2 da inhibira rast tumora in vivo može biti zbog njegove sposobnosti da inhibira angiogenezu potaknutu tumorom prije nego zbog neposredne inhibicije proliferacije stanica tumora.

Mehanizam kojim 2-MeOE2 vrši svoje močne antimitogene i antiangiogene učinke se još uvijek razjašnjava. Postoji dokaz da pri visokim koncentracijama može inhibirati polimerizaciju mikrotubula te djeluje kao slabi inhibitor vezanja kolhicina za tubulin. Nedavno je, ipak, nađeno da pri koncentracijama koje blokiraju mitozu, tubulinski filamenti u stanicama ne depolimeriziraju nego imaju istovijetnu morfologiju onoj viđenoj nakon tretmana taksolom. Stoga je moguće da, kao taksol, lijek koji se koristi za terapiju raka jajnika i raka dojke jajnika, 2-MeOE2 djeluje stabiliziranjem dinamike mikrotubula.

Dok identifikacija 2-MeOE2 kao nove terapije za rak predstavlja važan napredak, biodostupnost oralno davanih estrogena je slaba. Nadalje, oni mogu proći ekstenzivan metabolizam za vrijeme svog prvog prolaza kroz jetru. Kao dio istraživačkog programa razvijanja inhibitora steroid sulfataze za terapiju raka dojke, identificiran je estron-2-O-sulfamat (EMAT) kao močan inhibitor usmjeren na aktivno mjesto. Neočekivano, EMAT je dokazao da posjeduje močne estrogenske značajke sa svojim oralnim uterotrofnim djelovanjem kod štakora koje je stostruko više nego ono estradiola. Mislilo se da njegov poboljšani estrogenicitet rezultira iz svoje apsorpcije od strane crvenih krvnih zrnaca (rcbs) što ih štiti od inaktivacije za vrijeme svog prolaza kroz jetru, te što djeluje kao rezervoar za svoje polagano otpuštanje kroz produženi period vremena. Brojni analozi modificiranog A-prstena su bili sintetizirani i testirani, uključujući 2-metoksiestron-3-O-sulfamat. Dok je taj spoj bio ekvipotentan EMAT-u kao inhibitor steroid sulfataze, bio je lišen estrogeniciteta.

Vjerujemo da spoj ovog izuma pruža načine za tretman rakova i, posebno, raka dojke.

Dodatno ili alternativno spoj ovog izuma može biti koristan u blokiranju rasta rakova uključujući leukemije i solidnih tumora kao što su tumori dojke, endometrija, prostate, jajnika i pankreasa.

TERAPIJA U POGLEDU ESTROGENA

Vjerujemo da neki od spojeva ovog izuma mogu biti korisni u kontroli razina estrogena u tijelu - osobito kod ženki. Stoga, neki od spojeva mogu biti korisni pružajući načine kontrole plodnosti - kao što je oralna kontraceptivna tableta, pilula, otopina ili pastila. Alternativno, spoj može biti u obliku implantata ili kao flaster.

Tako, spojevi ovog izuma mogu biti korisni kod tretiranja hormonalnih stanja povezanih s manjkom estrogena.

Dodatno ili alternativno spoj ovog izuma može biti koristan u tretiranju hormonalnih stanja dodatno onima povezanima s estrogenom. Stoga spoj ovog izuma može također biti sposoban utjecati na djelovanje hormona te također može biti sposoban utjecati na imunološki odgovor.

NEURODEGENERATIVNA OBOLJENJA

Vjerujemo da neki od spojeva ovog izuma mogu biti korisni u tretmanu neurodegenerativnih oboljenja, i sličnih stanja.

Primjerice, vjeruje se da inhibitori STS-a mogu biti korisni u poboljšanju memorijskih funkcija kod pacijenata koji pate od bolesti ka što su amnezija, ozljede glave, Alzheimerova bolest, epileptička demencija, predsenilna demencija, posttraumatska demencija, senilna demencija, vaskularna demencija, i demencija nakon udara ili individua koje inače traže poboljšanje memorije.

TH1

Vjerujemo da neki od spojeva ovog izuma mogu biti korisni kod TH1 primjena.

Primjerice, vjeruje se da prisustvo inhibitora STS-a unutar makrofaga ili drugih stanica koje prezentiraju antigen može dovesti do smanjene sposobnosti senzibiliziranih T stanica da poluče (visoki IL-2, IFNy niski IL-4) odgovor. Normalni regulatorni utjecaj ostalih steroida kao što su glukokortikoidi će stoga prevladavati.

UPALNA STANJA

Vjerujemo da neki od spojeva ovog izuma mogu biti korisni u tretiranju upalnih stanja - kao što su stanja povezana s jednim ili više od slijedećeg: autimunitet, uključujući na primjer, reumatoidni artritis, diabetes tipa I i II, sistemski eritematozni lupus, multipla skleroza, miastenia gravis, tiroiditis, vaskulitis, ulcerozni kolitis i Kronova bolest, kožni poremećaji, e.g. psorijaza i kontaktni dermatits; bolest presadka protiv primatelja; ekcem; astma i odbacivanje organa nakon transplantacije.

Primjerice, vjeruje se da inhibitori STS-a mobu spriječiti normalni fiziološki učinak DHEA ili srodnih steroida na imunološke i/ili upalne odgovore.

Spojevi ovog izuma mogu biti korisni u izradi medikamenta za izazivanje endogenog učinka sličnog onom glukokortikoida.

OSTALE TERAPIJE

Također je za shvatiti da spoj/smjesa ovog izuma može imati druge važne medicinske primjene.

Na primjer, spoj ili smjesa ovog izuma može biti korisna u tretmanu poremećaja popisanih u WO-A-99/52890 - viz:

Dodatno, ili alternativno, spoj ili smjesa ovog izuma može biti korisna u tretmanu poremećaja popisanih u WO-A-98/05635. Zbog olakšavanja reference, dio tog popisa je pružen sada: rak, upala ili upalna bolest, dermatološki poremećaji, vručica, kardiovaskularni učinci, hemoragija, koagulacijski i odgovor akutne faze, kaheksija, anoreksija, akutna infekcija, HIV infekcija, šok stanja, reakcije presadka protiv primatelja, autoimunološka bolest, reperfuzijske ozljede, meningitis, migrena i o aspirinu ovisna antitromboza; rast tumora, invazija i širenje, angiogeneza, metastaze, maligni, ascitesi i maligni pleuralni izljev, cerebralna ishemija, ishemična bolest srca, osteoartritis, reumatoidni artritis, osteoporoza, astma, multipla skleroza, neurodegeneracija, Alzheimerova bolest, ateroskleroza, udar, vaskulitis, Kronova bolest i ulcerozni kolitis; peridontitis, gingivitis; psorijaza, atopični dermatitis, kronični čirevi, epidermioliza buloza; ulceracija rožnice, retinopatija i zacijeljenje kirurških rana; rinitis, alergični konjuktivitis, ekcem, anafilaksa; restenoza, kongestivno zatajenje srca, endometrioza, ateroskleroza ili endoskleroza.

Dodatno, ili alternativno, spoj ili smjesa ovog izuma može biti korisna u tretmanu poremećaja popisanih u WO-A-98/07859. Zbog olakšavanja reference, dio tog popisa je pružen sada: djelovanje citokina ili stanične proliferacije/diferencijacije; imunusupresirajuća i imunostimulirajuća djelovanja (e.g. za tretiranje imune deficijencije, uključujući infekcije virusom humane imunodeficijencije; regulacija rasta limfocita; tretiranje raka i mnogih autoimunih bolesti, te za spriječavanje odbacivanja transplantata ili induciranje tumorskog imuniteta); regulacija hematopoeze, e.g. tretiranje mijeloidnih ili limfoidnih bolesti; pospješivanje rasta tkiva kosti, hrskavice, tetiva, ligamenta i živčanog tkiva, e.g. za zacjeljivanje rana, tretman opeklina, čireva, peridontalne bolesti i neurodegeneracije; inhibicija ili aktivacija folikul stimulirajućeg hormona (prilagođavanje plodnosti); kemotaktična/kemokinetička djelovanja (e.g. za mobiliziranje specifičnih tipova stanica na mjesta ozljede ili infekcije); hemostatička ili trombolitička djelovanja (e.g. za tretiranje hemofilije i udara); antiinflamatorna djelovanja (za tretiranje e.g. septičkog šoka ili Kronove bolesti); kao antimikrobna sredstva; modulatori e.g. metabolizma ili ponašanja; kao analgetici, tretiranje specifčnih poremećaja deficijencije; kod tretmana e.g. psorijaze, u humanoj i veterinarskoj medicini.

Dodatno, ili alternativno, smjesa ovog izuma može biti korisna u tretmanu poremećaja popisanih u WO-A-98/09985. Zbog olakšavanja reference, dio tog popisa je pružen sada: inhibitorno djelovanje makrofaga i/ili T stanica i stoga, antiinflamatorno djelovanje; antiimuno djelovanje, i.e. inhibitorna djelovanja protiv staničnog i/ili humoralnog imunološkog odgovora, uključujući odgovor koji nije povezan s upalom; inhibira sposobnost makrofaga i T stanica da se vežu za komponente ekstracelularnog matriksa i fibronektin, kao i uzvodno reguliranje ekspresije fas receptora kod T stanica; inhibira neželjenu imunološku reakciju i upalu uključujući artritis, upalu povezanu s hipersenzitivnošću, alergijske reakcije, astmu, lupus, bolesti kolagena i druge autoimune bolesti, upalu povezanu s aterosklerozom, arteriosklerozom, aterosklerotičnu srčanu bolest, reperfuzijske ozljede, srčani zastoj, infarkt miokarda, vaskularne upalne poremećaje, respiratorni stres sindrom ili druge kardiopulmonarne bolesti, upalu povezanu s čirom na želucu, ulcerozni kolitis i druge bolesti gastroinetstinalnog trakta, hepatičku fibrozu, cirozu jetre ili druge hepatičke bolesti, tiroiditis ili druge žljezdane bolesti, glomerulonefritis ili druge bubrežne i urološke bolesti, otitis ili druge otorinolaringološke bolesti, dermatitis ili druge kožne bolesti, peridontalne bolesti ili druge zubne bolesti, orhitis ili epididimo-orhitis, neplodnost, orhidna trauma ili druge imunološki povezane testikularne bolesti, placetalna disfunkcija, placentalna insuficijencija, habitualni abortus, eklampsija, preeklampsija i ostale imunološke i/ili upali srodne ginekološke bolesti, posteriorni uveitis, intermedijarni uveitis, anteriorni uveitis, konjuktivitis, korioretinitis, uveoretinitis, optički neuritis, intraokularna upala, e.g. retinitis ili cistoidni makularni edem, simpatetička oftalmija, skleritis, retinitis pigmentoza, imunološke i upalne komponente bolesti degenerativnog fundusa, upalne komponente okularne traume, okularna upala uzrokovana infekcijom, proliferativne vitreo-retinopatije, akutna ishemična optička neuropatija, povečano strašenje, e.g. nakon operacije filtriranja glaukoma, imunološke i/ili upalne reakcije protiv okularnih implantata i druge imunološke i upalama srodne oftalmičke bolesti, upala povezana s autoimunim bolestima ili stanjima ili poremećajima gdje, i u centralnom živčanom sustavu (CNS) ili u nekom drugom organu, će supresija imunološkog sustava i/ili upalne biti dobrotvorna, Parkinsonova bolest, s AIDS-om povezana demencija kompleks s HIV-om povezana encefalopatija, Devikova bolest, Sydenhamova koreja (chorea), Alzheimerova bolest i druge degenerativne bolesti, stanja ili poremećaji CNS-a, upalne komponente (moždanog) udara (op.prev.: u engl. tekstu ovdje stoji "stokes" što je vjerojatno greška umjesto "strokes"), post-polio sindrom, imunološke i upalne komponente psihijatrijskih poremećaja, mijelitis, encefalitis, subakutni sklerozirajući pan-encefalitis, encefalomijelitis, akutna neuropatija, subakutna neuropatija, kronična neuropatija, Guillai-Barre sindrom, Sydenhamova koreja, miastenija gravis, pseudo-tumor mozga, Downov sindrom, Huntingtonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, upalne komponente pritiska na CNS ili traume CNS-a ili infekcija CNS-a, upalne komponente mišićnih atrofija i distrofija, i imunološko i upalno srodnih bolesti, stanja ili poremećaji centralnog i perifernog živčanog sustava, posttraumatska upala, septički šok, infekcijske bolesti, upalne komplikacije ili popratne pojave kirurgije, komplikacije i popratne pojave kod transplantacije koštane srži ili drugih transplantacija, upalne i/ili imunološke komplikacije i popratne pojave genske terapije, e.g. zbog infekcije virusnim prijenosnikom, ili upala povezana s AIDS-om, supresirati ili inhibirati humoralni i/ili stanični imunološki odgovor, tretirati ili poboljšati proliferativne bolesti monocita ili leukocita, e.g. leukemija, smanjivanjem količine monocita ili limfocita, za sprječavanje i/ili tretman odbacivanja presadka u slučajevima transplantacije prirodnih ili umjetnih stanica, tkiva i organa kao što je rožnica, koštana srž, organi, leće, pacemaker-i, prirodno ili umjetno kožno tkivo.

PRIPRAVLJANJE SPOJA

Spojevi ovog izuma mogu biti pripravljeni reagiranjem odgovarajućeg alkohola s prikladnim kloridom. Primjerice, sulfamat spojevi ovog izuma mogu biti pripravljeni reagiranjem odgovarajućeg alkohola s prikladnim sulfamoil kloridom, formule R1R2NSO2Cl.

Tipični uvjeti za izvođenje reakcije su kako slijedi.

Natrijev hidrid i sulfamoil klorid su dodani u miješanu otopinu alkohola u bezvodnom dimetil formamidu pri 0°C. Nakon toga, reakcija je puštena da se zagrije do sobne temperature nakon čega je miješanje nastavljeno daljih 24 sata. Reakcijska smjesa je prelivena na hladnu zasićenu otopinu natrijevog bikarbonata a rezultirajuća vodena faza je ekstrahirana diklormetanom. Kombinirani organski ekstrakti su sušeni nad bezvodnim MgSO4. Filtracija nakon koje je slijedila evaporacija otapala u vakuumu i ponovna evaporacija s toulenom dala je sirovi talog koji je dalje počišćen flash kromatografijom.

Preferira se da je alkohol deriviran, kao što je prikladno, prije reakcije sa sulfamoil kloridom. Gdje je to neophodno, funkcionalne grupe u alkoholu mogu biti zaštićene na poznati način, a zaštitna grupa ili grupe uklonjene na kraju reakcije.

Preferira se da su sulfamat spojevi pripravljeni u skladu s učenjima od Page et al (1990 Tetrahedron 46;2059-2068). Alternativno, sulfamat spojevi mogu biti pripravljeni u skladu s WO 96/05216 ili WO 96/05217.

Sažetak

U sažetku, ovaj izum pruža nove smjese prikladne za oralnu kontracepciju, hormonsku nadomjesnu terapiju, inhibiciju E1-STS kao i druge terapeutske primjene.

PRIMJERI

Ovaj izuma će sada biti opisan samo pomoću primjera u odnosu na pripadajuće slikovne prikaze u kojima:

Slika 1 predstavlja dijagram toka;

Slika 2 predstavlja grafikon;

Slika 3 predstavlja grafikon;

Slika 4 predstavlja grafikon;

Slika 5 predstavlja grafikon;

Slika 6 predstavlja grafikon;

Slika 7 predstavlja grafikone;

Slika 8 predstavlja grafikone;

Slika 9 predstavlja grafikon;

Slika 10 predstavlja grafikon;

Slika 11 predstavlja grafikone;

Slijedeći spoj(evi) u skladu s ovim izumom su bili pripravljeni

Pripravljanje estron-3-sulfamata

Natrijev hidrid (60% disperzija; 2 eq) i sulfamoil klorid (2 eq) su bili dodani u miješanu otopinu estrona (1 eq) u bezvodnom dimetil formamidu pri 0°C. Nakon toga, reakcija je puštena da se zagrije do sobne temperature nakon čega je miješanje nastavljeno daljih 24 sata.

Reakcijska smjesa je prelivena na hladnu zasićenu otopinu natrijevog bikarbonata a rezultirajuća vodena faza je ekstrahirana diklormetanom. Kombinirani organski ekstrakti su sušeni nad bezvodnim MgSO4. Filtracija nakon koje je slijedila evaporacija otapala u vakuumu i ponovna evaporacija s toulenom dala je sirovi talog koji je dalje pročišćen flash kromatografijom.

Analiza je pokazala slijedeće podatke:

δ1H(270MHz; CD3OD): 0.91 (s, 3H, C18-Me), 1.40-2.55(serije m, 13H), 2.90-2.92 (m, 2H), 7.04 (šir. d, 2H, J=10.44Hz), 7.33 (šir. d, 1H, J=8.42Hz).

δ13C (67.8MHz; CD3OD): 14.53 (q, C18-Me), 22.8 (t), 27.24 (t), 27.73 (t), 30.68 (t), 33.05 (t), 37.01 (t), 39.76 (d), 45.73 (s, C18), 51.86 (d), 120.76 (d), 123.54 (d), 127.89 (d), 139.83 (s), 150.27 (s), 223.87 (s, C=0).

m/z (%): 349(9)(m+), 270 (100), 213 (26), 185(43), 172(31), 159(21), 146(36), 91(33), 69(37), 57(73), 43(56), 29(24).

Mikroanaliza:

C H N

Očekivano: 61.87% 6.63% 4.01%

Nađeno: 61.90% 6.58% 3.95%

Studije s estradiol sulfamatom (J995)

Tehnologija

Estradiol Sulfamat (J995) je bio istraživan s obzirom na njegove hormonalne značajke in vivo i in vitro. In vitro studije uključile su procjenjivanje njegovog specifičnog vezanja za estrogenske receptore korištenjem citosolnih pripravaka uterinog tkiva štakora i miševa i MCF-7 tumorske stanice. In vivo studije su bile izvedene na nekoliko vrsta životinja uključujući intaktne štakore i one kojima je učinjena ovariektomija, te cynomolgus majmune. Te vrste su služile za detaljne farmakodinamičke i farmakokinetičke studije kod parenteralnog i oralnog davanja spoja.

Studije su kod ljudi bile izvedene s oralnim davanjem spoja kod žena u postmenopauzi. Različite su doze procjenjivane pri jednostrukim i višestrukim davanjima. In vitro studije su bile izvedene s otopinama u uljnim prijenosnicima za parenteralno davanje. Oralni tretman je bio izveden sa suspenzijama kristalnog J995 u vodenim prijenosnicima. Kliničke studije su bile izvedene s amorfnom ljekovitom tvari galenički formuliranom sa smjesom konvencionalnih sastojaka kao kapsule ili tablete.

In vitro studije su otkrile da J995 per se nema afinitet za estrogenski receptor. Nije bilo specifičnog vezanja radioaktivno označenog J995 na estrogenski receptor miševa, štakora i ljudi. Veliki suvišak J995 nije mogao ukloniti specifični vezani radioaktivno označeni estradiol. Oba nalaza su jaki dokaz da J995 pokazuje estrogenske učinke nakon transformacije od hormonski nedjelatne u hormonski djelatnu molekulu. Preteča J995, ili njegov glavni metabolit estron sulfamat (EMAT), je hidroliziran do amidosulfonske kiseline i prirodnih estrogenskih hormona estradiola odnosno estrona (slika 1).

Zbog preferencijalnog transporta u eritrocitima, preteča i J995 imaju osobite farmakokinetičke značajke. J995 ne cirkulira u plazmatskoj frakciji krvi kao konvencionalni estrogeni, ali udio od 98-99% J995 cirkulira u odjeljku eritrocita. Taj transport eritrocitima dovodi do vrlo reduciranog djelovanja hepatičkog hormona i ekstrakcije pri prvom prolazu kroz jetru te do dugotrajnog otpuštanja J995 iz eritrocita koji funkcioniraju kao depo.

Prednosti J995 s obzirom na oralnu terapiju estrogenom

Smanjenje individualnih varijacija razina u krvi (slika 2 i 3):

Zlatni standard oralne terapije estrogenom je etinil estradiol. Taj spoj ne dovodi do dobro definiranih razina u krvi (slika 4). Nedostatak te individualne varijacije je nužnost davanja većih doza nego je neophodno kod većine individua s ciljem postizanja prihvatljive brzine uspješnih tretmana.

Smanjenje doze estrogena i količine aktivnih metabolita za koje se sumnja da potpomažu rast nekih tumora zavisnih o hormonima:

Konvencionalna oralna hormonalna nadomjesna terapija s takozvanim konjugiranim estrogenima, estradiolom, estradiol valeratom ili estron sulfatom vodi do velikog pool-a estron sulfata u cirkulaciji. Hidroliza nekih od tih metabolita dovodi do terapeutski relevantnih razina estrona i estradiola u krvi. Ipak, estron sulfat ima nedostatak da je osobito djelatno hidroliziran sulfatazom u tkivu tumora dojke što može stvoriti estrogene koji potencijalno potpomažu rast. J995, s obzirom na svoju dozu, vodi do viših i puno dugotrajnijih razina estradiola nego estradiol valerat u istoj dozi (slika 6, 7). Metabolit estron sulfat koji nastaje nizvodno ostaje barem za faktor 10 niže nego pod tretmanom estradiol valeratom (slika 5).

Smanjenje hepatičkih estrogenskih djelovanja:

Visoka doza estrogena je esencijalna za konvencionalnu oralnu estrogensku terapiju s ciljem da se bori s u osnovi hepatičkim gubitkom hormona. Nedostatak te visoke doze je nepovoljni učinak na hepatičke funkcije regulirane estrogenom. Ove uključuju učinak na činioce hemostatičkog sustava i srodne tromboemboličke poremećaje, povišenje angiotenzinogena u cirkulaciji i slijedeće učinke na adrenalne, renalne i vaskularne funkcije, promjene kod izlučivanja žući, i metabolizam lipida. Mehanizam prolaska kroz jetru djelovanja J995 te strategija ultraniske doze u skladu s ovim izumom izbjegava odgovarajuće neželjene učinke klimakteričnog estrogenskog tretmana. Oralno davan J995 postiže eritrocitni pool do skoro 100%. Daleko više od 50% ove preteče se pojavljuje kao estron i estradiol u cirkulaciji (slika 11). To dozvoljava uvelike smanjenu dozu u usporedbi s konvencionalno oralnom estrogenskom terapijom po jedinici vremena.

Postizanje konstantnih razina u krvi:

Razine estrogena u krvi fluktuiraju iz dana u dan pod konvencionalnim dnevnim oralnim estrogenskim tretmanom (slike 5, 6, 7) gdje J995 dovodi do vrlo konstantnih, dugotrajnih razina u krvi (slike 5, 6, 7, 8, 9, 10). Slika 9 prikazuje skoro konstantne razine estron sulfata koje odražuju uzvodno stvaranje estradiola i estrona nakon 14 dana tretmana s J995 s vrlo niskom dozom od 100μg dnevno u fazi ispiranja kroz 144 sata.

Učinci estradiol sulfamata u kostima s manjkom estrogena

Konstantne i dobro definirane razine u krvi kako su ovdje opisane ne mogu se postići s ustanovljenom oralnom estrogenskom terapijom. J995 omogućuje precizni osteoprotektivni tretman ispod samog praga koji vodi do endometrijskog rasta. Neprisustvo endometrijskih učinaka dopušta, u preferiranom aspektu, korištenje J995 bez istovremenog davanja progestina.

Poboljšanja koja se mogu postići sa samo estrogen pripravkom za estrogensku nadomjesnu terapiju baziranu na J995

Terapija bez krvarenja:

Osnovni princip kombiniranog estrogen/progestin tretmana je kontrola endometrijske proliferacije koja pedstavlja rizik razvoja raka endometrija. Cijena za taj zaštitni esencijalni učinak je prilično stvarna. I ciklički i kontinuirani kombinirani tretman dovode do uterinih krvarenja koja su vjerovatno najvažniji razlog prekida estrogenske nadomjesne terapije.

Učinci na blagostanje:

Slijedeći ustanovljeni negativni aspekt ovog tretmana je umanjenje pozitivnih učinaka koje estrogen pokazuje na blagostanje klimakteričnih žena.

Dojke:

Pitanje je postavljeno proliferativnim učincima progestina u dojkama analogno učincima progesterona u trudnoći. Zabrinutost o tim učincima je povezana s njihovom potencijalnom ulogom u razvoju raka dojke.

Metaboličke popratne pojave:

Progestini, kao sam progesteron, imaju važne učinke na široki spektar metaboličkih funkcija. Ove uključuju izlučivanje inzulina i otpornost inzulina, koji je smanjen, i učinke na metabolizam lipida. Odgovarajući učinci predstavljaju neželjene učinke u kontekstu estrogenske nadomjesne terapije.

Značaj estrogenske nadomjesne terapije:

Žene imaju stalni gubitak koštane mase nakon prestanka izlučivanja ovarijskog estrogena nakon menopauze. Zbog činjenice da je očekivano trajanje života kod žena vrlo dugo te da i dalje raste, nalaže se sprječavanje gubitka kosti i rezultirajuće skeletne krhkosti. To je daleko najvažniji činioc rizika nesposobnosti i također boležljivosti, i smrtnosti kod starih osoba.

Sve publikacije i patenti spomenuti u gornjem opisu patenta su ovdje uključeni referencom.

Razne modifikacije i varijacije ovog izuma biti će očite iskusnim stručnjacima bez da napuštaju područje i duh izuma. Premda je izum bio opisan u vezi sa specifičnim preferiranim aspektima, treba shvatiti da izum kako je zahtjevan ne bi trebao biti neopravdano ograničen na takve specifične aspekte. Zaista, namjera je da su razne modifikacije opisanih načina za izvođenje izuma, koje su očite onima koji imaju iskusva u kemiji, biologiji ili srodnim poljima, unutar područja slijedećih zahtjeva.

Claims (26)

1. Farmaceutska smjesa koja je naznačena time da sadrži (i) spoj formule (I) [image] Formula I gdje: X je hidrokarbil prsten koji ima najmanje 4 atoma u prstenu; K je hidrokarbil grupa; Rs je sulfamat grupa; (ii) opcionalno pomiješanu s farmaceutski prihvatljivim prijenosnikom, razrijeđivačem, ekscipijentom ili adjuvantom, gdje je spoj prisutan u količini da pruži dozu ne veću od 200μg dnevno.

2. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevom 1, a koja je naznačena time da je spoj prisutan u količini da pruži dozu od 10 do 200μg dnevno.

3. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevima 1 ili 2, a koja je naznačena time da je spoj prisutan u količini da pruži dozu od 50 do 200μg dnevno.

4. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevima 1 ili 2, a koja je naznačena time da je spoj prisutan u količini da pruži dozu od 20 do 50μg dnevno.

5. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevom 1, a koja je naznačena time da je spoj prisutan u količini ne većoj od 200μg po dozi.

6. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevom 1, a koja je naznačena time da je spoj prisutan u količini ne većoj od 1 mg po dozi.

7. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevom 1, a koja je naznačena time da je spoj prisutan u količini ne većoj od 4 mg po dozi.

8. Farmaceutska smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, a koja je naznačena time da X u kombinaciji s K oponaša steroidnu strukturu.

9. Farmaceutska smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, a koja je naznačena time da K je ciklička grupa.

10. Farmaceutska smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, a koja je naznačena time da X je šesteročlani prsten.

11. Farmaceutska smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, a koja je naznačena time da prsten X ima šest ugljikovih atoma u prstenu.

12. Farmaceutska smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, a naznačena je time da spoj ima formulu II [image] Formula II gdje svaki Rs, X i K su kao što su definirani u zahtjevu 1.

13. Farmaceutska smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, a koja je naznačena time da X u kombinaciji s K je steroidna prstenasta struktura.

14. Farmaceutska smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, a koja je naznačena time da grupa K i prsten X su steroidna prstenasta struktura ili njeni supstituirani derivati.

15. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevom 14, a koja je naznačena time da je Rs grupa na poziciji 3 prstena X.

16. Farmaceutska smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, a koja je naznačena time da Rs je sulfamat grupa.

17. Farmaceutska smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, koja je naznačena time da spoj ima formulu III [image] Formula III a gdje su X, K i Rs kao što su definirani u zahtjevu 1; Rh1 je opcionalno halo grupa; Rh2 je opcionalno halo grupa; barem jedna od Rh1 i Rh2 je prisutna

18. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevom 17, a koja je naznačena time da je Rh1 na poziciji 2 prstena X.

19. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevom 17 ili 18, a koja je naznačena time da je Rh2 na poziciji 4 prstena X.

20. Farmaceutska smjesa u skladu sa zahtjevom 1, a koja je naznačena time da je spoj formule I odabran među spojevima [image] [image] 17α etinil 17β estradiol-3-sulfamat 17β estradiol-3-sulfamat [image] [image] 17α estradiol-3-sulfamat estron-3-sulfamat (EMAT) [image] estriol-3-sulfamat

21. Smjesa u skladu s bilo kojim od prethodnih zahtjeva, a koja je naznačena time da je za upotrebu u medicini.

22. Upotreba smjese u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 20, a koja je naznačena time da služi proizvodnji medikamenta za upotrebu u oralnoj kontracepciji.

23. Upotreba smjese u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 20, a koja je naznačena time da služi proizvodnji medikamenta za upotrebu u hormonskoj nadomjesnoj terapiji.

24. Upotreba smjese u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 20, a koja je naznačena time da služi proizvodnji medikamenta za upotrebu u hormonskoj nadomjesnoj terapiji za zaštitu kosti bez endometrijske stimulacije.

25. Upotreba smjese u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 20, a koja je naznačena time da služi proizvodnji medikamenta za upotrebu u terapiji stanja ili bolesti povezanih s STS-om.

26. Upotreba smjese u skladu s bilo kojim od zahtjeva 1 do 20, a koja je naznačena time da služi proizvodnji medikamenta za upotrebu u stanja ili bolesti povezanih sa štetnim razinama STS-a.