CZ20022282A3 - Farmaceutický prostředek a jeho pouľití - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutického prostředku, který obsahuje cyklickou sloučeninu, sestávající z kruhového systému a sulfamátové skupiny. Prostředek je určen k léčebnému použití, zejména pro perorální antikoncepci, substituční léčbu, ochranu kostní tkáně bez stimulace endometria a podobně.

Dosavadní stav techniky

Estrogeny hrají základní úlohu při hormonální antikoncepci, při substituční léčbě po přechodu (HRT) a při léčení gynekologických onemocnění, například zhoubných nádorů mléčné žlázy a také v případě některých onemocnění u mužů, například zhoubných nádorů prostaty. V případě HRT a antikoncepce se estrogeny převážně používají spolu s gestageny, jako jsou levonorgestrel, desogestrel, norethisteron, cyproteronacetát, chlormadinonacetát nebo dienogest.

Při použití k antikoncepčním účelům se estrogeny užívají pro potlačení zrání folikulů a k potlačení ovulace, mimo to však nahrazují endogenní sekreci vaječníků, která je potlačena. Tato náhrada je důležitá pro udržení umělého menstruačního cyklu a pro další pohlavní funkce, které by nebylo možno splnit v potřebném rozsahu v případě, že by byl použit pouze gestagen.

Mimo to endogenní a exogenní estrogeny mají důležité funkce v centrálním nervovém systému a důležité • * · · metabolické funkce v organismu ženy. Normální koncentrace estrogenu přispívá k celkovému dobrému zdravotnímu stavu. Přítomnost těchto hormonů v organismu brání vývoji kardiovaskulárních onemocnění různým mechanismem. Jde zejména o udržení příznivé koncentrace lipoproteinů v krevním séru, o inhibici ukládání lipidů ve stěnách krevních cév, o snížení krevního tlaku příznivým ovlivněním napětí cév, o snížení periferního odporu v důležitých orgánech a o snížení podnětů, které vedou ke smrštění cévní svaloviny. Pod vlivem estrogenů uvolňuje výselka cév faktory, které brání tvorbě thrombů.

Estrogeny jsou také nezbytné pro zachování kostní struktury u žen. V případě jejich nedostatku může dojít k destrukci kostní tkáně a ke vzniku osteoporózy. Tyto účinky na centrální nervový systém a na metabolismus jsou v případě estrogenů hlavním důvodem pro substituční léčbu. Je možno předpokládat, že v mužském organismu mají estrogeny analogickou funkci a že při jejich nedostatku dochází k podobným poruchám jako u žen. Rozdíl mezi oběma pohlavími spočívá v tom, že produkce hormonů u mužů nastává méně pravidelně a až ve vyšším věku než u žen.

I když používání estrogenů k léčebným účelům má svá velmi pozitivní hlediska, existují ještě nerozřešené problémy, které omezují léčebné použití estrogenů vzhledem ke vzniku nežádoucích účinků.

Známé estrogeny mají nedostatky zejména pokud jde o farmakokinetiku. Při perorálním podávání jsou přírodní estrogeny, jako estradiol, estron, estronsulfát, estery estradiolu nebo estriol biologicky dostupné pouze ve velmi nízkém stupni. Tento stupeň se mimo to může u jednotlivých osob měnit natolik, že není možno doporučit obecné dávkování. Další problém vyvolává rychlé odstranění uvedených látek z krve. Z tohoto důvodu je nutno podávané dávky jednotlivě upravovat.

Totéž platí o syntetických estrogenech.

Nejdůležitějším synteticky pozměněným estrogenním steroidem je ethinylestradiol, EE. Tento estrogen převažuje zejména při perorální hormonální antikoncepci. Kromě EE se ještě v menší míře používá mestranon. Jde o prekursor, který se v organismu metabolizuje na EE. V případě perorálního podávání má EE daleko lepší biologickou dostupnost než svrchu uvedené přírodní estrogeny, avšak i biologická dostupnost této látky při perorálním podání se u různých jedinců do značné míry mění. Řada autorů zdůrazňuje, že po perorálním podání této látky jsou dosažené koncentraci v krevním séru vysoce nepravidelné, například Goldzieher J. W. 1989, Goldzieher J. W. 1990, Humpel M. 1987, Kuhnz, 1993).

Mimo to mají známé estrogeny také farmakodynamické nedostatky. Po vstřebání ze střev vstupují perorálně podané účinné látky do organismu přes játra. Tento fakt má specifickou důležitost pro estrogenní látky vzhledem k tomu, že játra jsou jejich cílovým orgánem. Při perorálním podání estrogenů působí tyto estrogeny velmi silně na játra. Sekreční účinnost, která je v lidských játrech řízena estrogeny, zahrnuje syntézu přenosových bílkovin CBG, SHGB, TBG, angiotensinogenu, některých dalších faktorů, které jsou důležité pro srážení krve a lipoproteinů. V případě, že jsou přírodní estrogeny přiváděny do organismu žen tak, aby nedošlo k průchodu játry, například transdermálně, zůstávají jaterní funkce v podstatě nezměněné. Léčebně ekvivalentní dávky • · • * přírodních estrogenů při perorálním podání mají za následek zřejmou změnu jaterních parametrů. Jde o zvýšení SHBG, CBG, angiotensinogenu, HDL (lipoproteinu s vysokou hustotou). Tyto jaterní účinky estrogenů jsou zřetelně silnější v případě, že se místo přírodních lidských estrogenů použijí koňské estrogeny (Campbell, S. a další 1981). Ethinylestradiol a DES mají na jaterní tkáň ještě vyšší estrogenní účinek.

Pokud jde o antigonadotropní vlastnosti, má EE přibližně 4 až 18krát vyšší estrogenní účinek v játrech při perorálním podání než přírodní estrogeny (Campbell S. a další 1981). V tomto případě jde o velmi nepříznivou vlastnost uvedené látky.

Tyto nedostatky používaných látek mají podstatný klinický význam při jakémkoliv použití přírodních i syntetických estrogenů.

Známou komplikací, k níž může dojít při použití vysokých dávek estrogenů u mužů s karcinomem prostaty, je smrtelná thromboembolická příhoda. Potenciál EE vyvolávat vedlejší účinky v játrech určuje také, i když v menším měřítku strategii perorální hormonální antikoncepce. Na jedné straně je totiž nutno dosáhnout požadovaného antikoncepčního účinku a udržení menstruace, na druhé straně je nutno brát v úvahu podstatné vedlejší účinky a je tedy obtížné řídit koncentraci EE v krevním séru tak, aby bylo dosaženo obou cílů. Řada žen nemůže používat perorální antikoncepci vzhledem k tomu, že u nich dochází k abnormálnímu mentrualnímu krvácení nebo k jiným vedlejším účinkům, vyvolaným estrogeny.

• ·

Na základě výzkumu je pravděpodobné, že estrogeny jsou hlavními mitogeny, které se účastní podpory růstu nádorových tkání v lidských tkáních, závislých na působení hormonů, jako jsou mléčná žláza a endometrium. Přestože koncentrace estrogenů v krevní plazmě jsou podobné v případě zhoubného nádoru mléčné žlázy i v případě, že se tento nádor nevyskytuje, koncentrace estronu a estradiolu v případě nádorů mléčné žlázy jsou podstatně vyšší než v případě normální mléčné žlázy. Důležitým faktorem pro vysoké koncentrace estrogenů v nádorové tkáni je patrně syntéza estrogenů přímo v těchto tkáních a z tohoto důvodu by mělo být vhodné použít pro léčení těchto nádorů, závislých na hormonech, inhibitory a zvláště specifické inhibitory biosyntézy estrogenů.

V posledních dvou desetiletích byly vyvíjeny značné snahy syntetizovat inhibitory metabolismu aromatázy, jde o enzym, který mění androgenní prekursor androstendion na estron. Neexistuje však žádný důkaz, že metabolismus estronsulfatázy (El-STS), to znamená hydrolýza estronsulfátu na estron (EIS na El) je ve srovnání s metabolismem aromatázy hlavním zdrojem estrogenů v případě nádorů mléčné žlázy. Tato teorie je podporována mírným snížením koncentrace estrogenů v plazmě u žen po přechodu s nádory mléčné žlázy, léčenými inhibitory aromatázy, například aminoglutethimidem a

4-hydroxyandrostendionem a také skutečností, že koncentrace EIS v plasmě u těchto nemocných, léčených inhibitorem aromatázy, zůstává poměrně vysoká. Tuto teorii také podporuje dlouhý poločas EIS v krvi (10 až 12 hodin) ve srovnání s nekonjugovanými estrogeny (20 minut) a vysoká koncentrace steroidní sulfatázy v játrech a v normální i zhoubné tkáni mléční žlázy.

• · · ·

V PCT/GB92/01587 se uvádějí nové inhibitory steroidní sulfatázy a farmaceutické prostředky, které tyto látky obsahují a jsou určeny k léčení nádorů, závislých na estronu, zejména zhoubných nádorů mléčné žlázy. Tyto inhibitory steroidní sulfatázy jsou sulfamátové estery, například N, N-dimethylestron-3-sulfamát a s výhodou estron-3-sulfamát, který se také označuje jako Emate. Další sulfamátové estery jsou popsány v mezinárodních přihláškách WO 96/05216 a WO 96/05217. Tyto sulfamátové estery zahrnují estradiol-3-sulfamát, který bude dále uváděn jako J995.

Emate, to znamená estron-3-O-sulfamát je možno vyjádřit následujícím strukturním vzorcem:

Je známo, že Emate je účinným inhibitorem El-STS a vyvolává více než 99% inhibici účinnosti této látky na neporušených buňkách MCF-7 při koncentraci 0,1 mM. Emate také vyvolává inhibici enzymu El-STS v závislosti na čase a koncentraci, což prokazuje, že působí jako inaktivační látka přímo v místě účinku. Přestože Emate byl původně zkonstruován pro inhibici El-STS, bylo prokázáno, že rovněž vyvolává inhibici dehydroepiandrosteronsulfatázy,

DHA-STS, jde o enzym, který patrně hraje základní úlohu při řízení biosyntézy estrogenního steroidu androstendiolu. Také v tomto případě se nyní zdá pravděpodobné, že by androstendiol mohl mít větší důležitost při vyvolávání nádorového růstu v mléčné žláze. Emate je také účinný in vivo jako téměř úplný inhibitor El-STS v krysích játrech, kde inhibice dosahuje 99 % a jako téměř úplný inhibitor DHA-STS (99 %) při perorálním i při podkožním podání. Mimo to bylo prokázáno, že Emate u krys zlepšuje paměť. Studie u myší podporují názor, že existuje spojení mezi účinností DHA-STS a řízením odpovědi imunitního systému. Je pravděpodobné, že by k tomu mohlo docházet i u člověka. Přemosťující kyslíkový atom sulfamátové skupiny v Emate je důležitý pro inhibiční účinnost. To znamená, že v případě, že se tento atom kyslíku nahradí jiným heteroatomem, jako tomu je v případě estron-3-N-sulfamátu nebo estron-3-S-sulfamátu, jsou takové analogy méně účinné a mají menší závislost na čase.

Přestože optimálního účinku pro inhibici El-STS je možno dosáhnout pomocí Emate, je možné, že estron může být uvolněn inhibici sulfatázy a že Emate a jeho analog estradiol mohou mít estrogenní účinnost.

V publikaci Ahmed a další, Biochem Biophys Res Commun 1999 Jan 27, 254(3), 811-5 se uvádějí vztahy mezi strukturou a účinností steroidních a nesteroidních inhibitorů STS.

Vynález si klade za úkol navrhnout nové prostředky, vhodné pro perorální antikoncepci, substituční hormonální léčbu, inhibici El-STS a pro další léčebné použití.

Podstata vynálezu

Vynález je založen na překvapujícím zjištění, že cyklické sloučeniny, které obsahují kruhový systém a sulfamátovou skupinu, mohou být použity v množství nejvýš 200 μς/den pro dosažení perorální antikoncepce, substituční hormonální therapie a/nebo inhibice El-STS.

V uváděné dávce mají uvedené látky příznivější poměr mezi požadovanými účinky a nežádoucími účinky.

Sulfamátové sloučeniny obsahují alespoň jednu kruhovou složku. Tato kruhová složka obsahuje v kruhu alespoň 4 atomy. V typických případech budou tyto čtyři atomy uhlíkové atomy. V typických případech tedy bude kruhovou složkou skupina, odvozená od uhlovodíku.

Cyklická sloučenina také obsahuje sulfamátovou skupinu jako další substituent nebo substituenty na kruhovém systému. Sulfamátová skupina je tedy substituentem na kruhové složce.

Podstatu vynálezu tedy tvoří farmaceutický prostředek, který obsahuje i) sloučeninu obecného vzorce I

X (I) • · · · kde

X znamená kruh, odvozený od uhlovodíku a obsahující alespoň 4 atomy v kruhu,

K znamená skupinu, odvozenou od uhlovodíku a

R_s znamená sulfamátovou skupinu, ii) popřípadě ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem, pomocnou látkou, ředidlem nebo jiným pomocným prostředkem, přičemž sloučenina je přítomna v množství, v němž je možno dosáhnout dávky nejvýš 200 pg/den.

Podle dalšího možného provedení vynálezu tvoří podstatu vynálezu farmaceutický prostředek, obsahující svrchu uvedenou sloučeninu, která je přítomna v takovém množství, že při podání prostředku je možno dosáhnout koncentraci účinné látky nebo jejího metabolitu v krevní plasmě tak, že celková denní dávka účinné látky je nejvýš 200 pg/den.

Svrchu uvedená maximální dávka a všechny další uváděné dávky v průběhu přihlášky jsou vztahovány na jednotlivce s hmotností 70 kg, pokud není výslovně uvedeno jinak. Je zřejmé, že každý odborník snadno upraví uváděné dávky pro jednotlivce, jehož hmotnost je odlišná.

Denní dávka se vypočítá tak, že se celková dávka, která má být podána dělí předpokládaným počtem dnů. Tento předpokládaný počet dnů bude odpovídat počtu dnů do následujícího podání, po tuto dobu má mít podaná dávka trvalý účinek.

00 0» *9

9 9 9 9 9 9

09 9 9909

99 « 0 9 9

9 9 ••00 09 ·9 •· 9000

Podle jednoho z možných provedení vynálezu se vynález týká farmaceutického prostředku pro použití v lékařství.

Podle dalšího z možných provedení se vynález týká použití svrchu uvedeného prostředku podle vynálezu pro výrobu léčiva pro perorální antikoncepci.

Podle dalšího z možných provedení se vynález týká použití svrchu uvedeného prostředku podle vynálezu pro výrobu léčiva pro substituční hormonální léčbu.

Podle dalšího z možných provedení se vynález týká použití svrchu uvedeného prostředku podle vynálezu pro výrobu léčiva pro léčení stavů nebo choroby, spojené s účinností STS.

Podle dalšího z možných provedení se vynález týká použití svrchu uvedeného prostředku podle vynálezu pro výrobu léčiva pro léčení stavů nebo onemocnění, spojených s nevhodnou koncentrací STS.

Podle dalšího provedení vynálezu je možno získané léčivo použít k léčení jednotlivců při celkové denní dávce nejvýš 200 μς.

Vynález bude nyní podrobněji popsán v souvislosti s jednotlivými provedeními, která budou dále podrobněji probrána.

Sloučenina, přítomná ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu se podle výhodného provedení podává v dávce 10 až 200 μς/Μβη.

9« ·· φ 9 9

99

99 ► · ·

Β 9 9 9 9 • Φ 99 • 9 9 9 • · ·

9999 99 ·· ·· ·· 9999

Sloučenina, přítomná ve farmaceutickém prostředku se podle dalšího výhodného provedení může podávat v dávce 50 až 200 ^ig/den.

Sloučenina, přítomná ve farmaceutickém prostředku se podle dalšího výhodného provedení může podávat v dávce 20 až 50 μς/den.

Podle dalšího výhodného provedení je sloučenina přítomná ve farmaceutickém prostředku v množství, které zaručuje denní dávku nejvýš 100 μς/Μεη.

Farmaceutický prostředek může být zpracován takovým způsobem, že jeho podání jednou denně, jednou za týden nebo jednou za měsíc zajistí požadovanou denní dávku. Farmaceutický prostředek podle vynálezu může například obsahovat sulfonátovou sloučeninu v množství nejvýš 20 μρ/dávka při denním podání, v množství nejvýš

1,4 mg/dávka lx za týden a v množství nejvýš 5 mg/dávka při podání lx za měsíc. Je zřejmé, že farmaceutický prostředek může být také zpracován pro podání v jiných intervalech než lx za den, za týden nebo za měsíc.

Ve sloučenině obecného vzorce I symbol X v kombinaci se symbolem K s výhodou napodobuje steroidní strukturu.

Podle jednoho z výhodných provedení je K cyklická skupina.

Podle dalšího výhodného provedení X znamená 6-členný kruh.

9 9 9 · 9 •♦·9 99 *·

Podle dalšího výhodného provedení obsahuje kruh ve významu X 6 atomů uhlíku v kruhu.

Sloučeninu obecného vzorce I je s výhodou možno vyjádřit obecným vzorcem II, v němž jednotlivé obecné symboly mají svrchu uvedený význam.

Skupina ve významu K a kruh X budou společně obsahovat včetně všech substituentů nejvýš přibližně 50 atomů uhlíku, obvykle nejvýš 30 až 40 atomů uhlíku.

Ve výhodném provedení tvoří skupina X v kombinaci se skupinou K steroidní kruhovou strukturu.

Podle dalšího výhodného provedení vytváří skupina K a skupina X steroidní kruhovou strukturu nebo její substituovaný derivát.

V dalším výhodném provedení je skupina R_s vázána v poloze 3 kruhu X.

Podle ještě dalšího výhodného provedení znamená R_s sulfamátovou skupinu.

Podle dalšího výhodného provedení obsahuje farmaceutický prostředek jako účinnou složku sloučeninu obecného vzorce III

9··

9· 99 > 9 9 9 » 9 9 kde

X, K a R_s mají svrchu uvedený význam,

Rhl je případná halogenová skupina,

Rh2 je případná halogenová skupina a je přítomna alespoň jedna ze skupin Rhl a Rh2.

Podle jednoho z výhodných provedení je skupina Rhl vázána v poloze 2 kruhu X.

Podle dalšího z výhodných provedení je skupina Rh2 vázána v poloze 4 kruhu X.

Pro některá použití nemají uvedené látky s výhodou žádný nebo mají pouze minimální estrogenní účinek.

Pro některá další použití svrchu uvedené látky s výhodou mají estrogenní účinek.

Podle jednoho z výhodných provedení je možno farmaceutický prostředek podle vynálezu použít pro léčení zhoubných nádorů mléčné žlázy.

Klíčovými výhodami farmaceutického prostředku podle vynálezu jsou zlepšená farmakokinetika a zlepšená farmakodynamika.

999 9999

9999 9 · »

9 9 99

99 9999 999

9999 99 99 *· ·» 9999

Klíčovou výhodou farmaceutického prostředku podle vynálezu je skutečnost, že v použité dávce mají sulfamátové sloučeniny jen velmi malý vliv na metabolismus v játrech. Je pravděpodobné, že sloučeniny podle vynálezu, jako Emate a J995 mají vysokou afinitu pro červené krvinky a že až 99 % sloučeniny v krevním oběhu je na tyto krvinky vázána. Průchod těchto sloučenin v játrech tímto způsobem pak znemožňuje metabolismus při prvním průchodu těchto látek játry. To znamená, že sulfamátové sloučeniny uvedeného typu mají po podání vysokou biologickou dostupnost.

Další klíčovou výhodou farmaceutického prostředku podle vynálezu je skutečnost, že uvedené sulfamátové sloučeniny mají po podání velmi malé variace v koncentraci těchto látek v krevní plazmě u různých jednotlivců. Toto snížení variability mezi koncentrací estrogenů u různých jednotlivců dovoluje použít stejný farmaceutický prostředek u žen po hysterektomii i u žen se zachovanou dělohou a není tedy zapotřebí vyvíjet odlišné farmaceutické prostředky.

Další klíčovou výhodou farmaceutického prostředku podle vynálezu je skutečnost, že se svrchu popsané sulfamátové sloučeniny jen pomalu vylučují. Z tohoto důvodu je možno při podávání farmaceutického prostředku podle vynálezu zajistit stálé hladiny estronu El a estradiolu E2 v krevní plazmě.

Jednou z klíčových výhod farmaceutického prostředku podle vynálezu je také skutečnost, že podaná dávka sulfamátových sloučenin má nízkou hormonální účinnost. Z

9 • 9 9 999 • · 9 9 9 9

9999 99 99 99

9 9

9999 tohoto důvodu dochází ke snížení rizika vzniku hluboké žilní trombózy.

Jednou z dalších klíčových výhod farmaceutického prostředku podle vynálezu je skutečnost, že při podávaných dávkách je možno dosáhnout ochrany kostní tkáně, přičemž podaná dávka stále ještě zůstává pod prahovou dávkou, při níž dochází ke stimulaci endometria a jeho proliferaci. Jak již bylo svrchu popsáno, estrogeny jsou nezbytné pro zachování struktury kostní tkáně u žen. Nepřítomnost estrogenů může mít za následek destrukci kostní tkáně a vznik osteoporózy. Avšak při typické substituční hormonální therapii se Estron podává v dávkách, při nichž kromě příznivých účinků dochází také k proliferaci endometria. Při podávání farmaceutického prostředku podle vynálezu je možno zajistit substituční hormonální léčbu k ochraně kostní tkáně bez stimulace endometria.

Součást podstaty vynálezu tvoří také použití svrchu uvedených látek, s výhodou ve formě farmaceutického prostředku, tak jak byl svrchu popsán, pro výrobu léčiva pro ochranu kostní tkáně, aniž by přitom došlo ke stimulaci endometria.

Další výhodou farmaceutického prostředku podle vynálezu je skutečnost, že prostředek nemusí obsahovat progestiny.

Další výhodou farmaceutického prostředku podle vynálezu je skutečnost, že prostředek nemusí obsahovat gestageny.

• · • 00

0 99 · 9 9 9 ·· 0 0 0 · · • ·· 0 9 9 9 000 •000 99 00 0· 0« 0000

Další výhodou farmaceutického prostředku podle vynálezu je skutečnost, že některé z použitých sloučenin nemohou být metabolizovány na látky, které mají nebo které indukují hormonální účinek.

Některé ze svrchu popsaných látek podle vynálezu jsou výhodné také z toho důvodu, že jsou účinné při perorálním podání.

Některé ze sloučenin podle vynálezu mohou být použity pro léčení zhoubných nádorů, například zhoubných nádorů mléčné žlázy a také pro léčení jiných chorobných stavů, například při prevenci autoimunitních onemocnění, zvláště v případě, že je nezbytné farmaceutické prostředky podávat u malých dětí.

Některé ze svrchu uvedených sloučenin podle vynálezu mohou tedy mít i jiné léčebné použití, než je léčení zhoubných nádorů, závislých na hormonech a je tedy možno je použít například při léčení autoimunitních onemocnění.

Substituční hormonální therapie

Sloučeniny podle vynálezu ve formě farmaceutického prostředku je možno použít k substituční hormonální therapii. Farmaceutický prostředek bude v tomto případě obsahovat sulfamátovou sloučeninu v takovém množství, které zajistí při předepsané frekvenci podávání požadovanou denní dávku sulfamátové sloučeniny.

V jednom z možných provedení vynálezu bude farmaceutický prostředek zpracován pro denní podávání. Takový prostředek může být také zpracován tak, že *· ·· ** • · · · · · · • ·» * · ·♦* • · « · · » ···· ·· ·· ·♦

9 ·

9 9 ·· 9

999 9 obsahuje sulfamátovou sloučeninu v kombinaci s progestiny.

Ve všech provedeních vynálezu včetně každodenního perorálního podání je možno zajistit substituční hormonální therapii daleko pohodlnějším způsobem než při použití transdermální náplasti, která je v těchto případech typickým způsobem podání.

Denní podání

V případě, že je farmaceutický prostředek určen pro denní podání, například při podání dávky 100 μς denně, je obvykle možno zajistit následující klíčové výhody:

• snížení variability koncentrace estrogenů v krevní plazmě u různých jednotlivců, • stálé koncentrace El a E2 v krevní plazmě.

V případě, že je farmaceutický prostředek určen pro denní podání dávky 20 až 50 pg/den, je možno zajistit následující výhody:

• není možno pozorovat krvácení z dělohy • není možno pozorovat žádný účinek na mléčnou žlázu.

Týdenní podání

Podle jednoho z možných provedení je možno farmaceutický prostředek podle vynálezu zpracovat pro podání jednou týdně. Je možno zajistit dávku 0,5 až 2 mg/týden, například 1 mg/týden.

ze je možno náplasti i v

Μ© ί© «4 *4 «4 4· • 444 444 »44© • 44 44 444 4 4 4 ΐ8 .· : :

•«44 ©4

Týdenní dávka může být výhodná proto, zajistit pohodlnější podání než v případě případě denního podání prostředku.

Měsíční podání

Farmaceutický prostředek podle vynálezu je možno zpracovat také pro substituční hormonální léčbu s podáním jednou za měsíc při dávce 2 až 4 mg nebo až 5 mg v jednotlivé dávce.

Mimo to je možno farmaceutický prostředek s obsahem sloučenin podle vynálezu použít k léčení endometriózy a k léčení nádorů, závislých na estrogenech. V těchto případech je jednou z klíčových výhod prostředku podle vynálezu skutečnost, že sulfamátové sloučeniny podle vynálezu mohou působit jako inhibitory steroidní sulfatázy.

Steroidní sulfatázy

Steroidní sulfatázy, která je někdy označována také jako sterylsulfatáza nebo zkrácené STS hydrolyzuje řadu sulfatovaných steroidů, jako estronsulfát, dehydroepiandrosteronsulfát a cholesterolsulfát. STS je označeno číslem EC 3.1.6.2.

STS byla klonována a bylo dosaženo její exprese, která je popsána například v publikacích Stein a další,

J. Biol. Chem. 264, 13865-13872, 1989 a Yen a další, Cell 49: 443-454, 1987.

·· • 9 » ·** *

• 9

9· «·'♦ • · 9 • 9 99 9 ·* ··

9 · 9 • « · 999· 99

9 9

9· 99

9 9

9 >

• 99

9999

STS je enzym, u nějž se předpokládá působení při celé řadě chorobných stavů.

Bylo například prokázáno, že při úplné nepřítomnosti STS může vzniknout ichtyósa. Podle některých vědeckých pracovníků k tomuto stavu dochází převážně v Japonsku. Titíž vědečtí pracovníci v publikaci Sakura a další, J. Inherit Metab. Dis. 1997, Nov. 20(6), 807-10 také uvádějí, že některé alergické choroby, například bronchiální asthma, alergická rýma nebo atopická dermatitis mohou být spojeny s nedostatkem steroidní sulfatázy.

Kromě chorobných stavů, které jsou vyvolány úplným nedostatkem STS může docházet k chorobným stavům také pri zvýšené koncentraci STS. Jako příklad je možno uvést, že úloha STS je velmi pravděpodobná při zhoubných nádorech mléčné žlázy a jejich metastázách.

Úloha STS se předpokládá také u jiných chorobných stavů. Jako příklad je možno uvést publikaci Le Roy a další, Beha Genet 1999 Mar. 29(2), 131-6, v níž autoři uvádějí, že pravděpodobně existuje genetická korelace mezi koncentrací steroidní sulfatázy a útočným chováním u myši. Autoři docházejí k závěru, že sulfatace steroidních látek může zasahovat komplexní metabolismus včetně genů a může ovlivňovat agresi pomocí vzniku mutací.

Inhibice STS

Je pravděpodobné, že některé chorobné stavy, spojené s účinností STS, jsou vyvolány přeměnou neúčinného sulfatovaného estronu na účinný, nesulfatovaný estron. V

• · ·· ·0·0 případě chorobných stavů, spojených s účinností STS by tedy bylo žádoucí dosáhnout inhibice účinnosti STS.

Pod pojmem „inhibice se v tomto případě rozumí snížení a/nebo potlačení a/nebo maskování a/nebo prevence účinku STS.

Inhibitor STS

Podle dalšího provedení vynálezu může sloučenina podle vynálezu působit jako inhibitor STS.

Pod pojmem „inhibitor ve spojení se sloučeninou podle vynálezu se rozumí sloučenina, která vyvolává inhibici účinnosti STS, například snižuje a/nebo potlačuje a/nebo maskuje a/nebo vyvolává prevenci účinku STS. Inhibitor STS může také působit jako antagonista.

Schopnost sloučenin vyvolávat inhibici účinnosti estronsulfatázy, je možno stanovit při použití neporušených buněk karcinomu mléčné žlázy MCF-7 nebo při použití mikrosomů z placenty. Mimo to je možno použít živočišný model. Podrobnosti, týkající se jednotlivých postupů, budou dále uvedeny. Je nutno uvést, že ke stanovení účinnosti STS je možno použít i jiné postupy, což platí i o stanovení inhibice STS. V tomto případě je také možno odkázat na mezinárodní patentovou přihlášku WO-A-99/50453.

Pro některá použití se uvedené látky s výhodou dále charakterizují také další svojí vlastnostnostί. V případě, že se sulfamátová skupina nahradí sulfátovou skupinou za vzniku sulfátového derivátu, měl by být sulfátový derivát hydrolyzovatelný enzymem s účinností steroidní sulfatázy (E.C. 3.1.6.2.), to znamená, že by mělo dojít k jeho hydrolýze při inkubaci s uvedenou steroidní sulfatázou při pH 7,4 a teplotě 37 °C.

Podle jednoho z výhodných provedení v případě, že by sulfamátová skupina v uvedených sloučeninách byla nahrazena sulfátovou skupinou za vzniku sulfátové sloučeniny, pak by tato sulfátová sloučenina měla být hydrolyzovatelná enzymem steroidní sulfatázou E.C. 3.1.6.2. a její hodnota Km by měla být nižší než 200, s výhodou nižší než 150, zvláště nižší než 100, zvláště výhodně nižší než 75 a nejvýhodněji nižší než 50 mM v případě inkubace s uvedenou steroidní sulfatázou při pH

7,4 a teplotě 37 °C.

Pro některá použití má sloučenina podle vynálezu s výhodou alespoň lOOnásobnou selektivnost pro cílový enzym, například STS, s výhodou alespoň 150násobnou selektivnost, zvláště alespoň 200násobnou selektivnost pro cílovou látku, zvláště výhodně alespoň 250násobnou selektivnost a nejvýhodněji alespoň 350násobnou selektivnost pro cílovou látku.

Je nutno uvést, že kromě schopnosti vyvolávat inhibici účinnosti STS mohou mít sloučeniny podle vynálezu ještě další příznivé vlastnosti.

Skupina K

Skupina K nemusí mít cyklickou strukturu. Je nutno uvést, že skupina K může mít také lineární strukturu, • · · · · · ···· • · · · · · · · · · ·

která může mít schopnost vytvořit kruhu podobnou strukturu in vivo.

Ve výhodném provedení je však skupina K cyklická a jde tedy o cyklickou skupinu K.

Cyklická skupina K nemusí být nezbytně kondenzována s kruhem X. Může být také oddělena vhodnou skupinou, může jít například o skupinu, odvozenou od uhlovodíku.

Ve výhodném provedení vynálezu však je cyklická skupina K kondenzována s kruhem X.

Skupina K může být také polycyklická skupina, nemusí však jít o kondenzovanou polycyklickou skupinu.

Ve výhodném provedení tedy tvoří skupina K a kruh X polycyklickou sloučeninu. Jak již bylo svrchu uvedeno pod pojemem „polycyklický jsou zahrnuty kondenzované a nekondenzované kruhové struktury včetně kombinací těchto struktur.

Alespoň jedna z cyklických skupin K a X může být heterocyklická skupina nebo neheterocyklická skupina.

Alespoň jedna z cyklických skupin K a X může být nasycená kruhová struktura nebo nenasycená kruhová struktura, například arylová skupina.

S výhodou je alespoň jedna z uvedených cyklických skupin arylový kruh.

V případě, že cyklická skupina je polycyklická, mohou být některé nebo všechny kruhové složky uvedené sloučeniny spolu kondenzovány nebo mohou být spojeny jednou nebo větším počtem skupin, které oddělují kruhy od sebe.

Polycyklická sloučenina může obsahovat celou řadu kondenzovaných kruhů. Kondenzované kruhy mohou být tvořeny jakoukoliv kombinací kruhů různé velikosti, může jít například o tři 6-členné kruhy, o 6-členný kruh, o 7-členný kruh a o 6-členný kruh nebo o 6-členný kruh a dva 8-členné kruhy a podobně.

Podle jednoho provedení vynálezu se vynález týká sloučenin, v nichž polycyklické sloučeniny jsou odlišné od látek, které obsahují dva 6-členné a jeden 7-členný kruh (6,6,7) . Podle dalšího možného provedení se vynález týká sloučenin, v nichž polycyklická sloučenina obsahuje pouze kruhy, odlišné od 7-členných kruhů.

Polycyklická sloučenina bude včetně všech substituentů obsahovat nejvýš přibližně 50 atomů uhlíku, obvykle nejvýš 30 až 40 atomů uhlíku.

Polycyklická sloučenina může obsahovat nejméně dvě kruhové složky nebo nejméně tři kruhové složky nebo nejméně čtyři kruhové složky.

S výhodou obsahuje polycyklická sloučenina čtyři kruhové složky.

• · · ·

Výhodnými polycyklickými sloučeninami jsou sloučeniny s steroidní strukturou jako částí sloučeniny nebo jejich bioisostery.

Skupina, odvozená od uhlovodíkové skupiny

Pod pojmem „skupina, odvozená od uhlovodíkové skupiny” se rozumí skupina, která obsahuje alespoň atomy uhlíku a atomy vodíku a může popřípadě obsahovat jeden nebo větší počet vhodných substituentů. Jako příklady takových substituentů lze uvést atomy halogenu, alkoxyskupiny, nitroskupiny, alkylové skupiny, cyklické skupiny a podobně. Substituentem může být také cyklická skupina nebo může cyklickou skupinu vytvářet kombinace substituentů. V případě, že skupina, odvozená od uhlovodíkové skupiny, obsahuje více než 1 atom uhlíku, pak nejsou tyto atomy uhlíku nezbytně na sebe vázány. Například mohou být alespoň dva uhlíkové atomy spolu spojeny přes vhodný prvek nebo skupinu. To znamená, že skupina, odvozená od uhlovodíkové skupiny, může obsahovat heteroatomy. Vhodné heteroatomy zvolí každý odborník a je například možno zahrnout atomy síry, dusíku a kyslíku. Jako neomezující příklad skupiny, odvozené od uhlovodíkové skupiny, je možno uvést acylovou skupinu.

Typickou skupinou, odvozenou od uhlovodíkové skupiny je zbytek uhlovodíku. Pod tímto pojmem se rozumí alkylová skupina, alkenylová skupina, alkinylová skupina, přičemž všechny tyto skupiny mohou mít přímý, rozvětvený nebo cyklický řetězec, může také jít o arylovou skupinu, všechny tyto skupiny mohou být popřípadě substituovány. V případě, že zbytek uhlovodíku má rozvětvený řetězec a je substituován, pak se substituenty mohou nacházet na hlavním řetězci nebo na vedlejších řetězcích. Mohou se také nacházet jak na hlavním řetězci, tak na vedlejších řetězcích.

Sulfamátová skupina

Podle jednoho z provedení vynálezu má kruh X jako substituent sulfamátovou skupinu. Pod pojmem „sulfamát se rozumí ester sulfamové kyseliny nebo ester

N-substituovaného derivátu sulfamové kyseliny nebo sůl těchto látek.

V případě, že R_s znamená sulfamátovou skupinu, pak je možno označit sloučeninu podle vynálezu jako sulfamátovou sloučeninu.

V typických případech je možno sulfamátovou skupinu vyjádřit obecným vzorcem (Rl)(R2)N-S(0)(0)-0kde Rl a R2 se s výhodou nezávisle volí ze skupiny atom vodíku, alkyl, cykloalkyl, alkenyl a aryl nebo kombinace těchto zbytků nebo společně tvoří alkylenovou skupinu, přičemž alkylová, cykloalkylová nebo alkenylová skupina nebo každá taková skupina popřípadě obsahují jeden nebo větší počet heteroatomů nebo heteroskupin.

V případě substituce mohou N-substituované sloučeniny podle vynálezu obsahovat jeden nebo dva substituenty ze skupiny N-alkyl, N-alkenyl, N-cykloalkyl nebo N-aryl, s výhodou obsahují tyto skupiny nejvýš 10 atomů uhlíku. V případě, že Rl a/nebo R2 znamená alkyl, • · • φφ

ΦΦΦ· ·· ·· ·· Φ· φφφφ volí se ve výhodném provedení Rl a R2 nezávisle z alkylových skupin, obsahujících 1 až 6 atomů uhlíku, jako jsou methyl, ethyl, propyl a podobně. Oba substituenty Rl a R2 mohou znamenat methylové skupiny. V případě, že Rl a/nebo R2 znamená aryl, jsou typickými skupinami v tomto významu fenyl a tolyl, s výhodou o-tolyl. V případě, že Rl a R2 znamenají cykloalkylové skupiny, jsou typickými skupinami v tomto významu cyklopropyl, cyklopentyl, cyklohexyl a podobně. V případě spojení Rl a R2 typicky tvoří tyto substituenty alkylenovou skupinu s řetězcem o 4 až 6 atomech uhlíku, popřípadě přerušeným jedním nebo větším počtem heteroatomů nebo heteroskupin, takže vzniká například 5-členná heterocyklická skupina, jako morfolinová, pyrrolidinová nebo piperidinová skupina.

Mezi skupiny, substituované alkylovou, cykloalkylovou, alkenylovou a arylovou skupinou jsou zahrnuty ty skupiny, které jsou substituovány jednou nebo větším počtem takových skupin, které neinterferuji s účinností této sloučeniny jako inhibitoru sulfatázy. Jako příklad neinterferujících substituentů je možno uvést hydroxyskupinu, aminoskupinu, atom halogenu, alkoxyskupinu a také alkylové a arylové skupiny.

V některých provedeních vynálezu může sulfamátová skupina vytvářet kruhovou strukturu, kondenzovanou nebo spojenou s jedním nebo větším počtem atomů ve skupině nebo na skupině X.

V některých provedeních může sloučenina podle vynálezu obsahovat více než jedenu sulfamátovou skupinu. Jako příklad je možno uvést sloučeninu s obsahem dvou sulfamátových skupin, to znamená, bis-sulfamátové • »9 9 · · 9

999 9 99

9999 99 9« sloučeniny. V případě, že základem těchto látek je steroidní jádro, je s výhodou druhá ze sulfamátových skupin nebo alespoň jedna z přídatných sulfamátových skupin umístěná v poloze 17 steroidní struktury. Sulfamátové skupiny přitom nemusí být totožné.

V některých výhodných provedeních znamená alespoň jeden ze symbolů R1 a R2 atom vodíku.

Podle dalšího výhodného provedení znamenají oba symboly R1 a R2 atomy vodíku.

V jednom z možných provedení může sloučenina s obsahem skupiny X a K napodobovat steroidní kruhovou strukturu.

Pod pojmem „napodobovat se v průběhu přihlášky rozumí tvorba podobné nebo odlišné struktury s podobným funkčním účinkem. Jinak uvedeno, mohou skupiny X a K vytvářet bioisostery steroidních kruhů nebo jejich účinné části.

Podle jednoho z výhodných provedení mohou skupina K a kruh X společně tvořit bioisoster estronového kruhu nebo jeho část.

Steroidní kruhová struktura

Podle jednoho z výhodných provedení vynálezu tvoří skupiny X a K steroidní kruhovou strukturu, to znamená cyklopentanofenanthrenovou kostru nebo její bioisostery.

• 4

444

Jak je z oboru známo, klasickou steroidní kruhovou strukturu je možno vyjádřit vzorcem

Ve svrchu uvedeném vzorci jsou jednotlivé kruhy označeny obvyklým způsobem.

Příkladem bioisosterů může být sloučenina, v níž je jakýkoliv kruh nebo větší počet kruhů A, B, C a D heterocyklický kruh a/nebo v níž je jakýkoliv kruh nebo větší počet kruhů A, B, C a D substituován a/nebo v níž je jeden nebo větší počet kruhů A, B, C a D modifikován, přičemž bioisoster v nepřítomnosti sulfamátové skupiny má steroidní vlastnosti.

Strukturu výhodného polycyklického útvaru je možno vyjádřit vzorcem • ♦ ··

9 <

kde každý z kruhů A', B' , C' a D' nezávisle znamená heterocyklický kruh nebo neheterocyklický kruh, přičemž tyto kruhy mohou být nezávisle substituované nebo nesubstituované a nasycené nebo nenasycené.

Jako příklad je možno uvést, že jeden nebo větší počet kruhů A', B', C' a D' může být nezávisle substituován vhodnými skupinami, jako jsou alkylové skupiny, arylové skupiny, hydroxyskupiny, atomy halogenu, zbytky uhlovodíku nebo oxyskupiny, odvozené od uhlovodíků a podobně.

Jako příklad kruhu D' je možno uvést 5-členný nebo 6-členný neheterocyklický kruh, který nese alespoň jeden substituent.

V jednom z výhodných provedení nese kruh D' jako substituent ethinylovou skupinu.

V případě, že kterýkoliv z kruhů A', B', C' a D' je heterocyklický kruh, pak tento heterocyklický kruh s výhodou obsahuje kombinaci uhlíkových atomů a alespoň jednoho atomu dusíku a/nebo alespoň jednoho atomu kyslíku. Mimo to mohou být kruhu ještě přítomny jiné heterocyklické atomy.

Jako příklad vhodného steroidního útvaru A'-D' je možno uvést kruhy A-D dehydroepiandrosteronů a estrogenů včetně estronu. Výhodné estrogeny zahrnují přírodní estrogeny, jako je estron, estradiol, estratriol a epiestriol a také konjugované estrogeny, obvykle deriváty equileninu.

• · • «

Podle jednoho z možných provedení vynálezu je výhodné, aby sloučenina podle vynálezu byla prekursorem přírodního estrogenu, s výhodou přírodního estrogenu ze skupiny estron, estradiol, estratriol a epiestriol.

Výhodnými steroidními kruhy Α'-D' sloučenin podle vynálezu zahrnují kruhy A-D následujících látek:

Estrony a substituované estrony:

estron

4-OH-estron

6a-0H-estron

7cc-OH-estron

16oc-OH-estron

Ιββ-OH-estron

17-deoxyestron estron

Estradioly a substituované estradioly:

4-OH-17p-estradiol

6cc-OH-17p-estradiol

7a-OH-17p-estradiol

4-OH-17a-estradiol

6a-OH-17a-estradiol

7a-OH-17a-estradiol

16a-OH-17a-estradiol

16cc-OH-17p-estradiol

16p-OH-17cc-estradiol

16p-OH-17p-estradiol

17cc-estradiol * 4

17p~estradiol

17a-ethinyl-17p-estradiol

17p-ethinyl-17a-estradiol

17-deoxyestradiol

Estrioly a substituované estrioly:

estriol

4-OH-estriol

6a-0H-estriol ct-OH -estriol

17-deoxyestriol

Dehydroepiandrosterony a substituované dehydroepiandrosterony:

dehydroepiandrosterony

6a-0H-dehydroepiandrosteron

7cc-OH-dehydroepiandrosteron

16a-OH-dehydroepiandrosteron

Ιββ-OH-dehydroepiandrosteron

Obecně může kruhový systém A'B'C'D' obsahovat celou řadu neinterferujících substituentů. Zvláště může tento kruhový systém obsahovat jednu nebo větší počet hydroxyskupin, alkylové skupiny, zvláště Cl-C6alkyl jako methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sek.butyl, terc.butyl, n-pentyl a další pentylové isomery a n-hexyl a další hexylové isomery, alkoxyskupiny, zvláště Cl-C6alkoxyskupiny jako methoxyskupinu, ethoxyskupinu, propoxyskupinu a podobně, dále alkinyl jako ethinyl nebo atom halogenu, například fluoru.

• ·

· · • ·*

Podle zvlaste výhodného provedeni je steroidni struktura kombinována s výhodnými substituenty podle vynálezu, takže se sloučeniny podle vynálezu volí ze skupiny sloučenin, ktere 3

17a ethinyl 17β estradiol-3-sul-f amát možno vyjádřit vzorci

Nesteroidní struktury

Podle dalšího možného provedení nemusí být sloučeniny podle vynálezu založeny na steroidním jádře nebo tuto strukturu nemusí obsahovat. V tomto případě může mít polycyklická sloučenina formu nesteroidního kruhového systému, jako je například diethylstilbestrol, stilbestrol, kumariny, flavonoidy, combrestatin a jiné kruhové systémy. Další vhodné nesteroidní sloučeniny pro použití podle vynálezu je možno nalézt v dokumentu US-A-5567831.

Η., ί

Další substituenty

Sloučeniny podle vynálezu mohou nést ještě jiné substituenty než svrchu uvedené skupiny Rhl, Rh2 a R_s. Jako příklad je možno uvést, že tyto další substituenty mohou být tvořeny jedním nebo větším počtem substituentů ze skupiny sulfamátové skupiny, fosfonátové skupiny, thiofosfonátové skupiny, sulfonátové skupiny, sulfonamidové skupiny, atomy halogenu, oxoskupiny, hydroxyskupiny, aminoskupiny, skupiny s obsahem síry nebo skupiny, odvozené od uhlovodíků, například oxyskupiny, odvozené od uhlovodíku.

Oxyskupiny, odvozené od uhlovodíku

Pod tímto pojmem se rozumí skupiny, které obsahují alespoň atomy uhlíku, vodíku a kyslíku a mohou popřípadě obsahovat jeden nebo větší počet vhodných substituentů. Jako příklady takových substituentů je možno uvést atomy halogenu, alkoxyskupiny, nitroskupiny a alkylové skupiny, cyklické skupiny a podobně. Mimo možnost, že substituentem je cyklická skupina může také dojít k tomu, že taková cyklická skupina vzniká kombinací substituentů. V případě, že oxyskupina, odvozená od uhlovodíku obsahuje více než 1 atom uhlovodíku, pak nemusí být tyto atomy uhlíku spolu spojeny. Například je možno spojit alespoň dva uhlíkové atomy přes vhodný prvek nebo skupinu. To znamená, že oxyskupina, odvozená od uhlovodíku může obsahovat heteroatomy. Vhodné heteroatomy budou odborníkům zřejmé, může jít například o atom síry nebo atom dusíku.

« fc •fc fcfc fcfcfcfc fcfcfcfc fc·· fcfcfcfc • fcfc · fcfcfcfc ·· · • fcfc · fc · · · · fc fcfcfcfc fcfc fcfc fcfc fcfc fcfcfcfc

Podle jednoho z možných provedení vynálezu je oxyskupinou, odvozenou od uhlovodíku skupina, odvozená od uhlovodíku, substituovaného oxyskupinou.

Pod tímto pojmem se rozumí alkoxyskupiny, oxyalkenylové skupiny nebo oxyalkinylové skupiny, které mohou být lineární, rozvětvené nebo cyklické, může však jít také o oxyarylové skupiny. Pojem zahrnuje také skupiny, které jsou popřípadě substituované. V případě, že jde o rozvětvenou strukturu, nesoucí substituenty, mohou se tyto substituenty nacházet na základním uhlovodíkovém řetězci nebo na jeho rozvětvené části nebo se mohou nacházet na obou částech řetězce.

V typických případech je takovou skupinu možno vyjádřit vzorcem C1-C6O, například C1-C3O.

Zkouška na stanovení účinnosti STS při použití karcinomových buněk (protokol 1)

Inhibice steroidní sulfatázy v buňkách MCF-7

Účinnost steroidní sulfatázy je možno měřit in vitro při použití neporušených buněk MCF-7, jde o buňky lidského karcinomu mléčné žlázy. Tyto buňky, závislé na hormonech jsou jako buněčná linie široce používány ke studiím, které se zabývají potlačováním buněčného růstu u lidských zhoubných nádorů mléčné žlázy. V těchto buňkách je možno prokázat vysokou koncentraci steroidní sulfatázy podle publikací Maclndoe a další, Endocrinology, 123, 1281-1287, 1988, Purohit and Reed, Int. J. Cancer, 50, 901-905, 1992, buňky jsou v USA běžně dostupné a je možno je získat od veřejné sbírky kultur American Type Culture «4 44 ·· 4« 4« 44

4 4 4 444 4 4 4 · • ·4 4 4444 4 4 * • 44 4444 444

444» Μ 44 44 44 ·44·

Collection (ATCC) a ve Velké Británii od veřejné sbírky The Imperiál Cancer Research Fund.

Buňky se pěstují v minimálním základním prostředí MEM (Flow Laboratories, Irvine, Skotsko), které obsahuje 20 mM Hepes, 5 % fetálního telecího séra, 2 mM glutaminu, neesenciální aminokyseliny a 0,075 % hydrogenuhličitanu sodného. Až 30 lahví pro tkáňové kultury s plochou pro pěstování 25 cm² je možno naočkovat při použití svrchu uvedeného prostředí množství 1 x 10⁵ buněk/lahev. Buňky se pak pěstují do vytvoření 80% souvislé vrstvy, přičemž prostředí se mění každý třetí den.

Neporušené jednobuněčné vrstvy buněk MCF-7 v trojnásobném opakování v lahvích pro tkáňové kultury s plochou 25 cm² se promyjí Earlovým vyváženým solným roztokem EBSS (ICN Flow, High Wycombe, Velká Británie) a buňky se inkubují 3 až 4 hodiny při teplotě 37 °C s 5 pmol (7 x 10⁵ dpm) [6,7-3H]estron-3-sulfátu se specifickou aktivitou 50 Ci/mmol (New England Nuclear, Boston, Mass., USA) ve 2,5 ml prostředí MEM bez séra spolu s 11 koncentracemi estron-3-sulfamátu: 0, 1 fM,

0,01 pM, 0,1 pM, 1 pM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 0,01 mM,

0,1 mM a 1 mM. Po inkubaci se každá láhev zchladí a vždy 1 ml prostředí se pipetou přenese do oddělených zkumavek, které obsahují [14C]estron (7 x 103 dpm) se specifickou aktivitou 97 Ci/mmol (Amersham International

Radiochemical Centre, Amersham, Velká Británie). Směs se důkladně protřepe 30 sekund s 5 ml toluenu. Pokusy prokázaly, že tímto způsobem se z vodné fáze odstraní více než 90 % [14C]estronu a méně než 0,1 % [3H]estron-3-sulfátu. Podíl 2 ml organické fáze se odstraní, odpaří a obsah 3H a 14C ve zbytku se stanoví pomocí scintilační • » • ·♦

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 9· 99 94 9999 spektrometrie. Množství hydrolyzované estron-3-sulfátu se vypočítá z počtu impulzů pro 3H s opravou na objem použitého prostředí a organické fáze a na zpětnou izolaci přidaného [14C]estronu a ze specifické aktivity substrátu. Každá skupina pokusu zahrnuje inkubaci mikrosomů, připravených z lidské placenty, pozitivní na sulfatázu (pozitivní kontrola) a inkubaci lahví bez buněk ke stanovení neenzymatické hydrolýzy substrátu. Počet buněčných jader v lahvi se stanoví počítacím zařízením Coulter Counter po zpracování jednobuněčných vrstev působením Zaponinu. Jedna láhev v každé skupině pokusů se použije ke zjištění stavu buněčné membrány a ke zjištění životnosti buněk při použití trypanové modři podle publikace Phillips H. J. (1973), Tissue culture and applications, eds. Kruše D. F. and Patterson, Μ. K., s. 406-408, Academie Press, New York.

Výsledky se vyjadřují jako účinnost steroidní sulfatázy v průměru ± střední chyba pro celý produkt (estron + estradion), vytvořený v průběhu doby inkubace 20 hodin, přepočítáno na 106 buněk. Stanoví se statistická významnost pro inkubační vzorky, které neobsahují estron-3-sulfamát. Pro vyhodnocení statistické významnosti výsledků byl použit nepárový Studentův t-test.

Zkouška na stanovení účinnosti STS při použití mikrosomů z placenty (protokol 2)

Inhibice steroidní sulfatázy v mikrosomech z placenty

Lidská placenta z porodu v normálním termínu, pozitivní na sulfatázu, se rozdrtí pomocí nůžek a promyje

AA AA A A A A • AA

A A · A A A · A A A

AAAA AA AA AA AA ···· se chladným 50 mM fosfátovým pufrem o pH 7,4 a pak se znovu uvede do suspenze v chladném fosfátovém pufru, pufr se užije v množství 5 ml/g tkáně. K homogenizaci se použije zařízení Ultra-Turrax, materiál se nechá projít 3krát vždy v době 10 sekund, mezi jednotlivými průchody se tkáň 2 minuty chladí v ledu. Jádra a buněčná drť se odstraní odstředěním při 2000 g při teplotě 4 °C po dobu 30 minut a podíly 2 ml supernatantu se uloží při teplotě 20 °C. Koncentrace proteinu v supernatantech se stanoví způsobem podle publikace Bradford, Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976.

Inkubace vzorků s objemem 1 ml se provádí při koncentraci proteinu 100 mg/ml a koncentraci substrátu 20 mM [6,7-3H]estron-3-sulfátu se specifickou aktivitou 60 Ci/mmol (New England Nuclear, Boston, Mass., USA, doba inkubace je 20 minut při teplotě 37 °C. V případě potřeby je možno použít 8 koncentrací sloučenin, a to 0 (kontroly), 0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,4 mM, 0,6 mM, 0,8 mM a 1,0 mM. Po inkubaci se každý vzorek zchladí a 1 ml prostředí se pipetou přenese do oddělených zkumavek, které obsahují [14C]estron (7 x 103 dpm) se specifickou aktivitou 97 Ci/mmol (Amersham International

Radiochemical Centre, Amersham, Velká Británie). Směs se 30 sekund důkladně protřepává s 5 ml toluenu. Pokusy prokázaly, že tímto způsobem se z vodné fáze odstraní více než 90 % [14C]estronu a méně než 0,1 % [3H]estron-3-sulfátu. Podíl 2 ml organické váze se odpaří a pomocí scintilační spektrometrie se stanoví počet impulzů pro obsah 3H a 14C. Množství hydrolyzovaného estron-3-sulfátu se vypočítá ze získaného počtu impulsů pro 3H s opravou na objem živného prostředí a použité organické fáze a s

J.IŮ LMLJULiHJI.1 ···· 9 9 9 «··*

99 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 9999 opravou na zpětnou izolaci přidaného [14C]estronu a ze specifické aktivity substrátu.

Živočišný model pro stanovení účinnosti STS (protokol 3)

Inhibice estronsulfatázy in vivo

Sloučeniny podle vynálezu je možno studovat při použití živočišného modelu, zvláště na krysách, jimž byly vyjmuty vaječníky. Na tomto modelu vyvolávají sloučeniny s estrogenním účinkem růst dělohy.

Sloučenina (0,1 mg/kg/den po dobu 5 dnů) se podává krysám perorálně, přičemž jiné skupině zvířat se podává pouze propylenglykol jako nosné prostředí. Na konci studie se odeberou vzorky jaterní tkáně a stanoví se účinnost estronsulfatázy při použití 3H estronsulfátu jako substrátu, tak jak bylo popsáno v přihlášce PCT/GB95/02638.

Živočišný model pro stanovení estrogenní účinnosti (protokol 4)

Nedostatek estrogenní účinnosti in vivo

Sloučeniny podle vynálezu je možno sledovat při použití živočišného modelu, zvláště na krysách, jimž byly vyjmuty vaječníky. Na tomto modelu vyvolávají sloučeniny s estrogenním účinkem růst dělohy.

Sloučenina (0,1 mg/kg/den po dobu 5 dnů) se perorálně podává skupině krys, přičemž další skupině zvířat se podává pouze propylenglykol jako nosné ♦ ♦ φφ ·· φ* ·* ·· • ♦ φ φ ΦΦΦ φ » φ · • φφ φ · ·φφ · · φ φ φ ΦΦΦ ·· ··· φ φ • φφ φφφφ ΦΦΦ φφφφ φφ φφ φφ »φ φφφφ prostředí. Na konci pokusu se vyjmou dělohy a zváží se, výsledky se vyjadřují jako poměr hmotnosti dělohy a celkové hmotnosti zvířete krát 100.

Sloučeniny, které nemají žádný statisticky významný účinek na růst dělohy, nemají estrogenní účinnost.

Biotechnologické zkoušky pro stanovení účinnosti STS (protokol 5)

Schopnost sloučenin vyvolávat inhibici estronsulfatázy je také možno stanovit při použití kodového nukleotidového řetězce pro STS nebo při použití sekvence aminokyselin nebo při použití účinných fragmentů, derivátů, homologů nebo variant těchto řetězců.

Pro identifikaci sloučeniny, schopné vyvolat modulaci STS, je možno použít jednu nebo větší počet cílových struktur, například sekvenci aminokyselin a/nebo nukleotidovou sekvenci při použití různých postupů pro identifikaci vyvolaných změn. Cílovou použitou strukturu při takových zkouškách je možno použít v roztoku, vázanou na pevný nosič, vázanou na buněčný povrch nebo uloženou uvnitř buněk. Pak je možno měřit snížení nebo eliminaci účinku na cílovou strukturu nebo tvorbu komplexů mezi cílovou strukturou a zkoumanou látkou.

Podle vynálezu je možno použít takové zkoušky, při nichž je možno zkouškám podrobit větší počet sloučenin.

Technika vyšetřování různých sloučenin na jejich účinnost může být založena na způsobu podle Geysena, «* 0« 00 0* ·* 0· 0000 000 0000 0 90 9 0 «· 9 0 · «90 00 000 0 0

90 0090 009

9000 00 09 9« 00 0990 který je popsán v evropské patentové přihlášce 84/03564, zveřejněné 13. září 1984. Při tomto postupu se na pevném substrátu, například na hrotech z plastické hmoty nebo na jiném povrchu syntetizuje velký počet různých malých peptidů jako zkoumaných látek. Tyto zkoumané látky se nechají reagovat s vhodnou cílovou strukturou nebo jejím fragmentem a promyjí. Vázané struktury se pak stanoví známými postupy. Čištěnou cílovou strukturu je také možno nanést jako povlak přímo na plotny pro sledování účinnosti různých sloučenin. Podle jiného postupu je také možno použít neneutralizující protilátky k zachycení peptidu a jeho imobilizaci na pevném nosiči.

Podle vynálezu je možno využít také kompetitivní zkoušky, při nichž se neutralizující protilátky, schopné vázat cílovou strukturu, dostávají do kompetice se zkoumanou látkou pro vazbu na cílenou strukturu.

Dalším možným způsobem sledování účinnosti různých sloučenin je vysoce účinný postup (HTS) pro látky s vhodnou vaznou afinitou ke zkoumaným látkám, postup je podrobněji popsán v dokumentu WO 84/03564.

Je možno očekávat, že sloučeniny podle vynálezu bude možno podrobit zkouškám ve větším i menším měřítku a že budou možné také kvantitativní zkoušky.

V jednom z výhodných provedení se vynález týká způsobu identifikace sloučenin, které selektivně modulují STS a je možno je vyjádřit vzorcem la.

» ♦ · 9·*· 9·

9« ·« <9 < 9 999 • » · 9 • 9 99

9» 99

9 · >99 9 » · • 9 9999

Reportéry

Při provádění zkoušek podle vynálezu je možno využít širokou škálu reportérů, přičemž při použití výhodných reportérů je možno dosáhnout vhodných detekovatelných signálů například při spektroskopii. Jako příklad je možno uvést reporterový gen, který je kódem pro enzym, katalyzující reakci, která mění absorpci světla.

Při dalších postupech je například možno použít imunosorpční zkoušky s vázaným enzymem, ELISA, radioimunologické zkoušky RIA a aktivaci fluorescence buněk při jejich třídění, FACS. Je možno použít i imunologickou zkoušku, při níž se užívají monoklonální protilátky, reaktivní pro dva neinterferující epitopy. Tyto a další zkoušky jsou podrobněji popsány například v souhrnných publikacích Hampton R a další, 1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Perss,

St Paul MN a Maddox DE a další, 1983, J. Exp. Med.

8:121 1.

Jako příklady reportérových molekul je možno uvést látky ze skupiny β-galaktosidáza, invertáza, zeleně fluoreskující protein, luciferáza, chloramfenikol, acetyltransferáza, (-)-glukuronidáza, exoglukanáza a glukoamyláza. Je možno postupovat také tak, že se radioaktivně značené nebo fluoreskující tag-značené nukleotidy zabudují do transkriptů, které se pak identifikují po jejich vazbě na oligonukleotidové sondy.

Řada výrobců, jako Pharmacia Biotech (Piscataway,

NJ), Promega (Madison, WI) a US Biochemical Corp (Cleveland, OH) dodává balíčky a sestavy k provádění ·» ·· 9· ·· ·· *9 ···« · · » ···· ·»· · · ··· 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 9999 takových zkoušek. Vhodné reportérové molekuly nebo vhodné značení zahrnuje radionuklidy, enzymy, fluorescenční látky, chemiluminiscenční látky nebo chromogenní látky a také substráty, kofaktory, inhibitory, magnetické částice a podobně. Z dokumentů, v nichž se takové látky uvádějí, lze uvést US-A-3817837, US-A-3850752, US-A-3939350,

US-A-3996345, US-A-4277437, US-A-4275149 a US-A-4366241.

Hostitelské buňky

Pojem „hostitelská buňka v průběhu přihlášky vynálezu zahrnuje jakoukoliv buňku, která by mohla představovat cílovou strukturu pro sloučeninu podle vynálezu.

Podle dalšího provedení vynálezu se tedy vynález týkal hostitelských buněk, které byly transformovány nebo transfektovány polynukleotidem, který je cílovou strukturou podle vynálezu nebo vyvolává její expresi. S výhodou je tento polynukleotid uložen ve vektoru pro replikaci a expresi polynukleotidů, které jsou cílovou strukturou nebo mohou vyvolat expresi cílové struktury. Hostitelské buňky se volí tak, aby byly kompatibilní s takovým vektorem, přičemž může jít o prokariotické buňky, například bakteriální buňky, houby, kvasinky, nebo o rostlinné buňky.

Gramnegativní bakterie E. coli se široce používá jako hostitelská buňka pro expresi heterologního genu. V tomto případě však se často hromadí uvnitř buněk velké množství heterologního proteinu. Následné čištění požadovaného proteinu z nitrobuněčných proteinů E. coli je někdy velmi obtížné.

• · · · · · · • ·· · · ··· ·

Na rozdíl od E. coli jsou bakterie z rodu Bacillus velmi vhodné jako heterologní hostitelské buňky, protože mají schopnost vylučovat proteiny do živného prostředí. Další bakterie, vhodné k uvedenému účelu je možno volit například z rodů Streptomyces a Pseudomonas.

V závislosti na povaze kodového polynukleotidu pro polypeptid podle vynálezu a/nebo v závislosti na dalším zpracování proteinu po expresi je možno dát přednost některému z eukariotických hostitelů, jako jsou kvasinky nebo jiné houby. Obecně jsou kvasinkové buňky výhodnější než buňky hub, protože manipulace s nimi je snadnější. Některé proteiny se však z kvasinkových buněk vylučují jen v malém množství a v některých případech nejsou správně zpracovány, například dochází v kvasinkách k jejich hyperglykosylaci. V těchto případech by měl být zvolen jiný houbový hostitelský organismus.

Jako příklady vhodného hostitele pro expresi pro účely vynálezu je tedy možno uvést houby, například z čeledi Aspergillus, tak jak byly popsány například v EP-A-0184438 a EP-A-024603 a z čeledi Trichoderma, dále bakterie, například z čeledi Bacillus, například kmeny, popsané v dokumentech EP-A-0134048 a EP-A-0253455, dále může jít o čeleď Strepromyces a pseudomonáz a také o kvasinky, například z čeledi Kluyveromyces, popsané například v EP-A-0096430 a EP-A-0301670 a z čeledi Saccharomyces. Příkladem typických hostitelů pro expresi mohou být Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus

WRHW

licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyevromyces lactis a Saccharomyces cerevisiae.

Při použití vhodné hostitelské buňky, například kvasinkové buňky, houbové buňky nebo rostlinné hostitelské buňky je možno zajistit posttranslační modifikace, jako myristoylaci, glycosylaci, zkrácení sekvence, vynechání některých úseků sekvence a fosforylaci tyrosinu, šeřinu nebo threoninu, tyto modifikace mohou být nezbytné pro optimální biologickou účinnost rekombinantních produktů exprese podle vynálezu.

Organismus

Pod pojmem „organismus se v průběhu přihlášky rozumí jakýkoliv organismus, který by mohl obsahovat cílovou strukturu podle vynálezu a/nebo produkty, získané z této cílové struktury. Jako příklady takových organismů je možno uvést houbu, kvasinku nebo rostlinu.

Pod pojmem „transgenický organismus se ve smyslu vynálezu rozumí jakýkoliv organismus, který obsahuje cílovou strukturu podle vynálezu a/nebo produkty, získané z této struktury.

Transformace hostitelských buněk/hostitelský organismus.

Jak již bylo uvedeno svrchu, hostitelský organismus může být prokaryotický nebo eukaryotický. Příkladem vhodných prokaryotických hostitelů mohou být E. coli a Bacillus subtilis. Informace o transformaci prokaryotických hostitelů jsou dobře dokumentovány a je možno je nalézt například v souhrnné publikaci Sambrook a

• · · » · ··· další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press a Ausubel a další, Current Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley and Sons, lne.

V případě, že má být použit prokaryotický hostitel, může být zapotřebí nukleotidovou sekvenci před transformací vhodným způsobem modifikovat, například odstraněním intronů.

Podle dalšího možného provedení může být transgenickým organismem kvasinka. Kvasinky jsou rovněž široce využívány pro expresi heterologních genů. Čeleď Saccharomyces cerevisiae má svou dlouhou historii průmyslového využití včetně použití pro expresi heterologních genů. Exprese heterologních genů v tomto organismu byla souhrnně popsána v publikacích Goodey a další 1987, Yeast Biotechnology, D R Berry a další, eds, s. 401-429, Allen and Unwin, London a King a další, 1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E. F. Walton a G.

T. Yarronton, eds, s. 107-133, Blackie, Glasgow.

Kvasinky Saccharomyces cerevisiae jsou vhodné pro expresi heterologních genů z několika důvodů. Především není tento organismus pathogenní pro člověka a nevytváří endotoxiny. Mimo to je známa jeho dlouhá historie bezpečného využívání pro nejrůznější účely po celá staletí. Organismus je tedy z tohoto hlediska naprosto přijatelný. Mimo to byla v průběhu běžného průmyslového využití a výzkumu shromážděna velká řada informací, týkajících se genetiky a fyziologie tohoto organismu a také jeho pěstování ve velkém měřítku.

Souhrnné informace o expresi heterologních genů v Saccharomyces cerevisiae a o vylučování produktů exprese těchto genů do živného prostředí jsou shrnuty v publikaci E. Hinchcliffe E. Kenny, 1993, Yeast as a vehicle for the expression of teherologous genes, Yeasts, sv. 5, Anthony H. Rose a J. Stuart Harrison, eds, 2. vydání, Academie Press Ltd.

V současné době je k dispozici několik typů vektorů pro kvasinky včetně integrativních vektorů, u nichž je nutno uskutečnit rekombinaci s genomem hostitele pro jejich udržení, mimo to je možno využít také vektory typu plasmidů s autonomní replikací.

Aby bylo možno připravit transgenický organismus Saccharomices, je nutno vytvořit konstrukty pro expresi uložením nukleotidové sekvence do konstruktu, určeného pro expresi v kvasinkách. Bylo vyvinuto několik typů konstruktů, které je možno užít pro heterologní expresi. Tyto konstrukty obsahují promotor, účinný u kvasinek, spojený s nukleotidovou sekvencí. Jde obvykle o promotor kvasinkového původu, například promotor GAL1. Obvykle se užívá také signální sekvence kvasinkového původu, například sekvence, kódující signální peptid SUC2. Terminátor, účinný v kvasinkách končí systém pro expresi.

Pro transformaci kvasinek byla navržena celá řada postupů. Například je možno transgemický organismus Saccheromyces podle vynálezu připravit způsobem podle publikace Hinnen a další, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929, Beggs, J. D. 1978, Nátuře, London, 275, 104, a Ito, H. a další 1983, J. Bacteriology 153, 163-168.

• · · · · · » · • ·· · · ··· · • · · · ·· ·· · ·

Transformované kvasinkové buňky se podrobí selekci při použití různých markérů. Z markérů, použitých pro transformaci lze uvést celou řadu auxotrofních markérů, jako LEU2, HIS4 a TRPÍ a také dominantní markéry pro odolnost proti antibiotikům, například aminoglykosidovým antibiotikům, jako G418.

Jiným hostitelským organismem může být rostlina. Základní princip konstrukce geneticky modifikovaných rostlin spočívá v tom, že se genetická informace uloží do genomu rostliny, takže přetrvává v tomto genomu. Pro uložení genetické informace je známo několik postupů, dva hlavní postupy spočívají v tom, že se genetická informace uloží přímo nebo se uloží s použitím vektoru. Souhrnné informace o obecných postupech tohoto typu je možno nalézt v publikacích Potrykus, Annu Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 1991, 42:205-225 a Christou, Agro-FoodIndustry Hi-Tech březen/duben 1994, 17-27. Další údaje, týkající se transformace rostlin je možno nalézt v dokumentu EP-A-0449375.

Součást podstaty vynálezu tedy tvoří také způsob transformace hostitelské buňky nukleotidovou sekvencí, která je cílovou strukturou nebo vede k expresi cílové struktury. Hostitelské buňky transformované takovou nukleotidovou sekvencí je možno pěstovat za podmínek, při nichž dochází k expresi proteinu, pro nějž je kódem uložená nukleotidová sekvence. Protein, produkovaný rekombinantní buňkou, se může nacházet na povrchu buňky.

V případě potřeby je možno upravit vektory pro expresi, obsahující takovou kódovou sekvenci s použitím signální sekvence, která vyvolá sekreci kódované sekvence přes ·· 99 99 99 ·· · 9 9 ·«· · ·· * 9999 9 i ·

9999 9« » · 99 9« membránu prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Další rekombinantní konstrukce mohou spojit kodovou sekvenci k nukleotidové sekvenci pro polypeptidovou oblast, která usnadní čištění rozpustných proteinů způsobem podle publikace Kroll D. J. a další 1993, DNA Cell Biol 12: 441-53.

Varianty, homology a deriváty

Kromě specifických sekvencí aminokyselin a nukleotidových sekvencí, tak jak byly uvedeny svrchu, zahrnuje vynález také použití homologů, variant a derivátů těchto sekvencí.

V průběhu přihlášky se za homologní sekvenci považuje sekvence aminokyselin, která je s původní sekvencí identická alespoň ze 75, 85 nebo 90 %, s výhodou je identická alespoň z 95 nebo 98 %. Přestože homologii je možno uvažovat také na základě fyziologické podobnosti (to znamená, že zbytky aminokyselin mají podobné chemické vlastnosti a funkce), pro účely vynálezu je výhodnější vyjádřit homologii jako přítomnost totožných zbytků aminokyselin.

Srovnávání pro účely homologie se obvykle provádí při použití programů, které jsou konstruovány pro srovnávání sekvencí. Tyto běžně dodávané počítačové programy jsou schopné vypočítat procento homologie mezi dvěma sekvencemi nebo větším počtem sekvencí.

Homologii v procentech je možno vypočítat tak, že se jedna ze sekvencí použije jako základní sekvence a další sekvence, například sekvence aminokyselin se s touto sekvencí přímo srovnávají tak, že se postupně srovnávají odpovídající polohy zbytků aminokyselin. Tento postup se označuje jako srovnávání bez přerušení. Tímto způsobem se obvykle srovnává poměrně krátká sekvence zbytků.

Přestože jde o velmi jednoduchou a použitelnou metodu, nebere tento postup do úvahy, že například v jinak totožném páru sekvencí může dojít vypuštěním nebo zařazením jednoho zbytku aminokyseliny k úplnému rozrušení sledu odpovídajících zbytků, takže by potenciálně došlo k velkému snížení homologie v procentech při celkovém srovnání takových sekvencí. V důsledku toho je většina srovnávacích postupů navržena tak, aby se kvence byly nejprve optimálně uloženy proti sobě, takže je možno brát do úvahy vypuštění nebo zařazení zbytků, aniž by došlo k narušení celkové homologie obou sekvencí. Toho je možno dosáhnout zařazením přerušení nebo „štěrbin do sekvencí tak, aby bylo možno dobře vyjádřit místní homologii kratších částí celé sekvence.

Při těchto složitějších postupech je však nutno odečíst určité procento homologie pro každou štěrbinu, kterou je nutno do sekvence zavést, což znamená, že program musí být upraven tak, aby při stejném počtu identických zbytků aminokyselin obsahovala sekvence co nejmenší množství štěrbin, takže bude zřejmá vysoká homologie mezi oběma srovnávanými sekvencemi. Pro každou přítomnost štěrbiny se odečte určité procento homologie, menší procento se odečte pro zbytek aminokyseliny navíc, který se nachází v takové štěrbině. Jde o obecný způsob hodnocení, který je však ještě možno modifikovat. Tímto způsobem je také možno srovnávat výsledky z různých • · • ·· programů. Například při použití programu GCG Wisconsin Bestfit, který bude ještě dále popsán, se užije v sekvenci aminokyselin pro každou štěrbinu snížení o 12 % a pro každé prodloužení sekvence snížení o 4 %.

V případě, že má být vypočítána maximální homologie v procentech, je tedy zapotřebí nejprve dosáhnout optimální polohy obou sekvencí pro srovnání a je tedy nutno brát do úvahy snížení, k němuž dojde v případě zařazení štěrbin. Jak již bylo uvedeno, vhodným počítačovým programem pro uskutečnění takového srovnání je program GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, USA, Devereux a další, 1984, Nucleic Acids Research 12, 387). Příkladem dalších počítačových programů mohou být například program BLAST, popsaný v publikaci Ausubel a další, 1999, tamtéž v kapitole 18, program FASTA (Atschul a další, 1990, J. Mol. Biol., 403410) a program GENEWORKS. Programy BLAST a FASTA byly podrobněji popsány v publikaci Ausubel a další, 1999 tamtéž str. 7-58 a 7-60. Je však výhodnější použít program GCG Bestfit.

Další postupy je možno nalézt v publikaci FEMS Microbiol. Lett 1999, 15. května, 174(2):247-50 a ve zveřejněné opravě této publikace z 1. srpna 1999,

177 (1) :187-8.

Přestože homologii v procentech je možno měřit na základě totožnosti zbytků aminokyselin v totožných polohách, není srovnávání přísně založeno na srovnání dvojic aminokyselin způsobem „vše nebo nic”. Místo toho se obvykle užívá matrice pro hodnocení podobnosti, která hodnotí totožnost dvojic aminokyselin na základě chemické • · • ·· • · ··· · podobnosti nebo na základě polohy této aminokyseliny v průběhu vývoje. Jednou z používaných matric je matrice BLOSUM62, která se používá zejména pro program BLAST. Program GCG Wisconsin obecně užívá zveřejňované hodnoty v dodávaných tabulkách podle pokynů výrobce. Pro tyto programy je spojení s programem GCG velmi výhodné, v případě jiných počítačových programů je lépe použít matrici BLOSUM62.

Jakmile bylo pomocí počítačového programu dosaženo optimální polohy sekvence pro srovnání, je možno vypočítat homologii v procentech, to znamená procentuální množství totožných dvojic aminokyselin v sekvencích. Počítačový program toto srovnání obvykle automaticky provede a dá k dispozici příslušnou hodnotu.

Sekvence mohou mít vypuštěné části, substituce aminokyselin nebo části, které jsou do sekvence zařazeny navíc. Může přitom jít o tak zvanou „němou změnu, při níž se vytvoří funkčně ekvivalentní sekvence. Substituce aminokyselin je možno uskutečnit na základě jejich podobnosti, pokud jde o polaritu, náboj, rozpusnost, hydrofobnost, hydrofilnost a/nebo amfipatickou povahu zbytku, pokud zůstává zachována vazná účinnost uvedené látky. Například aminokyseliny s negativním nábojem zahrnují kyselinu asparagovou a glutamovou, aminokyseliny s kladným nábojem zahrnují lisin a arginin a aminokyseliny s nenabitou polární hlavní skupinou a s podobnou hydrofilností zahrnují leucin, isoleucin, valin, glycin, alanin, asparagin, glutamin, serin, threonin, fenylalanin a tyrosin.

• ·

Konzervativní substituce je možno uskutečnit například podle následující tabulky. Vzájemně je možno zaměnit aminokyseliny, uvedené ve stejném bloku druhého sloupce a s výhodou v téže řádce třetího sloupce.

Alifatické	Nepolární	GAP I L V
	Polární bez náboje	C S T M N Q
	Polární s nábojem	D E K R
Aromatické		H F W Y

Vektory pro expresi

Nukleotidovou sekvenci, která má být užita jako cílová konstrukce nebo má být užija pro expresi cílové konstrukce, je možno uložit do rekombinantního vektoru, schopného replikace. Tento vektor je pak možno použít k replikaci a expresi nukleotidové sekvence v kompatibilní hostitelské buňce. Expresi je možno řídit při použití řídící sekvence, která zahrnuje promotory a/nebo zesilovače exprese a další signály pro řízení exprese. Přitom je možno použít promotory, specifické pro určité tkáně. Je rovněž možno použít chimérní promotory, které obsahují části sekvencí ze dvou nebo většího počtu různých svrchu popsaných promotorů.

Protein, produkovaný expresí nukleotidové sekvence v rekombinantní hostitelské buňce může být z této buňky vylučován nebo může být přítomen uvnitř buňky v závislosti na použité sekvenci a/nebo na použitém vektoru. Kodová sekvence může být opatřena signální • · sekvencí, která řídí sekreci látky, vznikající expresí kódové sekvence přes buněčnou membránu příslušné prokaryotické nebo eukaryotické buňky.

Fúzní proteiny

Cílová sekvence aminokyselin může být produkována jako fúzní, to znamená složený protein, například k usnadnění isolace očištění. Jako příklady částí, vhodných pro tvorbu fúzních proteinů je možno uvést enzymy, jako jsou glutathion-S-transferáza, GST, 6xHis, GAL4 (domény pro vazbu a/nebo transkripční aktivaci DNA) a (-)-galaktosidáza. Může také být vhodné zařadit mezi požadovaný protein a druhou část fúzního proteinu místo pro proteolytické štěpení tak, aby bylo možno snadno izolovat požadovaný protein. Fúzní protein by s výhodou neměl potlačovat účinnost cílové struktury.

Fúzní protein může obsahovat antigen nebo antigenní derminantu, vázanou na sloučeninu podle vynálezu. Při tomto provedení může být fúzní protein látkou, která se přirozeně nevyskytuje a která obsahuje sloučeninu, která může působit jako pomocný prostředek v tom smyslu, že obecně stimuluje imunitní systém. Antigen nebo antigenní determinantu je možno zařadit na aminoterminální nebo karboxyterminální zakončení sloučeniny.

Podle dalšího možného provedení vynálezu je možno sekvenci aminokyselin navázat na heterologní sekvenci za vzniku fúzního proteinu. Například pro rozbor peptidových bank a jejich vyšetření na látky, schopné ovlivnit účinnost sloučeniny, může být vhodné vytvořit kódovou sekvenci pro chimérní sloučeninu, takže dochází k expresi :x..

heterologního epitopu, který je rozpoznáván běžně dodávanou protilátkou.

Použití k léčebným účelům

Sloučeniny podle vynálezu je možno použít k léčebným účelům.

Pod pojmem „léčebné účely s rozumí přímé léčení různých onemocnění, příznivé ovlivnění některých jejich příznaků, a také preventivní použití sloučenin.

Sloučeniny je možno použít k léčení člověka nebo jiných živočichů, s výhodou samic.”

Farmaceutický prostředek

Součást podstaty vynálezu tvoří rovněž farmaceutický prostředek, který jako svou účinnou složku obsahuje sloučeninu podle vynálezu, popřípadě spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo pomocnou látkou včetně kombinace takových látek.

Farmaceutický prostředek může být určen pro použití v lidském lékařství nebo ve veterinárním lékařství a bude obvykle obsahovat 1 nebo větší počet farmaceuticky přijatelných ředitel, nosičů, nebo pomocných látek. Farmaceuticky přijatelné nosiče nebo ředidla jsou látky, které jsou ve farmaceutickém průmyslu obecně známé a jsou souhrnně popsány například v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A. R. Gennaro edit. 1985. Volbu farmaceutického nosiče, pomocné látky nebo ředidla je možno uskutečnit v závislostí na předpokládaném způsobu podání a podle běžné farmaceutické praxe. Farmaceutický prostředek může obsahovat jako pomocnou látku jakékoliv vhodné pojivo, kluznou látku, suspenzní činidla, materiály pro tvorbu povlaků nebo pomocná rozpouštědla.

Konzervační prostředky, stabilizátory, barviva a látky pro úpravu chuti mohou být dalšími složkami farmaceutického prostředku podle vynálezu. Jako příklad konzervačních prostředků je možno uvést benzoát sodný, kyselinu sorbovou a estery kyseliny p-hydroxybenzoové. Mimo to je možno použít také antioxidační látky a suspenzní činidla.

Na farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou být vzneseny ještě další požadavky v případě, že prostředek má být použit specifickým způsobem. Farmaceutický prostředek podle vynálezu může být například aplikován pomocí miničerpadla nebo vstřebáváním sliznicí, například ve formě spreje na nosní sliznicí nebo ve formě aerosolu, určeného k inhalaci nebo ve formě roztoku pro perorální podání nebo je možno účinné látky zpracovat na parenterální lékovou formu, zejména na injekční formu, určenou například pro nitrožilní, nitrosvalové nebo podkožní podání.

V případě, že účinná látka má být vstřebávána sliznicí zažívací soustavy, měla by zůstat při průchodu zažívací soustavou stálá. To znamená, že by měla být odolná k proteolytické degradaci, měla by být stálá při pH v kyselé oblasti a měla by odolávat účinku žluči.

9· '9· «· ·· * · · 9 9 * »

19 9 9 · ·· · 9 • ··· · « · · « *

Farmaceutický prostředek podle vynálezu je v případě potřeby možno podávat také inhalací, ve formě čípku nebo pesaru, ve formě jiného nitroděložního systému, místně, zejména ve formě emulze, roztoku, krému, mazání nebo pudru, nebo je možno prostředek zpracovat na náplast, pro perorální podání na formu tablet, obsahujících pomocné látky, jako škrob nebo laktózu nebo na formu kapslí, obsahujících účinnou látku samostatně nebo ve směsi s pomocnými látkami. Účinnou látku je možno zpracovat také na formu elixírů, roztoků nebo suspenzí, obsahujících látku pro úpravu chuti nebo barvivo, nebo je možno tyto sloučeniny podávat injekčně parenterálním způsobem, například nitrožilně, nitrosvalově nebo podkožně. V případě parenterálního podání je nejvhodnějším zpracováním účinné látky zpracování na sterilní vodný roztok, který může obsahovat další látky, například soli nebo monosacharidy, tak aby roztok byl isotonický s krví. Pro podání ústní sliznicí nebo pod jazyk je možno vytvořit tablety nebo kosočtverečné tablety, zpracované obvyklým způsobem.

Farmaceutické prostředky s kombinací účinných látek

Součeniny podle vynálezu je také možno použít v kombinaci s jednou nebo větším počtem dalších účinných látek, zejména s farmaceuticky účinnými látkami.

Jako příklad je možno uvést, že sloučeniny podle vynálezu lze použít v kombinaci s dalšími inhibitory STS a/nebo jinými inhibitory, například s inhibitorem aromatázy (jako je například 4-hydroxyandrostendion, 4-OHA), a/nebo se steroidy, může jít například o přírodně se vyskytující neurosteroidy, dehydroepiandrosteronsulfát

I • · • · * · ♦· ♦ · 4 • ·♦ • 4 4 •44« 44

4 4 4 4 4 ·· 44 ·»

DHEAS a pregnenolonsulfát PS a/nebo další strukturně podobné organické sloučeniny.

Sloučeniny podle vynálezu je možno použít samostatně nebo v kombinaci s progestinem. Ve výhodném provedení se však tyto látky použijí bez progestinů. To znamená, že výhodný farmaceutický prostředek podle vynálezu je v podstatě prostý progestinů.

Navíc nebo mimo to je možno sloučeniny podle vynálezu použít v kombinaci s látkami, které modifikují biologickou odpověď.

Pod pojmem „látky, které modifikují biologickou odpověď, BRM je možno zahrnout cytokiny, modulátory imunitní odpovědi, růstové faktory, faktory, které řídí krvetvorbu, faktory, stimulující růst kolonií, chemotaktické látky, hemolytické a thrombolytické látky, receptory na povrchu buněk, ligandy, molekuly s adhesí na leukocyty, monoklonální protilátky, preventivní a léčebné vakciny, hormony, složky extracelulární matrice, fibronectin a podobně. Pro některá použití je výhodným módifikátořem biologické odpovědi cytokin. Jako příklady cytokinů je možno uvést interleukiny IL, jako IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 a IL-19, dále je možno použít faktor nekrózy nádorů TNF, jako TNF-α, interferon α, β a γ a TFG-β. Pro některá použití je výhodným cytokinem faktor nekrózy nádorů, TNF. V některých případech je možno použít jakýkoliv typ TNF, například TNF-α nebo TNF-β včetně derivátů nebo směsí těchto látek. Obvykle je však výhodným cytokinem TNF-oc. Popis TNF a jejich účinků je možno nalézt například v dokumentech WO-A-98/08870 a WO-A-98/13348.

99 99 ·· * 9 9 9 9 9 9 9999

999 99999 99 9

99 9999 9 9 9

9999 99 99 99 99 9999

Podávání

V typických případech určí ošetřující lékař dávkování, které bude pro určitého nemocného nej vhodnější a které se bude měnit v závislosti na věku, hmotnosti a odpovědi určitého nemocného na léčení. Dále budou uvedeny některé dávky jako příklady průměrných dávek. V určitých případech však je možno použít i vyšší nebo nižší dávky.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu je možno podávat injekčně, zejména je možno tyto látky zpracovat na parenterální, nitrosvalové, nítrožilní nebo podkožní podání, je však možno je podávat také sliznicí, nitroočně nebo transdermálně.

Specifické dávkování a frekvence dávek pro určitého nemocného se bude měnit v závislosti na celé řadě faktorů, jako jsou použití specifické účinné látky, metabolická stálost a délka působení zvolené sloučeniny, věk nemocného, jeho tělesná hmotnost, celkový zdravotní stav, pohlaví, způsob stravování, způsob a doba podávání účinné látky, rychlost jejího vylučování, kombinace použitých účinných látek, závažnost léčeného onemocnění a podobně. Kromě typických způsobů podávání, tak jak byly svrchu uvedeny, se pod pojmem „podávání rozumí také podávání některými specifickými postupy, jako je transfekce, zprostředkovaná lipidy, podávání pomocí liposomů, immunoliposomů, lipofectinu, kationtových faciálních amfifilních látek CFA a při použití kombinací těchto postupů. Zásadně mohou být účinné látky podávány vstřebáváním sliznicí, nosní sliznicí, ústní sliznicí, parenterálně, zažívací soustavou, místně a pod jazyk.

· • 4 4· • 9 9 ·4

9 4 9

4»·· ·· ©©

4 4

4 © •4 4444

Pod pojmem „podávání se rozumí také postupy, které nejsou omezené na podávání sliznici, to znamená ve formě spreje na nosní sliznici, nebo aerosolu pro inhalaci nebo roztoku pro perorální podání. Předpokládá se také možnost parenterálního podání, zejména v injekční formě, například nitrožilně, nitrosvalově nebo podkožně.

To znamená, že pro podávání ve formě farmaceutického prostředku je možno zpracovat inhibitory STS podle vynálezu jakýmkoliv vhodným způsobem při použití obvyklých farmaceutických způsobů zpracování a rovněž při použití běžných farmaceutických nosičů, pomocných látek, ředidel a podobně, tak jak se běžně užívají ve farmaceutickém průmyslu. Pokud jde o dávkování, může být sloučenina podávána jednou denně, rozděleně v několika intervalech a/nebo v celé řadě denních dávek po řadu dnů. V případě perorálního podání je možno účinnou látku zpracovat na tablety, kaplse, roztoky nebo suspenze. Alternativně je možno tyto látky zpracovat pro parenterální podání spolu s nosičem, vhodným pro parenterální podání a zejména pro podávání jednou denně. Účinné denní dávky se budou měnit v závislosti na účinnosti zvolené látky a na hmotnosti nemocného, tyto variace jsou běžné, takže účinnou dávku pro určitého nemocného snadno určí ošetřující lékař.

Poruchy rozmnožování buněk

Účinné látky podle vynálezu je možno s úspěchem použít pro léčení poruch, při nichž dochází k narušenému rozmnožování buněk.

• 9 • 9·· • · • ··

Jak je podrobně uvedeno v publikaci Molecular Cell Biology, 3. vydání, Ed. Lodish a další, s. 177-181, mohou různé eukaryotické buňky růst různou rychlostí a také se mohou dělit různou rychlostí. Například kvasinkové buňky se mohou dělit každých 120 minut, první dělení oplodněných vajíček ježovky a hmyzu nastává pouze po 1530 minutách vzhledem k tomu, že se dělí velká, předem existující buňka. Avšak většina rostoucích rostlinných a živočišních buněk potřebuje 10 až 20 hodin ke zdvojení svého počtu, přičemž některé z těchto buněk mohou svůj počet zdvojit ještě daleko pomaleji. Řada buněk u dospělých, například nervové buňky a buňky příčně pruhovaných svalů se již vůbec nedělí. Jiné buňky, například fibroblasty, které napomáhají hojení ran, se mohou dělit a růst v případě potřeby, jinak však zůstávají v klidovém stavu.

Každá eukaryotická buňka, která se dělí, musí poskytnout stejný genetický materiál oběma dceřiným buňkám. Syntéza DNA u eukaryotických buněk neprobíhá v průběhu dělení buňky, avšak je omezena na určité období před. buněčným dělením.

Vztah mezi syntézou DNA u eukaryotických buněk a mezi buněčným dělením byl podrobně analyzován v kulturách savčích buněk, schopných růstu i buněčného dělení. Na rozdíl od bakterií bylo prokázáno, že eukaryotické buňky použijí pouze část svého času na syntézu DNA, která je úplně ukončena celé hodiny před buněčným dělením, mitózou. To znamená, že mezi syntézou DNA před buněčným dělením je ještě k dispozici určité časové období. Další časové období nastává po rozdělení buněk před následující syntézou DNA. Tato analýza vedla k závěru, že životní • · • ♦ · · • « • · * ·«

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99·9 99 ·· 99 * 9 9999 cyklus ekaryotické buňky je tvořen fází M, to znamená mitotickou fází, fází Gi, to znamená prvním časovým obdobím, fází S, při níž dochází k syntéze DNA a fází G₂, druhým klidovým obdobím, za nímž opět následuje fáze M. Fáze mezi jednotlivými mitózami, to znamená Gi, S a G₂ se souhrnně označují jako interfáze.

Řada nedělících se buněk v různých tkáních, například všechny fibroblasty vklidovém stavu zastaví svůj cyklus po mitóze před syntézou DNA. Takové buňky v „klidovém stavu” vlastně vystoupily z buněčného cyklu a setrvávají ve stádiu G_o.

Je možné identifikovat buňky v jedné ze tří fází buněčného cyklu při použití zařízení, které buňky třídí na základě fluorescence, FACS a měří jejich relativní obsah DNA. Buňka se nachází ve stadiu Gi před syntézou DNA při definovaném množství x této DNA. V průběhu fáze S, v níž dochází k replikaci DNA, je množství DNA mezi x a 2x. Ve stadiu G₂ (nebo M) obsahuje buňka 2x DNA.

Stádia mitózy a cytokinese v živočišné buňce jsou následuj ící.

a) Interfáze. Stádium G₂ bezprostředně předchází začátku mitózy. Dochází k replikaci chromosomální DNA a její vazbě na protein v průběhu fáze S, avšak chromosomy není ještě možno pozorovat jako zřetelné struktury. Nukleolus je jedinou substrukturou, která je viditelná ve světelném mikroskopu. V diploidní buňce před replikací DNA existují dva morfologické chromosomy každého typu a buňka se uvádí jako 2n. Ve stadiu G₂ po aplikaci DNA jde o 4n. Existují 4 kopie každé chromosomální DNA. Vzhledem k tomu, že • · » 9 9« • 9 • 99

99 9999 999

99«· 99 99 99 «9 9999 sesterské chromosomy se od sebe ještě neoddělily, označují se jako sesterské chromatidy.

b) Časná profáze. Centrioly, každý s nově vytvořeným dceřiným centriolem, se počínají pohybovat směrem k opačným pólům buňky. Je možno pozorovat chromosomy jako dlouhá vlákna. Jaderná membrána se počíná dělit na malé nukleoly.

c) Střední a pozdní profáze. Kondenzace chromozomů je ukončena. Každá viditelná struktura chromosomu je tvořena dvěma chromatidy, které jsou k sobě přidržovány v místě svých centromerů. Každý chromatid obsahuje jednu ze dvou nově replikovaných dceřinných molekul DNA. Mikrotubulární vřeteno se počíná posunovat z oblastí přilehlých k centriolu do oblasti pólů. Některá vlákna vřetena zasahují od pólu až ke druhému pólu, většina z nich směřuje k chromatidům a napojuje se na kinetochory.

d) Metafáze. Chromosomy se pohybují směrem k equatoru buňky, kde vytvářejí equatoriální rovinu. Sesterské chromatidy se dosud nerozdělily.

e) Anafáze. Dva sesterské chromatidy se dělí na nezávislé chromosomy. Každý z nich obsahuje centromer, který je spojen vláknem vřetena k jednomu z pólů, k němuž se pohybuje. To znamená, že každá dceřinná buňka obdrží jednu kopii každého chromosomu. Současně se buňka prodlužuje stejně jako vřeteno, které zasahuje od pólu k pólu. Začíná docházet k cytokinesi.

f) Telofáze. Kolem dceřiných jader se počínají tvořit nové membrány. Chromosomy se rozvíjí a stávají se méně

V9 *· ·· ·· ·» 99

9 9 9 9 9 9 9 9*9

99 9 9 999 · 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 ·· «· ··»» zřetelnými, nukleolus začíná být znovu viditelný a kolem každého dceřiného jádra se vytvoří jaderná membrána. Cytokinese je téměř ukončena a vřeteno mizí, současně dochází k depolymeraci mikrotubulů a dalších vláken. V průběhu mitózy roste „dceřinný centriol na každém pólu až do své plné délky. V telofázi je zdvojení původních centriolů úplné a v průběhu následující interfáze se vytvoří nové dceřinné centrioly.

g) Interfáze. Po ukončení cytokinese vstupuje buňka do fáze Gi buněčného cyklu a začíná nový cyklus.

Je zřejmé, že buněčné dělení je velmi důležitým pochodem. Odchylky od normálního dělení buněk mohou mít za následek celou řadu poruch a onemocnění. Zvýšené a/nebo ničím neomezené buněčné dělení může vést ke vzniku zhoubných nádorů. Snížení buněčné dělení může mít za následek různé degenerativní stavy. Při použití sloučenin podle vynálezu je možno takové chorobné stavy léčit.

Sloučeniny podle vynálezu jsou tedy vhodné pro použití k léčení poruch dělení buněk, jako jsou zhoubné nádory včetně národů, závislých a nezávislých na hormonech.

Sloučeniny podle vynálezu jsou přitom vhodné pro léčení různých typů zhoubných nádorů, jako jsou například zhoubné nádory mléčené žlázy, vaječníků, endometria, sarkomů, melanomů, zhoubných nádorů prostaty, slinivky břišní a jiných pevných nádorů.

Pro některé aplikace je nutno buněčné dělení zbrzdit nebo mu zabránit. V tomto případě jde obvykle o inhibici ·· 00 0« ·« 00 »0

0 0 0 0 0 · · · > ·

00 0 · »00 0 · ·

4 ·*· · * 0 0 0 0*0 00 • 00« 0· 4« ** 00 0000 buněčného dělení ve fázi G₂/M. Je také možné zabránit buněčnému dělení ireverzibilním způsobem.

Pod pojmem „zábrana buněčného dělení ireverzibilním způsobem se rozumí, že po aplikaci sloučeniny podle vynálezu a po ukončení podávání této sloučeniny je stále ještě možno pozorovat účinky této látky, zejména zástavu buněčného dělení. Buňky, které byly ošetřeny sloučeninami podle vynálezu, méně rostou po stupni 2 protokolu 6 než kontrolní buňky. Podrobnosti budou dále uvedeny.

Sloučeniny podle vynálezu tedy mohou vyvolat inhibici buněčného růstu u buněk zhoubných nádorů mléčné žlázy, které jsou pozitivní na receptor pro estrogeny (ER+) nebo jsou v tomto smyslu negativní (ER-), zkouška se provádí in vitro a sleduje se prevence a/nebo inhibice buněčného dělení. Mimo to nebo navíc může dojít k regresi nádorů mléčné žlázy, které byly vyvolány podáváním nitrosomethylmočoviny na jinak zdravých zvířatech, jimž nebyly vyjmuty vaječníky. Sloučeniny podle vynálezu tedy mohou zabránit množení buněk zhoubných nádorů in vitro i in vivo.

Zkouška na rozmnožování buněk (protokol 6)

Stupeň 1

Buňky karcinomu mléčené žlázy MCF-7 se naočkují na plotny s větším počtem vyhloubení, hustota buněk je 105 buněk/vyhloubení. Buňky se pěstují tak dlouho, dokud nedojde k jejich přilnutí k povrchu plotny a růstu až do vytvoření 30% spojité vrstvy. Pak se buňky rozdělí na následující skupiny:

• ·· .· :

···· ·· ·· ··

Kontroly - na buňky se nijak nepůsobí

Buňky, jimž se přidává do prostředí 20 μΜ zkoumané látky (COI)

Buňky se pěstují 6 dnů v růstovém prostředí s obsahem COI, přičemž tato prostředí se mění vždy po 3 dnech. Na konci tohoto období se buňky spočítají při použití zařízení Coulter cell counter.

Stupeň 2

Po 6 dnech se buňky, které byly pěstovány v přítomnosti COI znovu naočkují při hustotě 10⁴ buněk/vyhloubení. Do živného prostředí se účinná látka již nepřidává. Buňky se pěstují dalších 6 dnů v přítomnosti růstového prostředí. Na konci tohoto období se znovu stanoví počet buněk.

Zhoubné nádory

Jak již bylo uvedeno, je možno sloučeniny podle vynálezu použít k léčení poruch rozmnožování buněk.

Nejvýznačnější takovou poruchou jsou zhoubné nádory.

Zhoubné nádory zůstávají v západních státech nej častější příčinou úmrtí. Léčení tohoto onemocnění se rozvinulo tak, že nyní zahrnuje také blokování syntézy hormonů, aby došlo k inhibici růstu nádorů, které jsou ne hormonech závislé. Mimo to je však za potřebí při léčení nádorů, nezávislých na hormonech používat daleko agresivnější chemotherapii.

Znamenalo by tedy podstatný léčebný pokrok, kde by bylo možno vyvinout farmaceutické prostředky s protinádorovým účinkem jak pro nádory, závislé na hormonech, tak pro nádory, na hormonech nezávislé, pokud by tyto farmaceutické prostředky měly menší vedlejší účinky než dosud používaná chemotherapie nebo by dokonce neměly žádné takové účinky.

Je známo, že estrogeny po své syntéze podléhají řadě hydroxylačních a konjugačních reakcí. Až dosud se předpokládalo, že tyto reakce jsou částí metabolického pochodu, na jehož konci je ve vodě rozpustný estrogen, který se snadno vylučuje z organismu. V současné době je zřejmé, že některé hydroxymetabolity, například 2-hydroxyderivát a 16a-hydroxyderivát a také konjugáty, například estronsulfát EIS, jsou důležitými látkami a určují některé komplexnější vlivy estrogenů v organismu.

Byla například sledována tvorba 2- a 16-hydroxylovaných estrogenů, pokud jde o riziko karcinomu mléčné žlázy. Nyní je zřejmé, že faktory, zvyšující účinnost 2-hydroxylázy, vedou k nižšímu riziku vzniku karcinomu, kdežto faktory, které zvyšují 16a-hydroxylaci toto riziko zvyšují. Další zájem, týkající se biologické úlohy estrogenů a jeho metabolitů, byl stimulován průkazem, že 2-methoxyestradiol je endogenním metabolitem s antimitotickými vlastnostmi. 2-methoxyestron-3-0-sulfamát, 2-MeOE2 se tvoří z 2-hydroxyestradiolu, 2-OHE2 katecholestrogenmethyltransferázou, jde o enzym, který je v organismu široce rozšířen.

« · • · • · · · · · ·· · · ··· ·

Bylo prokázáno, že in vivo vyvolává 2-MeOE2 inhibici růstu nádorů, vznikajících po podkožní injekci sarkomu Meth A, melanomu B16 nebo nádorových buněk mléčné žlázy typu MDA-MB-435, které jsou negativní vzhledem k receptoru pro estrogen (ER-). Tato látka rovněž vyvolává inhibici proliferace a migrace endotheliálních buněk a inhibici angiogenese in vitro. Schopnost 2-MeOE2 vyvolávat inhibici nádorového růstu in vivo může být patrně spojena spíše se schopností této látky vyvolávat inhibici angiogenese než s přímou inhibici proliferace nádorových buněk.

Mechanismus, který vede k tomu, že 2-MeOE2 má antimitogenní a antiangiogenní účinky, není ještě zcela osvětlen. Je zřejmé, že ve vysoké koncentraci může tato látka vyvolat inhibici polymerace mikrotubulů a působit jako slabý inhibitor vazby kolchicinu na tubulin. V poslední době se však uvádí, že koncentrace, při níž dochází k blokování mitózy, nevedou k depolymeraci vláken tubulinu, nýbrž k takové změně morfologie vláken jako po působení taxolu. Je tedy možné, že stejně jako taxol, působí 2-MeOE2 při léčení zhoubných nádorů mléčené žlázy a vaječníků přes stabilizaci dynamiky mikrotubulů.

Identifikace 2-MeOE2 jako nové látky pro léčení zhoubných nádorů znamená důležitý pokrok, biologická dostupnost perorálně podávaných estrogenů je však stále ještě nízká. Mimo to mohou být estrogeny do značné míry metabolizovány při prvním průchodu játry. Jako část výzkumného programu pro vývoj inhibitoru steroidní sulfatázy k léčení karcinomu mléčné žlázy byl identifikován estron-3-0-sulfamát, EMATE jako účinný inhibitor, specifický pro určité místo působení. Zcela • φ φ · • φφφφ * φ φ a ► · · «

Φ · · Φ neočekávaně bylo prokázáno, že EMATE má silné estrogenní vlastnosti při perorálním podání u krys, přičemž toto působení je lOOkrát vyšší než působení estradiolu.

Zvýšená estrogenita této látky je patrně důsledkem absorbce této látky červenými krvinkami (rbc), což chrání tuto látku proti inaktivaci v průběhu průchodu játry, současně je uvedená látka na červených krvinkách zásobníkem pro její pomalé uvolnění v delším časovém období. Byla syntetizována řada analogů, modifikovaných na kruhu A a podrobena zkouškám včetně 2-methoxyestron-3-O-sulfamátu. I když je tato látka stejně účinná jako EMATE jako inhibitor steroidní sulfatázy, nemá žádný estrogenní účinek.

Je zřejmé, že sloučenina podle vynálezu tedy představuje účinný prostředek pro léčení zhoubných nádorů, zvláště nádorů mléčné žlázy.

Mimo to nebo navíc může být sloučenina podle vynálezu vhodná pro inhibici růstu zhoubných nádorů včetně leukémií a pevných nádorů, například nádorů mléčené žlázy, endometria, prostaty, vaječníků a pankreatických nádorů.

Vliv na koncentraci estrogenu v organismu

Je zřejmé, že některé sloučeniny podle vynálezu je možno využít ke snížení koncentrace estrogenu v organismu, zvláště u žen. Některé z těchto látek je možno využít pro antikoncepci, například perorální antikoncepci. Může jít o tablety, pilulky, roztoky, avšak také o implantáty nebo náplasti.

Sloučeniny podle vynálezu je tedy možno využit k léčení stavů, spojených s koncentrací estrogenů, zejména s příliš nízkou koncentrací estrogenů.

Kromě působení na koncentraci estrogenů mohou sloučeniny podle vynálezu také ovlivnit odpověď imunitního systému organismus.

Neurodegenerativní choroby

Některé ze sloučenin podle vynálezu je možno použít k léčení neurodegenerativních chorob a podobných stavů.

Jako příklad je možno uvést, že inhibitory STS je možno použít při zlepšení paměti u nemocných, trpících například ztrátou paměti, u nemocných po poranění hlavy, v případě Alzheimerovy choroby, epileptické demence, presenilní demence, posttraumatické demence, senilní demence, vaskulární demence a demence po mrtvici nebo v jiných případech, kdy je zapotřebí zlepšit paměť.

TH1

Je zřejmé, že některé sloučeniny podle vynálezu bude možno využít i v případě odpovědi TH1.

Je pravědpodobné, že přítomnost inhibitorů STS u makrofágů nebo jiných buněk, prezentujících antigen, může vést ke snížené schopnosti sensitisovaných T-buněk vytvořit odpověď typu TH1 (vysoká koncentrace IL-2, IFNy, nízká koncentrace IL-4). Pak převáží normální řídící vliv jiných steroidů, například glukokortikoidů.

·· ·· • * ·· ·« « · • · · * * ♦ · • · ♦ · · · · · .· : : : ::

···· ·· ♦· ··

Vliv na záněty

Je pravděpodobné, že některé sloučeniny podle vynálezu bude možno využít při léčení zánětlivých stavů, například stavů, spojených s autoimunitními reakcemi, včetně reumatoidní arthritidy, cukrovky typu I a II, systemického lupus erythematosus, v případě roztroušené sklerózy, myasthenia gravis, při zánětech štítné žlázy, malých cév, v případě ulcerativní colitis a Crohnovy nemoci, při kožních onemocněních, jako lupence a kontaktní dermatitidě, v případě odmítnutí štěpu nebo nepříznivého ovlivnění hostitele štěpem, v případě ekzémů, astmatu a odmítnutí orgánu po transplantaci.

Je zřejmé, že inhibitory STS mohou bránit normálnímu fyziologickému účinku DHEA nebo příbuzných steroidů v případě imunitní a/nebo zánětlivé odpovědi.

Sloučeniny podle vynálezu je možno využít také pro výrobu farmaceutického prostředku k vyvolání endogenního účinku, podobného účinku glukokortikoidů.

Další použití

Sloučeniny podle vynálezu mohou mít na základě svých účinků další důležité použití v lékařství.

Uvedené látky je možno použít například k léčení poruch, uvedených v dokumentu WO-A-99/52890, běží o poruchy, které zde nebudou podrobněji uváděny.

Mimo to je možno použít uvedené látky k léčení poruch, uvedených v dokumentu WO-A-98/05635. Jde • · • · · ·

například o zhoubné nádory, záněty nebo zánětlivá onemocnění, kožní poruchy, horečnaté stavy, kardiovaskulární choroby, krvácení, příliš vysokou srážlivost, kachexii, anorexii, akutní infekce, infekci HIV, šokové stavy, reakce mezi hostitelem a štěpem, autoimunitní onemocnění, choroby po reperfusi, meningitidu, migrénu a poruchy po podávání acylpyrinu, nádorový růst včetně metastáz, angiogenetické poruchy, metastázy, ascites a pohrudniční výpotek při zhoubných onemocněních, mozkovou ischemii, ischemickou srdeční chorobu, osteoarthriti, rheumatoidní arthritis, osteoporózu, asthma, roztroušenou sklerózu, neurodegenerativní choroby, Alzheimerovu chorobu, atherosklerózu, mrtvici, záněty malých cév, Crohnovu nemoc a ulcerativní colitis, periodontitis, gingivitis, lupenku, atopické kožní záněty, chronickou vředovou chorobu, epidermolysis bullosa, rohovkové vředy, retinopathii a hojení ran, alergický zánět spojivek, ekzémy, anafylaktické stavy, restenózy, městnavé srdeční selhání, endometriózu, atherosklerózu nebo endosklerózu.

Mimo to nebo navíc je možno sloučeniny nebo farmaceutické prostředky podle vynálezu použít k léčení poruch, uvedených v dokumentu WO-A-98/07859. Jde například o choroby, spojené s poruchami účinku cytokinů a poruchami proliferace a diferenciace buněk, poruchy stimulace nebo potlačení imunitního systému, včetně infekce virem HIV, řízení růstu lymfocytů, léčení zhoubných nádorů a řady autoimunitních onemocnění, sloučeniny je možno použít také k prevenci odmítnutí transplantátu nebo k vyvolání imunity proti nádorům. Dále k řízení krvetvorby, například k léčení myeloidních nebo lymfoidních chorob, k vyvolání růstu kostní tkáně, • 4

4·· : : · : :: : · : : .· ···· ·· ·· ·» ·· ···· chrupavky, šlach, vazů a také nervové tkáně, například v případě hojení ran, popálenin, vředové choroby, chorob periodontu nebo neurodegenerativních poruch, dále k inhibici nebo aktivaci folikulostimulačního hormonu a tím i k úpravě plodnosti, dále k úpravě chemotaktické nebo chemokinetické účinnosti, například k mobilizaci určitého typu buněk proti infekci nebo jinému poškození, dále pro úpravu hemostatické a thrombolytické účinnosti, například k léčení hemofilie a záchvatu mrtvice a také k léčení zánětlivých stavů, například septického šoku nebo Crohnovy nemoci, jako antimikrobiální látky, modulátory metabolismu, analgetické látky, k léčení lupenky a podobně.

Mimo to nebo navíc je možno sloučeniny podle vynálezu použít k léčbě poruch, které jsou uváděny v dokumentu WO-A-98/09985. Jde například o úpravu inhibiční účinnosti makrofágů a/nebo T-buněk a tím protizánětlivé účinnosti, o modulaci antiimunitní účinnosti, to znamená inhibičního účinku proti buněčné a/nebo humorální imunitní odpovědi včetně odpovědi, která není spojena se zánětem, k inhibici schopnosti makrofágů a T-buněk přilnout k složkám extracelulární matrice a fibronectinu a také k úpravě exprese receptoru fas v T-buňkách, k inhibici nežádoucí imunitní reakce a zánětu včetně kloubních zánětů, jako jsou reumatoidní arthritis, záněty spojené s přecitlivělostí, alergické reakce, asthma, systemické lupus erythematosus, choroby kolagenu a jiné autoimunitní choroby, dále záněty, spojené s atherosklerózou včetně sklerózy srdečních cév, při reperfusním poškození, zástavě srdce, srdečním infarktu, při zánětlivých poruchách cév, syndromu nedostatečnosti dýchacího ústrojí a jiných onemocněních srdce a plic, při • ·

I * zánětech, spojených s peptickým vředem, při ulcerativní colitis a jiných onemocnění zažívací soustavy, při jaterní fibróze, cirhóze jater a dalších jaterních onemocněních, při zánětu štítné žlázy a dalších chorobách žláz, při glomerulonefritidě a dalších ledvinových a urologických chorobách, v případě zánětu středního ucha a dalších othorhinolaryngologických onemocněních, při kožních zánětech a jiných kožních chorobách, při onemocnění periodontu nebo zubů, při orchitidě a epididymoorchitidě, při neplodnosti, poranění varlat nebo chorobách varlat, vyvolaných imunitní reakcí, při dysfunkci placenty, nedostatečnosti placenty, habituálním potratu, eklampsii, preeklampsii a dalších gynekologických onemocněních, spojených s chorobami imunitního systému a/nebo záněty, při zánětech duhovky, zánětech spojivek, zánětech sítnice, optického nervu nitroočních zánětech, při otoku očního nervu, sympatetické oftalmii, skleritidě, při retinitis pigmentosa, při imunitních a zánětlivých chorobách a degeneraci očního pozadí, v případě zánětlivých složek očních poranění, v případě očních zánětů, vyvolaných infekcí, při chorobách sklivce a sítnice, při akutní ischemii očního nervu, u glaukomu, v případě imunitní a/nebo zánětlivé reakce proti očním implantátům a v případě podobných onemocnění, dále v případě autoimunitních chorob nebo stavů centrálního nervového systému nebo jakéhokoliv jiného orgánu, v případě Parkinsonovy choroby, u komplikací a/nebo vedlejších účinků při léčení Parkinsonovy choroby, u encefalopathie, spojené s infekcí HIV, v případě demence při AIDS, v případě Devicovy choroby, Sydenhamovy chorey,

Alzheimerovy choroby a u jiných degenerativních onemocnění, stavů nebo poruch CNS, u zánětlivých složek • · • · r

po mrtvici, po obrnách, v případě imunitních a zánětlivých složek psychiatrických opruch, u myelitidy, encefalitidy, subakutní sklerozující panencefalitidy, encefalomyelitidy, v případě akutní neuropathie, subakutní neuropathie, chronické neuropathie, syndromu Guillaim-Barre, u myasthenie gravis, u mozkových pseudonádorů, v případě Downova syndromu, Huntingtonova onemocnění, amyotrofické laterální sklerózy, v případě zánětlivých složek zvýšeného tlaku v CNS, v případě poranění nebo infekce CNS, v případě zánětlivých složek svalových atrofií a dystrofií a při stavech nebo poruchách centrálního a periferního nervového systému na imunitním a zánětlivém podkladu, v případě zánětů po úrazech, v případě septického šoku, infekčních onemocněních, u zánětlivých komplikací nebo vedlejších účinků chirurgických zákroků, při komplikacích a/nebo vedlejších účincích při transplantaci kostní dřeně nebo jiných transplantacích, při zánětlivých a/nebo imunitních komplikacích a vedlejších účincích genové therapie, například v důsledku infekce virovým nosičem, při zánětech, spojených s AIDS, k potlačení nebo inhibici humorální a/nebo buněčné imunitní odpovědi, k léčení nebo zlepšení proliferativních onemocnění monocytů a leukocytů, například při leukémii, ke snížení počtu monocytů nebo lymfocytů, k prevenci a/nebo léčení odmítnutí štěpu v případě transplantace přírodních nebo konstruovaných buněk, tkání a orgánů, jako jsou rohovka, kostní dřeň, čočka, pacemakery a přírodní nebo umělá kožní tkáň.

·♦ Ο • · · • · ··· ·· ·· «'· * 9· • · ι · · · · ·

• « « · · ·

Příprava sloučenin podle vynálezu

Sloučeniny podle vynálezu je možno připravit tak, že ne nechá reagovat příslušný alkohol s vhodným chloridem. Například sulfamátové sloučeniny podle vynálezu je možno připravit reakcí příslušného alkoholu s vhodným sulfamoylchloridem obecného vzorce R1R2NSO₂C1.

V typických případech se reakce provádí následujícím způsobem.

K míchanému roztoku alkoholu v bezvodém dimethylformamidu se při teplotě 0 °C přidá hydrid sodíku a sulfamoylchlorid. Pak se reakční směs nechá zteplat na teplotu místnosti, načež se míchá dalších 24 hodin. Pak se reakční směs vlije do chladného nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a výsledná vodná fáze se extrahuje dichlormethanem. Organické extrakty se spojí a vysuší se bezvodým síranem horečnatým. Filtrací s následným odpařením rozpouštědla ve vakuu a společným odpařováním s toluenem se získá surový odparek, který se dále čistí rychlou chromatografií.

S výhodou se příslušný derivát alkoholu vytvoří před reakcí se sulfamoylchloridem. V případě potřeby je možno funkční skupiny alkoholu chránit známým způsobem a na konci reakce pak ochranné skupiny opět odstranit.

Sulfamátové sloučeniny se s výhodou připravují způsobem podle publikace Page a další, 1990 Tetrahedron 46, 2059-2068. Sulfamátové sloučeniny je také možno připravit způsobem podle mezinárodních patentových přihlášek WO 96/05216 nebo WO 96/05217.

I .:

« · · · · · • · • · · ·

Shrnutí

Z to, co bylo svrchu uvedeno, je zřejmé, že předmětem vynálezu jsou nové farmaceutické prostředky, vhodné pro perorální antikoncepci, substituční hormonální léčbu, inhibici El-STS a další léčebné použití.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je zakresleno schéma biologické transformace.estradiolvalerátu ve srovnání s transformací estradiolsulfamátu.

Na obr. 2 je graficky znázorněn průběh koncentrace estronu v krevní plasmě u žen v menopauze po jediném perorálním podání jednoho miligramu estradiolsulfamátu.

Na obr. 3 je znázorněn průběh koncentrace estronu v krevní plasmě u žen v menopauze po podání jediné dávky 4 mg estradiolsulfamátu.

Na obr. 4 jsou graficky znázorněny variace koncentrace ethinylestradiolu v krevní plasmě u různých jednotlivců po podání jediné dávky 50 μς této látky za standardizovaných podmínek.

Na obr. 5 je znázorněna graficky koncentrace estronsulfátu v plasmě u žen v menopauze, jde o srovnání • » z

* ·

mezi podáním jediné dávky 2 mg estradiolsulfamátu a mezi opakovaným podáním 2 mg estradiolvalerátu.

Na obr. 6 je znázorněn průběh koncentrace estronsulfátu v krevní plasmě u žen v menopauze po podání různě vysokých perorálních dávek estradiolsulfamátu nebo 2 mg estradiolvalerátu.

Na obr. 7 je graficky znázorněn průběh koncentrace estronu a estradiolu v krevní plasmě u žen v menopauze po podání jediné dávky 2 mg estradiolsulfamátu a 2 mg estradiolvalerátu.

Na obr. 8 je znázorněn průběh koncentrace estronu a estradiolu u žen v menopauze po podání jediné perorální dávky placeba, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg nebo 8 mg estradiolsulfamátu.

Na obr. 9 je znázorněn průběh koncentrace estronsulfátu v plasmě u žen v menopauze po opakovaném perorálním podání 100 μρ estradiolsulfamátu.

Na obr. 10 je znázorněn průběh koncentrace estronsulfátu v krevní plasmě u žen v menopauze po jediném perorálním podání 2 mg estradiolsulfamátu.

Na obr. 11 je graficky znázorněna biologická dostupnost estradiolsulfamátu při perorálním podání jediné dávky 0,5 mg této látky.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

• 9 · 9

• · 9 9 9 9

Příklady provedení vynálezu

Byly připraveny následující sloučeniny podle vynálezu:

Příprava estron-3-sulfamátu

K míchanému roztoku 1 ekvivalent estronu v bezvodém dimethylformamidu se při teplotě 0 °C přidají 2 ekvivalenty hydridu sodíku ve formě 60% disperze v oleji a 2 ekvivalenty sulfamoylchloridu. Pak se reakční směs nechá zteplat na teplotu místnosti a v míchání se pokračuje dalších 24 hodin.

Reakční směs se vlije do chladného nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a výsledná vodná fáze se extrahuje dichlormethanem. Organické extrakty se spoj a vysuší se bezvodým síranem hořečnatým. Směs se zfiltruje, rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a pak ještě jednou společně s toluenem, čímž se získá surový produkt který se dále čistí rychlou chromatografií.

δ^χΗ (270 MHz, CD₃OD) : 0,91 (s, 3H, Ci₈-Me) , 1,40-2,55 (série m, 13H), 2,90-2,92 (m, 2H) , 7,04 (široký d, 2H, J=10,44 Hz), 7,33 (široký d, 1H, J=8,42 Hz).

Ó¹³C (67,8 MHz, CD₃OD) : 14,53 (q, C₁₈-Me) , 22,80 (t),

27,24 (t), 27,73 (t), 30,68 (t), 33,05 (t), 37,01 (t), 39,76 (d), 45,73 (s, C₁₈) , 51,86 (d) , 120,76 (d) , 123,54 (d), 127,89 (d), 139,83 (s), 150,27 (s), 223,87 (s, C=O) m/z (%): 349 (9) (m⁺) , 270 (100), 213 (26), 185 (43),

172 (31), 159 (21), 146 (36), 91 (33), 69 (37), 57 (73), 43 (56), 29 (24).

· • · · ·

··

Mikroanalýza Vypočteno: Nalezeno:

61,87

61,90

H

6, 63 6, 58

4,01% 3,95 %

Zkoušky s estradiolsulfamátem (J995)

Technologie

Byl zkoumány hormonální vlastnosti estradiolsulfamátu J995 in vitro a in vivo. Zkoušky in vitro zahrnovaly vyhodnocení specifické vazby této látky na receptory estrogenů při použití cytosolických preparátů děložní tkáně krys a myší a nádorových buněk MCF-7. Sledování in vivo bylo prováděno u několika druhů živočichů včetně neporušených krys, krys s odejmutými vaječníky a opic cynomolgus. Tyto živočišné druhy sloužily pro podrobné farmakodynamické a farmakokinetické studie po parenterálním nebo perorálním podání.

Sledování na člověku bylo prováděno při perorálním podávání uvedené látky u žen v menopauze. Byla vyhodnocena řada dávek při jednorázovém nebo opakovaném podání. Studie in vitro byly prováděny s roztoky v olejovém nosném prostředí, určenými pro parenterální podání. Při perorálním podání byla použita suspenze krystalického J995 ve vodném nosném prostředí. Klinické studie byly prováděny s amorfní sloučeninou, zpracovanou na galenickou lékovou formu spolu se směsí běžných pomocných složek, byly připraveny například kapsle nebo tablety.

• ···

Studie in vitro prokázaly, že sloučenina J995 jako taková nemá žádnou afinitu pro receptor estrogenů. Nebylo možno prokázat žádnou specifickou vazbu radioaktivně značené sloučeniny J995 na receptor estrogenů u myši, krysy a člověka. I když byla uvedená sloučenina použita ve velikém přebytku, nedošlo k vytlačení specificky vázaného radioaktivně značeného estradiolu. Obě zkoušky potvrzují, že sloučenina má estrogenní účinek až po přeměně hormonálně neúčinné molekuly na molekulu účinnou. Prekursor J995 nebo jeho hlavní metabolit estronsulfamát, EMATE se hydrolyzuje na kyselinu sulfamovou a přírodní estrogenní hormony estradiol a estron, jak je znázorněno na schématu na obr. 1.

Vzhledem k přednostnímu transportu v erythrocytech má prekursor a J995 specifické farmakokinetické vlastnosti. J995 neobíhá v krevní plasmě jako běžné estrogeny, avšak z 98 až 99 % obíhá spolu s erythrocyty. Tímto způsobem dochází k velmi nízkému metabolismu hormonu při prvním průchodu játry a k prodlouženému uvolňování J995 z červených krvinek, které slouží jako zásobník této látky.

Výhody J995 ve srovnání s perorálním podáním estrogenů • Snížení variací koncentrace v krevní plasmě (obr. 2 a 3) :

Standardní perorální léčbou estrogeny je podávání ethinylestradiolu. Tato sloučenina však nevede k dosažení dobře definovaných koncentrací v krvi, jak je zřejmé z obr. 4. Nevýhodou této variace koncentrace u různých jednotlivců je nutnost podávat u většiny jednotlivců ► 99 ·

• 999

99

9 9 9

9 · • 9 «9 • 9 · 9 • 99

9«9 9999 99 • 9 9 9 · 99 vyšší dávky než je nezbytné, tak aby bylo u všech dosaženo dostatečné koncentrace pro úspěšné léčení.

• Snížení dávky estrogenu a tím i účinných metabolitů, které by mohly podporovat růst některých nádorů, závislých na hormonech:

Při běžné substituční perorální léčbě estrogeny při použití tak zvaných konjugovaných estrogenů, estradiolu, estradiolvalerátu nebo estronsulfátu, dochází k velkému vzestupu koncentrace estronsulfátu v oběhu. Hydrolýza některých jeho metabolitů vede ke vzniku vyšších koncentrací estronu a estradiolu v oběhu. Estronsulfát však má tu nevýhodu, že je zvláště dobře hydrolyzován sulfatázou v nádorové tkáni nádorů mléčné žlázy, čímž může docházet k potenciálnímu vzniku estrogenů, podporujících růst těchto nádorů. Při podávání J995 je možno dosáhnout vyšší a déletrvající koncentrace estradiolu v krevním oběhu než při podání estradiolvalerátu v téže dávce, jak je zřejmé z obr. 6 a 7. Obvyklý metabolit estronsulfát však dosahuje pouze lOkrát nižší koncentrace než při podávání estradiolvalerátu, jak je zřejmé, z obr. 5.

• Snížení účinku estrogenů v játrech:

Při běžném podávání estrogenů perorálně je nutno použít vysokou dávku těchto látek, tak, aby došlo k vyrovnání ztráty těchto hormonů při průchodu játry. Nevýhodou této vysoké dávky je nepříznivý vliv na jaterní funkce, které jsou řízeny estrogeny. Jde o účinek na faktory hemostatického systému, takže může vzniknout thromboembolická porucha, může dojít ke zvýšené « 0 • »♦· • 0 • ·· koncentraci angiotensinogenu v krevním oběhu a k následným účinkům na nadledvinky, ledviny a cévní funkce, a také ke změnám sekrece žluči a metabolismu lipidů. V případě použití J995 dochází k obejití průchodu játry s možností použít nižší dávku a tím snížit odpovídající nežádoucí účinky podávání estrogenů v klimakteriu. Při perorálním podávání J995 dochází v téměř 100 % k transportu erythrocyty. Více než 50 % prekursoru se objevuje v oběhu jako estron a estradíol, jak je zřejmé z obr. 11. Tímto způsobem je možno použít daleko nižší dávku než při běžné substituční léčbě za jednotku času.

• Dosažení stálých koncentrací v krevním oběhu:

Při běžném substitučním léčení estrogenů dochází ke kolísání koncentrace těchto látek v krvi v jednotlivých dnech, jak je zřejmé z obr. 5, 6 a 7, kdežto při podávání J995 je možno dosáhnout velmi stálé dlouhotrvající koncentrace v krevním oběhu, jak je zřejmé z obr. 5, 6,

7, 8, 9 a 10. Zejména z obr. 9 je zřejmá téměř stálá koncentrace estronsulfátu, která odráží tvorbu estradiolu a estronu 14 dnů po podání J995 ve velmi nízké dávce 100 μς denně po 144 hodinách.

• Účinek estradiolsulfamátu na kostní tkáň:

Při běžném perorálním podávání estrogenů nemůže být dosaženo stálé a dobře definované koncentrace v krevním oběhu. Podáváním J995 je možno zajistit ochranu kostní tkáně při dávkách, které se nacházejí pod prahem, který vyvolává růst endometria. Nepřítomnost účinku na endometrium je velmi výhodné vzhledem k tomu, že J995 je možno použít bez současného podávání progestinů.

Zlepšení, jichž je možno dosáhnout při léčení, založeném pouze na J995 • Nepřítomnost krvácení:

Při podávání kombinace estrogenu a progestinu k potlačení proliferace endometria vzniká riziko vzniku zhoubných nádorů endometria. Cenou za tento ochranný účinek je krvácení z dělohy, které je pravděpodobně nejčastější a nejdůležitější příčinou přerušení substitučního léčení estrogeny.

• Vliv na celkový zdravotní stav:

Dalším prokázaným negativním faktorem tohoto léčení je tedy snížení pozitivních účinků, které by mohly estrogeny mít na celkový zdravotní stav u žen v klimakteriu.

• Vliv na mléčnou žlázu:

Není vyřešena otázka proliferativního účinku progestinu v mléčné žláze ve srovnání s progesteronem v těhotenství. Uvažuje se o tom, že by mohlo dojít k potenciální stimulaci růstu zhoubných nádorů mléčné žlázy.

• Metabolické vedlejší účinky:

Progestiny mají stejně jako progesteron důležité účinky na široké spektrum metabolických funkcí. Tyto funkce zahrnují sekreci inzulínu nebo mohou vyvolat ·· ·« » 0 9 » 9 9·· odolnost proti inzulínu a další účinky na metabolismus lipidů. Jde o nežádoucí účinky substitučního léčení podáváním estrogenů.

Význam substitučního léčení estrogeny:

U žen dochází po menopauze ke stálému úbytku kostní tkáně, jakmile ustane vylučování estrogenů vaječníky. Vzhledem k tomu, že průměrná délka života žen je velmi vysoká a stále se zvyšuje, je velmi účelné zabránit ztrátě kostní tkáně a s tím spojené lomivosti kostí. Jde totiž o nejdůležitější rizikový faktor zdravotní neschopnosti a nemocností a ve vysokém věku také úmrtnosti žen.

Je zřejmé, že by bylo možno uskutečnit ještě celou řadu různých modifikací a variací, rovněž spadajících do rozsahu vynálezu. Přestože vynález byl popsán v souvislosti s několika specifickými výhodnými provedeními, není možno jej na popsaná provedení omezit.

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje i) sloučeninu obecného vzorce I

   R.

   ^K V) kde

   X znamená kruh, odvozený od uhlovodíku a obsahující alespoň 4 atomy v kruhu,

   K znamená skupinu, odvozenou od uhlovodíku a

   R_s znamená sulfamátovou skupinu, ii) popřípadě ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem, pomocnou látkou, ředidlem nebo jiným pomocným prostředkem, přičemž sloučenina je přítomna v'množství, v němž je možno dosáhnout dávky nejvýš 200 μρ/den.
2. 2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce I v množství, při němž je možno dosáhnout dávky 10 až 200 μς/άβη.
3. 3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící tím, že obsahuje

   9 9

   9« • 9 99

   9 9 9 9

   9 9 9

   9·

   9 9 9

   9 9 9

   9 9 · ·« sloučeninu obecného vzorce I v množství, při němž je možno dosáhnout dávky 50 až 200 μς/Ηβη.
4. 4. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce I v množství, při němž je možno dosáhnout dávky 20 až 50 μ9/άθη.
5. 5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce I v množství 200 μg/dávka.
6. 6. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce I v množství 1 mg/dávka.
7. 7. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce I v množství 4 mg/dávka.
8. 8. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 7,vyznačující se tím, že v obecném vzorci I napodobuje X v kombinaci s K steroidní strukturu.
9. 9. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 8,vyznačující se tím, že v obecném vzorce I znamená K cyklickou skupinu.
10. 10. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 9,vyznačující se tím, že v obecném vzorci I znamená X β-členný kruh.

    • 9 94

    4 9 9 « • · « • 4 ·

    9 9 9 ·· ··«« • ♦ ♦ « · 9 ·

    9 94 4 4 9·4

    4 4 9 4 9 9 4 9 • 4 4 4 9 4 9

    9999 49 94 94
11. 11. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že v obecném vzorci I obsahuje X šest atomů v kruhu.
12. 12. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 11 vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje sloučeninu obecného vzorce II kde R_s,

    X a K mají význam, uvedený v nároku 1.
13. 13. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že v obecném vzorci účinné látky X v kombinaci s K znamená steroidní strukturu,
14. 14. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že v obecném vzorci účinné látky X v kombinaci s K vytváří steroidní strukturu.
15. 15. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 14,vyznačující se tím, že skupina R_s se nachází v poloze 3 kruhu X.
16. 16. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že R_s znamená sulfamátovou skupinu.
17. 17. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje sloučeninu obecného vzorce III

    R

    R,

    K (///) kde X, K a R_s mají význam, uvedený v nároku 1,

    Rhl znamená případný atom halogenu,

    Rh2 znamená případný atom halogenu, přičemž je přítomna alespoň jedna ze skupin Rhl a Rh2.
18. 18. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že Rhl se nachází v poloze 2 kruhu X.
19. 19. Farmaceutický prostředek podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se tím, že Rh2 se nachází v poloze 4 kruhu X.
20. 20. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že se sloučenina obecného vzorce I volí z následujících látek

    OH

    O

    OH

    17α estradiol-3-sul f amat estron -3-sul f amát (EMATE)

    OH estriol-3-sul j amát
21. 21. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1až 20 pro použití v lékařství.
22. 22. Použití farmaceutického prostředku podle některého z nároků 1 až 20 pro výrobu léčiva pro použití k perorální antikoncepci.
23. 23. Použití farmaceutického prostředku podle některého z nároků 1 až 20 pro výrobu léčiva pro použití pro substituční hormonální léčbu.
24. 24. Použití farmaceutického prostředku podle některého z nároku 1 až 20 pro výrobu léčiva, určeného pro substituční hormonální léčbu k ochraně kostní tkáně bez stimulace endometria.
25. 25. Použití farmaceutického prostředku podle některého z nároků 1 až 20 pro výrobu léčiva pro použití k léčení chorob, spojených s STS.

    • · • · • · ·· • ·
26. 26. Použití farmaceutického prostředku podle některého z nároků 1 až 20 pro výrobu léčiva pro použití k léčení chorobných stavů nebo onemocnění, vyvolaných nežádoucí koncentrací STS.