SI9720050A - Multivalentne DTP-polio vakcine - Google Patents

Abstract

Opisan je multikomponentni vakcinski sestavek, ki obsega acelične pertusisne vakcinske komponente, difterični toksoid, tetanusni toksoid in aktivirani poliovirus. Sestavek lahko vsebuje tudi konjugat kapsularnega polisaharida Haemophilus influenzae tipa b in tetanusnega toksoida ali difteričnega toksoida, katerega lahko rekonstruiramo iz liofiliziranega stanja z drugimi komponentami vakcine. Dajanje multiple komponente vakcine nima za posledico zmanjšanja imunogenosti katerekoli komponente kot rezultata interference z ostalimi komponentami vakcine.ŕ

Description

Predloženi izum se nanaša na multivalentne vakcine za, še zlasti, pediatrično dajanje.

Sklic na sorodno na prijavo

Ta prijava je delna nadaljevalna prijava ameriške patentne prijave št. 08/501,743, vložene 12. julija 1995, ki je istočasno v postopku, katera pa je sama delna nadaljevalna prijava ameriške patentne prijave št. 08/433,646, vložene 4. maja 1995, kije istočasno v postopku.

Ozadje izuma

Oslovski kašelj ali pertusis je resna, zelo nalezljiva infekcija gornjega respiratornega trakta, katero povzroča Bordetella pertussis. Svetovna zdravstvena organizacija ocenjuje, da je lemo 60 milijonov primerov pertusisa in 0,5 do 1 milijon z njim povezanih smrti (ref. 1). Skozi ta opis so v oklepajih navedene različne reference z namenom, da bi bolj popolno opisali stanje tehnike, na katerega se nanaša predloženi izum. Polno bibliografsko informacijo za vsako referenco najdemo na koncu opisa, čemur takoj sledijo zahtevki. Opisi teh referenc so tukaj vključeni z navedbo v predloženem opisu. V nevakciniranih populacijah je bila pri otrocih, mlajših od 5 let, opažena celo 80 % stopnja pojavnosti pertusisa (ref. 2). Čeprav se pertusis splošno smatra za otroško bolezen, pa obstaja rastoča prisotnost klinične in asimptomatične bolezni pri adolescentih in odraslih (ref. 3, 4 in 5).

Uvedba celoceličnih vakcin, sestavljenih iz kemično in toplotno inaktiviranih organizmov B. pertussis, leta 1940, je bila odgovorna za dramatično zmanjšanje pojavnosti oslovskega kašlja, povzročenega z B. pertussis. Nivoji učinkovitosti za celocelične vakcine so bili v odvisnosti od posamezne definicije ocenjeni do 95 % (ref. 6). Medtem ko daje infekcija z B. pertussis doživljensko imunost, obstajajo povečani dokazi za pojemajočo zaščito po imunizaciji s celoceličnimi vakcinami (ref.

3), Več poročil navaja razmerje med celocelično pertusisno vakcinacijo, reaktogenostjo in resnimi stranskimi učinki, ki so vodili do upadanja v sprejemljivosti vakcine in posledični obnovljeni epidemiji (ref. 7). Nedavno so bile razvite definirane komponentne pertusisne vakcine.

Antigeni za definirane pertusisne vakcine

Razvite so bile različne acelične pertusisne vakcine, ki vključujejo antigene Bordetella pertussis, pertusisni toksin (PT), filamentni hemaglutonin (FHA), 69 kDa protein zunanje membrane (pertaktin) in fimbrijalne aglutinogene (glej tabelo 1 spodaj. Tabele so na koncu opisa).

Pertusisni toksin

Pertusisni toksin je eksotoksin, ki je član A/B družine bakterijskih toksinov z ADP-riboziltransferazno aktivnostjo (ref. 8). A-del teh toksinov izraža ADP-riboziltransferazno aktivnost in B- del posreduje vezavo toksina na celične receptorje gostitelja in translokacijo A na njegovo mesto delovanja. PT omogoča tudi pritrditev B. pertussis na cilirane epitelijske celice (ref. 9) ter igra tudi vlogo v invaziji makrofagov z B. pertussis (ref. 10).

Vse acelične pertusisne vakcine so vključevale PT, ki je bil smatran kot glavni virulentni faktor in zaščitni antigen (ref. 11, 12). Naravna infekcija z B. pertussis generira tako humoralne, kot celično-posredovane odzive na PT (ref. 13 do 17). Otroci imajo transplacentalno-izvedena anti-PT protitelesa (ref. 16, 18) in humano mlezivo. ki vsebuje anti-PT protitelesa, je bilo učinkovito v pasivni zaščiti miši proti aerosolni infekciji (ref. 19). Celično posredovan imunski (CMI = cell-mediated immune) odziv na PT podenote se je pokazal po imunizaciji z acelično vakcino (ref. 20) in CMI odziv na PT se je generiral po celocelični vakcinaciji (ref. 13). Kemično inaktiviran PT v celocelični ali komponentni vakcini je zaščiten (protektiven) tako pri živalskih modelih, kot pri ljudeh (ref. 21). Še več, monoklonalna protitelesa, specifična za podenoto Sl, ščitijo proti infekciji z B. pertussis (ref. 22 in 23).

Glavni patofiziološki učinki PT so posledica njegove ADP-riboziltransferazne aktivnosti. PT katalizira transfer ADP-riboze iz NAD na G; gvanin nukleotid-vezoči protein, s čimer razbije celični regulacijski sistem adenilat ciklaze (ref. 24). PT preprečuje tudi migracijo makrofagov in limfocitov na mesta vnetja ter moti nevtrofilno-posredovano fagocitozo in ubijanje bakterij (ref. 25). Za določitev encimatske aktivnosti Sl in/ali PT so se uporabljali številni in vitro in in vivo testi, vključno z ADP-ribozilacijo govejega transducina (ref. 26), testom grupiranja CHO celic (Chinese Hamster Ovary = CHO) (ref. 27), histaminsko senzibilizacijo (ref. 28), levkocitozo in NAD glikohidrolazo. Kadar so izpostavljene PT, CHO celice razvijejo značilno gručasto morfologijo. Ta fenomen je odvisen od vezave PT in naknadne translokacije ter ADP-riboziltransferazne aktivnosti Sl, zaradi česar se test grupiranja CHO celic široko uporablja za testiranje integritete in toksičnosti PT holotoksinov.

Filamentni hemaglutinin

Filamentni hemaglutinin je velik (220 kDa) netoksični polipeptid, ki posreduje pri pritrditvi B. pertussis na ciliirane celice gornjega respiratornega trakta med bakterijsko kolonizacijo (ref. 9, 29). Naravna infekcija inducira anti-FHA protitelesa in celično posredovano imunost (ref. 13, 15, 17, 30 in 31). Anti-FHA protitelesa se nahajajo v človeškem mlezivu, posredujejo pa se tudi transplacentalno (ref. 17, 18 in 19). Vakcinacija s celoceličnimi ali aceličnimi pertusisnimi vakcinami generira anti-FHA protitelesa in acelične vakcine, ki vsebujejo FHA, inducirajo tudi CMI odziv na FHA (ref. 20, 32). FHA je zaščitni antigen v mišjem modelu respiratornega izziva modelu aktivni ali pasivni imunizaciji (ref. 33, 34). Vendar pa FHA sam ne ščiti v testu jakosti mišjega intracerebralnega izziva (ref. 28).

kDa protein zunanje membrane (pertaktin) kDa protein je protein zunanje membrane, katerega so prvotno identificirali iz

B.bronchiseptica (ref. 35). Ta protein je znan tudi kot pertaktin in P.69. Pokazalo se je, daje zaščitni antigen proti B. bronchiseptica in naknadno je bil identificiran tako v

B. pertussis, kot v B. parapertussis. 69 kDa protein se veže neposredno na evkariotične celice (ref. 36) in naravna infekcija z B. pertussis inducira anti-P.69 humoralni odziv (ref. 14), P.69 pa inducira tudi celično posredovan imunski odziv (ref. 17, 37, 38). Vakcinacija s celocelično ali acelično vakcino inducira anti-P.69 protitelesa (ref. 32, 39) in acelične vakcine inducirajo P.69 CMI (ref. 39). Pertaktin ščiti miši proti aerosolnemu izzivu z B. pertussis (ref. 40) in v kombinaciji s FHA ščiti v testu intracerebralnega izziva proti B. pertussis (ref. 41). Pasivni transfer poliklonalnih ali monoklonalnih anti-P.69 protiteles ščiti miši tudi proti aerosolnemu izzivu (ref. 42).

Aglutinogeni

Serotipi B. pertussis so definirani s svojimi aglutinirajočimii fimbrijami. WH0 priporoča, da celocelične vakcine vključujejo aglutinogene (Agg) tipov 1, 2 in 3, ker le-ti niso navzkrižno-zaščitni (ref. 43). Agg 1 je nefimbrijalen in se nahaja na vseh sevih B. pertussis, medtem ko sta serotipa 2 in 3 Agg fimbrijalna. Naravna infekcija ali imunizacija s celoceličnimi ali aceličnimi vakcinami vključuje anti-Agg protitelesa (ref. 15, 32). Specifični celično posredovan imunski odziv je lahko izzvan pri miših z Agg 2 in Agg 3 po aerosolni infekciji (ref. 17). Agg 2 in 3 sta zaščitna pri miših proti respiratornem izzivu in človeško mlezivo, ki vsebuje anti-aglutinogene, bo ščitilo tudi v tem testu (ref. 19, 44, 45).

Acelične pertusisne vakcine

Prva razvita acelična pertusisna vakcina je bila dvokomponentna PT + FHA vakcina (JNIH 6) Satoa in sod. (ref. 46). To vakcino so pripravili z istočasnim čiščenjem PT in

FHA antigenov iz supematanta kulture B. pertussis seva Tohama, čemur je sledila formalinska toksoidacija (zastrupitev). Acelične vakcine različnih izdelovalcev in različnih sestav se uspešno uporabljajo za imunizacijo japonskih otrok proti oslovskemu kašlju že od 1981, kar je imelo za rezultat dramatično zmanjšanje v pojavnosti bolezni (ref. 47). JNIH 6 vakcina in monokomponentna PT toksoidna vakcina (JNIH 7) sta bili testirani v velikem kliničnem testu na Švedskem leta 1986. Začetni rezultati so kazali na nižjo učinkovitost, kot je bila poročana učinkovitost celocelične vakcine, toda zasledovalne študije so pokazale, da je bolj učinkovita proti blažji bolezni, diagnosticirani s serološkimi metodami (ref. 48, 49, 50, 51). Pri teh vakcinah pa je obstajal dokaz za vrnitev v prvotno stanje toksičnosti formalinskoinaktiviranega PT. Ugotovljeno je bilo tudi, da te vakcine bolj ščitijo proti bolezni, kot proti infekciji.

Ocenjene so bile številne nove acelične in komponentne pertusisne vakcine, ki vključujejo kombinacije PT, FHA, P.69 in/ali aglutinogenov, in ki so navedene v tabeli 1. Za kemično detoksifikacijo PT je bilo uporabljenih več tehnik, vključno z inaktivacijo s formalinom (ref. 46), glutaraldehidom (ref. 52), vodikovim peroksidom (ref. 53) in tetranitrometanom (ref. 54).

Tetanus

Tetanus je akutna infekcija, povzročena s Clostridium te tani. Za bolezen so značilne resne boleče mišične kontrakcije, katere spremlja hipersenzibilnost, hiperrefleksija in povečana avtonomna stimulacija prizadetega(ih) telesnega(ih) dela(ov). Blage stimulacije lahko povzročijo resne refleksne mišične krče. Zaradi ekstremnega mišičnega krča je lahko prisotna vročina. Tetanus je lahko posplošen, pri čemer vključuje obraz, vrat, trebuh in trup, ali pa je lokaliziran na specifični telesni del (prizadeto mesto). Če je vključena žvečilna mišica obraza, ima to za posledico trirnus ali otrpni krč, kar povzroči klasični izraz obraza znan kot risus sardonicus (ref. 78).

C. tetani obstaja kot nepatogen organizem v črevu ljudi in živali. Organizem najdemo tudi v zemlji, kontaminirani s fekalijami, in v zemlji lahko preživi leta v obliki infekcijskih spor (ref. 79).

Tetanus je posledica anaeorobne rasti C. tetani in nevrotoksinske produkcije v kontaminiranih ranah. Infekcijo povzroči uvedba materialov, kontaminiranih z organizmi ali sporami, v tkivo. Najbolj običajen scenarij je infekcija preko penetracijske poškodbe. Vendar pa v mnogih primerih ni mogoče dobiti zgodovine poškodbe. Prisotnost nekrotičnega ali ishemskega tkiva pospešuje rast bacila (ref. 78).

Infekcijo preprečimo z vakcinacijo in z dobro oskrbo rane, vključno s skrbnim čiščenjem in odstranitvijo debrisa devatiliziranih tkiv. Posameznikom s kontaminiranimi ranami, in ki niso prejeli serij, moramo dati tako tetanusno vakcino, kot tetanusni imunski globulin.

Zdravljenje sindroma je v glavnem podporno in lahko vključuje respiratorno podporo, dajanje tetanusnega antitoksina in skrbno čiščenje inficiranih ran. Kljub sodobni medicinski oskrbi je nivo smrtnosti primerov še vedno visok, od 30 do 90 % (ref. 97). To še zlasti velja pri starejših. Naravna infekcija ne proizvede vedno imunosti pred nadaljnjo infekcijo.

Preprečevanje infekcije z vakcinacijo je najbolj učinkovita metoda kontrole bolezni. Od uvedbe univerzalne vakcinacije je postal tetanus v razvitih državah izredno redek. Primeri se pojavljajo skorajda izključno pri posameznikih, ki niso dokončali svoje serije vakcinacij, ali ki niso prejeli ustreznih poživilnih odmerkov. Posamezniki morajo prejeti poživilni odmerek enkrat vsakih 10 let.

Difterija

Difterija (davica) je akutna infekcija, povzročena z bakterijo Corynebacterium diphtheriae. Glavno mesto infekcije je zgornji respiratorni trakt (nos, farinks, larinks in traheja) (ref. 80). Karakteristična lezija, rezultat bakterijskega citotoksina, so madeži sivkaste psevdo-membrane, obkroženi z vnetjem. To spremlja cervikalna limfadenopatija, otekanje in edemi žrela. V resnih primerih lahko otekanje napreduje do točke obstrukcije (laringealna difterija). Ostale komplikacije vključujejo miokarditis, učinke na centralni živčni sistem (kranialne, motorične in senzorične nevropatije, kot je naraščajoča paraliza) in trombocitopenija. Manj pogosto so lahko prizadete ostale sluznične membrane. Klinična prezentacija lahko variira od asimptomatične infekcije, do bliskovitega multisistema in smrti (ref. 79). Infekcije kože in ran z difterijo so običajne v tropih in o njih pogosto poročajo pri revni populaciji ZDA. Edini rezervoar za C. diphtheriae je človek (ref. 79).

Verjetna diagnoza je lahko narejena na osnovi kliničnega opazovanja karakterističnih lezij, toda potrjena mora biti z bakterijskim preizkusom lezij. Če obstaja močan kliničen sum difterije (davice), je takoj potrebno začeti zdravljenje z antibiotiki (penicilin ali eritromicin) in difteričnim antitoksinom, tudi če diagnoza ni potrjena. Smrtnost narašča, kolikor dlje po začetku kliničnih simptomov čakamo (ref. 80). Nivo smrtnosti primerov je kljub sodobni medicinski oskrbi v območju od 5 do 10 % (ref 79) in se v glavnem pojavlja pri zelo mladih in pri starejših. Naravna infekcija ne proizvede vedno imunosti pred nadaljnjo infekcijo (ref. 80).

Prenaša se z neposrednim stikom z izločki ali gnojem iz inficiranega posameznika. Posamezniki so kužni toliko časa, kolikor časa v izločkih opazimo bakterijo. To lahko traja do 4 tedne po infekciji. Prenašanje se lahko pojavi tudi z inficiranimi izbljuvki (ref. 79). Priporoča se stroga izolacija primerov.

Redkeje lahko posamezniki postanejo nosilci in prenašalni organizmi do 6 mesecev po infekciji. Neimunizirane nosilce je potrebno promtno vakcinirati s polnimi serijami. Zdravljenje z antibiotiki eliminira sposobnost nošenja in infektivnost primerov v 4 dneh (ref. 80).

Poliomelitis

Širom po svetu sta bili v nadzorovanju poliomelitisa učinkoviti tako inaktivirana (IPV), kot živa oslabljena (atenuirana) (OPV) poliovirusna vakcina. Kombinirana DPT-IPV vakcina je trenutno dovoljena za uporabo v Evropi in Kanadi in pokazala se je kot vama in učinkovita pri miljonih otrok širom po svetu.

Haemophilus influenzae tipa b

Predno so bile na razpolago učinkovite vakcine za Haemophilus influenzae tipa b (Hib), je bil le-ta pri malih otrocih glavni vzrok meningitisnih invazivnih infekcij, ki se prenašajo s krvjo, in bil je glavni vzrok meningitisa v prvih dveh letih življenja (ref. 81). Približno 10 % žrtev Haemophilus influenzae meningitisa umre kljub medicinski oskrbi. Pri preživelih so običajna permanentno slaba zdravstvena stanja. Imunizacija proti Haemophilus influenzae seje v Kanadi pričela leta 1987 s polisaharidno vakcino (poliriboza ribitol fosfat [PRP] iz Haemophilus influenzae tipa b). Leta 1988 je bila dosežena izboljšana imunogenost pri otrocih, starosti 18 mesecev in starejših, z uvedbo vakcine, katero je tvoril PRP, konjugiran na difterični toksoid (PRP-D). Od 1992 je možna imunizacija otrok z dovoljenimi PRP konjugatnimi vakcinami, ki so imunogene pri otrocih, mlajših od enega leta (PRP konjugiran s tetanusnim toksoidom ali PRP-T). Uporaba teh Haemophilus influenzae konjugatnih vakcin je povezana z dramatičnim zmanjšanjem v pojavnosti invazivne infekcije s Haemophilus v Kanadi in drugod (ref. 82). Dve kanadski klinični študiji, ki sta vključevali skoraj 900 otrok v britanski Kolumbiji in Alberti, sta pokazali, da je lahko liofiliziran PRP-T, poleg z običajnim razredčilom, slanico, rekonstituiran tudi z DPT (COMBIPACK) (ref. 83) ali z adsorbiranim DPT-polio (ΡΕΝΤΑ™) (ref. 84). Klinične študije, ki so vključevale več kot 100000 otrok po svetu, so pokazale učinkovitost liofiliziranega PRP-T(ActHib™). Nad 90 % jih je doseglo anti-PRP nivoje, ki se smatrajo kot zaščitni (>0,15 μg/ml) po 3 odmerkih PRP-T s pričetkom v starosti 2 mesecev, ali po posamičnem odmerku PRP-T, katerega se daje po starosti 12 mesecev. Razmerje doseženih nivojev, ki so indikativni za dolgotrajno zaščito (>l,0 pg/ml), variira, odvisno od študije, od 70 do 100 %. Od 1. 1992 je bilo v Kanadi prodanih milijone odmerkov PRP-T. Primeri izbruha invazivne haemophilus infekcije po vakcinaciji s PRP-T so redki in jih lahko povezujemo z boleznimi, kot je imunska nezadostnost (ref. 85).

Kombinirane vakcine

Čeprav obstajajo številne dejanske in potencialne koristi vakcin, ki združujejo antigene, ki dajejo zaščito proti večim patogenom, imajo te kombinacije lahko škodljiv učinek na imunogenost posameznih komponent. Kombinacije difteričnega in tetanusnega toksoida s celocelično pertusisno vakcino (DTP) so bile na razpolago več kot 50 let in protitelesih odziv na kombinacijo je boljši od tistega na posamezne komponente, morda kot rezultat adjuvansnega učinka celocelične pertusisne vakcine. DTP kombinacije, ki vključujejo tudi inaktivirano poliovirusno vakcino, imajo dovoljenje za uporabo v mnogih državah, čeprav se lahko protitelesih odziv na pertusisne antigene s to kombinacijo zmanjša (ref. 69 do 71). Učinek združevanja DTP vakcin s Hib konjugatno vakcino je bil variabilen. Študije s francosko DTP in PRPT so pokazale podobno varnost, toda zmanjšan prohtelesni odziv na PRP (ref. 72 do 73), medtem ko študije s kanadsko DTP in PRPT vakcino niso pokazale učinka na PRP odziv, a so pokazale nižje pertusisne aglutinogene in povečano občutljivost mesta injiciranja pri kombinirano imunizirani skupini (ref. 74, 75).

Sedaj so razpoložljivi podatki o učinku združevanja APDT vakcin s Hib konjugatno vakcino. Pri dva meseca starih otrocih, katerim smo dali tri odmerke acelične pertusisdifterija-tetanus vakcine (APDT), združene z Hib konjugatno vakcino (PRP-T), je bil prohtelesni odziv na PRP signifikantno nižji v skupini, kateri so bile dane ločene injekcije na isti dan (ref. 76). Podobni rezultati so bili poročani še za eno acelično pertusis-difterija-tetanus vakcino, združeno s PRP-T, ki je bila dajana za prve tri odmerke (ref. 77).

V nasprotju z ostalimi poročanimi študijami, so imeli otroci, ki so bili imunizirani s kombinirano vakcino, superiorni prohtelesni odziv na PRP, difterijo in na več izmed pertusisnih antigenov, če smo jih primerjali z otroki, katerim je bil PRP dajan ob ločenih obiskih. Obstaja lahko več razlogov za ekvivalentno ali boljšo imunogenost za te vakcine, kadar jih dajemo kot kombinirano injekcijo, v primerjavi z zmanjšano imunogenostjo, o kateri poročajo z ostalimi produkti. Vse acelične in komponentne pertusisne vakcine niso identične v svoji antigenski vsebnosti, metodi toksoidiranja, adjuvansu ali konzervansu. Tako so poročali o zmanjšani imunogenosti z aceličnimi pertusisnimi vakcinami, ki vsebujejo PT, FHA in 69K (ref. 77), in ki vsebujejo PT, FHA, 69K in fimbrije (ref. 76).

V fazi III kliničnega poizkusa, ki je bil nedavno zaključen na Švedskem pod okriljem Nacionalnega inštituta za zdravje (ref. 78), so ugotovili, da ima petkomponentna APDT vakcina, ki je bila preiskovana v tej študiji, 85 % protektivno učinkovitost (primer 5) (95 % Cl 81/89)

Kombinirane vakcine, ki so trenutno na razpolago na trgu, lahko tudi ne vsebujejo ustreznih formulacij ustreznih antigenov v ustreznih imunogenskih oblikah za doseganje želenega nivoja učinkovitosti pri Človeški populaciji, občutljivi na pertusis.

Želeno bi bilo, da zagotovimo učinkovite kombinirane vakcine, ki obsegajo acelične pertusisne komponente, ki vsebujejo izbrane relativne količine izbranih antigenov.

Povzetek izuma

Predloženi izum se nanaša na kombinirane ali multivalentne vakcine, ki vsebujejo acelične pertusisne vakcinske komponente in na postopke za njihovo uporabo.

Po enem vidiku predloženega izuma je podan multivalentni imunogenski sestavek za dajanje zaščite gostitelju proti bolezni, povzročeni z infekcijo z Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, poliovirusom in/ali Haemophilus influenzae, ki obsega:

(a) pertusisni toksoid, filamentni hemaglutinin, pertaktin in aglutinogene v očiščeni obliki.

(b) tetanusni toksoid, (c) difterični toksoid, (d) inaktiviran poliovirus in, po izbiri, (e) konjugat nosilne molekule, izbran izmed tetanusnega toksoida in difteričnega toksoida ter kapsulamega polisaharida Haemophilus influenzae tipa b.

Imunogenski sestavek je lahko formuliran kot vakcina za in vivo dajanje gostitelju, pri čemer so posamezne komponente sestavka formulirane tako, da imunogenost posameznih komponent ni poslabšana z ostalimi posameznimi komponentami sestavka.

imunogenski sestavek lahko nadalje obsega adjuvans, še zlasti aluminijev hidroksid ali aluminijev fosfat.

Takšen imunogenski sestavek lahko vsebuje okoli 5 do okoli 30 μg dušika pertusisnega toksoida, okoli 5 do okoli 30 pg dušika filamentnega hemaglutinina, okoli 3 do okoli 15 pg dušika pertaktina in okoli 1 do okoli 10 μg dušika aglutinogenov.

V specifični izvedbi lahko imunogenski sestavek obsega pertusisni toksoid, fimbrijalni hemaglutinin, 69 kDa protein in filamentne aglutinogene Bordetella pertussis v masnem razmerju okoli 20:20:5:3, kar zagotovimo z okoli 20 μg pertusisnega toksoida, okoli 20 pg filamentnega hemaglutinina, okoli 5 pg fimbrijalnih aglutinogenov in okoli 3 pg 69 kDa proteina v posamezni humani dozi. V še eni specifični izvedbi lahko vakcina obsega pertusisni toksoid, filamentni hemaglutinin, 69 kDa protein in fimbrijalni aglutinogen Bordetella pertussis v masnem razmerju 10:5:5:3, kar zagotovimo z okoli 10 pg pertusisnega toksoida, okoli 5 pg filamentnega hemaglutinina, okoli 5 pg fimbrijalnega aglutinogena in okoli 3 pg 69 kDa proteina v posamezni humani dozi. V eni izvedbi imunogenskega sestavka, ki je podan tukaj, vsebuje vakcina okoli 15 Lf difteričnega toksoida in okoli 5 Lf tetanusnega toksoida.

Inaktiviran poliovirus, katerega uporabimo v imunogenskem sestavku v smislu izuma, splošno obsega zmes inaktiviranih poliovirusov tipa 1, 2 in 3. Takšno zmes inaktiviranih poliovirusov tipa 1, 2 in 3 lahko uporabimo v sestavkih:

okoli 20 do okoli 50 D antigenskih enot poliovirusa tipa 1 okoli 5 do okoli 10 D antigenskih enot poliovirusa tipa 2 okoli 20 do okoli 50 D antigenskih enot poliovirusa tipa 3 v posamezni humani dozi.

V eni formulaciji lahko takšna zmes inaktiviranih poliovirusnih tipov obsega: okoli 40 D antigenskih enot poliovirusa tipa 1;

okoli 8 D antigenskih enot poliovirusa tipa 2;

okoli 32 D antigenskih enot poliovirusa tipa 3;

v posamezni humani dozi.

Konjugatna molekulska komponenta imunogenskega sestavka lahko obsega konjugat tetanusnega toksoida ali difteričnega toksoida in poliriboza ribitol fosfata (PRP) Haemophilus influenzae tipa b. Takšno konjugatno molekulo lahko pripravimo v liofilizirani obliki, katero za dajanje rekonstituiramo z združevanjem z drugimi komponentami. Imunogenski sestavek lahko vsebuje v posamezni humani dozi konjugat v količini od okoli 5 do okoli 15 pg PRP, konjugiranega na okoli 15 do okoli 35 pg tetanusnega toksoida. V eni formulaciji uporabimo konjugat v količini okoli 10 pg PRP, konjugiranega na okoli 20 pg tetanusnega toksoida.

V takšnih določenih izvedbah imunogenski sestavki zagotovijo profil imunskega odziva na vsakega od vsebovanih pertusisnih antigenov in odzivni profil, ki ga zagotovijo acelične komponente, je v bistvu ekvivalenten tistemu, katerega proizvede celocelična pertusisna vakcina.

V prednostni izvedbi predloženega izuma je podan multivalentni vakcinski sestavek, ki na 0,5 ml dozo obsega 20 pg pertusisnega toksoida, 20 pg filamentnega hemaglutinina; 5 pg fimbrij 2 in 3; 3 pg membranskega proteina pertaktina; 15 Lf difteričnega toksoida; 5 Lf tetanusnega toksoida; poliovirus tipa 1 40 D antigenskih enot, poliovirus tipa 2 8 D antigenskih enot; 1,5 pg aluminijevega fosfata.

Takšen sestavek lahko nadalje na 0,5 ml doze obsega 10 pg očiščenega poliriboza ribitol fosfat kapsulamega polisaharida (PRP) Haemophilus influenzae tipa b, ki je kovalentno vezan na 20 pg tetanusnega toksoida. Poleg tega lahko takšni sestavki na 0,5 ml doze vsebujejo 0,6 % 2-fenoksietanola.

V nadaljnjem vidiku izuma je podan postopek imunizacije gostitelja proti večim boleznim, ki obsega dajanje gostitelju, ki je lahko človek, imunoučinkovite količine imunogenskega sestavka ali vakcine, kot je podan(a) tukaj.

Prednosti predloženega izuma vključujejo multivalentno vakcino, ki lahko na varen in učinkovit način daje zaščito proti vrsti običajnih otroških bolezni. Koristna je sposobnost, da zagotovimo posamično vakcinacijo proti večim boleznim, ne da bi prišlo do interference med imunogenskimi odzivi na različne imunogene.

Kratek opis slik

Predloženi izum bomo v nadaljevanju razložili z naslednjim podrobnim opisom in primeri ob sklicevanju na priloženo sliko, pri čemer je:

na sl. 1 shematski potek postopka izolacije aglutinogenskega pripravka iz seva Bordetella.

Podroben opis izuma

Aglutinogenski pripravek

Na sl. 1 je ponazorjen potek postopka za pripravo aglutinogenskega pripravka iz seva Bordetella. Kot je razvidno na sl. 1, Bordetella celično pasto, ki vsebuje aglutinogene, kot je B. pertussis celična pasta, ekstrahiramo npr. s pufrom, ki vsebuje sečnino, kot je mM kalijevega fosfata, 150 mM NaCl in 4M sečnine, da iz celične paste selektivno ekstrahiramo aglutinogene tako, da proizvedemo prvi supematant (spl), ki vsebuje aglutinogene in prvi rezidualni precipitat (pptl). Prvi supematant (spl) ločimo od prvega rezidualnega prerecipitata (pptl) tako, da ga odcentrifugiramo. Rezidualni precipitat (pptl) zavržemo. Očiščen supematant (spl) lahko nato koncentriramo in diafiltriramo proti, npr. 10 mM kalijevem fosfatu/150 mM NaCl/0,1 % Triton Χ-100 ob uporabi, npr. 100 do 300 kDa NMWL membranskega filtra.

Prvi supematant nato inkubiramo pri temperaturi in toliko Časa, da nastane očiščen supematant (sp2), ki vsebuje aglutinogene in drugi odpadni precipitat (ppt2), ki vsebuje neaglutinogenske kontaminante. Ustrezne temperature vključujejo okoli 50 °C do okoli 100 °C, vključno z okoli 75 °C do okoli 85 °C, in ustreženi inkubacijski časi obsegajo okoli 1 do okoli 60 minut. Očiščen supematant nato koncentriramo npr. z dodatkom polietilenglikola z molekulsko maso okoli 8000 (PEG 8000) do končne koncentracije okoli 4,5 ± 0,2 %, pri čemer rahlo mešamo vsaj okoli 30 minut, da dobimo tretji precipitat (ppt3), katerega lahko nato zberemo s centrifugiranjem. Preostali supematant sp3 zavržemo.

Ta tretji precipitat (ppt3) ekstrahiramo z, npr., pufrom, ki obsega 10 mM kalijevega fosfata/150 mM NaCl, da dobimo surovo raztopino, ki vsebuje fimbrijalni aglutinogen. K surovi fimbrijalni raztopini lahko dodamo 1 M kalijev fosfat, da jo napravimo okoli 100 mM glede na kalijev fosfat. Alternativno lahko očiščen supematant toplotno obdelanih fimbrijalnih aglutinogenov očistimo brez obarjanja z gelsko filtracijsko kromatografijo ob uporabi gela, kot je sefaroza CL6B. Fimbrijalne aglutinogene v surovi raztopini nato očistimo s kolonsko kromatografijo, kot npr. s prehodom skozi kolono PEI silicijev dioksid, da v eluatu proizvedemo fimbrijalni aglutinogenski pripravek.

Ta eluat, ki vsebuje fimbrijalni aglutinogen, lahko nadalje koncentriramo in diafiltriramo proti, npr., pufru, ki vsebuje 10 mM kalijevega fosfata/150 mM NaCl, ob uporabi 100-300 kDa NMWL membrane. Aglutinogenski pripravek lahko steriliziramo s filtracijo skozi < 0,22 μΜ membranski filter, da dobimo končni očiščeni fimbrijalni aglutinogenski pripravek, ki vsebuje fimbrijalni aglutinogen 2 in 3, v bistvu brez aglutinogena 1. Masno razmerje Agg 2 proti Agg 3 je lahko od okoli 1,5:1 do okoli 2:1.Vakcine lahko vsebujejo druge očiščene imunogene Bordetella, vključno s filamentnim hemaglutininom, 69 kDa proteinom zunanje membrane in pertusisnim toksinom ali njegovim toksoidom, vključno z genetsko detoksificiranimi analogi PT, kot je opisano npr. v ref. 68.

Ostali imunogeni Bordetella, pertusisni toksin (vključno z njegovimi genetsko detoksificiranimi analogi, kot je opisano v, npr., Klein et al, U.S. patent št. 5,085,862 pravice katerega so prenesene na prijavitelja in ki je tu vključen z referenco), FHA in 69 kDa protein lahko proizvedemo v očiščeni obliki z množico postopkov, kot so opisani spodaj.

Čiščenje PT

PT lahko izoliramo iz supematanta kulture seva B. pertussis z uporabo običajnih postopkov. Uporabimo lahko npr. postopek Sekura-e et al. (ref. 55). PT izoliramo tako, da najprej absorbiramo supematant kulture na kolono, ki vsebuje barvilo-ligand gelsko matrico, Affi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). PT eluiramo iz te kolone z visoko soljo, kot je 0,75 M magnezijev klorid in ga, po odstranitvi soli, spustimo skozi kolono matrice z afiniteto za fetuin-sefarozo, sestavljeno iz fetuina, vezanega na sefarozo, ki je aktivirana s cianobromidom. PT eluiramo iz fetuinske kolone z uporabo 4 M magnezijeve soli.

Alternativno lahko uporabimo postopek Ironsa et al. (ref. 56). Supematant kulture absorbiramo na kolono s CNBr-aktivirane sefaroze 4B, na katero se najprej kovalentno veže haptoglobin. PT se veže na absorbent pri pH 6,5 in iz kolone ga eluiramo z uporabo 0,1 M Tris/0,5M NaCl pufra tako, da postopoma spreminjamo pH do pH 10.

Alternativno lahko uporabimo postopek, opisan v U.S. patentu št. 4,705.686, podeljenem Scott-u et al 10. novembra 1987 in ki je tu vključen za referenco. V tem postopku supematante kulture ali celične ekstrakte B. pertussis spustimo skozi kolono anionske izmenjevalne smole z dovoljšno kapaciteto, da adsorbira endotoksin, toda ki omogoči, da antigeni Bordetella tečejo skoznjo ali da se kakorkoli drugače ločijo od endotoksina.

Alternativno lahko PT očistimo z uporabo biserne kromatografije, kot je opisano v EP patentu št. 336 736, pravice katerega so prenesene na prijavitelja in ki je tu vključen za referenco.

Detoksifikacija PT

PT detoksificiramo, da odstranimo nezaželene aktivnosti, ki bi lahko povzročile stranske reakcije končne vakcine. Uporabimo lahko kateregakoli izmed vrste konvencionalnih kemijskih detoksifikacijskih postopkov, kot je obdelava s formaldehidom, vodikovim peroksidom, tetranitrometanom ali glutaraldehidom.

PT lahko npr. detoksificiramo z glutaraldehidom z uporabo modifikacije postopka, ki ga so ga opisali Mimoz et al. (ref. 57). PT, očiščen v tem detoksifikacijskem postopku, inkubiramo v raztopini, ki vsebuje 0,01 M fosfatno napufrane slanice. Raztopino napravimo 0,05 %-no z glutaraldehidom in zmes inkubiramo pri sobni temperaturi 2 uri, in nato z L-lizinom naredimo 0,02 M. Zmes nadalje inkubiramo 2 uri pri sobni temperaturi, nato pa jo dializiramo 2 dni proti 0,01M PBS. V določeni izvedbi lahko uporabimo detoksifikacijski postopek EP patenta št. 336 736. Na kratko, PT lahko detoksificiramo z glutaraldehidom kot sledi:

Očiščen PT v 75 mM kalijevem fosfatu pri pH 8,0, ki vsebuje 0,22 M natrijev klorid, razredčimo z enakim volumnom glicerola do koncentracije proteina približno 50 do 400 μg/ml. Raztopino segrejemo na 37 °C in detoksificiramo z dodatkom glutaraldehida do končne koncentracije 0,5 % (m/v). Zmes vzdržujemo pri 37 °C 4 ure in nato dodamo aspartinsko kislino (1,5 M) do končne koncentracije 0,25 M. Zmes inkubiramo pri sobni temperaturi 1 uro in jo nato diafiltriramo z 10 volumni 10 mM kalijevega fosfata s pH 8,0, ki vsebuje 0,15 M natrijevega klorida in 5 % glicerola, da reduciramo glicerol in da odstranimo glutaraldehid. PT toksoid sterilno filtriramo skozi 0,2 μΜ membrano.

V kolikor za pripravo PT mutantne molekule, ki ni toksična ali je malo toksična, za uporabo kot toksoidirane molekule uporabimo rekombinantne tehnike, kemijska detoksifikacija ni potrebna.

Čiščenje FHA

FHA lahko očistimo iz supernatanta kulture v bistvu tako, kot so opisali Cowell et al. (ref. 58). Za povečanje dobitka FHA v supematantih kulture lahko uporabimo promotorje rasti, kot so metilirani beta-ciklodekstrini. Supematant kulture nanesemo na hidroksilapatitno kolono. FHA se adsorbira na kolono, PT pa ne. Kolono močno speremo s Tritonom Χ-100, da odstranimo endotoksin. Nato FHA eluiramo z uporabo 0,5 M NaCl v 0,1 M natrijevem fosfatu in, če je potrebno, spustimo skozi kolono fetuin-sefaroza, da odstranimo rezidualni PT. Dodatno čiščenje lahko vključuje prepust skozi kolono sefaroza CL-6B.

Alternativno lahko FHA očistimo z uporabo monoklonalnih protiteles na antigen, pri čemer se protitelesa pritrdijo na s CNBr-aktivirano afinitetno kolono (ref. 59).

Alternativno lahko FHA očistimo z uporabo biserne kromatografije, kot je opisano v zgoraj omenjenem EP 336 736.

Čiščenje 69 kDa proteina zunanje membrane (pertaktina) kDa protein zunanje membrane (69K ali pertaktin) lahko rekuperiramo iz bakterijskih celic tako, da najprej inaktiviramo celice z bakteriostatičnim sredstvom, kot je timerozal, kot je opisano v objavljenem EP 484 621 in je tukaj vključen kot referenca. Inaktivirane celice suspendiramo v vodnem mediju, kot je PBS (pH 7 do 8) in izpostavimo ponovni ekstrakciji pri povišani temperaturi (45 do 60 °C) ob naknadnem ohlajanju na sobno temperaturo ali 4 °C. Ekstrakcije iz celic sprostijo 69K protein. Material, ki vsebuje 69K protein, zberemo s precipitacijo in spustimo skozi kolono Affi-gel Blue. 69K protein eluiramo z visoko koncentracijo soli, kot je 0,5M magnezijev klorid. Po dializi ga spustimo skozi kromatofokusirajočo podlago.

Alternativno lahko 69 kDa protein očistimo iz gojitvenega supematanta B. pertussis kulture kot je opisano v objavljeni PCT prijavi WO 91/15505, na ime prijavitelja in ki je vključena tu kot referenca. Takšen postopek je prednosten, ker dobimo pertaktin brez adenilat ciklaznih barvilnih kromatografskih materialov.

Ostali ustrezni postopki čiščenja 69 kDa proteina zunanje membrane iz B. pertussis so opisani v U.S. patentu št. 5,276,142, podeljenem Gottu et al. 4. januarja 1984, in v

U.S. patentu št. 5,101,014, podeljenem Burnsu 31. marca 1992.

Ostale sestavine izuma

Vakcine v smislu izuma vsebujejo tudi ne-Bordetella imunogene, ki vključujejo tetanusni toksoid, difterični toksoid, inaktiviran poliovirus (IPV) in po izbiri, konjugat difteričnega toksoida ali tetanusnega toksoida in kapsulamega polisaharida Haemophilus influenuzae tipa b. Ostale možne komponente multikomponentnib vakcin vključujejo proteine zunanje membrane Haemophilus, površinskega antigena hepatitisa B, mumpsa, ošpic in rdečk.

Konjugate tetanusnega toksoida ali difteričnega toksoida in kapsulamega polisaharida Hib lahko formiramo tako, da izoliramo poliriboza ribitol fosfat (PRP), izoliran iz H. influenzae tipa b, izvedemo PRP, da dobimo dihidrazid adipinske kisline, in kovalentno konjugiramo na tetanusni toksoid ali difterični toksoid, da dobimo PRP-T ali PRP-D konjugate.

Vsakega izmed antigenov individualno absorbiramo na adjuvans, kot je aluminijev fosfat ali aluminijev hidroksid, skupno imenovana galun, da zagotovimo prikladno in hitro proizvodnjo vakcin, ki vsebujejo izbrane relativne količine teh antigenov v vakcinah, kot je podano tukaj.

Izbrane multivalentne vakcinske formulacije

V izbranih izvedbah izum zagotavlja vakcine z naslednjimi karakteristikami (pg proteinov, ki so uporabljeni tukaj, temeljijo na rezultatih Kjedahlovega testa, ki je bil izveden na očiščenih koncentratih, in so izraženi kot pg proteinskega dušika), pri čemer lahko vse dajemo z intramuskulamo injekcijo:

(a) CP₂o/₂o/5/3DT-mIPV (HIBRID).

Ena formulacija obsega kombinacijo komponentne pertusisne vakcine (CP), združene z difteričnim (Dl) in tetanusnim (T) toksoidom ter inaktiviranim poliovirusom (mIPY) in je imenovana CP₂o/2o/5/3DT-mIPV (HIBRID). Poliovirusi, gojeni na MRC-5 celicah, so imenovani mlPV, medtem ko so poliovirusi, gojeni na vero celicah, imenovani IPV ali vIPV. V formulacijah lahko izmenično uporabimo katerikoli inaktiviran poliovirusni material.

Vsaka 0,5 ml humana doza CP₂o/₂o/2O/5/3DT-mIPV (HIBRID) je formulirana tako, da vsebuje okoli:

pg pertusinega toksoida (PT) pg filamentnega hemaglutinina (FHA) pg fimbrijalnih aglutinogenov 2 in 3 (FIM) pg pertaktina proteina zunanje membrane (69kDa)

Lf difteričnega toksoida 5 Lf tetanusnega toksoida

D antigenskih enot poliovirusa tipa 1 8 D antigenskih enot poliovirusa tipa 2

D antigenskih enot poliovirusa tipa 3

1,5 mg aluminijevega fosfata

0,6 % 2-fenoksietanola, kot konzervans.

(b) CP_?n/2o/5/3DT-mIPV (HIBRID) + PRP-T:

Še ena formulacija obsega kombinacijo komponentne pertusisne vakcine (CP) združene z difteričnim (D) in tetanusnim (T) toksoidom ter inaktiviranim poliovirusom (mlPV) in je imenovana CP₂o/2o/5/3DT-mIPV (HIBRID), uporablja pa se jo za rekonstitucijo liofiliziranega PRP-T. Nastali sestavek vsebuje, na 0,5 ml dozo, okoli:

pg pertusisnega toksoida (PT) pg filamentnega hemaglutinina (FHA) pg fimbrijalnih aglutinogenov 2 in 3 (FIM) pg pertaktina proteina zunanje membrane (69 kDa)

Lf difteričnega toksoida 5 Lf tetanusnega toksoida pg očiščenega poliriboza ribitol fosfat kapsulamega polisaharida (PRP) Haemophilus influenzae tipa b, ki je kovalentno vezan na 20 pg tetanusnega toksoida poliovirusa tipa 1 40 D antigenskih enot poliovirusa tipa 2 8 D antigenskih enot poliovirusa tipa 3 32 D antigenskih enot

1,5 mg aluminijevega fosfata

0,6 % 2-fenoksietanola.

(c) CP20/20/3/3DT-PRP-T-IPV (HIBRID):

Dodatna formulacija obsega kombinacijo komponentne pertusisne vakcine (CP) združene z difteričnim (D) in tetanusnim toksoidom (T), inaktiviranim poliovirusom (mlPV) in PRP-T ter je imenovana CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV (HIBRID). Vsaka 0,5 ml humana doza tega sestavka vsebuje okoli:

pg pertusisnega toksoida (PT) pg filamentnega hemaglutinina (FHA) pg fimbrijalnih aglutinogenov 2 in 3 (FIM) pg pertaktina proteina zunanje membrane (69 kDa)

Lf difteričnega toksoida 5 Lf tetanusnega toksoida pg očiščenega riboza ribitol fosfat kapsulamega polisaharida (PRP) Haemophilus influenzae tipa b, ki je kovalentno vezan na 20 pg tetanusnega toksoida poliovirusa tipa 1 40 D antigenskih enot poliovirusa tipa 2 8 D antigenskih enot poliovirusa tipa 3 32 D antigenskih enot

1,5 mg aluminijevega fosfata

0,6 % 2-fenoksietanola.

Klinični testi (a) DTP komponentna pertusisna vakcina

Na ljudeh so bili izvedeni številni tukaj opisani klinični testi z namenom, da bi ugotovili varnost, nereaktogenost in koristnost komponentnih pertusisnih vakcin, ki vsebujejo fimbrijalne aglutinogene, pripravljene kot je opisano tukaj, za zaščito proti pertusisu. Se zlasti so bili pridobljeni imunski odzivi na vsakega izmed antigenov, ki jih vsebujejo vakcine (kot je prikazano, npr., v tabeli 3 spodaj). Da bi ugotovili učinkovitost vakcine proti tipičnem pertusisu, smo na rizični človeški populaciji določeno multivalentno pertusisno vakcino CP10/5/5/3DT analizirali v velikem placebokontroliranem, multi-centričnem, dvojno-naključnem kliničnem testu.

Definicija primera za tipično pertusisno bolezen je bila:

dni ali več spazmotičnega kašlja in vsak s kulturo potrjen B. pertussis, ali serološki dokaz specifične infekcije z Bordetella, indiciran s 100 % IgG ali IgA protitelesnim porastom v ELISA proti FHA ali PT v sparjenih serijah, ali če serološki podatki manjkajo, je bil otrok iz študije v stiku s primerom s kulturo potrjenega B. pertussis v gospodinjstvu, kateri je začel kašljati znotraj 28 dni pred ali po začetku kašlja pri otroku iz študije.

Rezultati te študije so pokazali, da je CP10/5/5/3DT okoli 85 %-no učinkovita v preprečevanju pertusisa, kot je definiran v definiciji primera za tipično pertusisno bolezen, kot je opisano zgoraj. V isti študiji je bila dvokomponentna pertusisna acelična vakcina, ki je vsebovala le PT in FHA, okoli 58 %-no učinkovita (PT;,. FHA25.DT) in celocelična pertusisna vakcina (DTP) je bila okoli 48 %-no učinkovita (glej tabelo 4 spodaj). Poleg tega je CP10/5/5/3DT vakcina preprečila blag pertusis, definiran kot kašelj, ki je trajal vsaj en dan, do učinkovitosti okoli 77 %. Še zlasti je bil profil dobljenega imunskega odziva v bistvu enak tistemu, ki smo ga dobili po imunizaciji s celoceličnimi pertusisnimi vakcinami, ki so bile opisane kot zelo učinkovite proti pertusisu.

(b) Multivalentna DPT-PRP-T-IPV vakcina (I) Pri otrocih starosti 2, 4, 6 in 18 mesecev smo varnost in imunogenost komponentnih pertusisnih vakcin v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim toksidom in tetanusnim toksoidom, Haemophilus influenzae tipa b tetanusni toksoid konjugatno vakcino in inaktivirano poliomelitisno vakcino, gojeno na vero celicah, (CP₂o 20 5 3DTPRP-T-IPV), primerjali s celocelično pertusisno vakcino (a) v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom ter inaktivirano poliomelitisno vakcino, (b) v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom ter inaktivirano poliomelitisno vakcino, gojeno na MRC-5 celicah, (DPT-polio adsorbirana), ki se uporabi za rekonstitucijo liofilizirane Haemophilus influenzae tipa b tetanusni toksoid konjugatne vakcine (ΡΕΝΤΑ™), ali (c) komponentno pertusisno vakcino v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom, Haemophilus influenzae tipa b tetanusni toksoid konjugatno vakcino in inaktivirano poliomelitisno vakcino, gojeno na MRC-5 celicah, (CP20/20/5/3DT-111IPV), ki smo jo dajali ločeno, ali pa smo jo uporabili za rekonstitucijo liofilizirane Haemophilus influenzae tipa b tetanusni toksoid konjugatne vakcine, (PRP-T).

Ta naključno kontroliran test je vključeval 897 otrok starih 2 meseca, ki so prejeli eno izmed osmih različnih vakcinacij skih orožij: CP20/205/3DT-PRP-T-IPV (tekoča); CP20/20/5/3DT, ki smo jo dali zaporedoma, toda na drugo mesto kot PRP-T; ali kontrolno vakcino, celocelično DPT-polio, uporabljeno za rekonstitucijo PRP-T (ΡΕΝΤΑ™).

Vse testne vakcine so bile dobro prenašane. Opazili nismo nobenih signifikantnih razlik v reakcijskih nivojih med obema tipoma rekombinantnih pertusisnih kombinacij. Otroci, ki so prejeli kombinirano CP₂o/2o/5/3DT-mIPV, uporabljeno za rekonstitucijo PRP-T, so imeli rahlo višje stopnje lokalne reakcije v primerjavi z enakimi produkti, dajanimi na različna mesta. Vse komponentne pertusisne kombinacije so imele konsistentno nižje nivoje lokalne in sistemske reakcije od tistih, ki jih je imela celocelična kombinacija. Razlike v nivoju reakcije med komponentno pertusisno in celocelično vakcino so bile najbolj razvidne v obdobju 24 ur takoj po vakcinaciji.

Obe komponentni pertusisni kombinaciji sta proizvedli odlične odzive na vse antigene. V vseh primerih so bili odzivi na pertusis PT, FHA in pertaktin boljši od odzivov, ki smo jih opazili na celocelične kombinacije. Med komponentno in celocelično kombinacijo nismo opazili nikakršnih signifikantnih razlik. Nikakršnih signifikatnih razlik nismo opazili niti med komponentno in celocelično formulacijo za anti-PRP, difterijo in polio 1 in 2. Obe komponentni pertusisni formulaciji sta proizvedli višje tetanusne odzive kot ΡΕΝΤΑ™. Obe komponentni formulaciji sta proizvedli podobne serološke odzive na vse antigene, razen na polio 3, za katerega je CP₂o/2o/5/3DT-mIPV, uporabljena za rekonstitucijo PRP-T, proizvedla višje odzive kot CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV. Postopek dajanja ni vplival na serološke odzive na kateregakoli od antigenov, razen na tetanus. V obeh skupinah, kombinirani in ločeni, je bilo 100 % otrok zaščitenih (>0,01 EU/ml) proti tetanusu po 3 odmerkih vakcine.

Najpomembneje, vse vakcinske skupine so imele dobre odzive na PRP-T, pri čemer je

98,3 % otrok doseglo nivoje >0,15 pg/ml in več kot 86,1 % otrok je doseglo nivoje >1,0 pg/ml. Te Številke so primerljive s tistimi, ki so bile opažene v predhodnih študijah, v katerih so uporabili celocelično pertusisno vakcino s PRP-T.

Dobljeni in zgoraj opisani serološki odzivi so prikazani v tabelah 5 do 7 (H = hibrid).

(II) Pri otrocih starosti 18 do 19 mesecev smo varnost in imunogenost komponentne pertusisne vakcine v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom ter inaktivirano poliomelitisno vakcino gojeno na MRC-5 celicah, (CP20203DTmlPV), ki smo dajali ločeno ali pa smo jo uporabili za rekonstitucijo liofilizirane Haemophilus influenzae tipa b tetanusni toksoid konjugatne vakcine, (PRP-T), primerjali s celocelično pertusisno vakcino v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom ter inaktivirano poliomelitisno vakcino, gojeno na MRC-5 celicah, (DPT-polio adsorbirana), uporabljeno za rekonstitucijo liofilizirane Haemophilus influenzae tipa b tetanusni toksoid konjugatne vakcine (ΡΕΝΤΑ™).

Ta petdelna študija je vključevala celocelično ΡΕΝΤΑ™ kot kontrolno orodje in CP2o/2o/5/3DT-mIPV, uporabljeno za rekonstitucijo PRP-T. Peti skupini smo dali CP20/20/5/3DT-111IPV zaporedoma, toda na drugo mesto kot PRP-T. 489 osebkov je prejelo vakcino v starosti 18-19 mesecev, od katerih jih je 466 (95 %) študijo končalo po protokolu. CP₂o/₂o/5/3DT-mIPV, uporabljena za rekonstitucijo PRP-T, je bila signifikantno manj reaktogena kot ΡΕΝΤΑ , še zlasti znotraj prvih 24 ur po vakcinaciji. Rekonstituiran produkt je imel rahlo višje nivoje lokalnih reakcij kot ločeno dajani produkt.

ΡΕΝΤΑ™ je proizvedla višje polio 1 odzive kot CP20/20/5/3DT-111IPV, uporabljena za rekonstitucijo PRP-T. Opazili nismo nobenih signifikatnih razlik za anti-PRP, difterijo, pertusisni aglutinin, fimbrije, polio 2 ali polio 3. CP₂o/2o/5/3E>T-mIPV, uporabljena za rekonstitucijo PRP-T, je proizvedla signifikantno višje pertusisne PT, FHA in pertaktinske serološke odzive. CP₂o/₂o/5/3DT-mIPV, uporabljena za rekonstitucijo PRP-T, je proizvedla konsistentne serološke odzive na vse testirane antigene. Opazili nismo nobenih signifikantnih razlik med CP₂₀/₂₀/5/3DT-mIPV, dajano ločeno, v primerjavi s tisto, ki smo jo uporabili za rekonstitucijo PRP-T, razen za tetanusni antitoksin (6,78 proti 4,91 EU/ml).

Ta študija je pokazala, da je CP₂o/2o/5/3DT-mIPV, uporabljena za rekonstitucijo PRP-T, proizvedla konsistentne serološke odzive v treh skupinah in da je bolj imunogena kot ΡΕΝΤΑ™ za pertusisne odzive. CP₂o/2o/s/3DT-mIPV je proizvedla tudi signifikantno nižje nivoje lokalnih in sistemskih reakcij kot ΡΕΝΤΑ™.

(III) Pri otrocih starosti 4 do 6 let smo varnost in imunogenost komponentne pertusisne vakcine kombinirane z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom ter inaktivirano poliomelitisno vakcino, gojeno na MRC-5 celicah, (CP₂o/2o/5/3DT-mIPV), primerjali s celocelično pertusisno vakcino v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom ter inaktivirano poliomelitisno vakcino, gojeno na MRC-5 celicah, (DPT-polio adsorbirana).

164 osebkov smo naključno razporedili v razmerju 4:1 tako, da so prejemali bodisi CP2o/2o/5/3DT-mIPV (n=131), bodisi DPT-polio (n=33). V študiji se niso pojavili nikakršni signifikantni ali resni škodljivi dogodki. CP20/20/5/3DT-111IPV je imela konsistentno nižje nivoje tako lokalnih, kot sistemskih reakcij, še zlasti v obdobju od 0 do 24 ur. Lokalne reakcije so bile običajne za obe skupini s 97 % za DPT-polio in

76,9 % za CP2o/2o/5/3DT-mIPV recipiente, ki so imeli določeno lokalno reakcijo v obdobju od 0 do 24 ur. CP20/20/5/3DT-111IPV lokalne reakcije so bile običajno blage ali zmerne. Nasprotno pa je imela več kot polovica DPT-polio recipientov lokalne reakcije ocenjene kot resne. Občutljivost mesta injiciranja je običajno izginila v 72 urah, toda rdečica ali oteklina seje ohranila še dolgo v obdobje 24 do 72 ur.

Sistemske reakcije v obdobju od 0 do 24 ur so bile manj običajne pri recipientih CP2o/2o/s/3DT-mIPV (38,5 %), kot pri recipientih DPT-polio (90,9 %). Sistemske reakcije v obdobju 24-72 ur niso bile običajne pri nobeni od obeh skupin.

Difterija, tetanus, polio 2 in polio 3 odzivi so bili primerljivi med obema vakcinama. Recipienti DPT-polio so imeli znatno višji polio 1 odziv (15,462), kot recipienti CP₂o/2o/5/3DT-mIPV (10,903). Vsi osebki so imeli odlične odzive in bi jih lahko smatrali kot zaščitene proti omenjenim boleznim. Serološki odzivi na vse pertusisne antigene so bili signifikantno višji pri recipientih CP₂o zo saDT-mlPV.

(IV) Pri otrocih, starosti 18 do 19 mesecev, smo varnost in imunogenost komponentne pertusisne vakcine v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim tetanusnim toksoidom, Haemophilus influenzae tipa b tetanusni toksoid konjugatno vakcino in inaktivirano poliomelitisno vakcino, gojeno na MRC-5 celicah, (CP20/20/5/3DT-PRP-TmlPV), primerjali s celocelično pertusisno vakcino v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom ter inaktivirano poliomelitisno vakcino, gojeno na MRC-5 celicah, (DPT-polio adsorbirana), uporabljeno za rekonstitucijo liofilizirane Haemophilus influenzae tipa b tetanusni toksoid konjugatne vakcine (ΡΕΝΤΑ™), ali s komponentno pertusisno vakcino v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom ter inaktivirano poliomelitisno vakcino, gojeno na MRC-5 celicah, (CP_2O/2o/5/3DT-mIPV), uporabljeno za rekonstitucijo liofilizirane Haemophilus influenzae tipa b tetanusni toksoid konjugatne vakcine, (PRP-T).

Namen te trodelne, naključno kontrolirane, posamično slepe študije je bil doseči varnost in imunogenost dveh novih aceličnih pertusisnih kombinacij, CP₂o 20/5/3DT-PRP-T-IPV in CP₂o/2o/5/3DT-mIPV, uporabljenih za rekonstitucijo PRP-T s ΡΕΝΤΑ™ (celocelična pertusisna DPT polio, uporabljena za rekonstitucijo PRP-T) pri otrocih starosti 18 do 19 mesecev. Skupno je sodelovalo 99 otrok; 33 v vsaki od treh vakcinskih skupin, od katerih jih je 97 (98 %) končalo študijo skladno s protokolom.

V tej študiji nismo opazili nobenih resnih reakcij. Veliko verjetneje je bilo, da bodo recipienti ΡΕΝΤΑ™ doživeli zmerno ali resno lokalno in sistemsko reakcijo, kot pa recipienti drugih dveh vakcin. Razlike so bile najbolj poudarjene v obdobju 24 ur in so dosegle statistično signifikanco za vročino, rdečico, otekanje, občutljivost, živčnost, zmanjšano aktivnost in manjši apetit. Pri otrocih, ki so prejeli komponentne pertusisne kombinacije, so bile reakcije blage. Opazili nismo nobenih signifikantnih razlik v reakcijskih nivojih med obema komponentnima pertusisnima formulacijama, čeprav je bila živčnost vidna pogosteje znotraj 24 ur pri tistih, ki so prejeli CP₂o/2o/5/3UT-mIPV, uporabljeno za rekonstitucijo PRP-T, v primerjavi s CP₂o 20/5/3DT-PRP-T-IPV (18 % proti 3 %).

Serološki odzivi so bili zadovoljivi pri 100 % udeležencih, ki so dosegli nivoje, katere smatramo kot zaščitne za difterični antitoksin (>0,01 IU/ml), tetanusni antitoksin (>0,01 IU/ml) in anti PRP (>l,0 pg/ml). Pri vseh udeležencih smo po imunizaciji opazili nevtralizacijska protitelesa za polio tipa 1, 2 in 3, ki jih je bilo možno detektirati.

Difterični odzivi so bili višji pri recipientih ΡΕΝΤΑ™, kar se je odražalo v višji antigenski vsebnosti te vakcine (25 Lf proti 15 Lf).

Pertusisna protitelesa so bila konsistentno višja v dvokomponentnih pertusisnih kombinacijah v primerjavi s ΡΕΝΤΑ™, pri čemer je bila dosežena statistična signifikanca za anti-PT, anti-FHA in anti-pertaktin GMT odzive. Anti-fimbrijalna in pertusisna aglutinirajoČa protitelesa so bila prav tako višja pri recipientih komponentnega pertusisa, čeprav razlike niso dosegle statistične signifikance. Če povzamemo, ta študija je pokazala, da sta bili obe acelični pertusisni kombinaciji, CP2o/2o/5/3DT-mIPV, uporabljena za rekonstitucijo PFP-T, in CP20/20/5/3DT-PRP-T-IPV, primerljivi in da sta proizvedli zadovoljivo nizke reakcijske nivoje in visoke serološke odzive, kadar smo ju dali kot poživilo otrokom starosti 18 do 19 mesecev.

(V) Varnost in imunogenost komponentne pertusisne vakcine v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom (CP20/20/5/3DT), samima ali v kombinaciji z enim ali dvema inaktiviranima poliovirusoma, pri čemer je eden mlPV, gojen na MRC-5 celicah, in je drugi vIPV, gojen na vero celicah, ali z oralno poliomelitisno vakcino (OPV) pri otrocih starosti 17 do 19 mesecev.

Ta petdelna študija je bila zasnovana z namenom raziskati interkacijo med CP20/20/5/3DT in obema IPV (gojenima na vero celicah ali MRC-5 celicah). Oba IPV smo kombinirali kot posamezen tekoč produkt s CP20/20/5./3DT-111IPV in CP20/20/5/3DT-VIPV, ali pa smo ju dali zaporedno, toda na ločeno mesto iniciranja (CP20/20/5/3DT+111IPV in CP20/20/5/3DT+VIPV). Peta študijska skupina je prejela CP20/20/5/3DT in OPV zaporedno. Vsi osebki so prejeli PRP-T ob odvzemu krvi po imunizaciji. Anti-PRP odzivi v tej študiji niso bili zasledovani.

NAČRT ŠTUDIJE

ŠTEVILO	OBISK 1 (17-19 mesecev)	OBISK 2 (+1 mesec)
85	1· CP20/20 5 3DT mlPV (1 injekcija)	PRP-T
85	2. CP20/20 5 3DT+mIPV (2 injekciji)	PRP-T
85	3- CP20/20 5/3DT+VIPV (1 injekcija)	PRP-T
85	4. CP20/20 5/3DT+VIPV (2 injekciji)	PRP-T
85	5. CP20/20 5/3DT+OPV (1 injekcija)	PRP-T

V splošnem ni bilo razlik v nivojih škodljivih reakcij, poročanih po inaktiviranih poliomelitisnih vakcinah, izvedenih iz MRC-5 ali vero celic, ne glede na to, ali smo vakcino dali kot ločeno injekcijo, ali kot kombinirano z vakcino CP2020/53DT (HIBRID).

Opazili nismo signifikantnih razlik med skupinami za PT, FHA in pertaktin. Odzivi so bili pri otrocih, ki so prejeli CP20/20/5/3DT (HIBRID) in OPV, rahlo, toda ne signifikatno, višji od tistih pri otrocih, ki so prejeli CP20/20/5/3DT (HIBRID) in vero celični IPV za FIM, pertusisni aglutinin, difterijo in tetanus. Polio odzivi so bili splošno primerljivi ali višji pri otrocih, ki so prejeli IPV v primerjavi z OPV vakcino. Vsi, razen enega posameznika, so imeli pertusisni aglutinin > 1:64. Vsi, razen enega posameznika, so dosegli nivoje difteričnega antitoksina >0,1 EU/ml in vsi so dosegli nivoje tetanusnega antitoksina >0,1 EU/ml.

Rezultati te študije kažejo, da je CP20/20/5/3DT (HIBRID) v kombinaciji z IPV (bodisi MRC-5 ali vero celice) vama in imunogena pri otrocih starosti 17 do 19 mesecev. Kombinirane vakcine so bile vsaj toliko imunogene kot vakcine, dajane kot ločene injekcije, in v nekaterih primerih so bile celo bolj imunogene. Kombiniranje vakcine kot posamezne injekcije ni bilo povezano s signifikatnim povečanjem v lokalnih škodljivih reakcijah. Opažene niso bile nikakršne bistvene razlike med škodljivimi reakcijami ali imunskim odzivom na oba IPV pripravka, bodisi kot ločene injekcije ali kot kombiniranih produktov. Vključitev IPV ni povečala nivoja škodljivih reakcij v primerjavi s CP20/20/5/3DT (HIBRID) katero smo dali samo (t.j. z OPV).

Serološki rezultati, dobljeni v študiji, so povzeti v tabeli 8 (H = hibrid).

(VI) Pri otrocih starosti 17 do 19 mesecev smo določili varnost in imunogenost komponentnih pertusisnih vakcin v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidoma (CP20/20/5/3DT in CP10/5/5/3DT) samima, ali v kombinaciji s Haemophilus influenzae tipa b konjugatno vakcino.

Šestdelno študijo smo oblikovali z namenom, da bi pri otrocih, starostih 18 do 19 mesecev, raziskali interakcijo med obema, klasično (CP10/5/5/3DT) in hibridno (CP20/20/5/3DT) komponentno pertusisno formulacijo ter Haemophilus influenzae tipa b konjugatno vakcino (PRP-T).

Uporabili smo tri sheme, v katerih (a) smo uporabili vsako izmed komponentnih pertusisnih vakcin za rekonstitucijo PRP-T, (b) smo jih dali zaporedno, toda na ločeno mesto od PRP-T, ali (c) smo dali PRP-T 1 mesec po komponentni pertusisni vakcini. Vsi otroci so prejeli OPV pri prvem obisku in bili primirani z istimi komponentami pertusisne vakcine v starosti 2, 4 in 6 mesecev. Vsi otroci so predhodno sodelovali v veliki varnostni študiji teh dveh vakcinskih formulacij.

V študijo je bilo celokupno vključenih 545 osebkov, od katerih jih je 542 (99 %) končalo študijo.

NAČRT ŠTUDIJE

ŠTEVILO	OBISK 1 (17-19 mesecev)		OBISK 2 (+1 mesec)	OBISK 3 (+2 meseca)
154	ICP20/20/5/3DT uporabljena za rekonstitucijo PRP-T	KRI +	kri
152	CP20/20/5/3DT dajana hkrati s PRP-T OPV	OPV	kri
159	CP20/20/5/3DT		PRP-T	kri
27	CP10/5/5/3DT uporabljena za rekonstitucijo PRP-T	KRI + OPV	kri
29	CP10/5/5/3DT dajana hkrati s PRP-T		kri
21	CP10/5/5/3DT		PRP-T	kri

Serološki odzivi so bili splošno višji na večino antigenov, kadar smo komponentno pertusisno kombinacijsko vakcino in PRP-T dajali na isti dan, v primerjavi s primerom, ko smo ju dajali na ločene dni (glej tabelo 9).

Pomembno je, da anti-PRP odzivi niso bili zmanjšani, kadar smo PRP-T dajali ločeno v primerjavi s kombiniranim dajanjem s komponentno pertusisno kombinirano vakcino na isti dan. Post-imunizacijski GMT-ji pri otrocih, katerim smo dali vakcine na ločene dni, so bili signifikatno nižji. Razlike v anti-PRP odzivih med kombiniranimi in ločenimi injekcijami so bili opaženi, kadar so bili osebki stratificirani s formulacijo komponentne pertusisne vakcine. Recipienti CP20/20/5/3DT (HIBRID) so izražali nižje anti-PRP nivoje, kadar smo vakcino dajali v kombinaciji, v primerjavi s primerom, ko smo jo dajali ločeno. Teh razlik nismo opazili pri recipientih CP10/5/5/3DT in razlike so izginile, kadar smo skupine združili. Vsi udeleženci so dosegli anti-PRP nivoje > 0,15 pg/ml in nad 98 % od vsake skupine je imelo nivo >1,0 pg/ml. Le štirje (0,7 %) udeleženci te študije niso dosegli tega nivoja; trije v skupini ločenih injekcij na ločene dni in eden v skupini kombinirane injekcije. Nad 82 % od vsake skupine je preseglo titre 10 μg/ml anti-PRP protitelesa.

Med lokalnimi reakcijami, ki so se pojavile, je bila med bolj pogostimi opažena le preobčutljivost v kombinirani skupini (27,8 %), v primeijavi s skupino z ločeno dnevno vakcinacijo (16,7 %). Ta nivo se ne razlikuje od tistega, katerega smo opazili pri skupini, kateri smo dajali vakcine na isti dan kot ločene injekcije (24,2 %).

Na splošno smo pri udeležencih vsake od vakcinskih skupin opazili sistemsko reakcijo s podobno frekvenco (60 do 62,1 %). Vročino smo opazili pri približno eni tretjini udeležencev. Zgolj rdečico smo opazili bolj običajno v skupini kombiniranega injiciranja (33,3 %), v primerjavi z ločeno injekcijo (22,0 %), ali s skupino z ločenim dnevom (22,8 %).

Če povzamemo rezultate tega testa vidimo, da hkratno dajanje CP10/5/5/3DT ali CP20/20/5/3DT in PRP-T na isti dan ni oviralo anti-PRP odzivov, ampak jih je v bistvu lahko celo pospešilo. Serološki odzivi na druge antigene so bili prav tako odlični. Kadar smo obe vakcini zmešali skupaj, je bil tetanus edini prizadeti antigen, toda vsi otroci so imeli visoke nivoje zaščite.

Za slednje klinične teste smo pripravili CP10/5/5/3DT-IPV, gojeno na MRC5 celicah, za rekonstitucijo z ActHib (PRP-T) in A5I (CP10/5/5/3DT-PRP-T-IPV, gojena na vero celicah, 3 μg/ml). Komponentne pertusisne antigene smo posamično adsorbirali na aluminijev fosfat, 3 mg/ml, brez prisotnosti konzervansa. Ob upoštevanju tega je bil PT v 10 mM kalijevem fosfatu, 0,15M NaCl, 5 % glicerolu, FHA je bil v 10 mM kalijevem fosfatu, 0,5 M NaCl, 69 K je bil v 10 mM kalijevem fosfatu, 0,15 M NaCl in fimbrije so bile v 10 mM kalijevem fosfatu, 0,15 M NaCl. D je bil adsorbiran na aluminijevem fosfatu (6,25 mg/ml) v koncentraciji 300 Lf/ml. 2-fenoksietanol je bil dodan kot konzervans do 0,6 %. T je bil adsorbiran na aluminijevrm fosfatu (6,25 mg/ml) v koncentraciji 300 Lf/ml. 2-fenoksietanol je bil dodan do 0,6 %.

Adsorbirane komponentne pertusisne antigene smo združili z adsorbiranim D in adsorbiranim T v koncentraciji 3,65 doz/ml ali 55 % končnega volumna. Vsebnost 2-fenoksietanola je bila 0,6 %. Pred kombiniranjem z mlPV ali vIPV/PRP-T smo potrdili sterilnost, vsebnost aluminijevega oksida in vsebnost 2-fenoksietanola. Za 5 ml smo dodali m-IPV in 2-fenoksietanol ter razredčili do končne jakosti. Za A5I smo dodali v-IPV, PRP-T in 2-fenoksietanol ter razredčili do končne jakosti.

V povzetku rezultatov kliničnega testa z multivalentnimi vakcinami lahko vidimo, da CP2o/2o/5/3DT-mIPV, uporabljena za rekonstitucijo PRP-T, proizvede primerljive serološke odzive na difterijo, tetanus in polio 1, 2 in 3 v primerjavi s ΡΕΝΤΑ (ki vsebuje celocelično pertusisno vakcino). Anti-PRP odzivi so primerljivi ali višji od tistih, ki smo jih opazili s ΡΕΝΤΑ™, tako pri infantilnih kot poživilnih odmerkih. Tetanusni odzivi so nižji od CP2o/2o/5/3DT-mIPV, uporabljene za rekonstitucijo PRP-T, kadar jih primerjamo s CP2o/2o/5/3DT-mIPV, katero dajemo ločeno od PRP-T, toda to zmanjšanje ni klinično relevantno.

Skladno z ostalimi študijami proizvede celocelična vakcina primerljive ali višje fimbrijalne in aglutininske odzive kot komponentna pertusisna vakcina, vendar pa je znano, da uporabljena celocelična vakcina vsebuje visoko imunogensko fimbrijalno komponento. Vsi ostali pertusisni odzivi so bili konsistentno višji s CP₂0 20'5 3DT-mIPV, uporabljeno za rekonstitucijo PRP-T, v primerjavi s tistimi za ΡΕΝΤΑ™. Tako predloženi izum podaja multivalentne imunogene sestavke, v katerih imunski odzivi na antigene niso zmanjšani ali poslabšani z ostalimi komponentami ali z njihovo vklučitvijo v multivalentno vakcino. Zmanjšane imunske odzive včasih imenujemo tudi interferenca.

Vakcinski pripravek in uporaba

Imunogenske sestavke, ki so primerni za uporabo kot vakcine, lahko tako pripravimo iz imunogenov, kot je opisano tukaj. Vakcina izzove imunski odziv v osebku, ki proizvaja protitelesa.

Imunogenski sestavki, ki vključujejo vakcine, so lahko pripravljeni kot pripravki za injiciranje, kot tekoče raztopine ali emulzije. Imunogene lahko zmešamo s farmacevtsko sprejemljivimi ekscipienti, ki so kompatibilni z imunogeni. Takšni ekscipienti lahko vključujejo vodo, slanico, dekstrozo, glicerol, etanol in njihove kombinacije. Imunogenski sestavki in vakcine lahko nadalje vsebujejo pomožne snovi, kot so omočilna sredstva ali emulgima sredstva, sredstva za pH pufranje ali adjuvanse za pospeševanje njihove učinkovitosti. Imunogenske sestavke in vakcine lahko dajemo parenteralno, z injiciranjem subkutano ali intramuskularno. Imunogenske pripravke in vakcine dajemo na način, kije kompatibilen z dozirno formulacijo in v takšni količini, kot bo terapevtsko učinkovita, imunogena in zaščitna. Količina, ki jo dajemo, je odvisna od osebka, katerega obdelujemo, vključno z, npr., kapaciteto imunskega sistema posameznika, da sintetizira protitelesa in, Če je potrebno, da proizvede celično posredovan imunski odziv. Natančne količine aktivne sestavine, ki je potrebna za dajanje, bodo odvisne od presoje zdravnika. Seveda bo strokovnjak s področja zlahka določil ustrezna dozirna območja, ki so lahko reda mikrogramov imunogenov.

Ustrezni režimi začetnega dajanja in poživilnih doz so prav tako variabilni, toda vključujejo lahko začetno dajanje, kateremu sledijo naknadna dajanja. Doziranje je lahko odvisno tudi od poti dajanja in bo variiralo skladno z velikostjo gostitelja.

Koncentracija imunogenov v imunogenskem sestavku v smislu izuma je splošno okoli do okoli 95 %. Imunogenost lahko signifikantno izboljšamo, če antigene dajemo hkrati z adjuvansi, ki se običajno uporabljajo kot 0,005 do 0,5 % raztopina v fosfatno pufrani slanici. Adjuvansi povečujejo imunogenost antigena, toda niso nujno sami imunogeni. Adjuvansi lahko delujejo tako, da lokalno zavirajo antigen blizu mesta dajanja, s čimer se proizvede depojski učinek, ki omogoča počasno, zadržano sproščanje antigena v celice imunskega sistema. Adjuvansi lahko tudi privlačijo celice imunskega sistema k antigenskem depoju in stimulirajo takšne celice, da izzovejo imunske odzive.

Imunostimulatoma sredstva ali adjuvansi se za izboljšanje imunskih odzivov gostitelja, npr., na vakcine, uporabljajo že vrsto let. Notranji adjuvansi, kot so lipopolisaharidi, so običajno komponente ubitih ali atenuiranih bakterij, uporabljenih kot vakcina. Zunanji adjuvansi so imunomodulatoiji, ki so tipično nekovalentno vezani na antigene, in so formulirani tako, da pospešujejo imunske odzive gostitelja. Tako so bili adjuvansi identificirani kot pospeševala imunskega odziva na antigene, ki jih dajemo parenteralno. Vendar pa so nekateri izmed teh adjuvansov toksični in lahko povzročijo neželene stranske učinke, zaradi česar so neprimerni za uporabo pri ljudeh in številnih živalih. V bistvu uporabljamo rutinsko kot adjuvanse v humanih in veterinarskih vakcinah le aluminijev hidroksid in aluminijev fosfat (skupno običajno imenovana galun). Učinkovitost galuna v zvišanju protitelesnih odzivov na difterični in tetanusni toksoid je že dobro določena.

Širok obseg zunanjih adjuvansov lahko izzove močne imunske odzive na antigene. Ti vključujejo saponine, kompleksirane na antigene membranskega proteina (imunsko stimulirajoči kompleksi), pluronske polimere z mineralnim oljem, ubite mikro bakterije v mineralnem olju, Freundov kompletni adjuvans, bakterijske produkte, kot so muramil dipeptid (MDP) in lipopolisaharid (LPS), kot tudi lipid A in liposomi.

Za učinkovito induciranje humoralnih imunskih odzivov (HIR) in celično posredovane imunosti (CMI), imunogene pogosto emulgiramo v adjuvanse. Številni adjuvansi so toksični, povzročijo granulome, akutna in kronična vnetja (Freundov kompletni adjuvans, FCA), citolizo (saponini in pluronski polimeri) in pirogenost, artritis ter anteriomi uveitis (LPS in MDP). Čeprav je FCA odličen adjuvans in se široko uporablja v raziskavah, zaradi svoje toksičnosti ni dovoljen za uporabo v humanih ali veterinarskih vakcinah.

Želene značilnosti idealnih adjuvansov vključujejo:

(1) niso toksični;

(2) sposobnost, da stimulirajo dolgotrajen imunski odziv;

(3) enostavnost izdelave in stabilnost pri dolgotrajnem skladiščenju;

(4) sposobnost, da izzovejo tako CMI kot HIR na antigene, dajane po različnih poteh;

(5) sinergijo z drugimi adjuvansi;

(6) sposobnost selektivne interakcije s populacijami celic, ki predstavljajo antigen (APC - antigen presenting celiš);

(7) sposobnost, da specifično izzovejo ustrezne ThI ab T_H2 celičnospecifične imunske odzive; in (8) sposobnost, da selektivno povečajo ustrezne nivoje protitelesnih izotipov (npr. IgA) proti antigenom.

US patent št. 4,855,283, podeljen Lockhoffu et al. 8. avgusta 1989, ki je tu vključen za referenco, opisuje kot imunomodulatorje ali adjuvanse glikolipidne analoge, ki vključujejo N-glikozilamide, N-glikozilsečnine in N-glikozilkarbamate, izmed katerih je vsak substituiran v sladkornem ostanku z aminokislino. Tako Lockhoff et al. (US patent št. 4,855,283 in ref. 60) opisujejo, da so N-glikolipidni analogi, ki izražajo strukturne podobnosti z naravno-obstojeČimi glikolipidi, kot so glikosfuigolipidi in glikoglicerolipidi, sposobni izzvati močne imunske odzive, tako v vakcini virusa herpes simpleks, kot v vakcini virusa pseudorabies. Nekateri glikolipidi so bili sintetizirani iz alkilaminov z dolgo verigo in maščobnih kislin, ki so vezane neposredno s sladkorji preko anomemega ogljikovega atoma, tako da posnemajo funkcije naravno obstoječih lipidnih ostankov.

US patent št. 4,258,029, podeljen Moloneyu, pravice katerega so bile prenešene na prijavitelja in ki je vključen tu za referenco, navaja, da oksadecil tirozin hidroklorid (OTH) deluje kot adjuvans, kadar je kompleksiran s tetanusnim toksoidom in formalinsko inaktivirano I, II in III poliomelitisno virusno vakcino. Tudi NixonGeorge et al. (ref. 61) so poročali, da oktodecilni estri aromatskih aminokislin, kompleksiranih z rekombinantnim hepatitis B površinskim antigenom, pospešujejo imunske odzive gostitelja proti virusu hepatitisa B.

PRIMERI

Gornji opis splošno opisuje predloženi izum. Popolnejše razumevanje lahko pridobimo s sklicevanjem na naslednje specifične primere. Ti primeri so opisani zgolj za namene ponazoritve in niso mišljeni kot omejitev obsega izuma. Spremembe v obliki in substitucija ekvivalentov so zaobsežene kot možnosti, ki lahko služijo kot sugestija ali vabilo. Čeprav smo tu uporabili specifične izraze, so takšni izrazi mišljeni v opisnem smislu in ne za namen omejitve.

Uporabljeni postopki proteinske biokemije, fermentacije in imunologije, ki pa niso eksplicitno opisani v opisu in teh primerih, so obsežno navedeni v znanstveni literaturi in so znotraj sposobnosti strokovnjakov.

Primer 1:

Ta primer opisuje rast Bordetella pertussis.

Matično seme:

Matične semenske kulture Bordetella pertussis smo hranili kot liofilizirane semenske partije pri 2 °C do 8 °C.

Delovno seme:

Liofilizirano kulturo smo oživili v Homibrookovem mediju in uporabili za zasaditev Bordet-Gengou agamih (BGA) plošč. Homibrookov medij ima naslednjo sestavo:

Komponenta za 1 liter kazein hidrolizat (obdelan z ogljem) 10,0 g nikotinska kislina 0,001 g kalcijev klorid 0,002 g natrijev klorid 5,0 g magnezijev klorid heksahidrat 0,025 g kalijev klorid 0,200 g kalijev fosfat dvobazni 0,250 g škrob 1,0 g destilirana voda do 1,0 litra pH smo naravnali na 6,9 ± 0,1 z 1 % raztopino natrijevega karbonata. Medij smo porazdelili v epruvete in sterilizirali s parjenjem v avtoklavu 20 minut in avtoklaviranjem 20 minut pri 121 °C do 124 °C. Seme smo dvakrat podkultivirali, najprej na BGA ploščah in nato na komponentnem pertusisnem agarju (CPA = Comopnent Pertusis Agar). Komponenta! pertusisni agar (CPA) je imel naslednjo sestavo:

NaCl 2,5 g/1

KH₂PO₄ 0,5 g/1

KC1 0,2 g/1

MgCl₂(H₂O)₆ 0,1 g/1

Tris baza 1,5 g/1 kazamino kisline 10,0 g/1

NaHglutamat 10,0 g/1 konc. HCI do pH 7,2 agar 15,0 g/1 rastni faktorji (CPGF) 10,0 ml/1

Komponentni pertusisni rastni faktorji (CPGF = Component Pertusis Growth Factors) - 100 X so imeli naslednjo sestavo:

L-cistein HCI 4,0 g/1 niacin 0,4 g/1 askorbinska kislina 40,0 g/1 glutation, reduciran 15,0 g/1

Fe₂SO₄, (H₂O)₇ 1,0 g/1 dimetil-3-ciklodekstrin 100 g/1

CaCl₂ (H₂O)₂ 2,0 g/1

Končno kulturo smo suspendirali v pretusisnem semenskem suspenzijskem pufru (CPSB), porazdelili v 2 do 4 ml alikvote in shranili zamrznjene pri -60 °C do -85 °C.

Pertusisni semenski suspenzijski pufer (PSSB = Pertusis Seed Suspension Buffer) je imel naslednjo sestavo:

kazamino kislina 10,0 g/1

Tris baza 1,5 g/1 brezvodni glicerol 100 ml/1 konc. HCI do pH 7,2

Te glicerolne suspenzije so dale izhodni material za pripravo delovnega semena.

Postopek kultivacije

Razmnoževanje delovnega semena smo vodili v komponentnem pertusisnem agarju v Romeovih steklenicah 4 do 7 dni pri 34 °C do 38 °C. Po tej kultivaciji smo s celic sprali agar s komponentno pertusisno brozgo (CPB = Component Petussis Broth). Vzorce smo opazovali z barvilom po Gramu na čistoto kulture in opaciteto.

Celice smo prenesli v 4 litrske konične bučke, ki so vsebovale CPB, in jih ob stresanju inkubirali pri 34 °C do 38 °C 20 do 26 ur. Vzorce smo opazovali z barvilom po

Gramu in preverili čistoto kulture. Vsebino bučk smo zbrali in suspenzijo uporabili za zasaditev dveh fermentorjev, ki sta vsebovala CPB (10 litrski volumen, s pričetkom pri OD600 0,1-0,4). Seme smo pustili rasti do končnega OD₆oo 5,0 do 10,0. Vzorce smo testirali z barvilom po Gramu na čistoto kulture, z antigensko specifično ELISA in na sterilnost.

Primer 2:

Ta primer opisuje čiščenje antigenov iz celične kulture Bordetella pertussis.

Proizvodnja brozge in celičnih koncentratov:

Bakterijsko suspenzijo smo gojili v dveh proizvodnih fermentorjih 35 do 50 ur pri 34 °C do 37 °C. Fermentorja smo vzorčevali za testiranje sterilnosti medija. Suspenzijo smo napolnili v kontmuimo centrifugo z nizom diskov (continuous-flow disk-stack centrifuge) (12,000 x g), da smo celice ločili od brozge. Celice smo zbrali, da so počakale do ekstrakcije fimbrijalne komponente. Zbristreni likvor smo spustili skozi <0,22 pm membranski filter. Filtriran likvor smo koncentrirali z ultrafiltracijo ob uporabi membrane z 10 do 30 kDa nominalne molekulske masne meje (NMWL=nominal molecular weight limit). Koncentrat smo shranili do ločevanja in čiščenja komponent pertusisnega toksina (PT), filamentnega hemaglutinina (FHA) in 69 kDa (pertaktina).

Ločevanje komponent brozge:

Komponente brozge (69 kDa, PT in FHA) smo ločili in očistili z biserno kromatografijo in selektivnimi eluacijskimi koraki, v bistvu takimi, kot so opisani v EP patentu št. 336,736 in v prijaviteljevi objavljeni PCT prijavi št. WO 91/15505, opisanima zgoraj. Izvedene specifične operacije čiščenja so opisane spodaj.

Pertusisni toksin (ΡΤ):

Biserno kolono smo sprali s 50 mM Tris, 50 mM Tris/0,5 % Triton X-100 in 50 mM Tris pufri. PT frakcijo smo iz biserne kolone eluirali s 50 mM Tris/0,12 M NaCl pufrom.

PT frakcijo iz biserne kromatografije smo nanesli na hidroksilapatitno kolono in jo nato sprali s 30 mM kalijevim fosfatnim pufrom. PT smo eluirali s 75 mM kalijevim fosfatom/225 mM NaCl pufrom. Kolono smo sprali z 200 mM kalijevim fosfatom / 0,6 M NaCl, da smo dobili FHA frakcijo, katero smo zavrgli. K očiščenemu PT smo do 50 % dodali glicerol in zmes shranili pri 2 °C do 8 °C do detoksifikacije v obdobju enega tedna.

Filamentni hemaglutonin (FHA):

Frakcijo FHA smo eluirali iz biserne kolone z 50 mM Tris/0,6 M NaCl. Filamentni hemaglutinin smo očistili s kromatografijo skozi hidroksilapatit. FHA frakcijo iz biserne kolone smo nanesli na hidroksilapatitno kolono, jo nato sprali s 30 mM kalijevim fosfatom, kije vseboval 0,5 % Tritona Χ-100, čemur je sledil 30 mM kalijev fosfatni pufer. PT frakcijo smo eluirali s 85 mM kalijevim fosfatnim pufrom in jo zavrgli. FHA frakcijo smo nato eluirali z 200 mM kalijevim fosfatom / 0,6 M NaCl in shranili pri 2 °C do 8 °C do detoksifikacije v obdobju enega tedna.

kDa (pertaktin):

Koncentrat brozge smo razredčili z vodo za injiciranje (WFI = water for injection), da smo dosegli prevodnost 3 do 4 mS/cm in jo nanesli na biserno kolono, pri čemer smo napolnili 0,5 do 3,5 mg proteina na ml biserov. Eluat (69 kDa komponentna frakcija) smo koncentrirali z ultrafiltracijo ob uporabi 10 do 30 kDa NMWL membrane. K eluiranemu koncentratu smo dodali amonijev sulfat do 35 % ±3 % (m/v) in nastalo zmes shranili pri 2 °C do 8 °C za 4 ±2 dni, ali pa smo jo takoj centrifugirali (7000 χ g). Prebitni supematant smo oddekantirali in precipitat zbrali s centrifugiranjem (7000 x g). 69 kDa peleto smo bodisi shranili zmrznjeno pri -20 °C do -30 °C, ali pa smo jo raztopili v Tris ali fosfatnem pufru in takoj uporabili.

kDa protein zunanje membrane, ki smo ga dobili z obarjanjem koncentriranega bisernega eluata s 35 % (m/v) amonijevim sulfatom, smo uporabili za čiščenje. Amonijev sulfat (100 ± 5 g na liter) smo dodab k frakciji 69 kDa in zmes mešali vsaj 2 uri pri 2 °C do 8 °C. Zmes smo centrifugirali (7000 x g), da smo rekuperirali supematant. K supematantu smo dodali amonijev sulfat (100 do 150 g na liter) in zmes mešali vsaj 2 uri pri 2 °C do 8 °C. Zmes smo centrifugirali (7000 x g), da smo pridobili peleto, katero smo raztopili v 10 mM Tris, HC1, pH 8. Ionsko jakost raztopine smo naravnali na ekvivalent 10 mM Tris HC1 (pH 8), ki vsebuje 15 mM amonijevega sulfata.

kDa protein smo nanesli na hidroksilapatitno kolono, ki je v tandemu povezana s Q-sefarozno kolono. 69 kDa protein, katerega smo zbrali v eluatu, smo sprali iz kolon z 10 mM Tris, HC1 (pH 8), ki vsebuje 15 mM amonijevega sulfata, in združili z 69 kDa proteinom v eluatu. Zbrani 69 kDa protein smo diafiltrirali s 6 do 10 volumni 10 mM kalijevega fosfata (pH 8), ki vsebuje 0,15 M NaCl na 100 do 300 kDa NMWL membrani. Ultrafiltrat smo zbrali in koncentrirali 69 kDa protein v ultrafiltratu.

kDa protein smo s topilom zamenjali v 10 mM Tris HC1 (pH 8) in adsorbirali na Qsefarozo, sprali z 10 mM Tris HC1 (pH 8)/5 mM amonijevim sulfatom. 69 kDa protein smo eluirali s 50 mM kalijevim fosfatom (pH 8). 69 kDa protein smo diafiltrirali s 6 do 10 volumni 10 mM kalijevega fosfata (pH 8), kije vseboval 0,15 M NaCl na 10 do 30 kDa NMWL membrani. 69 kDa protein smo sterilno filtrirali skozi <0,22 pm filter. To sterilno zalogo smo shranili pri 2°C do 8 °C in adsorpcijo izvedli v obdobju treh mesecev.

Fimbrijalni aglutinogeni:

Aglutinogene smo očistili od celične paste po ločitvi od brozge. Celično pasto smo razredčili na 0,05 volumske frakcije celic v pufru, kije vseboval 10 mM kalijev fosfat, 150 mM NaCl in 4M sečnino ter mešali 30 minut. Celični lizat smo zbistrili s centrifugiranjem (12000 x g), ga nato koncentrirali in diafiltrirali proti 10 mM kalijevem fosfatu/150 mM NaCl/0,1 % Triton Χ-100 ob uporabi 100 do 300 kDa NMWL membranskega filtra.

Koncentrat smo toplotno obdelovali 30 minut pri 80 °C in ga nato ponovno zbistrili s centrifugiranjem (9000 x g). K zbistrenem supematantu smo dodali PEG 8000 do končne koncentracije 4,5 % ±0,2 % in previdno mešali še vsaj 30 minut. Nastalo oborino smo zbrali s centrifugiranjem (17000 x g) in peleto ekstrahiraii z 10 mM kalijev fosfat/150 mM NaCl pufrom, da smo dobili raztopino surovega fimbrijalnega aglutinogena. Fimbrijalne aglutinogene smo očistili s prepustom skozi PEI kremenico. Surovo raztopino smo z uporabo IM kalijevega fosfatnega pufra napravili 100 mM glede na na kalijev fosfat ter jo prepustili skozi PEI kremenično kolono.

Eluat iz kolon smo koncentrirali in diafiltrirali proti 10 mM kalijev fosfat/150 mM NaCl pufru z uporabo 100 do 300 kDa NMWL membranskega filtra.

To sterilno zalogo smo shranili pri 2 °C do 8 °C in v obdobju 3 mesecev izvedli adsorpcijo. Fimbrijalni aglutinogenski pripravek je vseboval fimbrijalni Agg 2 in fimbrijalni Agg 3 v masnem razmerju od okoli 1,5 do okoli 2:1 in ugotovili smo, daje v bistvu brez Agg 1.

Primer 3;

Ta primer opisuje toksoidacijo očiščenih Bordetella pertussis antigenov, PT in FHA,

PT, pripravljen v čisti obliki kot je opisano v primeru 2, smo toksoidirali tako, da smo naravnali glutaraldehidno koncentracijo v PT raztopini na 0,5 % ±0,1 % in ga inkubirali 4 ure pri 37 °C ±3 °C. Reakcijo smo ustavili z dodajanjem L-aspartata do 0,21 ±0,02 M. Zmes smo nato vzdrževali pri sobni temperaturi 1 ± 0,1 ure in nato pri 2 °C do 8 °C 1 do 7 dni.

Nastalo zmes smo diafiltrirali proti 10 mM kalijev fosfat/0,15M NaCl/5 % glicerol pufru na 30 kDa NMWL membranskem filtru in nato sterilizirali s prepustom skozi <0,22 pm membranski filter. To sterilno zalogo smo shranili pri 2 °C do 8 °C in v obdobju 3 mesecev izvedli adsorpcijo.

FHA frakcijo, pripravljeno v čisti obliki kot je opisano v primeru 2, smo toksoidirali tako, da smo naravnali koncentracijo L-lizina in formaldehida na 47 ± 5 mM in 0,24 ± 0,05 % ter inkubirali 6 tednov pri 35 °C do 38 °C. Zmes smo nato diafiltrirali proti 10 mM kalijevem fosfatu/0,5 M NaCl ob uporabi 30 kDa NMWL membranskega filtra ter sterilizirali s prehodom skozi membranski filter. To sterilno zalogo smo shranili pri 2 °C do 8 °C ter v obdobju 3 mesecev izvedli adsorpcijo.

Primer 4:

Ta primer opisuje adsorpcijo očiščenih antigenov Bordetella pertussis.

Za posamezno adsorpcijo PT, FHA, Agg in 69 kDa na aluminijev fosfat (galun), smo pripravili zalogo raztopine aluminijevega fosfata v koncentraciji 18,75 ±1 mg/ml. Pripravili smo ustrezno posodo in kateregakoli izmed antigenov aseptično porazdelili v posodo. Aseptično smo dodali 2-fenoksietanol, da smo dosegli končno koncentracijo 0,6 % ±0,1 % v/v in mešali do homogenosti. V posodo smo aseptično dodali ustrezen volumen aluminijevega fosfata. Dodali smo ustrezen volumen sterilne destilirane vode, da smo dosegli končno koncentracijo 3 mg aluminijevega fosfata/ml. Vsebnike smo zapečatili in označili ter pustili mešati pri sobni temperaturi 4 dni. Posodo smo nato shranili, daje počakala do končnega formuliranja.

Primer 5:

Ta primer opisuje formulacijo komponentne pertusisne vakcine kombinirane z difteričnim in tetanusnim toksoidom.

Antigene B. pertussis, pripravljene kot je opisano v predhodnih primerih, smo formulirali z difteričnim in tetanusnim toksoidom, da smo zagotovili več komponentnih pertusisnih (CP) vakcin, kot je opisano spodaj.

Pertusisne komponente smo proizvedli iz Bordetella pertussis, gojene v submerzni kulturi, kot je natančno opisano v primerih 1 do 4 zgoraj. Po zaključku rasti smo kultivacijsko brozgo in bakterijske celice ločili s centrifugiranjem. Vsak antigen smo čistili individualno. Pertusisni toksin (PT) in filamentni hemaglutinin (FHA) smo očistili iz brozge s sekvenčno kromatografijo preko biserov in hidroksilapatita. PT smo detoksificirali z glutaraldehidom in kakršenkoli rezidualni PT (približno 1 %), prisoten v FHA frakciji, smo detoksificirali s formaldehidom. Iz bakterijskih celic smo pripravili fimbrijalne aglutinogene (2+3) (AGG). Celice smo razkrojili s sečnino in jih toplotno obdelali, fimbrijalne aglutinogene pa smo očistili s precipitacijo s polietilenglikolom in kromatografijo skozi polietileniminsko kremenico. 69 kDa proteinsko (pertaktin) komponento smo izolirali iz eluata iz stopnje biserne kromatografije (primer 2) z obarjanjem z amonijevim sulfatom ter očistili s sekvenčno kromatografijo preko hidroksilapatita in Q-sefaroze. Vse komponente smo sterilizirali s filtracijo skozi 0,22 gm membranski filter.

Difterični toksoid smo pripravili iz Corynebacterium diphtheriae, gojene v submerzni kulturi, s standardnimi metodami. Proizvodnjo difteričnega toksoida smo razdelili v 5 stopenj, in sicer na vzdrževanje delovnega semena, rast Corynebacterium diphtheriae, žetev difteričnega toksina, detoksifikacijo difteričnega toksina in koncentriranje difteričnega toksoida.

Priprava difteričnega toksoida (I) Delovno seme

Sev Corynebacteriwn diphtheriae smo vzdrževali kot liofilizirano semensko zalogo. Rekonstruirano seme smo gojili na Loeffierjevih poševninah 18 do 24 ur pri 35 °C ±2 °C in ga nato prenesli v bučke difteričnega medija. Kulturo smo nato testirali na čistoto in Lf vsebnost. Preostalo seme smo uporabili za inokulacijo fermentorja.

(II) Rast Corynebacterium diphtheriae

Kulturo smo inkubirali pri 35 °C ± 2 °C in jo stresali v fermentorju. H kulturi smo dodali predhodno določene količine železovega sulfata, kalcijevega klorida in fosfatne raztopine. Za vsako zalogo medija smo eksperimentalno določili dejanske količine vsake raztopine (fosfata, železovega sulfata, kalcijevega klorida). Izbrani nivoji so bili tisti, ki so dali najvišjo Lf vsebnost. Na koncu rastnega ciklusa (30 do 50 ur) smo kulture vzorčevali za čistost in Lf vsebnost.

pH smo naravnali z natrijevim bikarbonatom in kulturo inaktivirali z 0,4 % toluenom 1 uro pri vzdrževani temperaturi 35 °C + 2 °C. Nato smo izvedli test sterilnosti, da smo potrdili odsotnost žive C. diphtheriae.

(III) Žetev difteričnega toksina

S toluenom obdelane kulture iz enega ali več fermentorjev smo zbrali v velikem rezervoarju. Dodali smo približno 0,12 % natrijevega bikarbonata, 0,25 % oglja in 23 % amonijevega sulfata in testirali pH.

Zmes smo mešali okoli 30 minut. Dodali smo diatomejsko zemljo in zmes prečrpali v globinski filter. Filtrat smo recirkulirali, dokler ni bil čist, ga nato zbrali in vzorčevali za testiranje Lf vsebnosti. K filtratu smo dodali dodatno količino amonijevega sulfata, da smo dobili koncentracijo 40 %. Dodali smo tudi diatomejsko zemljo. To zmes smo vzdrževali 3 do 4 dni pri 2 °C do 8 °C, da smo omogočili umiritev oborine. Precipitiran toksin smo zbrali in raztopili v 0,9 % slanici. Diatomejsko zemljo smo odstranili s filtracijo in toksin dializirali proti 0,9 % slanici, da smo odstranili amonijev sulfat. Dializiran toksin smo zbrali in ga vzorčevali za testiranje Lf vsebnosti in čistote.

(IV) Detoksifikacija difteričnega toksina

Detoksifikacijo smo izvedli neposredno po dializi. Za detoksifikacijo smo toksin razredčili v tolikšni meri, daje končna raztopina vsebovala:

a) difterični toksin pri 1000 ± 10 % Lf/ml

b) 0,5 % natrijev bikarbonat

c) 0,5 % formalin

d) 0,9 % m/v L-lizin monohidroklorid

Raztopino smo privedli do volumna s slanico in pH naravnali na 7,6 ±0,1.

Toksoid smo filtrirali skozi filtrske celulozne blazinice diatomejske zemlje in/ali skozi membranski predfilter in 0,2 pm membranski filter v zbiralno posodo ter ga inkubirali 5 do 7 tednov pri 34 °C. Odvzeli smo vzorec za testiranje toksičnosti.

(V) Koncentriranje očiščenega toksoida

Toksoide smo zbrali, jih nato koncentrirali z ultrafiltracijo in zbrali v ustreznem vsebniku. Odvzeli smo vzorce za testiranje Lf vsebnosti in čistote. Dodali smo konzervans (2-fenoksietanol), da smo dobili končno koncentracijo 0,375 % in pH naravnali na 6,6 do 7,6.

Toksoid smo sterilizirali s filtracijo skozi predfilter in 0,2 pm mebranski filter (ali ekvivalent) ter zbrali. Sterilni toksoid smo nato vzorčili za testiranje ireverzibilnosti toksoidne Lf vsebnosti, vsebnosti konzervansa, čistote (vsebnost dušika), sterilnosti in toksičnosti. Sterilni koncentrirani toksoid smo shranili pri 2 °C do 8 °C do končnega formuliranja.

Priprava tetanusnega toksoida

Tetanusni toksoid (T) smo pripravili iz Clostridium tetani, gojene na submerzni kulturi.

Proizvodnjo tetanusnega toksoida lahko razdelimo v pet stopenj, in sicer na vzdrževanje delovnega semena, rast Clostridium tetani, žetev tetanusnega toksina, detoksifikacijo tetanusnega toksina in čiščenje tetanusnega toksoida.

(I) Delovno seme

Sev Clostridium tetani, uporabljen v proizvodnji tetanusnega toksina za konverzijo v tetanusni toksoid, smo vzdrževali v liofilizirani obliki v semenski zalogi. Seme smo inokulirali v tioglikolatni medij in ga pustili rasti približno 24 ur pri 35 °C ± 2 °C. Odvzeli smo vzorec za testiranje čistote kulture.

(II) Rast Clostridium tetani

Tetanusni medij smo porazdelili v fermentor, ga toplotno obdelali in ohladili. Fermentor smo nato zasejali in pustili kulturo rasti 4 do 9 dni pri 34 °C ±2 °C. Vzeli smo vzorec za testiranje čistote kulture in Lf vsebnosti.

v (III) Žetev tetanusnega toksina

Toksin smo ločili s filtracijo skozi celulozne balzinice z diatomejsko zemljo in očiščen toksin nato filtracijsko sterilizirali z uporabo membranskih filtrov. Odvzeli smo vzorce za testiranje Lf vsebnosti in sterilnosti. Toksin smo koncentrirali z ultrafiltracijo ob uporabi velikosti por 30000 daltonov.

(IV) Detoksifikacija tetanusnega toksina

Toksin smo pred detoksifikacijo vzorčili za testiranje Lf vsebnosti. Koncentrirani toksin (475 do 525 Lf/ml) smo detoksificirali z dodatkom 0,5 % m/v natrijevega bikarbonata, 0,3 % v/v formalina in 0,9 % m/v L-lizin monohidroklorida in ga privedli do volumna s slanico. pH smo naravnali na 7,5 + 0,1 in zmes inkubirali 20 do 30 dni pri 37 °C. Odvzeli smo vzorce za testiranje sterilnosti in toksičnosti.

v (V) Čiščenje toksoida

Koncentrirani toksoid smo sterilizirali skozi predfiltre, katerim so sledili 0,2 pm membranski filtri. Odvzeli smo vzorce za testiranje sterilnosti in Lf vsebnosti.

Optimalna koncentracija amonijevega sulfata je temeljila na frakcionimi S krivulji, določeni iz vzorcev toksoida. Prva koncentracija je bila dodana toksoidu (razredčen na 1900-2100 Lf/ml). Zmes smo vzdrževali vsaj 1 uro pri 20 °C do 25 °C, nakar smo supematant zbrali in precipitat, ki je vseboval frakcijo z visoko molekulsko maso, zavrgli.

Drugo koncentracijo amonijevega sulfata smo dodali supematantu za drugo frakcionacijo, da smo odstranili nečistote z nizko molekulsko maso. Zmes smo vzdrževali vsaj 2 uri pri 20 °C do 25 °C, nato pa smo jo lahko vzdrževali pri 2 °C do 8 °C največ 3 dni. Oborino, ki predstavlja očiščeni toksoid, smo zbrali s centrifugiranjem in filtracijo.

Amonijev sulfat smo od očiščenega toksoida odstranili z diafiltracijo z uporabo Amicon (ali ekvivalentnih) ultrafiltracijskih membran s PBS, vse dokler ni bilo v toksoidni raztopini več možno zaznati amonijevega sulfata. pH smo naravnali na 6,6 do 7,6 in dodali 2-fenoksietanol, da smo dobili končno koncentracijo 0,375 %. Toksoid smo sterilizirali z membransko filtracijo in odvzeli vzorce za testiranje (ireverzibilnost toksoida, Lf vsebnost, pH, vsebnost konzervansa, čistota, sterilnost in toksičnost).

Formulacija multivalentne vakcine

Eno formulacijo komponentne pertusisne vakcine, združene z difteričnim in tetanusnim toksoidom, smo označili CP10/5/5/3DT (včasih imenovana KLASIČNA). Vsako 0,5 ml humano dozo CP10/5/5/3DT smo formulirali tako, daje vsebovala:

pg pertusisnega toksoida (PT) pg filamentnega hemaglutonina (FHA) pg fimbrijalnih aglutinogenov 2 in 3 (FIMB) pg 69 kDa proteina zunanje membrane

Lf difteričnega toksoida

Lf tetanusnega toksoida

1,5 mg aluminijevega fosfata

0,6 % 2-fenoksietanola kot konzervans.

Še eno formulacijo komponentne pertusisne vakcine, kombinirane z difteričnim in tetanusnim toksoidom, smo označili CP10/5/5DT (včasih imenovana HIBRID). Vsako 0,5 ml humano dozo CP10/5/5DT smo formulirali tako, daje vsebovala:

pg pertusisnega toksoida (PT) μg filamentnega hemaglutonina (FHA) μg fimbrijalnih aglutinogenov 2 in 3 (FIMB)

Lf difteričnega toksoida

Lf tetanusnega toksoida

1,5 mg aluminijevega fosfata

0,6 % 2-fenoksietanola kot konzervans.

Še eno formulacijo komponentne pertusisne vakcine, kombinirane z difteričnim in tetanusnim toksoidom, smo imenovali CP20/20/5/3DT. Vsako 0,5 ml humano dozo CP20/20/5/3DT smo formulirali tako, daje vsebovala:

μg pertusisnega toksoida (PT) μg filamentnega hemaglutonina (FHA) pg fimbrijalnih aglutinogenov 2 in 3 (FIMB) μg 69 kDa proteina zunanje membrane

Lf difteričnega toksoida

Lf tetanusnega toksoida

1,5 mg aluminijevega fosfata

0,6 % 2-fenoksietanola kot konzervans.

Nadaljnjo formulacijo komponentne pertusisne vakcine, kombinirane z difteričnim in tetanusnim toksoidom, smo označili CP20/10/10/6DT. Vsako 0,5 ml humano dozo CP20/10/10/6DT smo formulirali tako, daje vsebovala:

μg pertusisnega toksina (PT) μg filamentnega hemaglutonina (FHA) pg fimbrijalnih aglutonogenov 2 in 3 (FIMB) 6 pg 69 kDa proteina zunanje membrane

Lf difteričnega toksoida

Lf tetanusnega toksoida

1,5 mg aluminijevega fosfata

0,6 % 2-fenoksietanola kot konzervans.

Primer 6:

Ta primer opisuje klinično oceno komponentnih aceličnih pertusisnih vakcin.

v (a) Študije na odraslih

Študije na odraslih in otrocih, starosti 16 do 20 mesecev, so pokazale, da so multikomponentne vakcine, ki vsebujejo fimbrijalne aglutinogene vame in imunogene (tabela 2).

Fazo I klinične študije smo izvedli pri 17 in 18 mesecev starih otrocih v Calgaryu, Alberta, s petkomponentno pertusisno vakcino (CP10/5/5/3DT) in poročali smo o škodljivi reakciji. 33 otrok je prejelo vakcino, dodatnih 35 pa jih je prejelo enako vakcino brez komponente 69 kDa proteina.

Lokalne reakcije so bile redke. Sistemske škodljive reakcije, v glavnem sestoječe iz preobčutljivosti, so bile prisotne pri približno polovici udeležencev študije, ne glede na to, katero vakcino so prejeli. Signifikantne dvige protiteles smo izmerili za anti-PT, anti-FHA, anti-fimbrijalne aglutinogene in anti-69 kDa IgG protitelesa z encimskim imunotestom in anti-PT protitelesa v CHO celičnem nevtralizacijskem testu. Pri otrocih, ki so prejeli štirikomponentno (CP10/5/5DT) ali petkomponentno (CP10/5/5 3DT), nismo opazili nobenih razlik v protitelesnem odzivu, razen v anti-69 kDa protitelesu.

Otroci, ki so prejeli petkomponentno vakcino, ki je vsebovala 69 kDa protein, so imeli signifikantno višji nivo post-imunizacijskih anti-69 kDa protiteles.

Študija odziva na dozo je bila izvedena s štirikomponentno vakcino v Winnipegu, Manitoba, Kanada. Uporabili smo dve komponentni vakcinski formulaciji: CP10/5/5/3DT in CP20/10/10/6DT. Kot kontrola je bila vključena tudi celocelična DPT vakcina.

Ta študija je bila dvojna-slepa študija pri enaindevetdesetih 17 do 18 mesecev starih otrocih v času njihovega poživilnega pertusisnega odmerka. Ti otroci so dobro prenašali obe, CP10/5/5/3DT in CP20/10/10/6DT. Izražene niso bile nobene razlike v številu otrok, ki so imeli kakršnokoli lokalno reakcijo ali sistemske reakcije po katerikoli od komponentnih vakcin. Nasprotno pa je imelo signifikantno več otrok, ki je prejelo celocelično vakcino, lokalne in sistemske reakcije, kot tisti otroci, ki so prejeli CP₂o/io/io/6DT komponentne vakcine.

Študije pri otrocih:

Faza II:

Študijo smo izvedli uporabo CP10/5/5/3DT vakcine v Calgaryu, Alberti in Britanski Kolumbiji, Kanada. V tej študiji je 432 otrok v starosti 2, 4 in 6 mesecev prejelo komponentno pertusisno vakcino ali celocelično kontrolno vakcino DPT.Ti otroci so dobro prenašali CP10/5/5/3DT vakcino. Po vsaki dozi so bile lokalne reakcije manj običajne s komponentno vakcino, kot s celocelično vakcino.

Signifikanten protitelesih odziv na vse antigene se je pojavil po vakcinaciji s komponentno pertusisno vakcino. Recipienti celocelične vakcine so imeli močan protitelesih odziv na fimbrijalne aglutinogene, D in T. Pri sedmih mesecih je imelo 82 % do 89 % recipientov komponentne vakcine in 92 % recipientov celocelične vakcine štirikratno povišanje ali večji dvig v protitelesnem titru na fimbrijalne aglutinogene. Nasprotno pa je bil protitelesih odziv na FHA 75 % do 78 % pri komponentnih vakcinah v primerjavi z 31 % pri recipientih celocelične vakcine.

Štirikratno povišanje v anti-69 kDa protitelesu je bilo opaženo pri 90 % do 93 % recipientih komponentah vakcin in 75 % pri recipientih celocelične vakcine. Štirikratno povišanje v protitelesu proti PT z encimskim imunotestom je bilo opaženo pri 40 % do 49 % komponentah vakcin in 32 % celoceličnih vakcin; štirikratno povišanje v PT protitelesu s CHO nevtralizacijo je bilo ugotovljeno pri 55 % do 69 % komponentah in 6 % celoceličnih vakcin (tabela 2).

Faza IIB:

Pri 100 otrocih starosti 2, 4 in 6 mesecev sta bili CP20/20/5/3DT in CP10/10/5/3DT vakcini ocenjeni v naključni slepi študiji proti D15PT kontrob z nižjo vsebnostjo difterije 15 Lf v primerjavi s 25 Lf formulacijo. Med obema komponentama formulacijama nismo opazili razlik v nivojih škodljivih reakcij; obe sta bili signifikantno manj reaktogeni kot celocelična kontrola. Pri recipientih CP20/20/5/3DT vakcine s povečano vsebnostjo antigena so bili doseženi višji titri protiteles proti PT z encimskim imunotestom in CHO nevtralizacijo ter proti FHA. Pri sedmih mesecih je bil anti-FHA geometrijski srednji titer 95,0 pri recipientih CP20/20/5/3DT, 45,2 pri recipientih CP10/5/5/3DT in le

8,9 pri recipientih Di₅PT. Anti-PT titri so bili 133,3, 58,4 in 10,4 z imunotestom in

82,4, 32,7 in 4,0 s CHO nevtralizacijo (tabela 2).

Ta študija je pokazala, da je bila komponentna pertusisna vakcina, kombinirana z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom s povečano antigensko vsebnostjo, vama in imunogena pri otrocih in da je povečana antigenska vsebnost povišala imunski odziv na pripravljene antigene (PT in FHA), ne da bi se pri tem povečala reaktogenosti.

NIAID, FAZA II, ZDA primerjalni test:

Faza II študije je bila izvedena v Združenih državah Amerike pod nadzorom nacionalnega inštituta za alergijske in infekcijske bolezni (National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NLAID)) kot uvod v test učinkovitosti aceličnih pertusisnih vakcin velikega merila. Eno komponentno pertusisno vakcino v smislu izuma, v kombinaciji z adsorbiranima difteričnim in tetanusnim toksoidom, (CP10/5/5/3DT), smo vključili v ta test skupaj z 12 drugimi aceličnimi vakcinami in 2 celoceličnima vakcinama. Varnostni rezultati so bili poročani pri 137 otrocih, imuniziranih v starosti 2, 4 in 6 mesecev s CP10/5/5/3DT komponentno vakcino.

Kot je bilo vidno že v predhodnih študijah, je bilo ugotovljeno, da je komponentna vakcina vama, ima nizko reaktogenost in jo vakcine dobro tolerirajo. Pri 7 mesecih so bila vsa anti-PT protitelesa, anti-FHA protitelesa, anti-69 kDa protitelesa in anti-fimbrijalna aglutinogenska protitelesa višja ali ekvivalentna nivojem, ki so bili doseženi po celoceličnih vakcinah (ref. 71 in tabela 2). Izvedena je bila dvojna slepa študija, v kateri so bili otroci naključno alocirani, da so prejeli bodisi CP20/20/5/3DT ali CP10/5/5/3DT vakcinsko formulacijo. Skupno je bilo v Združenih državah Amerike in Kanadi vključeno 2050 otrok; 1961 otrok je zaključilo študijo. Pri teh otrocih sta bili obe vakcinski formulaciji vami, z nizko reaktogenostjo in imunogenostjo. Imunogenost smo določili v podskupini 292-tih. Dvig protiteles je bil izzvan na vse antigene, ki so bili vsebovani v vakcini, z obema vakcinskima formulacijama. CP20/20/5/3DT formulacija je izzvala višje protitelesne titre proti FHA, toda ne proti PT. CP10/5/5/3DT formulacija je izzvala višje titre proti fimbrijam in višje aglutinogenske titre.

Nadaljnja varnostna in imunogenska študija je bila izvedena v Franciji. Načrt študije je bil podoben tistemu v severnoameriški študiji, ki je opisana zgoraj, s to razliko, da so bile vakcine dajane v starosti 2, 3 in 4 mesece. Lokalne in sistemske reakcije so bile splošno majhne. Splošno je bila vakcina pri udeležencih francoske študije ob uporabi tega režima dajanja dobro sprejeta.

S placebom kontroliran test učinkovitosti dveh aceličnih pertusisnih vakcin in celocelične vakcine pri 10000 otrocih

Po rezultatih NIAID faze II primerjalnega testa v ZDA sta bili izbrani dvokomponentna in petkomponentna acelična vakcina za multi-centrični, kontroliran, dvojno-naključen, s placebom kontroliran test učinkovitosti. Klinični test je bil izveden na Švedskem, kjer je visoka incidenca pertusisa. Dvokomponentna vakcina je vsebovala gliceraldehid in s formalinom inaktiviran PT (25 gg), s formalinom obdelan FHA (25 gg) in difterični toksoid 17 Lf ter tetanusni toksoid 10 Lf. Petkomponentna pertusisna vakcina je bila CP10/5/5/3DT.

Za test je bilo v štirinajstih geografsko definiranih študijskih krajih z uporabo registra rojstev rekrutiranih 10000 otrok, ki so predstavljali približno eno polovico otrok te starostne skupine na Švedskem.

Otroci, rojeni januarja in februarja 1992, so bili naključno izbrani v trodelni test. Po soglasju staršev sta dve tretjini otrok v starosti 2, 4 in 6 mesecev prejeli enega izmed dveh difterija-tetanus-acelični pertusis pripravkov. Kontrolna skupina je prejela le DT. V maju 1992 je bila uvedena v ZDA za uporabo dovoljena, tržno razpoložljiva celocelična DTP vakcina, in otroci, rojeni od marca do decembra 1992, so bib naključno izbrani v Štiridelni test. Po soglasju staršev so tri četrtine otrok v starosti 2, 4 in 6 mesecev prejele enega izmed treh DTP pripravkov. Kontrolna skupina je prejela le DT.

Vsako vakcino smo dali približno 2500 otrokom. Vakcine so bile dajane v treh odmerkih. Prvi odmerek smo dali v starosti 2 mesecev in ne kasneje kot v starosti 3 mesecev. Naknadne odmerke smo dali z osemtedenskimi intervali. Vakcine smo dali z intramuskulamo injekcijo.

Otroke in njihove družine smo spremljali 30 mesecev. Če smo sumili na pertusis, smo zbrali klinične podatke in laboratorijsko potrdili bolezen z nazalnimi aspirati za bakteriološko kulturo ter z diagnozo s polimerazno verižno reakcijo (PCR). Za serološke diagnoze smo zbrali akutne in konvalescentne krvne vzorce.

Pred to študijo je bil obseg pertaktina, kot posledice komponentnih pertusisnih vakcin v smislu predloženega izuma, pri rizični človeški populaciji (še zlasti novorojenčkih), neznan. Še zlasti je bil neznan prispevek različnih Bordetella komponent in njihove prisotnosti v pertusisnih vakcinah v izbranih relativnih količinah k učinkovitosti vakcin.

Glavni cilj testa je bil oceniti sposobnost aceličnih pertusisnih vakcin in celocelične vakcine za zaščito proti tipičnem pertusisu v primerjavi s placebom.

Drugi cilj je bil raziskati učinkovitost vakcine proti potrjeni pertusisni infekciji različne resnosti.

Učinkovitost vakcine je definirana kot odstotno zmanjšanje v verjetnosti za kontraktilni pertusis med recipienti vakcine glede na nevakcinirane otroke.

Relativno tveganje za pertusis je v obeh vakcinskih skupinah izraženo kot razmerje verjetnosti za bolezen v teh dveh skupinah.

Verjetnost kontraktnega pertusisa, imenovana tudi nivo napada, lahko ocenimo na različne načine. V izračunih vzorčne velikosti je verjetnost kontraktnega pertusisa v dani študijski skupini ocenjena s kvocientom med številom otrok s pertusisom in številom otrok, ki ostanejo v študijski skupini ob končanju zasledovanja študije.

Učinkovitost komponentne vakcine CP10/5/5/3DT za preprečevanje tipičnega pertusisa v tem testu je prikazana v tabeli 4 in je bila okoli 85 %. V istem testu je bila dvokomponentna pertusisna acelična vakcina, ki je vsebovala le PT in FHA, okoli 58 % učinkovita in celocelična vakcina je bila okoli 48 % učinkovita. CP10/5/5/3DT je bila učinkovita tudi pri preprečevanju blagega pertusisa z ocenjeno učinkovitostjo okoli 77 %.

Primer 7

Ta primer opisuje formulacijo in imunogenost multivalentne kombinirane vakcine, ki vsebuje kapsulami polisaharid Haemophilus influenzae.

(a) Priprava PRP-T komponente

Kapsulami polisaharid (PRP) iz H. influenzae smo očistili in konjugirali na tetanusni toksoid na naslednji način. Iz liofiliziranih ampul delovne semenske zaloge H. influenzae smo izvedli tri zaporedne predkultivacije. Prva predkultivacija je bila na trdnem mediju. Ampule smo inokulirali v posode oglje agar + prevreta kri (10 % konjske krvi segrevane 15 min pri 80 °C) in inkubirali 20 ± 4 ure pri 36 °C do 37 °C pod CO₂. Druga predkultivacija je bila v tekočem mediju 8 ur pri 37 °C. Tekoči medij je imel naslednjo sestavo na liter:

1. kazamino-kisline Difco 10 g mononatrijev fosfat 2H₂O 2,03 g dinatrijev fosfat 12H₂O 31,14 g natrijev laktat (60 % raztopina) 1,5 ml

L-cistin 0,07 g

L-triptofani 0,02 g

CaCl₂, 2H₂O 0,02 g (NH4)₂ SO₄ 1 g

MgSO₄, 7H₂O 0,4 g protipenilo Dow Corning M.S.A.

pri 25 % v parafinskem olju 0,15 ml

2. Ultrafiltrat hemina + dekstroze v razmerju 20 g dekstroze in 1 mg hemina.

Tej raztopini smo dodali 5 mg nikotinamid - adenin dinukleotida Steriliziran s filtracijo.

3. Kvasni ekstrakt Difco 5 g

Steriliziran s filtracijo.

Tretja predkultivacija je potekla v tekočem mediju ob mešanju 4 ure pri 37 °C. Tretjo predkultivacijo smo uporabili za inokulacijo fermentorja in kulturo smo ob mešanju vzdrževali pri 37 °C 12 do 14 ur. Kulturo smo zbrali v ohlajenem rezervoarju. Dodali smo formalin v koncentraciji 10 ml/liter. Kulturo smo ob rahlem mešanju vzdrževali pri 4 °C 2-24 ur in jo nato odcentrifugirali. Dodani formalin ni bil namenjen za to, da bi popolnoma inaktiviral bakterije, ampak da bi ustavil rast in inhibiral metabolizem. Ta dodatek je zmanjšal celično lizo s posledično kontaminacijo z intraceličnimi komponentami. Ta fiksacija je trajala od 2 do 24 ur in značilno smo kulturo, predno smo jo centrifugirali, pustili stati preko noči. Supematant, ki je vseboval pobsaharid, smo poželi in bakterijsko peleto zavrgli. Postopek čiščenja smo splošno izvedb v hladnem prostoru ali pri takšnih pogojih, da je bila temperatura produktov in reagentov manjša ali enaka + 10 °C, razen pri koraku fenolnega čiščenja, katerega smo izvedb pri sobni temperaturi. Po centrifugiranju kulture smo supematant kulture skoncentrirali. Kapsulami pobsaharid smo precipitirali iz nastalega koncentrata z dodatkom centrimida, da smo dobili končno koncentracijo 5 % m/v. Centrimid je precipitiral PS iz koncentrirane tekočine (SNF). Koprecipitiralo se je tudi nekaj proteina, nukleinske kisline in lipopolisaharida (LPS). Precipitate smo zbrali s centrifugiranjem, pri čemer je v SNF ostalo še nekaj drugih kontaminantov in proteina. Nastalo peleto smo zbrali s centrifugiranjem in jo shranili pri < -20 °C.

Pelete smo resuspendirali v 0,3 M NaCl raztopini in suspenzijo ponovno centrifugirali. NaCl je selektivno disociiral polisaharidne centrimidne komplekse. V postopku so se disociirali tudi nekateri kontaminanti (nukleinska kislina, LPS, protein). K supematantu smo dodali predhodno ohlajen absolutni etanol do končne koncentracije 60 %. Nastali precipitat smo zbrali s centrifugiranim in ga sprali s hladnim absolutnim metanolom. Precipitat smo posušili pod vakuumom pri 0-4 °C in to je bil intermediatni produkt. Intermediatni produkt smo pri sobni temperaturi raztopili v natrijevem acetatnem pufru in v fenolu. Vodno fazo smo zbrali z kontinuirno centrifugacijo. Fenolno ekstrakcijo in centrifugiranje se lahko večkrat ponovita in vodno fazo smo dializirali ter diafiltrirali. Kapsulami pobsaharid iz diafiltrirane raztopine smo precipitirali z dodatkom predhodno ohlajenega etanola do končne koncentracije 60 % v prisotnosti NaCl 0,3 M. Precipitat smo zbrali s centrifugiranjem, ga sprali s predhodno ohlajenim absolutnim etanolom, acetonom in etrom ter posušili pod vakuumom pri 4 °C. Posušeni precipitat smo nato pod nizko vlago zmleli v fm prah in ta produkt je tvoril očiščen polisaharid Haemophilus influenzae tipa b.

Očiščen polisaharid smo raztopili v vodi, da smo dobili 5 mg polisaharida na ml raztopine in pH z NaOH naravnali na 10,8 ± 0,2. Dodali smo cianogen bromid kot raztopino v vodi v deležu 0,5 mg CNBr/mg polisaharida. pH reakcijske zmesi smo vzdrževali z NaOH pri 10,8 ± 0,2 35 do 40 minut pri 23 °C ± 3 °C. pH smo znižali na pH 9 z dodatkom HC1. Dodali smo dihidrazid adapinske kisline, da smo dobili končno koncentracijo 3,5 mg ADH/mg polisaharida in pH naravnali na 8,5. Reakcijsko zmes smo inkubirali pri 23 ± 3°C 15 minut (pH smo vzdrževali pri 8,5) in nato raztopino ob previdnem mešanju inkubirali preko noči pri +4 °C. Reakcijsko zmes smo dializirali proti raztopini NaCl ter jo nato koncentrirali. Raztopino smo nato filtrirali skozi 0,45 μ filter ter zamrznili pri < -40 °C. Tvorila je AH-polisaharid, ki smo ga shranili pri temperaturi < -40 °C.

Za proizvodnjo tetanusne toksinske komponente smo sev Clostridium tetani inokulirali v serije epruvet ki so vsebovale 10 ml Rosenowovega medija ali tioglikolatnega medija. Rosenowov medij ima naslednjo sestavo:

formula (v gramih na liter destilirane vode) pepton 10 mesni ekstrakt 3 glukoza 2 natrijev klorid 5

Andradejev indikator (5 % fuksinska kislina) 10 ml beli marmor 1 kos možgani 1 kos

Ta medij, pripravljen neposredno pred uporabo iz že pripravljenih produktov, smo napolnili v epruvete in ga sterilizirali pri 120 °C 20 minut.

litrsko steklenico, ki je vsebovala 3 litre Massachusetts medija, smo inokulirali s

C. tetani in inkubirali 16 do 18 ur pri 35 °C ± 1 °C 16 ur. Vsebino smo nato prenesli v 20 litrsko steklenico, ki je vsebovala 15 litrov sterilnega Massachusetts medija, in inkubirali 8 ur pri 35 °C ± 1 °C. Za inokulacijo fermentorja, ki je vseboval 582 litrov Massachusetts medija smo uporabili vsako steklenico in inkubirali pri 35 °C 5 do 6 dni ob aeraciji. Fermentorje smo ohladili in kulturi dodali natrijev klorid, 12 kg, trinatrijev citrat, 8 kg. Stresanje smo nadaljevali 1 dan, nato prenehali in ta postopek omogoča ekstrakcijo rezidualnega toksina iz bakterij ob koncu gojenja. Toksin smo zbistrili bodisi s filtracijo, bodisi s prepustom skozi kontinuimo centrifugo.

Supernatant iz 1200 1 kulture smo koncentrirali z ultrafiltracijo in koncentriran toksin diafiltrirali proti raztopini 0,07 M dinatrijevega fosfata pH 8,2. Končni volumen smo naravnali na 500 Lf/m.

Za pridobitev očiščenega tetanusnega toksina smo izvedli dvojno precipitacijo z amonijevim sulfatom. Tako smo amonijev sulfat in 10 g oglja počasi dodali na liter predhodno dobljenega diafiltriranega toksina. Po 16 do 24 urah inkubacije pri + 4 °C smo toksin filtrirali na kartušah, da smo odstranili precipitat. Nato smo počasi dodali dovoljšnjo količino amonijevega sulfata na liter predhodno dobljenega supematanta, da smo pripravili 320 gm/1. Po okoli 48 urah pri +4 °C smo peleto zbrali s centrifugiranjem in jo raztopili v 0,05 M raztopini dinatrijevega fosfata pH 8,2. Raztopino smo diafiltrirali proti 0,05 M raztopini dinatrijevega fosfata pH 8,2 in naravnali na 300 Lf/ml. Raztopino smo nato filtrimo sterilizirali. Dodali smo 7,5 pmolov (0,225 %) formaldehida na ml toksinske raztopine. Detoksifikacija je bila dosežena po inkubaciji 24 dni pri +37 °C, vključno z intermediantnimi obdobji pri +4°C in +22 °C. Izvedli smo sterilizacijo s filtriranjem (0,22 μ), da smo dobili tetanusni toksoid. Tetanusni toksoid smo dializirali in koncentrirali proti NaCl ob uporabi membrane, ki loči molekulsko maso < 50000. Koncentrirani protein smo nato aseptično filtrirali in shranili pri +4 °C.

Enake količine AH-polisaharida in tetanusnega toksoida (±20 %) smo zmešali z 0,05 M NaCl, da smo dobili koncentracijo 7,5 mg polisaharida na ml. pH raztopine smo s HCI naravnali na pH 5,7 + 0,2 in dodali l-etil-3-(3-dimetil aminopropil)karbodiimid (EDAC), da smo dobili končno koncentracijo 19,17 mg EDAC/ml reakcijske zmesi. Karbonilne skupine tetanusnega proteina se aktivirajo z vezavo na EDAC. Pod rahlo kislimi pogoji reakcije sledi kondenzacijska reakcija, v kateri se kovalentno vežeta AH-PS in EDAC-aktivirani tetanusni protein. Zmes smo inkubirali pri konstantnem pH (5,7) 60 minut pri +4 °C in nato pH naravnali na pH 6,9 ± 0,2 z NaOH ter reakcijsko zmes dializirali proti NaCl pri + 4°C. Konjugat smo očistili s conskim centrifugiranjem na saharoznem gradientu (4 % do 60 %), da smo odstranili EDAC, prost AH-polisaharid, prost tetanusni protein in konjugat nizko molekulsko maso. K frakciji, ki je vsebovala posaharidni konjugat, smo nato dodali vodo brez pirogena, saharozo, Tris HCI pufer, da smo dobili konjugatno raztopino naslednje sestave:

saharoza 8,5 % m/v ± 0,5 % polisaharid konc. približno 200 μg/ml Tris-HCI pufer 10 mM pH 7,0 ± 0,5.

Raztopino smo nato aseptično filtrirali z uporabo 0,2 μ filtra in shranili pri -40 °C.

Zalogo Haemophilus influenzae tip b polisaharidnega konjugata smo razredčili pod sterilnimi pogoji z razredčilom, da smo dobili končno sestavo:

polisaharid Haemophilus tipa b konjugat koncentrirana zaloga Tris-HCI pufer 200 mM do pH 7,2 saharoza voda za injiciranje do 200 mg polisaharida do 10 mM do 850 g do 101

Končno zalogo smo napolnili v viale in liofilizirali. (Za uporabo smo liofilizirano vakcino rekonstruirali z 0,5 ml ali 0,4 % NaCI).

(b) Formulacija

Testirali smo dve formulaciji multivalentne komponentne vakcine (APDT). Prva (APDT-nizka) je vsebovala 10 pg pertusisnega toksoida (PT), 5 pg filamentnega hemaglutinina (FHA), 5 pg fimbrij 2 ter 3 pg 69 K proteina (69K) na 0,5 ml doze (KLASIČNA). Druga formulacija (APDT-visoka) je vsebovala dvojno količino PT (20 pg) in identične količine FIM in 69K (HIBRID). Obe formulaciji sta vsebovali 15 meje flokulacije (Limit of flocculation = Lf) difteričnega toksoida, 5 Lf tetanusnega toksoida, 1,5 mg aluminijevega fosfata kot adjuvansa in 0,6 % 2-fenoksietanola kot konzervansa. Hib-tetanusni toksoid konjugatno vakcino (PRPT) smo proizvedli na način, kije opisan zgoraj v Connaught Laboratories Inc. (Swiftwater, ZDA).

Populacija

V študijo smo rekrutirali zdrave, 17 do21 mesecev stare otroke, ki so bili v starosti 2, 4 in 6 mesecev v predhodnem kliničnem testu imunizirani s tremi odmerki bodisi APDT-nizka, bodisi s PRPT kot ločenimi injekcijami. Po soglasju na pisno informacijo, smo otroke alocirali z računalniško generiranim uravnoteženim blokovnim seznamom naključnih številk, tako da so prejeli bodisi PRT-T kot ločeno injekcijo na isti dan, kot ločeno injekcijo z PRP-T, katero smo dali en mesec po ADPT vakcini, ali kot posamezno injekcijo (liofilizirana PRP-T, rekonstruirana v APDT). APDT formulacija (visoka ali nizka) je za vsakega otroka ostala enaka, kot je bila dajana pri prvih treh odmerkih (alokacijsko razmerje 6:1 APDT-viska; APDT-nizka). Vakcine smo dali i.m. z 25 mm iglo v deltoidno mišico rame ali v stegensko mišico vastus lateralis, če deltoid ni imel dovoljšne mase. Kjer je bila za PRP-T potrebna druga injekcija, smo jo inicirali v nasproten ud.

Klinično in laboratorijsko nadzorovanje (monitoring)

Udeležence smo nadzorovali na lokalne in sistemske škodljive reakcije takoj po imunizaciji in preko staršev 72 ur po imunizaciji. Podatke smo zbrali s strukturiranim telefonskim intervjujem po 24 in 72 urah. Telesno temperaturo smo merili vsaj enkrat dnevno ali kadarkoli so starši mislili, da je otrok vročičen. Občutljivost in sistemske reakcije (iritabilnost, zmanjšana aktivnost, zmanjšan apetit) smo ocenili kot blage, zmerne ali resne glede na predhodno postavljene kriterije, s katerimi so starši izbrali resnost na osnovi strukturiranih primerov. Izmerjene lokalne reakcije so bile ocenjene glede na njihovo velikost in podaljšano trajanje joka. Pri otrocih, katerim smo dali PRP-T injekcijo (torej dva meseca po-APDT), smo zbrali krvne vzorce z odvzemom iz vene ali z vbodom v prst pred imunizacijo in 28 dni po njej. Z RIA smo merili protitelesa na kapsulami polisaharid Hib (PRP). IgG protitelesa na PT smo merili z ELA in PT-nevtralizacijsko protitelo z citotoksično nevtralizacijo ovarijskih celic kitajskega hrčka (CHO). IgG anti-FHA, anti-FIM in anti-69K protitelesa smo merili z ELA; število enot smo izračunali z uporabo US FDA referenčnega protiseruma (št. 3). Merili smo tudi pertusisne aglutinine. Difterični antitoksin smo merili z mikronevtralizacijskim testom in tetanusni antitoksin smo merili z ELA. Titre protiteles smo izrazili kot geometrijske sredine titrov. Serumskim vzorcem s titri, ki so bili manjši od detekcijske meje testa, smo za namen statističnih izračunov pripisali vrednost ene polovice nižje detekcijske meje.

Statistična analiza

Škodljive reakcije smo analizirali po razvrstitvi v skupino na klinično pomembnost. Nivoje škodljivih reakcij smo primerjali z Mantel-Haenszelovimi ocenami relativnega tveganja ob uporabi centrične in vakcinske formulacije kot stratifikacijskih spremenljivk. V vsakem primeru smo izvedli točkovno oceno in 95 % Cl RR. Cl, ki ne vključujejo 1,00, so statistično signifikantni.

Geometrijske sredine protitelesnih titrov in 95 % Cl smo izračunali za protitelesih titer za vsak vakcinski antigen pred in po imunizaciji. Povprečne log titre smo primerjali s trofaktorsko analizo spremembe. Razmerje oseb, ki so prejele predhodno določene nivoje v vsaki skupini, smo primerjali z logistično regresijo. Za večkratne primerjave nismo izvedli nikakršnih prilagoditev.

V študijo je bilo vključenih skupno 545 otrok (44 % žensk), od katerih jih je 74 % zaključilo otroško serijsko študijo. Razmerje udeležencev v tej študiji, ki so prejeli dve formulaciji, je ostalo 6:1 (468 APDT-visoka, 77 APDT-nizka). Srednja starost je bila

18,9 mesecev (območje 17-21 mesecev); vsi razen treh otrok (99,4 %) so zaključili študijo.

Škodljive reakcije

Nivo škodljivih reakcij se ni razlikoval po skupinah, ki so bile imunizirane z APDTvisoko ali APDT-nizko; nivoji so si bili tudi podobni, ne glede na to, ali so bile imunizacije dajane ločeno ob enem obisku, ali ob ločenih obiskih, ali pa v posamezni kombinirani injekciji.

Protitelesni odziv

Pred imunizacijo so bili protitelesni nivoji proti vsem antigenom, razen FHA, pri otrocih, ki so prejeli APDT-visoko ali APDT-nizko kot svoje prve tri doze, podobni. Otroci, ki so bili primirani z APDT-visoko, ki je vsebovala štirikratnik FHA, so imeli signifikantno višje FHA titre, kot otroci, ki so bili imunizirani z APDT-nizko (p = 0,0001). Po imunizaciji je APDT-visoka inducirala višje protitelesne titre kot APDT-nizka (p=0,0001) . Nasprotno pa so bili predimunizacijski anti-PT titri, izmerjeni s CHO nevtralizacijo ali ELA, podobni pri obeh skupinah. Paradoksalno je, da so bili, kljub dvakratni antigenski vsebnosti anti-PT, titri nižji po imunizaciji z APDT-visoko, kot APDT-nizko (p=0,038). Podobno so bila anti-FIM protitelesa in aglutinin po imunizaciji višji v skupini APDT-nizka (p = 0,01 in p = 0,04), kljub identičnim količinam fimbrijalnega antigena v obeh vakcinskih formulacijah.

Pred imunizacijo je bilo malo razlik v anti-pertusisnih protitelesih med skupino, ki je bila naključno določena, da prejema PRP-T, kombiniran z APDT, kot posamično injekcijo, ali kateri so dajali ločene injekcije na isti dan ali ločene dni. Podatki so predstavljeni ločeno za recipiente APDT-visoka ali APDT-nizka; vendar pa, zaradi majhnega števila otrok v skupini APDT-nizka, teh rezultatov kasneje ne bomo obravnavali. Skupina, naključno izbrana, da je prejela ločene injekcije na isti dan, je imela višja anti-PT protitelesa, določena s CHO nevtralizacijo, kot skupina, ki je bila določena, da prejme zaporedne injekcije na ločene dni (6,14:4,80 enot; p<0,05). Tudi v tej skupini so bili post-imunizacijski protitelesih nivoji višji (176 enot), kot v skupini ločenih injekcij na ločene dni (122 enot; p<0,01), Čeprav smo podobno visoke nivoje našli v skupini, kateri smo dajali posamično kombinirano imunizacijo (171 enot, p<0,01). V tej skupini smo po imunizaciji detektirali anti-69K protitelesih odziv, čeprav so imeli otroci, imunizirani z dvema injekcijama na isti dan, višji protitelesih odziv kot otroci, imunizirani s kombinirano posamično vakcino, in otroci, imunizirani z dvema injekcijami na isti dan, so imeli višji protitelesih odziv kot otroci, imunizirani na ločene dni (243:190 enotam; p<0,001), kot otroci, imunizirani z dvema injekcijama na ločene dni.

Anti-PRP protitelesih nivoji so si bili med vsemi tremi skupinami pred imunizacijo podobni. Post-imunizacijski titri so bili višji pri otrocih, imuniziranih z ločenimi injekcijami na isti dan (66,0 pg/ml) kot pri otrocih, imuniziranih na ločene dni (28,4 pg/ml; p<0,01), ali pri otrocih, katerim smo dajali posamično kombinirano imunizacijo (47,1, p<0,05). Kombinirana imunizacija je izvala tudi signifikantno višje protitelesne nivoje kot vakcine, katere smo dajali na ločene dni (p<0,05). Opazili nismo nobenih razlik med skupinami v odstotku, ki je prejel zaščitne nivoje; vsi udeleženci so imeli post-imunizacijske titre v prebitku 0,15 pg/ml in le štirje udeleženci (0,7 %) niso dosegli titra v prebitku 1 pg/ml (trije v skupini, kateri smo dali ločene injekcije na ločene dni in eden v skupini, kateri smo dali posamično kombinirano injekcijo). Več kot 82 % otrok v vsaki skupini je preseglo nivo anti-PRP protitelesa 10 pg/ml.

Močan protitelesni odziv je bil izvan tudi proti difteričnem in tetanusnem toksoidu. V primerjavi s skupino, kateri smo dali imunizacijo na ločene dni (2,1 IU/ml), so bili signifikantno višji anti-difterični protitelesni nivoji izzvani pri otrocih, imuniziranih z dvema injekcijama na isti dan (3,1; p<0,01 IU/ml), ali s kombiniranimi posamičnimi injekcijami (3,3 IU/ml; p<0,001). Protitetanusna protitelesa so bila višja pri prejemnikih dveh injekcij na isti dan (6,7 IU/ml) kot pri otrocih, imuniziranih na ločene dni (5,2 IU/ml; p<0,01), ali pri otrocih, katerim smo dali kombinirano posamično injekcijo (4,8 IU/ml; p<0,001). Vsi otroci so imeli post-imunizacijske antidifterične in anti-tetanusne protitelesne titre v prebitku 0,1 IU/ml, nivo 10-kratnega vsebovanega zaščitnega nivoja. Nad 96 % anti-tetanusnih titrov in nad 74 % antidifteričnih titrov je preseglo nivo 1,0 IU/ml; med imunizacijskimi skupinami ni bilo nobenih razlik.

Primer 8

Ta primer opisuje formulacijo in imunogenost multivalentne kombinirane vakcine, ki vsebuje inaktivirano poliovakcino.

(a) Priprava inaktiviranega poliovirusa (i) Go jen na MRC-5 celicah

Inaktivirani poliovirus, gojen na MRC-5 cebcah, smo proizvedli kot sledi. Celice smo odvzeli iz ledvičnih celic zelene opice (Ceropithacus aethiops):

Trivalentna poliovirusna vakcina, inaktivirana, je vsebovala tip I (Mahoney), tip II (MEF) in tip III (Saukett) komponente, katere smo gojili na MRC-5 celicah na mikronosilnih biserih, jih obdelali ter ločeno inaktivirali pred združitvijo v trivalentno poliovirusno vakcino.

Suspenzijo MRC-5 celic smo dodali k mediju za rast celic v fermentorju pri pH 7,2 (6,9 do 7,6) in temepraturi 37 °C ± 0,5 °C. Medij za rast celic je imel naslednjo sestavo:

CMRL medij 1969

Natrijev bikarbonat 0,15 %

Serum odraslega goveda 5,00 % - 7,00 %

Neomicin sulfat (pg aktivnosti) 10 IU/ml

Polimiksin B 200 IU/ml

CMRL medij je imel naslednjo sestavo:

SUH PRAH

Sestavine	mg/lit
Aminokislina
L-alanin	25,0
L-arginin (prosta baza)	58,0
L-aspartinska kislina	30,0
L-cistein. HCI	0,1
L-cistin dinatrij	24,0
L-glutaminska kislina. H2O	67,0
L-glutamin	200,0
L-glicin	50,0
L-histidin (prosta baza)	16,2
L-hidroksiprolin	10,0
L-izolevcin	20,0
L-levcin	60,0
L-lizin. HCI	70,0
L-metionin	15,0
L-fenilalanin	25,0
L-prolin	40,0

Sestavine mg/liter

L-serin 25,0

L-treonin 30,0

L-triptofan 10,0

L-tirozin 40,0

L-valin 25,0

Vitamini p-aminobenzojska kislina 0,05 askrobinska kislina 0,05 d-biotin 1,00 kalcijev pantotenat 1,00 holin dihidrogen citrat 2,12 folna kislina 1,00 glutation 0,05 i-inozitol 2,00 nikotinamid 1,00 piridoksal. HC1 1,00 riboflavin-5-fosfat 0,10 tiaminHCl 1,00

Sestavine mg/liter komponenta natrijev klorid 8000,0 kalijev klorid 400,0 kalcijev klorid (brezvodni) 140,0 magnezijev sulfat. 7H₂O 200,0 natrijev fosfat, dvobazni brezvodni 180,0 natrijev fosfat, nebazni 70,0

D-glukoza (brezvodna) 1000,0 fenol rdeče 20,0

10,852 gm da 1 liter medija CMRL 1969.

Medij smo pripravili kot sledi:

450 litrov destilirane nepirogene vode smo dodali k 905 ml IN klorovodikove kisline. K tej zmesi smo dodali 5426,5 g CMRL 1969 suh prah, pri čemer smo kontinuimo mešali, dokler se ni raztopil do bistre raztopine. Ob kontinuimem mešanju smo dodali naslednje kemikalije v podanem vrstnem redu, pri čemer smo vsakič, predno smo dodali naslednjo, počakali, da seje posamezna kemikalija raztopila:

neomicin	10 mcg/ml
polimiksin B TES pufrna raztopina natrijev bikarbonat goveji serum	200 enot/ml 5000,0 ml 750,0 g 30,01

Volumen smo privedli do 500 1 s svežo destilirano vodo in mešali, dokler ni bilo enakomerno premešano.

Opazovali smo rast celic in ko smo določib, da so celice v logaritemski fazi, smo porabljeni rastni medij zavrgli in ga nadomestili z medijem za rast virusov. Medij za rast virusov je imel naslednjo sestavo:

Kemikalije medija 199 z Earleovimi solmi

natrijev bikarbonat Tween 80	0,26 % 20 ppm
neomicin sulfat (pg aktivnosti) polimiksin B L-glutamin L-arginin L-levcin	lOIU/ml 200 IU/ml 100 mg/1 29 mg/1 30 mg/1
L-izolevcin	10 mg/1
L-metionin	7,5 mg/1
L-serin	12,5 mg/1

L-treonin L-cistin holm diH citrat mg/1 10 mg/1 107 mg/1

CMRL 199 medij je imel naslednjo sestavo:

SUH PRAH

Sestavine

L-alanin

L-arginin (prosta baza) L-aspartinska kislina L-cistein . HCI. H2O L-cistin dinatrij L-glutaminska kislina H₂O L-glutamin glicin

L-histidin (prosta baza)

L-hidroksiprolin

L-izolevcin

L-levcin

L-lizin

L-metionin

L-fenilalanin

L-prolin

L-serin

L-treonin

L-triptofan

L-tirozin

L-valin p-aminobenzojska kislina mg/liter

25,0

58,0

30,0

0,1

24,0

67,0

100,0

50,0

16,2

10,0

20,0

60,0

70,0

15,0

25,0

40,0

25,0

30,0

10,0

40,0

25,0

0,050

askorbinska kislina	0,050
d-biotin	0,010
kalcijev pantotenat	0,010
holin dihidrogen citrat	1,060
folna kislina	0,010
glutation	0,050
i-inozitol	0,050
menadion	0,010
nikotinamid (niacinamid)	0,025
nikotinska kislina (niacin)	0,025
piridoksal. HC1	0,025
piridoksin. HC1	0,025
riboflavin-5-fosfat	0,010
tiamin HC1	0,010
vitamin A acetat	0,100
vitamin D (kalciferol)	0,100
vitamin E (-tokoferol fosfat)	0,010
adenin sulfat	10,000
adenozin trifosfat	1,000
adenozin-5-fosfoma kislina	0,200
deoksi-2-riboza	0,500
d-riboza	0,500
holesterol	0,200
gvanin	0,300
hipoksantin	0,300

Kulture smo z večkratno infekcijo inficirali z ustreznim semenskim virusom. Infekcija je potekala pri 36 °C ±1 °C. Ko je bil virus C.P.E. kompleten, smo kulturo ohladili na 2 °C do 15 °C.

Virusno žetev smo zbistrili s filtracijo. Volumen virusne žetve smo zmanjšali z membransko ultrafiltracijo do volumna, primernega za diafiltriranje proti 0,04M fosfatnem pufru, pri čemer smo odstranili nominalno molekulsko maso 100000. Po diafiltraciji smo volumen nadalje koncentrirali do volumna, ki je bil primeren za gelsko filtracijo. Koncentrat živega virusa smo vzorčili in shranili pri 2 °C do 8 °C.

Koncentrat živega virusa smo nanesli na gelsko filtracijsko kolono in iz kolone eluirali z 0,04 M fosfatnim pufrom. Virusno frakcijo smo zbrali z opazovanjem optične gostote kolonskega eluata pri 254 in 280 nm.

Drugo stopnjo čiščenja smo izvedli z uporabo DEAE-ionskega izmenjevalnega medija z 0,04M fosfatom kot eluacijskim pufrom. To stopnjo smo dvakrat ponovili, v kolikor količina uporabljenega ionskega izmenjevalnega medija ni bila dovoljšna, kar smo določili z opazovanjem pri 254 in 280 nm.

Zbrano virusno frakcijo smo koncentrirali in dializirali proti Hankovemu specialnemu mediju, da smo zmanjšali vsebnost fosfata. Hankov specialni medij je imel naslednjo sestavo:

Aminokisline mg/liter

D,L-alanin 25,00

L-arginin. HCI D,L-aspartinska kislina L-cistein HCI H2O L-cistin 2HC1 D,L-glutaminska kislina L-glutamin glicin

L-histidin HCI. H₂O

L-hidroksiprolin

D,L-izolevcin

58,00

30,00

0,10

26,00

67,00

100,00

50,00

16,20

10,00

20,00

D,L-levcin	60,00
L-lizin. HC1	70,00
D,L-metionin	15,00
D,L-fenilalanin	25,00
L-prolin	40,00
D,L-serin	25,00
D,L-treonin	30,00
D,L-triptofan	10,00
L-tirozin (dinatrijeva sol)	40,00
D,L-valin	25,00
Vitamini
askorbinska kislina	0,050
d-biotin	0,010
vitamin D (kalciferol)	0,100
D-kalcijev pantotenat	0,010
holin klorid	1,060
folna kislina	0,010
i-inozitol	0,050
Mineralne soli	mg/liter
kalcijev klorid (brezvodni)	40,00
železov nitrat. 9H2O	0,10
kalijev klorid	400,00
natrijev klorid	8000,00
magnezijev sulfat. 7H2O	200,00
Ostale sestavine
adenin sulfat	10,000
adenozin trifosfat (dinatrijeva sol)	1,000
adenilna kislina	0,200
d α tokoferol fosforna kislina (natrijeva sol)	0,010
holesterol	0,200

deoksiriboza	0,500
glukoza	1000,000
glutation	0,050
gvanin. HCI	0,300
hipoksantin (natrijeva sol)	0,300
riboza	0,500
natrijev acetat. 3H2O	81,500
timin	0,300
Tween 80	20,000
uracil	0,300
ksantin (natrijeva sol)	0,300
menadion	0,010
nikotinska kislina	0,025
nikotinamid	0,025
p-aminobenzojska kislina	0,050
piridoksal. HCI	0,025
piridoksin. HCI	0,025
riboflavin-5-fosfat	0,010
tiamin. HCI	0,010
vitamin A (acetat)	0,140

Očiščeno virusno frakcijo smo filtrirali skozi 0,2 μ porozni filter.

Eno ali več frakcij očiščenega virusnega koncentrata smo zbrali za inaktivacijo. Na osnovi rezultatov ELISA testa smo monovalentni virusni vložek razredčili na: tip I: 1750 ±250 DU/rnl tip II: 1500 ±250 DU/ml in tip III: 1250±250 DU/ml s Hankovim specialnim medijem.

Monovalentni vložek smo segreli na 37 °C ± 1 °C, nato pa filtrirali skozi 0,2 μ porozni filter.

Dodali smo potrebno količino formalina, da smo dosegli koncentracijo 1:4000. Virusni vložek in formalin smo zmešali in kontinuimo mešali pri 37 °C±1 °C. Monovalentni virusni vložek smo vzorčili za sposobnost za življenje (=viabilnosti). Šesti dan smo vložek inaktiviranega virusa prefiltrirali skozi 0,2 μ filter in vzdrževali pri 37 °C±1°C. Trinajsti dan inaktivacije smo virusni vložek filtrirali skozi 0,2 μ filter.

Izbrali smo eno ali več inaktiviranih monovalentnih komponent ter jih aseptično povezah z zbiralnim rezervoarjem. Monovalentni vložek smo nadalje koncentrirali z membransko ultrafiltracijo, pri čemer se odloči nominalna molekulska masa 100000. Nato smo izvedli dializo proti RIV-PBS razredčilu:

dinatrijev hidrogen fosfat (Na₂HPO₄), 0,346 g/CCml kalijev dihidrogen fosfat (KH₂PO₄),), 0, 187 g/CCml s Tweenom, da smo dosegli poenotenost končnega produkta.

Dodali smo albumin (humani), da smo dosegli končno koncentracijo 0,5 %. Zbrani monovalentni koncentrat smo nato filtrirali skozi 0,2 μ fileter. Dodali smo RIV-PBS razredčilo s Tweenom, da smo dosegli ocenjeno (z računanjem) koncentracijo 10 do 15 doz na 0,5 ml. Zbran koncentrat smo shranili pri 2 °C do 8 °C, dokler ga nismo potrebovali.

Izračunali smo ustrezne volumne monovalentnih komponent tipa I, II in III in jih združili. Načrtovali smo, daje trivalentna vakcina vsebovala: tip I: 40 DU/0,5 ml doze tip II: 8 DU/0,5 ml doze tip III: 32 DU/0,5 ml doze

Trivalentni koncentrat smo do uporabe shranili pri 2 °C do 8 °C. Dodali smo formaldehid in 2-fenoksietanol ter mešali. Dodali smo albumin (humani), pri čemer smo izračunali, da smo dobili končno koncentracijo 0,5 %.

(ii) Goiiten na vero celicah

Ampule vero delujoče celične banke smo subkultuvirali do nivoja izbranega celičnega prehoda. Ampule celic smo konzervirali v tekočem dušiku. Celice so bile gojene z uporabo mikro-podpomih biserov, ki so bili sferični biseri povprečnega premera okoli 100 pm, konstituirani iz dekstranskih polimerov z radikali DEAE, cepljenimi na njihovo površino (dietilaminoetil), kar jim da pozitiven naboj.

Osnovni medij za celično rast je bil Minimum Essential Medium (MEM) Eagla v Earleovi raztopini slanice, obogaten z 0,2 % laktalbumin hidrolizatom, 0,1 % dekstrozo, 5 % telečjim serumom. Vsak mililiter medija je vseboval naslednje antibiotike:

Streptomicin 75 enot na ml

Neomicin 14 enot na ml

Polimiksin B sulfat 35 enot na ml

Vero celice smo progresivno subkultivirali v biogeneratoijih povečane velikosti. Nato smo gojitveni medij in dovoljšen volumen mikropodpomih biserov na liter medija uvedli v industrijski biogenerator. Temperaturo smo stabilizirali pri +37 °C. Dodali smo celice, zbrane s tripsinacijo, ter jih začeli mešati. Gojitev smo nadaljevali 4 do 7 dni pri +37 °C, pri Čemer smo mešanje progresivno povečevali. Običajno smo ob koncu gojenja opazili 6- do 20-kratno povečanje v celični rasti. Medij, uporabljen za virusno rast, je bil medij 199 (Parker) v Earlovi raztopini slanice, obogateni z 0,1 % dekstroze. Ta medij vsebuje enake antibiotike in v enaki koncentraciji kot medij za celično rast, toda ne vsebuje telečjega seruma. Na 4/7 dan celične rasti smo biogeneratorsko mešanje v industrijskem merilu ustavili; biseri so se nabrali na dnu rezervoarja, star medij smo odstranili. Nekaj medija 199 brez seruma smo nato uvedli v vsak biogenerator ter mešali. Ta medij smo nato odstranili, pri čemer smo sprali bisere in celice. Nekaj medija 199 brez seruma smo prenesli v biogenerator skupaj s potrebnim volumnom semenske zaloge. Virus se je adsorbiral v celice ob rahlem mešanju. Ob koncu gojenja virusov smo z mešanjem prenehali. Virusno suspenzijo smo odstranili in zbrali ter bisere zadržali s filtracijo. Virusno suspenzijo smo homogenizirali. Žetev, filtrirano na organski membrani s srednjo velikostjo por 0,20 mm, smo shranili pri +4°C. Virus smo koncentrirali z ultrafiltracijo.

Virus smo nadalje očistili z ionsko izmenjevalno kromatografijo z uporabo DEAEdekstran-sferosil podlage, uravnotežene s fosfatnim pufrom 0,04M, pH = 7,00. Virus smo nadalje očistili z gelsko filtracijsko kromatografijo ob uporabi kolone, ki je vsebovala agarozni gel, sefarozo CL-6B, napufrano s fosfatom 0,04M, pH = 7,00. Virus smo nadalje očistili s kromatografijo z uporabo DEAE dekstran-sferosil, napufranega s fosfatnim pufrom 0,04M, pH = 7,00. Takoj po zadnjem čiščenju smo virusno suspenzijo naravnali na zahtevani volumen z nekaj medija M-199, pH = 7,0 brez fosfata, ga 10-krat koncentrirali v EDTA 5 mm, glicin pri 0,5 % in Tween 80 do končne koncentracije 50 mg/liter (inaktivacijski medij). Ta zmes tvori koncentrirano virusno zmes in filtrirali smo jo na 0,2 gm membrani. Koncentrirano virusno suspenzijo smo shranili pri +4°C, kjer je čakala inaktivacijo.

Zmešali smo eno ali več zalog koncentrirane virusne zmesi istega tipa in po možnosti razredčili ali naravnali z nekaj inaktivacijskega medija v ustreznem rezervoarju. Razredčitev smo naravnali na pravilen volumen glede na tipe, da smo dobili D antigenski titer med:

- 1500 in 2000 D enot v tipu 1

- 800 in 1000 D enot v tipu 2

- 1000 in 1500 D enot v tipu 3 in proteinski nivo:

- < 40 gg/ml v tipu 1

- < 70 gg/ml v tipu 2

- < 30 gg/ml v tipu 3.

Naravnano očiščeno koncentrirano virusno suspenzijo smo filtrirali na 0,22 gm membrani skoraj 72 ur pred pričetkom inaktivacije. Virusno suspenzijo smo nato ponovno segreli do +37 °C. Za inaktivacijo smo dodali formaldehidno raztopino, da smo dobili koncentracijo 1/4000. Da bi sledili inaktivacijski kinetiki, smo med prvimi štirimi dnevi odvzeli vzorce po 24, 48, 72 in 96 urah. Izvedli smo 10 ml vzorčevanje s takojšnjo nevtralizacijo formaldehida z delovanjem natrijevega bisulfita in neposrednim shranjevanjem pri -20 °C, sledila pa je titracija.

6. dan smo virusno suspenzijo med inaktivacijo filtrirali z uporabo 0,22 pm filtra. Po filtraciji smo nadaljevali inkubacijo tekočine pri 37 °C še 6 dni ob konstantnem mešanju. 9 dan inaktivacije smo odvzeli trikratni volumen, ki ustreza 3000 humanim dozam in 500 ml minimuma surove posamezne žetve. Ta volumen smo izračunah glede na titer v D antigenu koncentrirane virusne zmesi. Vzorec smo neposredno nevtralizirali z nekaj natrijevega bisulfita, da smo ustavili delovanje rezidualnega formaldehida. Homogenizirano in inaktivirano virusno suspenzijo smo nato po 12 dneh inaktivacije odvzeli iz inkubatorja pri +37 °C. Volumen smo neposredno nevtrabzirali z nekaj natrijevega bisulfita in shranib pri +4 °C.

Za pripravo koncentrirane trivalentne zaloge IPV smo združili monovalentne

pripravke, da smo pripravili:
tip 1 (Mahoney)	400 antigenskih D enot
tip 2 (MEF-1)	80 antigenskih D enot
tip 3 (Saukett)	320 antigenskih D enot
medij 199- pH 7,2 q.s. do	1 ml

Zmes smo mešali do homogenosti, filtrirali na membrani s poroznostjo 0,22 mikrometra.

Končno zalogo produkta smo dobib iz koncentriranih trivalentnih zalog, kot so tiste, ki so opisane, z razredčevanjem z medijem 199, pH 7,2, brez fenol rdečega, tako daje enotska doza na 0,5 ml vsebovala:

enot D antigena za tip 1 enot D antigena za tip 2 enot D antigena za tip 3.

(b) Formulacije

Multivalentna vakcinska formulacija (APDT) je vsebovala 5 pertusisnih antigenov (10 pg PT, 5 pg FHA, 5 pg FIM 2 in 3, 3 pg 69K), 15 Lf difteričnega toksoida, 5 Lf tetanusnega toksoida, 1,5 mg aluminijevega fosfata kot adjuvansa in 0,6 % 2-fenoksietanola kot konzervansa na 0,5 ml (KLASIČNA). Vakcino smo uporabili samo ali v kombinaciji bodisi z IPV, proizvedeno na MRC-5 celicah (mlPV), pripravljeno kot je opisano zgoraj, IPV, proizvedeno na vero celicah (vIPV), pripravljeno kot je opisano zgoraj, ali z OPV (Connaught Laboratories Limited). Da ne bi zmotili njihovega rutinskega imunizacijskega umika, smo Haemophilus influenzae b-tetanusni toksoid konjugatno vakcino dajali ob zasledovalnem obisku.

Populacija

V študijo smo rekrutirali zdrave, 17 do 19 mesecev stare otroke, ki so bili imunizirani s tremi dozami DTP in dvema dozama OPV, ali tremi dozami DTP-IPV pred starostjo 8 mesecev. Po pisnem soglasju staršev ali skrbnikov, smo otroke alocirali z računalniško generiranim uravnoteženim blokovnim seznamom naključnih številk tako, da so prejeli enega od petih vakcinskih režimov. Kombinirane vakcine, ki so vsebovale A3DT, smo dali po intramuskulami poti s 25 mm iglo v deltoidno mišico roke ali stegensko mišico vastus lateralis, če deltoid ni bil dovoljšne mase. IPV (0,5 ml; mlPV ali vIPV), kadar smo jo dali samo, smo dajali po subkutani poti z uporabo igle, dolžine 12,5 do 16 mm (1/2 do 5/8 palcev), vakcine ki so vsebovale APDT, smo dali v levi ud; desni ud smo uporabili za inaktivirane poliovirusne vakcine, kadar smo jih dajali ločeno, in za vse Haemophilus influenzae b-konjugatne vakcine pri drugem obisku.

Klinično in laboratorijsko nadzorovanje (monitoring)

Krvne vzorce smo zbrali z odvzemom iz vene ali z vbodom v prst pred imunizacijo in 28 dni po njej. IgG protitelesa na PT smo merili z encimskim imunotestom in PTnevtralizacijsko protitelo s CHO nevtralizacijo. IgG anti-FHA, anti-FIM in anti-69K protitelesa smo merili z encimskim imunotestom; enote smo izračunali z uporabo US FDA referenčnega protiseruma (št. 3). Merili smo tudi pertusisne aglutinine. Difterični antitoksin smo merili z mikronevtralizacijskim testom in tetanusni antitoksin z imunotestom. Protitelo-poliovirus tipa 1, 2 in 3 protitelesa smo merili z virusno nevtralizacijo. Titre protiteles smo izrazili kot geometrijske sredine titrov, serumskim vzorcem s titri, ki so bili manjši od meje detekcije testa, smo za namen statističnih izračunov pripisali vrednost ene polovice nižje detekcijske meje.

Geometrijske sredine protitelesnih titrov in 95 % intervale zaupanja smo izračunali za protitelesih titer na vsak vakcinski antigen pred in po imunizaciji. Dvige povprečnih log titrov in povprečnih log-krat protitelesnih titrov smo primerjali s profilno analizo in analizo spremembe. Razmerje oseb, ki so prejele predhodno določene nivoje v vsaki skupini, smo primerjali z logistično regresijo. Naredili smo primerjave med vsako poliovirusno vakcino, ki smo jo dali ločeno, ali kot kombinirano injekcijo med mlPV in vIPV (obe ločeno in kombinirani) in med kombiniranimi IPV vakcinami ter OPV. Za večkratne primerjave nismo naredili nobenih prilagoditev.

V študijo je bilo vključeno celokupno 425 otrok (52 % žensk), ki so prejeli poživilno imunizacijo. Ob vključitvi je bila povprečna starost 17,8 mesecev (območje 17,0 do 20,0). Vzorce post-imunizacijskega seruma smo dobili od 422 (99,3 %) udeležencev povprečno 29,2 dni po imunizaciji (območje 28 do 41 dni). V tej študiji škodljivi dogodki, kategorizirani kot resni, niso bili običajni.

Pred imunizacijo so bili protitelesni nivoji med skupinami za večino antigenov ekvivalentni. Izjeme so bile, da so imeli udeleženci, ki so bili alocirani, da so prejeli APDT in mlPV kot ločene injekcije, signifikantno nižje nivoje anti-FIM, aglutinina, anti-difteričnih in anti-tetanusnih protiteles, kot skupina, alocirana, da je prejela kombinirano APDT-mlPV vakcino. Podobno je imela skupina, ki je bila naključno izbrana, daje prejemala ločene injekcije APDT in vIPV, nižje nivoje anti-tetanusnega protitelesa kot skupina, kije bila določena, da prejme kombinirano APDT-vIPV.

Po imunizaciji je prišlo do signifikantnega porasta protiteles pri vseh vakcinskih skupinah proti vsem antigenom, ki so bili vključeni v vakcine. Obstajalo je nekaj razlik v protitelesnem odzivu na pertusisne antigene v odvisnosti od poliovakcinske skupine. Opazili nismo razlik v anti-PT protitelesu z encimskim imunotestom ali CHO nevtralizacijo, ali v anti-FHA protitelesih. Anti-69K protitelesa so bila signifikantno višja v skupini, kateri smo dali mlPV vakcino kombinirano z APDT (77,7 enot), kot pri skupini, kateri smo dali mlPV kot ločeno injekcijo (37,9 enot; p < 0,001) ali pri skupini, kateri smo dali OPV (47,7; p < 0,05). Anti-FIM protitelesa in aglutinini so bili višji tudi pri skupini, kateri smo dali kombinirano APDT-mlPV skupino, kot pri skupini, kateri smo dali ločene injekcije; vendar pa smo enake razlike opazili tudi v pred-imunizacijskih serijah.

Razlike smo opazili v anti-poliovirus protitelesnih odzivih. Tako APDT-mlPV kot APDT-vIPV sta izzvala višje anti-poliovirus tip 1 in tip 3 protitelesa (P < 0,001 za vse primerjave). Anti-poliovirus tip 2 protitelesih nivoji so bili višji tudi po APDT-mlPV (10,633 recipročna razredčitev) in APDT-vIPV (10,256) kot OPV (7185); vendar pa je to doseglo statistično signifikanco le za APDT-mlPV (p < 0,05). Anti-poliovirusni protitelesih titri, doseženi s kombinirano APDT-mlPV, so bili tudi višji kot v primeru, kadar smo dali mlPV kot ločeno injekcijo (6620-1 p < 0,05).

Anti-tetanusni protitelesih titri so bili višji pri recipientih OPV v primerjavi s katerokoli od IPV kombinacij (p < 0,05). Pri OPV recipientih so bili višji tudi antidifterični titri, toda statistično signifikanco so dosegli le v primerjavi z APDT-vIPV skupino (p < 0,05). Po imunizaciji so imeli vsi otroci protitelesne nivoje proti difteriji in tetanusu v prebitku 0,01 IU/ml in vsi, razen enega otroka, so imeli nivoje v prebitku 0,1 IU/ml.

Rezultati te študije kažejo, da lahko komponentno pertusisno vakcino, ki vsebuje PT, FHA, 69K, in FIM kombinirane z difteričnim in tetanusnim toksoidom, kombiniramo tudi z inaktivirano poliovirusno vakcino, ne da bi prišlo do kakršnegakoli signifikantnega povišanja v reaktogenosti ali izgubi imunogenosti. V nasprotju z rezultati s celocelično DTP, ni prišlo do nikakršnega zmanjšanja protitelesnega odziva na antigene Bordetella pertussis. Prisotne niso bile nikakršne pomembne razlike med IPV vakcinami, pripravljenimi bodisi na MRC-5 ab veroceličnih linijah; obe vakcini sta inducirali višje serumske anti-poliovirus protitelesne nivoje kot OPV. Demonstracija ekvivalence mlPV in vIPV omogoča uporabo acelične pertusisne vakcine v jurisdikcijah s preferenco za IPV, izvedeno iz določene celične linije.

V zaključku testiranja, poročanega v tem primeru, to pomeni, da lahko petkomponentno acelično pertusisno vakcino varno kombiniramo s katerokoli izmed dveh IPV vakcin za četrto vakcinsko dozo med 17. in 19. mesecem starosti.

Povzetek opisa

V povzetku tega opisa predloženi izum podaja nove pripravke Bordetella in neBordetella antigenov za proizvodnjo multi-komponentnih pertusisnih vakcin. Takšne vakcine so vame, nereaktogene, imunogene in zaščitne pri ljudeh. Znotraj obsega predloženega izuma so možne modifikacije.

Tabela 1: Acelične pertusisne vakcine

Referenca	ΓΊ \0	m \0	rt sO	cm n m m	^0		ΓΊ C*>	r- o
AGG3	1	1	1	1 1	+	1	+	+
AGG2	1	1	1	1 1	+	+	+	+
o\ 0-		1	1	1 +		+	1	+
FHA	•	1	+	+ +	+	+	+	+
Toksoidacijsko sredstvo	Γ4 O CM E	u s δ	o O	F17G1 Fl/Gl	w«H Uu	E	o	5
PT	+	+	+	+	+	+	+	+
Vakcina	AMVC	J ffi CU CZ) CZ) rt s	Institut Merieux	Smith-Kline	2	Lederle/Takeda	Connaught

o § P£i ω

e o

tl tl υ

- -o 2 -2 s

H o ° .2 CZ) *5i O P-, 'g rt

Ih

O

-s

J rt o

E tn £

(U s

o

U g ·£

S .s ϋ cu

IZ1 ti ω ^w .S

M e«

Vi

CZ) rt rt

J-H ;£ .s .s

V) ^6

O «M

O cu >

o nS

Ό

O >

υ

Ό rt

S • ·

ΓΜ

JS

Tu υ

(β .Ν '5

Ε ο

α.

aΗ

Q c

>« ♦ Μ

TE υ

« ο

£

Λ c

« s

ο

G,

E

J

GA «

U

O ·— — « h

G.

c

CA

S «

M

4)

C >o • B*

U

4>

eO

E o

.CA ** u

«i

G.

E o

GA

4) 'S .2, .3

V OJD

U.

.4)

S ‘E

VI

VI

U <U

G.

<,

E o

.GA 'S

3	4)
C	G.
'B	E Έ
o o	>o
e CA	S o 3
4>	·->
Ήΐ	*3
'<-1	s
O	o
U G.	Δ V
O	U 3
ar
m	G.

'S o

otroci I	po imunizaciji |	Λ h £ o	306,55 (155,84-603,03)	29,86 (16,51-53,99)	1243,3 (594,8-2603,5)	116,16 (57,87-233,19)	342,51 (146,6-800,2)	9,65 (5,62-16,57)	z-s V) cm r< i vf S»/	«n CM
DTP	221,32 (99,83-490,67)	30,06 (11,82-76,46)	315,2 (127,4-779,9)	60,13 (24,59-147,04)	270,60 (24,6-1100,8)	8,75 (6,52-23,92)	4,11 (3,20-5,28)	CM l-H
pred imunizacijo	S £ § § I IX o	15,45 (8,50-28,10)	3,86 (3,03-4,93)	29,24 (13,63-62,75)	9,45 (5,50-16,23)	9,71 (4,71-20,03)	<0,1	l‘0>	25
DTP	43,71 (14,29-133,88)	2 93 (1,81-4,73)	26,72 (16,94-42,15)	6,54 (2,79-15,33)	27,47 (7,36-102,62)	<0,1	θ' V	©
odrasli	28. dan po imunizaciji	C «Λ S j u	415,87 (243,91-709,09)	317,37 (243,05-141,41)	2048,00 (1025,62-4089,55)	855,13 (396,41-1844,67)	604,67 (403,82-405,41)	θ' v	© V	IT)
placebo	16,56 (9,08-30,22	13,36 (7,71-23,16)	27,0 (15,37-47,78)	7,46 (3,51-15,87)	10,78 (5,54-20,97)	<0,1	<0,1	16
pred imunizacijo	C ΙΛ 3 j O	22,78 (12,11-42,86)	23,59 (15,59-35,69)	28,64 (12,20-67,21)	11,47 (6,41-20,55)	21,11 (10,35-43,06)	<0,1 _1	<0,1	ΜΊ
placebo	16,45 (9,46-28,62)	15,24 (10,28-22,60)	21,26 (12,14-37,23)	7,89 4,00-15,56)	12,30 (6,97-21,68)	©* V	<0,1
			pertusisni toksoid	filamentni hemaglutinin	aglutinogeni	pertaktin	CHO celični nevtralizacij ski test	difterični toksoid	tetanusni toksoid	| št. preučevanih

Tabela 3: Serološki rezultati komponentnih pertusisnih vakcin pri otrocih (starih 2, 4 in 6 mesecev)

Geometrijske sredine titrov	Dip	00 rt o” o* *	m m* o* o	0,14 0,21 0,31	0,33 0,38	0,53 0,27
Tet	« ® , I r* tn	ι/γ cn rb	ΟΛ 00Λ r—1 r-M	ΟΛ 00Λ CN r-T	Ot rt-i
aglutinacija	•n πί cn rt 00 t” rt 00	1 4	4	307,0 219,2	1	a r- t u, 2 2 2 S
CHO celična nevtralicacija	o o — o O «n g r~ — — 00 es	29.6 2.6	't, o CM CM _J rt 00	66,9 68,7	0‘9 9*601	Ό rt . r* σ\ «n m
fimbrijalni aglutinogeni	<N rt £ C\ (N N	239,8 603,2	111,4 203.8 393.9	358.6 220.6	601.9 906.9	O rt- _ (A S 2 S 2
CO S C\ 'O	m _4. o S i—H T—· r·'	°\ rt- g) *	A -t oo 2 £ o·	71,1 87,6	106,3 16,8	Š $
FHA	Γ- ko — n ir	r- 2	°ί. ® o 5 S «	82,5 163,9	cn* oo »—«	δ
PT	00 <0 o > en cn cn ko	87,1 20	58.4 133,3 10.4	105,1 101,6	212,7 101,4	CN Ot 00 rt m t-r
število udeležencev	§ 2 2 2 -	315 101	cn m o m m co	42 250	00 00 tn <n	O O o o 00 00 00 00
študija	U.S. NIAID Multicentrična primerjalna študija (krog I)	faza II Kanada	faza IIB Kanada	faza IIC Kanada	Montreal izvedljivostna študija	U.S. NIAID primeijalna študija (krog II)
produkt	s .4 S £ M <U £ e k £ s s Q c >u tn iQ S tn tn O O 2288 rt rt. »S —m Π ri U « U U O O	J »J u H 'rt >s m <L> š 8 O . r«M n « O U	—) J u H H 'Z' S Q S c c «J e S a tn n (U δ o υ c£7 cu — u o 8	Q C tn S O tn n O o CU CU U u	/—“M H-1 J u Q « C xj •n § 13 o £ rt O Pl 13 U o	jj brt /**\ O Ή T3 ι-J O U J H i-* O 2 S ζΖ m brt & Q S >O Ό 5 3 S 4 mg«« „2 J 8 8 Pl Pl 13 13 U U o o
Klinični test		rtM	CN	m	rt	*n	\o

t/5 υ

'C o

o3 l-l

O rt

H-1 ,£>

&H

CA e

ω (Λ is ΐΛ

CO

Λ

CO co

Λ

I v, ίΛ

OJ

Oh ω

ec £

O l-i

O &

o o

H-H

CA 'C o

l-l

O rt

J

1) §

sj υ

CA

O ‘C o

eC l-l

O *rt h-1 ω —— Ih <U T3 ω J ec

S o

JD *rt

Ž o

S • ^4

I—I co <u

O

S l-i

O •s

CC rt

O

U

I

J

J u

Tabela 4: Učinkovitost aceličnih pertusisnih vakcin

Vakcina	Učinkovitost %
	A	B
CP10/5/5/3DT	84.7 (80,3^88,5)1	77
PT25. FHA25.DT	58 (49,8-^64,8)1
DPT2	47,9 (37,1^56,9)1

A: definicija primera: 21 dnevni spazmotični kašelj in pozitivna kultura

B: definicija primera: blag pertusisni kašelj vsaj en dan

Opomba 1: meje zaupanja

Opomba 2: celocelična pertusisna vakcina

Tabela 5

o c Al «r-	88,4	84,5	88,9	81,0
%>0,15	o\ Γ Os	98,4	100	97,1
GMT (95 % CI)	4,76 (4,12-5,50)	4,37 (3,74-5,09)	3,83 (3,05-4,80)	3,84 (2,90-5,07)
Z	327	322	108	105
Vakcina	HCPDT-vIPV-PRP-T (tekoča)	HCPDT-mlPV za rekonstitucijo PRP-T	HCPDT-mlPV in PRP-T (ločeno)	DPT-IPV za rekonstitucijo PRP-T

Tabela 6

POLIO 3	1268 (1082-1485)	1938 (1640-2291)	1837 (1362-2477)	2726 (2108-3525)
POLIO 2	2397 (2043-2814)	2173 (1837-2570)	2595 (2005-3360)	2597 (2000-3373)
POLIO 1	624 (533-732)	718 (589-875)	702 (512-960)	889 (630-1255)
Z	328	323	108	105
Vakcina	HCPDT-vIPV-PRP-T (tekoča)	HCPDT-mlPV za rekonstitucijo PRP-T	HCPDT-mlPV in PRP-T (ločeno)	DTP-mlPV za rekonstitucijo PRP-T

Tabela 7

> 0, 1— s 1 H Oh Q

za rekonstiucijo PRP-T

(n = 105)

CN «rf

(12,7-19,01)

1 t‘l£

(27,2-36,2)

332,3 I

(264,6-417,3)

O\ A 00

x—S C\ 1 00 <-z

0,29

(0,22-0,38)

0,63

(0,51-0,78)

H ol

2 Oh

x—\

x*s ΓΛ

X—-s

C • P* >

o c o

108)

KO CN

rH

5,3

N- 00 1

0 A «n

-451,

<n A <**>

-49,7

36

-0,46

KO

0 00 A RM

g

>o o

II cs

O rH

1 Λ

KO

8,4

ΜΊ m

9,4

't

0 A cn

0

,28

0 •’Τ A

1

's-.Z

'iZ/

O\

rt

cn

0

»M

H

CN

X—X

'•'—Z

Q

's—Z

Oh

U

E

E-1 f CL

> n .

2 Oh

X~\

X*\ 0

x-\ r*

x-\

g H Q

O 0 S •J3

= 322)

89,1

Λ KO Ok 1 «r> A

152,5

,6-162,

244,5

A CN 00 CN 1 A

56,0

cn ko 1 T A

0,28

24-0,33

00 00 A 0

KO OK A O 1 0 00

c/5

Cj

CN

m

C\

r,

A

u

ti

00

Tt

rj-

0

0

0

s*-z

CN

'—Z

z

E

H*

O

u-i

03

N

H Š

z—>s

C

x-\

χ-—\

Om 1 > Oh

7? >0 0

CN m

86,7

0 A cn ΟΊ

Ά

rt KO

CN A KO

v? m 1

55,2

-62,5

29

-0,33

60

OK 1—4 T*H

> H

£

II c

O\ A O

•ΖΊ

CN Γ

r> CN

CN A CN

8,7

0

«c CN

O 0 A

'ii/

00

Tf

-rf

Tt

O

1—1

Q

^_z

CN

\-z

s»z

\-z

Oh

''S

^-z

U

E

2

ω O 1—4

H

i

S

1

E Oh

E-1 tu

H

Oh

U-.

ϋ.

t: D

Dl

H

5

CL

Tabela 8

HCPDT + OPV HIBRID + OPV (n = 85)	6,19	4,02	86,8	120,9	47,7	1215	1532	2110	7185	5563
HCPDT + mlPV 2 injekciji (n = 81)	3,89	3,31	65,2	117,8	37,9	753,3	1040	8784	6620	8541
HCPDT - mlPV 1 injekcija (n = 87)	4,99	3,25	80,5	112,8	77,7	1210	1606	10242	10633	6798
HCPDT +vIPV 2 injekciji (n = 84)	r-~ V) r\ Tf	3,13	68,2	98,1	45,1	809,1	1285	5681	7861	7781
HCPDT-vIPV 1 injekcija (n = 85)	A 'T	3,17	73,9	93,9	63,8	r- rf ΓΊ A	1278	6672	10256	5771
ANTIGEN	difterija	tetanus	PT	FHA	pertaktin	FIM	aglutinini	polio tip 1	polio tip 2	polio tip 3

Kombiniranje PRP-T s komponentno pertusisno vakcino, kadar smo jo dali kombinirano ali ločeno na isti dan ali ločene dni

4) '3?

e cn «β

L* o

<u cn <U ω

ε σ\ ‘C

CL ffl ►—H o

Ci o

CM

Oi

U z

>a

H

Q £5 »rj v>

O

klasična/hibrid & PRP-T ločena injekcija ločeni dnevi (n = 180)	32,4	Tt rf	5,3	96,1	co	87,5	168	315	682
klasična/hibrid & PRP-T ločena injekcija isti dan (n= 181)	60,8	ε*ε	6,6	t)-	189	99,3	223	434	1033
klasična/hibrid za rekonstitucijo PRP-T posamična injekcija (n= 181)	59,3	rf	5,0	120	»n <3> 1—*	102	187	430	1004
ANTIGEN	anti-PRP	difterija	tetanus	PT	CHO	Cl,	pertaktin	FIM	aglutinini

Opomba: vrednosti z ujemajočimi se črkami so se signifikantno razlikovale (p < 0,05)

REFERENCE

1. Muller, A.S. Leeuwenburg, J. and Pratt, D.S. (1986) Pertussis: epidemiology and control. Buli WHO 64: 321-331.

2. Fine, P.E.M. and Clarkson, J.A. (1984). Distribution of immunity to pertussis in the population of England and Wales. J. Hyg. 92:21-26.

3. Mortimer, E.A. Jr. (1990). Pertussis and its prevention: a family affair. J. Infect. Dis. 161: 473-479.

4. Addiss, D.G., Davis, I.P., Meade, B.D., Burstyn, D.G. Meissner, M., Zastrow, J.A., Berg, J.L., Drinka, P., and Phillips, R. (1991). A pertussis outbreak in a Wisconsin nursing home. J. Infect. Dis. 164: 704-710.

5. Halperin, S.A. and Marne, T.J. (1991a). Pertussis encephalopathy in an adult: čase report and review. Rev. Infect. Dis. 13: 1043-1047.

6. Onorato, I.M., Wassilak, S.G. and Meade, B. (1992). Efficacy of whole-cell pertussis vaccine in preschool children in the United States. JAMA 267: 2745-2749.

7. Miller, D.L., Ross, E.M., Alderslade, R., Bellman, M.H., and Brawson, N.S.B. (1981). Pertussis immunization and serious acute neurological illness in children. Brit Med. J. 282: 15951599.

8. Tamura, M., Nogimori, K., Murai, S., Yajima, M., Ito, K., Katada, T., Ui, M., and Ishii, S. (1982). Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toxin, in conformity with the A-B model. Biochemistry 21: 5516-5522.

9. Tuomanen, E. and Weiss, A. (1985). Characterization of two adhesins of Bordetella pertussis for human ciliated respiratory epithelial celiš. J. Infect. Dis. 152:118125.

10. Friedman, R-L., Nordensson, K., Wilson, L., Akporiaye, E.T., and Yocum D.E. (1992). Uptake and intracellular survival of Bordetella pertussis in human macrophages. Infect. Immun. 60: 4578-4585

11. Pittman, M (1979). Pertussis toxin: the cause of the harmful effects and prolonged immunity of whooping cough. A hypothesis. Rev. Infect. Dis., 1: 401-402

12. Granstrom, M. and Granstrom G. (1993). Serological correlates in whooping cough. Vaccine 11:445-448.

13. Gearing, A.J.H., Bird, C.R., Redhead, K., and Thomas, M. (1989). Human cellular immune responses to Bordetella pertussis infection. FEMS Microbial. Immunol. 47: 205-212.

14. Thomas, M.G., Redhead, K., and Lambert, H.P. (1989a). Human serum antibody responses to Bordetella pertussis infection and pertussis vaccination. J. Infect. Dis. 159:211-218.

15. Thomas, M.G., Ashworth, L.A.E., Miller, E., and Lambert, H.P. (1989b). Serum IgG, IgA, and IgM responses to pertussis toxin, filamentous haemagglutonin, and agglutinogens 2 and 3 after infection witb Bordetella pertussis and immunization with whole-cell pertussis vaccine. J. Infect. Dis. 160: 838-845.

16. Tomoda, T., Ogura, H., and Kurashige, T. (1991). Immune responses to Bordetella pertussis infection and vaccination. J. Infect. Dis. 163: 559-563.

17. Petersen, J.W., Ibsen. P.H., Haslov, K., Capiau, C., and Heron, I. (1992a). Proliferative responses and gamma interferon and tumor necrosis factor production by lymphocytes isolated from trachcobroncheal lymph nodes and spleens of mice aerosol infected with Bordetella pertussis. Infect. Immun. 60: 45634570

18. Englund, J.A., Reed, G.F., Edwards, K.M., Decker, D., Pichichero, M.E., Ronnels, M.B., Steinhoff, M.C., Anderson, E.L., Meade, B.D., Deloria, M.A., and the NLAID Acellular Pertussis Vaccine Group. (I992b). Effect of transplacental antibody and development of pertussis toxin (Pl) and filamentous haemagglutonin (FHA) antibody after acellular (AC) and whole celi (WC) pertussis vaccines in infants. Pediat. Res. 31:91 A.

19. Oda, M., Cowell, J.L., Hurstyn, D.G., Thaib, S., and Manclark, C.R. (1985). Antibodies to Bordetella pertussis in human colostrum and their protective activity against aerosol infection of mice. Infect. Immun. 47:441-445.

20. Petersen, J.W., P.H. Hentzon, M.W., Capiau, C., and Heron, I. (1991). The celi mediated and humoral immune response to vaccination with acellular and whole celi pertussis vaccine in adult humans. FEMSMicrobiol Lett. 76: 279-288.

21. Oda,.M., Cowell. J.L., Burstyn, D.G., and Manclark, C.R. (1984). Protective activities of the filamentous haemagglutonin and the lymphocytosis-promoting factor of Bordetella pertussis in mice. J. Infect. Dis. 150: 823833.

22. Sato, H., Ito, A.. Chiba, J. and Sato. Y. (1984b). Monoclonal antibody against pertussis toxin: effect on toxin activity and pertussis infections. Infect. Immun. 46: 422-428.

23. Sato, H. and Sato, Y. (1990). Protective activities in mice of monoclonal antibodies against pertussis toxin. Infect. Immun. 58: 3369-3374.

24. Weiss, A.A. and Hev/lett, E.L. (1986). Virulence factors of Bordetella pertussis. Ann. Rev. Microbiol 40: 661-668.

25. Munoz, J.J. (1988). Action of pertussigen (pertussis toxin) on the host inunune system. In: Pathogenesis and Immunity in Pertussis. A.C. Wardlaw and R. Parton, eds., John Wiley & Sons Ltd., Toronto, pp. 211-229.

26. Watkins, P.A., Burns, D.L., Kanaho, Y., Liu, Τ-Υ., Hewlett E.L., and Moss, J. (1985). ADPribosylation of transducin by pertussis toxin. J. Biol. Chem. 260: 1347813482.

27. Burns, D.L., Kenimer, J.G., and Manclark, C.R. (1987). Role of the A subunit of periussis toxin in alteration of Chinese hamster ovary celi morphology. Infect. Immun., 55: 24-28.

28. Munoz, J.J. , Arai, H:. , and Cole, R.L. (1981) . Mouse-protecting and histaminesensitizing activities of pertussigen and fimbrial hemaggiutinins from Bordetella pertussis. Infect. Immun. 32: 243-250.

29. Relman, D.A., Domenighini, M., Tuomanen, E., Rappuoli, R., and Falkow, S. (1989). Filamentous haemagglutonin of Bordetella pertussis·. nucleotide sequence and crucial role inadherence. Proč. Natl. Acad Sci. USA 86: 2637-2641.

30. Di Tommaso, A., Domenighini, M., Bugnoli, M., Tagliabuc, A., Rappuoli, R., and De Magistris, M.T. (1991). Identification of subregions of Bordetella pertussis filamentous haemagglutonin that stimulate human T-cell responses. Infect. Immun. 59: 3313-3315.

31. Tomoda, T., Ogura, H., and Kurashige, T. (1992). The longevity of the inunune response to filamentous haemagglutonin and pertussis toxin in patients with pertussis in a semiclosed community. J. Infect. Dis. 166: 908-910.

32. Edwards, K.M., Meade, B.D., Decker, M.D., Reed, G.F., Rennels, M.B., Steinhoff, M.C., Anderson, E.L., Englund, J.A., Pichichero, M.E., Deloria, M.A.,

Deforest, A., and the NIAID Acellular Pertussis Vaccine Study Group (1992). Comparison of thirteen acellular pertussis vaccines: serological response. Pediatr. Res. 31:91 A.

33. Kimura, A., Mountzoutos, K.T., Relman, D.A., Falkow, S., and Cowell, J.L. (1990a). Bordetella pertussis filamentous haemagglutonin: evaluation as a protective antigen and colonization factor in a mouse respiratory infection model. Infect. Immun. 58:7-16.

34. Shahin, R.D., Amsbaugh, D.F., and Leef, M.F. (1992). Mucosal immunization with filamentous haemagglutonin protects against Bordetella pertussis respiratory infection. Infect. Immun. 60: 1482-1488.

35. Montaraz, J.A., Novotny, P., and Ivanyi, J. (1985). Identification of a 68kilodalton protective protein antigen from Bordetella bronchiseptica. Infect. Immun. 161: 581-582.

36. Leininger, E., Roberts, M., Kenimer, J.G., Charles, I.G., Fainveather, M., Novotny, P., and Hrennan, M.J (1991). Pertactin, and ArgGly-Asp-containing Bordetella pertussis surface protein tbat promotes adherence of mammalian celiš. Proč. Natl.AcadSci. USA 88: 345-349.

37. De Magistris, T., Romano, M., Nuti, S., Rappuoli, R. and Tagliabue, A. (1988). Dissecting human T responses against Bordetella species J. Exp. Med 168: 13511362.

38. Seddon, P.C., Novotny, P., Hall, C.A., and Smith, C.S. (1990). Systemic and mucosal antibody response to Bordetella pertussis antigens in children with whooping cough. Serodiagnosis Immunother. Inf Dis. 3: 337-343.

39. Podda, A., Nencioni, L., Marsili, I., Peppoloni, S., Volpini, G., Donati, D., Di Tommaso, A., De Magistris, M.T., and Rappuoli, R. (1991). Phase I clinical tnal of an acellular pertussis vaccine composed of genetically detoxified pertussis toxin combined witb FHA and 69 kDa. Vaccine 9: 741-745.

40. Roberts, M., Tite, J.P., Fairweather, N.F., Dougan, G. and Charles, I.G. (1992). Recombinant P.69/pertactin: immunogenicity and protection of mice against Bordetella pertussis infection. Vaccine 10: 43-48.

41. Novotny, P., Chubb, A.P., Cownley, K., and Charles, I.G. (1991). Biological and protective properties of the 69kDa outer membrane protein of Bordetella pertussis·. a novel formulation for an acellular vaccine. J. Infect. Dis. 164: 114-122.

42. Shahin, R. D., Hrennan, M.J., Li. Z.M., Meade, H.D., and Manclark, C.R. (1990b). Characterization of the protective capacity and immunogenicity of the 69kD outer membrane protein of Bordetella pertussis. J. Exp. Med. 171: 63-73.

43. Robinson, A., Irons, L.I., and Ashworth, L.A.E. (1985a). Pertussis vaccine: present status and future prospects. Vaccine 3: 11-22.

44. Robinson, A., Ashworth, L.A.E. Baskerville, A., and Irons, L.I. (1985b). Protection against intranasal infection of mice with Bordetella pertussis. Develop. Biol. Stand. 61: 165-172

45. Robinson, A., Gorrige, A.R., Funnell, S.G.P., and Femandez, M. (1989b). Serospecific protection of mice against in infection with Bordetella pertussis. Vaccine 7: 321-324.

46. Sato, Y., Kimura, M., and Fukumi, H. (1984a). Development of a pertussis component vaccine in Japan. Lancet i: 122-126.

47. Kimura, M. (1991). Japanese clinical experiences with acellular pertussis vaccines. Deve lop. Biol. Standard. 73: 5-9.

48. Ad Hoc Group for the Study of Pertussis Vaccines (1988). Placebo-controlled trial of two acellular vaccines in Sweden-protective eficacy and adverse effects. Lancet i: 955-960.

49. Olin, P., Storsaeter, J., and Romanus, V. (1989).. The efficacy of acellular pertussis vaccine. JAMA 261:560.

50. Storsaeter, J., Hallander, H., Farrington, C.P., Olin, P., Moliby, R., and Miller, E. (1990). Secondary analyses of the efficacy of two acellular pertussis vaccines evaluated in a Swedish phase ΙΠ trial. Vaccine 8: 457-462.

51. Storsaeter, J., and Olin, P. (1992). Relative efficacy of two acellular pertussis vaccines during three years of passive surveillance. Vaccine 10: 142-144,

52. Tan, L.U.T., Fahim R.E.F., Jackson, G., Phillips, K., Wah, P., Alkema, D., Zobrist, G., Herbert, A., Boux. L, Chong, P., Harjee, N., Klein, M., and Vose, J. (1991). A novel process for preparing an acellular pertussis vaccine composed of nonpyrogenic toxoids of pertussis toxin and filamentous haemagglutonin. Moleč, immunol. 28: 251-255.

53. Sekura, R.D., Zhang, Y., Roberson, R., Acton, B ,,Trollfors, B,. Tolson, N., Siloach, J., Bryla, D., Muir-Nash, J., Koeller, D., Schneerson, R., and Robbins, J.B. (1988). Clinical, metabolic,and antibody responses of adult volunteers to an investigation vaccine composed of pertussis toxin inactivated by hydrogen peroxide. J. Pediatr. 113: 807-813.

100

54. Winbeny, L., Walker, R., Cohen, N., Todd, C., Sentissi, A., and Siber, G. (1988), Evaluation of a new method for inactivating pertussis toxin with tetranitromethane. International Workshop on Bordetella pertussis, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana.

55. Sekura, R.D. et al. (1993), J.Biol. Chem. 258: 14647-14651.

56. Irons, L.I. et al. (1979), Biochem. Biophys. Acta 580: 175-185.

57. Munoz, J.J. et al. (1981). Infect. Immun. 33: 820826.

58. Cowell, J.L. et al. (1980), Seminar on Infectious Diseases 4: 371-379.

59. Selmer, J.C. Acta Path. Microbial. Immunol. Scand. Sect. C, 92: 279-284.

60. Lockhoff, 0. (1991) Glycolipids as Immunomodulators: Synthesis and Properties, Chem. Int. Ed Engl. 30: 1611-1620.

61. Nixon-George, A., Moran, T., Dionne, G., Penney, C.L., Lafleur, D., Bona, C.A. (1990) The adjuvant effect of stearyl tyrosine on a recombinant subunit hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 144: 4798-4802.

62. Siber, G.R., Thakrar, N., Yancey, B.A., Herzog. L., Todd, C., Cohen, N., Sekura,

R.D., Lowe, C.U. (1991). Safety and immunogenicity of hydrogen peroxideinactivated pertussis toxoid in 18-month-old children. Vaccine 9; 735-740.

63. Siber, G., Winberry, L., Todd, C., Samore, M ., Sentissi, A., and Cohen, N. (1988). Safety and immunogenicity in adults of pertussis toxoid inactivated with tetronitromethane. In: International Workshop on Bordetella pertussis, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana.

101

64. Edwards, K.M., Bradley, R.B., Decker, M.D ,,Palmer, P.S., Van Savage, J., Taylor, J.C., Dupont, W.D., Hager, C.C., and Wright, P.F. (1989). Evaluation of a new highly purified pertussis vaccine in infants and children. J. Infect. Dis. 160: 832837.

65. Rutter, D.A., Ashworth, L.A.E., Day, A., Funnell, S., Lovell, F., and Robinson, A. (1988). Tnal of new acellular pertussis vaccine in healthy adult volunteers. Vaccine 6;

29-32.

66. Hlumberg, D.A., Mink, C.A.M, Cherry, J.D., Johnson, C., Garber, R., Plotkin,

S.A.. Watson, B., Ballanco, G.A., Daum R.S., Sullivan B., Tovvnsend, T.R. Brayton, J., Gooch, W.M., Nelson, D.B., Congeni, B.L., Prober, C.G., Hackell, J.G., Dekker, C.L., Christenson, P.D., and the APDT Vaccine Study Group (1991). Comparison of acellular and whole celi pertussis-component diphtheria-tetanuspertussis vaccines in infants. J. Pediatr. 119: 194-204.

67. Englund, J.A., Glezen, W.P. and Barreto, L. (1992a). Controlled study of a new fivecomponent acellular pertussis vaccine in adults in young children. J. Inf. Dis. 166: 1436-1441.

68. Zealey, G., Loosmore, S., Yacoob, R., Klein, M., Vaccine Research, Vol. 1, pp. 413-427.

69. Baker JD, Halperin SA, Edwards K, Miller B. Decker M, Stephens D. Antibody response to Bordetella pertussis antigens after immunization with American and Canadian whole celi vaccines J. pediatr. 1992, 121:523-527.

70. Halperin SA. Eastwood BJ. Langley JM. Immune responses to pertussis vaccines concurrently administered with viral vaccines. Ann NY Acad Sci. 1995, 754: 89-96.

102

71. Halperin S A, Langley JM. Eastwood BJ. Effect of inactivated poliovirus vaccine on the antibody response to Bordetella pertussis antigens when combined with diphtheria-pertussis-tetanus vaccine. Ciin. Infect. Dis. 1996; in press

72. Ferreccio C., Clemens J. Avendano A. et al. The clinical and immunogenic response of Chilean infants to Haemophilus influenzae type b polysaccharide tetanus protein conjugate vaccine coadministered in the same syringe with diptheria-tetanus toxoide-pertussis vaccine at two, four and six months of age. Pediatr. Infect. Dis. J. 1991; 10:761-771.

73. Clemens J. Ferreccio C., Levine M. et al. Impact of Haemophilus influenzae typ b polysaccharidetetanus protein conjugate vaccine on responses to concurrently administered diphetheriatetanus pertussis vaccine. JAMA 1992; 267:6738.

74. Scheifele D. Barreto L. Meekison W.et al. Can Haemophilus influenaze vaccine be combined with diptheria and tetanus toxoids. CanMedAssoc.J. 1993; 149:1105-16.

75. Gold R., Scheifele D., Barreto L. et al. Safety and immunogeniciy of Haemophilus infleunzae vaccine (tetanus toxoid conjugate) administered concurrently or combined with diptheria and tetanus toxoids, pertussis vaccine and inactivated poliomyelitis vaccine to healty infants at two, four and six months of age. Pediatr. Infect. Dis J. 1994; 13: 348-55.

76. Shinefield H. Black S, Ray P, Lewis E. Fireman B ., Hohenboken, hackell JG. Safety of combined acellular pertussis vaccine in infants [abstract no G72]. In: program and Abstracts of the 35th Interscience Conference on Antimicrobiols and Chemotherapy. Washington, DC; American Society of Microbiology 1995: 171.

77. Greenberg DP, Wong VK, Partridge S, Howe BJ, Fing J. Ward JL. Evaluation of a new combination vaccine that incorporates diptheria-tetanusacellular pertussis, hepatitis b, and Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines [Abstract no G70]

103

In program and Abstracts of the 35th Interscience Conference on'Antimicrobiols and Chemotherapy. Washington, DC; American Society of Microbiology 1995: 170.

78. Wassilak SGF, Orenstein WA, Tetanus, In Plotkin SA, Mortimer EA, Jr., eds, Vaccines, WB Saunders Company, Philadelphia, 1988; 45- 73.

79. Gustaffson et al, New England J. Medicine, 1996, vol. 334. Pp 349- 355.

80. Mortimer EA Jr., Diphtheria Toxoid, In Plotkin SA, Mortimer EA, Jr., eds, Vaccines, WB Saunders Company, Philadelphia, 1988; 31-44.

81. Varughese P: Haemophilus Influenzae infection in Canada, 1969- 1985. Can Dis Wkly Rep 1986; 12:37-43.

82. Schelfele D, Gold R, Law B, et al: Decline in Haemophilus Influenzae type b invasive infections at five Canadian pediatric centres. Can Commun Dis Rep 1993; 19:88-91

83. Scheifele D., Barreto L., Meekison W. et al.. Can Haemophilus influenzae type btetanus toxoid conjugate vaccine be combined with diphtheria toxoid-pertussis vaccine-tetanus toxoid? Can MedAssoc J1993,149: 1105- 1112

84. Gold R, Scheifele D, Barreto L et al.. Safety and Immunogenicity of Haemophilus Influenzae type b vaccine (tetanus toxoid conjugate) administered concurrently or combined with diphtheria and tetanus toxoids, pertussis vaccine and inactivated poliomyelitis vaccines to healthy infants at two, four and six months of age. Pediatric Infections Diseases Journal 1994; 13:348-55

85. Scheifele D, Gold R et al. Canada Communicable Disease Report 22-3, F1-F3 Feb 1, 1996.

Za

Connaught Laboratories Limited:

Claims (22)

1. Patentni zahtevki

   1. Multivalentni imunogenski sestavek za dajanje zaščite v gostitelju proti bolezni, povzročeni z infekcijo z Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae in poliovirusom, ki obsega:

   (a) pertusisni toksoid, filamentni hemaglutinin, pertaktin in aglutinogene v očiščeni obliki, (b) tetanusni toksoid, (c) difterični toksoid in (d) inaktiviran poliovirus, ki je formuliran kot vakcina za in vivo dajane gostitelju, označen s tem, da so posamezne komponente sestavka formulirane tako, da imunogenost posameznih komponent ni poslabšana z ostalimi posameznimi komponentami sestavka.
2. 2. Imunogenski sestavek po zahtevku 1, označen s tem, da je nadalje okarakteriziran z adjuvansom.
3. 3. Imunogenski sestavek po zahtevku 2, označen s tem, daje adjuvans aluminijev hidroksid ali aluminijev fosfat.
4. 4. Imunogenski sestavek po zahtevku kateremkoli od zahtevkov 1 do 3, označen s tem, daje v posamezni humani dozi navedeni pertusisni toksoid prisoten v količini od 5 do 30 pg dušika, je navedeni filamentni hemaglutinin prisoten v količini od 5 do 30 pg dušika, je navedeni pertaktin prisoten v količini od 3 do 15 pg dušika in so navedeni aglntinogeni prisotni v količini od 1 do 10 pg dušika.
5. 5. Imunogenski sestavek po zahtevku 4, označen s tem, da v posamezni humani dozi vsebuje 20 pg dušika pertusisnega toksoida, 20 pg dušika filamentnega hemaglutinina, 5 pg dušika pertaktina in 3 pg dušika aglutinogenov.

   105
6. 6. Imunogenski sestavek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 5, označen s tem, daje navedeni difterični toksoid prisoten v količini od 10 do 20 Lfs in je navedeni tetanusni toksoid prisoten v količini od 1 do 10 Lfs.
7. 7. Imunogenski sestavek po zahtevku 6, označen s tem, da je navedeni difterični toksoid prisoten v količini 15 Lfs in je tetanusni toksoid prisoten v količini 5 Lfs.
8. 8. Imunogenski sestavek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 7, označen s tem, da navedeni inaktivirani poliovirus obsega zmes inaktiviranih poliovirusov tipov 1, 2 in 3.
9. 9. Imunogenski sestavek po zahtevku 8, označen s tem, da je navedena zmes inaktiviranih poliovirusov tipov 1, 2 in 3 prisotna v razmerjih:

   20 do 50 D antigenskih enot poliovirusa tipa 1,

   5 do 10 D antigenskih enot poliovirusa tipa 2,

   20 do 50 D antigenskih enot poliovirusa tipa 3, v posamezni humani dozi.
10. 10. Imunogenski sestavek po zahtevku 9, označen s tem, da uporabimo navedeno zmes inaktiviranih poliovirusov tipov 1, 2 in 3 v razmerjih:

    40 D antigenskih enot poliovirusa tipa 1,

    8 D antigenskih enot poliovirusa tipa 2,

    32 D antigenskih enot poliovirusa tipa 3, v posamezni humani dozi.
11. 11. Imunogenski sestavek po kateremkoli od zahtevkov 1 do 10, označen s tem, da nadalje daje zaščito proti bolezni, povzročeni z infekcijo s Haemophilus influenzae, in nadalje obsega konjugat nosilne molekule, izbrane iz skupine, ki sestoji iz tetanusnega toksoida in difteričnega toksoida, in kapsulamega polisaharida Haemophilus influenzae tipa b.

    106
12. 12. Imunogenski sestavek po zahtevku 11, označen s tem, da navedeni konjugat obsega konjugat tetanusnega toksoida ali difteričnega toksoida in poliriboza ribitol fosfata (PRP) Haemophilus influenzae tipa b.
13. 13. Imunogenski sestavek po zahtevku llali 12, označen s tem, daje navedeni konjugat pripravljen v liofilizirani obliki in je rekonstituiran za dajanje v navedenem imunogenskem sestavku s komponentami sestavka.
14. 14. Imunogenski sestavek po kateremkoli od zahtevkov 11 do 13, označen s tem, da navedeni imunogenski sestavek vsebuje v posamezni humani dozi konjugat v količini 5 do 15 pg PRP, konjugiranega na 15 do 35 pg tetanusnega toksoida.
15. 15. Imunogenski sestavek po zahtevku 14, označen s tem, da navedeni imunogenski sestavek vsebuje v posamezni humani dozi konjugat v količini 10 pg PRP, konjugiranega na 20 pg tetanusnega toksoida.
16. 16. Multivalentni vakcinski sestavek, označen s tem, da na 0,5 ml doze obsega 20 pg pertusisnega toksoida

    20 pg filamentnega hemaglutinina 5 pg fimbrij 2 in 3

    3 pg pertaktina membranskega proteina 15 Lf difteričnega toksoida 5 Lf tetanusnega toksoida poliovirus tipa 1 40 D antigenskih enot poliovirus tipa 2 8 D antigenskih enot

    1,5 pg aluminijevega fosfata.
17. 17. Sestavek po zahtevku 16, označen s tem, da nadalje na 0,5 ml doze obsega 10 pg očiščenega poliriboza ribitol fosfat kapsulamega polisaharida (PRP) Haemophilus influenzae tipa b, kovalentno vezanega na 20 pg tetanusnega toksoida.

    107
18. 18. Sestavek po zahtevku 16 ali 17, označen s tem, da nadalje na 0,5 ml doze obsega 0,6 % 2-fenoksietanola.
19. 19. Multivalentni imunogenski sestavek za dajanje zaščite v gostitelju proti bolezni, povzročeni z infekcijo z Bordetellla pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae in Haemophilus influenzae, ki obsega:

    (a) pertusisni toksoid, filamentni hemaglutinin, pertaktin in aglutinogene v očiščeni obliki, (b) tetanusni toksoid, (c) difterični toksoid in (d) konjugat nosilne molekule in kapsulamega polisaharida Haemophilus influenzae tipa b, ki je formuliran kot vakcina za in vivo dajanje gostitelju, označen s tem, da so posamezne komponente sestavka formulirane tako, da imunogenost posameznih komponent ni poslabšana z ostalimi posameznimi komponentami sestavka.
20. 20. Imunogenski sestavek po zahtevku 19, označen s tem, da je navedena nosilna molekula izbrana izmed tetanusnega toksoida in difteričnega toksoida.
21. 21. Uporaba imunogenskega sestavka po kateremkoli od zahtevkov 1 do 20 v pripravi zdravila za imunizacijo gostitelja proti bolezni.
22. 22. Imunogenski sestavek po kateremkoli od zahtevkov 4 do 22 v izdelavi zdravila za imunizacijo gostitelja proti bolezni.