SE530596C2 - Metod att fastställa syrebrist i blod från skalpen under förlossning - Google Patents

Description

25 30 35 530 556 eller pH utgör ideala prediktorer för moderat/svår I-IIE: känsligheten är endast 67 % för laktat och 50 % för pH, medan specificiteten är omkring densamma, 76 % för laktat och 73 % för pH. Känslighet och specificitet i att förutsäga acidos hos nyfödda är dessutom mindre än 70 % både för laktat och pH. En nyligen presenterad svensk rapport drar slutsatsen att även vid fosterövervakning med en kombination av kardiotografi (CGT) och STAN (analys av det kardiografiska ST-segmentet) så finns det en risk att man inte upptäcker perinatal asfyxi av ett slag som kan resultera i encefalopatisk skada (SBU Alert-rapport nr 2006-04).

Enzymer som är kända för att ha förhöjd halt i nyfödda spädbarn som utsatts för asfyxi under förlossning är LDH (laktatdehydrogenas), ALT (alaninaininotransferas) och AST (aspartataminotransferas) som också är kända som leverenzymer. LDH hittas i de flesta celler i kroppen och anses vara ett ospecifikt enzym. Det används därför inte ofta i kliniskt arbete. Tidigare användes LDH som markör för hjärtmuskelskada men har numera ersatts med mera specifika tester. AST och speciellt ALT är mera specifika för leverskada. I en studie över effekten av förlossningsarbete och förlossning på leverenzymer i plasma hos nyfödda hos en grupp av kinesiska lågriskkvinnor, bestämdes LDH (laktatdehydrogenas), ALT (alanintransarninas) och AST (aspartattransaminas) och GGT (y-glutamyltransaminas) och korrelerades med maternella och neonatala karakteristika (Mongrelli M et al., J Obstet Gynaecol Res, 26(1): 61-63, 2000).

Om ett foster utsätts för hypoxi under eller nära födelsen kommer blodflödet i dess kropp att omfördelas från "mindre viktiga organ" (njurar, lever, fett och tarmar) till fördel för hj ärnan, hjärtat och binjurarna. Detta tenderar att skada celler i icke privilegierade organ. Cellskadan resulterar ett läckage av enzymer som kommer in i blodomloppet. Om hypoxin är allvarlig kommer celler att dö och enzymkoncentrationen ökar ännu mer i blodet. Hypoxi påverkar också elektrolytbalansen i fostrets kropp. Ett exempel är inkommande flöde av kalcium från blodet, in i cellerna, under hypoxi. Det har i en modell med nyfödda djur visats att koncentrationen av joniserat kalcium i serum ökar under hypoxi. Kalcium predikterar också utgången Gijäinskada eller inte) hos människospädbarn. Andra enzymer och elektrolyter av intresse, vilka ändras under hypoxi hos nyfödda däggdjur, är kalium (KT), magnesium (Mgfl), natritnn (N a+), glukos, kreatininkinas (CK) och GGT.

Det finns således ett behov av förbättringar i fastställandet av status för syretillförsel hos ett foster vid förlossningen. 10 15 20 25 30 35 530 538 UPPFINNINGENS SYFTEN Det är ett syfte med föreliggande uppfinning att erbjuda en metod att fastställa hypoxi/syrebrist i blod från skalpen under förlossning, vilken metod saknar åtminstone en del av nackdelarna hos de metoder som är kända inom området.

Det är ett annat syfte med föreliggande uppfinning att erbjuda en metod att fastställa hypoxi/syrebrist i blod från skalpen under förlossning, vilken metod kompletterar de metoder som är kända inom området, och därmed ger en stadigare grund för fastställandet av hypoxi/syrebrist.

Ytterligare syften med uppfinningen kommer att vara uppenbara utifrån studien av följande beskrivning av uppfinningen, en föredragen utföringsfonn därav och de bilagda patentkraven.

KORTFATTAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt föreliggande uppfinning beskrivs det en metod att fastställa hypoxi i blod av vilket ett prov tagits under förlossning från skalpen av ett foster, innefattande fastställande av LDH (laktatdehydrogenas) i plasma. Det är föredraget att, förutom LDH, bestämma en eller flera markörer valda från gruppen som består av K, Mg, Ca, AST, ALT och laktat i sagda blod från fostrets skalp. Speciellt föredraget är det att kombinera LDH med vilken som helst av K, Mg, Ca, AST, ALT, laktat. Även kombinationen av LDH, laktat, Mg och AST och/eller ALT är föredragen.

I föreliggande ansökan avser "LDH" och "laktatdehydrogenas" den totala mängden laktatdehydrogenas, dvs. inte isoenzymer därav.

I metoden enligt uppfinningen tas det under förlossning ett blodprov från skalpen av ett foster, via vagina, vilket prov utsätts för separation av plasma (blodserum) från blodceller, speciellt från erytrocyter, och sagda plasma analyseras avseende LDH och eventuellt avseende en eller flera av K, Mg, Ca, AST, ALT, laktat.

Det är känt att hos friska personer så innehåller erytrocyter omkring 150 gånger mer LDH än vad serum gör. Det är därför viktigt att utföra provtagningen och separationen på ett sätt som inte skadar erytrocyterna, för att förhindra att deras innehåll av LDH går ut i plasman. Det är också viktigt att ta hänsyn till de små volymer blod från skalpen som är tillgängliga för analys. I metoden enligt uppfinningen separeras ett blodprov från i 10 15 20 25 30 35 530 555 skalpen i plasma och blodceller genom att bringa plasman att passera genom en porös matris, i föreliggande ansökan benänmd "membran", på ett fast underlag med förrnåga att hålla kvar blodcellema. Plasman analyseras på konventionellt sätt avseende LDH. K, Mg, Ca, AST, ALT och/eller laktat kan analyseras i plasma eller i blod; och om det analyseras i blod så måste blodprovet från skalpen delas upp i en del från vilken plasma erhålls för mätningen av LDH och en eller flera delar för analys av den eller de andra hypoximarkörema. Det ligger inom uppfinningens omfång att använda andra metoder som är kända inom teknikområdet, såsom rnikrocentrifugering, för att separera plasma från blodceller i blodprovet från skalpen enligt uppfinningen.

Metoder att analysera LDH i fluider såsom blodplasma är kända inom teknikområdet och kan anpassas till att mäta LDH i serum som erhållits från blod från foster; se t.ex.

Pinto P V C et al., Clin Chem 152339-349, 1969. Speciellt användbar är den metod som beskrivs i US patent nr. 4,803,l59, som härmed införlivas i föreliggande ansökan. Det finns en kommersiell apparat för användning i den senare nämnda metoden (V itros® DT6O II Chemistry System; Ortho-Clinical Díagnostics, Inc., U.S.A.). Metoder för analys av K, Mg, Ca, ALT, AST och laktat i blod används rutinmässigt inom klinisk kemi och är därför enkla för en fackman inom teknikområdet att ta till sig.

Enligt uppfinningen finns det förhöjda halter av LDH, K, Mg, Ca, ALT, AST och laktat i blod av vilket ett prov tagits under förlossning från skalpen av ett foster, ifall fostret befinner sig i hypoxiskt tillstånd, varvid standarden (baslinjen) är motsvarande halter i ett foster under förlossning och/eller omedelbart efter förlossning i samband med en icke problematiskt förlossning. Speciellt är halterna av LDH, ALT och AST förhöjda med en faktor två, speciellt tre eller mer, hos ett foster under förlossningen, vilket foster lider av svår asfyxi, dvs. asfyxi som ger fostret en 10 %, speciellt en 25 %, högre risk att få HIE.

Enligt en föredragen aspekt av föreliggande uppfinning beskrivs det en metod att fastställa hypoxi i ett blodprov från skalpen under förlossning, innefattande att anordna en kammare för insamlande av vätska, vilken kammare har en membranvägg och en öppning som står i kommunikation med ett medel som ger ett negativt tryck, påföring på membranet på dess yta som är vänd bort från kammaren med provet, applicerande av ett negativt tryck på kammaren, därigenom separerande blodceller från plasma som samlas i kammaren, avlägsna plasman från kammaren och analysera plasman avseende LDH. Det är föredraget att kammaren får uppnå omgivningstemperatur innan plasman avlägsnas. 10 15 20 25 30 35 530 596 Enligt en föredragen variant av föreliggande uppfinning står sarnlingskammaren i kommunikation med det plasmaanalyserande medlet, genom en ledning som innefattar ett ventildon, vilken ledning kan sättas under reducerat tryck för att avlägsna provet efter det att trycket i kammaren har återgått till omgivningstryck och ventildonet har öppnats. Alternativt kan kammaren sättas under positivt tryck efter det att ventildonet öppnats, för att tömma kammarens innehåll av plasma ut i ledningen. Det är uppenbart att kammarens, membranets och ledningens dimensioner bör anpassas till den lilla provvolymen och att membranet och de väggar med vilka provet kommer i kontakt företrädesvis bör vara hydrofoba för att undvika vidhäftning av provet och plasman. Det i är föredraget att använda material såsom poly(tetratluor)eten, polyeten, polypropen, polystyren och liknande för kammaren och ledningen. Enligt en annan föredragen variant står samlingskammaren dessutom i kommunikation med analyserande medel för en eller flera av K, Mg, Ca, AST, ALT, laktat, genom t.ex. en andra ledning som innefattar ett ventildon.

Enligt en andra föredragen aspekt beskrivs det en plasmaseparationsanordning för användning i metoden enligt uppfinningen. Anordningen innefattar ett hus, ett fack i huset, en första öppning i huset som är täckt med ett semipermeabelt membran, en andra öppning i huset som bringar facket att via en ledning kommunicera med ett medel för negativt tryck, samt ett ventildon för att kontrollera sagda kommunikation. Det är föredraget för ventilmedlen att vara anordnade i ledningen. Facket kan dessutom vara försett med en andra ledning som är anordnad att kommunicera med en nedre del därav vilken är försedd med ett andra ventildon för att kontrollera tömning av fluid (plasma) som ansarnlats i botten av facket. Altemativt kan facket innefatta medel för att fastställa LDH och andra markörer i den ansamlade plasman. Det är föredraget att membranet har nn arna av från s rnnfi nu iooo nnnï npeniniir från 20 nnnz nu 300 nrrn? Föreliggande uppfinning kommer nu att förklaras i större detalj genom beskrivningen av föredragna men inte begränsande utföringsfonner därav, illustrerat i grova figurer.

KORTFATTAD FIGURBESKRIVNING Fig. 1 är ett blockschema över en föredragen uttöringsform av metoden enligt uppfinningen; Fi g. 2 till 4 är tvärsnittsvyer över en första uttöringsforrn av en separationsanordning i efter varandra följ ande användningssteg av metoden enligt uppfinningen. 10 15 20 25 30 35 530 538 BESKRIVNING AV FÖREDRAGNA UTFÖRINGSFORMER EXEMPEL Bestämning av laktatdehydrogenas. Membranet i ett plasmaseparationskort (Micronics, Inc.; U.S.A.) laddades med kapillärt fingerblod (40 ul) som erhållits från friska vuxna (en man och en kvinna). Därefter applicerades det manuellt ett vakuum på membranets motsatta sida. Tio ul plasma som sugits till plasmasanilingskarnrnaren i kortet aspirerades med en elektronisk pipett efter det att kammarens lock öppnats medelst en skalpell. l tre efter varandra följande experiment applicerades det vardera 10 pl av aspirerad plasma på Vitros EKTACHEM DT 60 II objektglas för analys av LDH, AST respektive Mg. LDH och AST analyserades i en Vitros DTSC modul (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., U.S.A.), medan Mg analyserades på en Vitros DT 60 modul från samma företag.

Plasmaseparatíonsanordning. En plasmaseparationsanordning 1 enligt uppfinningen visas i Fig. 2-4, i efter varandra följande användningssteg enligt metoden. Anordningen 1 innefattar ett generellt cirkulärt hus i ett hydrofobt polymermaterial såsom poly(tetrafluoreten). Ett plasmasamlingsfack 2 i huset har en övre öppning som är tillsluten medelst ett plasmaseparationsmembran 5 som uppbärs av ett galler 6 av samma eller liknande material som materialet fór huset. Fackets botten 4 lutar ned mot dess centrum i form av en kon med stor vinkel. En rörformig ledning 8 försedd med en ventil 9 sträcker sig från en sidovägg i facket 2. Ledningen 8 går till en källa for negativt tryck, såsom en vakuumpump (ej visad). I F ig. 2 har ett prov 7 om 40 pl avsatts på den yttre ytan av membranet 5, varvid ventilen 9 befinner sig i stängd position. Genom öppnande av ventilen 3 sätts facket 2 under negativt tryck (Fig. 3); varigenom plasma 7' sugs in i facket 2 och ansamlas på dess lutande botten 4 medan blodcellerna 7" hålls kvar av membranet 5. Efter det att ventilen 8 stängts uppnås det tillstånd som visas i Fig. 4, i vilket trycket i kammaren utjämnas mot omgivningstrycket genom luft som sugs in genom membranet 5. Alternativt kan det via ledningen 8 åstadkommas tryckutjämning i facket 2, efter det att bildandet av ett negativt tryck stoppats, eller på något annat lämpligt sätt. F ig. 4 illustrerar avlägsnandet av plasmaprovet 7" från facket 2 medelst en aspirerande spruta vars kanyl 10 har införts genom membranet 5. För att undvika kontaminering av plasmaprovet 7" med blodceller på membranet, kan det vara anordnat en separat införselsport (ej visad) såsom t.ex. en skiljevägg av gummi som är anordnad i en separat öppning i en övre vägg eller en sidovägg hos anordningen 1.

Blockschemat i Fig. 1 illustrerar principerna för metoden enligt uppfinningen. 10 15 20 530 595 Analys av blod från skalpen. Analysen upprepades med framgång för blod av Vilkßï ßfi prov tagits från skalpen av en frisk vuxen man, med Standardutrustning som används i kliniska rutinundersökningar av pH eller för mätning av laktat. Proverna var med eller utan användning av ett vaginalrör (för att undvika kontaminering med fostervatten i en verklig situation). Tiden från applicering av blodprovet på plasmaseparationskortet till uppvisande av resultatet vari genomsnitt 7 minuter. Det är uppenbart att tiden for analys kan kortas avsevärt, såsom till tre eller fyra minuter eller till och med mindre, genom att använda utrustning anpassad till metoden, speciellt ett separationskort i vilket det negativa tryck som appliceras på membranets vakuumsida är välkontrollerat och tidskontrollerat, såsom genom användning av elektroniska medel. Användningen av metoden enligt uppfinningen vid bädden, i bestämmande av blod från skalpen av ett foster, är således helt tänkbar i en akut situation.

Vid mätningarna befanns det att LDH låg betydligt högre i blod från skalpen än i kapillärt fmgerblod; LDH: 1044 U/L och 1127 U/L i blod från skalpen med respektive utan användning av ett fostervattenrör, versus 400 U/L i fingerblod. En avvikelse mellan blod från skalpen och blod från navelsträngen, liknande den som ses för LDH hos vuxna män, har observerats avseende glukos och hemoglobinkoncentration hos foster. Det verkar som om mätning av LDH i blod från skalpen av ett foster inte är tidigare känt inom omrâdet.

Claims (1)

1. 0 15 20 25 30 538] 555 PATENTKRAV 1. 10. En metod fór att fastställa akut asfyxi i blod av vilket ett prov tagits under förlossning från skalpen av ett foster, kännetecknad av att metoden innefattar fastställande/bestämning av den totala mängden av laktatdehydrogenas (LDH) i plasma som erhållits från provet. En metod enligt kravet 1, varvid provet är från 5 pl till 60 pl. En metod enligt vilket som helst av kraven l till 2, varvid metoden innefattar separering av plasma från blodceller genom ett semipermeabelt membran. En metod enligt kravet 3, varvid membranet har en area av från 5 mrnz till 1000 mmz. En metod enligt kravet 3 eller 4, varvid metoden innefattar stegen påförande av ett prov på en sida av membranet, applicering av undertryck på membranets andra sida samt uppsarnlande av plasmai ett fack som år vänt mot nämnda andra sida. En metod enligt kravet 5, vilken metod innefattar ett steg med överföring av plasma från facket till en anordning for fastställande/bestämning av LDH. En metod enligt krav 5, vilken metod innefattar fastställande/bestämning av LDH i den plasma som avsatts i facket. En metod enligt kravet 3, varvid membranet är överfórt på en porös matris in i vilken plasma vandrar attraherad av kapillärkrafter. En metod enligt kravet 8, varvid membranet avlägsnas från matrisen efter en bestämd tid för att fastställa/bestämma LDH i matrisen. En metod enligt vilket som helst av kraven 1 till 2 och innefattande stegen av: separering av plasma från blodceller i provet genom en milcrocentrifiig och överföring av den på ytligt flytande (”supernatant”) plasman till en apparat for fastställande/bestämning av LDH. 10 15 20 25 30 530 595 11. En metod enligt vilket som helst av kraven 1 till 10, vilken metod vidare innefattar järnfórelse av LDH som fastställts/bestämts på detta sätt med LDH som fastställts/bestämts i plasma som erhållits från ett blodprov från skalpen av ett foster, vilket blodprov under en förlossning tagits från ett foster som ej lidit brist på syre. 12. En metod enligt kravet 1 1, varvid en ökad nivå av LDH som är statistiskt signifikant indikerar brist på syre. i 13. En metod enligt kravet l l, varvid en statistiskt signifikant ökning av LDH-nivån med en faktor av tre eller mer indikerar en lO-procentig ökning av risken för hypoxisk-ischemisk encefalopati. 14. En metod enligt vilket som helst av kraven 1 till 13 som dessutom innefattar bestämning av en eller flera medlemmar av den grupp som består av K, Mg, Ca, AST, ALT och laktat i nämnda skalpblod och/eller plasma. 15. En metod enligt kravet 14, varvid en statistiskt signifikant ökning av nivån av vilken som helst av K, Mg, Ca, AST, ALT och laktati kombination med en statistiskt signifikant ökning av LDH indikerar syrebrist (hypoxi). 16. Användning av en apparat för separering av plasma från blodceller i metoden enligt vilket som helst av kraven 1 till 15, varvid apparaten innefattar ett hus, ett fack i huset, en första öppning i huset vilken första öppning är täckt av ett semipermeabelt membran, en andra öppning i huset vilken via en ledning står i förbindelse med facket med ett medel för undertryck, samt ett ventildon för styming av nämnda förbindelse. 17. Användning enligt kravet 16, varvid ventildonet är anordnat i ledningen. 18. Användning enligt krav 16 eller 17, varvid facket vidare innefattar en andra ledning anordnad att kommunicera med en bottendel därav och försedd med ett andra ventildon för kontrollerad tömning av plasma som ansarnlats på botten av facket. 530 595 l9. Användning enligt krav 16 eller 17, varvid facket innehåller eller står i förbindelse med ett medel fór att fastställa/bestämma LDH i den plasma som ansamlats i huset.