SE526214C2 - Ett sätt att generera metallkelaterande affinitetsligander - Google Patents

Description

526 214 I allmänhet är IMAC användbart till separation av proteiner eller andra molekyler som uppvisar affinitet för matrisens övergàngsmetalljon. Exempelvis kommer proteiner att binda till matrisen i närvaro av tillgängliga histidin-, cystein- och tryptofanresiduer, vilka alla uppvisar en affinitet för den kelaterade metallen. Med de nyare molekylärbiologiska teknikerna anpassas eller märks proteiner nu enkelt med en eller flera histidinresiduer för att öka deras affinitet för metall- kelaterade ligander, och följaktligen har metallkelatkromato- grafi pä senaste tiden antagit en allt viktigare roll i reningen av proteiner.

Enkla kelatorer har föreslagits som ligander för IMAC, sä som iminodiättiksyra (IDA). IDA, kopplad till stationärfaser av agaros och därefter laddad med olika metaller, så som Cuæj Zn”' och Nih) har använts för att fånga in proteiner och peptider och är också tillgänglig som kommersiella resiner. Mer specifikt beskriver USP 4,551,27l (Hochuli, innehavare Hoffmann-La Roche Inc.) en metallkelatresin vilken innefattar IDA-ligander, vid rening av interferon. Resinen kan definieras av följande formel: [agaros] -o- (om) - (cHoH) -CHZ-N (cnzcoofi 2Me2*, vari Me är Ni eller Cu.

De bästa resultaten erhålles med denna resin om interferonet redan har renats delvis. Resinen kan enligt specifikationen framställas på känt sätt genom att behandla agaros med epiklor- hydrin eller epibromhydrin, regera den bildade epoxiden med dinatriumsaltet av iminoättiksyra och överföra produkten till koppar- eller zinksalt genom tvätt med koppar(II)- eller zinklösning.

Mer nyligen beskrev EP 87l09892.7 (F. Hoffman-La Roche AG) och dess ekvivalent USP 4,877,83O (Döbeli et al, innehavare Hoffmann-La Roche Inc.) en tetradentatkelator känd som nitrilotriättiksyra (NTA) för användning med metaller som har sex koordinationsplatser. Mer specifikt kan matrisen beskrivas med den generella formeln [bärarmauris] -spacer-NH- (C112) x-CH (coon) -N (cuzcoofi ,Ni2*, 526 214 vari x = 2-4. Den beskrivna matrisen framställs genom att reagera en aminosyraförening med formeln R-HN-(CHflx-CH(NH2)- COOH, vari R är en aminoskyddsgrupp och x är 2, 3 eller 4, med bromättiksyra i alkaliskt medium och därefter, efter ett mellanliggande reningssteg, klyva av skyddsgruppen och reagera denna grupp med en aktiverad matris. Följaktligen involverar framställningsmetoden separata steg för alkylering och avskydd- ning av aminosyran, vilka steg gör metoden tidskrävande och, som en följd därav, kostsamma. Dessutom är alkyleringskemin mindre effektiv, och efter avskyddning är produkten inte väl definierad med avseende pà restprodukter frän neutralisering och klyvning.

Efter detta kopplas materialet till en fast stationärfas som bär karboxylfunktionaliteter genom att bilda en amidbindning. Detta förfarande kan emellertid involvera avigsidor, eftersom det erhållna mediet presenterar den immobiliserade önskade kelaterande liganden så väl som några oreagerade karboxylgrupp- er, ges således ett heterogent medium. Vidare är mono-Nlskyddade aminosyror dyra startmaterial vilket gör metoden som helhet ännu mer kostsam.

Slutligen beskriver WO Ol/81365 (Sigma-Aldrich Co.) en metall- kelaterande samansättning som enligt spècifikationen är kapabel att bilda relativt stabila kelater med metalljoner och uppvisar en förbättrad selektivitet för polyhistidinmärkta proteiner.

Enligt sagda WO 01/81365 är bindningen mellan kelatorn och resinen en viktig parameter för selektiviteten, och bindningen är en neutral eter, en tioeter en selenoeter eller en amid. Den beskrivna sammansättningen kopplas till en olöslig bärare, sä som Sepharose“"enligt givna exempel. Kromatografimediet fram- ställs pà två olika sätt; antingen genom en fastfasreaktion direkt pä den i förväg aktiverade fasta stationärfasen som slutligen används i kromatografimediet, eller genom en separa- tion i lösning av den intermediära produkten N,N,N',N'-tetrakis (karboximetyl)-L-cystein som slutligen kopplas till den fasta stationärfasen. Fastfassyntesen utförs genom tillsats av L- cystein till en, i förväg epiklorhydrinaktiverad Sepharosegel, under alkaliska betingelser under en utökad reaktionstid (18 tim), följt av tvättar. Därefter tillsätts bromättiksyra, igen under alkaliska betingelser och en utökad reaktionstid (72 tim), 526 214 4 och igen följt av tvättar, och slutligen förses återstående fria aminogrupper som närvarande på gelen med ändgrupper (capping groups) med ättiksyraanhydrid.

Fastfassyntes på detta sätt erbjuder dålig kontroll av reaktionen och potentiella sidoreaktioner, och därigenom en mindre homogen produkt.

Den alternativa vägen, baserad pà syntes i lösning av en inter- mediär produkt startar med tillsats av ett stort överskott (40 gånger) av glyoxylsyra till L-cystein i en alkalisk borat- buffert. Denna intermediära produkt renades därefter, efter pH- manipulationer och konduktivitetsjusteringar av reaktionsbland- ningen, med jonbyteskromatografi vilket gav N,N,N',N'-tetrakis (karboximetyl)-L-cystein.

Före koppling till en fast stationärfas måste N,N,N',N'- tetrakis(karboximetyl)-L-cystein reduceras till N,N-bis(karboxi- metyl)-L-cystein med användning av tris-(karboxietyl)fosfin under alkaliska betingelser. Detta material kan slutligen användas för att koppla till en i förväg aktiverad fast stationärfas och bilda kromatografimediet. Denna syntesmetod är omständlig och beroende av ett stort överskott av reagens för att bilda den önskade produkten som slutligen renas under specifika kromatografibetingelser, följt av reduktion som ett ytterligare syntessteg, och är därigenom mindre lämpad för användning i storskalig produktion.

Följaktligen finns det fortfarande ett behov av förbättrade metoder för syntes av IMAC-ligander så väl som för immobiliseringen därav till en basmatris.

Sammanfattning av föreliggande uppfinning Ett syfte med föreliggande uppfinning är således en förbättrad metod för att generera metallkelaterande affinitetsligander i polydentatform för efterföljande koppling till en basmatris, vilken metod utnyttjar kostnadseffektiva och lättillgängliga startmaterial och reagens och ger höga utbyten. Detta kan åstadkommas så som definieras i patentkrav l.

Ett annat syfte med den föreliggande uppfinningen är att möjliggöra ett omsorgsfullt val av liganderna som immobiliseras på en basmatris för användning i IMAC. Detta kan åstadkommas med 526 214 en metod som genererar ett separationsmedium innefattande metallkelaterande affinitetsligander i polydentatform kopplade till en basmatris, vari kopplingskemin är väl definierad och enkel att kontrollera.

Ytterligare ett syfte med uppfinningen är att tillhandahålla en sådan metod, vilken resulterar i en homogen produkt. Ännu ett syfte med uppfinningen är att tillhandahålla en metod såsom diskuterats ovan, vilken också tillåter introduktion av två eller flera funktionaliteter, vilka funktionaliteter kan vara av samma sort eller olika.

Ett annat syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ligander för immobiliserad metallaffinitets- kromatografi, vilka ligander presenterar ett förbättrat handtag för koppling till en basmatris och således en förbättrad kopplingseffektivitet jämfört med ligander enligt känd teknik.

Ett ytterligare syfte med den föreliggande uppfinningen är att tillhandahålla ett kromatografimedium, vilket vid användning i immobiliserad affinitetskromatografi (IMAC) ger ett lågt läckage av metalljoner.

Ett annat syfte med uppfinningen är att tillhandahålla en metod för att generera ett mångfaldigt bibliotek av metallkelaterande affinitetsligander baserat på samma scaffold dvs stomme, vilken metod kan användas för optimering av ligander för en specifik tillämpning.

Syftena med uppfinningen kan uppnås genom ett eller flera av de bifogade patentkraven. Ytterligare syften, fördelar och utföringsformer av föreliggande uppfinning framgår av den detaljerade beskrivningen som följer.

Kortfattad beskrivning av figurerna Figur 1 tillhandahåller en schematisk illustration av den generella vägen att framställa ett separationsmedium som innefattar polydentata metallkelaterande affinitetskromatografi- ligander enligt uppfinningen.

Figur 2 (a) och (b) illustrerar rening av maltosbindande protein med (His)6-svans (MBP-His) med användning av IMAC-separations- 526 214 6 medium framställt enligt uppfinningen. Mer specifikt är figur 2(a) kromatogrammet, medan figur 2(b) är en förstoring av gradientdelen av sagda kromatogram. I figur 2 är kurvan vid A280 nm betecknad A, procenthalten (%) av elueringsbufferten är betecknad B och konduktiviteten är betecknad C.

Figur 3 visar SDS-PAGE-analyser av fraktioner fràn IMAC-rening av MBP-His. Fraktionsnumrering som i figur 2 kromatogram.

Figur 4 visar ett testkromatogram, vari UV 372 nm = A, Konduktivitet = B, Injektion = C. Den nickelbindande kapaciteten hos denna prototyp bestämdes till 16 umol Ni/ml och metalläckaget till 4 %.

Figur 5 visar resultaten av nickelkapacitetstestet utfört pà ett separationsmedium enligt uppfinningen så som beskrivs i exempel 5.

Definitioner Uttrycket "separationsmedium” används här för ett material användbart t.ex. som packning av en kromatografikolonn, och bestàr mer specifikt av en eller flera ligander kopplade till en basmatris. Basmatrisen fungerar således som en bärare, medan liganderna tillhandahåller funktionaliteter som interagerar med màlsubstanser i kromatografi.

Uttrycket ”spacer” används för en kemisk enhet som distanserar en ligand från basmatrisen.

Uttrycket ”ligand” betyder här en kemisk enhet som är kapabel att binda màlsubstanser. Sådana màlsubstanser kan antingen vara en förening, vilken det är önskvärt att isolera eller avlägsna med kromatografi, eller en analytisk màlsubstans.

Uttrycket ”polydentata metallkelaterande” ligander avser ligander med tvâ eller flera donatoratomer som samtidigt kan koordinera till, dvs. kelatera, en metall. Således har en polydentatligand tvà eller flera donatoratomer och upptar två eller flera platser i en koordinationssfär.

Således avser uttrycket ”metallkelaterande funktionaliteter” de grupper som tillhandahåller donatoratomer. Vanligen är funktionaliteterna distanserade från varandra och följaktligen används uttrycket ”ligandarm” för varje funktionalitet.

Uttrycket ”gel” används för en separationsmatris, vilken föreligger i form av en gel. 526 214 Detaljerad beskrivning av uppfinningen En första aspekt av föreliggande uppfinning är en metod för att generera åtminstone en metallkelaterande affinitetsligand, vilken ligand är ett polydentat, vilken metod innefattar stegen att man (a) åstadkommer åtminstone en stomme definierad av den generella formeln (I) 3 \ X1 vari X1, X2 och X3 oberoende av varandra är spz- eller sp3- hybridiserade kolatomer eller heteroatomer, X4 är en nukleofil och m är ett heltal av 0-2; (b) åstadkommer åtminstone en arm innefattande metallkelaterande affinitetsligander i form av polydentat, eventuellt i en form vari de metall-kelaterande funktionaliteterna är skyddade, på vardera stommen genom att derivatisera de nukleofila X4- grupperna på sagda stomme medan stommens cvkliska struktur bibehålls; (c) öppnar ringen vid bindningen mellan karbonylen och svavlet på den derivatiserade stommen genom att tillsätta ett reagens som adderar en eller flera metallkelaterande affinitetsligand-armar till stommen, och, om erfordras, (d) avskyddar ligandarmens(armarnas) funktionaliteter som åstadkoms i steg (b).

Stommen från steg (a) kan tillhandahållas som ett fast ämne eller, företrädesvis, i ett lösningsmedel. I den mest fördelaktiga utföringsformen är X1, X2 och X3 i formel (I) kolatomer. I alternativa utföringsformer är en eller flera av X1, X2 och X3 heteroatomer, dvs. valda från gruppen bestående av syre, svavel, kväve och/eller kisel, förutsatt att sagda 526 214 8 heteroatom inte inverkar i den efterföljande användningen av liganderna.

I formel (I) är X1 någon lämplig nukleofil grupp som möjliggör derivatisering. I en illustrativ utföringsform väljs således X4 från en grupp så som -OH, -SH eller -NH2.

Som nämnts ovan kan m vara något heltal av 0-2, dvs. 0, l eller 2. Som framgår av metodstegen kommer värdet av m att bestämma antalet atomer mellan ligandarmen och dess fästpunkt pà en basmatris då den är utvecklad till ett separationsmedium.

I en fördelaktig utföringsform är m 1 och stommen är homocystein-tiolakton i formel (I). Som fackmannen inom området kommer att inse kan homocystein-tiolakton användas i ren form eller som racemat. Homocystein-tiolakton är kommersiellt tillgänglig t.ex. från Aldrich, katalog nr H1, 580-2, och CAS nr 6038-19-3.

I steg (b) utförs derivatiseringen genom att addera ett lämpligt derivatiserande ämne bestående av en första del, vilken är elektrofil och således kapabel att reagera med X4 i formel (I), och en andra del, vilken består av en metallkelaterande funktionalitet.

Den första delen av det derivatiserande ämnet, dvs. elektrofil del, kan illustreras av C=C; C-Y, vari Y representerar till exempel en halogen, så som Br, I, Cl, eller ett mesylat, eller en tosylatgrupp; eller en syra eller en aktiverad syra så som WC=O, vari W till exempel bildas från N-hydrosuccinimid, pentafluorfenol, para-nitrofenol eller isopropyl-kloroformat.

I en fördelaktig utföringsform tillhandahålls derivatiseringen genom att addera två derivatiserande ämnen, av vilka var och en innefattar olika eller identiska metallkelaterande funktionali- teter, häri betecknade L1 och L2. I denna utföringsform är de elektrofila delarna av ämnet företrädesvis av samma natur för att underlätta derivatiseringen. I en alternativ utföringsform introduceras mer än två olika eller identiska metallkelaterande 526 214 funktionaliteter genom derivatisering av X4, företrädesvis genom användning av tvà eller flera olika steg, så som inses av fackmannen inom området. Följaktligen tillhandahålls multipla funktionaliteter enkelt i samma polydentata metallkelaterande affinitetsligand.

Det eller de derivatiserande ämnen som används i föreliggande metod kan antingen innefatta de metallkelaterande funktionaliteterna i skyddad form, vari donatoratomerna är otillgängliga för reaktion under derivatiseringen av stommen, eller i oskyddad form. I utföringsformen där funktionaliteten är skyddad, ska sagda skyddsgrupp vara enkel att avlägsna i ett efterföljande steg. Följaktligen är skyddsgruppen antingen syralabil, så som en alkylgrupp, eller baslabil, så som en tert.butylgrupp. I en utföringsform är skyddsgruppen en CHZCH3- grupp. Olika slags metallkelaterande funktionaliteter år kända inom detta omràde, och kan i princip vara vilken elektron- donerande grupp som helst. Mer specifikt väljs de metall- kelaterande funktionaliteterna som används i den föreliggande metoden fràn gruppen som består av aromater, heterocykliska derivat, så som pyridin, tiofen, furan och imidazol, syror, estrar, ketoner, amider, sulfoner, sulfönamider, nitriler, kol- kol-dubbel- och trippelbindningar.

I en illustrativ utföringsform är det derivatiserande ämnet en halogenerad karboxylsyraester, sà som en alkylester av en halogenerad karboxylsyra. Sá som nämnts ovan är X4, i en mer speciell utföringsform, NH2. Metoder för att reagera en NH¿-grupp med en grupp som bär en halogen eller en annan lämnande grupp är väl kända i detta område och utförs behändigt vid rumstemperatur i ett lösningsmedel så som N,N-dimetylformamid (DMF). I en utföringsform används det derivatiserande ämnet i ett molför- hàllande pà 2:1 till stommen för att frambringa två metall- kelaterande affinitetsligandarmar på varje stomme genom derivatiseringen. Fackmannen kan enkelt övervaka reaktionen och bekräfta den erhàllna derivatiseringen med en konventionell metod sä som LC-MS. Således tillhandahåller den föreliggande uppfinningen en mindre komplex syntesväg till polydentata metallkelaterande affinitetsligander än WOO1/81365. Pà grund av 526 214 u v den fördelaktiga kemin resulterar den föreliggande metoden också i en mer homogen produkt. De erhållna utbytena enligt den föreliggande metoden kan vara så höga som 90 %, och startmaterialen är för närvarande enkelt tillgängliga till en resonabel kostnad.

I steg (c) tillhandahålls ringöppning vid bindningen mellan karbonylen och svavlet pà den derivatiserade stommen genom tillsats av ett reagens, vilket adderar en eller flera metallkelaterande affinitetsligandarmar pá stommen. Således öppnas den cykliska strukturen vilket tillhandahåller en eller flera ytterligare metallkelaterande ligandarmar.

Ringöppningen kommer också att resultera i ett handtag tillgäng- ligt för efterföljande koppling till en basmatris i form av den tiofila gruppen, vilken på grund av sin nukleofila natur till- handahàller behändig kopplingskemi.

I en fördelaktig utföringsform är ringöppningen hydrolys genom tillsats av alkalihydroxid, så som NaOH, i vilket fall stommens karbonyl överförs till en karboxylgrupp. Fackmannen inom detta omrâde kommer emellertid förstå att om ringöppningen utförs med ett annat reagens kan en eller flera olika metallkelaterande funktionaliteter introduceras. I en alternativ utföringsform år ringöppningen aminolys, i vilket fall kvävet bär en eller flera metallkelaterande funktionaliteter. I denna utföringsform definieras reagenset av den generella formeln II: Formel 2 vari L3 och L4 innefattar metallkelaterande funktionaliteter, vilka kan vara samma eller olika. Vidare är, i en utföringsform, sagda ligandarmar L; och L4 samma som de som tillhandahölls i steg (b) genom derivatiseringen. 526 214 ll Sá som indikerats ovan, i utföringsformen där de metall- kelaterande funktionaliteterna L1 och L2 var skyddade under derivatiseringssteget, utförs således företrädesvis ett avskyddningssteg. I en utföringsform utförs sagda avskyddning som ett separat steg som följer efter steg (c), och kan åstadkommas genom att tillsätta en bas eller en syra, så som indikerats ovan. Kemin som är användbar för skyddning/ avskyddning av funktionaliteter är väl känd inom detta område och fackmannen inom området kan enkelt utföra sådana steg.

I en speciellt fördelaktig utföringsform av föreliggande metod utförs avskyddningen i samma steg som ringöppningen.

Följaktligen är den stora fördelen med denna utföringsform att polydentata metallkelaterande affinitetsligander kav genereras med användning av ett tvàstegsförfarande. Därför tillhandahåller denna utföringsform en mindre komplex metod än metoderna enligt känd teknik för syntesen av polydentata metallkelaterande affinitetsligander. I en utföringsform vari det derivatiserande ämnet innefattar en baslabil grupp, frambringas detta steg genom tillsats av natriumhydroxid. Hydrolysen utförs lämpligen vid rumstemperatur i t.ex. 1-2 tim. Faktum är att de föreliggande uppfinnarna också har visat att även om'allt startmaterial kan överföras inom 90 minuter, ger ytterligare 48 timmar inte upphov till några sidoprodukter. Följaktligen resulterar hydrolysen enligt uppfinningen i en stabil, homogen och väldefinierad produkt. I en alternativ utföringsform, vari det derivatiserande ämnet innefattar en syralabil grupp, i steg (c), frambringas detta steg genom tillsats av en syra, så som HCl.

I en speciell utföringsform av föreliggande metod har steg (a) och (b) utförts tidigare för att tillhandahålla en enkelt derivatiserbar stomme. Följaktligen omfattar föreliggande uppfinning också en metod, vari karboximetylering av stommen har utförts tidigare.

I en fördelaktig utföringsform kopplar man den på så vis erhållna produkten via sitt svavel till en basmatris för att framställa ett separationsmedium. Ett sådant separationsmedium är användbart för isolering av málsubstanser, för analytiska 526 214 12 ändamål etc. Basmatrisen som används i föreliggande metod kan vara av något material som är lämpligt för det avsedda ändamålet.

I fallet där separationsmediet är avsett för användning i immobiliserad metallkelaterande affinitetskromatografi är således basmatrisen vanligen i pärl- eller monolitform och gjord från naturliga polymerer, t.ex. agaros eller dextran, eller syntetiska polymerer, sä som divinylbensen eller styren.

Basmatrisen kan t.ex. vara i formen av en gel.

Vad beträffar naturliga polymerer är lämpliga porösa polymer- pärlor därav antingen enkla att utföra av fackmannen inom området enligt standardmetoder, sà som omvänd suspensions- gelering (invers suspension gelation) (S. Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964) eller spinnande skivteknik (spinning disk technique) (se t.ex. WO 88/07414 Prometic Biosciences Inc)). Alternativt erhàlls naturliga polymerpärlor fràn kommersiella källor, så som Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sverige. Illustrativa varunamn pà sådana användbara naturliga polymerpärlor är t.ex. av typen kända som Sepharosem eller Sephadexflfl Vad gäller syntetiska polymerer består basmatrisen av tvärbundna syntetiska polymerer, så som styren eller styrenderivat, divinylbensen, akrylamider, akrylatestrar, metakrylatestrar, vinylestrar, vinylamider etc. Sådana polymerer framställs enkelt enligt standardmetoder, se t.ex. ”Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization” (R Arshady: Chimica e L'industria 70(9), 70-75 (1988)). Alternativt kan en kommersiellt tillgänglig produkt, så som Source““(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sverige) ytmodifieras enligt uppfinningen.

I alternativa utföringsformer kan basmatrisen t.ex. vara ett membran, ett filter, ett eller flera chips, ytor, kapillärer etc.

I en utföringsform är basmatrisens reaktiva grupper allylgrupper dvs. kol-kol-dubbelbindningar. I en utföringsform används en kommersiellt tillgänglig basmatris vilken redan uppvisar 526 214 13 allylgrupper. I en alternativ utföringsform tillhandahålls allylgrupperna enligt väl kända metoder. I en illustrativ utföringsform har således den föreliggande basmatrisen allylerats genom behandling med en epoxid som bär en allyl- funktionalitet vid lämpliga temperaturer och reaktionstider. Ett exempel på en sådan vanligt använd allylfunktionell epoxid är allylglycidyl-eter (AGE)., I en speciell utföringsform kopplas, i steg (d), följaktligen ligandens svavelgrupp till basmatrisen via den aktiverade allylgruppen pà allylglycidyl-etern (AGE). I denna utföringsform kommer, i slutprodukten, svavelgruppen vara fäst till basmatrisen genom en spacer innefattande etergrupper och hydroxigrupper och separationsmediet kan definieras som basmatris-O-CH;-CHOH-CH;-O-CH2-CHOH~CH2-S-ligand_ I alternativa utföringsformer används andra, väl kända kopplingstekniker för tiolinnehàllande ligander, så som epoxidöppning eller av radikaladdition till dubbelbindningar.

I en speciell utföringsform aktiveras sagda allylgrupper genom bromering eller, alternativt, är kopplingen en fri radikal- reaktion. Den fria radikalen som används kan vara någon lämplig kommersiellt tillgänglig initiator, UV'etc.

En andra aspekt av föreliggande uppfinning är en polydentat metallkelaterande affinitetsligand eller ett separationsmedium innefattande åtminstone en, företrädesvis ett flertal, polydentata metallkelaterande affinitetsligander kopplade till en basmatris, vilket medium har genererats med en metod sä som beskrivits ovan. I en speciell utföringsform är den metallkelaterande affinitetsliganden tridentat. Ett sådant separationsmedium kan sedan laddas med en lämplig metalljon, så som Cu(II), Zn(II), Ni(II), Ca(II), Mg(II), Fe(III), Al(III), Ga(III), Sc(III) etc, och användas enligt väl kända principer för IMAC, t.ex. så som skildrats i sektionen ”Bakgrund” ovan. I den mest föredragna utföringsformen används Nihl I en fördelaktig utföringsform är de föreliggande polydentata metallkelaterande affinitetsliganderna tridentata ligander definierade av formeln -S-(CH¿)n-CH(COOH)-N(CH¿COO')2. 526 214 14 I en speciell utföringsform definieras det föreliggande separationsmediet, vilket innefattar polydentata metallkelaterande affinitetsligander kopplade till en basmatris, av den generella formeln basmatris-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH;-CHOH-CH2S-(CH2)n-CH(COOH)~N(CH¿COO' )2Ni2+ vari n är ett heltal av 2-4. I en utföringsform är n = 2. I detta sammanhang är det underförstått att om basmatrisen är t.ex. i form av en partikel, så kommer ett flertal ligander kopplas till varje partikel sä som beskrivits ovan.

En tredje aspekt av uppfinningen är användning av homocystein- tiolakton som ett startmaterial i framställningen av polydentata metallkelaterande ligander. Uppfinningen omfattar ocksà'anvànd- ningen av en karboximetylerad stomme så som homocystein- tiolakton i framställningen av polydentata metallkelaterande ligander. I den mest fördelaktiga utföringsformen är sagda användning så som definierats ovan. Sá som nämnts ovan är homocystein-tiolakton kommersiellt tillgänglig.

En ytterligare aspekt av föreliggande uppfinning är ett kit, vilket innefattar en stomme såsom definierats av den generella formeln (I) ovan, vilket kit innefattar sagda stomme i en fast form tillsammans med instruktioner, företrädesvis skrivna, för användning därav i tillverkningen av metallkelaterande affinitetsligander eller ett separationsmedium innefattande polydentata metallkelaterande affinitetsligander kopplade till en basmatris. I en alternativ utföringsform innefattar ett kit enligt uppfinningen någon annan form av stommen, sä som ett delvis eller fullständigt derivatiserad stomme, tillsammans med vätskor och/eller reagens lämpliga för att utföra metoden enligt uppfinningen. I en speciell utföringsform bestàr ett kit av en stomme reagerad enligt föreliggande metod med undantag av avskyddningen, i vilket fall ifrågavarande kit också innefattar ett lämpligt reagens för avskyddning, såsom en bas eller en syra, tillsammans med instruktioner för användning. 526 214 15 Föreliggande uppfinning innefattar också en kromatografikolonn packad med ett medium enligt uppfinningen. Kolonnen kan vara av vilken storlek som helst, så som för storskalig produktion eller labbskala, eller lämplig för analytiska ändamål. Kolonnen kan också kombineras med separationsmedium och eventuellt vätskor i en andra uppsättning, vilket också omfattas av den föreliggande uppfinningen. I en utföringsform innefattar uppsättningen enligt uppfinningen metalljoner, så som Ni”>joner.

Dessutom avser föreliggande uppfinning också en process för att separera en mälsubstans från en vätska, vilken process innefattar att tillhandahålla ett separationsmedium så som definierats ovan, att ladda sagda medium med lämpliga metall- joner för att bilda kelater och att bringa sagda medium i kontakt med vätskan för att adsorbera mälsubstansen därpå. I en fördelaktig utföringsform innefattar processen också ett steg för att eluera mälsubstansen från separationsmediet genom att tillsätta en vätska som desroberar mälsubstansen från separa- tionsmediet. I en utföringsform erhålles elueringen genom att använda en vätska som innefattar en minskande pH-gradient eller genom att använda en gradient som ger en ökande imidazolkoncent- ration. De generella kromatografiprinciperna för att separera en mälsubstans så som diskuterats ovan är väl kända inom området, och fackmannen inom området kan enkelt ta till sig de parametrar som är nödvändiga för användning av den föreliggande processen.

Slutligen avser föreliggande uppfinning ett förfarande för att generera en eller flera olikartade bibliotek av metall- kelaterande affinitetsligander för screening och optimerings- ändamål. Således kan, i detta förfarande, en arm som bär ett dentat hållas konstant medan andra armar väljs med avseende pà optimal prestanda. Som fackmannen kommer att förstå kan till exempel en eller flera av de ovan diskuterade L1, L2, L3 och L4 varieras för att fastställa den optimala formen, och därefter, när den optimala formen har fastställts, hålls den konstant medan andra varieras. Följaktligen tillhandahåller optimerings- förfarandet ett verktyg för att tillverka ett separationsmedium innefattande optimala, utvalda ligander. 526 214 16 Detaljerad beskrivning av figurerna Figur 1 tillhandahåller en schematisk illustration av den generella vägen att framställa ett separationsmedium som innefattar polydentata metallkelaterande affinitets- kromatografiligander enligt uppfinningen. Det första steget motsvarar steg (b) i den föreliggande metoden, dvs. en derivatisering, det andra steget är en hydrolys för att öppna ringen i den derivatiserade stommen och det sista steget är immobilisering dvs. koppling av den så framställda liganden till en basmatris. Som framgår av det ovanstående är det andra steget lämpligen en kombinerad ringöppning och avskyddning. I figur 1 betecknar R antingen väte eller alternativt en syra- eller baslabil skyddsgrupp.

Figur 2 (a) och (b) illustrerar rening av maltosbindande protein med (His)5-svans (MBP-His) med användning av IMAC-separations- medium enligt uppfinningen. Mer specifikt är figur 2(aï kromatogrammet medan figur 2(b) är en förstoring av gradient- delen av sagda kromatogram. I figur (2) bettecknas kurvan vid A280 nm A, procenthalten (%) av elueringsbuffert betecknas B, och konduktiviteten betecknas C.

Figur 3 visar SDS-PAGE-analyser av fraktioner från IMAC-rening av MBP-His. Fraktionsnumrering som i kromatogrammet i figur 2. Éigur 4 visar ett testkromatogram, vari UV 372 nm = A, konduktivitet = B, injektion = C. Den nickelbindande kapaciteten hos denna prototyp bestämdes till 16 umol Ni/ml och làckaget till 4 %, så som förklaras i exempel 5 nedan.

Figur 5 visar resultaten av nickelkapacitetstestet utfört pà ett separationsmedium enligt uppfinningen så som beskrivs i exempel 5.Mer specifikt visar X-axeln liganddensiteten medan Y-axeln visar nickelbindningen. Det framgår tydligt att den nickel- bindande kapaciteten ökar linjärt med liganddensiteten och att lutningen är nära ett.

EXPERIMENTELL DEL Följande exempel tillhandahàlles endast för illustrativa syften och ska inte tolkas som att de begränsar omfattningen av den föreliggande uppfinningen såsom den definieras av bifogade 526 214 17 patentkrav. Alla referenser givna nedan eller någon annanstans i föreliggande ansökan inkluderas häri härigenom genom referenser.

Experimentbeskrivning IH-NMR-, “C-NMR-, CH-korrelation-, APT- och cosy-spektra registrerades i ö-skala (ppm) med Bruker 300 MHz med användning av TMS som referens. Alla spektra registrerades i CDC13 om inget annat sägs. TLC utfördes med användning av i förväg täckta kiselgels-F34-plattor från Merck. Ninhydrin eller en blandning av Mo/Ce användes för att synliggöra fläckar på TLC-plattor. LC- MS-data registrerades med användning av Hewlett Packard 1100 MSD elektrospray. Reningar med flashkolonnkromatografi utfördes med användning av Merck G-60 kiselgel.

Exempel 1: Karboximetylering av stomme för att frambringa N,N- bis(etylkarboximetylester)+/-homocystein-tiolakton I I en torr 250 ml rundkolv löstes D/L-homocystein-tiolakton (4,5 g; 29,22 mmol) i 100 ml DMF. Till detta sattes bromättiksyra- etylester (9,76 g; 58,44 mmol; 6,48 ml), KI (4,850 g; 29,22 mmol) och NaHCO3 (14,727 g; 175 mmol). Reaktionsblandningen rördes i rumstemperatur. Reaktionen följdes med TLC (toluenzetylacetat 3:1) och LC-MS-data. Reaktionen var fullständig efter 3,5 tim.

Den önskade produkten har ett Rf= 0,35 (toluen etylacetat 3:1).

Lösningsmedlet indunstades, det bildade fasta ämnet löstes pà nytt i CHCI3, extraherades med H¿O x 2. Den organiska fasen torkades slutligen över Na2SO4, filtrerades och indunstades.

Produkten renades med flashkolonnkromatografi (toluen:etylacetat 3:1). Utbyte: 7,636 g (26,422 mmol), 90 %.

IH-NMR : Ö 1,52 (t, 6H, Cgå-CH;-O-), Ö 2,05-2,56 (m, 2H, -S-C§¿- CH;-CH-C=O), 5 3,25 (m, 2H, -S-CH;-Cfig-CH-C=O), Ö 3,52 (s, 4H, -N- cgå-N-cggfl, ö 3,65 (dd, 1H, s-cH,-cH2-cg-c=o), ö 4,24 ( m, 414, cflg-cgå-o-L- “c-NMR: ö 14,71 (gH3-cH,-o-), ö 27,42 (s-gflz-CHZ-cn- C=O), Ö 29,68 (S~§H2-CH2-CH-C=O), Ö 54,01 (CH3-QHZ-O~ ), 5 60,99 ßn-QHZ-N-gnz), ö 67,15 (-s-cH,-cH2-ç_H-c=o), ö 170,94 (o=g-cH,-N- CH;-§=O), Ö 207,20 (-S-CH2-CH;-CH-C=O). LC-MS: M* 290. 526 214 18 Exempel 2: Hydrolys för att frambringa N,N-bis(karboximetyl+/- homocystein och stabilitetstest N,N-bis(etylkarboximetylester)+/-homcystein-tiolakton (50 mg; 0,173 mmol) framställd så som beskrivits i exempel 1 ovan, löstes i 1 ml 1M NaOH.

I en 100 ml rundkolv. Reaktionsblandningen rördes i rums- temperatur i 100 minuter. Reaktionen följdes tills den gått fullständigt tills inget starmaterial syntes enligt LC-MS.

Stabilitetstest: Efter fullständig hydrolys späddes den ovan- stående reaktionsblandningen till 5 ml med H¿O. pH Justerades till 12,5 och reaktionsblandningen värmdes vid 50 °C med omrörning. Ett prov pà 50 ul togs ut fràn blandningen med 1 tim intervaller i fyra timmar. Varje 50 ul-prov blandades sedan med 1 ml MeOH för LC-MS-analysen. Efter detta steg fick reaktionsblandningen stà över natt och slutligen togs ett 50 pl- prov ut för LC-MS-analys så som beskrivits ovan. Inget sönder- fall observerades under tiden för experimentet. ' Ràprodukten frystorkades. ln-NMR (D,o)= 6 1,52 (m, 2H, -cH-CHZ-cgysn), ö 2,24 (m, 2H, -cH- cgš-CHZ-sn), 6 3,20 (m, SH, oæ-cë-N-cg-n “c-NMR (1320): ö 22,34 (-CH-CH2-QHZ-SH), ö 35,39 (-CH-QH2-CH2-SH), ö 57,33 (O=C-§H2-N-§H2- ), 5 67,30 (-QH-CH;-CH;-SH), Ö 180,55 (O=§-CH;-N-CH;-g=O), Ö 181,84 (-N-CH-§=O); LC-MS: M* 252.

Exempel 3: Koppling av produkten erhàllen i exempel 2 till allylerad agaros med användning av AGE 10 ml Sepharosem HP-allyl (Amersham Bioscences, Uppsala Sverige) (44 umol/ml gel) rördes i 20 ml destillerat vatten med 1 g NaOAc. Br; aq mättad tillsattes tills en bestående gul färg bildats. Natriumformat tillsattes sedan tills den gula färgen försvunnit. Gelen tvättades sedan med destillerat vatten. N,N- bis(etyl-karboximetylester)+/-homocystein tiolakton (102 mg) rördes i 2 ml lM NaOH i rumstemperatur i 2 timmar. 5 ml Destillerat vatten och 3 ml 1M NaHCO3 tillsattes, och pH justerades till 11,0 med 2M NaOH.

Ligandlösningen sattes sedan till den avrunna gelen i en vial, vilken förslöts. 526 214 19 Vialen skakades vid 50 °C i 16 tim, sedan tvättades gelen med destillerat vatten på en glasfiltertratt.

Exempel 4: Rening av maltosbindande protein med (His)6-svans (MBP-His) med användning av ett IMAC-separationsmedium skapat enligt uppfinningen och metalläckage test Material och metoder: Extrakt med MBP-His C-terminalt hexaHis-svansat maltosbindande protein, MBP-His, Teoretiska Mr och pI var 43 781 och 5,4: Fermentering av en E. coli~klon som uttrycker MBP-His och cellhomogenisering utfördes enligt ett standardförfarande.

Koncentrationen av MBP-His i detta extrakt uppskattades till ungefär 1,9 mg/ml.

IMAC A-buffert För en liter: (en PBS-tablett till 1000 ml vatten ger enligt specifikation 10 mM Na-fosfat, 140 mM NaCl och 3 mM KCl, pH 7,4.) Tvà PBS-tabletter löstes i vatten, NaCl tillsattes från 5 M stamlösning vilket gav 720 mM extra (slutligen således 140 + 140 + 720 mM = 1 M), pH justerades till!7,4 med NaOH och slutlig volym till 1000 ml. (Buffert innehöll också 6 mM KCl).

Elueringsbuffert (IMAC B-buffert): Framställd pà samma sätt som IMAC A-bufferten, men även imidazol tillsattes till 500 mM (fràn 2,0 M stamlösning av imidazol-HCl, pH 7,4) före slutlig justering av pH och volym.

Aüz*-sulfatlösning: 100 mM i vatten. Filter 0,2 um. pH ~4,6.

Provbuffert och betingelser för körning enligt instruktioner för ExcelGel““(Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige).

Geler: ExcelGelTM SDS, gradient 8-18 %.

Provberedning: Prover blandades 1+1 med 2x provbuffert (för reningar med stora mängder màlprotein) eller 1 volym prov + 1/3 volym 4x provbuffert (reningar med smá mängder màlprotein). (4x Provbuffert = 526 214 20 100 mM Tris-HAC pH 7,5; 2 % SDS.) Värmning vid 95 °C i 3-5 minuter.

Provapplicering: IEF provappliceringsbitar (5xl0 mm filterpappersbitar, #80-1129-46 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) användes. Upp till 30-32 pappersbitar placerades med sina kortsidor mot körriktningen. 20 pl provcocktail applicerades på varje bit. Bitarna lämnades pà gelen under hela elektroforesen.

Elektrofores: I en MultifoImM II (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) apparat vid 15 °C (cirkulerande kylbad). EPS 3500 strömförsörjning. Begrànsande inställningar: eoo v, so mA, 30 w. I Färgning: I 0,1 % Coomassie R350 löst i 30 % MeOH, 10 % HAC. Avfärgning i 25 % EtOH, 8 % HAC.

Kromatografi: Mediet packades i HR 5/5 kolonner (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) till en bäddhöjd pà 5 cm = 1,0 ml bädd. Mediet laddades med Ni” innan användning genom att pumpa Ni-sulfatlösning på kolonnen (5 kolonnvolymer), följt av vatten och av jämviktning med bindningsbuffert (= IMAC A~buffert) med S mM imidazol tillsatt) En kort blankkörning utfördes genom att applicera elueringsbuffert, igen följt av jåmviktning med bindningsbuffert.

E. coli-extraktet med MBP-His, 1,0 M NaCl, 5 mM imidazol och 1 mM PMSF (tillsatt färsk) klarnades genom centrifugering och genom 0,45 um filtrering. Den erforderliga volymen introducerades sedan till en Superloop““(Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) genom ett 0,2 um filter kort innan start av IMAC. 3 ml Applicerades sedan på kolonnen. Efter omfattande _tvätt med bindningsbuffert, kördes en 20 ml linjär gradient (40 % elueringsbuffert = 200 mM imidazol) med användning av ett ÃKTÅN Explorer 10-system (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) Slutligen applicerades en 5 ml-knuff med 100 % elueringsbuffert (500 mM imidazol) Alla steg var med 1,0 ml/min. 526 214 21 Exempel 5: Bestämning av nickelbindande kapacitet och metalläckage vid pH 4,0 Nickelbindande kapacitet Den nickelbindande (Nim) kapaciteten hos ett separationsmedium enligt uppfinningen bestämdes kromatografiskt med användning av en ÃKEÄW Explorer 10-system (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) försedd med en UV/Vis DAD-detektor. Testet utfördes på en gel till vilken N,N-bis(karboximetyl)+/-homocystein hade kopplats enligt tidigare beskrivning, och packad i 1 ml HR 5/5 kolonner (figur 4). Detta resultat jämfördes med ligand- densiteten närvarande pá gelen enligt bestämning med elementar- analys (kväveanalys, varje ligand innehåller en kvâveatom).

Korrelationen mellan nickelbindande kapacitet och liganddensitet ansågs vara mycket god, dvs. en ligand bär en metalljon.

Karaktäristiska resultat visas i figur 5.' I Metodbeskrivning En NiSO4-lösning injicerades för att ladda gelen med Ni”>joner.

Metallöverskott avlägsnades genom tvätt med vatten och fosfat- buffert (20 mM P04, 500 mM NaCl, pH 7,4). Nickeljonerna bundna till gelen eluerades med EDTA, vilket är en mycket stark kelator och effektivt skalar bort metalljonerna från gelen. Topparean för det eluerade grönfärgade Ni-EDTA-komplexet mättes vid 372 nm. En linjär kalibreringskurva fastställdes fràn lösningar med olika koncentrationer av Ni-EDTA och användes för kvatifiering.

Den nickelbindande kapaciteten (figur 4, topp 1) gavs som umol Ni/ml packad gel.

Metalläckage Ett metalläckagetest utfördes för att fastställa stabiliteten hos ligand-nickel-komplexet. Den nickelladdade gelen tvättades med acetatbuffert, pH 4,0 innan bestämning av Ni-innehållet på gelen (figur 4).

Metalläckaget ansågs vara mycket lågt för alla testade geler framställda enligt den föreliggande uppfinningen; läckaget var typiskt 4 %. 526 214 22 Metodbeskrivning Läckage av nickeljoner testades analogt med den nickelbindande kapaciteten. Emellertid tvättades gelen med tio kolonnvolymer av acetatbuffert, 100 mM, pH 4,0 före eluering av nickeljoner med EDTA. Làckaget gavs som % av bindningskapaciteten och bestämdes som skillnaden mellan den nickelbindande kapaciteten och mängden eluerad efter tvätt med pH 4(figur 4, topp 2) enligt formeln (areatopp z-areatopp 1) /areatopp 1 .

Claims (6)

5226 2'l4 23 PATENTKRAV

1. En metod för att generera åtminstone en metallkelaterande affinitetsligand, vilken ligand är ett polydentat, vilken metod innefattar stegen att man (a) åstadkommer åtminstone en stomme definierad av den generella formeln (I) 3 \ X1 vari X1, X2 och X3 oberoende av varandra är spz- eller sp3- hybridiserade kolatomer eller heteroatomer, x, är ën nukieofn Qch m är ett heltal av O-2; (b) åstadkommer åtminstone en arm innefattande en metallkelaterande affinitetsligand, vilken ligand är ett polydentat, eventuellt i en form vari de metall-kelaterande funktionaliteterna är skyddade, på varje stomme genom att derivatisera de nukleofila X4-grupperna på sagda stomme, medan stommens cykliska struktur bibehålls; (c) öppnar ringen vid bindningen mellan karbonylen och svavlet pà den derivatiserade stommen genom att tillsätta ett reagens som adderar en eller flera metallkelaterande affinitetsligandarmar till stommen; och, om så erfordras, (d) avskyddar ligandarmens, eller ligandarmarnas, funktionaliteter som àstadkoms i steg (b).

2. En metod enligt patentkrav 1, vari X1, X2 och X3 i formel (I), är kolatomer.

3. En metod enligt något av de föregående patentkraven, vari X4i formel (I) är -NH2.

4. En metod enligt något av de föregående patentkraven, vari, i formel (I), m är I och stommen är homocystein-tiolakton.

5. En metod enligt något av de föregående patentkraven, vari man åstadkommer derivatiseringen i steg (b) genom att tillsätta åtminstone ett derivatiserande ämne bestående av 10. ll. 12. 13. 14. 15. 1

6. 526 214 24 en del, som är elektrofil och därmed kapabel att reagera (I), metallkelaterande affinitetsligand. med X4 i formel och en del, som är en En metod enligt patentkrav 5, vari man åstadkommer derivatiseringen genom att addera två derivatiserande ämnen, vilka innefattar två olika eller identiska metallkelaterande funktioner. En metod enligt patentkrav 5 eller 6, vari ett derivatiserande ämne är en halogenerad, skyddad ester. En metod enligt patentkrav 7, vari ett derivatiserande ämne är bromättiksyra-etylester. En metod enligt något av de föregående patentkraven, vari ringöppningen i steg (c) är hydrolys som åstadkommes genom tillsats av en bas. En metod enligt något av de föregående patentkraven, vari de metallkelaterande funktionaliteterna är skyddadefi steg (b), och steg (c) och steg (d) sedan utförs samtidigt. En metod enligt något av de föregående patentkraven, vari steg (a) och (b) har utförts tidigare för att åstadkomma en stomme som lätt kan derivatiseras. En metod enligt något av de föregående patentkraven, vari produkten erhållen i steg (d) kopplas via sin tiolgrupp till en basmatris för att framställa ett separationsmedium. En metod enligt patentkrav 12, vari tiolgruppen kopplas till allylgrupper på basmatrisen. En metod enligt patentkrav 12 eller 13, vilken också inkluderar ett steg av allylering av basmatrisen för att frambringa reaktiva grupper. En metod enligt något av patentkrav 12-14, vari ligandens tiolgrupp kopplas till basmatrisen via allylgruppen på allylglycidyl-eter (AGE). En metod enligt något av patentkrav 12-15, vilken också innefattar ett steg där man aktiverar basmatrisens reaktiva grupper genom bromering.