CN104487447B - 用于降低蛋白制剂领域中的聚集物含量的混合的多官能性金属亲和表面 - Google Patents

用于降低蛋白制剂领域中的聚集物含量的混合的多官能性金属亲和表面 Download PDF

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Abstract

用于降低蛋白制剂的聚集物含量的组合物，包括含有第一表面结合配体的第一基底，所述第一表面结合配体具有金属亲和官能性，所述第一基底还包括第二表面结合配体或第二表面结合配体任选地提供于第二基底上，所述第二表面结合配体具有与所述第一基底的金属亲和官能性电荷相反的聚集物电荷，其中所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体的位置使得所述蛋白制剂可同时接触所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体。

Description

用于降低蛋白制剂领域中的聚集物含量的混合的多官能性金 属亲和表面
本发明涉及用于纯化蛋白，特别是抗体的材料。其具体涉及用于降低聚集物，且特别是包含宿主细胞染色质残留物如核小体、组蛋白和DNA的聚集物的含量的材料。
发明背景
已证明宿主细胞来源的污染物与通过体外细胞培养方法产生的重组蛋白间自发形成非天然的异源聚集物(Shukla et al.,Biotechnol.Progr.(2008)24:1115-1121；Luhrs et al.,J.Chromatogr.B(2009)877:1543-1552；Mechetner et al.,J.Chromatogr.B(2011)879:2583-2594；Gagnon et al.,J.Chromatogr.A,(2011)1218:2405-2412；Gagnon,Bioprocessing J.(2010)9(4):14-24)。这些异源聚集物在两个方面可被认为是非天然的：1)组成性污染物常常为非人来源的，由活的非人宿主细胞分泌，或在非人的宿主细胞死亡裂解后释放至培养基中。在活的人体中，不存在此类非人的污染物；以及2)相比人体内***(其中死细胞组分被快速清除)，组成性污染物积累至较高浓度。因此，组成性产物以在生命***中通常不会出现的浓度暴露于高水平的强相互作用的污染物。同时，高表达水平的重组蛋白使得其成为适于与这些非人的污染物非特异性结合的底物，从而促进不同组分的非期望异源聚集物的形成。
异源聚集物的污染蛋白含量在某种程度上通过直接靶向污染蛋白(Shukla etal.和Gagnon et al.,同上)和间接通过靶向针对污染蛋白的对应的DNA组分(Luhrs etal.和Gagnon,同上)进行处理。已证明在一些复合物解离时出现了抗体聚集物水平的降低(Shukla et al.,Mechetner et al.和Gagnon,同上)。已公开了阴离子交换剂降低抗体-污染物复合物水平的能力(Luhrs et al.和Gagnon et al.,同上)，但还未证明存在能够完全清除异源聚集物的阴离子交换处理。尺寸排阻、阳离子交换和疏水相互作用层析法也被用于尝试降低异源聚集物，但这些技术通常不如阴离子交换(Gagnon et al.,同上)。
与抗体形成稳定结合物的污染物的具体来源并非总是已知的(参见，例如Shuklaet al.同上)。一些努力聚焦于DNA污染物，而很少注意到其他可能的污染物的具体来源(Gagnon et al.和Gagnon,同上)。一些证明宿主污染物与抗体制备中的聚集物关联性的努力特别地聚焦于包含核染色质降解产物的污染物(Luhrs et al.和Mechetner et al.同上)。在这些实例中，聚合可直接通过抗体对核染色质代谢产物如组蛋白和DNA的免疫特异性介导。还证明核染色质代谢产物能够通过非特异性相互作用与抗体形成稳定复合物。因此，对不包含核染色质代谢产物的抗原具有已知免疫特异性的单克隆抗体，可与来源于死的宿主细胞的细胞核的核小体、组蛋白和DNA形成具有不同类型的高度稳定的聚集物。特别地，已证明核染色质代谢产物在高分子量(HMW)聚集物中有高度代表性。HMW聚集物特别值得关注，因为其疑似参与促进治疗中和性抗体的形成。HMW聚集物通常被定义为大小比目标抗体的较小倍数更大的聚集物。例如，2-抗体结合物不被认为是HMW聚集物，大多数4-抗体聚集物也不是。然而，大小大得多的聚集物如对应于约8至约10或更多的抗体的聚集物通常可被归类为HMW聚集物。
用预期可能解离异源聚集物的试剂处理抗体制剂证明通常是无效的。例如，采用高浓度的尿素、盐或二者的组合不会大幅解离IgM-污染物异源聚集物(Gagnon et al.同上)。以尿素、乙醇和表面活性剂在洗脱前洗涤的蛋白A亲和层析被证明相比无洗涤能够更有效地降低异源聚集物水平(Shukla et al.同上)，其与将尿素、盐和EDTA与蛋白G亲和层析结合的洗脱前洗涤一样(Mechetner et al.同上)。以尿素在洗脱前洗涤的阴离子交换层析被证明相比无尿素洗涤能够更有效地降低异源聚集物(Gagnon et al.同上)。具有洗脱前的EDTA洗涤的阳离子交换层析也被证明相比无洗涤能够更有效地降低异源聚集物(Gagnon et al.同上)。最后，具有尿素和/或盐的洗脱前洗涤的羟磷灰石相比无此类洗涤也能够更有效地降低异源聚集物(Gagnon同上)。尽管存在这些观察结果，一般而言，将解离剂用于与层析柱结合的抗体的洗脱前洗涤仅存在适度的成功。
发明概述
在某些实施方案中，本发明提供了用于纯化蛋白的物质组合物和装置，包括降低抗体制剂中的聚集物浓度。在某些实施方案中，所述组合物特别地降低包含染色质残留物如核小体和/或组蛋白和/或DNA的聚集物的含量。在某些实施方案中，提供了用于降低蛋白制剂的聚集物含量的物质组合物，其中所述组合物包括具有金属亲和官能性的第一表面结合配体，和具有与所述第一表面的金属亲和官能性电荷相反的聚集物电荷的第二表面结合配体，并且其中所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体的位置使得蛋白制剂可同时接触所述第一表面结合配体和第二表面结合配体。
附图说明
图1显示了在纯化接受了尿囊素-依沙吖啶批次颗粒处理的IgM-529中以所示的间隔采集的图谱的尺寸交换色谱(SEC)的时间进程图。Aggr:聚集物。HCP:宿主细胞蛋白。实线:280nm。虚线:254nm。所有时间标度与中间图的相同。
图2A显示了滤除了IgM-84的细胞培养物上清液(CCS)的SEC图谱。Aggr:聚集物。HMW:高分子量聚集物。HCP:宿主细胞蛋白。LMW:低分子量细胞培养基组分。实线:280nm。虚线:254nm。
图2B显示了尿囊素-依沙吖啶和过柱处理之后图2A的滤除了IgM-84的CCS的SEC图谱。Aggr:聚集物。HCP:宿主细胞蛋白。实线:280nm。虚线:254nm。
图3显示了以尿囊素-依沙吖啶处理和过柱处理之前(左图)和之后(右图)的单克隆IgG HER2CCS的SEC图谱。Aggr:聚集物。HCP:宿主细胞蛋白。LMW:低分子量细胞培养基组分。LC:轻链。实线:280nm。虚线:254nm。
发明详述
令人惊奇地，发现在本发明的某些实施方案中，包含带负电荷的表面结合金属亲和配体(第一表面结合配体)与带正电荷的表面结合性配体(第二表面结合配体)的组合，或者包含带正电荷的表面结合金属亲和配体(第一表面结合配体)与带负电荷的表面结合性配体(第二表面结合配体)的组合，的物质组合物具有大幅降低蛋白制剂中的高分子量(HMW)聚集物和较小尺寸的聚集物含量的能力。在某些实施方案中，所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体可存在于相同的表面上。在某些实施方案中，所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体可存在于不同的表面上。在某些实施方案中，所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体可存在于相同的表面和/或不同的表面。本发明的某些实施方案具有去除诸如可能被添加至蛋白制剂的多价离子和抗病毒化合物的试剂的另外的能力。
在某些实施方案中，本发明提供了包含两种或更多种表面官能性的混合物的装置，用于降低蛋白制剂中的聚集物水平，其中所述表面中的至少一个具有金属亲和官能性，能够与金属离子形成稳定的配位键，并且另一个表面具有与所述金属亲和官能性相反的净电荷。在优选的实施方案中，本发明可提供组合物，其具有的一个表面具有负电性的金属亲和官能性，而另一个表面包含正电性的金属亲和官能性。每个表面可包含或组合有其他的化学官能性，潜在地包括但不限于，疏水性的、π-π结合、氢键结合和金属亲和力。固相表面结构可为颗粒的、纤维的、多孔膜状或整块材料，包含多种结构类型的组合。所述装置可以这样的方式配置，其使得所施用的样品与带负电荷的和带正电荷的表面的接触是同时的。
在某些实施方案中，本发明提供了用于纯化蛋白，包括降低抗体制剂中的聚集物浓度的物质组合物和装置。在某些实施方案中，提供了用于降低蛋白制剂的聚集物含量的组合物，其中所述组合物包括具有金属亲和官能性的第一表面结合配体，和具有与所述第一表面的金属亲和官能性电荷相反的聚集物电荷的第二表面结合配体，并且其中所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体的位置使得蛋白制剂中的蛋白可同时接触所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体。
在某些实施方案中，所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体各自与基底共价结合。所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体可各自与相同的基底共价结合。在其他实施方案中，所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体各自与不同的基底共价结合。所述基底可为颗粒，并且在某些实施方案中，所述颗粒可为多孔的或无孔的。在某些实施方案中，所述基底为多孔的颗粒，其具有的孔足够大，从而允许蛋白制剂中的蛋白进入。在其他实施方案中，所述孔太小，从而不能允许蛋白制剂中的蛋白进入。在某些实施方案中，所述基底为多孔的颗粒，其具有的平均孔径为约10nm至约100nm、小于约10nm或大于约100nm。在某些实施方案中，所述基底为膜、整块材料，或者固相的或多孔的有壁纤维。在某些实施方案中，与所述第一化学部分结合的基底类型不同于与所述第二部分结合的基底。例如，一个基底可为颗粒，而另一个基底可为整块材料、膜或纤维。
在某些实施方案中，所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体不同。在某些实施方案中，所述第一表面结合配体为多配位基金属螯合部分。在某些实施方案中，所述第一表面结合配体具有负电性的聚集物电荷。在其他实施方案中，所述第一表面结合配体具有正电性的聚集物电荷。在某些实施方案中，所述第二表面结合配体具有金属亲和官能性。在某些这类实施方案中，所述第二表面结合配体为多配位基金属螯合部分。
在某些实施方案中，所述第一表面结合配体为正电性的，并且该表面具有与其结合的其他的化学部分，条件是该表面的聚集物电荷为正电性的。在其他实施方案中，所述第一表面结合配体为负电性的，并且该表面具有与其结合的其他的化学部分，条件是该表面的聚集物电荷为负电性的。在某些实施方案中，所述基底中的至少一个具有除所述第一表面结合配体或所述第二表面结合配体之外的一个或多个化学部分，其中此类其他的化学部分提高所述组合物参与与所述蛋白制剂中的蛋白的氢键结合、疏水相互作用或π-π结合的能力。
在某些实施方案中，所述第一表面结合配体为负电性的，并且为亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)、乙二醇(氨基乙基醚)二乙酸、次氮基乙酸(2,2',2″-次氮基三乙酸)、天冬氨酸或谷氨酸。在某些实施方案中，所述第一表面结合配体为正电性的，并且为三(2-氨基乙基)胺或去铁胺。在某些这类实施方案中，所述第二表面结合配体为三(2-氨基乙基)胺。在某些实施方案中，所述第一表面结合配体为亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)，并且所述第二表面结合配体为三(2-氨基乙基)胺。
在某些实施方案中，前述实施方案中描述的结合表面的化学部分可任选地在物理表面的合成期间被直接掺入一种或多种聚合物的结构中。
在某些实施方案中，本发明提供了经配置用于色谱分析的装置，其包含本发明的组合物。在某些实施方案中，所述装置为与所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体结合的一个或多个基底一起包装的色谱柱。在某些实施方案中，所述装置含有一个或多个多孔膜，并且此类膜中的至少一个为与所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体结合的基底。在某些实施方案中，所述装置含有多孔网状纤维布置，其中此类纤维为中空的壁上多孔的纤维或无孔纤维，并且此类纤维为与所述第一表面结合配体和第二表面结合配体结合的基底。
在某些实施方案中，所述装置含有夹在多孔膜或整块材料之间的多孔或无孔的颗粒。在某些这类实施方案中，颗粒为与所述第一表面结合配体或所述第二表面结合配体结合的基底，并且所述膜或整块材料为与所述第一表面结合配体与所述第二表面结合配体中的另一者结合的表面。在某些实施方案中，所述装置含有夹在织物或无定形纤维过滤器之间的多孔或无孔的颗粒。在某些这类实施方案中，所述颗粒为与所述第一表面结合配体或所述第二表面结合配体结合的基底，并且所述纤维过滤器为与所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体中的另一者结合的表面。在某些实施方案中，所述装置含有夹在晶状熔块之间的多孔的或无孔的颗粒。在某些这类实施方案中，所述颗粒为与所述第一表面结合配体或所述第二表面结合配体结合的基底，并且所述晶状熔块为与所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体中的另一者结合的表面。在某些实施方案中，所述装置含有包埋于网状聚合物网络中的多孔的或无孔的颗粒。在某些这类实施方案中，颗粒为与所述第一表面结合配体或所述第二表面结合配体结合的基底，并且所述网状聚合物网络为与所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体中的另一者结合的表面。在某些实施方案中，所述装置提供了这样的结构，其中与所述第一表面结合配体结合的基底和与所述第二表面结合配体结合的基底二者均为颗粒，并且所述颗粒被配置为位于膜、整块材料、网状聚合物网络、织物或无定形纤维过滤器、晶状熔块或其组合之间。
在某些实施方案中，所述装置的一个或多个组件的化学表面可为相对惰性的，或者具有相对小的表面积，使得对所述装置的化学官能性无显著影响。在某些这类实施方案中，所述相对惰性的或具有相对小的表面积的化学表面经配置使得能够产生结构完整性，或使得液体能够从中直接流过，或使得能够物理封闭、捕获或携带蛋白制剂中的不可溶物质，以防止其干扰所述装置的有效应用。
在一些实施方案中，第一表面与第二表面的比率范围可为约1:99至约99:1。本领域技术人员将理解几乎任何比率可适合于特定应用。在实施中，在一些实施方案中，可通过采用所述第一和第二组件的合理的1:1比率以及通过从该起点改变比率来***优化比率，开始优化第一表面与第二表面的比率。
定义了术语以便可以更容易地理解本发明。其他的定义在整个详细描述中有陈述。
“聚集物”是指生理条件下稳定且可在较广的pH范围和导电性条件下保持稳定的两个或更多个分子的结合物。聚集物通常包含至少一个生物分子如蛋白、核酸或脂质，以及另一个分子或金属离子。该结合作用可通过任何类型的化学相互作用或其任意组合发生。抗体的聚集物可分为两类：“均聚聚集物”是指两个或更多个抗体分子的稳定结合物；“异源聚集物”是指一个或多个抗体分子与一个或多个非抗体分子的稳定结合物。所述非抗体组分可由来自如下的一种或多种实体组成：核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白、脂质或细胞培养基组分。
“抗体”是指免疫球蛋白、其复合形式或片段形式。该术语可包括但不限于来源于人或其他哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类型的多克隆或单克隆抗体，包括天然的或遗传改良的形式如人源化的、人的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、移植的和体外产生的抗体。“抗体”还可包括复合形式，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”还可包括抗体片段，如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其他组分，不论其是否保留抗原结合功能。
“内毒素”是指存在于革兰氏阴性菌外膜中的、裂解后从细胞释放的有毒的、热稳定的脂多糖物质。由于内毒素的高含量的磷酸盐和羧基残基，其通常可为酸性的，并且由于脂质-A区域的脂肪酸含量，其可为高度疏水性的。内毒素可提供大量的氢键结合机会。
“基底”或“固相物质”是指不可溶的有机或无机固体，其性质可为颗粒、晶状、聚合物、纤维、多孔的中空纤维、整块材料或膜状的。其可由无孔或多孔的颗粒、多孔的膜、多孔的过滤器或多孔的整块材料组成。如果为颗粒，所述颗粒可为大致球形的或非球形的，并且尺寸范围可为小于100nm至大于100微米。多孔颗粒的平均孔径范围可为小于10nm(微孔的)至大于100nm(大孔的)。膜的平均孔径范围可为小于100nm至大于1微米。膜或整块材料的平均通道尺寸范围可为小于1微米至大于10微米。固体材料还可由化合物结构组成，例如，其中颗粒被包埋在网状基质中、被夹在膜之间，或二者均有。
“金属亲和官能性”是指可固定于表面上的化学部分优选以1:1形式结合金属离子的能力。此类部分可具有与金属离子形成配位键的能力，并且某些这类部分可为二配位基或多配位基特征。具有该能力的带负电部分的非限制性实例包括亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)、二乙胺三胺五乙酸和次氮基乙酸(2,2',2″-次氮基三乙酸)。具有该能力的带正电荷的化合物的实例包括但不限于三(2-氨基乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺和去铁胺。
“带正电荷的表面”是指主要带正电荷的基底或固相物质表面。表面的正电性可由如下的化学基团赋予，包括但不限于弱阴离子交换基团，如氨基、乙二胺、二乙基氨基乙基、聚丙烯胺、聚亚乙基亚胺；强阴离子交换基团，如季铵基；组合的弱-强交换剂，如聚赖氨酸、聚精氨酸或三(2-氨基乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树状物(乙二胺核)或上述分子的任意组合。在带正电荷的表面上产生混合的化学特性的第二官能性可由带负电荷的或带正电荷的基团、疏水基团、π-π结合基团、氢键结合基团或金属螯合基团组成。第二官能性可存在于带正电荷的表面上作为合成颗粒的生产材料或工艺的偶然的副产物，或者其可通过有意的设计存在。第二官能性的浓度范围可为小于每毫升颗粒1毫当量至每毫升大于100毫当量。
“带负电荷的表面”是指主要带负电荷的基底或固相物质表面。表面的负电性可由如下的化学基团赋予：包括但不限于所谓的弱阳离子交换剂，如羧基、氨基羧基(亚胺二乙酸或次氮基乙酸)或磷酰基；或者强交换剂，如磺基(例如磺基、磺甲基、磺乙基、磺丙基)。在带负电荷的表面上产生混合的化学特性的第二官能性可由带负电荷的或带正电荷的基团、疏水基团、π-π结合基团、氢键结合基团或金属螯合基团组成。第二官能性可存在于带负电荷的表面上作为合成颗粒的生产工艺的偶然的副产物，或者其可通过有意的设计存在。第二官能性的浓度范围可为小于每毫升颗粒1毫当量至大于每毫升100毫当量。
“多核苷酸”是指由链中共价结合的多个核苷酸单体组成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。多核苷酸可具有形成氢键的高倾向性。
“蛋白”是指任何含有碳、氢、氧、氮和通常地硫的复杂的有机大分子组群，并且主要由一个或多个通过肽键连接的氨基酸链组成。蛋白可为天然或重组来源的。可以用非氨基酸部分改性蛋白，如通过糖基化、聚乙二醇化或与其他化学部分缀合。蛋白的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽类激素。
“蛋白制剂”是指任何含有目标蛋白的水性或主要为水性的溶液，如含有细胞的细胞培养收获物、(基本上)无细胞的细胞培养物上清液或含有来自纯化阶段的目标蛋白的溶液。
“病毒”或“病毒颗粒”是指仅在活的宿主(主要是细菌、植物和动物)细胞中复制的超显微的(直径大致为20-300nm)、代谢惰性的感染剂：其由RNA或DNA核、蛋白衣壳以及在更复杂类型中，环绕的包衣组成。
在某些实施方案中，用于实施本发明的固体材料可包括天然或合成来源的不可溶的颗粒，诸如但不限于通常用于进行色谱分析的多孔微颗粒。此类颗粒可采用大孔来允许诸如但不限于抗体的蛋白扩散进入；或者其可采用小孔来允许诸如盐、糖和解离异质聚集物的试剂的小化学物质扩散进入，但这些小孔太小，从而不能允许诸如抗体的蛋白进入。固体材料可可选地包含无孔的颗粒、膜或整块材料、纤维(包括壁上多孔的中空纤维)、多孔的膜，和/或采用上述元件的组合的化合物结构。
带正电荷的基团可包括所谓的强阴离子交换基团和/或所谓的弱阴离子交换基团。术语强阴离子交换剂包括官能团如季铵，其包含大于pH 12的pK。术语弱阴离子交换剂被理解为是指诸如二乙基氨基乙基和乙二胺的官能团，其包含小于12的pK。具有弱的或混合的强-弱阴离子交换能力的带正电荷的基团可能是优选的，因为其能够参与与溶解的金属离子的配位相互作用，产生所需的从所施加的生物样品清除污染性金属离子的结果。此类具有金属配位能力的混合的弱-强阴离子交换基团的非限制性实例为三(2-氨基乙基)胺(TREN)。
带负电荷的基团可包括所谓的强阳离子交换基团或所谓的弱阳离子交换基团。术语强阳离子交换剂被理解为包括硫酸盐或磺基，其含有pK小于3的部分。术语弱阳离子交换剂被理解为包括含有pK大于3的羧基和/或磷酸基的部分。主要带负电荷的具有两级性特性(在中性pH下)的基团，如两个羧基与氨基的组合，可能是优选的，因为其能够强烈地参与与溶解的金属离子的配位相互作用，产生所需的从所施加的生物样品清除污染性金属离子的结果。此类基团的非限制性实例包括亚氨基二乙酸(IDA)和次氮基乙酸(NTA)基团。
带正电荷的或带负电荷的材料的表面也可包含具有脂肪族和/或芳香族特性的疏水基团，其中后者可能是优选的，因为其能够参与所谓的π-π结合。混合的化学特性可存在于单类表面上或不同表面上的单个的复合化学基团、具有不同特性的单独的化学基团，或上述的任意组合。可同时采用一个或多个带负电荷的金属亲和基团和/或一个或多个带正电荷的金属亲和基团，并且它们可就其呈现的形式存在差异。具有不同个体特征的化学官能性可以针对具体样品组分的需求定制的不同比率使用。例如，期望用于处理澄清的细胞培养物上清液的组合可包含过量的带正电荷的表面，而期望用于处理已用带正电荷的解离异质聚集物的试剂如依沙吖啶或聚亚乙基亚胺处理过的上清液的组合可包含过量的带负电荷的表面。
在某些实施方案中，本发明可提供与带正电荷的颗粒组合的、具有带负电荷的金属亲和官能性的颗粒，所述带正电荷的颗粒可混合在一起，并且可进一步与中性物质混合和/或通过中性物质包裹、包埋于中性物质中，或者通过自身为负电荷性和/或正电性的物质包裹或包埋于自身为负电荷性和/或正电性的物质中。
在某些实施方案中，本发明可提供与带负电荷的颗粒组合的、具有带正电荷的金属亲和官能性的颗粒，所述带负电荷的颗粒可混合在一起，并且可进一步与中性物质混合和/或通过中性物质包裹、包埋于中性物质中，或者通过自身为负电荷性和/或正电性的物质包裹或包埋于自身为负电荷性和/或正电性的物质中。
在某些实施方案中，本发明可提供与具有带正电荷的金属亲和官能性的颗粒组合的、具有带负电荷的金属亲和官能性的颗粒，所述具有带正电荷的金属亲和官能性的颗粒可混合在一起，并且可进一步与中性物质混合和/或通过中性物质包裹、包埋于中性物质中，或者通过自身为负电荷性和/或正电性的物质包裹或包埋于自身为负电荷性和/或正电性的物质中。
在某些实施方案中，本发明可提供带负电荷的和/或带正电荷的表面，其可包含其他的化学官能性，包括但不限于参与疏水相互作用、π-π结合、氢键结合和金属亲和力的能力。在某些实施方案中，本发明可提供一种或多种类型的带负电荷的颗粒，以及一种或多种类型的带正电荷的颗粒，其混合在一起并且通过中性物质包裹。
在某些实施方案中，所述颗粒可具有不同的尺寸和/或不同的孔隙率。在某些实施方案中，本发明可提供颗粒，其可与具有其他物理形式的带负电荷的和/或带正电荷的物质(包括但不限于膜、纤维和整块材料)混合和/或包裹于其间。
在某些实施方案中，可挑选一个或多个基底上的不同比例的带负电荷的和带正电荷的官能性，以适应不同组合物的蛋白制剂的需求。
对本领域技术人员显而易见的是，在某些实施方案中，除了可用于降低蛋白制剂中均聚聚集物和异质聚集物的含量外，本发明还可用于从蛋白制剂大幅降低宿主细胞蛋白、多核苷酸、内毒素和病毒的含量。在主要的官能性伴随有例如其他的官能性如疏水性和氢键键合的情况下，本发明还可降低限制下游纯化方法重复实现其目标的能力的细胞培养基成分和添加剂的含量。对本领域技术人员显而易见的还有，尽管本发明的某些实施方案在应用于相对粗制的进料流时可具有有效价值，但是在某些实施方案中，在使用基本上纯化的样品时，其可提供重要价值。
在某些实施方案中，本发明可提供组合物或装置，使得可在使用后对固体物质进行清洁和再循环。在其他实施方案中，其可被配置为用于一次性使用。
本发明的其他目标和优势部分地将在随后的描述中陈述，并且部分地将从所述描述变得显而易见，或者可以通过实施本发明学得。本发明的目标和优势将凭借权利要求中明确的元素和组合实现和获得。
应当理解，如同所声明的，上述的一般描述和下文的详细描述均仅为示例性和说明性的，并且不限制本发明。
实施例
实施例1
从0.5mL的带负电荷的螯合性多孔颗粒(Chelex-100)和0.5mL带正电荷的多孔颗粒(Macroprep High-Q)制备了原型颗粒混合物，将其混合并夹在玻璃构件中的纤维素过滤器之间。在接近生理条件：pH 7.0,10mS/cm下，使IgG单克隆抗体(Her2)的纯化样品通过颗粒，其没有损失。使用未纯化的抗体的实验在25mS/cm、20mS/cm和30mS/cm下进行。在所有情况下均去除了异源聚集物和HMW聚集物。使用含有0.02％依沙吖啶的未纯化的抗体的实验在相同的电导率下进行。在所有情况下均去除了异源聚集物和HMW聚集物，并且如通过缺少365nm处的UV吸收所证明的，流过液没有依沙吖啶。
实施例2
在与实施例1平行的一组实验中，在增加的盐条件：pH 7.0,200mS/cm下，使IgM单克隆抗体(克隆529)的纯化样品通过颗粒。在20、30和40mS/cm下施加未纯化的抗体和未纯化的含有0.02％依沙吖啶的抗体。在所有条件下均去除了异源聚集物和HMW聚集物，并且如通过缺少365nm处的UV吸收所证明的，流过液没有依沙吖啶。向样品中添加0.2％依沙吖啶来重复这些实验。在所有情况下均去除了异源聚集物和HMW聚集物，并且流过液没有依沙吖啶。
实施例3
通过由Chelex-100和MacroPrep High Q的等体积混合物组成的填充床时的从单克隆IgM培养物上清液去除DNA和聚集物的能力研究。将每种0.5mL的Chelex-100和MacroPrep High Q夹在PVDF膜之间。以1mL/min加载IgM-529细胞培养物上清液，并在25、50和100mL处采集流过液样品，然后通过分析性SEC进行分析。即使在最大荷载下，254种主要的异源聚集物基本上被从流过液清除。不同荷载(低至高)的IgM回收率分别为58％、73％和85％。通过添加NaCl产生25mS/cm的电导率来重复实验。异质聚集物减少未受影响，但IgM回收率分别增加至约85％、90％和95％。
实施例4
重复实施例3的实验，但在20mS/cm的电导率下组合了微孔和大孔的带正电荷的和带负电荷的介质，加上等体积的微孔的亲脂性颗粒：QAE Sephadex A-25、SP Sephadex C-25、Nuvia Q、Nuvia S和Sephadex LH-20。将尿囊素和依沙吖啶添加至5％的补充了血清的单克隆IgM上清液，至终浓度分别为1％(过饱和)和0.02％。通过离心将上清液澄清，然后使其流过床(每毫升填充床20mL上清液)。然后通过阳离子交换色谱法捕获和分级分离IgM。在两步法中IgM回收率为80％，且通过分析性SEC测得纯度大于90％，没有明显的聚集物。
实施例5
将具有带负电荷的金属螯合性亚氨基二乙酸基团的微孔苯乙烯二乙烯基苯颗粒和具有带正电荷的螯合性配体三(2-氨基乙基)胺的大孔琼脂糖颗粒的等量混合物夹在聚乙烯熔块之间，并用50mM Hepes、100mM NaCl,pH 7.0平衡。使经过滤的含有IgG(克隆HER2)的哺乳动物细胞培养物上清液通过配件，并通过尺寸排阻色谱进行分析。未处理的样品含有约10％的聚集物。处理的样品含有少于0.2％的聚集物。AccuBlue测试揭示出处理还去除了约98％的DNA。抗体回收率为99％。
实施例6
将实施例5的颗粒混合物以50mM Hepes、100mM NaCl,pH 7.0平衡，并直接添加至含有IgG(克隆HER2)的经过滤的哺乳动物细胞培养物上清液，在搅拌下孵育1小时，然后通过膜过滤去除。分析揭示出实施例5的大约一半的聚集物减少和DNA去除。搅拌下于4下孵育16小时展示实施例5的约80％的功效。
实施例7
将带负电荷的金属螯合性苯乙烯二乙烯基苯颗粒、带正电荷的聚甲基丙烯酸酯多孔颗粒和带负电荷的聚甲基丙烯酸酯颗粒的等量混合物，与先前已用终电导率为20mS/cm的NaCl、1％尿囊素和0.025％依沙吖啶处理过的IgM-529样品混合。颗粒与样品的体积比为1:20。在10分钟、20分钟、40分钟和60分钟采集样品，并通过微滤去除颗粒。图1显示了所有时间点的高分子量聚集物的显著减少，但所有聚集物随着时间呈渐进增大式减少，随后宿主细胞蛋白污染物也明显大幅减少。随后的分析表明聚集物和宿主蛋白的减少均反映了从样品的组合的染色质残留物减少。在所有时间点依沙吖啶也被从样品清除。
实施例8
图2A和2B显示了如下的处理之前和之后的尺寸排阻色谱图谱：如同实施例7中的，以NaCl、尿囊素和依沙吖啶处理IgM-84，然后以与实施例7中的相同的介质混合物处理，但为通过使样品通过这样的装置来进行处理，在该装置中混合介质被夹在具有足够窄的网格来保持颗粒的织物聚合物保持器之间。HMW聚集物以及大多数较小的聚集物被完全清除。下表1显示DNA和组蛋白最初分布于所有具有IgG部分的聚集物部分之间，以及所有含有蛋白的部分之间。
表1.SEC部分的IgM和污染物含量。
ElT,min [IgM] DNA大小 [DNA] [His] 254:280
9 0.31 bld 10 0.13 1.31
10 0.09 bld 10 0.11 1.30
11 0.42 bld 10 0.13 1.03
12 0.68 (150-1000) 12 0.13 0.98
13 20.29 bld 44 0.21 0.49
14 21.08 (660) 236 0.76 0.89
15 2.33 445/(660) 459 1.87 0.97
16 0.30 316/445 435 0.82 1.59
17 0.51 316 796 1.09 1.45
18 0.38 155/316 314 0.96 1.60
19 0.31 90/155 339 0.33 1.40
20 0.09 90 684 0.86 1.56
21 bld 58 123 1.33 0.90
22 bld bld 23 0.54 1.21
23 bld bld 13 bld 3.67
24 bld bld 3 bld 15.86
ElT:洗脱时间，分钟。[IgM]:浓度，微克/毫升。DNA大小为碱基对(bp)。括号中的值来自离子交换实验中检测到的DNA。[DNA]浓度，ng/mL。[His]:总组蛋白浓度，微克/毫升。bld:低于检测下限。
表1还显示了DNA的大小分布，其引起了意料不到的发现，即除DNA和组蛋白之外，一些聚集物类群还包含含有不同数目的核小体的核小体系列。来自该处理的IgM回收率为98％。
实施例9
图3显示了实施例16的抗HER2单克隆IgG抗体的相同程序之前和之后的尺寸排阻色谱图谱。相比实施例8，结果在类型上相同，但在程度上有所改善，这可能(至少部分地)是因为抗体的浓度为约10倍高。
实施例10
使添加NaCl至电导率为20mS/cm的IgM-84细胞培养物上清液通过具有结合表面的带负电荷的螯合剂亚氨基二乙酸的、多孔整块材料的聚甲基丙烯酸酯盘(CIM IDA,BIASeparations)，然后立即使其通过具有二乙基氨基乙基带正电荷基团(CIM DEAE,BIA)的整块材料，体积比为50:1的上清液:整块材料。聚集物和DNA的清除与实施例7中一样有效。IgM回收率为98％。组蛋白和整体宿主蛋白清除为实施例7中达到的水平的约一半，均为约35％对于来自实施例7的约70％。对本领域技术人员显而易见的是，两种化学基团可可选地混合存在于单个整块材料的表面上。
实施例11
重复实施例10的方案，除了以具有带正电荷的季铵基的微滤膜(Sartobind Qnano)替代带正电荷的整块材料。DNA和聚集物清除以及IgM清除未发生改变。对本领域技术人员显而易见的是，两种化学基团可存在于单个膜的表面上。
实施例12
重复实施例11的方案，除了以具有以延伸配置的衍生的氨基配体的移植配体替代具有带正电荷的微孔中空纤维(Qyu-speed D,Asahi-Kasei Medical Company)的带正电荷的膜。
实施例13
重复实施例12的方案，除了使用夹在织物聚合物保持器之间的、具有带正电荷的螯合剂三(2-氨基乙基)胺(BioWorks TREN hi-sub)的多孔琼脂糖颗粒来代替带正电荷的微滤膜，以及除了进料流为未额外添加盐的含IgG的细胞培养物上清液。
实施例14
重复实施例13的方案，除了将带负电荷的膜(Sartobind S nano)替换为亚氨基二乙酸整块材料。结果与实施例12的相同。
实施例15
重复实施例14的方案，除了将具有带负电荷的螯合配体亚氨基二乙酸(Chelex100)的多孔苯乙烯二乙烯基苯颗粒与带正电荷的三(2-氨基乙基)胺螯合配体琼脂糖颗粒混合。将混合的颗粒夹在多孔聚乙烯残留物之间，并使经1％尿囊素和0.025％依沙吖啶处理过的含IgG的细胞培养物上清液在其上流过。聚集物被清除。IgG回收率为99％。对本领域技术人员显而易见的是，两种化学基团可在单种颗粒类型的表面上混合。
实施例16
重复实施例15的方案，除了向混合物中添加在带负电荷的多孔聚甲基丙烯酸酯颗粒(Macroprep T-Butyl,Bio-Rad)上的丁基疏水性配体，使得比例为2部分带正电荷的颗粒、1部分的带负电荷的疏水性颗粒、与1部分的带负电荷的螯合颗粒。抗体回收率为99％，且聚集物被从约7％减少至少于2％。依沙吖啶被清除。
实施例17
按实施例15中所述处理含有单克隆IgG的哺乳动物细胞培养物上清液。聚集物被减少了多于2.7％至0.31％。IgG回收率为99％。随后通过由空间排阻色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱组成的3步法纯化抗体。最终纯化的IgG中的DNA被减少至不能被测量的程度。聚集物被减少至少于0.05％，其基本上为尺寸排阻色谱的检测限。最终抗体纯度计算为大于99.999％。最终抗体回收率为81％。
实施例18
用1％尿囊素和0.025％依沙吖啶处理来自感染了鼠白血病病毒的哺乳动物细胞悬液的经过滤的上清液，然后按实施例10中所述使其通过整块材料。病毒水平被降低了3.06log。DNA被降低了3.5log。依沙吖啶被从处理的样品清除。
实施例19
重复实施例17的方案，除了使用来自感染了少量小鼠病毒的哺乳动物细胞悬液的经过滤的上清液。病毒水平被降低了5.06log。DNA被降低了3.5log。依沙吖啶被从处理的样品清除。这最后两个实施例证明本发明具有降低病毒污染以及清除聚集物和宿主来源的污染物的重要应用。对本领域技术人员显而易见的是，其也可清除内毒素。
对本领域技术人员显而易见的是，以上实例采用了在颗粒、整块材料、膜和纤维上的化学基团；和带正电荷的螯合剂与带负电荷的基团、带正电荷的螯合剂与带负电荷的螯合剂、带正电荷的基团与带负电荷的螯合剂的组合，并且二者均组合有其他化学反应性如疏水相互作用配体。尽管这些实例随IgG和IgM抗体而存在差异，但显而易见的还有，可以设想许多更多的虽然不同但呈现本发明的必要特征的这类组合，并且其可适用于除抗体外的许多蛋白类型，其中其可预期产生与以上说明的那些益处类似的益处。
本发明可与各种纯化方法组合以实现所需纯化水平。实例包括但不限于，通常用于诸如蛋白A的抗体的其他纯化方法，以及其他形式的亲和层析、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱法、固相金属亲和色谱和其他混合模式的色谱方法。发展用于各种方法的合适的条件并将其与本文的发明整合以实现特定抗体的必要纯化，处于本领域技术人员的范围内。
本文所引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文并用于所有目的，其程度与就像每个单个的出版物或专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用整体并入本文用于所有目的相同。当通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相冲突时，说明书预期替代和/或优先于任何这类相冲突的材料。
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如对本领域技术人员所显而易见的，可进行本发明的许多修饰和改变，而不脱离其精神和范围。本文描述的具体实施方案仅通过实例的方式提供，并且不试图以任何方式具有限制意义。预期，说明书和实例仅被认为是示例性的，本发明的真实范围和精神由如下权利要求所指明。

Claims (9)

1.用于降低蛋白制剂的聚集物含量的物质组合物，包括：
含有第一表面结合配体和第二表面结合配体的第一基底；其中
(i)所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体的位置使得所述蛋白制剂同时接触所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体，
(ii)所述第一表面结合配体为负电性的，并且为亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)，以及
(iii)所述第二表面结合配体为三(2-氨基乙基)胺。
2.用于降低蛋白制剂的聚集物含量的物质组合物，包括：
(a)含有第一表面结合配体的第一基底，和
(b)含有第二表面结合配体的第二基底，其中
(i)所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体的位置使得所述蛋白制剂同时接触所述第一表面结合配体和所述第二表面结合配体，
(ii)所述第一表面结合配体为负电性的，并且为亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)，以及
(iii)所述第二表面结合配体为三(2-氨基乙基)胺。
3.用于降低蛋白制剂的聚集物含量的物质组合物，包括以下的等量混合物：
(a)包含带负电荷的金属螯合性亚氨基二乙酸基团的微孔苯乙烯二乙烯基苯颗粒；和
(b)包含带正电荷的三(2-氨基乙基)胺基团的大孔琼脂糖颗粒；
其中所述(a)的微孔颗粒和所述(b)的大孔颗粒夹在聚乙烯熔块之间，并且
其中所述带负电荷的金属螯合性亚氨基二乙酸基团和所述带正电荷的三(2-氨基乙基)胺基团的位置使得所述蛋白制剂同时接触所述带负电荷的金属螯合性亚氨基二乙酸基团和所述带正电荷的三(2-氨基乙基)胺基团。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，还包含所述蛋白制剂。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述蛋白制剂包含含有核染色质的高分子量聚集物。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述蛋白制剂包含重组抗体。
7.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述第一基底包含颗粒。
8.如权利要求2所述的组合物，其中所述第二基底包含颗粒。
9.包含权利要求1-8中任一项所述的组合物的色谱分析装置。
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