SE513894C2 - Förfarande för lufttät lagring av fuktigt spannmål i närvaro av ett biokontrollmedel - Google Patents

Description

N) Oi 30 513 894 2 kunna reduceras i hög grad i lufttäta silon vari jästen Pichia anomala (Hansen) Kurtzman var en dominerande art (S. Lindgren, personlig kommunikation). Denna upptäckt indikerar att denna jäst interagerar kompetitivt eller antagonistiskt med mögelsvampar. Pichia anomala (syn. Hansenula anomala) har även frekvent isolerats vid andra studier avseende lufttätt lagrat spannmål och från bär, gummi, bryggeri- och bagerijäst, fingerhirs, öl, läskedrycker, fruktjuicer, lönnsirap, kondenserad mjölk, surkål, salta bönor, melass, miso, människa och djur (Barnett mil. 1990; Lacey och Magan 1991).

Björnberg och Schnürer (1993) utförde en studie i syfte att undersöka möjligheterna av att använda en jäst för att undertrycka växten av vanliga spannmålsskademögelsvampar. De utvärderade de antagonistiska effekterna av Pichía cmomala mot mögelsvamparna Penicillium roqueforti och Aspergillus candidus pä agarplattor. Organismerna samodlades under kontrollerade betingel- ser in uitro, och författarna fann att Pichia anomala undertryckte växten in uitro av nämnda två viktiga skademögelsvampar, även under perioder av obegränsad lufttillförsel. Vidare var graden av inhibition av skadesvampar relaterad till den initiala koncentrationen av Pichia anomaZa-celler. lnhibitionen var mest uttalad vid temperaturer som var suboptimala för växt och sporbildning av Penicillium roqueforti och Aspergillus candídus, dvs. under 15OC och över 300C.

I en ytterligare studie fastställde Petersson och Schnürer (1995) den antagonistiska aktiviteten av Pichia anomala, Pichia guilliermondii och Saccharo- myces cereuisiae på agar mot 17 mögelsvamparter. Det visade sig att Pichia anomala i synnerhet kan användas för biokontroll av mögelsvampväxt i fuktigt vete, som förvaras under lufttäta betingelser. Denna publikation avslöjar att Pichia anomala reducerar växt på agarplattor av alla testade mögelsvamparter på ett dosberoende sätt, varvid emellertid de olika mögelsvamparterna uppvisar olika känslighet för de undersökta jästarterna. Pichia anomala hade den kraftigaste antagonistiska aktiviteten i vete, varvid 105 och 106 CFU/g fullständigt inhiberade växten av Penicillium roqueforti. Även vid denna studie konstaterades att den bästa effekten erhölls vid temperaturer som var suboptimala för växten av mögelsvamparterna.

Användningen av antagonistiska mikroorganismer vid biologisk kontroll av svampsjukdomar på exempelvis spannmål, frukt och grönsaker framgår även av patentlitteraturen, varpå exempel ges nedan. 10 20 30 513 894 3 US 5 670 368 och dess avdelade US 5 413 783 (McLaughlin m.fl.) avser biologisk kontroll av växtpatogener på jordbruksalster såsom fiukt, grönsaker, cerealier etc. genom användning av en antagonistisk mikroorganism som är vald från Pichia guilliermondii och Hanseniasporum uuarum.

I US 4 820 531 (Tomes) avslöjas ett förfarande för att bevara kvaliteten hos lagrat hö med hög fukthalt genom behandling av färskt hö med mikroorganismen Bacillus pumílus eller mutanter därav.

US 4 981 705 (Tomes) avser ett förfarande för att konservera ensilage genom behandling av ensilaget med mikroorganismen Propionibacterium jensenii eller genetiska ekvivalenter därav.

Ett forfarande för framställning eller konservering av en dj urfoderkomposi- tion avslöjas i US 5 371 011, vilket innefattar att man på ett foder applicerar den antifungala bakteristammen Serratia rubidaea.

I US 4 842 871 beskriver Hill ett förfarande för att konservera en jord- bruksprodukt genom att behandla densamma med mikroorganismen Lactobacillus plantarum. Jordbruksprodukten kan vara ensilage, balat hö eller spannmål med hög fukthalt.

Användningen av Pichia guilliermondii för biologisk kontroll av röta hos frukt efter skörd avslöjas av Wilson m.fl. iUS 5 041 384. Wilson m.fl. avslöjar även ett förfarande för användning av isolat av Candida oleophila för kontroll av sjukdomar hos frukt efter skörd (US 5 425 941). Ett förfarande för behandling eller profylax av mikroorganismsjukdom hos frukter avslöjas även i US 5 525 132 (Shanmuganathan), varvid förfarandet innefattar användningen av en eller flera j äststammar.

Ingen av de referenser som tillhör teknikens ståndpunkt avslöjar emellertid eller ensiantyder den kombination av särdrag som är karaktäristisk för föreliggan- de uppfinning.

Det problem som skall lösas av uppfinningen _ I tempererade klimat, såsom Sverige, skördas cere aliespannmål vanligen vid en vattenhalt av 20%, vilket motsvarar en vattenaktivitet av 0,9 (N. Jonsson, J ordbrukstekniska institutet, personlig kommunikation). Mögelsvampväxt i cerealiespannmål förhindras ofta genom torkning men i tempererade klimat är torkningsförfaranden dyrbara och energikrävande. Foderspannmål kan förvaras vid hög fukthalt i lufttäta silon, där växten av mikroorganismer förhindras av låga O! 10 30 513 894 4 syre- och höga koldioxidnivåer, som tillhandahålls genom respiration av den epifytiska mikrofloran och själva spannmålet (Lacey och Magan 199 1). Svårigheter att upprätthålla ett lågt partialtryck av syre och hög koldioxidnivå gör lagringssys- temet känsligt för luftväxling mellan silon och den yttre atmosfären. Ofullständig tätning, dagliga temperaturfluktuationer och frekvent avlägsnande av spannmål bidrar samtliga faktorer till luftläckage till siloatmosfaren. Tíllsats av ett biokon- trollmedel, som är effektivt for att förhindra mögelsvampväxt, såsom den antago- nistiska jästen Pichia anomala, skulle förbättra tillförlitligheten hos lufttäta system för lagring av spannmål med hög fukthalt.

Syftet med uppfinningen är således att förbättra tillforlitligheten hos lufttäta system för lagring av spannmål med hög fukthalt och att motverka effekterna av ovan angivna luftläckageproblem. Detta syfte uppnås med föreliggan- de uppfinning.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning baserar sig på den överraskande upptäckten att växten av mögelsvamp arter, som tillhör Penicillium roqueforti-gruppen, vid lagring av spannmål med hög fukthalt och vid begränsat lufttillträde, är beroende av den använda spannmålssorten, dvs. det finns sorter som har en inneboende resistens mot skadesvampar under dessa betingelser. Således 'tillhandahåller föreliggande uppfinning ett förfarande för tillförlitlig lufttät lagring och konservering av fuktigt spannmål, varvid förfarandet utmärks av kombinationen att man som spannmål använder en sp annmålssort, som motstår infektion av lagerskadesvamp ar, och att man utför lagringen i närvaro av en antifungalt effektiv mängd av ett biokontroll- medel, som undertrycker eller inhiberar lagerskadesvamp ar och förstärker effekten av att använda nämnda resistenta spannmålssort. Uppfinningen tillhandahåller även en biokontrollkomposition for användning vid förfarandet enligt uppfinning- en, varvid kompositionen utmärks av att den innefattar minst ett biokontrollmedel, som undertrycker eller inhiberar lagerskadesvamp ar, företrädesvis ett Pichia anomalwisolat.

Beskrivning av ritningarna Fig. 1 Effekten av att öka initiala nivåer av Pichía anomala J 121 (Û) på växten och sporbildningen av Penicillium roqueforti Jö (Å) efter 14 dagars samodlíng i 10 15 20 25 30 513 894 5 höstvete (sort Kosack) (a), vårvete (sort Dragon) (b), råg (sort Motto) (c), korn (sort Golf) (d) och havre (sort Svea) (e). Ympnivå av Penicillium roqueforti J 5 anges med (A). Ymp at spannmål (aw 0,95) ínkuberades med begränsad lufttillförsel vid 25°C under 14 dagar. Data ges som log CFU/gram spannmål (i SA, n = 3).

Fig. 2 Effekten av att öka initiala nivåer av Pichia anomala J 121 på växten och sporbildningen av de tre Penicillium roqueforti-isolaten J 5 (Û), J 5A (I) och J 282 (Å), vid samodling på höstvete (sort Kosack, aW 0,95) vid 25°C efter 14 dagar. Den streckade linjen representerar medelvärdet av ympade nivåer av Penicillium roqueforti. Data ges som log CFU/gram höstvete. Variationskoefficienten fór log- transformerade CFU-värden översteg ej 6% för någon datapunkt (n = 3).

Fig. 3 Effekten av att öka initiala nivåer av de tre Pichia anomala-ísolaten J 121 (Û), J 281 (Å) och CBS5759 (I) på växten av Penicillium roqueforti J 5, vid samodling på höstvete (sort Kosack, aw 0,95) vid 25°C efter 14 dagar. Den strecka- de linjen representerar medelvärdet av ymp ade nivåer av Penicillium roqueforti J 5.

Data ges som log CFU/ gram höstvete. Variationskoefñcienten fór log-transformera- de CFU-värden översteg ej 6% fór någon datapunkt (n = 3).

Fig. 4 Växt och sporbildning av Penicillium roqueforti-gruppen i glasrör med begränsad lufttillfórsel, innehållande a) korn sort Golf, b) råg sort Motto, c) vårbete sort Dragon (parti A), d) och höstvete sort Kosack (aw 0,96), under inkubation vid 2500 under 14 dagar. Data ges som log mögelsvamp-CFU/gram cerealiespannmål på dag 0 (n = 1, ofyllda staplar) och dag 14 (fyllda staplar).

Angivna standardavvikelser beräknades på log-transformerade värden (n = 3).

Fig. 5 Växt av Penicillium roqueforti i vete, som hade uttagits från silon och exponerats fór luft efter 10 månaders lagring. Vete fórvarades med fullständig lufttillfórsel vid 2000. Icke-ympat (Û), ympat med 103 CFU/g Penicillium roquefor- ti (I), 103 CFU/g Penicillium roqueforti och 104 CFU/g Pichia anomala (Å) eller 10 20 30 513 894 6 103 CFU/g Penícillium roqueforti och 106 CFU/g Pichia cmomala (V).

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning avser ett forfarande för tillförlitlig lufttät lagring och konservering av fuktigt spannmål, varvid förfarandet utmärks av kombinatio- nen av att man som spannmål använder en spannmålssort, som motstår infektion av lagerskadesvampar, och att man utför lagringen in närvaro av en antifungalt effektiv mängd av ett biokontrollmedel, som undertrycker eller inhiberar lager- skadesvamp ar och förstärker effekten av att använda nämnda resistenta spann- målssort.

Uppñnningen baserar sig på den överraskande upptäckten att växt av mögelsvamparter, vid lagring av spannmål med hög fukthalt under betingelser som innebär läga syre- och höga koldioxidkoncentrationer, är beroende av den använda spannmålssorten, dvs. det finns sorter med en inneboende resistens mot skade- svampar under dessa betingelser.

Den använda spannmålssorten är företrädesvis en foderspannmålssort som innefattar cerealiespannmålssorter. Vilken som helst spannmålssort som motstår infektion av skadesvampar kan användas. l syfte att fastställa huruvida en spannmålssort motstår infektion av skadesvamp ar, speciellt Penicillium roqueforti, kan fackmannen lätt bestämma detta genom att använda de förfaranden som föreslås i denna beskrivning under rubriken "IL Cerealiespannmålssorter med inneboende resistens mot infektion av skadesvampar", "Material och metoder".

Med "cerealiespannmål" avses, genomgående i denna beskrivning och patentkraven, vete, råg, korn, havre, rågvete (triticale), majs, sorghum, hirs, ris etc.

De mest föredragna cerealiespannmålssorterna är råg sort Motto, vårvete sort Dragon och kornsorterna Maud och Mentor.

För närvarande synes jästarter vara de mest lovande biokontrollmedlen som alternativ till kemiska fungicider vid lagring efter skörd. Detta är en följd av det faktum att jästarter ej producerar mykotoxiner eller allergeniska sporer, att huvuddelen ej är patogen för människa eller djur, att många jäststammar kan växa vid låg vattentillgänglighet och på mycket olika substrat vid låga syrep artial- tryck.

Som biokontrollmedel kan vilken som helst jäststam med förmåga att undertrycka växten av sp annmålsskademögelsvampar och förstärka effekten av 10 15 20 515 894 7 att använda en resistent spannmålssort användas vid förfarandet enligt uppfin- ningen, förutsatt att det uppfyller följande tre urvalskriterier: (1) det bör vara naturligt närvarande i spannmål; (2) det bör uppvisa god växt vid låg vattenaktivi- tet; och (3) det bör växa väl vid låg temperatur. Alla dessa kriterier uppfylls av Pichia anomala, vars lämplighet vidare underbyggs av observationer som indikerar att den är dominerande i mögelsvampfritt, lufttätt lagrat spannmål. Förmågan hos en jäststam att undertrycka växten av vanliga spannmålsskademögelsvampar kan bestämmas medelst de inhibitionsförsök som beskrivs av Björnberg och Schnürer (1993), sid. 624, eller av Petersson och Schnürer (1995), sid. 1028.

Användningen av en Pichia anomala-stam som biokontrollmedel är en föredragen utföringsform av uppfinningen. Användningen av Pichia anomala som biokontrollmedel i cerealier kan räknas som en extra tillsats av en vanlig medlem av mikrofloran i cerealier. Detta är en fördel för att erhålla ett allmänt erkännande av detta biotekniska tillvägagångssätt för foderlagríng. I allmänhet har Pichia anomala variabel växt vid både 350C och kroppstemperatur (Barnett m.fl. 1990).

Humaninfektioner, orsakade av Pichia anomala, är ytterst sällsynta.

Speciellt användbara stammar är Pichia anomala J 121, Pichia anomala J 281 och Pichia anomala CBS5759.

Stammen Pichia anomala J121 beskrivs av Björnberg och Schnürer (1993) och Petersson och Schnürer (199 5). Nämnda stam har deponerats hos "Centraalbu- reau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Nederländerna den 27 februari 1998 under depositionsnummer CBS 100487.

En karaktärisering av Pichia anomala J 121 ges nedan.

Ch 10 30 513 894 Växttemperatur 25OC.

Morfologi: Citronformade celler - + Rosafärgade kolonier ~ Knoppande celler Delande celler - Filament + Pseudohyfer + Artrokonidier - Ballistokonidier - Askosporer: +,hattformade Knoppar på stjälkar Septathyfer - Symmetriska ballistokonidier - Fermentering: D-glukos Maltos + Laktos - D-galaktos Sackaros + Raffinos + Växt: D-glukos + Maltos + Glycerol + D-galaktos OAOL-trehalos + Erytritol L-sorbos - Metyl-oc-D-glukosid + D-glucitol D-glukosamin - Cellobíos - D-mannitol + Dmibos - Melibíos - Myo-inositol - D-xylos + Laktos - Z-keto-D-glukonat - L-arabinos - Raffinos + D-glukonat - L-ramnos - Melezitos + D-glukuronat - Sackaros + DL-laktat Nitrat + Etylamin + L-ljysin Kadaverin + 0,01% cykloheximid - Ättiksyraproduktion - vid; ss°o s7°c + 4o°c Pichía anomala Jl2l har förmågan att växa vid pH-värden från ca 2 till ca l 1 och har förmågan att växa vid temperaturer från ca 6OC till ca 37OC. En speciell egenskap hos Pichia anomala J 121 är dess förmåga att växa vid laktatkoncentra- tioner upp till 0,5 M vid pH-värden mellan ca 4 och ca 6.

Vid förfarandet enligt uppfinningen kan närvaron av biokontrollmedlet vara en följd av dess naturliga förekomst i spannmålet eller en följd av att biokontroll- medlet har applicerats på spannmålet, exempelvis i form av en biokontrollkomposi- tion.

De antifungala j äststammarna enligt föreliggande uppfinning kan framstäl- las i erforderlig kvantitet genom att man fermenterar ett prov av nämnda stam under lämpliga betingelser och i ett lämpligt medium. Dylika betingelser och medier är väl kända inom tekniken. Ett exempel ges nedan under rubriken "I. 10 15 20 25 30 35 513 894 9 Pichia anomala som biokontrollmedel av Penicillium roqueforti i spannmål med hög fukthalt under lufttäta betingelser", "Material och metoder", "Inokulat".

J äststammen kan erhållas från fermenteringsmäsken genom koncentrering eller ultrafiltrering, eventuellt följt av tillsats av ett beredningsmedel, såsom ytaktíva medel, fasta eller flytande bärare eller utsp ädningsmedel, dispergermedel, etc.

Enligt en ytterligare aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahålls således en biokontrollkomposition, som innefattar minst ett biokontrollmedel, som undertrycker eller inhiberar lagerskadesvampar och förstärker effekten av att använda en spannmålssort, som motstår infektion av skadesvampar, och som företrädesvis innefattar en jäststam och i synnerhet någon av ovannämnda föredragna Pichia anomala-isolat.

Vid utövande av förfarandet enligt upp finningen kan biokontrollkompositio- nen appliceras som en vätska eller ett partikelformigt fast material. När den appliceras som en vätska, kan bäraren vara vatten medan, då den appliceras som ett fast material, bäraren är ett fast material. Exempel på fasta bärare innefattar cerealier såsom malt korn och malt vete, malda majskolvar och andra material såsom lera, krita, magnesit, kalksten och talk.

Eventuellt ytterligare material som sätts till biokontrollkompositionen enligt uppfinningen innefattar näringsämnen, tillväxtfaktorer, antioxidanter och material som är avsedda att minska damningsbenägenheten hos additiven, förbättra adhesionen till det för lagring avsedda spannmålet eller selektivt förstärka växten av den jäststam som används som biokontrollmedel.

De relativa proportionerna av bärare och jäststam, som införlivas med biokontrollkompositionen för användning vid lagring av spannmål, beror på den speciella jäststam ifråga som används och dess aktivitet och viabilitet. Koncentra- tionen av levande celler, såsom definieras av antalet kolonibildande enheter (CFU = Colony Forming Units), kan användas som vägledning för bestämning av lämpliga doseringar. Som ledning kan nämnas att jästcellerna kan appliceras som en flytande suspension eller fast additiv i koncentrationer inom intervallet från ca ' 103 CFU till ca 106 CFU per gram lagrat spannmål, beroende på spannmålets beskaffenhet och kondition. Företrädesvis ligger koncentrationen inom intervallet från ca 104 till ca 105 CFU per gram spannmål.

Vid framställning av biokontrollkompositionen enligt uppfinningen torkas vanligen jäststammen medelstlämpliga metoder, exempelvis frystorkas eller 10 w O l 30 515 894 10 spraytorkas, eller en levande kultur återsuspenderas i vatten och blandas därefter med andra komponenter medelst konventionella blandningsförfaranden.

Enligt en ytterligare aspekt av uppfinningen tillhandahålls ett forfarande för tillförlitlig lufttät lagring och konservering av fuktigt spannmål, varvid förfarandet utmärks av att man på spannmålet applicerar en biokontrollkomposi- tion, som innefattar ett biokontrollmedel som undertrycker eller inhiberar växten av lagerskadesvampar, varvid det använda spannmålet är en spannmålssort som motstår infektion av lagerskadesvampar. Biokontrollmedlet är företrädesvis ett enligt ovan definierat Pichia anomala-isolat. Biokontrollkompositionen kan utgöras av jästcellerna som sådana eller vara en beredning, vilken innehåller, förutom jästcellerna, beredníngsmedel såsom har definierats ovan.

Appliceringen av biokontrollkompositionen enligt uppfinningen kan åstad- kommas genom blandning, pudring, injektion, gnidning, sprutning, borstning, doppníng eller valsning.

Den lufttäta lagringen kan åstadkommas i silon med begränsat lufttillträde eller i lufttäta säckar av plast, gummi eller liknande material. l de försök i pilotskala som redovisas nedan applicerades Pichia anomala- celler genom sprutning på spannmålet i en foderblandare för erhållande av en jämn fördelning. l full skala kan jästen tillsättas genom anordnandet av ett sprutmunstycke i den transportskruv som används för inmatning i silon. Den efterföljande omblandningen fördelar jästcellerna jämnt över sp annmålet. lnokula- tet tillsattes ingående i tillväxtmediet, innefattande en mindre mängd av näring- sämnena. Det är även möjligt att tillsätta cellerna av Píchia cmomala tvättade i kranvatten.

Kommersiell användning och fördelar De resultat som presenteras i det försöksavsnitt som följer indikerar lämpligheten av storskalig applicering av Pichia anomala som biokontrollmedel mot skada på lufttätt lagrat foderspannmål av hög fukthalt efter skörd. Jästen inhiberar växt av Penicillium roqueforti-gruppen, de mest betydande skademögel- svamparna vid luftät lagring, vid provokationsympning till en mycket hög nivå under sílolagring och fördröjer även mögelsvampväxt när spannmål, som avlägsnas från silon, exponeras för luft.

Fördelar som uppnås med de olika aspekterna av föreliggande uppfinning är: 10 15 20 30 513 894 11 - uppfinningen förbättrar konserveringen av spannmålet; - uppfinningen förbättrar det biologiska värdet hos det lagrade spannmå- let; - uppfinningen gör det möjligt att lagra spannmål vid högre fukthalt vilket innebär energibesparingar; - uppfinningen tillhandahåller sp annmål med bättre hållb arhetsegenska- per även efter avslutandet av den lufttäta lagringen; - uppfinningen utövar biokontroll huvudsakligen genom konkurrens om näringsämnen och syre; - Pichia anomala växer kraftigt på billiga tillväxtmedier under använd- ning av enkel teknik, vilka är viktiga faktorer för kommersiellt utnytt- jande av denna jäst i stor skala.

Uppfmningen åskådliggörs närmare av det försöksavsnitt som följer.

Försöksavsnitt För att underbygga uppfinningen experimentellt utvärderade vi användning- en av Pichia anomala som biokontrollmedel under lagring av vete (höst- och värformer), råg, korn och havre, som är de vanligast odlade cerealierna i Sverige.

Dessa cerealier kan samtliga användas som foderspannmål och kan lagras under lufttäta betingelser utan föregående torkning. För att imitera ett felfungerande lufttätt system för lagring av spannmål av hög fukthalt, fylldes glasrör med ympat sp annmål (vattenaktivitet 0,95) och förse glades med en butylgummipropp. För att simulera luftläckage infördes en nål genom varje butylgummipropp. Tre isolat av Pichia anomala jämfördes som biokontrollmedel i höstvete av hög fukthalt, som underkastades begränsad lufttillförsel. Vidare utvärderades känsligheten av tre Penicillium roqueforti-isolat mot Pichia anomala i höstvete.

I. Pichia anomala som biokontrollmedel av Penícillium roqueforti i spannmål med hög fukthalt under lufttäta betingelser Material och metoder Svampisolat Pichia anomala (Hansen) Kurtzman J 121 med tidigare visad antagonistisk effekt (Petersson och Schnürer 1995) isolerades ursprungligen från lufttätt lagrat 10 20 N) O! 30 515 894 12 vete, liksom vårt senaste isolat Pichia anomala J281. För jämförelseändamål använde vi Pichia anomaZa-stammen CBS57ö9 från "Centraalbureau voor Schim- melcultures" (CBS), Baarn, Nederländerna. Penícillium roqueforti Thom J5 och Penicillium roqueforti J 5A, som ursprungligen isolerades från lufttått lagrat spannmål, och Penicillium roqueforti J282, som nyligen har isolerats från ensilage, var gåvor från Dr. P. Häggblom, Statens Veterinärmedícinska Anstalt, Uppsala.

Alla använda svampar var tillgängliga från svampsamlingen vid Avdelningen for Mikrobiologi, Sveriges Lantbruksuniversitet, SLU, Uppsala. J äststammarna identifierades med ID 32 C-testet (Biomerieux, Marcy l'Etoile, Frankrike) och genom morfologiska studier (Kreger-van Rij 1984; Kurtzman 1984). Mögelsvampisolaten identifierades som Penicillium roqueforti genom morfologiska studier (Pitt 1991; Samson mil. 1995). Svarnpkulturerna hölls på maltextraktsnedagar (MEA, Oxoid, Basingstoke, England) vid ZZOC.

Cerealiespannmål Höstvete (sort Kosack), vårvete (sort Dragon), råg (sort Motto), korn (sort Golf) och havre (sort Svea), samtliga av frökvalitet, köptes från Svenska Lantmän- nens Riksförbund, Uppsala.

Inokulat J ästsusp ensioner framställdes genom ymp ning av 100 ml av en jästextrakt- maltextrakt-sackarosbuljong (0,2 j ästextrakt (BBL, Meyland, Frankrike), 1,5 g maltextrakt (Oxoid, Basingstoke, England), 1,0 g sackaros (BDH, Poole, England) i 1,0 liter destillerat vatten) med en ögla av celler från en kultur, som förvarades på MEA vid ÉZOC. Efter inkubation i en rotationsskakare (100 varv per minut) vid 25OC under 48 timmar, bestämdes antalet jästceller under användning av en hemocytometer. Sporsuspensionen av mögelsvamp framställdes genom att man skördade sporer från 7 dagar gamla kolonier (som fått växa på MEA vid 25oC) i peptonvatten (2 g "PhytoneTM"-pepton (BBL, Becton Dickson and Co., Cockeysville, USA) per liter destillerat vatten) med 0, 0 15% "TWeen 80" tillsatt för att underlätta dispergeringen av konidier. Sporkoncentrationen bestämdes med en hemocytome- ter.

UI 10 15 20 25 30 35 513 894 13 Inhibition av Penicillium roqueforti J5, ympad på vete, råg, korn och havre, av jästen Pichia anomala J 121 Icke-sterilt cerealiespannmål, som hade lagrats vid en vattenhalt av 10% vid 2000, fuktades med kranvatten för erhållande av en vattenaktivitet av 0,95 (ca 22% vattenhalt). För att fukthalten skulle nå jämvikt, lagrades spannmålet 3-5 dagar vid 200 med frekvent blandning, Vattenaktiviteten (aw) uppmättes vid 25OC med en "Novasina TH-2/RTD-33/BS", försedd med en temperaturkonstanthållare (Defensor AG, tidigare Novasína AG, Pfäffikon, Schweiz).

Spannmål med aw 0,95 ympades med mögelsvampsporsuspensionen till ca 3 x 103 mögelsvampsporer per gram. Sporerna applicerades genom tillsats av suspensionen som droppar på spannmålet och omblandning för erhållande av en jämn sporfördelning. J ästen Pichia anomala inympades likaledes för erhållande av 0, 101, 102, 103, 104, 105 och 106 celler per gram spannmål vid separata försök.

Inokulaten, < 1 ml svampsuspension per 100 gram cerealiespannmål, påverkade ej mätbart spannmålets vattenaktivitet. Tjockväggiga glasför (27 ml) fylldes med portioner om ca 17 g av ymp at spannmål och förseglades med en butylgummipropp.

För att simulera luftläckage, infördes en nål (diameter 0,6 mm) genom varje butylgummipropp. Rören inkuberades vid 25°C. Enligt tidigare observationer representerar dessa betingelser (aW 0,95, 2500, 3 x 103 mögelsvampsporer per gram) en miljö som gynnar växt av Penicillium roqueforti och valdes i syfte att utsätta den antagonistiska aktiviteten av Pichia anomala för ett mycket strängt test (Petersson och Schnürer 1995).

På dag 14 öppnades tre rör från varje behandling, och innehållet späddes tiofaldigt med peptonvatten, blötlades under 0,5 timmar och homogeniserades under 2 minuter vid normal hastighet i en "Stomacher 400" (Colworth, England).

Jästväxt kvantifierades på MEA, kompletterad med 100 ppm kloramfenikol (C- 0378 Sigma Chemical Co., St. Louis,; Mo. USA) (MEAC-plattor). För att undvika växtínhibition av antagonistísk jäst på agarplattor, avsedda för räkning av mögelsvamp-kolonibildande enheter (CFU), användes MEACC (MEAC komplette- rad med 10 ppm cykloheximid C-7698 Sigma Chemical Co., St. Louis; Mo. USA) för ytutstrykning av 0,1 ml alikvoter. Kloramfenikolen är ett bakteriostatiskt bred- spektrumantibiotikum och cykloheximid inhiberar växt av Pichia anomala (Björnberg och Schnürer 1993). Mjölksyrabakterier och det totala antalet aeroba bakterier räknades på "LBS" (BBI, Meyland, Frankrike) respektive platträkningsa- gar (Oxoid, Basingstoke, England), båda kompletterade med 0,1% "Delvocid®" 10 15 20 30 513 894 14 (Gist-Brocades, Delft, Nederländerna). "Delvocid" är en bredspektrumfungicid med natamycin som aktiv beståndsdel. Endast kontrollrören vid försöken, dvs. rör som ej hade ympats med jäst, analyserades med avseende på bakterier.

Inhibition av tre ísolat av Penicillium roqueforti under användning av Píchia anomala J12l För att utvärdera ísolatrelaterad variation i känslighet för den antagonistis- ka jästen Pichia anomala J 121 i lufttätt lagrat höstvete med hög fukthalt, använ- des tre isolat av Penicillium roqueforti (J ö, J 5A och J 282) i tre separata försök, som utfördes såsom beskrivits ovan.

Inhibítion av Penicillium roqueforti Jö under användning av tre ísolat av Pichia anomala Tre isolat av Píchia anomalajämfördes med avseende på deras antagonistis- ka aktivitet mot Penícíllium roquefortí Jö i lufttätt lagrat höstvete med hög fukthalt. Píchía anomaZa-isolaten J12l, J28l och CBS5759 användes vid tre separata försök, som utfördes såsom beskrivits ovan.

Samtliga inhibitionsförsök utfördes i triplikat och upprep ades två gånger.

RESULTAT Inhibition av Penicillium roquefortí Jö, ympad på vete, råg, korn och havre, av jästen Pichia anomala J12l På höstvete (sort Kosack) reducerade Pichia anomala växten av Penícíllium roqueforti på ett dosberoende sätt (Fig. la). På vårvete (sort Dragon) reducerades även Penicíllium roqueforti på ett dosberoende sätt ehuru dess växt ej var så kraftig som på höstvete (Fig. lb). På råg (sort Motto) växte ej Penicillium roquefor- ti, oberoende av huruvida spannmålet hade ympats med Pichia anomala eller ej (Fig. lc). I själva verket observerades till och med en svag nedgång i Penicillium roquefortí-CF U (jämfört med ympad mängd) på råg utan inympad Pichia anomala.

Penicillium roqueforti växte väl i korn (sort Svea) och ökade från 5 x 103 till 106 CFU/g, vilket var jämförbart med dess växt på höstvete (Fíg. la och d). Pichia anomala reducerade växten av Penicillium roqueforti i korn till 104 CFU/g vid 103 CF U/g av inympad Pichia anomala och inhiberade totalt växten vid 105 CF U/g (Fig. ld). Växten av Penicillium roqueforti på havre var jämförbar med den på 10 20 25 30 513 894 15 höstvete och korn (F ig. le). Pichia anomala inhiberade totalt växten av Penicillíum roqueforti på havre vid 104 CFU/g.

Pichia anomala växte till samma nivå på fyra av de fem testade cerealierna, dvs. till ca 5 x 107 CFU/g, vid ympning till densiteter överstigande 103 celler per gram, varvid undantaget var vårvete (sort Dragon), där den nådde en nivå av ca 1 x 109 CFU/g (Fig. lb). På ympnivåer under 103 CFU/g var växten av Pichia anomala mest uttalad i vårvete och råg (Fig. lb och c).

Efter 14 dagars inkubation påträffades mjölksyrab akterier på nivåer mellan 102 och 103 CFU per gram i alla cerealier (data visas ej). Det totala antalet aeroba bakterier var 105 CFU per gram i råg och 107 CFU per gram i övriga cerealier (data visas ej).

Inhibition av tre isolat av Penicillium roqueforti under användning av Píchia anomala J 121 Utan tillsats av jäst växte Penicillium roqueforti J 5, J 5A och J 282 samtliga i samma grad på höstvete, dvs. från 5 x 103 till 106 CFU/g (Fig. 2). Penicillium roqueforti J 5, J 5A och J282 liknade mycket varandra med avseende på deras känslighet för den antagonistiska jästen Pichia anomala J 121. Växten påverkade påtagligt vid en initial nivå av 104 CFU/g och inhiberades totalt vid 105 CFU/g (Fíg. 2).

Inhibition av Penicillíum roqueforti J5 under användning av tre isolat av Pichia anomala Pichia anomala J121, J 281 och CBS57 59 reducerade alla växten av Penicil- lium roqueforti J 5 på höstvete (sort Kosack) (Fig. 3). Växten av Penicillium roquefonrti inhiberades totalt av en initial nivå av 105 CFU av Pichia anomala per gram. Vid försöket med Pichia anomala J 121, konstaterades högre mögelsvamptal vid både 0 och låga jästinympningar (<108 CFU/g) än vid de övriga två försöken (Fíg. 3). i:'kívkirk**************inhfrkakicärškie-Ic*irkiefikulriewkak* Av resultaten ovan kan följande slutsatser dras.

Pichia anomala inhiberar växten och sporbildningen (uppmätta som CFU) O! 10 30 513 894 16 av Penicillium roqueforzfi på höstvete, korn och havre på ett dosberoende sätt. Den antagonistiska aktiviteten av Pichia anomala i cerealiespannmål, lagrade i ett rör med begränsad lufttillförsel, var ej beroende av cerealievarieteten. Pichia anomala växte kraftigt på alla fem testade cerealier.

Av någon anledning var spannmålsinfektionen med Penicíllium roqueforti klart lägre på råg och i viss utsträckning även på vårvete. Skillnader i mikromiljö i spannmålen till följd av närvaron av skal, konkurrerande mikroorganismer, näringstillgänglighet eller antifungala föreningar kan alla förväntas påverka växten av både den inympade jästen och mögelsvampen. Tillgängligheten av näringsämnen i cerealiespannmål skiljer sig förmodligen åt mellan sorter och är även beroende av mikrofloran och den tidigare hanteringen av spannmålet. Vi har observerat bakterienivåer mellan 103 och 5 x 107 CFU per gram och jästnivåer melan 102 CFU (detekteringsnivå) och ö x 105 CFU per gram ivete som lagrats vid 10% vattenhalt (opublicerade data). Om dessa skillnader orsakas av mikrobiell växt på spannmålet, och ej endast av tillfällig kontaminering, kan avsevärda skillnader i förbrukade näringsämnen i spannmålet förväntas. Bakterienivån i cerealierna förklarar emellertid ej fiånvaron av växt av Penicíllium roqueforti i råg och den svaga växten i vårvete, jämfört med höstvete, havre och korn. Antalet aeroba bakterier efter inkubationsperioden var klart lägre i råg än i de övriga cerealierna. Fortfarande var den nivå som nåddes av Pichia anomala på råg, på vilken Penicillium roqueforti ej växte, minst lika hög som den som nåddes på de övriga cerealierna. Det skulle emellertid kunna ha funnits andra antagonistiska mikroorganismer än Pichia cmomala i rågen, men några bakterier eller någon jäst identifierades eller karaktäriserades ej.

Långtidslagring och -odling av mikroorganismer kan ändra deras egenska- per. Följaktligen utvärderades en stam av Pichia anomala, som nyligen isolerats från höstvete. Vidare isolerades nyligen en av de tre Penicillium roqueforti som användes från ensilage. Den antagonistiska aktiviteten av Pichia anomala mot Penicillium roquefortí i vårt modellsystem var ej isolatspecifik. Vidare undertryck- tes de tre Penicillium roqueforti-isolaten i lika grad av Pichia anomala J12l på höstvete med hög fukthalt, lagrat med begränsad lufttillförsel. Förmågan hos Pichia anomala J 121 att effektivt reducera växten av Penicillíum roqueforti återspeglar stabiliteten hos denna antagonistiska aktivitet, även efter år av lagring under laboratoriebetingelser. 10 15 30 513 894 17 Sammanfattningsvis reducerade Pichia anomala växten av Penícillium roqueforti i höstvete med hög fukthalt, havre och korn i en behållare med begrän- sad lufttillförsel. Denna upptäckt indikerar att Pichia anomala skulle kunna användas för att förbättra tillförlitligheten vid lufttät lagring av foderspannmål.

Eftersom Penicillium roqueforti ej växte på råg, var det ej möjligt att utvärdera den mögelsvampinhiberande aktiviteten av Pichia anomala på råg. Den överraskande upptäckten att Penicillium roqueforti ej växte på råg initierade emellertid oss att undersöka växten av Penicillium roqueforti och ett antal olika mögelsvamparter på olika spannmålssorter. De överraskande resultat som därvid erhölls diskuteras närmare i detalj nedan.

II. Cerealiespannmålssorter med inneboende resistens mot infektion av skadesvampar Arten Penicillium roqueforti innefattar flera taxa, och det har nyligen föreslagits att den skall uppdelas i tre olika arter benämnda Penicillium roqueforti, Pencillium carneum och Penicillium panum, baserat på bl.a. olika sekundära metabolitprofiler och nukleinsyrasekvensskillnader (Boysen m.fl., 1996). De tre arterna, Penicíllium roqueforti, Penicillium carneum och Penicillium panum, är morfologiskt mycket lika varandra och kan, för praktiska ändamål, anses som underarter eller som en enda art (Pitt och Hocking, 1997). Idag är ingenting känt om skillnader i naturlig habitet för de tre arterna. Alla har förmodligen potentialen att förstöra livsmedel liksom foder, speciellt vid ensilage och lufttätt lagrat spannmål med hög fukthalt.

Nedan följer en redogörelse för våra undersökningar vad gäller infektionsför- mågan hos Penicillium carneum, Pencillium paneum och Penicillium roqueforti under lufttät lagring av höstvete, vårvete, råg och korn med hög fukthalt. Patogeni- citeten efter skörd hos Penicillium roqueforti, dvs. Penicillium roqueforti, Penicil- lium carneum och Penicillium paneum, mot olika sorter och partier av vårvete och sorter av korn jämförs även.

Material och metoder Studerade svampar Penicillium roqueforti Thom J 5 och Penicillium roqueforti J 5A var gåvor från Dr. P. Häggblom (Statens Veterinärmedicinska Anstalt, Uppsala). Penicillium UI 10 20 N.) CJ! 30 515 894 18 carneum lBTl4042, Penicillium carneum lBT6889, Penicilliumpaneum IBT13929, Penicíllium paneum lBT13321, Penicillium roqueforti IBT18689 och Penicíllium roqueforti IBT14088 var gåvor från Dr. J. Frisvad, Bioteknologiska Institutet, Lyngby, Danmark. Artidentiteter bekräftades baserat på morfologi och RAPD- profiler (Boysen mil., 1996). Svampkulturerna hölls på maltextraktsnedagar (LNIEA; Oxoid, Basingstoke, England) vid 200. Alla använda svampar har depone- rats i svampsamlingen vid Institutionen för Mikrobiologi, Sveriges Lantbruksuni- versitet, SLU, Uppsala.

Studerade cerealier Höstvete (lat. Tríticum aestíuum) sort Kosack, vårvete (lat. Triticum aestiuum) sort Dragon (betecknas som A), råg (lat. Secale cereale) sort Motto och korn (lat. Hordeum vulgare, vårform) sort Golf inköptes samtliga från Svenska Lantmännens Riksförbund, Uppsala. Korn, sorterna Baronesse, Kinnan, Maud och Mentor, var gåvor från Jörgen Löhde (Svalöf Weibull AB, Svalöv). Baronesse och Kinnan används som foderspannmål medan Maud och Mentor är kornmaltsorter.

Vårvete, sorterna Alve, Curry, Dragon (betecknas som B), Thasos och Tjalve, var gåvor från Jan Persson (Svalöf Weibull AB, Svalöv). Fyra extra partier av vårvete sort Dragon från Svalöf Weibull AB användes för att undersöka variationer i resistens mot växt av Penicillium roqueforti (Jö) bland partier av samma sort.

Partierna betecknas som C (P151703 -95), D (M. Elit 88621), E (>96) och F (-97).

Alla partier representerar samma genotyp av vårvete sort Dragon; var och en fick emellertid växa under olika betingelser.

Inokulatframställning Konidiesuspensioner av mögelsvamparna framställdes genom att man skördade sporer från 7 dagar gamla kolonier (som fått växa på maltextraktagar (MEA) [Oxoid, Basingstoke, England] vid 250C) i peptonvatten (2 g "Phytone TM” pepton [BBL, Becton Dickinson and Company, Cockeysville] per liter destillerat vatten) med 0,0l5% "Tween 80", som tillsattes för att underlätta dispergering av konidierna. Sp orkoncentrationen bestämdes under användning av en hemocytome- ter. 10 15 20 25 30 513 894 19 Infektionsförmåga hos Penícillíum roqueforti, Pencillium carneum och Penicillíum paneum i korn, råg och vete Icke-sterilt cerealiespannmål, tidigare lagrat vid en vattenhalt av 10% vid 200C, fuktades med kranvatten för erhållande av en vattenaktivitet (aw) av 0,96 (ca 25% vatten). För att utjämna fukthalten lagrades spannmålen under 2-4 dagar vid 200 med frekvent blandning. Vattenaktíviteten mättes vid 22-2400 under användning av en "CX-Z AquaLab" utrustning (Decagon Devices, Inc., Washington, USA).

Spannmål (aw 0,96) ympades med mögelsvampsporsuspension för att nå en nivå av ca 104 mögelsvampsporer per gram. Sporerna applicerades genom tillsats av suspensíonen som dropp ar på sp annmålet, följt av omsorgsfull omblandning för att erhålla en jämn sporfördelning i spannmålet. Tjockväggíga glasrör (27 ml) fylldes med portioner om ca 17 g av ympat spannmål och förseglades med butyl- gummiproppar. För att simulera luftlåckage infördes en nål (diameter 0,6 mm) genom varje butylgummipropp. Rören inkuberades vid 2500. På dag 14 öppnades tre rör från varje behandling och innehållet späddes tiofaldigt med peptonvatten, blötlades under 0,5 tim och homogeniserades under 2 min vid normal hastíghetí en "Stomacher 400" (Colworth, England). För att undvika växtinhibition av bakterier på agarplattor, avsedda för mögelsvamp-CFU-räkning, ytutströks 0, 1 ml alikvoter på maltextraktagar, kompletterad med 100 ppm kloramfeníkol (C-0378 Sigma Chemical Co. St. Louis; Mo. USA) (MEAC). Kloramfenikol är en bakteriosta- tisk bredspektrumsubstans. Mjölksyrabakterier och det totala antalet aeroba bakterier räknades på M.R.S. (de Man, Rougosa, Sharpe; Oxoid, Unipath Ltd., Basingstoke, Hampshire, England) respektive platträkningsagar ("Tryptone" glukosjästagar; Oxoid, Unipath Ltd., Basingstoke, Hampshire, England), båda kompletterade med 0,1% "Delvocid®" (Gist-Brocades, Delft, Nederländerna).

"Delvocid" är en bredspektrumfungicid som innehåller natamycin som aktiv beståndsdel.

RESULTAT Infektionsförmåga hos Penicíllium roqueforti, Penicillium carneum och Penicillium paneum i korn, råg och vete I korn (sort Golf) ökade alla åtta mögelsvampisolaten iP. roqueforti-gruppen från inympningsnivån 5 x 103 till 4 x 105 CFU/g (Fíg. 4a). Det totala antalet av andra mögelsvampar än de som tillhörde den tillsatta P. Roqueforti-gruppen 10 20 30 513 894 20 minskade under inkubationsperioden från 1 x 103 till under detekteringsgrånsen.

J ästmängden låg under detekteringsgränsen på dag 0 liksom på dag 14. Mängden aeroba bakterier i korn var 1 x 107 CFU/g både vid starten och efter 14 dagars inkubation, oberoende av arten av tillsatt mögelsvamp. Mjölksyrabakterierna ökade i antal från under detekteringsgränsen, dvs. 102 CFU/g, till 8 x 103 CFU/g vid alla behandlingar. l råg (sort Motto) växte inte något av de åtta mögelsvampisolaten tillhöran- de P. roqueforti-gruppen (Fíg. 4b). Istället minskade det genomsnittliga antalet av mögelsvamp-CFU från ö x 103 CFU/g till 3 x 102 CFU/g mellan dag 0 och dag 14.

Det totala antalet av andra mögelsvampar än de som tillhörde den tillsatta P. roqueforti-gruppen minskade från 1 x 104 till under detekteringsgränsen. Jäst- mängden i proverna låg under detekteringsgränsen på dag 0 liksom på dag 14. De aeroba bakterierna i råg minskade från 1 x 107 till 2 x 105 oberoende av arten av tillsatt mögelsvamp. lVljölksyrab akterierna växte från under de tekteríngsnivån till 5 x 103 CFU/g. lvårvete sort Dragon (A) visade samtliga isolat dålig växt. Medelvärdet för CFU ökade från 4 x 104 till 7 x 104 per gram (Fig. 40). Antalet P. paneum och P. carneum ökade något men signifikant mera jämfört med isolat av P. roqueforti (P<0,01). Det totala antalet av andra mögelsvampar än de som tillhörde den tillsatta P. roqueforti-gruppen ökade från 2 x 102 till 3 x 108 CFU/g. Koncentratio- nen av jäst ökade under inkubationsperioden från 2 x 105 till 3 x 107 CFU/g. De aeroba bakterierna i vårvete ökade i antal från 1 x 107 till 4 x 107 under den 14 dagar långa ínkubationen. Mjölksyrabakterierna ökade från under detekterings- gränsen till 1 x 103 CPU/g. l höstvete (sort Kosack) ökade alla tre arterna tillhörande P. roqueforti- gruppen i antal till ca 5 x 105 CFU/g (Fig. 4d), fiån en detekterad inokulatnivå som sträckte sig från 2 x 103 till 9 x 104 CFU/g. Det totala antalet av andra mögelsvam- par ökade från under detekteringsgränsen till 4 x 105 CFU/g. Jästen i höstvete förblev på O-dagsnivån 8 x 104 CFU/g under hela ínkubationen. De aeroba bakteri- erna ökade i antal från 6 x 106 till 6 x 107 CFU/g under inkubatíonen, oberoende av arten av tillsatt mögelsvamp. Mjölksyrabakterierna ökade i antal från under detekteringsgränsen till 3 x 103 CFU/g. 10 15 20 'w 513 894 21 Växt av Penícillium roqueforti, Penícillium carneum och Penicillium paneum i olika sorter av korn och vårvete Korn För alla stammar av P. roqueforti, paneum och P. carneum ökade CFU- nivåerna signifikant (P<0,0Û1) i fodersorterna Baronesse och Kinnan, men ej i maltsorterna Maud och Mentor (Tabell 1). I sorterna Maud och Mentor ökade P. paneum och P. carneum till något högre CFU-värden än de som erhölls med P. roqueforti (Tabell 1).

Mängden aeroba bakterier på dag 0 var 1,8 x 106 CFU/g i sorten Baronesse, 4,6 x 105 CFU/g i Kinnan, 1,8 x 107 CFU/g i Maud och 3,7 x 106 CFU/g i Mentor.

Efter 14 dagars inkubation hade de aeroba bakterierna växt till 3,9 x 107 CFU/g i sorten Baronesse och till 4,7 x 106 CFU/g i sorten Kinnan. I maltsorterna Maud och Mentor fanns ej någon detekterbar växt av aeroba bakterier. I fodersorterna Baronesse och Kinnan växte de aeroba bakterierna signifikant mera i spannmål ympat med P. roqueforti än i spannmål ympat med P. paneum eller P. carneum (P<0,001, data visas ej). Antalet mjölksyrabakterier ökade till 103 CFU/g i kornsorten Kinnan i kombination med P. roqueforti men var ej detekterbart med de andra ympade Penicillium-arterna eller i de andra sorterna.

Den initiala mängden jäst var 1,5 x 104 CFU/g i korn, sorten Baronesse, 1,2 x 105 CFU/g i sorten Maud, 2,6 x 104 CFU/g i sorten Mentor och 5,5 x 103 CFU/g i sorten Kinnan. Antalet jästkolonibildande enheter ökade under försöket till 9 x 103 CFU/g i sorten Baronesse, 1,5 x 103 CFU/g i sorten Mentor och till mindre än 103 CFU/g i sorten Maud och i sorten Mentor.

Vårvete ' I vårvetesorterna Alve, Curry, Tjalve och Thasos ökade alla stammar av P. roqueforti, P. paneum och P. carneum från en inympad nivå av ca 104 CFU/g till 106 CFU/g under 14 dagar (P<0,001). I de två partierna av sorten Dragon (A och B) förelåg emellertid icke någon signífikant ökningi antalet CFU för något av de åtta testade svampisolaten (Tabell 2).

Aeroba bakterier ökade i vårvetesorterna från ca 104 till 107 CFU/g i sorgerna Alve och Tjalve och från 107 till 108 CFU/g i sorterna Curry, Dragon (parti A) och Thasos under den 14 dagar långa inkubationen, oberoende av arten av inympad mögelsvamp. Mjölksyrabakterierna växte under inkubationen i vårvetesorten Curry till 104 CFU/g men kunde ej påvisas i de andra sorterna. J äst 10 30 515 894 22 växte i vårvetesorten Dragon (parti A) till 6 x 103 CFU/g under inkubationen men kunde ej påvisas i de andra varieteterna.

Sex olika partier av vårvetesorten Dragon ympades till ca log 4,6 CFU/g med P. roqueforti J 5 for att utvärdera sortens resistens mot svampen under betingelser där lufttillforseln är begränsad. I parti A och F ökade P. roqueforti J 5 ej signifikant i CFU, medan en svagt signifikant (P<0,05) växt observerades i B och signifikant växt (P<0,01) i parti C. l motsats härtill erhölls en kraftigt signifikant (P<0,001) ökning av P. roqueforti Jö i parti D och E och i kontrollspannmålet höstvete sort Kosack (Tabell 3). l allmänhet skilde sig arterna tillhörande Penicillium roqueforti-gruppen, dvs. Penicillium roqueforti, Penicillium carneum och Penícilliumpaneum, ej åt vad gäller deras förmåga att växa i det testade cerealiespannmålet. Bland de testade cerealierna, dvs. korn (fyra sorter), råg, höstvete och vårvete (fem sorter), motstod endast rågsorten Motto och två partier av vårvetesorten Dragon infektion av Penicillium roquefortt-gruppen.

Frånvaron av allmänna skillnader i infektionsförmågä hos Penicíllium roqueforti, Penicillium carneum och Penicillium paneum i de testade cerealierna varken motsäger eller underbygger indelningen av Penicíllíum roqueforti i tre arter. Ej heller är det möjligt att förutsäga, med ledning av de presenterade resultaten, om en av arterna är huvudskadesvampen framför de Övriga vid lufttät lagring av spannmål med hög fukthalt.

Mikrofloran i spannmålen kan skydda mot invaderande svamp. Svamp kan reducera växten av andra svampar genom parasitism, antibios eller näringskon- kurrens. J ästen i alla testade kornsorter reducerades i antal under inkub ationspe- rioden. I vårvete var emellertid jästantalet, efter inkubationsperioden, högre i sorten Dragon än i andra sorter. Jästen kan ha bidragit till resistensen mot svampväxt i vårvetesorten Dragon. Bakterieinnehållet kan även inhibera svampin- vasion genom att forbruka näringsämnen eller avsönda antibiotiska substanser. l foderkornsorterna växte både aeroba bakterier och mögelsvamp väl, medan i maltsorterna det förelåg mindre växt av både aeroba bakterier och mögelsvamp.

Således inhiberade bakterieväxten ej mogelsvampväxten.

Sammanfattningsvis var kornsorterna Maud och Mentor, rågsorten Motto och två partier av vårvete, sort Dragon, resistenta mot Penicillium roquefortí- gruppen. Resistensen antas vara beroende av behandlingar både fore och efter skörd. Alla tre arterna i Penicillium roqueforti-gruppen, dvs. Penicillium carneum, 10 20 30 513 894 23 Penicillium paneum och Penicillium roqueforti, infekterade de testade cerealierna jämnt. Följaktligen kan alla tre arterna förstöra lufttätt lagrat spannmål med hög fukthalt. Valet av mindre känsliga sorter med inneboende resistens mot infektion av skadesvampar blir av stor betydelse för att tillförsäkra bättre mikrobiell kvalitet hos det slutliga fodret eller livsmedlet under det att användningen av jordbrukskemikalier minimeras.

III. Försök i pilotskala Petersson och Schnürer (1995) visade att den kraftiga inhibitoriska effekten av Pichia anomala på Penicillium roqueforti på agarplattor även var uppenbar på fuktiga vetekärnor, lagrade vid 25OC, även om detta är nära den optimala tempera- turen för denna mögelsvamp (Björnberg och Schnürer 1993). Antagonister, som verkar lovande under laboratoriebetingelser, uppträder emellertid ej med nödvän- dighet lika väl vid ett försök i större skala. Så exempelvis kan interaktioner variera, beroende på substrattyp eller andra míljöbetingelser (Magan och Lacey 1985). Som biokontrollmedel måste en mikroorganism konkurrera med andra svamp ar för att etablera en aktiv population iden nya miljön. Förmågan att snabbt bygga upp en population antas vara en förutsättning för att framgångsrikt konkurrera med skademikroorganismer eller -patogener.

I Sverige skördas cerealiespannmål vanligen vid en vattenhalt av 20-22%, motsvarande en vattenaktivitet av 0,9. Mögelsvampväxt i cerealiespannmål förhindras ofta genom högtemperaturtorkning, ehuru det är dyrbart och energikrä- vande i ett tempererat klimat. På gårdar, där cerealier får växa under användning av konventionella odlíngsmetoder, förbrukas ca 60% av den totala mängd bränsle som används vid växtodlingsoperationer i samband med högtemperaturtorkningen av spannmål (Pick m.fl., 1989). Lufttät lagring, som är en alternativ metod för att lagra foderspannmål, förutsätter perfekt tätning i kombination med de anaeroba betingelser som orsakas genom respiration av sj älva sp annmålet och de vidhäftan- de mikroorganismerna. Lufttät lagring kräver endast ca 2% av den energi som förbrukas vid högtemperaturtorkning (Pick m.fl., 1989). Emellertid kan luftläcka- ge under lufttät lagring lätt leda till en försämring av de betingelser som krävs för konservering. Ändringar i silöns inre temperatur (mestadels till följd av solstrål- ning) och atmosfariskt tryck, jämte en ökande gasvolym allteftersom silon töms, leder till luftrörelser genom reduceringsventilerna och perforationer i höljet eller genom uttagssystemet. 10 20 æl 515 894 24 I praktiken uttas spannmål ej varje dag från silona. Istället lagras större satser med full tillgång till luft under flera dagar. Åtgärder för att förhindra mögelsvampskada och mykotoxinproduktion skulle vara fördelaktiga även under denna korttidslagring.

För att utvärdera den praktiska potentialen av Pichia anomala som mögelsvamp-biokontrollmedel konstruerade vi en 0,2 m3 "silo i pilotskala" för lufttät lagring av fuktigt spannmål. Vete med hög fukthalt och med olika ympkon- centrationer av Pichia anomala och Penicillium roqueforti lagrades i silona och prover uttogs två gånger i veckan. Koncentrationerna av syre och koldioxid övervakades och spannmålens mikrobiella kvalitet följdes under 18 månaders lagring. Den mögelsvampundertryckande förmågan hos Pichía anomala under aerobisk lagring av vete, som hade avlägsnats från silona, utvärderades efter 10 och 12 månaders lufttät lagring. Även överlevnaden av Pichia anomala i vete med hög fukthalt utvärderades vid olika temperaturer under 15 månaders lufttät lagring.

Silon Silona innehöll vardera 0,21 m3 spannmål, motsvarande 160 kg. För att utjämna skillnaderna mellan inre och yttre lufttryck var varje silo försedd med en "lunga" och en Z-vägs reduceringsventil tillverkad av ett U-rör, fyllt med en vätska som ej frös. Med undantag av då spannmålet avlägsnades genom uttagsrören, kunde något läckage ej uppträda genom reduceringsventilen förrän trycket översteg #60 mm statiskt vattentryck. Denna tryckdifferens kunde ej byggas upp förrän "lungan" hade antingen fyllts med 14 liter luft eller 7 liter luft hade avdragits från den.

Gasanalysutrustning Koncentrationerna av C02 och 02 i silona mättes med en infraröd monitor (noggrannhet i (15%) respektive en galvanisk cell (noggrannhet i 1%) (GA 90, Geotechnical Instruments Limited, Leamington Spa, Warwickshire, England).

Tryckvariationer registrerades kontinuerligt med en differentialtryckmätare (modell 600D, Innovex, Hopkins, MN, USA) i en av silona. Temperaturen på vetet uppmättes vid varje provtagningstillfälle med en infraröd-termometer (modell C- 600, Linear Laboratories, Mountain View, Ca, USA). 10 20 25 30 513 894 25 Inhibitionsförsök J äst- och mögelsvampsporsuspensioner framställdes såsom beskrivits ovan.

Konventionellt odlat höstvete (sort Kosack) skördades vid en vattenhalt av 24% motsvarande en vattenaktivitet av 0,94. Vattenaktiviteten uppmättes vid 22-2400 med en "Aqua Lab CX-2" (Decagon Devices Inc., Pullman, Washington, USA).

Vattenaktiviteten i vetet uppmättes på prover efter 0, 8, 10 och 57 veckor.

Inympning Nyskördat vete spannmål ympades med Penicillium roqueforti-sporsuspensio- nen till ca 3 x 108 mögelsvampsporer per gram. Sporerna applicerades genom tillsats av suspensionen som droppar på spannmålet under omblandníng i en foderblandare for erhållande av en jämn sporfordelning i spannmålet. Jästen ympades på liknande sätt for erhållande av 0, 104 och 106 celler per gram vete. Vid kontrollbehandlingen tillsattes endast kranvatten. Samma volym av ymppreparat användes i samtliga försök. Silona fylldes med ca 160 kg av ympat vete och varje försök kördes i triplikat. Efter fórsegling placerades silona i ett skyddsrum utomhus, skyddat från regn och direkt solstrålning, under 13 månader.

Avsiktligt luftinsläpp Efter 54 veckors lagring öppnades silona för att uppnå en förhöjd syrekon- centration i silona. Först avlägsnades locken till uttagsrören (diameter 44 mm) och efter 3 dagar även anslutningarna till "lungorna" (diameter 8 mm) till dess syrekoncentrationen var ca 18% före stängning, dvs. 5 dagar. Koncentrationerna av C02 och 02 övervakades kontinuerligt, först i en silo med vete som ympats med 106 CFU av Pichia anomala per gram och därefter i en av silona med oympat spannmål. Mikrofloran analyserades en vecka efter stängning av silona.

Provtagning och kvantifiering av mikrobiell växt Provtagning från silona skedde initialt efter en månads lagring och därefter två gånger i veckan. Veteproverna, 1 kg vardera, avlägsnades genom uttagsrören.

Prover uttogs efter 5, 5,5, 6 och 8 veckor och därefter månadsvis. Efter omsorgsfull omblandning späddes alikvoter om ca 20 gram tiofaldigt med peptonvatten, blötlades under 0,5 tim och homogeniserades under 2 min vid normal hastighet i en "Stomacher 400" (Colworth, England). J ästväxten kvantifierades på MEA, kompletterad med 100 ppm kloramfenikol (C-0378 Sigma Chemical Co. St. Louis; 10 NJ O! 30 515 894 26 Mo, USA) (LNlEAC-plattor). För att undvika växtinhibition av antagonistisk jäst på agarplattor avsedda för mögelsvamp-CFU-räkning, användes MEACC (MEAC kompletterad med 10 ppm cykloheximid; C-7698 Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) för ytutstrykning av 0,1 ml-alikvoter. Cykloheximid vid 10 ppm inhibe- rar växten av Pichia anomala (Björnberg och Schnürer, 1993). Mjölksyrabakterier och det totala antalet aeroba bakterier räknades på MRS (Oxoid, Basingstoke, England) respektive platträkningsagar (Oxoid, Basingstoke, England), båda kompletterade med 0,1% "Delvocid®" (Gist-Brocades, Delft, Nederländerna).

"Delvocid" är en bredspektrumfungicid som innehåller natamycin som aktiv beståndsdel.

Aerob stabilitet efter lufttät långtidslagring av vete Efter 10 och 12 månaders lagring, förvarades 700 g spannmål från varje silo under 3 veckor vid 20OC i Erlenmeyer-kolvar, förseglade med bomull. Före provtagning omblandades spannmålen väl. Mikrobiell analys utfördes såsom beskrivits ovan. Växten av Penícillium roqueforti, Píchia anomala, aeroba bakteri- er och mjölksyrabakterier bestämdes frekvent under 3 veckor, såsom beskrivits OVan.

RESULTAT Miljöbetingelser Temperaturen hos det för provning avsedda vetet följde nåra ändringarna i den dagliga medeltemperaturen hos utomhusluften under försöket. Skillnader i lufttryck mellan gasen i silona och den yttre atmosfären var nära noll större delen av tiden. Trycket inuti silona var tillräckligt lågt för att få luften att röra sig in i silon genom reduceringsventilen vid endast sju tillfällen under de första två månaderna och vid ett tillfälle under vecka 28, 29, 44 respektive 46.

Vattenaktiviteten hos vetesp annmålet med hög fukthalt förblev mellan 0,93 och 0,94 under lagringsperioden (data visas ej).

Gasanalys Redan 5 timmar efter försegling kunde någon 02 ej detekteras i luften inuti silona, och koncentrationen av C02 ökade snabbt under den första försöksveckan.

Efter två månader hade koncentrationen av C02 ökat till sitt maximum, ca 70%, i samtliga silon. När temperaturen sjönk under noll minskade koncentrationen av 10 15 20 25 30 513 894 27 C02 i triplikaten och stabiliserades på en nivå mellan 50 och 60%. Under samma tid kunde syrekoncentrationer tid endast strax efter provtagning.

Mikrobiell växt Inympningen med Pichia anomala, avsedd att nå 104 och 106 CFU/g, resulterade i 4 x 104 CFU/g respektive 5 x 105 CFU/g. Vidare hade spannmålet 1 x 104 CFU/g av Pichia anomala som naturlig flora. Efter de första fem veckornas lagring, i tillslutna silon, hade jästen växt till 6 x 104 CFU/g i de oympade spann- målen, till 2 x 104 CFU/g i spannmål ympat med Penicillium roqueforti, till 4 x 105 CFU/g vid ympning med 1 x 104 CFU av Pichia anomala/g och till 9 x 105 CFU/g vid ympning med 5 x 105 CFU av Pichia anomala/g. Efter åtta veckors lagring var mängden av Pichia anomala vid de två ympbehandlingarna 4 x 106 CFU/g, medan de behandlingar där jäst ej inympades uppvisade 4 x 105 CFU/g spannmål. Efter 10 veckors lagring hade den inympade Pichia anomala vid båda behandlingarna växt till 7 x 106 CFU/g. Naturligt förekommande Pichia anomala hade växt från 1 x 104 CFU/g till ca 6 x 105 CFU/gi det oympade vetet. Denna skillnad kvarstod under vecka 20 till 35, dvs. januari till slutet av april. Under maj månad ökade jästen i det oympade spannmålet till samma nivå som i de ympade spannmålen, dvs. till nära 107 CFU/g.

Penicillium roqueforti inympades till 3 x 103 CFU/g i syfte att representera en ytterst hög kontamineringsnivå. Trots detta detekterades den inympade nivån av Penicillium roqueforti i vetet endast vid ett tillfälle under året. Den inympade mängden reducerades till detekteringsgränsen, dvs. 102 CFU/g, under de forsta fem veckorna i de slutna silona. Vidare påträffades, vid slutet av lagringsperioden, ca 102 CFU/g av Penicillium roqueforti. I spannmål, som ej hade ympats med vare sig Pichia anomala eller Penicillium roqueforti, återfanns endogen Penicillium roqueforti vid ett provtagningstillfalle, dvs. efter 36 veckors lagring.

Vid igångsättandet av försöket påträffades ca 102 CFU/ g av mjölksyrab akte- rier vid alla behandlingar, med undantag av oympade sådana. Efter upp till vecka 39 av lagringen påträffades <103 CFU/g i en av silona vid denna behandling. Vid sällsynta tillfällen påträffades mindre än 103 CFU/g mjölksyrabakterier vid de övriga behandlingarna i koncentrationer.

Initialt innehöll vetet 5 x 105 CFU/g av aeroba bakterier. Under de fem O! 10 20 NJ O! 30 513 894 28 veckorna av sluten lagring minskade mängden men den detekterades till 105 CFU/g vid den oympade behandlingen, till 106 CFU/g vid behandlingen med enbart Penicillium roqueforti och till 104 CFU/g vid båda behandlingarna med inympad Pichia anomala. Under veckorna 20 till 35 (januari till slutet av april) förblev mängden aeroba bakterier stabil, följt av en minskning i alla behandlingar runt vecka 40 (början av juni).

Mikrobiell stabilitet efter ett simulerat större luftläckage Under det simulerade luftläckaget efter 54 veckors lagring, ökade syrekon- centrationen i samtliga silon till ca 18% på fem dagar (data visas ej). När väl silon med vete, ymp at med 106 CFU Pichía anomala per gram, tillslöts förbrukades allt syre inom 20 timmar, medan det tog 46 timmar i det oympade spannmålet. En vecka efter det planlagda luftläckaget kunde någon ökning i Penicillium roqueforti- CFU ej påvisas i någon av behandlingarna.

Aerob stabilitet efter lufttät långtidslagring I vete, lagrat under lufttäta betingelser under 10 månader och därefter exponerat för luft, nådde inympat Penicillium roqueforti enbart 105 CFU/g efter 6 dagar, medan det tog 12 dagar att nå samma nivå i vete, ympat med 104 CFU/g, och 14 dagar i vete, ympat med 106 CFU/g av Pichia anomala (Fig. ö). Liknande resultat erhölls med vete efter 12 månaders luft-tät lagring. *ivävlcvkirícvkücicärkvëflcvkvkäckir**icieslrickakvkwëürírkkicvirvkvkvš-íricic* Våxt av Penicillium roqueforti, uppmätt som kolonibildande enheter (CFU), i vete med hög fukthalt inhiberades totalt under den lufttäta lagringen i silona.

När de lagrade spannmålen togs ut från silona och exponerades for luft, fórdröjdes växten av Penicillium roqueforti av inympad Pichia anomala på ett dosberoende sätt. Eftersom Penicíllíum roqueforzti växte när spannmålen exponerades för luft, kan den slutsatsen dras att åtminstone några av de inympade svampsporerna var viabla. Således inhiberades växten av Penicillium roqueforti i silona genom ogynnsamma betingelser. Förmodligen bidrog både atmosfären i silona och de höga nivåerna av Píchía anomala i spannmålen till undertryckandet av växten av Penicillium roqueforti. 10 20 30 513 894 29 Våra tidigare tester under användning av Pichia anomala som biokontroll- medel i spannmål har utförts med 1-2 år gammalt återfuktat spannmål. Förmodli- gen fmns det fysiologiska skillnader mellan nyskördat och återfuktat spannmål.

Men vid dessa försök i pilotskala var den antagonistiska effekten av Pichia anomala uppenbar även vid användning av nyskördat spannmål.

Vid exponering för luft förstördes spannmål, som hade lagrats lufttätt under 10-12 månader, snabbare när det ej tidigare hade ympats med Píchia anomala, trots den höga nivån av endogen Pichia anomala i spannmålet före ympning. I spannmål, som uttogs från silon efter 10 månader, fördröjde inympad Pichia anomala växten av inympad Penicillium roqueforti till 5 x 104 CFU/g med 6 dagar.

Under samma period ökade Pichia anornala ej i antal. Således är den antagonistis- ka aktiviteten av Pichia anomala ej strikt förknippad med detekterbar växt. lnhibition av växt av Aspergillus flauus genom Pichia guilliermondii i sojabönor är beroende av den antagonístiska jästens aktiva växt. Aspergillus flauus, som tillsattes när den extensiva jästväxten under de forsta 2-3 dagarna hade minskat, kunde konkurrera med jästen (Paster m.fl., 1993). Således påverkar en aktiv växt av Pichia guilliermondii, i motsats till Pichia anomala, mögelsvampinhibitionen.

Vid provrörsförsök med 18 g vete med hög fukthalt, begränsas växten av Penicillium roqueforti av Pichia anomala, inympad till 103 CFU/g, och inhiberas praktiskt taget totalt av 104 CFU/g under 14 dagars luftläckage (Petersson .och Schnürer, 1995). I föreliggande studie med silon, innehållande 160 kg vete, användes 104 CFU/gram och 105 CFU/gram för att bestämma den mängd av Pichia anomala som krävdes för att inhibera växten av Penicillium roqueforti under den 13 månader långa lagringen. Som jämförelse kan nämnas att andra antagonistiska jästsvamp ar ofta används i mycket höga koncentrationer vid försök, exempelvis 106 CFU/g eller till och med högre koncentrationer.

De konstruerade silona imiterade funktionen av lufttäta silon ifullskala och kunde lätt hanteras. Emellertid kan ogenomträngligheten för luft ha varit för stor i silona, jämfört med en fullskalesilo. När spannmål med en fukthalt av 23% lagras i en fullständigt sluten behållare, har nivåer av koldioxid upp till 95% uppmätts.

I praktiken ökar koncentrationen av koldioxid, på grund av ofullständig tätning etc., ofta endast till 15-25%. Vid detta försök stabiliserades koldioxidnivån i silona vid 50-60%. Det var ej så många luftläckage genom luftregulatorn som förväntat, förmodligen till följd av skyddet för direkt solstrålning i silona och kapaciteten hos 10 30 513 894 30 gummilungorna. Icke desto mindre öppnades silona två gånger i veckan under ca 1 minut varje gång. Dessa öppningstillfallen gav förmodligen ej upphov till några avsevärda mängder av gasutbyte men utjämnade trycket i silona till utsidans tryck. Inte ens det inkommande syret vid slutet av lagringen gav emellertid upphov till någon växt av Penicillium roqueforti. Systemet syntes vara robust i sin mögelsvampinhiberande förmåga, även vid mindre luftläckage.

Tabell 1 Växt och sporbildning, uppmätta som kolonibildande enheter (CFU) per gram av Penicillium roquefortí-komplexet, på olika sorter av korn (av, 0,96) inkuberade med begränsad lufttillförsel i glasrör vid 25°C under 14 dagar. V ärdena ges som logaritmer och representerar medelvärdena för tre rör. Den minsta signifikanta skillnaden (LSD) mellan dag 0 och dag 14 är 0,33 vid P<0,05 (*), 0,43 vid P<0,01 (**) och 0,55 vid P<0,001 (***).

Kornsort P. ro ue orti P. Qaneum P. carneum daa Jö J5A 18689 14088 13929 13321 14042 6889 Baronesse 0 4,6 4,3 4,4 4,2 4,3 4,2 4,5 4,6 14 5,3 5,3 5,5 5,7 5,5 5,5 5,8 5,9 kk* 72k* *ii 'käšk *kit *kk 72k* kk* Kinnan 0 4,5 4,4 4,2 4,4 4,4 4,2 4,5 4,3 14 5,8 5,8 6,3 6,1 5,5 5,9 6,1 6,1 716%* irš* *vkvï fit* *kärr *írvë kk* 'kvšiv lvlaud 0 4,5 4,4 4,5 4,4 4,5 4,4 4,4 4,4 14 4,4 4,3 4,4 4,2 5,0 5,0 4,9 4,7 sing. es? es es es ** *** ** es Mentod 0 4,3 4,3 4,2 4,3 4,2 4,5 4,6 4,4 14 5,0 4,2 4,4 4,5 5,1 4,8 4,9 4,9 sing. *** es es es *** es es ** Anm.: 1. "sing." indikerar signifikansnivå för ökningen i CFU mellan värden på dag 14 och dag 0 2. "ej" indikerar ej signifikant. 10 15 20 25 30 513 894 31 Tabell 2 Växt och sporbildning, uppmätta som kolonibildande enheter (CFU) per gram av Penicillium roqueforti-komplexet, på olika sorter av vårvete(aw 0,96) inkuberade med begränsad lufttillfórsel i glasrör vid 25°C under 14 dagar. "Dragon A" och "Dragon B" representerar oberoende prover av samma varietet. Värdena ges som logaritmer och representerar medelvärdena för tre rör. Den minsta signifikanta skillnaden (LSD) mellan dag 0 och dag 14 är 0,75 vid P<0,05 (*), 0,99 vid P<0,01 (**) och 1,27 vid P<0,00l (***).

Vårvete- P. ro ue orti P. Qaneum P. carneum sort dag J5 J 5A 18689 14088 13929 13321 14042 6889 Alve 0 3,9 4,4 4,6 4,4 3,5 4,2 4,4 4,3 14 6,7 6,7 6,9 6,9 6,2 6,3 6,6 6,8 *ink kit* *kk ink* *ink kit* vl-*k *ätit Curry 0 4,3 4,0 3,9 4,5 4,0 4,3 4,0 4,3 14 5,9 5,3 6,5 6,5 6,1 6,4 6,0 6,2 *kuk kit* kit* *iflš ink* *kick ink* 1696* Dragon A 0 4,6 4,5 4,5 4,5 4,3 4,3 5,0 4,5 14 4,8 4,3 4,9 4,2 4,8 5,2 5,1 5,0 sign. esz es es es es es es es Dragon B 0 4,3 4,3 3,8 4,6 4,0 4,8 4,0 4,3 14 3,8 4,2 3,8 4,2 3,6 4,0 3,7 3,9 sign. es es es es es es es es Thasos 0 3,8 4,0 8,9 3,9 4,0 4,0 4,0 4,3 14 6,2 5,6 6,1 5,6 6,0 6,4 6,1 5,9 Sign. **~k ~k*'k kßfi* kit* ink* ivk* 12k* *ink Tjalve ' o 4,3 4,7 4,0 4,0 4,3 4,3 4,2 4,0 14 6,0 6,5 6,5 6,8 5,7 6,3 6,4 6,0 ätit* 1216* *å-i' ätit* 121%* ink* *Skit kit* Anm.: 1. "singï" indikerar signifikansnivå för ökningen i CFU mellan värden på dag 14 och dag O 2. "ej" indikerar ej signifikant. 10 20 513 894 32 Tabell 3 'Vl'axt, uppmätt som kolonibíldande enheter (CFU) per gram, av Penicillium roquefortí J 5 på olika partier av vårvete (aw 0,96) sort Dragon och höstvete sort Kosack som kontroll, i glasrör vid 2500 under 14 dagar. Alla partier representerar oberoende prover av samma sort. Värdena ges som logaritmer och representerar medelvärdet for tre rör. Den statistiska signifikansen av skillnader i CFU-varden mellan dag 0 och 14 anges (n=8).

Dragon Detekterad P. roqueforti J 5 parti (medelvärde for log CFU/g) dag 0 dag 14 A 4,6 4,7” B 4,6 5,2* C 4,3 5,4” D 4,6 6,3*** E 4,6 5,8*** F 4,3 4,5* Kontroll: Kosack 4,6 6,6*** Anzn: l. "es" indikerar ej signifikant, * (P<0,05), ** (P<0,01) och *** (P<0,00l). 10 15 20 25 513 894 33 REFERENSER Barnett, J .A., Payne, R.W. och Yarrow, D., 1990. Yeasts: characteristics and identification. Cambridge University Press, Cambridge.

Bj Örnberg, A. och Schnürer J., 1993. Inhíbition of the growth of grain-storage molds in uitro by the yeast Pichia anomala (Hansen) Kurtzman. Can. J. Microbiol. 39: 623-628.

Boysen, M., Skouboe, P., Frisvad, J., och Rossen, L., 1996. Reclassification of the Penicillium roqueforti group into three species on the basis of molecular genetic and biochemical proñles. Microbiology, 142: 541-549.

Chalutz, E. 1990. Postharvest biocontrol of green and blue mould and sour rot of citrus fruit by Debaryomyces hansenii. Plant. Dís. 74: 134-137.

Droby, S., Chalutz, E., Wilson, C.L. och Wisniewski, M. 1989. Characteriza- tion of the biocontrol activity of Debaromyces hansenii in the control of Penicillium digitatum on grapefruít. Can. J, Microbiol. 35: 794-800.

Droby, S., Chalutz, E. och Wilson, C.L. 1991. Antagonistic microorganisms as biological control agents of postharvest diseases of fiuits and vegetables. Posthar- vest News and Information. Vol. 2, sid. 169-173.

Häggblom, P. 1990. Isolation of roquefortin C from feed grain. Appl. Environ.

Microbíol. 56: 2924-2926.

Kreger-van Rij, N.J.W. (Red.), 1984. The yeasts. A Taxonomic study. North- Holland Publishing Co., Amsterdam.

Kurtzman, C13., 1984. Synonomy of the yeast genera Hansenula and Pichia demonstrated through comparison of deoxyribonucleic acid relatedness. Antonie van Leeuwenhoek, 50: 209-217.

Lacey, J., och Magan, N. 1991. Fungi in cereal grains; their occurrence and water 10 20 513 894 34 and temperature relationships. In Cereal grain. Mycotoxins, fungi and quality in drying and storage. Edited by J. Chelkowski, Elsevier, Amsterdam. sid. 77-118.

Magan, N., och Lacey, J. 1984. Effects of gas composition and Water activity on growth ofñeld and storage fungi and their interactions. Trans. Br. Mycol. Soc. 82: 305-314..

McLauglin, R.J.,Wisniewski, M.E.,Wilson, C.L., och Chalutz, E. 1990. Effect of inoculum concentration and salt solutions on biological control of postharvest diseases of apple With Candida sp. Phytopathology, 80: 456-461.

Petersson, S. och Schnürer, J. 1995. Biocontrol of mold in high-moisture Wheat stored under airtight conditions by Pichia anomala, Pichia guillerimondii and Saccharomyces cereuisiae. Applied and Environmental Nlicrobiology, 6 1: 1027-1032.

Pitt, J.I., 1991. A laboratory guide to common Penicíllium species. CSIRO Food Research Laboratory, North Ryde, Australien.

Pitt, J.I. och Hocking, A.D., 1997. Fungi and Food Spoilage, second Edition.

Blackie Academic & Professional, London.

Samson, R.A., van Reenen-Hoekstra, E.S., Frisvad, J.C., och Filtenborg, O., 1995. Introduction to food-borne fungi. Centraalbureau voor Schimmelculture, Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences, Baarn, Nederlän- derna.

VVilson, C.L. och Chalutz, E. 1989. Postharvest biological control of Peniczlllium rots of citrus With antagonistic yeasts and bacteria. Sci. Hortic. (Amsterdam), 40: 105-112.

Wilson, C.L., och Wisniewski, M.E. 1989. Biologícal control of postharvest diseases of fruits and vegetables: an emerging technology. Annu. Rev. Phytop athol. 27: 425-441.

Claims (9)

1. 0 15 20 25 513 894 35 PATENTKRAV 1. Förfarande för tillförlitlig lufttät lagring och konservering av fuktigt spannmål, kännetecknat av kombinationen att som spannmål använda en spannmålssort, som motstår infektion av lagerskadesvampar, och att utföra lagringen i närvaro av en antifungalt effektiv mängd av ett biokontrollmedel med förmåga att undertrycka eller inhibera lagerskadesvampar samtidigt som det förstärker effekten av att använda en spannmålssort som motstår infektion av dylika svampar.

2. F örfarandet enligt krav 1, kännetecknat därav, att den använda spann- målssorten är avsedd för användning som djurfoder. 8, Förfarandet enligt krav 2, känneteoknat därav, att den använda spann- målssorten är en cerealíespannmålssort. 4. Förfarandet enligt krav 3, kännetecknat därav, att cerealiesp annmålssor- ten är vald från vete, råg, korn, havre, rågvete, majs, sorghum, hirs och ris. 5. Förfarandet enligt krav 4, kännetecknat därav, att den använda cerealie- spannmålssorten är råg sort Motto, vårvete sort Dragon eller korn sort Maud eller sort Mentor. 6. F örfarandet enligt något av kraven 1-5, kännetecknat därav, att biokon- trollmedlet är ett Pichia anomala-isolat med förmåga att undertrycka eller inhibera lagerskadesvampar samtidigt som det förstärker effekten av att använda en spannmålssort som motstår infektion av dylika svampar. 7. Förfarandet enligt krav 6, kännetecknat därav, att Pichia anomala- isolatet är Pichia anomala J 121, som har deponerats hos Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) under depositionsnummer CBS 100487, Pichia anomala J 281 eller Pichia anomala CBS 5759. 8. Förfarandet enligt något av kraven 1-7, kännetecknat därav, att lagerska- desvamparna tillhör gruppen Penicillium-arter. 10 20 513 894 36 9. Förfarandet enligt krav 8, kännetecknat därav, att PenicilZium-arterna är Penicillium roqueforti, Penicíllium carneum, Penícilliumpanum och Penicillium UCFTLLCOSLLITI. 10. Förfarandet enligt något av kraven 1-9, kännetecknat därav, att närvaron av biokontrollmedlet är en följd av dess naturliga förekomst i sp annmålet och/eller är en folj d av applicering på spannmålet av en biokontrollkomposition som innehåller biokontrollmedlet. 11. Förfarandet enligt krav 10, kännetecknat därav, att biokontrollkomposi- tionen är i flytande, halvflytande eller fast form. 12. Förfarandet enligt krav 10 eller krav 11, kännetecknat därav, att biokon- trollkompositionen innefattar, förutom biokontrollmedlet, ett eller flera additiv valda från flytande eller fasta bärare och utspädningsmedel, ytaktiva medel, dispergerme del, näringsämnen, tillväxtfaktorer och antioxidanter och blandningar därav. 1

3. Förfarandet enligt något av kraven 10-12, kännetecknat därav, att appliceringen av biokontrollkompositionen åstadkoms genom blandning, pudring, injektion, gnidning, sprutning eller borstning, droppning eller valsning. 1

4. Biokontrollkomposition for användning vid forfarandet enligt något av kraven 1- 13, kännetecknad därav, att den innefattar minst ett biokontrollmedel som undertrycker eller inhiberar lagerskadesvampar. 1

5. Kompositionen enligt krav 14, kännetecknad därav, att den äri flytande, halvflytande eller fast form. 1

6. Kompositionen enligt krav 14 eller 15, kännetecknad därav, att den dessutom innefattar ett additiv, som är valt från flytande eller fasta bärare och utspädningsmedel, ytaktiva medel, dispergermedel, näringsämnen, tillväxtfaktorer och antioxidanter och blandningar därav. 1

7. Kompositionen enligt något av kraven 14-16, kännetecknad därav, att den 10 513 894 37 innehåller minst en jäststam som biokontrollmedel som är antagonistisk mot lagerskadesvampar. 1

8. Komposítionen enligt krav 17, kännetecknad därav, att jäststammen är ett Pichia anomala-isolat med förmåga att undertrycka eller inhibera lagerskade- svampar samtidigt som det förstärker effekten av att använda en spannmålssort som motstår infektion av dylika svampar. 1

9. Komposítionen enligt krav 18, kännetecknad därav, att Pichia anomala- isolatet är valt från den grupp som består av Pichia anomala-stam J 121, deponerad hos Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), Baarn, Nederländerna, under deposítionsnummer CBS 100487, Pichia anomala-stam J 281 och Pichia anomala- stam CBS 5759.