CN108077411A - 解淀粉芽孢杆菌y-3生物保鲜剂的制备方法及其使用方法 - Google Patents
解淀粉芽孢杆菌y-3生物保鲜剂的制备方法及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌新菌株Y‑3和解淀粉芽孢杆菌Y‑3生物保鲜剂的制备方法及其使用方法，S1、分离出解淀粉芽孢杆菌Y‑3；S2、拮抗细菌活化；S3、接种至NB发酵液中，其抗逆性芽孢率达90％以上后终止发酵；S4、将膨润土粉碎使其细度小于或等于44μm，高温高压灭菌；S5、将接种解淀粉芽孢杆菌Y‑3培养的NB发酵液、膨润土、PEG8000、净洗剂、羧甲基纤维素钠混合，经冷冻干燥后，粉碎使其细度小于或等于44μm，制得生物保鲜可湿性粉剂。使用时，将淀粉芽孢杆菌Y‑3生物保鲜剂加水稀释，采用喷雾或浸泡方式对采后的番茄进行处理。本发明为市场使用带来便利，方便跨地域运输及贮藏。
Description
技术领域
本发明涉及农业病虫害防治技术领域，具体地说涉及一株对番茄采后早疫病原和番灰霉病原具有良好抑制效果的解淀粉芽孢杆菌新菌株Y-3和一种解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的制备方法及其使用方法。
背景技术
番茄(Tomato)因其营养价值高、产量高、需求量大，种植面积不断扩大，但由于皮薄、肉嫩，不耐贮运，使其在采后到餐桌的“最后一公里”易发生腐烂，其病因主要包括生理性致病和病原物致病，其中以病原物致病引起的果实腐烂较为常见。目前经研究发现番茄采后病原主要包括葡萄孢菌属(Botrytis spp.)、链格孢菌属(Allternana spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、青霉菌属(Penicillum spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)和镰刀菌属(Fusarium spp.)等[3]，其中以B.cinerea和A.solani引起的腐烂问题较为常见，严重影响了其货架期、贮藏时间和商品价值，给番茄市场造成了巨大经济损失。
灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和茄链格孢菌(Allternana solani)作为番茄采后葡萄孢菌属和链格孢菌属的2种典型病原，不仅分布广泛、易传染、可侵染危害多种植物，而且还可二次侵染，加重病害流行，造成果实腐烂，对番茄采后贮藏和品质保障具有严重影响。另外，两种病原不仅潜伏侵染优势明显，结果盛期危害严重，在低温(5℃)下均可生长，而且分生孢子较为顽固，低温环境下仍可萌发，给采后病害爆发埋下隐患，因此采后灰葡萄孢和链格孢属真菌病害防治对番茄采后贮藏保鲜及品质和商品价值 保障具有重要意义。
目前国内外为有效控制番茄采后病害发生，已从物理防治、化学防治以及生物防治等方面进行了研究，如：童志丹等从番茄果实中分离筛选到1株对番茄采后早疫病菌具有较好抑制作用的内生细菌，贮藏期间病害防效可达40％左右；张娜娜等研究发现4000μg/mL肉桂醛处理能够有效地控制番茄采后灰霉病的发生及延长其保鲜期；段军娜等研究发现皮尔瑞俄类芽胞杆菌BC-39对番茄灰霉病的防治及番茄的采后保鲜具有良好效果；刘零怡等研究发现低浓度一氧化氮供体硝普钠(0.02mmol/L)能提高采后番茄果实抵抗灰霉病菌的侵染能力；习柳等研究发现酵母拮抗菌与碳酸氢钠配合可有效防治番茄采后贮藏期间的灰霉病害和绵腐病害；周防震等研究发现辣椒果实表面的2株拮抗酵母可有效降低番茄早已病原引起的腐烂率，且不影响番茄品质；MomeinH.El-Katatny等研究发现木霉孢子和悬浮液均可有效防治链格孢菌引起的番茄采后腐烂；Beifang等研究发现一氧化氮和过氧化氢可以提高采后番茄对黑根霉病菌的抗性；Arah,IsaacKojo等研究发现通过对采前和采后干预可有效提高番茄采后的保鲜效果；Paul,Vijay等研究发现1-methylcyclopropene(1-MCP)有助于番茄采后保鲜效果，延缓贮藏期间病害发生；Scott等研究发现低强度紫外照射和高强度脉冲对番茄采后保鲜及病害控制具有良好效果；孙昊等研究发现纳他霉素、脱氢乙酸钠和山梨酸钾轮换或混配使用，对防治番茄采后灰霉病具有显著效果。
虽然目前番茄采后病害的物理防治、化学防治以及生物防治已有相关报道，但市场应用中仍以物理防治、低温贮藏和化学杀菌剂联合应用为主，且生物防治虽有所报道，但多是集中在拮抗微生物筛选和菌株自身活性测 定，而有关相应生物保鲜剂的开发及应用却鲜有报道，特别是番茄微生物源生物保鲜剂的开发及应用还未见相关报道。另外，尽管化学杀菌剂在番茄采后病害防治中效果明显，但长期使用造成的病原菌抗药性问题、药剂残留对食品安全以及低温贮藏中冷害和高投入问题仍不可忽视。
发明内容
针对上述现有技术的缺陷，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的制备方法及其使用方法，以实验室前期获得的拮抗细菌为筛选源，从中筛选出对灰葡萄孢和茄链格孢菌都具有较好抑菌作用的拮抗细菌，并重点对其制剂制备和防病保鲜技术进行研究，以期为番茄采后贮运保鲜过程中该类病害控制提供一套安全、高效保鲜技术，为番茄采后商品价值保障保驾护航。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)新菌株Y-3，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y-3已于2017年5月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通为生物中心进行专利保藏，登记入册编号(CGMCC NO.)为：14113。其植物病害防治特性：
(1)解淀粉芽孢杆菌Y-3发酵液对番茄采后早疫病原和番茄灰霉病原具有良好的离体和活体抑菌效果。
(2)解淀粉芽孢杆菌Y-3在离体平板上对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌效果可达97.47％和88.48％，其抑菌活性同目前报道的相关菌株相比具有明显的活性优势。
(3)解淀粉芽孢杆菌Y-3在番茄活体上对番茄灰霉病菌和番茄早疫病 菌的抑菌率仍可达94.86％和64.01％，其中对采后番茄灰霉病原抑菌活性同离体相比下降不明显，在番茄采后灰霉病害防治中优势明显。
(4)解淀粉芽孢杆菌Y-3加工成制剂后，具有良好的贮藏稳定性，且稀释300倍后对番茄采后早疫病原和灰霉病原仍具有76.96％和86.0％的抑菌活性，对2种番茄采后病原的抑菌优势明显。
(5)成熟番茄经解淀粉芽孢杆菌Y-3可湿性粉剂300稀释液浸泡20min后，其20℃贮藏18d的腐烂率同对照相比可下降59.43％，降低番茄常温贮藏腐烂率效果明显。
一种解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的制备方法，该制备方法的步骤是：
S1、从梓树叶片分离出解淀粉芽孢杆菌Y-3，于-80℃的环境下保存；
S2、拮抗细菌活化：取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌Y-320μL采用涂布法涂布于新鲜NA平板，并于26℃恒温活化培养24h后用于后续试验；
S3、采用接种环取活化后的解淀粉芽孢杆菌Y-31环，接种至新鲜NB发酵液中，于160r/min、28℃发酵培养5d，使其抗逆性芽孢率达90％以上后终止发酵，用于可湿性粉剂制备；
S4、将膨润土经粉碎机粉碎使其细度小于或等于44μm，装于250mL磨口广口瓶后于高温高压灭菌锅灭菌30min，并置于50℃烘箱中烘干备用；
S5、将接种解淀粉芽孢杆菌Y-3培养的NB发酵液、膨润土、PEG8000(聚乙二醇8000)、净洗剂、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)混合，经45℃真空干燥后，于粉碎机中粉碎使其细度小于或等于44μm，制得生物保鲜可湿性粉剂；接种解淀粉芽孢杆菌Y-3培养的NB发酵液、膨润土、PEG8000、 净洗剂、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的质量比为70：10：2.4：3.6：2。
作为对上述技术方案的改进，所述NA平板由牛肉浸膏、蛋白胨，氯化钠、琼脂与蒸馏水搅拌后制备而成，所述牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水的质量比为3：10：5：18：1000，该NA平板的pH值为7.0。
作为对上述技术方案的改进，NB发酵液由牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、蒸馏水制备而成，所述牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、蒸馏水的质量比为3：10：5：1000，该NB发酵液的pH值为7.0。
本发明并提供了该解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的使用方法，该使用方法的步骤是：
S6、将淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂加水稀释至300倍，
S7、在20℃自然贮藏条件下，采用喷雾或浸泡方式对采后的番茄进行处理。
作为对上述技术方案的改进，所述浸泡时间为20min。
与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：筛选到一株对灰葡萄孢菌和茄链格孢菌具有良好抑菌效果的解淀粉芽孢杆菌新菌株Y-3；制剂化作为拮抗微生物走向市场应用的关键环节，本发明的解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的制备方法，一方面可为市场使用带来便利，另一方面方便跨地域运输及贮藏。本发明以采后病害防治为研究点，拓展了拮抗微生物的应用范围，为采后拮抗微生物开发提供参考依据的同时，还为番茄采前和采后病害生物防治提供了新制剂。
另外，本发明还以解淀粉芽孢杆菌新菌株Y-3对番茄采后防病保鲜应用为出发点进行综述，一方面为该类菌株制剂化开发及应用提供参考依据， 另一方面还可为番茄采后贮运保鲜过程中该类病害控制提供一套安全、高效保鲜技术，为番茄采后商品价值保障保驾护航。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)新菌株Y-3，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Y-3已于2017年5月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通为生物中心进行专利保藏，登记入册编号(CGMCC NO.)为：14113。其植物病害防治特性：
(1)解淀粉芽孢杆菌Y-3发酵液对番茄采后早疫病原和番茄灰霉病原具有良好的离体和活体抑菌效果。
(2)解淀粉芽孢杆菌Y-3在离体平板上对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌效果可达97.47％和88.48％，其抑菌活性同目前报道的相关菌株相比具有明显的活性优势。
(3)解淀粉芽孢杆菌Y-3在番茄活体上对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌率仍可达94.86％和64.01％，其中对采后番茄灰霉病原抑菌活性同离体相比下降不明显，在番茄采后灰霉病害防治中优势明显。
(4)解淀粉芽孢杆菌Y-3加工成制剂后，具有良好的贮藏稳定性，且稀释300倍后对番茄采后早疫病原和灰霉病原仍具有76.96％和86.0％的抑 菌活性，对2种番茄采后病原的抑菌优势明显。
(5)成熟番茄采后解淀粉芽孢杆菌Y-3可湿性粉剂300稀释液浸泡20min后，其20℃贮藏20d的腐烂率同对照相比可下降59.43％，降低番茄常温贮藏腐烂率效果明显。
本发明的解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的制备方法，其步骤是：
S1、从梓树叶片分离出解淀粉芽孢杆菌Y-3，于-80℃的环境下保存；
S2、拮抗细菌活化：取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌Y-320μL采用涂布法涂布于新鲜NA平板，并于26℃恒温活化培养24h后用于后续试验；
S3、采用接种环取活化后的解淀粉芽孢杆菌Y-31环，接种至新鲜NB发酵液中，于160r/min、28℃发酵培养5d，使其抗逆性芽孢率达90％以上后终止发酵，用于可湿性粉剂制备；
S4、将膨润土经粉碎机粉碎使其细度小于或等于44μm，装于250mL磨口广口瓶后于高温高压灭菌锅灭菌30min，并置于50℃烘箱中烘干备用；
S5、将接种解淀粉芽孢杆菌Y-3培养的NB发酵液、膨润土、PEG8000(聚乙二醇8000)、净洗剂、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)混合，经45℃真空干燥后，于粉碎机中粉碎使其细度小于或等于44μm，制得生物保鲜可湿性粉剂；接种解淀粉芽孢杆菌Y-3培养的NB发酵液、膨润土、PEG8000、净洗剂、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的质量比为70：10：2.4：3.6：2。
所述NA平板由牛肉浸膏、蛋白胨，氯化钠、琼脂与蒸馏水搅拌后制备而成，所述牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水的质量比为3：10：5：18：1000，该NA平板的pH值为7.0。
NB发酵液由牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、蒸馏水制备而成，所述牛肉 浸膏、蛋白胨、氯化钠、蒸馏水的质量比为3：10：5：1000，该NB发酵液的pH值为7.0。
本发明并提供了该解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的使用方法，该使用方法的步骤是：
S6、将淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂加水稀释至300倍，
S7、在20℃自然贮藏条件下，采用喷雾和浸泡方式对采后的番茄进行处理。
所述浸泡时间为20min。
制剂化作为拮抗微生物走向市场应用的关键环节，本发明的解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的制备方法，一方面可为市场使用带来便利，另一方面方便跨地域运输及贮藏。本发明以采后病害防治为研究点，拓展了拮抗微生物的应用范围，为采后拮抗微生物开发提供参考依据的同时，还为番茄采前和采后病害生物防治提供了新制剂。
另外，本发明还以解淀粉芽孢杆菌新菌株Y-3的番茄采后防病保鲜应用为出发点进行综述，其制剂的制备方法及其使用方法，一方面为该类菌株制剂化开发提供参考依据，另一方面还可为番茄采后贮运保鲜过程中该类病害控制提供一套安全、高效保鲜技术，为番茄采后商品价值保障保驾护航。
具体的过程是这样的：
1.材料与方法
1.1供试菌株
拮抗细菌：解淀粉芽孢杆菌Y-3(由课题组成员分离自梓树叶片，于山 西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所采后病理实验室保存)。
植物病原真菌：番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和番茄早疫病菌(Allternanasolani)，均有山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所采后病理实验室从采后番茄果实中分离、纯化、ITS序列鉴定、保存与提供。
1.2供试培养基及主要试剂
1.2.1供试培养基
NA培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，pH值7.0，蒸馏水1000mL。
NB培养液：牛肉浸膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH值7.0，蒸馏水1000mL。
PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂18g，pH自然，蒸馏水1000mL。
1.2.2主要试剂
载体：高岭土、硅藻土、膨润土、玉米粉、食用麦麸、木屑、滑石粉、白炭黑。
助剂：木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、拉开粉BX、净洗剂LS、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇8000、羧甲基纤维素钠、扩散剂MF、十二烷基硫酸钠、CF-200、LT-WP60。
稳定剂：羧甲基纤维素钠、碳酸钙、磷酸钾、磷酸氢二钾。
1.3菌株活化
(1)拮抗细菌活化：取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌Y-320μL采用涂布法涂布于新鲜NA平板，并于26℃恒温活化培养24h后用于后续试 验。
(2)植物病原真菌活化：采用直径为5mm的打孔器从4℃冰箱保存的平板病原真菌中，打取直径为5mm的病原真菌菌块，接种至新鲜的PDA平板上后置于26℃电热恒温培养箱中活化培养7d后用于后续试验。
1.4解淀粉芽孢杆菌Y-3对番茄采后病害的抑制作用及分类地位研究
以番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌为靶标，采用平板对峙法[19]对解淀粉芽孢杆菌Y-3的抑菌效果进行测定。
利用形态学鉴定、生理生化特性以及16S RNA基因序列分析相结合的方法对拮抗细菌的分类地位进行确定。
1.5解淀粉芽孢杆菌Y-3发酵培养和抗逆性芽孢制备
采用接种环取活化后的解淀粉芽孢杆菌Y-31环，接种至新鲜NB发酵液中，于160r/min、28℃发酵培养5d，使其抗逆性芽孢率达90％以上后终止发酵，用于可湿性粉剂制备。
1.6解淀粉芽孢杆菌Y-3番茄采后病害防治效果测定
选取大小和成熟度相近的番茄果实采用伤口接种法，测定解淀粉芽孢杆菌Y-3发酵液对B.cinerea和A.solani 2种病原的活体抑菌效果，每处理3颗果实，各试验均重复3次。流程如下：(1)表面消毒：75％乙醇浸泡45s，3％次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸擦干后用于后续试验；(2)伤口制备：采用直径为5mm的打孔器在番茄表面轻轻打孔直径为5mm的孔洞，且防止表皮开裂；(3)解淀粉芽孢杆菌Y-3发酵液和病原真菌接种：制备好伤口后采用移液器吸取120μL发酵液，接种至果实伤口，以空白无菌发酵液为对照，待液体被果实完全吸收后，采用接种针挑 取直径为5mm的病原真菌菌块，并接种至果实伤口；(4)培养：接种完毕后，将各果实置于经紫外杀菌后的分格泡沫盒中，并在空格处倒入50mL无菌水用于保湿。最后使用保鲜膜密闭后置于26℃恒温培养箱中培养7d后测定病斑面积，并计算防效。
病斑面积(cm2)＝πR2(R：果实表面病斑半径cm)
防效％＝(对照病斑面积-处理病斑面积)×100/对照病斑面积
1.7解淀粉芽孢杆菌Y-3番茄生物保鲜剂的开发
参照中华人民共和国行业标准NY/T2293.1-2012《细菌微生物农药枯草芽孢杆菌第1部分：枯草芽孢杆菌母药》对拮抗细菌的母药进行制备和生物保鲜剂可湿性粉剂制备。
1.7.1载体前处理
试验开始前各载体均经粉碎机粉碎使其细度小于或等于44μm，分装于250mL磨口广口瓶后于高温高压灭菌锅灭菌30min，并置于50℃烘箱中烘干备用。
1.7.2载体吸附特性测定及最佳载体筛选
载体吸附性测定：分别称取各类灭菌载体10g，置于90mm培养皿中后，加入细菌发酵液(每次1mL)，使载体湿润并保持疏松不结块，直至加入最后一滴时载体呈现稀糊状为止，此时已加入的发酵液体积即为各载体的最大吸附量，通过比较吸附量来确定各载体的吸附特性。
最佳载体筛选：依据各载体吸附性能，将发酵液和各类载体按相应比例混合制成母液，置于45℃真空干燥箱中烘干，经粉碎后细度小于或等于44μm，制成初始制剂(母药)。随后参照中华人民共和国行业标准《细菌微 生物农药枯草芽孢杆菌第1部分：枯草芽孢杆菌母药》(NY/T2293.1-2012)对各母药的质量性状进行测定，并筛选出质量性状较好的载体作为解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂载体。润湿时间测定参照GB/T5451-2001，悬浮率测定参照GB/T14825-2006。
1.7.3润湿剂、分散剂以及最佳配比和用量筛选
(1)最佳润湿剂和分散剂筛选：按照10％的添加量将各润湿剂和分散剂分别加入到以最佳载体制备好的母药中，经真风干燥箱45℃烘干后粉碎，并对其润湿时间和悬浮特性进行测定，以筛选出最佳润湿剂和分散剂。
(2)最佳配比筛选：参照李舒雯等[20]方法对润湿剂和分散剂的最佳配比进行筛选。
(3)最佳用量筛选：将分散剂和润湿剂以最佳配比按照2％、4％、6％、8％、10％的用量添加到母药中，经粉碎后，对制剂的润湿时间、悬浮特性和芽孢含量进行测定，以筛选出上述指标较好的用量作为助剂最佳添加量。
1.7.4稳定剂筛选
在上述最佳配方，以2％的用量分别加入CMC-Na、碳酸钙、磷酸钾和磷酸氢二钾等稳定剂，经粉碎，过筛后对其润湿时间、悬浮特性、初始活菌数以及贮藏30d后的活菌数进行测定，以贮藏30d后活菌数下降最少为最佳稳定剂。
1.7.5解淀粉芽孢杆菌Y-3可湿性粉剂的制备
将筛选出的最佳载体、润湿剂、分散剂和发酵液按照筛选出的最佳比例混合，经45℃真空干燥后，于粉碎机中粉碎使其细度小于或等于44μm，制得生物保鲜可湿性粉剂。随后对制剂进行分装，每袋净重10g，并于阴 凉干燥处保存，用于后续试验。
1.8解淀粉芽孢杆菌Y-3番茄生物保鲜剂病害防治效果评价
为确定解淀粉芽孢杆菌Y-3进行制剂加工后对番茄采后番茄灰霉病害和番茄早疫病害的防治效果和生物保鲜剂的稀释倍数，选取大小和成熟度相近番茄果实，采用打孔接种法，对不同稀释倍数下生物保鲜剂对番茄采后病害的防治效果进行测定，具体步骤如下：①表面消毒：番茄果实经3％NaClO和75％乙醇分别浸泡5min后使用无菌水清洗3次，无菌滤纸擦干表面后用于后续试验；②伤口制备：使用直径为5mm的打孔器，在番茄表面打取直径为5mm的小孔，用于接种番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌以及解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂；③生物保鲜剂稀释：采用无菌水对生物保鲜剂分别稀释0倍、100倍、300倍、500倍和800倍，以等量不含解淀粉芽孢杆菌Y-3的空白制剂作为对照；④接种：分别吸取不同稀释倍数下的生物保鲜剂稀释液120μL加入到直径为5mm的孔隙中，待其液体渗透完全后，采用接种针将直径为5mm的番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌菌饼接种至孔隙中；⑤培养：在接种完毕后置于无菌托盘中，放入沾有无菌水的无菌脱脂进行保湿，并用保鲜膜封闭于25℃下避光培养7d后，参照zheng等[21]的方法计算不同稀释倍数生物保鲜剂的防病效果。
1.9解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂在番茄采后保鲜中的应用效果评价
2017年7月4日于山西省太谷县任村乡郝村番茄种植区，采收200公斤成熟西红柿，品种为欧宝3号，且挑选果面完好无损的西红柿用于番茄贮藏试验。试验设计：共设计清水对照和生物保鲜剂300倍稀释液2个药 剂处理以及浸泡(15min)和喷雾(以果面不形成水滴落下为宜)2种处理方式，共计4个处理。每处理10公斤，重复4次。试验处理结束后置于20℃贮藏保鲜库中进行贮藏保鲜试验，每隔1天对各处理下的烂果数进行统计，并计算烂果率。
2.结果与分析
2.1解淀粉芽孢杆菌Y-3对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的平板拮抗效果
采用平板对峙法对解淀粉芽孢杆菌Y-3对番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌的抑菌活性进行测定后，发现该菌株对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌具有较好的抑菌活性，抑菌率分别为97.47％和88.48％，说明该菌株在番茄灰霉病害和番茄早疫病害防治具有较好的应用潜力。
解淀粉芽孢杆菌Y-3对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌效果
2.2解淀粉芽孢杆菌Y-3的形态学、生理生化特性及16S rRNA序列鉴定(1)形态特征
采用NA固体培养基对解淀粉芽孢杆菌Y-3形态特征进行观察后发现，该菌株颜色为米白色，表面干燥、褶皱，挑取时表面有层较薄皮层，但内部湿润。边缘锯齿状不整齐，且有扇叶状表型；经NB液体培养基静置培养后培养液表面可形成一层菌膜。
(2)生理生化特性
生理生化试验结果表明：解淀粉芽孢杆菌Y-3具有可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖和果糖，水解淀粉，利用葡萄糖产酸，接触酶反应阳性，兼性厌氧，生长温度范围15-45℃和具有一定耐盐特性，可在6.0％NaCl培养基中生长等生理生化特性。参照依据《Bergey’s manual ofdeterminative Bacteriology》、东秀珠编著的《常见细菌***鉴定手册》和文献(拮抗辣椒疫霉菌海洋细菌菌株SH-27的筛选鉴定及其防病促生作用)，发现解淀粉芽孢杆菌Y-3与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的生理生化特性基本相似。
解淀粉芽孢杆菌Y-3生理生化特性
注：+：表示呈阳性反应；–：表示呈阴性反应.
(3)16S rRNA序列分析
将解淀粉芽孢杆菌Y-316S rRNA基因序列在EzBioCloud数据库中同模式菌株16SrRNA序列进行比对后发现该菌株同Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarumstr.FZB42(NC_009725.1)相似比最高，为99％。
选取序列相似比较高的不同芽孢杆菌16S rRNA，采用MEGA5.0软件对相关序列进行进行比对后，构建NJ***发育树，结果发现解淀粉芽孢杆菌Y-3同Bacillusamyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42菌株聚类在同一支，进一步说明2菌株具有较高的同源性，因此综合形态特征、生理生化特性以及16S rRNA序列分析结果，可将拮抗细菌Y-3鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
解淀粉芽孢杆菌Y-3发酵液对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的活体抑菌效果
2.4解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂制备
2.4.1不同吸附载体对制剂特性的影响
不同载体由于其自身的特性差异，在加工成制剂后会对制剂特性产生一定影响：在载体吸附特性方面木屑效果最好、麦麸次之，白炭黑最差；在润湿时间方面：加工成制剂后除滑石粉和高岭土超过20s外，其余载体的润湿时间均低于20s，说明各类载体都具有较好的润湿特性，且差异较小；同润湿时间相比，各载体在悬浮率方面则差异较大，其中以膨润土和滑石粉的悬浮特性较好均在80％以上，而其他载体的悬浮率均低于60％，明显低于国标规定的70％；芽孢含量作为评价制剂质量最有效指标之一，和制 剂药效直接相关：各载体加工成制剂后对解淀粉芽孢杆菌Y-3的存活率具有一定影响，其中以膨润土和木屑存活率较高，均在1.6×108cfu/g以上，其次为高岭土、硅藻土、玉米粉和麦麸，均在1.5×108cfu/g以上，白炭黑存活率最低贮藏7d后活菌数仅为1.28×108cfu/g。说明膨润土作为载体不仅可有效保障制剂的悬浮特性和润湿时间，而且还可较好的保持菌株存活率，可作为解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的加工载体。
不同载体对制剂特性的影响
2.4.2不同助剂类型对解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂特性的影响
对不同类型助剂对解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的特性影响进行研究后发现，不同助剂类型之间效果差异显著。添加助剂后对制剂的润湿时间、悬浮率和活菌数都有显著影响，其中润湿时间普遍出现增加现象，以净洗剂LS润湿时间最长，PEG-8000最短，分别为186.44s和20.13s。虽然净洗剂LS延长了制剂的润湿时间，但却可有效提高制剂悬浮率，悬浮率可达77.44％，在各试验助剂中效果最好。在菌株存活率方面，以净洗剂LS 和PEG8000存活率最高，分别为1.60×108cfu/g和1.58×108cfu/g，说明净洗剂LS可有效提高制剂悬浮率和保持菌株存活率。润湿时间和悬浮率作为制剂质量性状的重要指标，因此综合考虑润湿时间、悬浮率和菌株存活率后选择PEG-8000和净洗剂LS相配合来提高制剂的悬浮率和降低润湿时间。
不同助剂类型对制剂特性的影响
2.4.3不同助剂配比对解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂特性的影响
PEG8000和净洗剂LS之间不同配比对菌株存活率的影响较小，而对解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的润湿时间和悬浮率则具有较大影响：当配比为1：9时悬浮率最高，为80.63％，而润湿时间最长，为163.48s明显高于国标规定的120s；当配比为9:1时，润湿时间最短，为18.18s，而悬浮率较低仅为24.89％，明显低于国标规定的70％；当配比为3：7、4：6和5：5时不仅悬浮率均在70％以上，而且润湿时间均低于120s符合国标有关微生物生物制剂的质量要求。综合考虑润湿时间和悬浮率后选择4：6最为助 剂PEG8000和净洗剂LS的最佳配比。
不同助剂比例对制剂特性的影响
2.4.4不同助剂添加量对解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂特性的影响
不同助剂的添加量对制剂的润湿时间和悬浮率影响显著，而对活菌数影响较小。随着添加量的增加润湿时间呈现递增趋势，而悬浮率则呈现上升趋势，且不同添加量下润湿时间和悬浮率均满足国标要求。因此综合考虑润湿时间、悬浮率以及经济因素后选择4％作为助剂的最佳添加量。
不同助剂添加量对制剂特性的影响
2.4.5不同稳定剂对解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂特性的影响
稳定剂是指能在较长时间内稳定理化性质，提高渗透性、展布性和保 持一定时间内微生物数量的一类物质，对制剂效果保障具有一定意义。研究结果表明：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)可在一定时间内有效保持解淀粉芽孢杆菌Y-3的存活率，下降率仅为1.86％，且对制剂润湿时间和悬浮率影响不大，效果明显优于磷酸钾、碳酸钙和磷酸氢二钾等稳定剂。因此，确定2％CMC-Na为解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的最佳稳定剂。
不同稳定剂对制剂特性的影响
2.5解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂对番茄采后病原物的抑制效果
微生物制剂环境同试验条件相比较为恶劣，有时常会出现某种微生物在实验室条件下表现出较好活性，而当加工成制剂后则出现抑菌活性下降，且剂型也会对制剂效果产生一定影响，因此制剂效果验证和使用浓度确定成为制剂推广应用前的必要环节。试验结果表明：当解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂稀释倍数高于300倍后对番茄采后B.cinerea和A.solani活体抑菌效果明显下降，均低于70％；当稀释倍数为300时，虽然防治效果低于0和100倍，但防效均维持在70％以上，因此选定该生物保鲜剂的最佳稀释倍数为300倍。
不同稀释倍数生物保鲜剂对番茄采后病害的防治效果
2.6解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂对番茄采后贮藏效果的影响
应用效果小试是解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂推广应用的重要环节。试验以田间正常管理后收获的番茄为试验对象，对自然贮藏条件下该生物保鲜剂300倍稀释液两种不同使用方式下的应用效果进行测定。结果表明：浸泡15min处理效果明显优于喷雾处理，且该生物保鲜剂对自然条件下降低番茄贮藏期间腐烂率具有一定作用。在20℃下贮藏18d后对照腐烂率已达100％，而浸泡处理后的腐烂率仅为40.57％，明显好于喷雾处理(75.76％)。在同一贮藏时间下，浸泡处理的效果明显好于喷雾处理，且浸泡处理的腐烂速率也低于喷雾处理。
生物保鲜剂浸泡处理对番茄采后贮藏效果的影响
3.结论与讨论
灰葡萄球菌和茄链格孢菌作为番茄采后引起腐烂的2种主要病原物，对番茄采后贮藏时间和品质具有较大影响，如：番茄贮藏期间番茄灰霉病菌可引起腐烂率可达1％～20％，有时甚至高达50％；童志丹等研究发现在番茄早疫病菌感染下，番茄贮藏15d腐烂率便可达40％左右；周防震等研究发现在番茄灰霉病菌感染下，番茄贮藏20d腐烂率便可达60％。目前有关2种采后病害的防治主要以化学药剂为主，不仅容易污染环境和食品，而且易导致病原物抗药性增强，增加番茄贮藏成本和影响人类健康。因此，本研究从绿色安全防治角度出发，对课题组前期筛选出的天然解淀粉芽孢杆菌Y-3及其天然产物对番茄采后灰霉和早疫2种病害的防治效果进行研究，并将其加工成生物保鲜剂，旨在为番茄采后病害安全防治提供新产品和新方法。
本研究采用平板对峙法、生长速率法和活体验证法对解淀粉芽孢杆菌Y-3对番茄采后灰霉病菌和早疫病菌的抑菌活性进行研究后发现，该菌株对番茄采后B.cinerea和A.solani具有较好的防治效果，活体抑制率可达94.86％和64.01％。防治效果同淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinus)PL36-1、皮尔瑞俄类芽胞杆菌(Paenibacillus peoriae)BC-39、酵母拮抗菌(Crytococcus laurentii)和解淀粉芽抱杆菌((Bacillusamyloliquefaciens)等生防微生物相比具有较好防治效果；同周防震等筛选到的番茄早疫病菌拮抗酵母菌菌株L-1-6相比解淀粉芽孢杆菌Y-3防治效果较低，但相差不大，且这些差异可能同番茄果实成熟度、品种以及采前因素不同有关，说明该菌株在番茄采后B.cinerea和A.solani防治中具有良好的应用潜力。另外，防治效果同一氧化氮处理、茉莉酸甲酯处理和肉桂醛处理相比具有相似或较好的防治效果，说明解淀粉芽孢杆菌Y-3在番茄采后B.cinerea和A.solani防治中具有良好的应用潜力。
制剂化作为拮抗微生物走向市场应用的关键环节，一方面可为市场使用带来便利，另一方面方便跨地域运输及贮藏。因此，本研究在明确解淀粉芽孢杆菌Y-3在平板和番茄活体上对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的防治效果后，在后期研究中对其生物保鲜剂制备进行了研究，研究发现解淀粉芽孢杆菌Y-3可湿性粉剂生物保鲜剂的最佳制备配方为：发酵液70％、膨润土10％、PEG80002.4％、净洗剂LS 3.6％、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)2％，膨润土补足100％。本研究则以采后病害防治为研究点，拓展了拮抗微生物的应用范围，为拮抗微生物采后应用提供参考依据的同时，还为番茄采后病害生物防治提供了新制剂。
明确解淀粉芽孢杆菌Y-3的制备工艺后，为确定其制剂化后的应用效果和稀释浓度，本研究随后在番茄活体上对解淀粉芽孢杆菌Y-3制剂化后的防治效果和稀释倍数进行了研究，结果发现解淀粉芽孢杆菌Y-3制剂在稀释300倍后防治效果较高同菌株制剂前差异不大，但当稀释倍数达到500倍是其防治效果则出现较大下降，对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的防治效果仅为69.63％和59.99％，说明该制剂的最大稀释倍数为300倍，此时对2种可保持在80％左右。
明确制剂在番茄活体上的防病效果后，为进一步明确制剂使用方法和对番茄采后贮藏效果的影响，本研究以田间采收的200公斤成熟番茄为试验对象，在20℃自然贮藏条件下，采用喷雾和浸泡2种处理方式对制剂应用效果进行了研究，结果发现对照组番茄贮藏18d后腐烂率便可达100％，而经制剂喷雾或浸泡处理后其腐烂率均有所下降，其中以浸泡方式效果较好，20℃贮藏18d可使番茄腐烂率有效降低59.43％。另外，虽然喷雾处理同浸泡相比腐烂率控制效果较差，但在番茄贮藏期间仍可在一定程度上降低番茄的腐烂速率，说明解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂在番茄采后病害防治和延缓成熟番茄采后腐烂方面具有良好应用效果，且处理方式为浸泡处理20min。
本研究发现解淀粉芽孢杆菌Y-3及其制剂在番茄采后灰霉病害和早疫病害防治具有良好效果，并对其制剂制备工艺、使用方法以及初步应用效果进行了研究。
Claims (6)
1.一株解淀粉芽孢杆菌新菌株Y-3，于2017年5月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通为生物中心进行专利保藏，登记入册编号CGMCC NO为：14113；解淀粉芽孢杆菌Y-3在离体平板上对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌效果可达97.47％和88.48％，其抑菌活性同目前报道的相关菌株相比具有明显的活性优势；在番茄活体上对番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的抑菌率达94.86％和64.01％，其中对采后番茄灰霉病原抑菌活性同离体相比下降不明显，在番茄采后灰霉病害防治中优势明显。
2.一种解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：该制备方法的步骤是：
S1、从梓树叶片分离出解淀粉芽孢杆菌Y-3，于-80℃的环境下保存；
S2、拮抗细菌活化：取-80℃保存的解淀粉芽孢杆菌Y-320μL采用涂布法涂布于新鲜NA平板，并于26℃恒温活化培养24h后用于后续试验；
S3、采用接种环取活化后的解淀粉芽孢杆菌Y-31环，接种至新鲜NB发酵液中，于160r/min、28℃发酵培养5d，使其抗逆性芽孢率达90％以上后终止发酵，用于可湿性粉剂制备；
S4、将膨润土经粉碎机粉碎使其细度小于或等于44μm，装于250mL磨口广口瓶后于高温高压灭菌锅灭菌30min，并置于50℃烘箱中烘干备用；
S5、将接种解淀粉芽孢杆菌Y-3培养的NB发酵液、膨润土、PEG8000、净洗剂、羧甲基纤维素钠混合，经45℃真空干燥后，于粉碎机中粉碎使其细度小于或等于44μm，制得生物保鲜可湿性粉剂；接种解淀粉芽孢杆菌Y-3培养的NB发酵液、膨润土、PEG8000、净洗剂、羧甲基纤维素钠的质量比为70：10：2.4：3.6：2。
3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：所述NA平板由牛肉浸膏、蛋白胨，氯化钠、琼脂与蒸馏水搅拌后制备而成，所述牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水的质量比为3：10：5：18：1000，该NA平板的pH值为7.0。
4.根据权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的制备方法，其特征在于：NB发酵液由牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、蒸馏水制备而成，所述牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、蒸馏水的质量比为3：10：5：1000，该NB发酵液的pH值为7.0。
5.一种如权利要求2至4所述制备方法所制得的解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的使用方法，其特征在于：该使用方法的步骤是：
S6、将淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂加水稀释至300倍，
S7、在20℃自然贮藏条件下，采用喷雾或浸泡方式对采后的番茄进行处理。
6.根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌Y-3生物保鲜剂的的使用方法，其特征在于：所述浸泡时间为20min。
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