SE511025C2 - Foderprodukt för häst omfattande Lactobacillus plantarum JI:1 samt Lactobacillus plantarum JI:1 och användning därav - Google Patents

Description

ll 16 21 26 31 36 511 025 2 tillhörande arterna L. salivarius, L. acidophilus och L. reuteri och de två sistnämnda arterna påträffades i alla delar av matsmältningskanalen under det att L. salivarius ej isolerades från magsäcken. Det är också viktigt att komma ihåg att mikrofloran även påverkas av den typ av foder som hästen äter.

Probiotika, dvs olika bakterie- och jästpreparat som administreras oralt i syfte att förbättra hälsan hos människa och djur, har sedan länge använts mot tarmrubbningar för att förbättra tarmfunktionen och det allmänna hälsotillståndet. Som probiotika användes vanligen olika stammar av mjölksyrabildande bakterier, såsom stammar av Lactobacillus och Streptococcus.

Enligt den probiotiska hypotesen gäller att om dessa bakterier kan tillföras i tarmen i en tillräckligt mängd vid tillstånd av stress eller sjukdom, dvs när tarmfloran är rubbad så att patogena bakterier gynnas, så kommer en etablering av de icke önskvärda bakteriestammarna i tarmen att motverkas. Att bibehålla en frisk tarmflora skulle då vara avgörande för att förhindra de sjukdomar som är förenade med en rubbning av tarmfloran.

I Fox, Veterinary Medicine, August 1988, Probiotics: Intestinal inoculants for production animals, görs en samman- ställning av olika probiotika som finns i handeln och som användes vid uppfödning av olika djur, speciellt kycklingar, grisar och kalvar.

KÄND TEKNIK Det är idag vanligt att utfodra hästar som har illaluktande träck med filmjölk eller yoghurt för att komma till rätta med de bakomliggande störningarna i mage och tarm. För häst avsedda produkter som finns på marknaden är t.ex. Bakteriebalans (Lantmännen, Sverige) och Lactosat®häst (Ewos Sverige AB, Södertälje) vilka båda innehåller tre olika stammar av mjölksyra- producerande bakterier, nämligen av Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus och Streptococcus faecium. Gemensamt för dessa medel är att de laktobaciller som finns i de tillförda produkterna antingen är sådana som är naturligt förekommande i den fermenterade produkten eller sådana som isolerats från människa.

Ett annat medel som har använts mot tarmstörningar hos häst är ColiCure (VETTECH AB, Stockholm), en produkt som består av en 11 16 21 26 31 '36 ß 511025 renad och stabiliserad Escherichia coli stam, vilken ursprung- ligen har isolerats från häst, i en koncentration av >1O9levande bakterier/ml. Samma princip ligger bakom tillförseln av sörpa, dvs uppslammad träck från en frisk häst, nämligen att få med någon bakteriestam som passar in i tarmmiljön och kan etablera sig där. Det är dock kontroversiellt att tillföra bakterier av familjen Enterobacteriaceae, t.ex. E. Coli, med tanke på patogenicitet och förekomst av endotoxiner.

EP 0 203 586 beskriver en komposition för behandling av gastrointestinala sjukdomar hos djur, speciellt sådana som orsakats av enterotoxigena stammar av Escherichia coli, som är baserad på stammen Lactobacillus fermentum ATCC 53113, som isolerats från gris. En fördel med den nya kompositionen uppges vara att den är icke-patogen och fungerar genom att hindra infektiösa organismer att binda till tarmslemhinnan. En översikt ges också av olika bakterier som använts för att förhindra eller avhjälpa gastrointestinala sjukdomar, men som alla har visat sig vara endast partiellt effektiva.

Man har tidigare visat att vissa stammar av Lactobacillus plantarum har förmågan att under en viss tid kunna etablera sig i tarmsystemet hos människa. I EP 92916294.9 beskrives således vissa stammar av Lactobacillus, speciellt L. plantarum 299 DSM 6595, och varianter därav, som visat sig ha förmågan att etableras i tarmen och finnas kvar minst 11 dagar efter avslutad tillförsel via oral väg. Dessa stammar har visat sig ha en gynnsam effekt på olika störningar av tarmmikrofloran hos människa.

Den normala laktobacillfloran i tarmen hos olika djurarter skiljer sig åt och även om samma art av Lactobacillus kan påträffas hos två olika djurarter tilhör bakterierna normalt inte samma stam av denna art. Dessa stammar uppvisar inbördes skillnader som har betydelse för deras möjlighet att etablera sig i den aktuella miljön. För att kunna behandla gastrointestinala sjukdomar hos häst finns därför ett fortsatt behov av en säker, icke-toxisk produkt som omfattar en eller flera bakteriestammar med förmåga att kunna etableras i hästens tarm.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Uppfinningen avser en foderprodukt för häst som förebygger 11 16 21 26 31 36 511 025 4 och avhjälper mikrobiellt orsakade tarmstörningar, vilken innehåller en eller flera stammar av Lactobacillus som isolerats från mag- eller tarmslemhinna från häst och som har förmåga att kolonisera i hästtarmen.

Med häst avses i detta sammanhang individer ur släktet Equidae, dvs förutom häst även åsna och zebra, med en likartad sammansättning av tarmfloran.

Foderprodukten enligt uppfinningen utgöres lämpligen av ett foder som fermenterats med en stam av Lactobacillus som isolerats från mag- eller tarmslemhinna från häst och som har förmåga att kolonisera i hästtarmen.

Foderprodukten enligt uppfinningen är lämpligen baserad på ett spannmålsbaserat kraft- eller tillskottsfoder, grönfoder eller hö.

En föredragen utföringsform av uppfinningen är en foderprodukt baserad på havre som fermenterats med en eller flera stammar av laktobaciller som isolerats från häst, speciellt med någon av de nedan angivna, nya stammarna.

Enligt en annan utföringsform av uppfinningen är foderprodukten ett ensilage baserat på grönfoder eller hö som fermenterats med en eller flera stammar av laktobaciller som isolerats från häst.

Uppfinningen avser vidare den nya stammen Lactobacillus plantarum JI:1, som har deponerats vid Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH den 21 april 1997 under nummer DSM 11520 och varianter därav; speciellt till användning för profylax eller behandling av störningar i tarmmikrofloran.

Ovanstående stam har visat sig växa bra på havre och ge en välsmakande foderprodukt, överleva passagen genom hästens magtarmkanal och ha förmåga att etablera sig i tarmen hos häst.

Bakterierna enligt uppfinningen sänker halten oönskade bakterier i hästtarmen, t.ex. totalantalet Bacillus och totalantalet Clostridium och synes förbättra hästens immunförsvar.

Foderprodukten enligt uppfinningen kan utgöras av ett fodertillskott eller ett foder, i fast eller flytande form.

Foderprodukten kan vara ett kraftfoder eller ett kompletteringsfoder baserat på vilken typ av foder som helst som kan fermenteras av de utvalda stammarna av laktobaciller, t.ex. spannmål, såsom havre, bl.a. svarthavre, korn, vete, råg, sorghum ll 16 21 26 31 '36 511 025 eller majs, eller grönsaker, såsom baljväxter, speciellt sojabönor, rotfrukter och kål, eller grönfoder, såsom vallväxter eller hö.

Havre utgör ett föredraget foder på grund av den höga halten av vitaminer och mineraler, den välbalanserade aminosyra- sammansättningen, innehållet av polära lipider och fibrer. En havresort med högre fetthalt har nyligen visat sig vara lämplig som foder till högpresterande hästar.

En föredragen utföringsform av en foderprodukt enligt uppfin- ningen kan framställas av havre i enlighet med den internation- ella patentansökningen W089/08405 avseende framställning av en näringskomposition. Andra exempel på framställning av föredragna foderprodukter ges nedan.

Uppfinningen avser även användning av en eller flera stammar av Lactobacillus som isolerats från mag- eller tarmslemhinna från häst och med förmåga att kolonisera i hästtarmen Speciellt avser uppfinningen även användning av den nya stammen Lactobacillus plantarum JI:l eller en variant därav för profylax eller behandling av störningar i tarmfloran hos häst.

Också inflammatoriska tillstånd i mag- och tarmslemhinnan kan lindras. Speciellt avser uppfinningen användning av ovanstående stam för framställning av en produkt för profylax eller behandling av störningar i tarmfloran hos häst.

En foderprodukt enligt uppfinningen kan ges före eller i samband med stressituationer, exempelvis vid uppvärmning inför en tävling, transport etc till hästar som vid sådana tillfällen får diarré; för att förbättra allmäntillståndet hos hästar med dåligt hull, dålig aptit eller dålig päls; för att få hästar att bli mindre infektionskänsliga, dvs för att stärka immunförsvaret; vid antibiotikabehandling för att hindra de rubbningar i tarmfloran som normalt uppträder, och därigenom den diarré som ofta är förknippad med antibiotikabehandling; till hästar med magsår; till hästar med diarré eller illaluktande träck som kan vara infekterade med Clostridium difficile eller någon annan patogen mikroorganism.

Halten laktobaciller i fodret bör ej understiga 5-108 CFU/g eller ml och en lämplig dosering till vuxna hästar är 2-10” CFU per dag, vilket motsvarar ca 2-4 liter av den nedan exemplifierade havrevällingen eller ca 100-200 ml av en ll 16 21 26 31 36 511 025 6 fryskultur enligt nedan. Högre halter kan utan risk användas vid speciella tilfällen. Vid administration till föl bör en mindre mängd ges.

BESKRIVNING AV RITNINGARNA Figur 1 visar ett fotografi av en elektroforesgel med stammar som genomgått RAPD-analys.

Figur 2 visar ett fotografi av en elektroforesgel med stammar som genomgått REA~analys.

EXPERIMENTELL DEL För att få fram den nya stammen har man först isolerat representativa stammar av Lactobacillus från häst, dessa stammar har därefter klassificerats och undersökts med avseende på förmåga att fermentera havre och snabbt ge en lämplig pH- sänkning, god smak och lukt, och slutligen har utfodringsförsök på hästar gjorts för att värdera den uppnådda effekten.

Isolering av laktobacillstammar Laktobacillfloran i mag- och tarmsystemet hos 10 friska, nyslaktade hästar undersöktes genom att biopsier på 1-2 cmz av tarmslemhinnan togs från tre olika ställen, nämligen den nedre magsäcken (pylorus), tunntarmen (ileum) och tjocktarmen (colon).

Proverna sköljdes direkt noga med steril transportlösning (0,9 g NaCl, 0,1 g pepton, 0,1 g Tween 80, 0,02 g cystein per liter), detta för att eliminera kontamination från bakterier i avföringen, och förvarades svalt under transport till laboratoriet. Där behandlades proverna dels i ultraljudsbad i 5 minuter och sedan i provrörsskak i 2 minuter, för att lossa bakterierna från tarmslemhinnan. Totalt togs 51 prover.

Z .E. . J 1! I .]]:] _ _ I hQ§_hä§& Från varje prov togs 1 eller 2 laktobacillisolat och dessa karaktäriserades med avseende på förmåga att fermentera 49 olika kolkällor enligt API 50 CH-systemet (API Systems S.A., Montalieu Vercieu, Frankrike). Härigenom erhålles normalt artspecifika mönster och de erhållna resultaten jämfördes med resultaten av ca 200 olika, kända stammar av Lactobacillus, däribland samtliga typstammar av alla godkända laktobacillarter. Följande resultat ll 16 21 26 fal 36 7 5711 025 erhölls: ALL å_â¥_iâQlš§fiD L. salivarius 14 L. salivarius-lik 29 L. reuteri-lik 14 L. johnsonii 4 L. johnsonii-lik 10 L. plantarum 12 L. animalis L. brevis L. vaccinostercus-lik L. murinus -bNNNm L. species i 1 I 1! _ .

De isolerade bakteriisolaten undersöktes därefter med avseende på förmåga att fermentera havrevälling, vilken fram- ställts enligt följande. 18,5 vikt-% havremjöl (MP-450, Kungsörnen AB, Järna), 0,925 vikt-% mältat kornmjöl (MBF, Nord Malt AB, Söderhamn) blandades med kranvatten och upphettades till 95°C under långsam omröring.

Efter 30 minuter kyldes vällingen till 37°C och fermenterades med de olika stammarna i 20 h till ett pH under ca 4. Speciellt undersöktes pH-sänkningshastigheten och slutproduktens lukt och arom. Bästa resultaten erhölls vid användning av isolaten L. plantarum och L. salivarius-lik som starterkultur och sämsta resultaten med L. reuteri och L. johnsonii-lik.

En stam utvaldes på basis av ovanstående. Stammen identifierades fenotypt på API 50 CH och genotypt med hjälp av analysmetoderna RAPD och REA som Lactobacillus plantarum JI:1.

Vid detta förfarande odlades renade isolat över natten i MRS buljong. Före ympning i API 50 CHL medium tvättades kulturerna en gång i 0,9 % NaCl-lösning. Proverna avlästes efter 2d och 7d.

Resultaten värderades från 0 (violett) till 5 (gul) och ett värde av 3-5 bedömdes som positivt. _ .

Slumpvist amplifierat polymorft DNA (RAPD) RAPD är en polymeraskedjereaktion (PCR) som består av upprepade cykler av templatdenaturering, primer annealing och 11 16 21 26 31 36 511 025 8 primerförlängning. Härigenom kan man erhålla en amplifiering av vissa fragment av genomet.

Renade bakterieisolat odlades över natten i Lactobacillus Carrying Medium (LCM; Efthymiou och Hansen, 1962) med 1% glukos.

Celler från 100 ul av kulturen uppsamlades genom centrifugering och tvättades två gånger i 1 ml sterilt destillerat vatten.

Cellerna resuspenderades i 0,25 ml sterilt destillerat vatten och sönderdelades därefter genom kraftig skakning med glaskulor (diameter 0,2 mm) under användning av en IKAVibrax VXR skak- apparat (IKA Labortechnik Staufen, Tyskland) vid maximal hastighet under 30 min i kyla. Cellresterna pelleterades genom centrifugering och 1 ul av supernatanten användes för PCR. PCR utfördes i en DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer, Norwalk, USA) under användning av en 9-mer primer (ACGCGCCCT; Pharmacia Biotech, Sverige) i en koncentration av 8 pmol/1. Nukleotiderna tillsattes vid en koncentration av 0,2 mmol/1 av varje dNTP (Perkin Elmer; Branchburg, NJ, USA), Taq-polymeraskoncentrationen var 50 U/ml (Boehringer Mannheim) och buffertkoncentrationen var 100 U/ml (10 x PCR-buffert; Boehringer Mannheim).

Reaktionsblandningen täcktes med mineralolja och utsattes för följande temperaturcykler: 94°C, 45 s; 30°C, 120 s; 72°C, 60 s under fyra cykler och därefter för 94°C, 5 s; 36°C, 30 s; 72°C, s i 26 cykler (förlängningssteget göres 1 sekund längre för varje ny cykel). PCR-förfarandet avslutades vid 75°C i 10 min och provet kyldes därefter till 4°C.

Gelelektrofores utfördes genom påföring av 20 pl av provet på en submers horisontell agarosgelplatta bestående av 75 ml 1,5 % agaros (typ III: High EEO, Sigma, St. Louis, USA) och med en storlek av 150 x 115 mm. Geler kördes i ca 2,5 timmar vid 100 V i TB elektroforesbuffert (89 mM borsyra, 89 mM Tris-OH, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) utan kylning. 0,5 pm av en DNA-molekylviktsmarkör VI (Boehringer Mannheim Scandinavia, Bromma, Sverige) användes som standard. Efter elektrofores färgades gelerna i etidiumbromid (3 pg mlq) under 5 minuter och tvättades därefter i 10 minuter och synliggjordes vid 302 nm med en UV transilluminator (UVP Inc., San Gabriel, Kalifornien, USA) och fotograferades. I figur 1 visas RAPD-mönstren av, räknat från vänster, L. plantarum JI:1, typstammen för L. plantarum ATCC 149 177 och markören. Härav framgår att mönstret för den nya stammen enligt uppfinningen har ll 16 21 26 31 36 9 511 025 ett mönster som avvikter något från mönstret av typstammen.

Rening av kromosomalt DNA Framställning och rening av kromosomalt DNA utfördes enligt den metod som beskrivits av Ståhl et al., International Journal of Systematic Bacteriology 40:189-193, 1990. Stammarna odlades över natten vid 37°C i 100 ml LCM buljong med 1 % glukos och skördades därefter och tvättades i TES (50 mM NaCl, 100 mM Tris, 70 mM natrium EDTA, pH 8,0) och suspenderades i 3 ml TES + 25 % (vikt/volym) sackaros. 2 ml TES + 25 % sackaros kompletterat med 120 mg lysozym (kvalitet VI, Sigma) och 140 U mutanolysin (Sigma) tillsattes. Cellerna inkuberades vid 42°C i 2 h; 3 mg proteinas K (kvalitet XI; Sigma) tillsattes därefter och suspensionen inkuberades vidare vid 37°C i 30 minuter. Efter kylning på is tillsattes 1 ml av en 5 %-ig NaCl-lösning, 1 ml 20 %-igt dodecylsulfat och 11 ml TES och suspensionen omrördes försiktigt med en glasstav och upphettades till 65°C. Cellysatet extraherades därefter en gång med redestillerad fenol-kloroform (1:l) och en gång med isoamylalkohol-kloroform (1:24). Därefter utfälldes DNA med etanol vid 20°C.

Det kromosomala DNA“t renades därefter och separerades från det kovalent bundna slutna církulära plasmid-DNA't genom densitetscentrifugering i en CsC1-gradient med etidiumbromid enligt Bauer och Vinograd, Journal of Molecular Biology 33, 141- 171, 1968. DNA-koncentrationerna bestämdes i en fluorometer (modell TKO 100 Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco) med färgämnet Hoechst 33258 enligt tillverkarens rekommendationer.

Restriktionsendonukleasanalys (REA) Portioner på 0,75 pg renat, kromosomalt DNA digererades separat vid 37°C under 4 h med 10 U HindIII, ClaI och EcoRI (Boehringer Mannheim). Gelelektrofores utfördes under användning av submersa horisontella agarosgelplattor bestående av 150 ml 0,9 % agaros (ultraren DNA-kvalitet, BioRad Laboratories) och dessa göts som gelplattor. 0,2 ug av en hög molekylvikts DNA-markör (BRL) tillsammans med 0,5 ug av en DNA molekylviktsmarkör VI (Boehringer Mannheim) användes som standarder. Dessutom sattes pHC 79, digererat med EcoRI, till varje brunn som en inre standard. Minimal banddistortion och maximal skärpa uppnåddes genom att provet av DNA påfördes i en Ficoll påföringsbuffert (2 g Ficoll, 8 ml vatten, 0,25 % bromfenol). ll 16 21 26 31 36 511 025 1,, Fragmenten separerades på 0,9 % agarosgeler vid 8,5°C och 40 V i 18 h och färgades därefter i 20 min i etidiumbromid (2 #9/ml) och avfärgades i destillerat vatten och fotograferades. Härigenom erhölls väl utspridda och ganska väl separerade band ned till en molekylvikt av 1,2 x 106, se Figur 2. Denna figur visar REA- mönstret för Lactobacillus plantarum stammarna JI:1, 299v och ATCC 149 17T (typstammen) efter behandling med i tur och ordning restriktionsenzymerna Ecco R1, Cla 1 respektive Hind III. Det första och det sista spåret visar en markör.

Exempel på foderkompositioner E !"JJ . I H11. . . 3 St _ 1] 1 J Havremjöl (318 kg), maltmjöl (12,8 kg) och vatten (1682 l) blandas och uppvärmes till 88°C varvid temperaturen först hålles vid 55°C under 1 h och därefter vid 88°C i 0,5 h. Blandningen kyles därefter till 38°C vilket tar ca 0,5 h. Vid denna temperatur ympas starterkulturen Lactobacillus plantarum JI:1 i en mängd av 2 l till 2000 1 av blandningen, vilket ger en koncentration av 2107 CFU/ml. Det hela inkuberas vid 38°C under -20 h, varefter pH skall ha sjunkit till <3,9. Den fermenterade blandningen kyles då till 6-8°C och är efter förpackning och kylförvaring färdig för distribution och försäljning.

Den nyframställda, färdiga produkten innehåller 1-2109 CFU/ml och efter 1-2 månaders lagring har bakteriehalten sjunkit till ca 5108 cFU/ml.

Näringsvärdet för ovanstående foderprodukt framgår av följande tabell H" _ ._ ä ICQ 2 1 Energivärde 240 kJ = 57 kcal 4780 kJ = 1143 kcal Protein 2,1 g 41,5 g Kostfiber* 1,5 g 29 g Fett** 1,1 g 23 g Kolhydrater 10 g 190 g Vitamin Bl (tiamin) 0,07 mg 1,3 mg * enligt ASP et al., J. Agric. Food Chem. 31:476-482 ** enligt SBR, Nordisk Metodikkommitté för livsmedel nr 131, 1989 Genom tillsats av CaCO3 vid ovanstående framställnings- förfarande erhålles efter en något förlängd fermenteringsprocess H ll 16 21 26 31 36 11 511 025 (20-22 h) en foderkomposition med ett högre bakterietal.

I ! 3 N!! För framställning av en sats fermenterade morötter river man morötter (10 kg) grovt eller finfördelar dessa på annat sätt.

Vatten (5 l) kokas upp och får därefter svalna till 40°C, varefter Lactobacillus plantarum JI:1 (ympmängd 2-10” CFU, vilket motsvarar ca 2 g frystorkad produkt eller 20 ml frys- kultur) och salt (100 g) tillsättes. De finfördelade morötterna varvas med ympvätskan i en steril behållare och packas tätt. Det är viktigt att grönsakerna ligger under vätskeytan. Behållaren tillslutes och inkuberas därefter vid 24°C under ca 2 dygn. Eftermogning sker i kylskåp eller sval i ca 3-4 veckor. Den fermenterade produkten kan därefter kylförvaras i ca 1 år. 1 l vatten 200 g skummjölkspulver 2 g jästextrakt 1 1 bakteriesuspension (5-10 CFU/ml) Ovanstående komponenter blandas och överföres till sterila plåtar som placeras på hyllor i en frystork. Produkten fryses till ca -40°C innan torkningen påbörjas. Efter ca 3 d avslutas torkningen och den erhållna produkten males till ett pulver som förpackas i sterila påsar under kontrollerad kvävgasatmosfär. Hållbarheten av den erhållna produkten är ca 2 år vid frysförvaring. 1 l av en bakteriesuspension med en halt av 5-10” CFU/ml sättes till 1 l av ett frysmedium av följande sammansättning kaliumdivätefosfat 0,36 g dikaliumvätefosfat 1,64 g trinatriumcitrat 1,18 g magnesiumsulfat 0,5 g glycerol 240 g destillerat vatten 760 ml Den erhållna prdukten fryses in vid -80°C i 200 ml flaskor. ll 16 21 26 31 36 511 025 12 ._11 . .J Ensilering bygger på två principer, nämligen att sänka grönmassans pH-värde till 4,2 eller lägre och att utestänga luftsyret. 50 g av den frystorkade kulturen av Lactobacillus plantarum JI:1 blandas med några liter vatten för att lösa upp pulvret och när så skett tillsättes ytterligare vatten och några kilo melass till en total volym av 50 l. I samband med att grönmassan rullas ihop till balar och plastas in doseras bakterielösningen in i massan i en mängd av ca 1 l per 200 kg grönmassa med hjälp av en doseringspunp som monteras på hacken eller pressen. Det är viktigt att få en jämn inblandning av bakterielösningen så att de tillsatta bakterierna kan växa i hela balarna. Vid tillverkning av ensilage i silo tillsättes bakterielösningen med doseringpump via fläkten i silon.

Försök på häst in vivo Administration av L. plantarum JI:1 i havrevälling I denna studie ingick 10 travhästar varav fem fick 2 l fermenterad havrevälling varje dag under 8 veckor medan de fem andra hästarna som inte utfodrades med havrevälling ingick i studien som referenshästar. Träckprover togs vid sex olika tidpunkter, direkt innan hästarna började att utfodras med havrevällingen och sedan efter 1, 3, 6 och 8 veckor och slutligen en vecka efter det att hästarna slutat att äta havrevällingen. De mikrobiologiska analyserna omfattade totala antalet laktobaciller, Enterobacteriaceae och Bacillus. pH-värdet i träckproverna analyserades också. Dessutom analyserades andelen L. plantarum JI:l av den totala laktobacillfloran.

Vid sidan av de mikrobiologiska analyserna gjordes också en del subjektiva bedömningar av hästarnas status under försöksperioden. Detta inkluderade träckkonsistens, träcklukt, hästarnas hull, pälsglans och slutligen hästarnas allmänna kondition.

Resultaten visade att laktobacillhalten väsentligen ökade hos två av hästarna under utfodringsperioden. Båda dessa hästar hade en låg halt laktobaciller vid försöktets start. Från alla hästar som erhöll den fermenterade havrevällingen isolerades bakterien L. plantarum JI:1 från resp. träck. Antalet varierade från 1 till 72% av den totala laktobacillfloran. Tre av fyra hästar hade L. 11 16 21 26 31 36 13 511 025 plantarum JI:1 i sin träck fortfarande en vecka efter det att utfodringen med havrevällingen avslutats.

Antalet Bacillus spp. minskade betydligt hos fyra av hästarna under utfodringsperioden och en vecka efter densamma, medan ingen trend kunde iakttas beträffande antalet Enterobacteriaceae eller träckens pH-värden under eller efter försökets genomförande.

Den fermenterade havrevällingen uppskattades mycket av hästarna och blev nästan som ett "godis". Vissa tecken tydde också på att hästarnas aptit ökade.

En av hästarna, Luradej, registreringsnummer 90-4843, är känd för återkommande problem med magen och tarmen. Samtidigt som dessa problem startar så sjunker kroppstemperaturen till omkring 36°C. Efter två veckors intag av den fermenterade havrevällingen steg temperaturen till en normal nivå på 37,5°C för första gången på flera månader. När hästen slutade att äta havrevällingen efter 8 veckors intag sjönk temperaturen ånyo efter 2-3 dagar till om- kring 36°C. Efter ett kort uppehåll började hästen att utfodras med havrevällingen igen vilket medförde att temperaturen steg till normal nivå. Detta upprepades vid ett senare tillfälle ytterligare en gång.

Under försöksperioden behandlades en av hästarna med bredspektrat antibiotikum (Gentaject vet., 1,2 g två ggr per dag under 7 dagar). När en häst behandlas med detta antibiotikum uppstår normalt en del bieffekter, t.ex. problem med magen och tarmen under en lång tid. I detta fall erhöll hästen den fermenterade havrevällingen under hela antibiotikakuren och även under ett antal veckor efter denna och hästen hade inga som helst problem med varken magen eller tarmen. Detta upprepades vid ett senare tillfälle med ytterligare en häst och med ett annat antibiotikum med samma positiva resultat.

K 1 . . I I [_ 1 3 É E I g I . E .Zz :Z I .l. .]..!! ..] Samma produkt som beskrivits i ovanstående försök användes också i denna studie. Sammanlagt ingick 26 travhästar utplacerade hos sex olika travtränare i södra Sverige i studien.

Hästarna hade varierande bakgrund där vissa hästar hade problem med lös, illaluktande träck och/eller dåligt hull och dålig pälsglans. Hästarna utfodrades lite olika med avseende på t.ex. ll 16 21 26 31 36 511 025 14 typ av kraftfoder och vissa tilläggsfoder. En del av hästarna gick också periodvis på bete.

Hästarna utfodrades med 2 l fermenterat havrefoder per dag i två månader och i vissa fall i tre månader. Ett mindre antal hästar utfodrades periodvis endast med 1 l per dag. Detta inträffade exempelvis när vissa av hästarna kom ut på bete och då inte var så intresserade av att äta något annat än gräs.

Träckprover togs direkt innan hästarna började att utfodras med det fermenterade fodret samt efter 2-3 månaders intag av detsamma. De mikrobiologiska analyserna omfattade totala antalet laktobaciller, andelen L. plantarum JI:1 av totala antalet laktobaciller (resultaten ännu ej färdiga), totalantalet Entero- bacteriaceae, Bacillus och Clostridium samt antalet B. cereus.

Vid sidan av de mikrobiologiska analyserna gjordes också en del subjektiva bedömningar av hästarnas status under försöks- perioden. Detta inkluderade träckkonsistens, träcklukt, hull, pälsglans, aktivitet och aptit.

Resultaten visade att laktobacillhalten även i denna studie ökade hos hästarna. Medelvärdet innan utfodringen startade var 2,9 miljoner och efter 2-3 månader 5,2 miljoner. Vid försökets start hade 14 hästar en laktobacillhalt på över 1 miljon per gram träck. Efter 2-3 månader hade 18 hästar det. Preliminärt återfanns L. plantarum JI:1 i träcken från samtliga hästar efter 2-3 månaders intag. Enligt en statistisk bearbetning av resultaten enligt Wilcoxon så är signifikansnivån för ökat antal mjölksyrabakterier 86,8%.

Minskningen av totalantalet Bacillus var väldigt tydlig. 16 av hästarna hade ett minskat antal och 4 ett oförändrat antal.

Av de sex hästar som fått ett ökat antal hade tre av hästarna ätit ett kraftfoder med ett mycket högt antal Bacillus. En statistisk bearbetning enligt Wilcoxon visar att signifikansnivån för minskat antal Bacillus är så högt som 99,6%. Vid försökets start hade 17 hästar ett högre antal än 10.000 per gram träck, medan motsvarande siffra efter 2-3 månader var 9. Beträffande antalet Enterobacteriaceae kunde inte någon tendens åt det ena eller andra hållet iakttas. Även antalet B. cereus varierade både uppåt och nedåt. I detta fall var dock antalen låga. Slutligen när det gäller totalantalet klostridier så minskade antalet hästar som hade ett högre antal än 5.000 per gram träck från 3 11 16 21 26 31 36 511 025 vid försökets start till 1 efter 2-3 månader. Övriga iakttagelser av intresse som gjordes under denna studie var följande: En del av hästarna hade vid försökets start problem med att de blev lösa i magen vid stress och vid värmningen inför ett lopp. Efter en kortare tids intag av det fermenterade fodret upphörde detta problem i samtliga fall.

Ett tiotal hästar hade problem med lös träck vid försökets start. Samtliga hästar fick efter högst några veckor en normal träck.

Knappt ett tiotal hästar hade problem med dåligt hull vid projektets start. Alla utom en har efter utfodring av det fermenterade fodret fått ett bättre hull.

Ca fem hästar hade en dålig pälsglans vid försökets start. Samtliga fick en finare päls efter några veckors intag av det fermenterade fodret.

Tre hästar har under försöksperioden erhållit antibiotika (två av hästarna har erhållit bredspektrat antibiotikum och en ett sulfapreparat). Inte i något fall har antibiotikan påverkat hästarna negativt utan det fermenterade havrefodret tycks istället ha haft en positiv effekt på hästarna och motverkat bieffekter som annars är vanliga.

Två av tränarna hade innan försökets start gett filmjölk till några av sina hästar utan märkbart resultat. Båda ansåg att effekten var betydligt bättre med det fermenterade havrefodret.

Tre av tränarna hade innan försökets start prövat produkten ColiCure på några av sina hästar med dåligt resultat. Det fermenterade fodret ansågs av samtliga ge ett bättre resultat.

Vid en samlad bedömning av det fermenterade havrefodrets effekt på de 26 hästarna har det i 19 fall konstaterats en mer eller mindre positiv effekt på hästarnas tarmflora och/eller hästarnas allmänna status. Endast i sju fall har inte någon tydlig positiv effekt iakttagits. I flera av dessa fall finns det förklaringar till detta, som t.ex. intag av kraftfoder av dålig hygienisk kvalitet eller andra problem som t.ex. inneburit medicinering av hästen. ll 16 21 26 31 36 511 025 16 i: . Iål.. . .

Jaffa Qui, registreringsnummer 92-1858, en mycket lovande travhäst, vann sitt första lopp som tidig 3-åring. Vid byte av stall fick hon som 3-åring under ca 6 månader vatten som innehöll en avsevärd mängd kolibakterier. När hon senare flyttade till ny tränare upptäcktes så småningom att hela stallet hade Rhinovirus och Herpesvirus. Jaffa Qui blev sjukast av alla hästarna, troligen på grund av den nedsatta motståndskraften som orsakats av den dåliga vattenkvaliteten. Hon fick även nässelfeber och såg allt eländigare ut. Hon släppte inte vinterpälsen, blev tussig och slutade nästan helt att äta och orkade inte träna. Efter administration av havrevällingen enligt uppfinningen, som hon genast accepterade och började äta, blev hon allt bättre och vi kan nu konstatera att hon aldrig tidigare varit så fin. Hon har bättre hull än tidigare och en glänsande päls. Hon har dessutom tagit emot träning mycket väl de senaste månaderna och har nu kvalat och debuterat.

Jämförelse mellan tillförsel av L. plantarum 299v och L.

Under en kortare period gavs de tio hästarna, som ingick i det första försöket som beskrivits ovan, fermenterad havrevälling producerad med L. plantarum 299v (isolerad från människa) som ingår i livsmedlet ProViva® i stället för med L. plantarum JI:1 (häststammen). Detta gjordes utan travtränarens vetskap. Efter bara en vecka har denne insett att något var fel med havrevällingen. Han hade observerat att effekten av den nya leveransen av den fermenterade havrevällingen var mindre än tidigare. Bl.a. så steg inte temperaturen hos Luradej till drygt 37°C som den gjort tidigare trots att hästen utfodrades med den fermenterade havrevällingen. Detta visar hur viktigt det är att rätt stam av rätt laktobacill används och inte bara rätt laktobacillart.

Claims (9)

10 15 20 25 30 35 17 511 025 PATENTKRAV

1. Foderprodukt för häst omfattande en eller flera stammar av Lactobacillus som isolerats från mag- eller tarmslemhinnan från häst och med förmåga att kolonisera i hästtarmen, kännetecknad av att den omfattar stammen Lactobacillus plantarum JI:1 med depositionsnummer DSM 11520 eller en variant därav.

2. Foderprodukt enligt krav 1, kännetecknad av att den utgöres av ett foder som fermenterats med stammen Lactobacillus plantarum JI:1 med depositionsnummer DSM 11520 eller en variant därav.

3. Foderprodukt enligt krav 1 eller 2, kännetecknad av att fodret utgöres av spannmål, grönsaker, grönfoder eller hö.

4. Foderprodukt enligt något av kraven 1 - 3, kännetecknad av att den utgöres av en havrevälling.

5. Foderprodukt enligt något av kraven 1 - 3, kännetecknad av att den utgöres av ensilage.

6. Lactobacillus plantarum JI:1 med depositionsnummer DSM 11520 eller en variant därav.

7. Lactobacillus plantarum JI:1 med depositionsnummer DSM 11520 eller en variant därav till användning för profylax eller behandling av störningar i tarmfloran hos häst.

8. Användning av en stam enligt krav 6 för framställning av en produkt för profylax eller behandling av störningar i tarmfloran hos häst.

9. Användning av en stam enligt krav 6 för att förbättra aptit, hull och pälsglans hos häst.