CN1272877A - 饲料产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种马饲料产品,其含有一种或多种分离自马的胃或肠粘膜并且有能力在马肠内定居的乳杆菌菌株。本发明具体涉及新的植物乳杆菌菌株JI:1,其以保藏号DSM11520保藏,以及乳杆菌种AC:3,其以保藏号DSM12429保藏;本发明还具体涉及用上述菌株发酵的燕麦片糊及其在预防或治疗马肠内微生物***失调和胃炎中的应用。
Description
本发明涉及新的乳杆菌属菌株以及含有一种或多种所述菌株的马饲料产品。
发明背景
马匹的肠内菌群失调可以引起马丧失对饲料中营养物的摄取能力,体能下降,对感染及不同类型的伴发性感染的抵抗力降低。其他综合征有粪便稠度改变且常有恶臭,以及外部毛发丑陋。已知上述肠内菌群失调不但在紧张状态如长途运输、改变马房环境、过度严格的训练和更换饲料期间出现,而且在抗生素治疗中也可能出现。肠内菌群失调的问题在幼驹中也有发生,它们在其生命初期必须获得其自身的肠内微生物***。
多种与肠内菌群改变有关的疾病是肠粘膜炎症和胃溃疡;和细菌性感染如急性结肠炎,例如肠chlostridiosis,其症状为腹泻和毒血症且由难辨梭状芽孢杆菌引起;和急腹痛,例如由产气英膜梭状芽孢杆菌引起的Baron-Gruff病。
粪便中是否存在大肠菌类早已被用于判断马的健康状况是否处于肠内菌群失调。人们认为高浓度的大肠菌类表示肠道处于良好状态,而低浓度的该大肠菌类以及芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌的浓度分别增高时可能存在肠功能失调。霉菌和其他真菌的存在也被认为是对肠内菌群产生不良影响。此外,体温降低(低于37℃)被视作是肠胃道内出现问题。马的正常体温应是37.3-37.8℃。
乳杆菌是健康马匹的肠内微生物***中的一种主要微生物。Fujisawa等人在《双歧杆菌微生物》(第12(2)卷,87-90页,1993)中公开业已从健康马匹的胃肠道内分离出286种乳杆菌菌株。这些菌株中的大部分经鉴别是属于唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌和路氏乳杆菌,并且后两个菌种存在于胃肠道的所有部分,但唾液乳杆菌不是从胃中分离出来的。重要的是记住,马所进食的饲料种类也能够影响微生物***。
作为口服给药用于增强人体和动物健康的不同细菌和酵母的制剂,益生菌早已被用来抵抗肠内菌群失调,改善肠功能和全身健康状况。通常所采用的益生菌是产乳酸菌的不同菌株,例如乳杆菌属和链球菌属的菌株。益生菌过低表示此时肠内菌群由于病原菌占优势而处于失调,如果能在应激条件或疾病过程中加入足够量的益生菌,将能够阻止有害菌株在肠内建立菌群。保持健康的肠内菌群将有助于防止与肠内菌群失调有关的疾病。
在Fox的《兽医学》,1988.8,“益生菌:用于畜牧动物的肠内接种剂”中,对用于饲养不同动物,特别是鸡、猪和小牛的多种市售益生菌作了评论。
现有技术
如今,常给粪便有恶臭的马匹喂食酸乳或酸奶以消除胃肠内的基础功能紊乱。市场上的马用产品例如是Bakteriebalans(Lantmannen,瑞典)和Lactosathast(Ewos Sverige AB,Sodertalje),两者都含有三种不同的产乳酸菌菌株,它们是保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和屎链球菌。上述制剂的共同点是,存在于饲料产品中的乳杆菌或者是发酵产品中常见的天然菌,或是分离自人体。
另一种用于抵抗马匹肠内失调的制剂是ColiCure(VETTECH AB,Stockholm),这是一种由浓度为>109活菌/ml的纯化并稳定的大肠埃希氏杆菌菌株组成,这种菌株最初分离自马匹。该制剂的原理同样是,在喂食“醪液”(即,得自健康马匹的分散的粪便)后可以得到适应肠内环境并在其中建群的菌株。但是,考虑到致病性和内毒素产生的原因,对于加入肠杆菌族的细菌如大肠埃希氏杆菌还存在争议。
EP 0 203 586描述了一种用于治疗动物胃肠道疾病、尤其是治疗那些由大肠埃希氏杆菌的产肠毒素菌株引起的疾病的组合物,所述菌株基于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株ATCC 53113,它分离自猪。该新组合物的优点据说在于无致病性,并且通过阻止感染性生物与肠粘膜结合来发挥功效。对用于预防或治疗胃肠疾病的不同细菌也有概述,但已证实它们均只是部分有效。
过去已有描述,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的某些菌株有能力在人体的肠道***内定居一段时间。在EP 92916294.9中描述了某些乳杆菌菌株,尤其是植物乳杆菌299 DSM 6595及其变种,其具有经口服给药后在肠内建群并滞留至少11天的能力。上述菌株对人体中不同的肠内微生物***失调具有有益作用。
不同动物物种肠内的正常乳杆菌菌群有所不同,尽管可以在两个不同的动物物种中发现相同的乳杆菌菌种,但这些细菌通常不属于该菌种的相同菌株。菌株之间存在差别,这对于它们在实际环境中建立菌群的可能性来说至关分重要。所以,为了能够治疗马匹的胃肠道疾病,人们始终需要安全、无毒的含有一种或多种有能力在马匹肠内定居的菌株的产品。
发明公开
本发明涉及一种预防和矫正微生物引起的肠失调的马饲料产品,该产品含有一种或多种分离自马的胃或肠粘膜且有能力在马肠内定居的乳杆菌菌株。
此处所述的马是指马科属的动物,也就是除马之外,还包括具有类似肠内菌群组成的驴和斑马。
本发明所述饲料产品优选是一种用乳杆菌菌株发酵的饲料,所述的乳杆菌菌株分离自马的胃或肠粘膜且有能力在马肠内定居。
本发明所述的饲料产品优选基于谷类颗粒或辅助饲料、绿色饲料或干草。
本发明的一个优选方面是一种基于燕麦的饲料产品,所述燕麦已用一种或多种分离自马的乳杆菌菌株发酵,尤其是用以下任一新菌株发酵。
根据本发明的另一方面,所述饲料产品是一种基于已用一种或多种分离自马的乳杆菌菌株发酵的绿色饲料或干草的青贮饲料。
本发明还涉及新的植物乳杆菌菌株JI:1及其变种,该菌株已在1997年4月21日由Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH保藏,其编号为DSM 11520;本发明尤其涉及其在治疗或预防肠内微生物***失调中的应用。
本发明还涉及另一种乳杆菌种的新菌株AC:3及其变种,该菌株已在1998年10月2日由Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturenGmbH保藏,其编号为DSM 12429。
现已证明,上述菌株在燕麦上生长良好且得到一种可口的饲料产品,在经过马的胃肠道后能够存活且有能力在马肠内定居。试验表明,新菌株植物乳杆菌JI:1可以减少马肠内有害菌的含量,例如减少芽孢杆菌(Bacillus)的总数和梭状芽孢杆菌(Clostridium)的总数,并且似乎可以增强马的免疫反应。
本发明所述的饲料产品可以是固体或液体形式的辅助饲料或饲料。该饲料产品是可用所选的乳杆菌菌株发酵的谷粒或在任何种类饲料基础上的辅助饲料,例如谷类,如燕麦,具体如黑燕麦、大麦、小麦、黑麦、高粱或玉米;或蔬菜,例如豆科植物,具体如大豆;根状植物和卷心菜;或绿色饲料,例如牧草或干草。
燕麦是优选的饲料,这归因于其维生素和矿物质的含量较高,均衡的氨基酸组成,并且含有极性类脂和纤维。近期证实,多种具有较高脂肪含量的燕麦是适用于高能量马匹的饲料。
本发明一个优选饲料产品可以根据国际专利申请WO 89/08405中所公开的营养组合物的制备方法由燕麦制得。下面将给出优选饲料产品制剂的其它例子。
本发明还涉及一种或多种分离自马的胃或肠粘膜且有能力在马肠内定居的乳杆菌菌株的应用。
本发明还具体涉及新的植物乳杆菌菌株JI:1或其变种在预防或治疗马肠内菌群失调中的应用。也可以用其缓解胃或肠粘膜内的炎症。本发明具体涉及所述菌株在制造用于预防或治疗马肠内菌群失调的产品中的应用。
本发明所述的饲料产品可以在应激状态之前或期间,如赛前热身、运输等中给马喂食,有时可给患腹泻的马匹喂食;也可以用来改善那些孱弱、食欲低下或毛发不佳的马匹的日常状况;还可以降低马匹对感染的敏感性,也就是增强免疫反应;在抗生素治疗期间用来预防通常出现的肠内菌群失调引起的通常与用抗生素治疗相关的腹泻;对患胃溃疡的马匹给药;对患有可能因感染难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)或任何其它致病微生物而引起的腹泻或粪便恶臭的马匹给药。
乳杆菌在饲料中的含量应不低于5×108CFU/g或ml,并且对于成年马匹来说适宜的剂量是2×1012CFU/天,这相当于约2-4升如下举例的燕麦片糊或约100-200ml下述冷冻培养物。在特定场合下采用较高的剂量也不存在任何危险。当给粪便恶臭的马匹喂食时,应使用较小用量。
附图说明
图1表示一幅用RAPD分析的菌株的电泳凝胶照片。
图2表示一幅用REA分析的菌株的电泳凝胶照片。
实验部分
为了生产新的菌株,首先从马匹中分离出多种乳杆菌的代表性菌株,随后将这些菌株分类并测试其发酵燕麦和快速产生适当的降低pH的性能,是否具有好的口感和味道,而且最终将对马进行饲养试验以评估所得到的效果。
乳杆菌菌株的分离
通过从三个不同部位,即胃下部(幽门)、小肠(回肠)和大肠(结肠),取1-2cm2的肠粘膜作活组织检查,以便研究10匹健康、新宰杀马匹的胃肠道内的乳杆菌菌群。用无菌运输液(每1升溶液含有0.9gNaCl,0.1g蛋白胨,0.1g吐温80,0.02g半胱氨酸)直接且小心地漂洗样本,从而避免被粪便内的细菌污染,并且在运输到实验室期间冷藏。样本在超声浴中处理5分钟,随后在管式摇动器中处理2分钟,以使得自肠粘膜的细菌疏松。试验共取51个样本。
对马胃肠道内的乳杆菌菌群的鉴定
从每个样本中取1或2个乳杆菌分离物并根据API 50 CH***(API***S.A.,Montalieu,Vereieu,France)鉴定其对49种不同碳源的发酵能力。这一般可得到(菌)种特异性图谱,将所得结果与约200个不同的已知乳杆菌菌株(包括乳杆菌所有已知菌种的全部类型的菌株)的结果进行比较。结果如下:
菌种 分离物的%
唾液乳杆菌(L.salivarius) 14
唾液样乳杆菌(L.salivarius-like) 29
路氏样乳杆菌(L.reuteri-like) 14
约氏乳杆菌(L.johnsonii) 4
约氏样乳杆菌(L.johnsonii-like) 10
植物乳杆菌 12
动物乳杆菌 6
短小乳杆菌 2
牛痘样乳杆菌(L.vaccinostercus-like) 2
鼠乳杆菌(L.murinus) 2
乳杆菌菌种(L.species) 4
被选菌株和鉴定
随后研究离体细菌分离物对燕麦片糊的发酵能力,所述燕麦片糊如下进行制备。
将18.5%(重量)燕麦片(MP-450,Kungsornen AB,Jarna)、0.925%(重量)加麦芽的大麦粗粉(MBF,Nord Malt AB,Soderhamn)用自来水混合并在缓慢搅拌的同时加热至95℃。30分钟后,将糊状物冷却至37℃并用不同的菌株发酵20小时直至pH降低至4以下。特别是对pH降低的速率以及最终产品的味道和气味进行测定。当用植物乳杆菌和唾液样乳杆菌的分离物作为起始培养物时可以获得最佳结果,采用L.reuteri和L.johnsonii-like时结果最差。
基于上述试验选择出两种菌株。在API 50 CH上进行表型鉴定,并且通过RAPD和REA分析法鉴定其基因型分别为植物乳杆菌JI:1和乳杆菌种AC:3。在此过程中,将纯化分离物在肉汤中培养过夜。在API 50 CHL培养基中接种之前,用0.9%氯化钠溶液将培养物洗涤1次。一般在2天和7天后读取样品。结果按0(紫色)-5(黄色)评估,数值等于3-5时被视作阳性。
基因鉴定
随机扩增多态DNA(RAPD)
RAPD是一种由模板变性、引物退火和引物伸展的反复循环构成的聚合酶链式反应(PCR)。由此扩增基因组的某些片段。
令纯化细菌分离物在含有1%萄萄糖的乳杆菌培养基(LMC,Efthyhymiou & Hansen,1992)中培养过夜。通过离心从100μl培养物中回收细胞并用1ml灭菌蒸馏水洗涤2次。将细胞重新悬浮在0.25ml灭菌蒸馏水中,随后在冷却条件下,用玻璃珠(直径0.2mm)采用IKAVibrax VXR摇动器(IKA Labortechnik Staufen,Germany)以最高速度剧烈摇动30分钟以使其分解。通过离心使细胞碎片成团并取1μl上清液用于PCR。PCR是在一个DNA热循环装置480(Perkin Elmer,Norwalk,US)中进行,采用浓度为8μmol/l的9元引物(ACGCGCCCT;Pharmacia Biotech,Sweden)。加入的核苷酸是浓度为0.2mmol/l的各种dNTP(Perkin Elmer;Branchburg,NJ,US)。Taq聚合酶的浓度为50U/ml(Boehringer Mannheim)并且缓冲液浓度为100U/ml(10×PCR缓冲液;Boehringer Mannheim)。用矿物油将反应混合物覆盖并在4个循环中经受以下的温度循环:94℃,45秒;30℃,120秒;72℃,60秒,随后进行26个循环的温度循环:94℃,45秒;36℃,30秒;72℃,30秒(伸展步骤在每个新循环中增加1秒)。在75℃下处理10分钟以中止PCR过程,随后将样本冷却至4℃。将20μl样本加入到浸没的水平琼脂糖凝胶平板上以进行凝胶电泳,该平板由75ml 1.5%琼脂糖(III型:高EEO,Sigma,St.Louis,US)组成且平板尺寸为150×115mm。在非冷却的条件下,在100V下和TB电泳缓冲液(89mM硼酸,89mM Tris-OH,2.5mM EDTA,pH8.3)中将凝胶运行2.5小时。用0.5μmDNA分子量标识物VI(Boehringer Mannheim Scandinavia,Bromma,Sweden)作为标物。电泳后,在溴化乙锭(3μgml-1)中将凝胶染色5分钟,随后洗涤10分钟,在302nm下用紫外透照仪(UVP Inc.,San Gabriel,California,US)观测并照相。
在图1中,从左边开始,显示出植物乳杆菌JI:1、植物乳杆菌ATCC149 17T的典型菌株和标识物的RAPD图谱。由此看出,本发明的这种新菌株的图谱与典型菌株的图谱略有区别。同样地,所述的唾液样乳杆菌菌株AC:3(根据API而定)区别于唾液乳杆菌亚种唾液型菌株(L.salivarius ssp.salivarium)ATCC 11741(未列出数据)。
染色体DNA的纯化
按照Stahl等人在《国际***细菌学杂志》40:189-193,1990中所述的方法制备和纯化染色体DNA。令菌株在37℃下、于100ml含有1%葡萄糖的肉汤中培养过夜,随后收获并在TES(50mM NaCl,100mM Tris,70mM EDTA钠,pH 8.0)中洗涤,将其悬浮在3ml TES+25%(重量/体积)的蔗糖溶液中。加入2ml TES+补充有120mg溶菌酶(性质VI,Sigma)和140U突变赖氨酸(mutanolysine)(Sigma)的25%葡萄糖溶液。将细胞在42℃下保温2小时;随后加入3mg蛋白酶K(性质XI;Sigma)并令悬浮液再在37℃下保温30分钟。在冰上冷却后,加入1ml 5%氯化钠溶液,1ml 20%十二烷基硫酸盐、11ml TES,用玻璃棒小心地搅拌上述悬浮液并加热至65℃。此后,用重蒸苯酚-氯仿(1∶1)将细胞裂解物提取1次并用异戊醇-氯仿(1∶24)提取1次。随后在20℃下用乙醇沉淀出DNA。
此后,将染色体DNA进行纯化,并根据Bauer & Vinograd在《分子生物学杂志》33,141-171,1968中所述内容,采用密度离心法、在含有溴化乙锭的CsCl梯度液中将染色体DNA从通过共价键闭合的环状质粒DNA上分离出来。采用染料Hoechst 33258、根据制造商的说明书在荧光计中(型号TKO 100 Hoefer Scientific Instruments,San Francisco)测定DNA的浓度。
限制性内切核酸酶测定法(REA)
在37℃下,分别用10U HindII、ClaI和EcoRI(Boehringer Mannheim)消化多份0.75μg纯化染色体DNA。用浸没式水平琼脂糖凝胶平板进行凝胶电泳,平板由150ml 0.9%琼脂糖(超纯DNA品质,BioRad Laboratories)组成并被成形为凝胶平板。采用0.2μg高分子量DNA标识物(BRL)和0.5μgDNA分子量标识物VI(Boehringer Mannheim)作为标物。另外,向各孔内加入用EcoRI进行消化的pHC 79作为内标物。在含有Ficoll的缓冲液(2g Ficoll,8ml水,0.25%溴苯酚)中加入DNA样本,达到最小带变形和最大清晰度。
在8.5℃和40V下的0.9%琼脂糖凝胶上分离各片段18小时,随后在溴化乙锭(2μg/ml)中染色20分钟并在蒸馏水中脱色且照相。由此得到适当分散且很好分离的且分子量降至1.2×106的带,参见图2。该图显示了植物乳杆菌菌株JI:1、299v和ATCC 149 17T(典型菌株)在分别用限制性内切酶Ecco R1、Cla 1和Hind III顺序处理后的REA图谱。第一泳道和最后泳道为标识物。采用REA分析菌株AC:3,发现其与唾液乳杆菌亚种唾液菌种的典型菌株相当不同(未给出数据)。
饲料组合物的实施例
以工业规模制造燕麦片糊
将燕麦片(318kg)、含麦芽的大麦粉(12.8kg)和水(1682升)混合并加热至88℃,温度首先在55℃下保持1小时且随后在88℃下维持0.5小时。此后在约0.5小时中令混合物冷却至38℃。在此温度下,以相对于20001上述混合物使用21植物乳杆菌起始培养物的量进行接种,其浓度为2×107CFU/ml。将所得物在38℃下保温15-20小时,此后pH将降低至<3.9。随后将发酵混合物冷却至6-8℃,包装后冷冻储存以备分配和出售。
新制备的终产物含有1-2×109CFU/ml,储存1-2个月后细菌数减少至约5×108CFU/ml。
显然,可以根据下表看出上述饲料产品的营养价值:
营养价值 每100g 每2kg
能量值 240kj=57kcal 4780kj=1143kcal
蛋白质 2.1g 41.5g
食用纤维* 1.5g 29g
脂肪** 1.1g 23g
碳水化合物 10g 190g
维生素B1(硫胺) 0.07g 1.3g
*按照ASP等人在《农业和食品化学杂志》31:476-482中所述;
**按照SBR,Nordisk Metodikkommitte for livsmedel 131期,1989所述。
通过在上述制备方法中加入碳酸钙,在略长的发酵过程(20-22小时)之后可以获得含有较高细菌数的饲料组合物。
利用乳杆菌菌种AC:3作为起始培养物,可以获得相应的燕麦片糊。
发酵胡萝卜
为了制备一批发酵胡萝卜,将胡萝卜(10kg)粗粗地磨碎或以其它任何方式粉碎。将水(51)烧开并冷却至40℃,同时加入植物乳杆菌JI:1(接种2×1011CFU,相当于约2g冻干产品或20ml冷冻培养物)和盐(100g)。在无菌容器中用接种液将磨碎的胡萝卜分层并压紧。重要的是,胡萝卜应低于接种液的表面。封闭容器并在24℃下保温约2天。在冰箱或冷冻储藏室中约3-4周后成熟。随后将发酵产品冷藏约1年。
冷冻干燥产品
1L水
200g脱脂奶粉
2g酵母提取物
1L细菌悬浮液(5×10 CFU/ml)
将上述组分混合并转移到灭菌盘中,将该盘置于冷冻干燥器的搁板上。将产品冷冻至约-40℃,随后开始干燥。经过约3天后,干燥完毕,将所得产品研磨成粉末,将其在可控氮气氛下包装在无菌袋内。在冷冻储藏下,所得产品的保质期约为2年。
冷冻培养物
将1L浓度为5×1010 CFU/ml的细菌悬浮液加入到1L组成如下的冷冻介质中。
磷酸二氢钾 0.36g
磷酸氢二钾 1.64g
柠檬酸三钠 1.18g
硫酸镁 0.5g
甘油 240g
蒸馏水 760ml
所得产物在-80℃下在200ml瓶中冷冻。
青贮饲料制剂
青贮基于两个原则,也就是将绿色物质的pH值降低到4.2或更低并除去氧气。将50g植物乳杆菌JI:1的冻干培养物与若干升水混合使粉末溶解,随后再加入水和数千克的蜜糖至总体积为50L。当将绿色物卷成捆并密封在塑料中后,用饲料切割机或打包机上安装的加料泵将细菌溶液加入其中,细菌溶液的用量是约1L溶液/200kg绿色物。重要的是使细菌溶液均匀混合,以便所加入的细菌可以在整捆绿色物中生长。当在窖中制造青贮时,用加料泵通过窖的通风器加入细菌溶液。
马的体内试验
给药燕麦片糊中的植物乳杆菌JI·1
本试验采用10匹赛马,其中5匹每天被喂食2L发酵燕麦片糊共8周,其余5匹不食用所述燕麦片糊,它们在本试验中作为对照马。在6个不同的时间取粪便样本,也就是正好在马匹食用燕麦片糊之前,喂食后第1、3、6和8周以及马停止吃燕麦片糊后1周时采样。微生物学分析包括乳杆菌、肠杆菌(Enerobacteriaceae)和芽孢杆菌的总数。对粪便样本的pH值也进行测定。此外,还测定总乳杆菌菌群中的植物乳杆菌JI:1的数目。
除进行微生物学分析以外,在试验期间还对马的状态进行一些主观评估。这包括粪便的稠度和气味,马匹的脂肪,外表的光泽以及试验最后马匹的全身状况。
结果显示,在喂食期间,2匹马中的乳杆菌含量明显增加。这两匹马在试验开始时的乳杆菌含量较低。从所有食用发酵燕麦片糊的马匹的粪便中分离出植物乳杆菌JI:1,其数目为总乳芽孢杆菌菌群的1~72%。4匹马中的三匹在用燕麦片糊喂食完成后1周粪便中仍然含有植物乳杆菌JI:1。在4匹马中,芽孢杆菌亚种的数目在喂食期间和停食1周后明显减少,而观测到肠杆菌或粪便的pH值在试验期间和之后没有变化。
马匹很喜好发酵燕麦片糊并且几乎变得“依赖”。还有迹象显示马匹的食欲也有所提高。
其中1匹马,Luradej(注册号90-4843)的胃肠病周期性复发。通常,在所述胃肠病开始时体温降低至约36℃。在食用了含有植物乳杆菌JI:1的发酵燕麦片糊2周后,体温首次在数月中上升到正常值37.5℃。当该马在喂食燕麦片糊8周后停止食用后,体温在2-3天后再次下降至约36℃。在短暂的停食后,再给该马喂食燕麦片糊,其结果是体温上升至正常值。该试验在下一情况中再次重复。当每天食用上述燕麦片糊2年之后,给Luradej喂食相同量的乳杆菌种AC:3的细菌浓缩物。其结果是在马全身状况中引起附加的阳性反应。
在试验期间,其中1匹马正在接受用广谱抗生素(Gentaject vet,每天1.2g两次,共7天)治疗。当用这种抗生素治疗马时,通常出现一些副作用,例如长时间的胃肠问题。在这种情况中,在整个治疗过程中和给药后若干周内给马喂食上述发酵燕麦片糊,马匹未出现胃肠问题。在另一匹马和另一种抗生素的后一情况中重复该试验,得到相同的阳性结果。
植物乳杆菌JI:1的定居及其对马粪便中的肠杆菌、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌的含量的影响
本试验也采用与上述试验相同的产品。本试验共使用34匹马。其中26匹马是和6名不同的训马师居住在瑞典南部。每匹马都有不同的背景,其中一些马匹存在粪便稀和恶臭的问题和/或脂肪不良和毛发无光泽的问题。马匹的饲养略有不同,例如,在谷粒的种类和某些辅助饲料上。一些马匹还定期吃草。
每天用2L发酵燕麦片糊喂食马匹共2个月,并且在某些情况下是3个月。少数马每天只定时喂食1L发酵燕麦片糊。这种情况可例如是,当一些马食草后,除了青草外其对其它任何饲料都不太感兴趣。在用发酵饲料喂食马匹之前和喂食该饲料2-3个月后直接取粪便样本。微生物学分析包括乳芽孢杆菌总数、乳杆菌总数中的植物乳杆菌JI:1数,肠杆菌、芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌的总数以及蜡状芽孢杆菌数。
除进行微生物学分析以外,在试验期间还对马的状态进行主观评估。这包括粪便的稠度和气味,脂肪,外观的光泽、活力以及食欲。
结果表明,本试验中马中的乳杆菌数明显增加(通过Wilcoxon标记等级试验(Wilcoxon signed rank test)分析,p<0.05)。喂食开始前的中间值是1×106cfu/g粪便(1×105-1.7×107),治疗2-3个月后中间值为3.5×106cfu/g(1×105-3.8×107)。在饲养后,从所有马匹的粪便中发现了起始植物乳杆菌JI:1。
芽孢杆菌的总数明显减少(通过Wilcoxon标记等级试验分析,p<0.001),有80%受测马匹的上述菌数在食用后减少。治疗后亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的数目也明显减少(通过Wilcoxon标记等级试验分析,p<0.05)。此时,74%的受测马匹的梭状芽孢杆菌数减少(梭状芽孢杆菌数极低,即低于2×102cfu/g粪便的马匹在统计学分析中忽略不计)。对于肠杆菌数,未观察到任何变化趋势。
在试验期间还观察到以下有趣的现象:
-在试验开始时,一些马匹在应激状态和赛前热身时存在腹泻问题。在短期食用发酵饲料后,这些马匹均不存在上述问题;
-约有10匹马在试验开始时患有稀便。在喂食数周后多数这样的马匹排便正常。
-仅有10匹马在试验开始时存在脂肪差的问题。在食用发酵饲料后,除1匹马之外,其它所有马匹的脂肪变好。
-约5匹马在试验开始时毛发缺乏光泽。在食用发酵饲料两三周后均获得了良好的毛发。
-在试验期间有3匹马接受抗生素(其中2匹接受光谱抗生素,另一匹接受磺胺制剂)。不是在所有情况下抗生素都对马产生副作用,但是马所食用的燕麦片糊似乎对马产生了有益作用并弥补了常见的副作用。
-2名训马师在试验开始之前给马匹服用酸奶,但没有明显的效果。他们提出发酵燕麦片糊饲料的作用更好。
-3名训马师在试验开始前对某些马尝试使用产品Colicure,但结果不佳。他们认为,发酵饲料的效果更好。
概括发酵燕麦片饲料对26匹马的作用时发现,对19匹马的马肠内菌群和/或马匹日常状态或多或少地产生有益作用。只在7匹马中未观察到明显的有益作用。在所述许多情况中,这可解释为,例如食用了存在卫生质量差或其它问题的浓缩饲料,这导致例如马匹接受医药治疗。
马匹样例Jaffa Qui的体内试验
Jaffa Qui(注册号92-1858)是一匹很有前途的赛马,它在3岁时赢得第一个冠军。当改变马房时,它在3岁时饮用了6个月的含有大量大肠杆菌的水。当它后来被移交给新的训马师时,逐渐发现整个马房存在鼻病毒和疱疹病毒。在马群中Jaffa Qui的病情最重,这可能归因于劣质水引起的抵抗力降低。它还患上了荨麻疹并且看起来每天都很悲惨。它无法脱去冬毛,变得虚弱且几乎停止进食,而且没有能力参加训练。在喂食本发明的燕麦片糊后,它立刻接纳了这种饲料并开始进食,它日渐恢复并且现在可以宣告它从未有如此的健康。该马具有比先前更好的脂肪和光泽毛发。在最近的数月中它还可以很好地接受训练,并且现在具有资格参加比赛。
植物乳杆菌299v对患有胃炎马匹的给药
5匹患有胃炎的马匹接受若干周的所述燕麦片糊的治疗,其中1匹在服用洛赛克(Astra AB,Sodertalje,瑞典)后胃炎部分治愈。全部动物均显示出胃炎得以完全临床康复且其中2匹马在胃镜检查后发现彻底恢复。其中1匹马同时接受洛赛克的治疗。详细情况及结果如下表所述:
马名 | 治疗前的诊断 | 植物乳杆菌JI:1的剂量和治疗时间 | 对治疗的反应 | 备注 |
Colombine | 胃炎 | 2×1012cfu/天,共3个月 | 临床完全康复,胃镜检查100%康复 | 无其它医药治疗 |
Fantasy Pride | 胃炎 | 2×1012cfu/天,共1.5个月 | 临床完全康复 | 无其它医药治疗 |
Faxa | 胃炎 | 2×1012cfu/天,共1个月 | 临床完全康复 | 无其它医药治疗 |
Bali Pet | 胃炎 | 2×1012cfu/天,共1个月 | 临床完全康复 | 用洛赛克治疗12天 |
Polk | 部分治愈的胃炎(复原60-70%) | 2×1012cfu/天,共1个月 | 临床完全康复,胃镜检查100%康复 | 无其它医药治疗 |
结果表明,本发明的饲料产品具有治愈马匹胃炎的功效。
植物乳杆菌299v和植物乳杆菌JI:1给药之间的比较
在短时间内,10匹马(包括上述第一个试验中所用马匹)食用用植物乳杆菌299v(分离自人体)代替植物乳杆菌JI:1(马菌株)制造的发酵燕麦片糊,该饲料是部分ProViva饲料。训马师不了解所用的饲料,但仅仅在1周后,训马师意识到燕麦片糊出现某些问题。他观察到,新供应的发酵燕麦片糊的作用比以前小。另外,尽管喂食了发酵燕麦片糊,但Luradej的体温没有象从前那样升高至略高于37℃。这表明,使用合适的乳杆菌的合适菌株是何等的重要,而不只是使用合适的乳杆菌菌种。
Claims (14)
1.马饲料产品,含有一种或多种分离自马的胃或肠粘膜并且有能力在马肠内定居的乳芽孢杆菌菌株。
2.根据权利要求1所述的饲料产品,其特征在于是已用乳芽孢杆菌菌株发酵的饲料,所述乳芽孢杆菌菌株分离自马的胃或肠粘膜并有能力定居在马肠内。
3.根据权利要求1或2所述的饲料产品,其特征在于含有植物乳芽孢杆菌菌株JI:1 DSM 11520或其变种。
4.根据权利要求1或2所述的饲料产品,其特征在于其含有植物乳芽孢杆菌菌株AC:3 DSM 12429或其变种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的饲料产品,其特征在于该饲料是谷物、蔬菜、绿色饲料或干草。
6.根据权利要求1-5任一项所述的饲料产品,其特征在于其是用植物乳芽孢杆菌菌株JI:1 DSM 11520或乳芽孢杆菌种菌株AC:3 DSM 12429发酵的燕麦片糊。
7.根据权利要求1-5任一项所述的饲料产品,其特征在于其是青贮饲料。
8.保藏号为DSM 11520的植物乳芽孢杆菌JI:1或其变种。
9.保藏号为DSM 12429的乳芽孢杆菌种AC:3或其变种。
10.一种或多种分离自马的胃或肠粘膜并有能力定居在马肠内的乳芽孢杆菌菌株在制备用于预防或治疗马肠内菌群失调的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用,所述乳芽孢杆菌菌株是保藏号为DSM 11520的植物乳芽孢杆菌菌株JI:1或其变种。
12.根据权利要求10所述的应用,所述乳芽孢杆菌菌株是保藏号为DSM 12429的乳芽孢杆菌种菌株AC:3或其变种。
13.一种或多种分离自马的胃或肠粘膜并有能力定居在马肠内的乳芽孢杆菌菌株在制备用于预防或治疗马胃炎的药物中的应用。
14.一种或多种分离自马的胃或肠粘膜并有能力定居在马肠内的乳芽孢杆菌菌株在制备用于减少马肠内的乳杆菌亚种和亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的数目的药物中的应用。
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