SE466158B - Analysmetod foer glukosbestaemning i helblod - Google Patents

Description

466 158 2 laboratoriet.

Ett ändamal med töreliggande uppiinning är därför att astadkomma en metod För kvantitativ bestämning av glukos i outspätt helblod genom transmissionsspektro~ fotometri. ' Ett annat ändamal är att astadkomma en torr reagens- komposition ¥ör denna bestämning.

Uppfinningen avser ocksa en metod och ett medel för bestämning av glukos i sma volymer av outspätt helblod.

Med "sma volymer" avses i detta sammanhang volymer mellan 0,1 och 0,001 ml, ¥öreträdesvis mellan 0,02 och 0,001 ml. Enligt uppiinningen är Företrädesvís blodet inte bara outspätt utan ocksa obehandlat.

Metoden enligt uppfinningen bestar i att samman¥öra outspätt helblod med en torr reagenskomposítion som om¥attar glutosdehydrogenas, dia¥oras, NAD, en hemo~ lyserande komposition, en substans med iörmaga att ändra ¥ärg vid paverkan av NADH och diaíoras och att mäta erhallen ëärgförändring med transmissionsspeHtro~ äatometrfii3Dia%emas«baeßemsäfitssrav awa§ogtgvem&andef.

Föreningar av typen tenazín-metosulfat eller Meldola blue. NAD kan ocksa ersättas av analogt verkande före- ningar som t ex den mest kända NADP.

Ett hjälpmedel tör att ut¥öra denna metod är beskrivet i US patent 4,0B8,448.

Reagenskompositionen enligt uppfinningen inneiattar en torr kombination av glukosdehydrogenas, diaforas eller alternativ som ienazin-metosuliat,4enazin-etosulfat, fenazin-íenosuliat och Meldola blue, NAD eller a1ter~ nativ som NQDP, hemolyserande substans eller sub- stanser, substans eller substanser med förmaga att ändra ¥ärg vid paverkan êran NADH och diaioras ¥öre- trädesvis tetrazoliumföreningar. Hemolyserande sub- stanser lämpliga i reagenset kan väljas bland ¥os+o- lipaser, Triton X~100(R), hemolytiska saponiner som escin, digitonin eller tillgängliga blandningar som ;\, 3 466 158 Whita saponin(R>, olika föreningar mellan socksrartsr- och alifatiska kolkodjor C10 till C16 som t ek dodeca~ noyl-M-metylglukamid.

Till grundkompositionsn kan tillföras komponenter som optimerar funktionen vid olika tillämpningar.

Mutarotas kan användas för att övsrföra alfa-glukos snabbt till batafglukos som är den form som reagerar mod glukosdohydrogenas. Dstta är av intresse när analys önskas pa prov som inta tagas direkt fran patient.

Glukosdehydrogsnas bryter nor bota~g1ukos specifikt. I vattonlösningar förekommer alfa- och beta-glukos i en tamporaturavhängig jamnvikt som inställer sig ganska langsamt. Eftarsom kroppstemperatursn är relativt konstant kan mutarotas, som paskyndar jamnviktsinställ- ningan, utoslutas ur reagenset om prov tages av kropps- varmt blod. Fördelarna är, fransett prissänkningen, att reaktionstiden minskar och det analytiska omradet ökar.

Nackdelen är att kalibreringslösningar och kontroll- lösningar bör tempereras i minst en timme.

Gubstanser med pH-paverkande effekt för att säkerställa att arbets-pH ligger inom enzymernas_verksamhetsomràdep, kan tillföras reagenset.

Substanser som paverkar löslighet och hallbarhet pa reagonskompositionen kan tillföras reagenset för olika krävande applikationer.

Ds ingaende komponenterna kan i de flesta fall ersättas med tidigare nämda analoger eller substanser med mot- svarande funktioner. Detta kan förorsakas av pris och tillgänglighetsskäl eller av toxiska- och tillverk- ningstekniska skäl. Glukosdehydrogenas kan erhallas fran olika species med olika molvikter, pH-optimum med mera. Uppfinningen avser med glukosdehydrogenas dock enbart NAD-ellsr Nêßanalogberoende enzym och inte de typer som är syreberoende och arbetar med kinoida co- anzym som ocksa benämnes glukosdehydrogenas. Diaforas kan ocksa komma fran olika species men kan ocksa er- sättas av kända substanser som t ex fenazinmetosulfat, Maldola blue m fl. Till NAD finns ocksa flera kända 466 158 analoger, som t en den mest kända NADP, som kan redu- ceras av glukos/glukosdehydrogenasreaktionen och över-- ¥öra reduktionen till ett iärgsystem.

Ytspänningspaverkande substanser kan behöva användas lör att underlätta vatning av ytor pa bjälpmedlet. Yt~ spänningsnedeattande substanser kan tillsättas tör att underlätta beläggning av hydroioba plastytor. För att anpassa suspensionen till olika typer av beläggnings~ utrustningar kan visknsiteten varieras genom tillsats av lämpliga högmnlekylära pmlymerer. Valet av hög- mdlekylära pmlymerer är inte kritiskt men paverkar upp- lösningshastigheten pa det torra reagenset. Bland an~ vändbara polymerer kan apm exempel nämnas pdlyety1en~ glykdl, polyvinylpyrrdlidmn, dextran och olika cellul- osaderivat. Valet av pdlymer kan ncksa göras med avsikt att fa en stabilisering av suspensionen. Med kännedom om beredningsteknik ¥ran t ex livsmedels-eller- kmametikaindustrin ska det inte valla nagra problem att anpassa reagenset till mlika ytnr.

Ytspänningsnedsättande substanser kan även ha en hemo- lyserande eiiekt sdm t en dekannyl-N-metylglukamid.

Detta är etü:välkänt;¥Ü§HaEIaWáeadem;áär%är«kam- substanser eller kombinationer av substanser användas.

Det finns även hemnlyserande substanser som inte har uttalade vtspänningspaverkande ef¥ekter som t en mellitin nch ëosênlipaser. Färgändrande substanser med iörmaga att andra iärg vid påverkan ëran NADH och dia¥øras åinns ocksa av flera kända typer. Tetrazo1ium~ iöreningar har den ¥ördelen att formazanfärgen bildas írreversibelt vid normala reaktionsbetingelser.3-(4,5- dímetyltiazdl~E-yl)~E.5~di¥enyl-EH-tetrazolium bromid (MTT) ger ett bra resultat i kompositionen men ilera andra tetrazdlium-föreningar är användbara.

Uppiinningen kommer att exempliíieras i det ¥ö1jande under hänvisning till bifogade figurer: Fíg 1. - Reaktiønsformel ¥ör ifragavarande reaktioner.

Fig E. ~ Spridning samt korrelatipn till re¥erensmetdd manga,¿ ,”\ 5 466 158 för "and pnint"~bæstämning.

Fig 3. ~ Hurva övær ræaktiuns¥ör1mpp vid "end point"~ hæmtämningu Fig 4. ~ Spæktra av hemoglobin och MTT-iormazan mad mät» och referensvaglängdar angivna.

Fig 5. ~ Horralation till ræ$eren5mætnd vid kinatisk mätning.

Mätningar är ut4örda pa halblmd som har iörsats med glukmfl iör att uppnå olika glukosnivàer. Hefærensmetod har varit ett glukoædehydrogenas tæstæystæm Fabrikat Mærck, Gluc~DH (R) mætod, typ lïßßó, 13887. Spektro~ iotomætri har ¥ör re¥ærænæmatod@n akett i UV~ømrad@t, 340 nm i ænlighat med bípacksadelsinstruktionen.

Rafærænsmætmden är av typ vatkemisk analysmetod.

Euæmpel 1. Reagenshompositinn 1 ml. 100 U glukosdæhydrogænas (Merck) 20 U diaimraß (Merck) RE mmmwl NAD (Mærck) 30 mmmol MTT (March) “E mg white sapunin 5 mg dæcanoyl~N~metylg1ukamid 1 ml jonhytt vatten Dætta gar än lösning lämplig för frystorkning i mikro~ Huvetter av den typ som beskrivas i US patent 4,0BB,448 av iurmsprutad typ, som ¥inns kommersiellt tillgängliga (Hemocue AB). God reproducerbarhet och linjäritet har erhållits fig (2). Mätningarna har utförts vid 660 nm mæd B80 nm som referensvaglängd och visar "end-point"- mätning.

Emæmpel 3. Reagenskompositinn 1 ml. 1 kU glukosdehydrogenas (Merck) 200 U dia¥oras (Merck) E20 mmmnl NQD (Merck) O,fl mmol MTT (Mærck) TS u..

J mg White sapnnin (R) (EDH) 50 mg Pluronic P 85 (R) (SERVA) 466 158 6 250 mml jmnbytt vatten lngaende komponenter iiniördelas till en suspension som' är lämplig att använda +ör beläggning av ytor med olika trycktekniker som silk~screen, cylindertryck m m. Denna typ av suspension är lämplig tör beläggning av mikro~ kuvetter av delad typ sem beskrivee i US patent 4,oaa,44a.

Exempel 3. Mikrokuvetter, enligt US patent 4,088,448 utiörda i cellulosa-acetatfbutyrat med ca 0,15 mm djup, belades med en reagenskemposition enligt exempel E. med hjälp av en tampontryck~maskin ( 4 tryck). Eiter tork- ning och sammaniogning studerades iunktionerna hos ku~ vetterna med olika helblodprov. Hemolys mättes vid óóü nm och tiden varierade mellan 20 och 4D sek beroende pa mängden erytrocyter. Färgutvecklingen studerades vid samma vagländ och ëör ett helblod med glukoskon~ centrationen ca 12 mmol/L uppnaddes en ur mäteynpunkt tillfredsställande slutpunktseštensL,5.mLn~$iggrf(3).- Figure(4)ovisar~spektat"av.hemogToBin“och=spekfirat'pà* bildad iärg fran ett helblodsprov med ca 12 mmol/L glukos i en kuvett enligt exempel 3. Det framgar klart att det finns goda möjligheter att mata den bildade ¥ormazan¥ärgen utan störande inter¥erens fran hemo- glmbin, likaså att det finns möjlighet att mäta tur- biditet ¥ör bakgrundskompensation utanför dessa spektra. Genom att variera beläggningens tjocklek pa- verkas givetvis reaktionstiderna och i viss man även maximalt bestämbara koncentrationen.

Exempel 4. Reagenskomposition 1 ml. 25 U glukosdehydrogenas med maximal mängd polyetylen~ glykolaldehyd metyleter 750 pakopplad. 5 U diaforas (Merck) 7 mmmol NAD (Merck) SO mmmol MTT (Merck) '\ 7 4 25 mg White eaponin (R) (Merck) O\ O\ ...x (Il CO 1 ml jonbytt vatten Detta ger en lösning lämplig tör fryetorkning analogt med exempel 1. Reageneet är anpassat lör Hinetisk mätf ning, till skillnad ¥ràn 4öregàende exempel som avser elutpunktsmätning. Den lörhàllandevie etora mängden glukoedehydrogenae beror pà den aktivitetesänkning som uppkommer vid pàkoppling av polymermolekylerna. Pàkopp~ ling av polymermolekyler till enzymet ökav stabiliteten vilket är ett välkännt Faktum och önskvärt för tester aveedda lör kínetiek mätning. Optimal polymertyp är inte utteetad och exemplet aveer endast att belysa möjfl ligheten. Polyetylenglykolmonometyletern över¥ördee till eldehyd genom reaktion med dimetylsulåoxid och ättikeyraanhydrid. Efter koppling till glukosdehydro- genes i natríumklorid/karhonatbu4¥ert pH 10, med polymer i överskott, dialyeerades och koncentrerades blandningen. Enzym/polymerkomplexet visade bättre etmbilitet än det rena enzymet. exempel pà resultat lràn kinetiska mätningar med reagens enligt exemplet vieae i figur (5). Mätningarna utfördes vid 660 nm mellan 3loch'3Q75=min mot re+erensvàg1ängdV880 nm.

Claims (5)

10 15 20 25 30 466 158 PATENTKRAV

1. Metod för kvantitativ bestämning av totalglukos i outspätt helblod, k ä n n e t e c k n a d av att ett prov av outspätt helblod bringas i kontakt med ett reagens i torr form som innefattar: - glukosdehydrogenas (GDH); - ett eller flera ämnen ur den grupp som består av diaforas, fenazinmetosulfat, fenazinetosulfat, fenazinfenosulfat och Meldola blue; - ett eller flera ämnen ur den grupp som består av NAD, NADP, tio-NAD, tio-NADP, nikotinamdid- purin-dinukleotid, nikotinamid-metylpurin-dinuk- leotid, nikotinamid-2-klor-metylpurin-dinukleotid; - ett eller flera hemolyserande ämnen ur den grupp som består av fosfolipas, hemolyserande saponiner samt föreningar mellan hydrofila mono-, di- eller trisackarider:ochtalifatiskaïkdiväten»med&lfi+l&r kolatomer; _ - en redoxindikatorfärg i form av ett tetrazolium- salt; och - eventuellt mutarotas; samt att en genom reagensets reaktion med glukos i det out- spädda helblodet uppkommen färgförändring mätes med transmissionspektrofotometri.

2. Metod enligt kravet l, k ä n n e t e c k n a d av att provet av helblod ges en volym på mindre än 20 mikro- liter.

3. Reagenskomposition för kvantitativ bestämning av totalglukos i outspätt helblod, k ä n n e t e c k - n a d av att den föreligger i torr form och att den innefattar: - glukosdehydrogenas (GDH); - ett eller flera ämnen ur den grupp som består av diaforas, fenazinmetosulfat, fenazinetosulfat, fenazinfenosulfat och Meldola blue; 10 15 20 25 30 35

4. t e c k n a d

5. 466 158 q ett eller flera ämnen ur den grupp som består av NAD, NADP, tio-NAD, tio-NADP, nikotinamid- purin-dinukleotid, nikotinamid-metylpurin-dinuk- leotid, nikotinamid-2-klor-6-metylpurin-dinukleo- tid; ett eller flera hemolyserande ämnen ur den grupp som består av fosfolipas, hemolyserande saponi- ner samt föreningar mellan hydrofila mono-, di eller trisackarider och alifatiska kolväten med 10-16 kolatomer; en redoxindikatorfärg i form av ett tetrazolium- salt; och eventuellt mutarotas. Reagenskomposition enligt kravet 3, k ä n n e - av att den innefattar: 7 glukosdehydrogenas, diaforas, NAD, ett eller flera saponin, ett tetrazoliumsalt, och eventuellt mutarotas. Användning av en reagenskomposition, vilken komposition innefattar: glukosdehydrogenas (GDH); ett eller flera ämnen ur den grupp som består av diaforas, fenazinmetosulfat, fenazinetosulfat, fenazinfenosulfat och Meldola blue; ' ett eller flera ämnen ur den grupp som består av NAD, NADP, tio-NAD, tio-NADP, nikotinamid- purin-dinukleotid, nikotinamid-metylpurin-dinukleo- tid, nikotinamid-2-klor-metylpurin-dinukleotid; ett eller flera hemolyserande ämnen ur den grupp som består av fosfolipas, hemolyserande saponiner samt föreningar mellan hydrofila mono-, di- eller trisackarider och alifatiska kolväten med 10-16 kolatomer; en redoxindikatorfärg i form av ett tetrazolium- salt, och 466 158 M? - eventuellt mutarotas, och vilken komposition föreligger i torr form, för ut- förande av en kvantitativ bestämning av totalglukos i outspätt helblod med hjälp av transmissionsspektro- fotometri.