SE455794B - Plasmid med nukleotidsekvens som kodar for aminosyrasekvensen i humant tillvexthormon och forfarande for framstellning derav - Google Patents

Description

455 794 motsvarande DNA-segment, innehållande en sekvens av tripletter, vilken svarar mot proteinets aminosyrasekvens. Den genetiska ko- den visas i nedanstående tabell.

Den biologiska process, som innebär omvandling av den i nuk- leotidsekvensen inneboende informationen till aminosyrasekvens- struktur, innefattar ett första steg, som kallas "transkription".

I detta steg kopieras först, med RNA, ett lokalt DNA-segment vars sekvens föreskriver vilket protein som skall framställas.

RNA är en polynukkntid, som liknar DNA, dock att i RNA ribos ingår i stället för deoxiribos och uracil ingår i stället för tymin.

Baserna i RNA kan bilda samma slags baspar som de i DNA ingående baserna. RNA-transkriptionsprodukten av en DNA-nukkntidsekvens blir därför komplementär till den kopierade sekvensen. Den så er- hållna RNA kallas budbäraFRNA (messenger RNA, mRNA), eftersom den utgör en intermediär produkt mellan cellens genetiska apparat och _ proteinsyntetiseringsapparat.

Inom cellen användes mRNA som mall i en komplice- rad process; denna process, som försiggår med tillhjälp av många olika enzymer och organeller inuti cellen, resulterar 1 syntesen av den specifika aminosyrasekvensen. Denna process kallas "över- sättning" (translation) av mRNA.

Ofta tillkommer ytterligare processteg, som ut- föres för att omvandla den genom översättningen eller translatio- nen syntetiserade aminosyrasekvensen till ett funktionellt pro- tein.

Genetisk kod Fenylalanin (Pm) TTK Histiain (His) cAx Leucin (leu) XTY Glutamin (Gln) CAJ Isoleucin (Ile) ATM ' Asparagin (Asn) AAK Metionin (Met) ATG Lysin (Lys) AAJ Valin (Val) GTL Aspartinsyra (Asp) GÅK Serin (Ser) QRS Glutaminsyra (Glu) GÅJ Prolin (Pro) CCL Cystein (Cys) TGK Treonin (Thr) ACL Tryptofan (Try) TGG 455 794 Alanin (Ala) GCL Arginin (Arg) wgz Tyrosin (Tyr) TAK Glycin (Gly) GGL Stoppsignal TAJ Stoppsignal TGA Anm, Varje med tre bokstäver angiven triplett representerar en trinukleotid i DNA-molekylen, vilken trinukleotid på vänstra sidan har en 5'-ände och pà högra sidan har en 3'-ände. Bokstäverna anger purin- eller pyrimidinbaserna i nukleotidsekvensen.

Manga proteiner, som har betydelse inom medicinen eller för forskningsändamàl, finns i eller tillverkas av cellerna av högre organismer, såsom vertebrater. Bland dessa proteiner kan exempel- vis nämnas hormonet insulin, andra peptidhormoner, såsom tillväxt- hormon, proteiner som är verksamma i samband med reglering av blod- trycket, och olika sorters enzymer som är av betydelse inom indus- tri, medicin eller forskning. Ofta är det svårt att erhålla sådana proteiner i användbara mängder medelst extrahering ur organismen; speciellt akut är detta problem när det gäller proteiner av humant ursprung. Det föreligger därför ett behov av teknologi för åstad- kommande av att dylika proteiner i acceptabla mängder kan tillver- kas av celler utanför organismen i fråga. I vissa fall kan man er- hålla lämpliga cell~linjer, som kan hållas vid liv medelst Vävnads- kulturteknik. Emellertid växer cellerna endast långsamt i vävnads- kultur, varjämte odlingsmediet är dyrt, betingelserna måste inreg- leras noggrant, och utbytena är låga. Dessutom är det i många fall svårt att bibehålla en odlad cell-linje, som har önskade, differen- tierade karakteristika.

Beträffande mikroorganismer - såsom bdierier - gäller däremot, att de relativt lätt kan odlas i kemiskt definierade medier. Jäs- ningsteknologin är en mycket långt avancerad teknologi och kan kon- trolleras väl. Organismerna växer snabbt, och man kan erhålla höga utbyten; Därtill kommer dessutom, att vissa mikroorganismer grund- ligt karakteriserats genetiskt; detta i så hög grad att de kan räk- nas till de bäst karakteriserade och bäst utforskade organismerna.

Det är därför mycket önskvärt att en gen, som utgör kod för ett från medicinsk synpunkt viktigt protein, skall kunna överföras från en proteinet normalt tillverkande organism till en lämplig mikroorganism. På detta sött kan proteinet sedan tillverkas av 455 794 mikroorganismen under kontrollerade tillväxtbetingelser och erhål- las 1 önskade mängder. Det är ävenledes möjligt, att tack vare ett sådant förfarande den totala kostnaden för det önskade proteinets tillverkning skulle kunna minskas i avsevärd grad. Dessutom måste möjligheten att dels isolera den genetiska sekvens, som bestämmer produktionen av ett visst bestämt protein, dels överföra denna sek- vens till en mikroorganism, som har en väldefinierad genetisk bak- grund, anses utgöra en synnerlínnn värdefull tillgång för forsk- ningen i syfte att undersöka, hur syntesen av ett sådant protein inregleras och vilka fortsatta processer proteinet undergár efter att ha syntetiserats. Dessutom kan isolerade genetiska sekvenser ändras så att de utgör kod för variantproteiner, vilka uppvisar ändrade terapeutiska eller funktionella egenskaper.

Genom föreliggande uppfinning blir det möjligt att uppnå ovan- nämnda syften. Uppfínningen avser sålunda en plasmíd lämpad för överföring av en gen till en Escherichia coli-bakterie, och den- na plasmíd kännetecknas av att den i sin nukleotidsekvens inne- håller en sekvens som kodar för aminosyrasekvensen i humant till- växthormon och omfattar 5'---TTR,CCL2ACL3ATM4CCL5X6TY6QR7S7W¿GZ5X9TY9TTK,OGAKIIAAKI2 GCL,3ATG,,X,STY,SWIGGZ,6GCL,;CAK,$W,9GZ19X20TY20CAK2,CAJ22X23 TY23GCL24TTK25GAK2GACLZ7TAR28CAJ29GAJ30TTK3,GAJ32GAJ33GCL3, TAK35ATM36CCL37AAJ38GAJ39CAJ4OAAJ4,TAK,2QR43S43TTK44X45TY,5 CAJ4sAÅK41CCL4aCAJ49ACLsoQRs15sjXs2TYs2TGKssTTKs4QRss3ssGA5se QRs15s1ATMssCCLseACLsoCCLs1QRG25e2ÅAKssWs4GZe4GAJssGÅJssÅCLs7 CAJssCAJssÅAJ1oQR71511AÅKv2X?aTYvaGÅJ14X1sTY1sX?eTYvsW11GZ17 ATM1sQR1s51sXsoTYsoXs1TYs1Xs2TYs2ATMaaCAJa4QRss5asTGGasXs1 TY¿7GAJs¿CCL¿9GTL90CAJ9ITTKQQXQ3TY93W9,GZ94QR95S§5GTL96TTK91 GCLssAÅKeeQR1oo51ooX1o1TY1o1GTL1o2TAK1o3GGL1o4GCL1osQR1oe51os GÅR:o7QR1os5:osAAK1osGTL11oTAK111GAK112X1:sTY11aX::4TY114 ÅÅ311sGÅK11sX11ïTY111GÅ311sGAJ11eGGL:2oATM:21CÅJ122ACL12s X124TY124ÅTG12sGGL12eW:21GZ:21X:2eTY:2sGAJ:2sGÅK:soGGL1s: QR1s251a2CCL1ssW1s4GZ1a4ACL1ssGGL1ssCÅ3:a1ATW1asTTK1asAÅJ:4o CA3141ÄCL142TÅK14sQR1445144AAJ14sTTK14eGAR141ACL:4sÄÅK14s QR1so51soCAK1s1AÅR1s2GÅK1saGÅK:s4GCL1ssX:saTY1scX1s1TY1s1 A331ssAAK1seTAH1soGGL1e1X:e2TY1e2X1esTY1saTÅR1s4TGK1asTTK1sc W:s1GZ1s1AA31esGAK1ssÅTG11oGÅK111AÅ3:v2GTL:1sGÅJ1v4ÄCL1vs TTK11sX117TY177W17sGZ11sATN11eGTL1soCA31s1T5K1szW:ssGZ1sa QR1s451s4GTL1ssGAJssGGL1s1QR:ss5:asTGK1s9GGL1euTTR;f'3' * 5 455 794 där A är deoxiadenyl, G är deoxiguanyl, C_är deoxicytosyl, T är tymidyl, J är A eller G; K är T eller C; L är A, T, C eller G; M är A, C eller T; xnär T eller C' °m Yn är A eller G, och C om Yn är C eller T; Yn är A, G, C eller T, om Xn är C, och A eller G om Xn är T; Wn är C eller A, om Zn är G eller A, och C om Zn är C eller T; Zn är A, G, C eller T, om Wn är C, och A eller G om W” är A; QRn är TC, om Sn är A, G, C eller T, och AG om Sn är T eller C; Sn är A, G, C eller T, om QRn är TC, och T eller C om QRn är AG och indexsiffrorna, n, anger aminosyrornas ställning i humant tillväxthormon, för vilket nukleotidsekvensen utgör motsvarig- het i enlighet med den genetiska koden, varvid aminosyraställ- ningarna är numrerade utgående från aminoänden.

Den ovan angivna sekvensen är korrekt och skiljer sig från den som anges i krav 1 genom att AAK100 har rättats till QR100 S100 och CAK153 har rättats till GAK153. De ursprungliga felaktiga uppgifterna härrör från oavsiktliga fel vid utskriv- ningen av försöksresultaten från sekvensbestämningen av genen. En fackman_skulle icke ha blivit vilseledd av de felaktiga uppgif- terna, eftersom Bewly et.al. redan är 1972 (International Journal of Peptide Research, 1972 (4), 281-287) angav Ser/AGC i position 100 och Asp/GAT i position 153 för humant tíllväxthormon.

Den ovan angivna plasmiden framställes genom ett för- farande som omfattar följande steg: ?455 794 (a) man isolerar mRNA från hypofysceller genom att homo- genisera hypofyscellerna i närvaro av en RNas-inhibitorkompo- sition innehållande 4M guanidiniumtiocyanat od10,O&-1,0M B-mer- kaptoetanol vid pH 5,0-8,0, varigenom RNas-nedbrytning av denna mRNA förhindras; (b) man framställer cDNA med en nukleotidsekvens som kodar för tillväkthormon genom att pà i och för sig känt sätt behand- la utvunnen mRNA med ett reverstranskriptas, varefter denna CDNA göres dubbelsträngad; (c) man fäster sekvenser med ett igenkânningsställe för ett restriktionsendonukleas vid ändarna av den erhållna dubbel- strängade cDNA, varvid restriktionsendonukleaset är detsamma som i steg (d) nedan, varefter resulterande cDNA spjälkas med restriktionsendonukleaset under bildning av kohesiva ändar; (d) en bakterieplasmid öppnas med restriktionsendonukleas} t ex Hind III eller Hsu I, till bildning av en öppnad plasmid- vektor med kohesíva ändar; (e) 5'~fosfatändgrupperna av den i steg (d) erhållna plas- midvektorn hydrolyseras genom behandling med alkaliskt fosfa- tas, t ex vid pH 8,0 och temperaturen 65°C under 30 min, vari- genom de under (d) nämnda kohesíva ändarna göres oförmögna att sammanbindas med varandra; och (f) den i steg (e) behandlade plasmídvektorn sammanbindes med den i steg (c) erhållna cDNA genom inkubering i närvaro av DNA-ligas och ATP, t ex vid pH 7,6 och temperaturen 14°C under 1 h med användning av ett molärt överskott av plasmidvektorn, varigenom man erhåller en plasmid med en nukleotídsekvens som kodar för tillväxthormon.

Uppfinningen omfattar sålunda bl.a. ett förfarande med en komplex serie av steg, som innefattar enzymkatalyserade reaktioner.

I det följande beskrives principerna för dessa enzymreaktioner, såsom man i enlighet med hittills känd teknik uppfattar dem.

Revers-transkriptas katalyserar syntes av DNA, som är komple- mentär till en som mall (template) tjänstgörande RNA-sträng, vil- ken syntes sker i närvaro av dels RNA-mallen, dels en s.k. "pri- mer" (starten dirigerande molekyl), som utgöres av en oligodeoxi- nukleotid, dels de fyra deoxinukleosidtrifosfaterna dATP. dGTP, dCTP, TTP. Reaktionen initieras genom att oligodeoxinukleotidmole- kylen bindes icke-kovalent till mRNA-molekylens 3'-ände; därefter m 1 455 794 följer stegvis addition av de "rätta" deoxinukleotiderna till den växande kedjans 3'-ände. d.v.s. addition av de deoxinukleotider, som i enlighet med basparbildningsreglerna är de "rätta" för de i den aktuella mRNA-nukleotidsekvensen föreliggande baserna. Den härvid som produkt erhållna molekylen kan beskrives som en hårnål- formig struktur, innehållande den ursprungliga RNA tillsammans med en komplementär sträng av DNA, vilken är sammanbunden med den ur- sprungliga RNA medelst en av en enda sträng bestående DNA-slinga.

Revers-transkriptas kan även katalysera en liknande reaktion med användning av en mall (template). som är en DNA bestående av en enda sträng; 1 detta fall erhålles som produkt en hårnàlformig I DNA som består av två strängar och har en slinga av ensträngs-DNA som förbindelse mellan molekyldelarnas ändar. Se Aviv. H. och Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 6Q¿ 1408 (1972), samt Ef- stratiadis, A., Kafatos. F.C., Maxam:-ÄTF. och Maniatis. T.. Qgll 1. 219 <19v6>.

Hestriktions-endonukleaser är enzymer med förmåga att hydro- lysera fosfodiesterbindningar hos tvåsträngs-DNA, varigenom ett avbrott uppstår 1 DNA-strängens kontinuitet. Om DNA-molekylen fö- religger i form av en sluten ring eller ögla,omvandlas denna till en linjär struktur. Vad som är speciellt utmärkande för ett enzym av denna typ är att dess hydrolyserande verkan kommer till stånd endast vid ett ställe, där en specifik nukleotidsekvens förelig- ger. En sådan sekvens kallas "igenkänningsställe" för restrik- tions-endonukleaset. Restriktions-endonukleaser från olika källor har isolerats och karakteriserats, varvid karakteriseringen skett i form av identifiering av nukleotidsekvensen hos de för dessa enzymer gällande igenkänningsställena. Några restriktions-endo- nukleaser hydrolyserar fosfodiesterbindningarna på båda strän- garna vid samma ställe, så att "stumt avskurna" ändar uppstår.

Andra katalyserar hydrolys av bünningar på inbördes förmqutna ställen, i det att dessa ställen ligger på ett inbördes avstånd av några få nukleotider. Härvid bildas fria ensträngsregioner vid varje ände av den uppspjälkade molekylen. Sådana ensträngsändar är självkomplementära och fördenskull kohesiva; de kan användas för att åter sätta ihop den hydrolyserade DNA-molekylen. Efter- som vilken som helst DNA, som är spjälkbar medelst ett dylikt enzym, mäste innehålla samma igenkänningsställe. kommer samma kohesiva ändar att bildas; därigenom blir det möjligt att he- terologa sekvenser av DNA, vilkar har behandlats med restrik- '455 794 tions-endonukleas,sammanlänkas med andra sekvenser, vilka har behandlats på liknande sätt. Se Roberts, R.J., Q§L§¿_§g!¿_§12; 9g3m¿ Q, 12) (1976). Restriktionsställen är relativt sällsynta, men användbarheten av restriktions-endonumeaser har ökats i betydande grad genom kemisk syntes av oligonukleotider. som består av två strängar och uppvisar restriktionsställets sek- vens. I själva verket kan därför praktiskt taget vilket DNA- -segment som helst kopplas till vilket annat segment som helst genom att man helt enkelt binder en passande restriktions-oligo- nukleotid till molekylens ändar_och underkastar produkten in- verkan av det motsvarande restriktions-endonukleaset, så att den hydrolyseras av detta endonukleas och därigenom ger upphov till bildning av de erforderliga. kohesiva ändarna. Se Heyneker, H.L., Shine. J., Goódman, H.M., ßoyer, H.W., Rosenberg,J., Dickerson, R.E., Narang, S.A.,>Itakura, K., Lin, S. och Riggs, A.D.. flatugg g§§, THB (l976), samt Scheller, R.H.,D1ckerson, R.E., Boyer, H,w., fiiggs. A.D. och Itakura, K., §gigggg šgš, 177 (1977)- Sl-endonukleas är ett enzym, som har generell specificitet' och har förmåga att hydrolysera fosfodiesterbindningarna ho-s an- tingen av en enda sträng bestående DNA eller av en enda sträng bestående luckor eller slingor i en DNA-molekyl, som i övrigt be- står av två strängar. Se Vogt, V.M., Eur. J. Biochem.}§, 192 (wmi . "_ _ DNA-ligas är ett enzym,'som har förmåga att katalysera bild- ning av en fosfodiesterbindning mellan två DNA-segment med en 5'-fosfatgrupp resp. en 3'-hydroxylgrupp, avcbn typ som skulle kunna bildas av två DNA-fragment, vilka är sammanhállna medelst kohesiva ändar. Enzymets normala funktion antas vara sammanbind- ning av korta avsnitt (nicks), som består av en enda sträng, i en i övrigt av två strängar bestående DNA-molekyl. Under lämpliga be- tingelser har emellertid DNA-ligaset förmåga att katalysera sam- manbindningäv "stumt avskurna" ändar, varvid två molekyler med dylika "stumma" ändar sammanlänkas kovalent. Se Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. och Khorana, H.G. Proc. Natl. Acad.Sci.USA, gg. 11162 (me).

Alkaliskt fosfatas är ett enzym, som har generell specificí- tet och har förmåga att hydrolysera fosfatestrar - däribland i 5'-ändställning bundna fosfater på DNA. 9 , 455 794 Ytterligare ett steg 1 det avsedda förfarandet 1 dess helhet är införandet av ett soecifikt DNA-fragment i en plasmid. Hed "plasmid" avses en autonomt replikerande DNA-en- het av vilket som helst slag, som kan finnas 1 en mikrobcell, un- dantagandes själva värdcellens egen genom. En plasmid är icke genetiskt kopplad till värdcellens kromosom. Plasmid-DNA-moleky- ler finns 1 form av ringformiga, av två strängar bestående moleky- ler med en molekylvikt, som vanligen är av storleksordningen någ- ra få miljoner, ehuru nâgra har en molekylvikt överstigande 10 , och de utgör i regel endast en liten procentuell mängd av cellens totala DHA. Plasmid-DNA kan vanligen separeras från värdcells-DNA på grund av att dessaolika slags DNA-molekyler har så olika stor- lek. Plasmider kan undergå replikering oberoende av den hastighet, med vilken värdcellens delning sker; i vissa fall kan deras re- plikeringshastighet kontrolleras av forskaren genom variationer 1 tillväxtbetingelserna. Ehuru plasmiden föreligger i form av en sluten ring. är det möjligt att på konstgjord väg införa ett DNA- -segment 1 plasmiden; härigenom bildas en rekombinant-plasmid med större molekylstorlek, utan att dess förmåga att replikera eller att uttrycka de plasmidburna generna påverkas 1 någon avse- värd grad. Plasmiden är därför värdefull som vektor för överför- ing av ett DNA-segment till en ny värdcell. Plasmider, vilka är användbara för den teknologi, som avser rekombinant-DNA, innehål- ler i typiska fall sàdanagpner, som kan vara till nytta för selek- tionsändamål, t.ex. gener för motståndskraft mot droger eller me- diciner. _ Genom att DNA kan erhållas med en specifik sekvens, som utgör den genetiska koden för ett specifikt protein, blir det möj- ligt att modifiera nukleotidsekvensen på kemisk eller biologisk väg på sådant sätt, att även det slutligen bildade specifika pro~ teinet modifieras. Härigenom blir det möjligt att framställa t.ex. ett modifierat tillväxthormon, som är "skräddarsytt" för ett spe- cifikt medicinskt behov. Den genetiska kapaciteten att producera en vilken som helst med tillväxthormon besläktad aminosyrasekvens med de viktigaste funktionella egenskaperna hos tillväxthormon kan därför överföras på en mikroorganism. -455 794 10 Tack vare det att den genetiska koden för ett specifikt pro- tein, som krävs för den normala metabolismen hos någon viss be- stämd högre organism, kan överföras till en mikroorganism, t. ex. en bakterie, får man stora möjligheter för odlingsproduktion av dylika proteiner. Detta i sin tur ger stora möjligheter att öka produktionen av sådana proteiner eller ersätta dem med proteiner framställda av enligt uppfinningen ändrade mikroorganismer, när- helst den högre organismens förmåga att fungera normalt vid pro- duktionen av sådana proteiner har blivit nedsatt. I samband'här- med kan man även se möjligheten att t.ex. upprätta Symbiosför- hållanden mellan mikroorganismer, som framställts enligt förelig- gande uppfinning, och människor med kroniska eller akuta brist- sjukdomar, varvid mikroorganismer, som ändrats genetiskt i enlig- het med föreliggande uppfinning, skulle kunna implanteras hos eller på annat sätt associeras med patienten i syfte att få en kompensa- tion för de patologiska bristerna 1 patientens metabolism.

Mera speciellt avser uppfinningen ett förfarande för isolering av en specifik nukleotidsekvens, innehållande genetisk information, syntes av DNA med den specifika nukleotidsekvensen, och överföring av denna DNA till en som värd tjänstgörande bakterie.

Vid förfarandet enligt uppfinningen isoleras först en utvald cell- population medelst en förbättrad metod. Intakt mRNA extraheras från cellerna medelst ett nytt förfaringssätt, vid vilket prak- tiskt taget all ribonukleas-aktivitet undertryckes. Intakt mRNA renas från extraktet medelst kolonnkromatografi och underkastas inverkan av enzymet revers-transkriptas, som verkar i närvaro av de fyra deoxinukleosidtrifosfater, som behövs för syntetisering av en komplementär (cDNA)-sträng. Produkten av denna första reak- tion med revers-transkriptas underkastas ett förfarande, vid vil- ket ribonukleotidsekvensen avlägsnas selektivt. Den då kvarvaran- de deoxinukleotidsekvensen, som är komplementär till den ursprung- liga mRNA, inkuberas i en andra reaktion med revers-transkriptas eller DNA-polymeras i närvaro av de fyra deoxinukleosidtrifosfa-_ terna. Den produkt. som då erhålles, är en dubbel cDNA-struktur. vars komplementära strängar vid ena änden är sammanlänkade via en slinga, bestående av en enda sträng. Denna produkt behandlas se- _dan med ensträngs-specifikt nukleas. som spjälkar den av en sträng - 455 794 11 bestående slingan. Den då bildade, av två strängar bestående cDNA förlängas sedan genom att man vid båda dess ändar adderar en spe- cifik DNA, innehållande en sekvens, som utgör ett igenkänningsstäl- le för ett restriktionsenzym. Adderingen katalyseras medelst ett DNA-ligasenzym. Därefter behandlas den förlängda cDNA med ett re- striktions-endonukleas, och på detta sätt bildas vid Sïändställ- ningarna hos varje sträng själv-komplementära, av en enda sträng bestående nukleotidsekvenser.

En plasmid-DNA, som uppvisar ett igenkänningsställe för samma restriktions-endonukleas, behandlas med detta enzym, så att-poly- nukleotidsträngen spjälkas och vid 5'-ändställningarna nukleotid- sekvenser bildas. vilka består av en enda sträng och är själv-kom- plementära.

På de av en enda sträng bestående ändpartierna avlägsnas de i 5'-ändarna befintliga fosfatgrupperna för att förhindra, att plasmiden bildar en ringstruktur med fömåga att omvandla en värd- cell. Den preparerade cDNA och den preparerade plasmid-DNA inku- beras tillsammans i närvaro av DNA-ligas. Under de beskrivna re- aktionsbetingelserna kan en livsduglig sluten ring av plasmid-DNA bildas endast om ett segment av cDNA inkluderas. Plasmiden, som innehåller cDNA-sekvensen, införes sedan i en lämplig värdcell. De celler, som har tagit emot en livsduglig plasmid, kan kännas igen genom uppkomsten av kolonier med ett genetiskt särdrag, som de har fått av plasmiden, t.ex. motståndskraft mot en drog. Man odlar se- dan upp rena bakteriestammar, som innehåller rekombinant-plasmiden med den däri inkorporerade cDNA-sekvensen, och rekombinant-plasmi- den isoleras ånyo. Stora mängder rekombinant-plasmid-DNA kan fram- ställas på detta sätt, och den specifika cDNA-sekvensen kan åter- isoleras ur denna plasmid genom endonukleolytisk spjälkning med det passande restriktions-enzymet.

Uppfinningen beskrives nedan i större detalj.

Enligt några utföringsformer av uppfinningen avses ett för- farande för isolering av en DNA-molekyl med en specifik nukleotid- sekvens och dess överföring till en mikroorganism, varvid den ur- sprungliga nukleotidsekvensenav nämde DNA förefinnes efter repli- kering i den organism, till vilken nämnda överföring skett.

Förfarandet enligt uppfinningen kan indelas i fyra generella steg. 455 794 ,2 l. Isolering av en önskad cellpopulation från en högre organism.

Det finns tvâ potentiella källor för en genetisk sekvens, som utgör kod för ett specifikt protein: Dels själva DNA i den som käl- la valda organismen, dels en RNA-transkriptionsprodukt (RNA trans- cript) av denna DNA. Enligt de f.n. gällande säkerhetsföreskrifterna i USA, utfärdade av National Instítutes of Health, får humana gener av ett vilket som helst slag införas i först rekombinant-DNA och se- dan bakterier endast efter det att generna mycket omsorgsfullt re- nats eller också i speciella för hög risk byggda lokaler (P4). Se Federal Register vol. ül, nr.'l3l, 7 Juli 1967, sid. 27902-å794}.

När det gäller förfaranden med potentiell användbarhet för produk- tion av humant protein, t. ex. föreliggande förfarande, föredrar man därför alltid att gå den vägen, att man isolerar specifik mRNA med en nukleotidsekvens, som utgör kod för det önskade proteinet.

Detta tillvägagångssätt har dessutom den ytterligare fördelen, att ifrågavarande mRNA kan renas lättare än från cellen extraherad DNA.

Speciellt kan nämnas, att man kan dra fördel av den omständígheten, att det när det är fråga om högt differentierade organismer, såsom vertebrater, kan vara möjligt att identifiera en specifik popula- tion av celler med specifikt säte 1 organismen, vilkas funktion i första hand är just producerandet av det aktuella proteinet. Alter- nativt kan en sådan population ev. existera under ett övergàngssta- dium i organismens utveckling. Vid sådana cellpopulationer kommer en stor del av den mRNA, som isolerats från cellerna, att ha den önskade nukleotidsekvensen; Av dessa skäl kan valet av cellpopula- tion, som skall isoleras, och den använda isoleringsmetoden, inne- bära en betydande fördel med avseende på den initiala renhetsgraden av den från cellpopulationen isolerade mRNA.

Hos de flesta vävnader, körtlar och andra organ är cellerna sammanhållna av ett i stort sett fibröst nätverk av bindväv. Denna består i främsta rummet av kollagen, men kan även innehålla - be- roende på vilken bindväv det är fråga om - andra strukturella pro- teiner, polfinckarider och mineralavsättningar. När celler skall isoleras från en given vävnad måste man nödvändigtvis använda sig av tekniska metoder för frigörande av cellerna från den "grund- massa", som utgöres av bindväven. Isolering och rening av specifi- ka, differentierade celltyper_omfattar därför två huvudsteg: Se- parering av celler från bindvävs-grundmassan och separering av 455 794 13 celler av den önskade typen från alla de andra celltyperna, som finns i vävnaden.

I många fall visar det sig att andelen önskad mRNA kan ökas genom att man drar fördel av cellernas reaktioner på stimuli i deras omgivning. Exempelvis kan behandling med ett hormon ev. ge upphov till ökad produktion av den önskade mRNA. Andra metoder är bl.a. odling vid någon viss bestämd temperatur och exponering för något specifikt näringsämne eller annat kemiskt ämne.' 2. Extrahering av mRNA. _ Ett viktigt särdrag hos förfarandet enligt föreliggande upp- finning är att RNas-aktivitet (ribonukleasaktivitet) 1 cellextrak- tet elimineras i huvudsak.fullständigt. Den mRNA, som skall ex- traheras, är en enda polynukleotidsträng, som alltså icke uppvi- sar baspar-sammanbindning med någon komplementär sträng. Hydroly- tisk spjälkning av en enda fosfodiesterbindning i sekvensen skul- le därför göra hela molekylen oanvändbar för överföring av en intakt genetisk sekvens till en.mikroorganism. Såsom ovan omnämnts har enzymet RNas stor spridning, aktivitet och i synnerhet stabi- litet. Detta enzym finns på huden; det överlever på glasföremàl vanliga tvättningsoperationer och förorenar i vissa fall förråd av Organiska kemikalier-,Problemet att RNas finns närvarande som en förorening föreligger i princip vid alla slags vävnader, och föreliggande förfarande för elimínering av RNas-aktivitet är till- lämpbart på alla sorters vävnader.

Enligt föreliggande uppfinning användes i kombination en kao- tropisk anjon, en kaotropisk katjon och ett disulfidbindningar upp- brytande medel under cellernas sönderbrytning och under alla för- faringssteg, som erfordras för separering av en i huvudsak från protein fri RNA. Att de nyss angivna medlen samverkar effektivt har visats genom deras användning vid isolering av i huvudsak icke-nedbruten mRNA ur isolerade hypofysceller, _ varvid goda utbyten av produkten har erhållits.

Valet av lämpliga kaotropiska joner bör baseras pà deras löslighet 1 vattenhaltiga medier och pà lättillgängligheten till dessa material. Lämpliga kaotropiska katjoner är bl.a. guanidinium, karbamoylguanidinium, guanylguanidinium, litium och liknande.

Lämpliga kaotropiska anjoner är bl.a. jodid, perklorat, tiocyanat, dijodsalicylat och liknande. Hur stor relativ effektivitet, som 455 794 14 erhålles med salter bildade genom kombination av sådana kat- och anjoner, beror till en del pà deras löslighet. Exempelvis är li- tiumdijodsalicylat ett kraftigare denatureringsmedel än guanidi- niumtiocyanat, men dess löslighet är endast ca O,lM och dessutom är detta salt tämligen dyrt. Guanidiniumtiocyanat utgör den före- dragna katjon-anjon-kombinationen enär detta salt är lättillgäng- ligt och är 1 hög grad lösligt i vattenhaltiga medier; löslig- heten är upp till ca 5M.

Beträffande tiolföreningar, såsom t. ex. ß-merkaptoetanol, vet man att de bryter upp intramolekylära disulfidbindningar i proteiner genom en tiol-disulfidutbytesreaktion. Många lämpliga tiolföreningar är kända för att vara verksamma för detta ändamål; förutonxß-merkaptoetanol kan nämnas t. ex. ditiotreitol, cystein. propanoldimerkaptan och liknande. Löslighet i vattenmedier är nöd- vändig, eftersom tiolföreningen måste förefinnas i stort över- skott relativt de intramolekylära disulfiderna för att utbytes- reaktionen skall bli i huvudsak fullständig. Man föredrar ß-mer- kaptoetanol, enär denna förening är lättillgänglig till en rimlig kostnad.

När det gäller inhibering av RNas under extraheringen av RNA ur celler eller vävnader, kommer effektiviteten av ett givet kao- tropiskt salt att vara direkt beroende av dess koncentration. Den föredragna koncentrationen är fördenskull den högsta praktiskt möjliga. En anledning till att man enligt föreliggande uppfinning lyckas bibehålla mRNA intakt under extraheringen förmodas vara den snabbhet, med vilken RNaset denatureras, förutom den utsträck- ning, i vilken denatureringen sker. Detta torde förklara att t. ex. guanidiniumtiocynat är ett så mycket bättre medel än hydroklori- den trots att hydrokloriden i och för sig i endast ringa grad är svagare som denatureringsmedel. Ett denatureringsmedels effekti- vitet eller verksamhet definieras som den tröskelkoncentration. som erfordras för att åstadkomma fullständig denaturering av ett protein. Denatureringshastigheten är däremot hos många proteiner beroende av denatureringsmedlets koncentration relativt tröskel- värdet upphöjt med 5:te till lO:de potensen. Se Tanford, C.A., Adv. Prot. Chem. gg, 121 (1968). kvalitativt synes detta förhål- lande ge vid handen, att ett denatureringsmedel, som har endast något litet kraftigare verkan än guanidiniumhydroklorid, kan de- naturera ett protein flera gånger snabbare vid samma koncentra- 15 4ss 194 tion. Företiden för föreliggande uppfinning torde sambandet mel- lan RNas-denatureringens kinetik och mRNA-molekylens intakthàl- lande under dess extrahering ur cellerna icke ha upptäckts eller utnyttjats. Om ovanstående analys är korrekt tyder detta på att det föredragna denatureringsmedlet bör vara ett sådant, som har en låg tröskelkoncentration för denaturering i kombination med hög löslighet i vattenmedier. Av denna anledning föredras guani- diniumtiocyanat framför litiumdijodsalicylat trots att sistnämnda ämne är ett kraftigare denatureringsmedel, emedan guanidiniumtio- cyanatets löslighet är mycket större och detta ämne fördenskull kan användas vid en koncentration, som medger snabbare RNas-in- aktivering. Ovanstående analys förklarar ävenledes, varför guani- diniumtiocyanat föredras framför det i jämförbar grad lösliga hydrokloridsaltet: Guanidiniumtiocyanatet har något kraftigare verkan som denatureringsmedel.

Användning av ett disulfidbindningar uppbrytande medel i kombination med ett denatureringsmedel ökar denatureringsmedlets effektivitet genom att RNas-molekylen då kan komma att vecklas ut fullständigt. Man tror, att tiolföreningen ökar denatureringspro- cessens förlopp i "framåt"-riktning genom att förhindra snabb re- naturering, vilken kan inträda när de intramolekylära disulfid- bindningarna lämnas intakta. Ev. i mRNA-preparatet kvarvarande, kontaminerande RNas kommer dessutom att förbli i huvudsak inak- tivt, t.o.m. i frånvaro av denatureringsmedlet och tiol, Disulfid bindningar uppbrytande medel, som innehåller tiolgrupper, är i viss mån verksamma vid vilken koncentration som helst; men gene- rellt sett föredrar man ett stort överskott av tiolgrupper i för~ hållande till de intramolekylära disulfidbindningarna i syfte att driva utbytesreaktionen i riktning mot spjälkning av intramoleky- lära disulfidbindningar. Å andra sidan är emellertid många tiol- föreningar illaluktande och obehagliga vid handhavande i höga kon centrationer; det finns således en praktisk övre koncentrations- gräns. Vid användning av'ß-merkaptoetanol har koncentrationer 1' omrâdet från 0,05M till l,0H visat sig vara verksamma, och 0,2M anses optimal.

Mediets pH-värde under extraheringen av mRNA från celler kan ligga var som helst i intervallet pH 5,0 - 8,0- 455 794 Ä 16 Efter celluppbrytningssteget separeras BNA från det huvudmas- san bildande cellproteinet och DNA. Flera olika tillvägagångssätt har utvecklats för detta ändamål. Alla dessa sätt är kända, och vilket som helst bland dem är lämpligt. En vanlig känd teknik är ett förfarande med etanolutfällning, där RNA selektivt utfälles.

Vid den enligt föreliggande uppfinning föredragna tekniken elimi- neras utfällningssteget och skiktas homogenatet direkt på en 5.7M cesiumkloridlösning i ett centrifugrör, varpå detta rör underkas- . tas centrifugering såsom beskrives av Glisin, V., Crkvenjakov, R., och Byus C., Biochemistrv lä, 2633 (l97Ä). Detta förfarande före- dras emedan därvid hela tiden en Rflas-fientlig miljö upprätthål- les och REA utvinnes i högt utbyte, fri från både DNA och protein.

Vid ovan beskrivna processer kommer den totala RNA att renas från cellhomogenatet. Endast en del av denna RNA är emellertid den önskade mRNA. För att ytterligare rena den önskade mRNA drar man fördel av det fenomenet att i celler av högre organismer mRNA efter transkriptionen undzrgår ytterligare processteg i cellen, i det att polyadenylsyra bíndes vid denna mRNA. Sådan mRNA, som inne- håller vid densamma bundna polyn-sekvenser, kan selektivt isoleras medelst kromatografi på kolonncr av cellulosa med vid cellulosan bundet oligotymidylat - såsom drtta beskrivits av Aviv, H. och Leder, P., loc. cit. Ovan angivna förfaranden är tillfyllest för att ge i huvudsak ren, intakt, översättningsbar mRNA från källor, vilka är rika på RNas. Rening av mRNA och efterföljande förfaran- den in vitro kan utföras på'i huvudsak ett och samma sätt - obero- ende av vilken sort mRNA det är fråga om och oberoende av vilken organism, som tjänstgjort som källa.

Under vissa omständigheter, exempelvis vid användning av väv- nadskulturceller som källa för mRNA, kan kontamineringen med Rflas ev. vara tillräckligt obetydlig för att nyss beskrivna metod för RNas-inhibering skall bli överflödig. I sådana fall kan ev. kända metoder för minskning av Rflas-aktivitet vara tillfyllest. 3. Bildning av cDNA.

De återstående stegen i förfarandet åskådliggöres schematiskt på bifogade ritning. Första steget är bildning av en_DNA-sekvens, som är komplemcntär till den renade mRNA. Det enzym, man helst an- vänder för denna reaktion, är revers-transkriptas, ehuru man 1 17 ~ 455 ?94 princip skulle kunna använda vilket enzym som helst som har förmå- ga att bilda en DNA-sträng, vilken är en trogen komplementärsträng till ifrågavarande mRNA-mall. Reaktionen kan utföras under betin- gelser, som är kända och beskrivna, med användning av mRNA som mall och en blandning av fyra deoxinukleosidtrifosfater som pre- kursorer för DNA-strängen. Man kan lämpligen se till att ett av deoxinukleosidtrifosfaterna märks med 32? i u-ställningen; på så sätt kan man övervaka reaktionens gång, införa en lämplig märk- ningssubmæms för utvinning av produkten efter sådana separerings- åtgärder som kromatografering och elektrofores, och få möjlighet till kvantitativa uppshmtningar beträffande utvinningen. Se Ef- stratiadis, A., et al., loc.eit.

Som framgår av ritningsfiguren är produkten från reaktionen med revers-transkriptas en "hàrnål". Den har två strängar, en RNA och en DNA. De är icke-kovnlent sammanbundna.

Produkten från revers-transkripasreaktionen avlägsnas ur reaktionsblandningen i enlighet med kända standardmetoder. Det har visat sig vara ändamålsenligt att använda en kombination av fenolextrahering, kromatograferíng på Sephadex G-lO0 och etanol- utfällning. "Sephadex" är ett varumärke (Pharmacia, Uppsala).

När cDNA enzymatiskt syntetiserats, kan RNA-mallen avlägsnas.

Det finns olika kända metoder för selektiv nedbrytning av RNA i närvaro av DNA. Den föredragna metoden är alkalisk hydrolys; den är mycket selektiv och kan lätt kontrolleras genom pH-inreglering.

Efter den alkaliska-hydrolysen med efterföljande neutrali- sering kan den 32?-märkta eDkA eventuellt, om så önskas, koncen- treras medelst etanolutfällning.

Syntes av en oDNA med två strängar i form av en hàrnålsstruk- tur àstadkommes genom användning av ett lämpligt enzym, såsom DNA-polymeras eller revers-transkriptas. Man använder liknande reaktionsbetingelser som de förut beskrivna, inklusive användning av ett u-JQP-märkt nukleosidtrifosfat. Revers-transkriptas kan er- hållas från olika källor. En lämplig källa är fágelmyeloblastos- virus. viruset kan erhållas frånlzlïzfieard (Life Sciences Incor- porated, St. Petersburg, Florida, USA), som framställer viruset enligt avtal med National Institutes of Health.

Efter bildningen av cDNA-hårnålsstrukuren kan det eventuellt vara lämpligt att rena den erhållna DNA från reaktionsblandningen. 455 794 { s _.. _ 18 Såsom ovan beskrivits har det visat sig vara lämpligt att använda stegen med fenolextrahering, kromatografering på Sephadex G-100 och etanolutfällning i och för rening av DNA-produkten, så att den blir fri fràn förorenande protein.

Hårnålsstrukturen kan omvandlas till en konventionell DNA- -struktur med två strängar genom att man avlägsnar den av en enda sträng bestående slinga, som sammanbinder ändarna av de komplemfifl' tära strängarna. För detta ändamål finns ett flertal olika enzymer, som har förmåga till specifik hydrolytisk spjälkning av ensträngs- avsnitt i DNA-molekylen. Ett lämpligt enzym för detta ändamål är S1-nukleas, som isolerats ur Aspergillus oryzae. Detta enzym kan inköpas hos Miles Research Products, Elkhart, Indiana. Här hàlnàls- -DHA-strukturen behandlas med Sl-nukleas, erhålles i högt utbyte cDNA-molekyler, vars ända har undergàtt basparbildning. Efter ex- traheringen följer kromatografering och etanolutfällning såsom ovan beskrivits. Användning av revers-transkriptas och Sl-nvkleas vid syntes av tvåsträngs-CDNA-transkriptionsprodukter av mRNA har beskrivits av Efstratiadis et al.loc. cit.

Eventuellt kan mängden cDNA-molekvler med "stumt avskurna" ändar maximeras genom behandling med E. coli DNA-polymeras I i närvaro av de fyra deoxinukleosidtrifosfaterna. Pâ grund av enzy- megs ex0nuk1ea5_ och polymeraseffekter avlägsnas alla eventuellt förefintliga utstående 3'-ändar och sker ifyllning vid alla even- tuellt förefintliga utstående 5'-ändar. På detta sätt säkerställes, att en maximal mängd cDkA-molekyler deltar vid de efterföljande - ligeringsreaktionerna ' Vid nästa steg i förfarandet behandlas cDNA-produktens ändar för att man vid vardera änden skall erhålla de lämpliga sekvenser, som innehåller ett igenkänningsställe för restriktions-endcnukleas.

Praktiska detaljer beträffande handhavandet blir avgörande för valet av DNA-fragment, som skall tillfogas vid ändarna. Den sek- vens, som skall tillfogas vid ändarna, väljes på basis av det spe- ciella restriktíons-endonukleasenzym, som valts, och detta sist- nämnda val i sin tur är beroende av valet av den DNA-vektor, med vilken cDNA-molekylen skall rekombineras. Den plasmid, som väljes, bör ha minst ett ställe, som är känsligt för spjälkning medelst restriktions-endonukleas. Exempelvis kan nämnas att plasmiden pMB9 innehåller ett restriktionsställe för enzymet Hindlll. Enzymet 455 794 19 Hind III isoleras ur Haemophilus influenzaeoch renas i enlighet med förfarandet av Smith, H.0. och Wilcox, K.w., J.Mol.Biol. 51, 379 (1970). Enzymet Hae III, erhållet ur Haemophilus aegyptuš: renas medelst förfarandet enligt Middleton, J.H., Edgell, M.H. och Hutcnison III, c.A., J.v1r01. io, ha (1972). att enzym från Hae- mophilus suis, som betecknas Hg; I, katalyserar samma för ett igen- känningsställe specifika hydrolys. vid samma igenkänningsställe, som enzymet Hind III. Dessa båda enzymer anses därför vara funktio- nellt utbytbara mot varandra.

Det är lämpligt och bekvämt att använda en kemisk syntetiserad dekanukleotid. som består av två strängar och innehåller igenkän- ningssekvensen för Hind III, i och för fästande av denna dekanuk- leotid vid ändarna av den av två strängar bestående cImA-molekylen.

Den av tvâ strängar bestående dekanukleotiden har den sekvens, som visas i ritningsfiguren. Se Heyneker, H.L.. et al. och Scheller, R.

H., et al. loc.cit. Fackmännon har tillgång till flera ylika dylika sekvenser, som framställts syntetiskt och som uppvisar restriktions- ställen, varför man kan framställa ändarna av en av två strängar bestående DNA på ett sådant sätt, att de blir känsliga för ett vilket som helst restriktions-endonukleas, valt bland många olika sådana endonukleaser.

Fästandet av de avsedda sekvenserna med restriktionsställen vid CDNA-molekylens ändar kan åstadkommas medelst ett vilket som helst förfarande, som är känt för fackmän på området. Allra helst använder man en reaktion, vid vilken förbindningen sker vid I "stumt avskurna" ändar (bluntenåligation), vilken reaktion kata- lyseras medelst DNA-ligas, som renats i enlighet med metoden av Panet, A., et al., Biochemistry 12, 50ü5 (1973). Denna typ av reaktion har beskrivits av Sgaramella, V.,et al-,loc.cit. Den pro- dukt, som erhàlles vid denna typ av sammanbindningsreaktion mel- lan à ena sidan en cDNA med "stumt avskurna" ändar och à andra sidan ettsmort molärt överskott av tvàsträngs-dekanukleotid, inne- hållande restriktionsstället för Hind III-endonukleaset, är en cDNA, vilken vid vardera änden uppvisar sekvenser med restriktions- ställen för Hind III. När reaktionsprodukten behandlas med Hind III-endonukleas, åstadkommas en spjälkning vid restriktionsstället, varvid vid 5'-ställningarna bildas ändpartier, som består av en Å enda sträng och som är själv-komplementära, se ritningsfiguren. *(455 794 20 H. Bildning av en rekombinant-DNA-överföringsvektor.

I princip skulle man kunna använda ett stort antal olika DNA- -molekyler av virustyp eller plasmidtyp 1 och för bildning av re- kombinationsprodukter med en cDNA, vilken preparerats på det nyss beskrivna sättet. De viktigaste fordringar,som bör uppfyllas, är att DNA-överföringsvektorn skall ha förmåga att intränga i en värd- cell och att i denna undergâ replikering, varjämte den bör ha en sådan genetisk determinant, som möjliggör utväljandet av de värd- celler, vilka har mottagit vektorn. Av allmänna säkerhetsskäl bör emellertid urvalet begränsas till sådana överföringsvektorer, som anses vara lämpliga för ifrågavarande typ av experiment, i enlig- het med ovan anförda^NIH-föreskrifter. Listan över godkända DNA- -överföringsvektorer utökas ständigt i och med att nya vektorer ut- vecklas och godkännes av NIH Reoombinant DNA Safety Committee.

Inom ramen för föreliggande uppfinning ligger användning av vilka som helst virus-DNA och plasmid-DNA, som har ovan beskrivna egen- skaper, däribland även de, som eventuellt först senare godkännes av NIH. Lämpliga överföringsvektorer, som för närvarande är god- ' kända för användning, inkluderar olika derivat av bakteriofag lambda (se t. ex. Blattner, F.R., Williams, B.G., Blechl, A.E., Denniston-Thompson, K., Faber, H.E., Furlong, L.A., Grundwald, D.J_, Kiefer, D.0., Moore, D.D., Schumm, J.w., Sheldon, E.L. och Smithies, O., Science 196, 161 (1977) och derivat av plasmiden col El, se t. ex. nøarišflgz, n.L., Bolivar. s., Gcoaman, n.n., aoyer, n.w. och Betlach, M.N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms In The Control of Gene Expression, D.P. Nierlich, W.J. Rutter, C.F.

Fox, Eds. (Academic Press, NY, 1976), sid. #71-H77. För plasmider, som härleder sig från col El, är det karakteristiskt att de är relativt små, har molekylvikter av storleksordningen några få mil- joner och har den egenskapen, att antalet kopior av plasmid-DNA per värdcell kan ökas från 20-H0 under normala betingelser till 1000 eller mer än 1000 genom att värdcellerna behandlas med klor- amfenikol. Genom att gendosen i värdcellen kan ökas blir det under vissa omständigheter och under forskarens kontroll möjligt att få värdcellen att producera i främsta rummet sådana proteiner, vars kod tillhandahållas av gener i plasmiden. Sådana derivat av col El användes därför _ vid rörraranaet enligt' föreliggande uppfinning. Bland lämpliga derivat av col El kan näm- nas plasmiderna pNB-9, som uppbär gencn för tetracyklinresistens, 455 794 21 och pBR-513, pBR-315, pBR-316, pBR-317 och pBR-322, vilka förutom genen för tetracyklinresistens innehåller en gen för ampieillin- resistens.Genom att ifrågavarande, drogresistensförlänande gener finns närvarande blir det möjligt att på ett lätt och lämpligt sätt välja ut celler, vilka framgångsrikt infekterats med plas- miden, eftersom kolonier av sådana celler växer i närvaro av dro- gen medan däremot sådana celler, som icke har tagit emot plasmi- den, icke kommer att tillväxa eller att bilda kolonier. Vid de experiment, som i föreliggande beskrivning redovisas som specifi- ka exempel på föreliggande uppfinning, användes alltid en_fràn col El härledd plasmid, vilken förutom ovan beskrivna "märkning" med avseende på resistens mot droger innehöll ett ställe för Hind III.

Beträffande värdorganismen gäller exakt som i fràga.om plasmi- den. att det finns ett stort antal organismer som i princip skulle kunna väljas, men med hänsyn till allmänhetens säkerhet är valet mycket begränsat. En stam av E. coli, kallad X-1776, har utvecklats och har godkänts av NIH för användning vid förfaranden av det slag, som här avses, varvid säkerhetsföreskrifterna enligt P2 skall följas. Se Curtiss. III, R., Ann.Rev.M1crobiol.. 30, 507 (1976). E. coli RR-1 är lämplig, när säkerhetsbestämmelserna enligt P3 kan följas. På samma sätt som när det gäller plasmider gäller'beträffande värdcellstammnr, att man enligt uppfinningen kan använda vilka sådana stammar som helst, som kan tjänstgöra som mottagare för den valda vektorn.

Rekombinant-plasmider bildas genom att man blandar plasmid- -DNA, som behandlats med restriktions-endonukleas, med cDNA, som ,innehàller på liknande sätt behandlade ändgrupper. För att i störs- ta möjliga utsträckning elimnrra risken. att segment av cDNA bil- dar kombinationer med varandra,tillsättes plasmid-DNA i molärt över- skott i förhållande till eDNA. Vid tidigare kända förfaranden har detta medfört, att de flesta plasmider undergàtt ringslutning utan att något eDNA-fragment inbyggts. De i an- slutning därtill omvandlade cellerna innehöll i främsta rummet plasmid, och icke cDNA-rekombinantplasmider. Selektionsprocessen var därför en mycket besvärlig och tidskrävande procedur. Vid de tidigare kända förfarandena har man sökt lösa detta problem på så sätt att man försökt få fram DHA-vektorer med ett ställe för 455 794 22 restriktions-endonukleas i mitten på en lämplig märkningsgen, så att införandet av en rekombinant delar upp genen, varigenom den funktion, för vilken genen utgör kod, går förlorad.

Företrädesvis använder man en metod för minskning av det an- tal kolonier, bland vilka man skall utvälja lämpliga för rekombí- nant-plasmider. Enligt denna metod behandlas med restriktions- -endonukleas uppskuren plasmid-DNA med alkaliskt fosfatas, ett enzym som finns i marknaden och kan erhållas från olika tillver- kare, t. ex. Worthington Biochemieal Corporation, Freehold, New Jersey. USA. Behandling med alkaliskt fosfatas avlägsnar de i 5'-ändställningarna befintliga fosfaterna från de medelšzendo- nukleaset bildade ändarna av plasmiden och förhindrar själv- 1í9@ïiU9 av ifrågavarande plasmid-DNA. Ring- bildning, och därmed omvandling, kommer således att bli beroende av införandet av ett DNA-fragment, som innehåller 5'-fosforylerade ändar. Det beskrivna tillvägagângssättet minskar den relativa om- vandlingsfrekvensen vid icke-rekombination till mindre än l:l0+u.

Föreliggande uppfinning är baserad på den omständigheten, att den med DNA-ligas katalyserade reaktionen inträder mellan en 5'- -fosfatändgrupp hos en DNA-molekyl och en jihydroxyländgrupp hos en DNA-molekyl. Om fosfatgruppen i 52ändstäl1ningen avlägs- nas, sker ingen sammanbindningsreaktion. När det gäller samman- bindning hos DNA med två strängar, är tre situationer möjliga, såsom visas i nedanstående tabfll 1. 23 { 455 794 'lelzelLl Fall Reaktionskomponenter Ligasprodukt I BI 5! 3! 5' ---~OH Hq0}P0------ --- 0-P-O - (_ ---_ OPOBHQ + HO_____il _ O_P_O_ + 2H20 5' 3' 5' 5' II 3! 5! 3! 5; ___. on n o P-o ._.---_-- ----. o-P-o ~«--_0H + 2 30H -~~--- __---OH HO-«----¿H2O 51 3/ s! j! III j' 5' ' ____“ OH H0 ingen reaktion on “” 1110-- 5' 3' I tabell l visas DNA, som har två strängar, schematiskt me- delst ettpar parallella heldragna linjer. 5'- och 3'- ändställningsgrupperna visas unpbära antingen en hydroxyl- grupp (OH) eller. 1 förekommande fall, en fosfatgrupp (OPO3H2).

I fallet I finns 5'-fosfater på bägge reagerande ändarna, vilket har till följd att båda strängarna sammanbíndes kovalent. I fallet II är det endast en av strängarna, som har en 1 5'-ändställning- en befintlig fosfatgrupp, vilket resulterar 1 att en enda sträng bindes kovalent, varvid samtidigt en lucka uppkommer 1 den andra strängen. Den icke-kovalent sammanbundna strängen hàlles ihop med den sammanbundna molekylen tack vare vätebindningar mel- lan komplementära baspar pà de mittemot varandra belägna strängar- na, såsom är allmänt känt. I fallet III finns det icke någon 5'-fosfatgrupp på vare sig den ena eller den andra komponentens än- de., med den påföljd att ingen reaktion kan inträda. 455 794 I 24 i: Icke-önskade sammanbindningsreaktioner kan därför förhindras genom att ifrågavarande reaktionsbenägna ändar, vars hopbdning man vill förhindra, behandlas 1 och för avlägsnande av 5'-fosfat- grupperna från dessa ändar. För detta ändamål kan man anlita vil- ket förfarande som helst, som är lämpligt för avlägsnande av 5'- -fosfatgrupper och icke i övrigt skadar DNA-strukturen. Man före- drar hydrolys, som katalyseras medelst enzymet alkaliskt fos- fatas.

Nyss beskrivna förfarande är även lämpligt ifall en linjär DNA-molekyl skall spjälkas till bildning av två delfragment - i typiska fall med användning av ett restriktions-endonukleasenzym - och sedan rekonstitueras med den ursprungliga sekvensen, Delfrag- menten kan renas vart och ett för sig, och den önskade sekvensen kan rekonstitueras genom att delfragmenten åter sammanbindes.

Enzymet DNA-ligas, som katalyserar förbindningen ände mot ände av DNA-fragment, kan användas för detta ändamål. Se Sgaramella, V., ' Van de Sande, J.H. och Khorana, H.G.,_Proc.Natl.Acad.Sci.USA §Z¿ 1468 (1970). Om de sekvenser, som skall sammanbindas, icke har "stumt avskurna" ändar, kan man använda det från E. coli erhållna ligaset, se Modrích, P.och Lehman, I.R., J. Biol. Chem. šï§¿ 5626 (1970).

Den effektivitet, med vilken den ursprungliga sekvensen re- konstitueras med utgångspunkt från delfragment erhållna genom be- handling med restriktions-endonukleas. ökas avsevärt om man be- gagnar sig av en metod för förhindrande av rekonstituering med oriktiga sekvenser. Nämnda icke önskvärda resultat undvikes ge- nom att cDNA-fragmentet. som uppvisar den önskade sekvensen och som har homogen längd, behandlas med ett medel för avlägsnande av de på 5'-ändställninnarnn befintliga fosfatgruppcrna på cDNA, in- nan denna homogena cDNA spjälkas med ett restriktions-cndonukleas.

Man föredrar enzymet alkaliskt fosfatas. De 1 5'-ändställningarna befintliga fosfatgrupperna är strukturmässiga förutsättningar för den efterföljande sammanbindningsverkan, som utövas av enzymet DNA-ligas, vilket användes 1 och för rekonstituering av de spjäl- kade delfragmenten. Ändar utan 5'-fosfatgrupper kan således icke sammanbindas kovalent. DNA-delfragmenten kan endast sammanbindas vid ändar, innehållande ett 5'-fosfat, som bildms genom den pà de isolerade DNA-fragmenten medelst restriktions-endonukleas utförda spjälkningen. { 455 794 25 Genom ovan angivna förfarande förhindras, att den viktigaste bland de icke-önskvärda sammanbindningsreaktionerna undvikes, näm- ligen att de båda fragmenten sammanbindes 1 omvänd ordningsföljd, dvs bakifrån-framåt i.st.f. framifrån-bakåt.Andra bireaktioner, som kan uppkomma, exempelvis dimerbildning och cyklisering, för- hindras ej : de kan nämligen uppträda genom en reaktion av typ II, se tabell l ovan. Emellertid är olägenheten med dessa bireaktioner icke lika stor, eftersom dessa reaktioner leder till fysikaliskt separerbara och identifierbara produkter, medan däremot rekombina- tion i omvänd ordningsföljd icke leder till dylika produkter.

Exemgel 1. (refeiensexempel) Här beskrives isolering och rening av en DNA. som har hela strukturgensekvensen för RGH, samt dels syntesen av en överfö- rinßsvektor. som innehåller hela strukturnenen för RGH, dels konstruktionen av en mikroornanism-stam. vilken innehåller ge- nen för RGB såsom en del av sin genetiska utrustning.

När det gäller gener av icke-humant ursprung föreskriver de federala myndigheterna i USA icke att cDNA måste isoleras i så hög renhetsgrad som den. vilken erfordras 1 Träna om humana cDNA. Fördenskull var det mñjligt att isolera cDNA. som innehfill hela RGH-strnkturgenen. genom att isolera elektroforetiskt sepa- reraa DNA »ned den vesntafae längden. ca 8oo baspar. bestämd på ba- sis av den kända aminosyralängden hos RGH-molekylen. Som källa. för RGH~mRNA användes odlade rått-hypofysceller. en suhklon till cell-linjen GH-1, som kan erhållas från American Type Culture Col- lection. Se Tashjian, A.H., et al., Endocrínolocv¿ §§¿ BÄE (1968). När sådana celler odlas under normala betingelser utgör tillväxthormon-mRNA endast en liten procentuell andel, 1-3%, av den totala poly-A-haltiga RNA. Emellertid höjdes halten av till- växthormon-mRNA till ett värde som var högre än det för andra eellulära mRNA genom synergistisk samverkan av tyroidhormoner och glukokortikoider. RNA utvanns ur 5 šgr 10 celler, som odla- lades i suspensíonskultur och bringades att producera tillväxt- hormon genom att man under Ä dygn före cellernas tillvaratagande inkorporerade l mM dexametason och 10 mH L-trijodtyronin i od- lingsmediet. Polyadenylerad RNQ isolerades ur de odlade celler- nas cytoplasmamembranfraktion, såsom beskrivits i litteraturen. 455 794 26 Se Martial, J.A., Baxter, J.D., Goodman, H.H. och Seeburg, P.H., Proc.Nat.Acad. Sci. USA Zfl¿ 1816 (1977), samt Bancroft, F.C., Wu, G. och Zubay, G., Pr0c.Nat.Acad.Sci. USA :gå }6U6 (1973).

Den erhållna mRNA renades ytterligare och transkriherades till tvåsträngs-cDHA. Efter fraktionering medelst gel-elek- trofores kunde man observera ett svagt men tydligt band. svaran- de mot en DNA som hade en längd uppgående till ca 800 baspar.

När den totala cDNA. som erhållits genom transkríption från den odlade hypofyscell-mRNA. behandlades med Hha l~endonukleas, erhölls två större eller huvudsakliga DNA-fragment, när produk- ten underkastats elektroforetisk separeríng. Det ena fragmentet (fragment A) hade en längd av ca 320 nukleotider, och det andra fragmentet (fragment_B) hade en längd av ca 2H0 nukleotider. Då de båda fragmenten A och B underkastades nukleotidsekvensanalysf visade det sig att dessa fragment verkligen utgjorde delar av vad som måste anses vara RGB-kodningsregionen med ledning av publicerade data beträffande aminosyrasekvensen í RGH och under Jämförelse med andra kända tillväxthormonaminosyrasekvenser. Se Wallis, N. och Davies, R.

V.N., Growth Hormone And Related Peptides (Eds., Copecile, A. och Muller, E.E.), sid. 1-lä (Elsevier, New York, 1976), samt Dayhoff, M.0., Atlas of Protein Sequence and Structure, §¿ suppl. 2, s1d.°l20-l2l (National Biomedical Research Foundation:_Washing- ton, D.C., l976). När den på ovan beskrivet sätt elektroforetiskt isolerade cDNA - som bestod av tvâ strängar och hade en längd av 800 baspar - på liknande sätt underkastades behandling med Hhal- -endonukleas, fann man bland de huvudsakliga produkterna från spjälkningen två fragment, vilka i fråga om sin längd svarade mot fragmenten A och B.

Eftersom den ungefärligen 800 baspar innehållande RGB-CDHA icke renades med användning av restriktions-endonukleas. var det nödvändigt att underkasta denna DNA en behandling för avlägsnan- de av ev. molekyländar med en enda oparad sträng. I praktiken ut- fördes behandlingen för avlägsnande av dylika oparade ändar före elektroforessepareringen 1 Päßul 60 mh Tris-HCl, pH 7.5, 8 mH MgCl2, lO mH ß-merkaptoetanol, l mM ATP och 200,uH av vart och ett av fosfaterna dATP, dTTP, dGTP och dCTP. Blandningen inkubc- rades med 1 enhet polymeras I för DNA ur E. coli vid l0°C under 455 794 27 10 minuter för att exonukleolytiskt avlägsna alla ev. förefint- liga i 3'-ställningen framskjutande ändar och för att åstadkomma en "ifyllning" vid alla ev. förefintliga i 5'-ställningen fram- skjutande ändar. DNA-polymeras I kan köpas från Boehringer-Mann- heim, Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USA.

Den ca 800 baspar innehållande RGH-cDNA behandlades ge- nom addering av kemiskt syntetiserade Hind III-länkar. Plasmiden pBR-322, som har en gen för ampicillinresistens och har ett enda Hind III-ställe, vilket ligger inom tetracyklinresistensgenen, förbehanlades med Hind III-endonukleas och alkaliskt fosfatas.

Den behandlade plasmiden omsattes med den 800 baspar innehållan- de RGH-cDNA i en DNA-ligasreaktionsblandning. Ligasreaktions- blandningen användes för omvandling av en suspension av celler E. coli X-1776. Rekombinatkolonier utvaldes genom odling på plattor, innehållande näringsämnen och ampicillin, och på grund- val av att cellerna icke kunde tillväxa på20 pg/ml tetracyklin.

Man erhöll 10 kolonier av detta slag; alla dessa innehöll plas- mid med ett däri infört avsnitt av ca 800 baspar, vilket fri- gjorts medelst Hind III-spjälkning.

Den 800 baspar innehållande RGH-DNA isolerades i pre- paratíva mängder ur rekombinantklonen pRGH-1, och dess nukleo- tidsekvens bestämdes. Denna gång innefattade nukleotidsekvensen delar av den vid 5'-änden befintliga oöversatta regionen av RGH liksom även en sekvens av 26 aminosyror, vilken finns i till- växthormonprekursorproteinet före ínsöndringen. Den förutsagda amínosyrasekvensen visar med undantag för ställningarna 1 och 8 god överensstämmelse med den partiella amínosyrasekvensen hos rått-tíllväxthormon, såsom den beskrivits av Wallis och Davies loc. cit. Denna partiella sekvens omfattar resterna 1-43, 65-69, 108-113, 133-143 och 150-190. 455 794 28 Exemgel 2.

I detta exempel beskrivas isolering och rening av hela den gensekvens, som utgör kod för HGH (humant tillväxthormon), jämte syntes av en rekombinatplasmid, som innehåller hela strukturgenen för HGH, och framställning av en mikroorganism, vilken såsom en del av sin genetiska utrustning innehåller hela strukturgenen för HGH.

Isoleringen av HGH-mRNA utföres i huvudsak pà det i ex.1 beskrivna sättet, varvid dock i föreliggande fall det biologiska källmaterialet är human hypofystumörvävnad. Fem benigna humana hypofystumörer, som snahbfrysts i flytande kväve efter att ha av- lägsnats vid en operation. vägande var och en 0,N g - 1,5 5, upp- tinades och homogeniserades i HH guanidiniumtiocyanat, innehållan- de lM merkaptoetanol och buffrat till pH 5,0, vid HOC. Homogena- tet skiktades över 1,2 ml 5,7M CsCl, innehållande lOO mM EDTA, och eentrifugerades l8 timmar med en hastighet av 37000 varv/mi- nut 1 SW 50,1-rotorn hos en Beckman-ultracentrifug vid 1500 (Beckman lnstrument Company, Fullerton, California, USA). RNA rör- de sig mot rörets botten. Ytterligare rernngnæd användning av en kolonn av oligo-dT och sackarosgradientsedimentering genomfördes.

Ca 10% av den sålunda isolerade RNA ansågs ge en kod för till- växthormon - detta på basis av ett prov, där man inkorporerade en radioaktiv aminosyraprekursor i ett utfällt antitillväxthor- monmaterial i ett cellfritt översättningssystem, som erhållits från vetegroddar. Se Roberts, B.E. och Patterson, B.M., Proc.Hat.

Acad. Sci, USA. Zgè 2330 (197)). Fremställning av HGH-cfiNA sker i huvudsak pâ det i exempel 7 beskrivna sättet. Den erhållna HOB- -cDNA fraktioneras medelst gelelektrofores, och material, som mig- rerar till ett läge svarande mot in längd av ca 800 nukleotider, utväljes i och för kloning. Den utvalda fraktionen behandlas med DNA-polymeras I,. varefter den under- kastas addition av Hind III-länkar 1 ändställningarna. Därefter rekombineras denna_cDNA med plasmid pßh-522, som behandlats med alkaliskt fosfatas. Rekombinationen sker med tillhjälp av DNA-li- gas. Med den erhållna rekombinant-DNA omvandlas E. coli X-1776, och man väljer ut en stam, som innehåller HGH-DHA. Denna stam od- las i preparativa mängder, HGH-DNA isoleras från stammen och dess nukleotidsekvens bestämmas. Den klonade HGH-DNA befinnes omfatta nukleotider, som utgör kod för hela aminosyrasekvensen i HGH. De 4sse794" 29 första 23 aminosyrorna 1 HGH är HqN-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser- 10 20 -Arg-Leu-Phe-Asp~Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leuf.

Resten av sekvensen visas i tabell 2.

Tabéll 2.

Nukleotidsekvensen hos en HGH-DNA-sträng. Siffrorna avser aminosyrasekvensen hos HGH med början vid aminoänden. Den visade DNA-sekvensen svarar mot mRNA-sekvensen för HGH, med undantag av ett mnNA 1 stället för T innehåller u. ' .n «|||| uuuoæuukoæuCuPu<@Uuu@uuvu »za >Hu mßu “um »Hu :Ho fl~> fimfi Hua uuu uuk : nom wu< nau :au ~c> uflu wu< :ua man use :Mu flm> maa nn< uu: nm< maa w»< usa nav uah :ua :ua æflo nav :m< maa omfl . owfi . _, ueu <»u :mg :ud -< @m< maa =«< w«= »um =«< »za @w< »pm Mag uuw ~>« ~=a_=Hu mä; »gm »HH :Hu »Hu hav »kw on» »um »Hu . ce" u nm< sflo :ua wu< aan uu: som una :#0 uflu aflu sfiu :ao :ua nm< m>A :wa :uu mm< une ~m> :m< now nm$.num w~< >~u o- . u u>P.Hfl> :uQ.&%W.:m< dn< mån An> nam wu< :un msn :HU Hn> Ohm :ao :uu unk hum :ab uHH :ua :mä :UA hum UHH mh< cøfl _ Oæ _ uhu uno o :un :uu :uu :ua :m< nam maa :Hu :Ho uzß :Hc :Hu wu< cm< »um oum use cum man nam :Ho now osm mao :uu Ham usa 1 ow o :Hu nu» =w< =~u :uu u=~ “um »ÄH mä; =~u :au mäd eu» QHH u>@ «A< :Hu :Hu »gm :Hu :Hu p>@ »ne @m< »za «H< . _ n« °< . «n «~ _ _ _ 455 794

Claims (4)

' 455 794 31 P a t e n t k r a v

1. Plasmid lämpad för överföring av en gen till en Esche- richia coli-bakterie, k ä n n e t e c k n a d a v att den i sin nukleotidsekvens innehåller en sekvens som kodar för amino- syrasekvensen i humant tillväxthormon och omfattar 5'---TTR,CCLQACLSATM4CCLSXGTYGQR,s7w8cz5x9TY9TTx,0cAx1,AAx12 GCL1sÅTG14X1STY1sW1GGZ1eGCL1vCAK1sW19Gz:9X2oTY2oCÅK21CAJ22X2s TY23GCL24TTK25GÅK25ÅCL27TÅK23CAJ29GAJ39TTK33GAJ32GAJ33GCL34 TÅK35ÅTM35CCL37AAJ33GÅJ39CAJ40ÅAJ41TAK42QR43S43TTK44X45TY45 CÅJ4sAÅK47CCL4sCAJ49ACLsoQRs1Ss1Xs2TYs2TGKssTTKs4QRss5ssGAJse QRs1551ATMssCCLssÅCLsoCCLs1QRs25e2AAKssWe CAJsaCÅJssAA31oQR11571AAK12X7aTY1sGA314XvsTY7sX7eTY1eW1vGZ11 ÅTM1sQR19519XsoTYsoXs1TYs1Xs2TYs2ÅTMsaCAJs4QRss5ssTGGseXa1 TY57GAJ83CCL59GTL90CÅJ91TTK92X93TY93W94GZ94QR95S95GTL95TTKg7 GCLesAÅK99 ^^K10g X1o1TY1o1GTL1o2TAK1oaGGL1o4GCL1osQR1os51os GÅR:o1QR1os51osAÅK1oeGTL11oTÅK1:1GAK112X:1aTY11sX:14TY114 AAJ11sGÅK11eX1:7TY111GÅJ11sGAJ11eGGL12oÅTM121CAJ122ACL12s X124TY124ATG12sGGL12sW121GZ127X12sTY12sGÅJ:2sGÅK1soGGL1s1 QR1325:32CCL1s3W134GZ1s4ACL1ssGGL:36CAJ:a7ATM1ssTTK13sAÅJ14o CÅJ141ACL142TÅKJ4sQR1445144AAJ14sTTK14eGAK147ACL14sAAK14s QR1so31soCÅK1s:AÅK1s2ÛÅK1ssGÅK1s4GCL1ssX1ssTY1ssX1s7TY1sv AAJ1ssAAK1ssTAK1eoGGL1s1Xie2TY1s2X1esTY1eaTAKzs4TGK:ssTTK1se W1e1GZ1s1AAJ1esGAK1esATG17oGÅK1v1AAJ172GTL11aGAJ:14ACL17s TTR11eX:11TY111W11aGZ11sÄTN11sGTL1soCÅJ1s1TGK1szW1ssGZ1sa QR1s451s4GTL1ssGAJssGGL1a7QR:sas:ssTGK1ssGGL1soTTR¿f*3' där är deoxiadenyl, är deoxiguanyl, är deoxicytosyl, är tymidyl, är A eller G; är T eller C; är A, T, C eller G; är A, C eller T; XZHNCJV-BOOIP' är T eller C' °m Yn är A eller G, och C om Y är C I! IJ ' 455 794 32 eller T; Yn är A, G, C eller T, om Xn är C, och A eller G om Xn är T; Wn är C eller A, om Zn är G eller A, och C om Z" är C eller T; Zn är A, G, C eller T, om Wn är C, och A eller G om Wn är A; QRn är TC, om Sn är A, G, C eller T, och AG om Sn är T eller C; ' Sn är A, G, C eller T, om QRn är TC, och T eller C om QRn är AG och indexsiffrorna, n, anger aminosyrornas ställning i humant tillväxthormon, för vilket nukleotidsekvensen utgör motsvarig- het i enlighet med den genetiska koden, varvid aminosyraställ- ningarna är numrerade utgående från aminoänden.

2. _Escherichia coli-bakterie modifierad till att inne- hålla plasmiden enligt krav 1.

3. Förfarande för framställning av en plasmíd enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v att (a) man isolerar mRNA från hypofysceller genom att homo- genisera hypofyscellerna i närvaro av en RNas-inhibitorkompo- sition innehållande 4M guanidiniumtiocyanat cch 0,0S~1,0M 8-mer- kaptoetanol vid pH 5,0-8,0L varigenom RNas-nedbrytning av denna mRNA förhindras; (b) man framställer cDNA med en nukleotidsekvens som kodar för tillväxthormon genom att på i och för sig känt sätt behand- la utvunnen mRNA med ett reverstranskríptas, varefter denna CDNA göres dubbelsträngad; (c) man fäster sekvenser med ett igenkänníngsställe för ett restriktionsendonukleas vid ändarna av' den erhållna dubbel- strängade CDNA, varvid restriktionsendonukleaset är detsamma som i steg (d) nedan, varefter resulterande CDNA spjälkas med restriktionsendonukleaset under bildning av kohesiva ändar; (d) en bakterieplasmid öppnas med restriktionsendonukleas, fil OI v 455 794 33 t ex Hind III eller Hsu 1, till bildning av en öppnad plasmid- vektor med kohesiva ändar; (e) 5'-fosfatändgrupperna av den i steg (d) erhållna plas- midvektorn hydrolyseras genom behandling med alkaliskt fosfa- tas, t ex vid pH 8,0 och temperaturen 65°C under 30 min, vari- genom de under (d) nämnda kohesiva ändarna göres oförmögna att sammanbindas med varandra; och (f) den i steg (e) behandlade plasmidvektorn sammanbindes med den i steg (c) erhållna cDNA genom inkubering i närvaro'av DNA-ligas och ATP, t ex vid pH 7,6 och temperaturen 14°C under 1 h med användning av ett molärt överskott av plasmidvektorn, varigenom man erhåller en plasmid med en nukleotidsekvens som kodar för tíllväxthormon.

4. Förfarande för framställning av en Escherichia coli- -bakterie innehållande en plasmid med en nukleotidsekvens som kodar för humant tillväxthormon, k ä n n e t e c k n a t a v att bakterien sammanföres med en plasmid enligt krav 1.