SU1205777A3 - Способ получени вектора,имеющего нуклеотидную последовательность,кодирующую протеин - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к способам получени  ДНК-переносчика, имекхцего нуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста.

Последовательность оснований ДНК (дезоксирибонуклеинова  кислота) хра нит генетическую информацию , и исполь зуетс  в качестве кода, в соответствии с которым клетка синтезирует последовательность аминокислот всех протеинов. Некоторые части этой последовательности  вл ютс  регул торами , контролирукнцими врем  и количество синтезируемых протеинов (природа этих контролирующих элементов исследована только частично). Кроме того последовательность оснований в каждой нити используетс  в качестве шаблона дл  репликации ДНК, котора  осуществл етс  при делении клетки.

Процесс, при помощи которого несуща  генетическую информацию последовательность оснований в ДНК используетс  дл  образовани  последовательности аминокислот протеинов,в самых общих чертах  вл етс  универсальным дл  всех живых организмов. Установлено, что кажда  аминокислота , содержаща с  в протеин.ах, определ етс  одним или несколькими трину- клеотидами или последовательност ми триплетов. Дл  каждого протеина суще ствует соответствующий сегмент ДНК, содержащий последовательность триплетов , соответствующих протеиновой последовательности аминокислот. Генетический код представлен в таблице.

В биологическом процессе преобразовани  информации, содержащейс  в последовательности нуклеотид,ов, в структуре последовательности а 1ино- кислот на первой стадии осуществл етс  транскрипци . На этой стадии локальный сегмент ДНК, содержащий последовательность, котора  относит с  к определенному протеину, копируетс  на РНК (рибонуклеиновой кислоте). I РНК  вл етс  полинуклеоти- дом, аналогичным ДНК, но вместо рибо вы здесь содержитс  дезоксирибоза, а вместо тимина используетс  урацил. Пары оснований в РНК могут быть взаимосв заны также как и в ДНК. Таким образом, в результате транскрипции РНК последовательности ну- клеотидов из ДНК РНК становитс 

10

15 к

20

25

057772

комплементарной по отношению к после дующему копированию. Така  РНК назы ваетс  матричной РНК ( мРНК) из-за ее промежуточного положени  между

I) генетическим аппаратом и аппаратом синтеза протеина клетки.

Внутри клетки мРНК происходит сложный процесс, в котором участвуют различные ферменты и органеллы внутри клетки, в результате которого синтезируетс  определенна  последовательность аминокислот. Этот процесс называетс  трансл цией мРНК. В результате дополнительной обработ-.- ки последовательность аминокислот, сичтезированна  в течение процесса трансл ции, превращаетс  в функциональный протеин.

Многие протеины, имеющие важное значение в медицине, в частности гормон роста, протеины, участвующие в механизме регулировани  кров  ного давлени , а также большое количество других ферментов, обнаружены в клетках или вырабатываютс ; клетками высших организмов, например позвоночных. Однако получить их в необходимом количестве экстрагированием из организма, особенно

30 из организма человека, очень трудно . Поэтому возникает необходимость в получении протеинов из искусственно выращенных клеток. Применение известных; способов выращивани 

35 биологической ткани нецелесообразно , поскольку клетки растут медленно , наблюдаетс  их низкий выход, используетс  дорогосто ща  среда дл  выращивани  и услови  выращи40 вани  необходимо жестко контролиро-; вать. Кроме того, как правило трудно поддерживать такие услови  выращивани  клеток, чтобы добитьс  искомых свойств делени .

Мик;юорганизмы, например, бактерии , относительно просто выращивать в среде, обладакмцей определенными химическими свойствами. Современна  технологи  процессов ферментации в достаточной степени развита и хорошо поддаетс  контролю. Микроорганизмы быстро размножаютс , что обеспечивает их высокий выход. Кроме того, некоторые микроорганизмы достаточно 55 хорошо исследованы с генетической точки зрени .

Таким образом, необходимо найти переносчика генетического кода про50

теина, представл ющего медицинскую ценность, из организма, который вы- рабатывает протеин, в нормальных услови х в подход щий микроорганизм. В этом случае протеин синтезируетс  микроорганизмами при контролируемых услови х роста и в необходимых количествах. Предлагаемый способ позвол ет значительно снизить общую стоимость получени  искомого протеина и обеспечивает, возможность выделени  и транспортировани  генетической последовательности, котора  программирует получение определенного протеина в микроорганизме , имеющего вполне определенную генетическута структуру, а также исследовани  механизма синтеза такого протеина в контролируемых услови х и механизма дальнейшей обработ ки протеина после стадии синтеза. Кроме того, выделенные генетические последовательности можно модифицировать с целью получени  генетического кода дл  синтеза других протеинов , имеющих другие терапевтические или функциональные свойства.

Цель изобретени  - получение вектора, имеющего нуклеотидную последовательность , кодирукмцую гормон ростэ, путем вь;целени  молекулы ДНК спецкгльной последовательности нукле отида и ее транспортировки в микроорганизм а также обнаружени  исходной последовательности нуклеотидов ДНК после репликации в указанном организме.

Предлагаемый способ состоит из четырех основных стадий .

I. Выделение искомой попул ции ,клетки из высшего организма.

Имеетс  два потенциальных источ- .ника последовательности, несущей генетический код дл  синтеза протеина: сама ДНК организма-источника и РНК, полученна  после транскрипции на матрице ДНК Мерами безопасности предусмотрено введение генов человека в рекомбинированную ДНК и затем в клетку бактерии только после их тщательного отбора при помощи специального оборудовани , предназ- наченного дл  экспериментов, св зан- -ных с большой степенью риска (Р4). I

В больщинстве тканей желез или других органов клетки св заны между собой слоистой сетью соединительных тканей, которые состо т в основ

205777

ном из коллагена, но могут содержать в зависимости от ткани и другие структурные протеины, полисахариды и минеральные отложени . При выделе5 НИИ клеток из соединительной ткани необходимы специальные средства.

Таким образом, выделение и очистка типа клеток заключает в.себе две основные стадии: высвобождение кле-т

10 ток из матрицы соединительной ткани и отделение клеток искомого типа от всех клеток других типов, которые содержатс  в ткани.

Содержание искомой мРНК можно

15 увеличить использу  способность

клетки реагировать на внешние возмущени , например обработку попул ции клетки гормоном, определенную темпе- ратуру и использован ие специальных пи2Q тательных или других химических вещест в, Например,при отделении мРНК гормона роста крысы (ГРК) обработка выращиваемых клеток гипофиза крысы тироид- ным гормоном и глюкокортикоидами

25 значительно увеличивает количество мРНК гормона роста.

И. Вьщеление мРНК. Применение предлагаемого способа позвол ет полностью выделить активную РНК

3Q из экстракта клеток.

Выдел ема  мРНК  вл етс  одной полинуклеотидной нитью, не имеющей пары среди других комплементарных нитей. Следовательно,гидролитическое рассечение одной фосфо- диэфирной св зи в последовательности может привести к образованию полной молекулы, котора  непригодна дл  транспортировки полной генетической последовательности в микро- организм. Широко распространенный, очень активный и исключительно устойчивый фермент РНК-азы находитс  на поверхности, обнаруживаетс  при помощи известных способов промывки и иногда загр зн ет используемые химические материалы, что особенно нежелательно при работе с экстрактами клеток поджелудочной железы, так как поджелудочна  железа  вл етс  источником пищеварительных ферментов и поэтому богата РНК- азой. Однако проблема загр знени  РНК-азой актуальна и при работе с

другими ткан ми. 55

Предлагаемый способ подавлени  активности РНК-азы применим к любым ткан м, однако наиболее эффективен

35

40

45

50

при выделении полной мРНК из отделенного участка ткани поджелудоч ной железы.

.Согласно предлагаемому способу используютс  хаостропный анион, хаостропный катион и разрывающий дисульфидные св зи агент как при разрушении клетки, так и в течение всех операций, которые необходимы дл  вьщелени  свободной РНК из протеина. Эффективность комбинированного действи  указанных агентов была доказана при их использовании дл  выделени  полной мРНК с хорошим выходом из участков Лангерханса поджелудочной железы крысы.

Выбор соответствукщих каостроп™ ных ионов зависит от их растворимости в водных средах. К хаостроп ным катионам относ тс  гуанидин, карбомоил-, гуанилгуанидин, литий и т.д.; к хаостропным анионам - иодид, перхлорат, тиоцианат, дийодо- салицинат и т.п. Относительна  эффективность солей, образованных комбинированием таких катионов и анионов, частично определ етс  их растворимостью, , Например, дийодо- салшдинат лити  обладает более сильным денатурирующим свойством, чем гуанидинтиоцианат, но его растворимость составл ет всего 0,1 Ми, кроме того, он  вл етс  относительно дорогосто щим материалом. Пред™ почтительно используют комбинацию катион-анион, так как она легкодоступна и хорошо раствор етс  в водны средах до 5 М.

Тиоловые соединени , такие как Э-меркаптоэтанол,дитиотрейтол,цйс-

теин, пропанолдимеркаптан, используютс  дл  разрыва внутримолекул рных дисульфидных св зей в прот.еи нах при помощи тиолдисульфидной реакции обмена. Наиболее предпочти- тельно применение р-меркаптоэтано- ла, поскольку он легкодоступен и имеет невысокую стоимость раствор тс  в воде, так как дл  доведени  обменной реакции до конца необходим чтобы :тиоловое соединение было в большом избытке по сравнению с. внутримолекул рными дисульфидами.

Эффективность хаос гропного агента непосредственно зависит и от его 5 онцентрации; предпочтительно исползуетс  максимально возможна  концентраци  .

Ю is

20 2.5 о

,,

р41

,|

f

5

На выход неповрежденной мРНК на стадии выделени  вли ет скорость, с которой денатурируетс  РНК-аза, а также масштаб процесса денатурации. Поэтому преимущественно используют ; гуанидинтиоцианат по сравнению с гидрохлоридом, несмотр  на то, что активность гидрохлорида в качестве денатурирующего агента лишь незначительно отличаетс  от активности тиоцианата. Эффективность денатурирующего агента определ етс  пороговой концентрацией, котора  необходима дл  достижени  полной денатура ции протеина, скорость-которой зависит от концентрации денатурирунлцего агента относительно порогового значени , измен ющегос  от 5 до 10-и степени. Поэтому денатурирующее средство, незначительно более сильное , чем гуанидингидрохлорид, может денатурировать протеин в несколько раз быстрее при той же концентрации .

Анализ показал, что целесообразно использовать денатурирукхцее средство с низким пороговым значением денатурирующей концентрации и высокой растворимостью в водной , среде. Исход  из этого целесообразнее примен ть гуанидинтиоционат, а не дийодсалицилат лити , хот  последний обладает более сильным денатурирук цим действием (растворимость гуанидинтиоционата намного Ъыше, поэтому его можно использовать в концентраци х, при которых гораздо быстрее подавл етс  активность РНК-азы). Кроме того, гуанидинтиоционат по сравнению с гидро- хлоридной солью, имеющей сравнимую степень растворимости, обладает несколько большей динатурирующей способностью.

Использование агента дл  разрыва дисульфидной св зи в комбинации с денатурирующим средством увеличивает эффективность последнего ,1 обеспечива  получение полностью развернутой молекулы РНК- азы. Если некоторое количество РНК-азы остаетс  в качестве примеси в процессе получени  мРНК, она неактивна даже при отсутствии денатурирующего средства и тиола. Аген ты дл  разрыва дисульфидных св зей содержащие тиоловые группы эффективны при любой концентрации, обес7

печивающей рассечение внутримолеку л рных дисульфидных св зей. Однако верхний предел концентрации ограничен тем, что соединени  при высоких концентраци х зловонны. Уста- 1новлено, что оптимальной концентрацией Р-меркаптоэтанола  вл етс  О,05-1,0 М, а дл  выделени  полной РНК из поджелудочной железы крысы концентраци  составл ет 0,2 М.

Величина рН среды в процессе экстрагировани  мРЫК из клеток может составл ть 5,0 - 8,0.

После стадии разрушени  клетки РНК выдел етс  из основной массы протеина клетки и ДНК известными способами, например осаждением из этанола, в соответствии с которым РНК селективно осаждаетс  в осадок В соответствии с предлагаемым способом эту стадию можно исключить, при этом гомогенат ввод т в раство 5,7 М хлорида цези , наход щийс  в камере центрифуги, что обеспечивает высокий выход РНК, свободной от ДНК и протеина.

В результате осуществлени  всех описанных выше стадий из гомогената клеток выдел етс  полна Т НК. Однако только часть этой РНК  вл етс  искомой мРНК. Дл  извлече НЦЯ искомой мРНК используетс  способность мРНК в клетках высших организмов после транскрип1дии присоедин ть полиадениловую кислоту. Така  мРНК, содержаща  последовательность полиА (аденин) которые присоединены к ней, может быть селективно выделена при помощ хроматографии на колоннах, содер- ,жащих целлюлозу с присоединением -опиготимидилата. Выполнение всех описанных выше стадий достаточно дл  получени  из источников, богатых РНК-азой, существенно чистой, полной, пригодной дл  копировани  (трансл ции) мРНК. Очистка мРНК и .последующие лабораторные стадии могут быть осуществлены из клеток любого организма.

Б некоторых случа х, например когда в качестве источника мРНК используютс  клетки ткани с достаточно низким содержанием РНК-азы, дл  снижени  активности РНК-азы могут примен тьс  известные способы

Ш. Образование кДНК (комплементарной ДНК).

205777

На чертеже схематически представлены оставшиес  стадии предлагаемого способа.

Перва  стади . Образование после- 5 довательности ДНК, комплементарной к выделенной мРНК.

В качестве фермента дл  данной .реакции выбрана обратна  транскрип- тиза, хот  можно использовать любой 10 другой фермент, способный образовывать точную копию нити к ДНК, использу  мРНК в качестве шаблона. Эта реакци  протекает при известных услови х с использованием мРНК в 15 качестве .шаблона . и смеси четыре г. дезоксинуклеозидтрифосфатов в ка- честве предшествующих соединений дл  ДНК из одной нити. Дл  того, чтобы можно было следить за течением 20 реакции, один из дезоксинуклеозидов- трифосфатов мет т при помощи в альфа-позиции; метку можно исполь зовать и в качестве ориентира дл  извлечени  продукта после стадии 25 отделени , например, при хроматогра- фии и электрофорезе, а также при проведении количественных оценок на стадии извлечени .

Как показано на чертеже, продук- 3Q том реакции с обратной транскрип- тазо: 1 « вл етс  структура из двух нитб, имеюща  форму приколки дл  волос, с нековалентной св зью между нитью РНК и нитью ДНК.

Продукт реакции с обратной транс- криптазой получают из реакционной смеси путем, например. Экстрагировани  из фенола, хроматографии на сефадексе G-100 и осаждени  из этанола .

После синтеза кДНК в результате ферментной реакции шаблон РНК можно удалить. Селекторное разрушение РНК в присутствии ДНК, по предлагаемому способу осуществл ют щелочным гидролизом с высокой избирательностью и возможностью регулировани , обеспечивани  необходимое значение величины рН.

После щелочного гидролиза и последующей нейтрализации, если это необходимо , кДНК, меченна  , может быть сконцентрирована путем осаждени  этанолом.

55 Синтез имеющей форму приколки дл  волос молекулы кДНК из двух нитей достигаетс  при помощи соответствующего фермента, такого как ДНК-

35

40

45

50

полимераза или обратна  транскрипта за. Реакционные услови  анг1логичны услови м, которые использовались ранее, включа  использование меченного оС - Р нуклеозидфосфата. Обратную транскриптазу можно получить, например, из вируса avian mallob- lastosis.

После образовани  молекулы кДНК, имеющей форму приколки дл  волос, ДНК извлекают из реакционной смеси путем экстрагировани  из фенола,, хроматографии на сефадексе и осаждени  из этанола: при этом ДНК очищаетс  от загр зн ющего протеина .

Молекулу. ДНК в форме приколки дл  волос можно превратить в более предпочтительную структуру ДНК из двух нитей при помощи удалени  петли из одной нити, соедин ющей концы комплементарных нитей. Дл  этого провод т обработку ферментами, пригодными дл  гидролитического рассечени  фрагментов ДНК, содержащих одну нить, например S1-нуклеазой, выделенной из Aspergillus. oryzae, в результате чего получают высокий выход молекул кДНК, концы которых соединены основанием. Затем осу ществл ют экстрагирование, хроматографию и осаждение из этанола.

При необходимости дол  молекул кДНК,имеющих срезанные концы,может быть увеличена при помощи обработки ДНК полимеразой- , котора  выдел етс  из микроорганизмов E.coli в присутствии четырех дезоксинуклеозидтри- фосфатов. Комбинированное действие ферментов эндонуклеазы и полимеразы приводи т к удалению лк)бого выступающего 3 -конца и к заполнению любого выступающего 5 -конца. При этом обеспечиваетс  участие максимальной доли молекул кДНК в последующих реакци х с лигазами,

Затем осуществл ют обработку концов кДНК с тем, чтобы обеспечить соответствующие последовательности на каждом конце, содержащие места узнавани  дл  эндонуклеазы ограничени . Выбор участка ДНК, который присоедин етс  к концам, определ етс  материалами, с которь и предстоит манипулировать. Последовательность , которую присоедин ют к концам , выбирают в зависимости от выбранного фермента,эндонуклеазы ограничени , который,в свою очередь.

0577.710

зависит от переносчика ДНК, с которым кДНК рекомбинирует. Выбранный при этом плазмид должен иметь по крайней мере одно звено, по которо-

5 му происходит рассечение при обработке эндонуклеазой ограничени . Например , плазмид рМВЭ содержит одну точку ограничени  дл  фермента Hind Ш. Фермент Hind Ш выдел ют из бактерий

10 Hemophilus influenzae и очищают (Смит Х.О., Уилкоксом К,В. J. Мо1. Biol, 1970, 51/379). Фермент Нае Ш получают из Hemophilus aegyptipris, и очищают ( Миддлтон Дж.Х, , Эдге- ,

15 лем М.Н., Хатчисоном III, С.А. - J. virol, 1972, 10, 42/1. Фермент, полученный из Hemophilus suis, названный Hsu 1, катализирует гидролиз тех же мест узнавани , что и фермент

20 Hind Ш. Следовательно эти два фермента могут замен ть друг друга.

С целью присоединени  к концам двойной кДНК предпочтительно использовать химически синтезированный

25 декануклеотид из двух нитей, содержащий последовательность м ест узнавани  дл  фермента Hind Ш. Известны различные синтетические последовательности мест узнавани , поэтому можно

.jg получить концы двойной ДНК, восприимчивые к действию любой из- эндону-f клеаз ограничени .

Присоединение последовательности мест узнавани  к концам кДНК осуществл ют известными метода.ми. Выбор осуп ествл ют на основе реакции, котора  завершаетс  лигацией срезанных концов, котора  катализируетс  ли- газой ДНК, о чищенной по. известному способу ( Панет А. и др. Biochemistry , 1973,, 12,5045;.

Продуктом реакции лигации срезанных концов между кДНК со срезанными .концами и большим мол рным избытком декануклеотида из двух нитей, содержащего в качестве, эндонуклеазы мест узнавани  фермент Hind Ш,  вл етс  кДНК, содержаща  на каждом конце последо вательность мест узнавани  фермента Hind Ш.: Обработка продукта реакции эндоку клеазой Hind Ш приводит к рассечению молекулы в месте узнавани  с образованием самокомплементарных молекул, состо щих из одной нити с концами 5 (см. чертеж).

1, Образование переносчика ре- комбинированной ДНК.

с целью образовани  рекомбинатов с кДНК можно использовать разные

35

40

45

50

55

11

жизнеспособные плазмиды ДНК,Основные требовани  заключаютс  в том, чтобы переносчик ДНК мог проникать в клетку-хоз ина , подвергатьс  в ней репликации и содержать генетический детерминант, при помощи которого можно было бы выбрать те клетки, , которые получили указанный переносчик . В качестве соответствующих переносчиков предпочтительно используют , в Ч встности производные бактериофагов л мбда и производные плазмиды cot El.

Плазмиды, полученные из col El, имеют молекулы относительно небольшого размера, молекул рный вес по-; р дка нескольких миллионов и, кроме того, обладают тем свойством, что число копий плазмид ДНК на одну клетку-хоз ина может быть увеличено от 20-40 при нормальных услови х до 1000 и более при обработке этих клеток хлорамфениколом. Способность плазмид распростран ть генетические факторы внутри клетки-хоз ина обеспечивает возможность при соответ- ствукнцих услови х, контролируемых исследователем, заставить клетку- хоз ина вырабатывать протеины, генетический код на синтез которых был i epeHeceH плазмидой. Таким образом, целесообразно, в качестве переносчика ДНК использовать производные , выделенные из со 1 Е1, в частности плазмиды рМВ-9, несущие ген, контролирующий устойчивость к тетрациклину, а также рБР-313, рВР-315, рВР-316, рВР-317 и рВР-322, которые несут ген, контролирующий устойчивость к амплицилину. Наличие генов, контролирующих устойчивость к лекарственным препаратам, позво-, л ет селекционировать клетки, кото- содержат плазмиды, так как попул ции таких клеток выращивают в присутствии лекарственных препаратов. Клетки,которые не содержат плазмид, не имеют возможности расти или образовывать попул ции. Согласно предлагаемому способу используют плазмиды , выделенные из col. Е1, содержащие , одно.место узнавани  дл  фермента Hind Ш.

Рекомбинированные плазмиды образуютс  в результате смешени  плазми- ды ДНК, обработанной эндонуклеазой ограничени , с кДНК, содержащей концевые группы послеаналогичной обработки. Дл  сведени  к минимуму

0577712

;веро тнос ти образовани  комбинации сегментов кДНК друг с другом плазмиду ДНК добавл ют в мол рном избытке по сравнению с кДНК. Это относитс  к

5 большинству плазмид, которые исполь- . зуютс  без введенного фрагмента кДНК. Следовательно, трансформированные клетки не содержат рекомбинирован- ных плазмид кДНК, Поэтому процесс

10 селекции  вл етс  очень трудоемким и продолжительным. Попытки синтезировать носители ДНК, содержащие места дл  действи  эндонуклеазы ограничени , в середине соответствующего

15 гена, так, чтобы введение рекомбина- та способствовало разделению гена, привели к снижению функции гена как носител  информации, Предпочтитель- -но используют способ дл  снижени 

20 числа колоний, к которым затем примен ют рекомбинированную плазмиду, согласно которому отрезки плазмиды ДНК обрабатывают эндонуклеазой ограничени  и щелочной фосфатазой,

25 вследствие, чего удал ютс  5 -терминальные фосфаты, наход щиес  на концах , образовавшихс  в результате действи  эндонуклеазы, и предотвращаетс  самолигаци  плазмиды ДНК.

30 Следовательно, образованиецикла, а значит и трансформаци , зависит от введени  в молекулу фрагмента ДНК, содержащего фосфорированные 5 -терминалы. Этот способ снижает относительную частоту трансформации при отсутствии рекомбинации до менее Ю

Предлагаемый способ основан на реакции, катализатором которой служит лигаза ДНК, между 5 -концевой фосфатной и З -концевой гидро- ксильной группами ДНК. Если терминальный 5 - фосфат отсутствует, то реакци  не осуществл етс .

Соединение ДНК из двух нитей представлено в таблице (концевые группы отмечены гидроксилом (ОН) или фосфатом(ОРОг Н 2 j.

В первом случае 5 -фосфаты на- .

50 ход тс  на обоих концах реагента, в результате чего между двум  Нит ми установлена ковалентна  св зь. Во втором случае только одна из нитей, вступающих в св зь, содержит

55 терминальный 5 - фосфат, в результате чего между одной парой нитей установлена ковалентна  св зь, тогда как на другой нити разрыв сохра40

13

и етс . Нить, не содержаща  кова лентной сэ зи, остаетс  св занной со всей молекулой благодар  св зывающему взаимодействию между атомами водорода комплементарных пар основа™ НИИ на противоположных нит х. В третьем случае ни один из концов не содержит 5 фосфата и реакци  сое цинени  отсутствует.

Таким образом, нежелательных реакций соединени  можно избежать обработав соответствующие концы молекулы реагента с целью удалени  5 - юсфатных групп любым известным способом а tie разрушакмцим структуру ДНК, в частности гидролизом, катализируемым ферментом - щелочной фос фатазой.

Аналогичным способом выдел етс  кДНК, содержаща  генетический код

Схема реакции между 5 -концевой фосфатной и З -концевой гидроксильной группами ДНК, катализируемой лигазой

Случай

Реагенты

ОН

-fHjOi

ОРОзН ,ОЫ

он он

.

он

он он

он он

05777

дл  синтеза ГРК, рекомбинируетс  с плазмидой и транспортируетс  в E.coli. После продолжительной репликации в E.coli вьщел етс  после™

5 довательность нуклеотидов, содержаща  приблизительно 800 нуклеотидов по длине. -Было установлено,, что она содержит полную последовательность j содержащую генетический

10 код дл  синтеза ГРК, а также некоторые части предшествугацих пептидов и часть 5 - области, котора  не участвовала в трансл ции.

Предлагаемый способ можно исполь15 зовать дл  вьщелени  и очистки гв нов высшего организма, включа  гены человека, а также тр анспортировки |ИХ в микроорганизм дл  репликаций. В таблице приведены конкретные

20 примеры вьшолнени  предлагаемого способа.

Лигаза

-С - Р - ,,

О - Р - О

5 3

, Oh

о - р - о он

Нет реакции

15

Культивированные клетки гипофиза крысы (подклон семейства кл.еток GH-U использовали в качестве источника мРНК дл  синтеза ГКР. В э тих клетках, если рост происходит в нормальных услови х, мРНК гормона роста содержитс  в небольших количествах 1 - 3% от общего содержани  РНК, имеющей полиА. Однако, содержание мРНК гормона роста значительно увеличиваетс  в результате стимулирующего действи  тироидных гормонов и глюкокортикоидов. РНК вьщел етс  из 5x10 клеток, выращиваемых в суспензии, в которую с . целью получени  гормона роста за 4 дн  до сбора клеток добавл ют 1 мМ дексаметазона и 10 мМ. L-три- йодтиронина. Полиаденилированна  РНК вьщел етс  из цитоплазменных раздел кщих мембран культивируемых клеток известными способами. Поли- аденилированна  РНК, выделенна  из гипофизных клеток, содержит мРНК, кодирующую гормон роста. Клетки делают более в зкими обработкой трипсина и обрабатывают лед ным 25 мМ раствором фосфата кали  и 0,1 М NaCi- при рН 7,4. Затем клетки инкубируют 10 мин при О с в 10 мМ NaCZ 10 мМ Грис -НСЕ , рН 8,5 и 3 мМ MgCij., 5 мл/г клеток. Далее. клетки разрушают в гомогенизаторе Доунса. Ядра удал ют дентрифугиро- ранием гомогената при 800 G в течение 5 мин. Супернатант изготовл ют из 0,5% (.вес/об.) додедилсульфата натри  (НДС), 1 мМ этилендиаминтетр уксусной кислоты (ЭДТК) и 100 ьй NaCf. РНК экстрагируют фенолхлоро- формом и осаждают объемами этанола . Таблетку РНК, полученную центрифугированием осадка при 10000 G в течение 20 мин, раствор ют в водном растворе, содержащем 0,5% (вес/об.; НДС, 5 мМ NaCf и 1 мМ ЭДТ после чего инкубируют и течение 30 мин при 37 с вместе с 100 мг/мл самопереваренной проназы. Из инкубированной смеси РНК повторно экстргируют фенолхлороформом и осаждают этанолом, после чего раствор ют в воде до концентрации в 2 мг/мп и хран т при .

Получают 10 клеток - 10 мг цито плазмовой РНК, включа  рибосомную РНК и РНК-1и;реносчик, в дополнение к полиаденилированной РНК.

1205777

16

Полиаденилированную ГНК выдел ют при помощи хроматографического анализа всего препарата РНК на олиго-(.дТ)- целлюлозе. Выход 30 мг из 5x10

клеток.

Синтез двунитьевой кДНК (где одна нить имела нуклеотидную последовательность , комплементарную мРНК) завершают реакцией, катализируемой

обратной транскриптазой,содержащей смесь дезоксиаденозинтрифосфат(дАТФ), дезоксицитидинТрифосфат (дЦТФ) де- зоксигуанозинтрифосфат (дГТФ),дезок- ,ситимидинтрифосфат (дТТФ), выделеннум как описано выше мРНК, олиго- .з -целлюлозу Supra и обратную транскриптазу.

Обратную транскриптазу, выделенную из вируса avian macloblastosis, используют дл  того, чтобы скопировать полную молекулу полиаденилиро- ванной РНК, полученную из участков Лангерханса крысы, на кДНК. Реакции осуществл ют в растворе 50 мМ трис- НСГ (рН 8,3) , 9 мМ MgCr, 30 мМ хлорида натри , 20 мМ р-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого из трех нерадиоактивных дезоксириОунуклеозидтрифосфатов,

250 мМ четвертого дезоксинуклеозидзгт

триофосфата, меченного Р в альфа- позиции, с удельной радиоактивностью 50-200 Ки/моль, 20 мг/мл олиго-дТ,..,, 100 мг/мл полиаденилированной РНК и 200 ед./мл обратной тpa cкpиптaзы . Смесь инкубируют при в течение 50 мин. После добавлени  45 мМ . ЭДТК-Na, раствор экстрагируют насьш енным водой фенолом, вод ной слой хроматографируют на сёфадексе

G-100 с колонкой диаметром 0,3 см и высотой 1 о см в смеси 10 мМ трис- НС Г. (рИ 9,0) , 100 мМ хлорида натри , 2 мМ ЭДТК. Нуклеиновую кислоту, элюированную в пустой объем, осаж-

дают этанолом после добавлени 

ацетата аммони , до 0,25 М ( рН 6,OJ , Осадок собирают центрифугированием. Полученный осадок раствор ют в 50 мл свежеприготс/вленного О, 1 М раство- .

ра гидрата окиси натри  и инкуби-. руют при в течение 20 мин с целью гидролиза РНК, Смесь нейтрализуют добавлением 1М раствора ацетата натри  (рИ 4,5), а меченную

р кДНК осаждают .этанолом, а затем вновь раствор ют в воде« Образовавшийс  промежуточный продукт представл ет собой однонитевую кДНК,

17

которую используют дл  синтеза требуемого двунитевого ДНК-продукта. С целью идентификации однонитевую кДНК анализируют дл  вы снени  возможности ее применени  дл  синтеза гормона роста.

Отдельные порции кДНК, состо щей из одной нити, анализируют на натуральных полиакриламидных гел х. Гели сушат и ДНК, меченную Р, анализируют при помощи авторадиографии с. использованием пленки Kodak No- sereen-2T. При помощи диаграммы электрофореза установлено, что кДНК представл ет собой гетероди- сперсоид/ После разделени  при помощи электрофореза на геле, обнаружена слаба  полоса поглощени , соответствующа  ДНК с примерно 800 парами оснований, что характерно ЦI  кДНК, кодирующей гормон роста,

Пример 1. Полученную кДНК, состо щую из одной нити, обрабатывают обратной транскриптазой с целью синтеза комплементарной нити .

Реакционна  смесь содержит 50 мИ (рН 8,3) ; 9 мМ MgCf, 10 iM дитиотрейтол; 50 мМ трех немеченных дезоксирибонуклеози;.-- триофосфатов; 1 мМ меченного P в альфа- позиции нуклеозидтрифосфата удельной радиоактивностью 1-10 Ки/мМ, 50 мг/мл кДНК и 220 ед. /мл обратной тра криптазы. Реакционного смесь инкубируют при АЗ С в течение 120 мин.

..Реакцию прекращают добавлением ЭДТК-Ма2 (до 25 мМ) . Смесь экстра гируют фенолом и подвергают хрома- тографическому анализу на сефадек™ се G-100, а затем осаждают этанолом . Порции продукта реакции с показателем от 500 до 100 отсчетов в 1 мин анализируют при помощи электрфреза на геле.

Полоса поглощени  гетеродисперсо да сосредоточена вокруг 800 нуклео- тидов по длине,.

При обработке полной кДНК, на кторой скопирована структура мРНК клетки гипофиза крысы, э,ндонуклеа- зой Hhal образуетс  два основных фрагмента ДНК (установлено при помщи разделени  7 лектрофорезом), причем один содержит примерно 320 нукл отидов (фрагмент А), а второй.240 нуклеотидов фрагмент В).

205777 «

На основе известной последовательности аминокислот ГКР и других из- вестных данных и гормонах роста уста-

5

0

5

0

5

0

5

новлено, что эти фрагменты  вл ютс  в действительности теми част ми, на которых.содержитс  генетический код , контролирующий синтез ГРК.

При воздействии на кДНК из двух нитей,, содержащую 800 пар оснований и выделенную при помощи электрофореза эндонуклеазой Hhal, при анализе среди основных продуктов рассечени  были обнаружены два фрагмента,соответствующие по длине фрагментам А и В.

Таким образом, двунитьевую кДНК, содержащую примерно 800 пар оснований , получили с помоЬчью реакции, катализируемой обратной транскрипта- ЗОЙ, содержащей в начале ДНК, имеюг- щую нуклеотидную последовательность, кодирующую ГРК.

Так как кДНК, контролирующую син. тез ГРК, содержащую приб аизительно 800 пар оснований, не очищают перед обработкой эндонуклеазой огр аниче- НИН, ДНК необходимо подвергнуть обра- ботке с тем, чтобы удалить все несое- диненные концы. Обработка с целью удалени  таких непарных концов производитс  перед стадией разделени  электрофорезом в смеси, содержащей 25 мл 60 мМ трис-НС (рН 7,5) , 8 мМ хлорида магни , 10 мМ (f3 -мер-, каптоэтанола, 1 мМ АТФ и 200 мМ каждого из дАТФ;дТТФ,дГТФ идЦТФ.Смесь инкубируют с полимеразой 1 ДНК { 1 ед.) , выделенной из штамма Е. со 11 при 10 С в течение 10 мин с тем, чтобы удалит } все выступающие З -концы и заполнить все 5 -выступающие концы.

кДНК, контролирующую синтез ГРК и содержащую приблизительно 800 пар оснований, обрабатьшают химически синтезированным линкером Hind Ш.

Полученный в результате реакции продукт, молекула которого состоит из двух нитей, с концентрацией 2-5 мг/мл обрабатывают 30 ед. S 1

нуклеазы имеющей активность 1200 ед/г-ш, в смеси, содержащей 0,03 М ацетата натри , (рЕ 4,6) 0,3 М хлорида , 4,5 мМ хлорида цинка , при в течение 30 мин, а

затем инкубируют еще в течение

15 мин при . С целью прекращени  ферментной реакции в смесь добавл ют трис-основание с конечной

19

концентрацией 0,1 м ЭДТК до 25 мМ и тРНК, вьщеленную из E.coli,,до 40 мг/мл. После экстрагировани  реакционной смеси этанолом и хрома- ографического анализа на сефадек- се G-100, меченную Р кДНК элюи- руют в пустой объем и осаждают при помощи этанола. В результате./ такой обработки обеспечиваетс  высокий вьпсод молекул кДНК, концы которой св заны основанием. I Декамеры Hind Ш добавл ют на каждый конец молекулы кДНК дл  обеспечени  возможности соединени  реакционноспособных концов гибридизацией или ковалентной св зью кДНК, полученной, расщеплением вектора- переносчика ограничительным ферментом Hind Ш. Лигаци  декамера Hind Ш с кДНК осуществл етс  при помощи инкубации при 14°С в смеси 66 гМ трис-HCf (рН 7,6), 6,6 мМ хлорида магни , I гМ АТФ, 10 мМ дитиотрейтола, 3 мМ декамера Hind Ш с показателем 10 отсчетов в минуту и лигазы ДНК Т4, приблизительно 500 ед./мл в течение 1 ч. Дл  дезактивации лигазы реакционную смесь нагревают до и выдерживают в течение 5 мин. Предварительно к пищеварительным ферментам, содержащим 150 ед./мл Hsu I или Hind Ш добавл ют KCf с конечной концентрцией 50 мМ, р - меркаптоэтанол с конечной концентрацией 1 мМ и ЭДТК с конечной концентрацией 0,1 мМ; смесь вьщерживают в течение 2 ч при . Эндонуклеазы Hind Ш и Нао Ш. Продукт реакции анализируют при помощи электрофореза на геле, при этом был обнаружен пик, соответствующий последовательности приблизительно 850 нукпеотидов нар ду с отдельными фрагментами рассеченного декамера Hind Ш.

Плазмиду рВР-322, содержащую ген, контролирующий устойчивость к ампицилину, и единственное место узнавани  дл  фермента Hind Ш, расположенное внутри указанного гена , рассекают в месте узнавани  дл  Hind Ш эндонуклеазой Hsu I, затем обрабатывают щелочньм фосфатом типа PAPF. Фермент ввод т в реакционную смесь с концентрацией О, 1 ДНК, Реакционну ) смесь инкубируют в 25 мМ трис-HCf при рН 8 в течение 30 мин при 65 С, затем удал ют фос05777 0

фатазу путем экстрагировани  в феноле .

Полученный продукт представл ет собой молекулу ДНК, приготовленную

5 расщеплением вектора-переносчика (в данном случае плазмида рВГ-322) ограничительным ферментом (в данном случае эндонуклеазой Hind Ш). Перед фосфатазной обработкой расщепленные

10 концы вектора-переносчика ДНК, генерированные в реакции расщеплени  Hind f l, способны соедин тьс  друг с другом с помощью гибридизации или присоедин тьс  к двунитевой

15 кДНК с образованием гибридной или ковалентной св зи. После осаждени  этанолом плазмидную ДНК, обработан-,, ную фосфатазой, добавл ют в кДНК, содержащую фермент Hind Ш, соедин ю20 щий концы молекулы, в мол рном соотношении 3 моль плазмиды и 1 моль кДНК.

Суд  по удельной радиоактивности, в реакции применено приблизительно

25 10-50 мг кДНК и 100 мг плазмидной ДНК. Смесь инкубируют в смеси 66 мМ трис-НСЕ ( рН 7,6), 6,6 мМ хлорида магни , 10 мМ дитиотрейтол.а и 1 мМ АТФ в течение 1 ч при 10 С в присут-

30 ствии 50 ед/мл лигазы ДНК Т4.

Смесь, в которой протекает лига- ци , добавл ют непосредственно в суспензию штамма E.coli Х-1776, которую дл  трансформации приготавливают следующим образом.

I

Клетки выращивают до удельной

плотности примерно 2x10 клеток/мл в 50 мл среды, содержащей триптон 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, хлорид натри  10 г/л, гидрат окиси натри  2 мМ, диаминопимелилова  кислота 10 мг/мл и тимин 40 мг/мл при 37°С. Клетки собирают центрифугированием в течение 5 мин со скорое-

5 тью 6000 G при , вновь суспендируют в 20 мл холодного 10 мМ раствора хлорида натри , центрифугируют, суспендируют в 20 мл буфера трансформации , сддержащем 75 мМ CaCl ,

50 хлорида натри  и 10 мМ

трис (рН 7,5) затем смесь выдерживают в течение 5 мин на льду. Клетки центрифугируют и вновь суспендируют в буфере трансформации 0,5 мл.

55 Трансформацию осуществл ют путем смешивани  100 мл суспензии ,;слеток с 50 МП рекомбината ДНК (1 мг/мл). Смесь инкубируют при О С в течение

40

21

15 мин, затем в течение 4 мин при 25°С и в течение 30 мин при О С. Клетки перенос т на питательный агар дл  роста в селективных услови х . Рекомбинированные ,колонии ; селекционируют вьфащиванием на питательной среде, содержащей ампи цилин, а если роста не обнаруживаетс , то на питательной среде содержащей тетрациклин с концентрацией 2 мкг/мл. Получено 10 таких колоний клеток, кажда  из которых содержит плазмид с приблизительно 800 парами оснований, молекула кото рого разрываетс  под воздействием фермента Flind Ш. Такие вводимые рекомбииатные плазмиды обозначают рГРК. Дл  дальнейшего анализа выбрали одну колонию рекомбинированных бактерий, обозначенных E.coli X Х-1776/рГ К-1, Из культуры E.coli Х-1776/рГРК-1 приготовили плазмиду ДНК, обозначенную рГРК-1.

ДНК гормона роста крысы, содержащую 800 пар оснований, выдел ют в препаративных количествах 5-30 мг из рекомбинированного клона рГРК-1 путем расщеплени  Hind Ш эндонук леазой и анализируют -последователь- кость нуклеотидов, Нуклеотидна  последовательность содержит участки 5 областей, которые не участвовали в трансл ции, а также последовательность 26 аминокислот, которые были обнаружены в протеине, предшествук дем гормону роста, перед стадией выделени .

Таким образом, приблизительно 800 пар оснований выделены из плазмиды рГРК-1, закодированной дл  гормона, роста и представл ющей собой вектор-переносчик ДНК, имеющий нуклеотидную последовательность кодирующую гормон роста.

Пример 2. Вьщеление мРНК, контролирующей синтез ГРЧ, провод т аналогично примеру 1, однако биологическим источником материала  в-- л етс  ткань гипофиза человека. П ть доброкачественных гипофизов человека, замороженных в жидком азоте после хирургического удалени  вес которых 0,4 - 1,5 г , оттаивают и тонко измельчают в 4М растворе гуанидинтиоционата, содержащем Ш буферный раствор р -меркап трзтанола (рН 5,0 при 4°С. Гомоге- нат наслаивают на 1,2 мл 5,7 -М рас205777 . 22 .

вора хлорида цэзи , содержащего 100 мМ ЭДТК и центрифигируют в течение 18 ч со скоростью 37000 об/мин на ультра-центрифуге Бекман с рото5 ром типа SW 50.1. При этом РНК

собираетс  на дне пробирки. Далее ,проводитс  очистка с использованием колонны на олиго-дТ осаждение при помощи градиентного раствора цукро10 , зы. Примерно 10% вьщеленной таким образом РНК содер;кит генетический . код дл  синтеза гормона роста, что установлено путем введени  радиоактивного соединени , содержащего

15 аминокислоты в гормон, подавл юций ;рост, который выпадает в осадок в .- системе рслеток, в которых не происходила трансл ци  и полученных из зародьшзей пшеницы. кДНК гормона рос20 та человека получают аналогично примеру 1. кДНК гормона роста фракционируют при помощи электрофореза . на геле и материал с примерно 800 нуклеотидами по длине выбирают дл 

25 размножени . Выбранную фракцию обрабатывают полимеразой1 ДНК согласно примеру 1, затем обрабатывают линкером Hind III с целью сцеплени  концов. Далее кДНК рекомбинируетс 

30 с плазмидой рВР-322, обработанной щелочной фосфатазой в присутствии лигазы ДНК. Клетки штамма Е. coli Х-1776 трансформируют рекомбинантом ДНК, а затем штамм, содержащий ДНК гормона роста, извлекают. Штамм, содержащий ДНК гормона роста, выращивают в препаративных количествах, из него выдел ют ДНК гормона роста, а затем определ ют последовательность нуклеодидов. Было установлено, что вьщеленна  ДНК гормона роста содержит нуклеотиды, содержащие информацию дл  синтеза полной последовательности аминокислот гормона роста человека. Первые 23 аминокислоты гормона роста имеют вид: HjN-Phe- -Pyo-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu- Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His- Arg Leu-His-Glu-Leu.

5Q Нуклеотидна  последовательность одной нити ДНК гормона роста человека,а также последовательность ДНК,котора  соответствуем последовательности мРНК, контролирующей синтез ГРЧ (исключение

,.j составл ет то.,что вмРНК V замен ет Т),. показаны ниже.Числа относ тс  к последовательности кислот ГРЧ,начина  с конечной аминогруппы.

35

40

45

u И

9

г-t

о ы

iH

(9 X

и

М

н ж

3

о.

О)

с  fs

01 ч

Щ (Х|

(в , О

U

01

л

V

I-}

э

JS

X

r-l

о

Kl

м

п

в) (К

1

о

б

и

S

о .

о

i S

о

н н

CJ

g

и

и н о

S

о

о

S

g

н

S

и

U

о и о о

о и и (J

S

и

S у S S

U

S

б

ё

S

S

U

н

S

и

о. о

5

о о

b

I Е.

fnRNA , . 5 з fA)

.j ГА)

, Is/

-j;

S ccAi ecTrees 3 Gff//C fAACCS

(K}CCAf(GCTrffe5 {T)GG//CGAACC3

f

.{A}OCA3 i.r}(GIICGAp5

мА

мАбСГТ, 5 A

A3

Г ТСбонВ

ТЧОШ f(GCTreG-L(A CCAAGCrr.

TTccMa: -)GGTrcGAt

cDNK OM

Составитель Т, Цол нска  Редактор Л. Пчелинска  Техред И. Ас галош Корректор И. Эрдейи

Заказ 8551/62 Тираж 490, Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета .СССР

по делам изобретений и oткpытиjl П3035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., Д. 4/5

Филиал ШШ Патент, г. Ужгород,, ул. Проектна , 4

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕКТОРА, ИМЕЮЩЕГО НУКЛЕОТИДНУЮ·ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ ПРОТЕИН, 'включающий выделение клеток животной ткани, экстракцию мРНК из клеток, кодирующей протеин в присут ствии ингибитора РНК—азы, выделение мРНК, последующий синтез комплементарной ДНК и конструирование нуклеотидной последовательности, кодирующей протеин, отличаю щийс я тем, что, с целью получения вектора, имеющего нуклеотидную последовательность, кодирующую гормон роста, в качестве клеточной ткани животного используют клетки гипофиза, в качестве ингибитора РНК-азы используют раствор 4М гуанидинэтиоцианата и 0,2 М бетамеркаптоэтанола, а вектор синтезируют путем реакции комплементарной ДНК с ДНК-молекулой, имеющей реакционноспособные концы, способные соединяться мелщу собой или с комплементарной ДНК при условии предотвращения соединения реакционноспособных ' концов молекулы ДНК.

2. Способ поп. 1, отличающий с я тем, что для предотвращения соединения реакционноспособных концов молекулы ДНК, ее обрабатывают щелочной фосфатазой.

SU ,_й, 1205777