JP3020811B2 - 糖鎖構造決定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、糖鎖構造決定方法、該
方法に用いるためのキット、及び新規オリゴ糖に関し、
更に詳細にはＮ−アセチルラクトサミン型糖鎖の糖鎖構
造決定方法、糖鎖構造決定用キット、及びＮ−アセチル
ラクトサミン型糖鎖由来の新規オリゴ糖に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、細胞認識や細胞接着、あるいは癌
の転移に糖鎖そのものが機能しているという証拠が数多
く出されており、糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質
中の糖鎖構造の解析は、ますます重要になっている。従
来用いられてきた糖鎖構造解析方法としては、メチル化
分析、過ヨウ素酸酸化、酵素消化などの分析法のほか、
核磁気共鳴法や質量分析器による分析が行われている。
これらの技術に加えて、最近急速に発展してきた高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて糖鎖を分析
することが可能となっている。特に長谷らによって開発
された糖鎖の蛍光標識法であるピリジル（−２−）アミ
ノ化（ＰＡ化）法〔ジャーナル オブ バイオケミスト
リー（Journal of Biochemistry)、第９５巻、第１９７
〜２０３頁（１９８４）〕と２種類のカラムを用いてＨ
ＰＬＣ分析を行う、いわゆる２次元マッピング法を組合
せて、多種類の糖鎖を簡便かつ高感度で分析することが
可能となっている〔アナリティカル バイオケミストリ
ー（Analitical Biochemistry)、第１７１巻、第７３〜
９０頁（１９８８）〕。しかし、この方法では、２種類
のカラムでの溶出位置が同じかあるいは非常に近い複数
の糖鎖を区別することはできない。更に、この方法はマ
ップに記載されていない糖鎖、特にシアル酸を持つ糖鎖
に対しては無効であり、構造が未知の糖鎖の構造決定の
方法としては適当ではない。ＰＡ化とＨＰＬＣとの組合
せに限らず、他のいかなる標識方法や分離方法でも、ク
ロマトグラフィーのみで糖鎖の構造を決定しようとした
場合、存在する可能性のあるすべての糖鎖が、既に何ら
かの方法で構造決定された標準物質として手元にあり、
それらがクロマトグラフィーにて分離同定できなけれ
ば、ただ１つの構造には決定できないが、糖鎖の多様性
を考慮すると、それはまず不可能である。そこで通常
は、糖鎖が特異的エキソグリコシダーゼで消化されるか
どうかを、クロマトグラフィーにて逐次確認していく方
法を併用することにより糖鎖の構造を決定している〔例
えば、Ｅ．ツダ（Tsuda)ら、バイオケミストリー（Bioc
hemistry) 、第２７巻、第５６４６〜５６５４頁（１９
８８）〕。以下、特異的エキソグリコシダーゼによる消
化を単に酵素消化と記述する。特異的エキソグリコシダ
ーゼには、糖鎖の非還元末端糖残基の種類とα、βとい
ったアノマー型、及び糖残基が置換している水酸基の位
置を綿密に認識しうるものが多く存在する（以後、アノ
マー型と、糖残基の置換している還元末端側の水酸基の
位置とを合せた、例えばα−２，３結合、β−１，４結
合といったものを結合様式と表現する）。例えば、肺炎
球菌より得られるβ−ガラクトシダーゼは、β−１，４
結合した非還元末端ガラクトース残基のみを認識し加水
分解するし、タチナタマメより得られるβ−ガラクトシ
ダーゼは、β結合した非還元末端ガラクトース残基を認
識し加水分解する。こういったエキソグリコシダーゼの
特異性を利用して、糖鎖の非還元末端の糖残基の種類と
結合様式とを推定することができる。例えば糖鎖サンプ
ルが肺炎球菌のβ−ガラクトシダーゼによって消化され
うるならば、その糖鎖が非還元末端にβ−１，４結合し
たガラクトースを有していることを推定できる。酵素消
化は通常、逐次消化が行われている。例えば、糖鎖サン
プル１が酵素Ａで消化されたとすると、消化産物の糖鎖
サンプル２が得られる。糖鎖サンプル２を回収し、続い
て酵素Ｂで消化すると、糖鎖サンプル３が得られ、これ
を更に酵素Ｃで消化するという操作を繰返すのである。
しかしながら、酵素消化によって構造決定する方法は、
微細な構造の違いを区別できる反面、酵素反応とクロマ
トグラフィーによる反応生成物の分析と回収を繰返さな
ければばならないため、多大な労力と、時間を費やすと
いう欠点をもっている。こうして欠点を補うため、糖鎖
の酵素消化を体系的に行い、糖鎖の構造を推定する方法
が開発されている〔特開平３−２２８６９８号、Ｃ．
Ｊ．エッジ（Edge) ら、プロシーディングズ オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サンエンシーズ オ
ブ ザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ）、
第８９巻、第６３３８〜６３４２頁（１９９２）〕。

【０００３】前記方法は、実質上、構造決定すべき糖鎖
サンプルを １、いくつかに等分割し、 ２、それぞれを異なる酵素混合物で完全消化し、 ３、これらの最終反応生成物を混合したのち、分析クロ
マトグラフィーに供し、 ４、その分析スペクトル、すなわち、ピークの溶出位置
とピークの強度をデータベース中の糖鎖の構造から理論
的に導かれるスペクトルと比較し、５、糖鎖サンプルの
スペクトルと統計学的に最も近いスペクトルを与える糖
鎖の構造をデータベースの中から検索し、これをもって
糖鎖サンプルの構造であると推定する、という一連の操
作を行うことを特徴としている。この方法では、分析ク
ロマトグラフィーは１回で済み、また、分析した糖鎖の
回収をする必要が無いので、この方法により、酵素消化
による糖鎖構造解析の簡便化、迅速化が実現されてい
る。しかしながら、この方法は実験スペクトルと理論ス
ペクトルとの近似を行う方法であるため、元々から実験
値と理論値との間に隔たりがある場合、あるいは、理論
スペクトルを全く同じくするか、あるいは酷似した複数
の糖鎖がデータベース上に存在する場合などには、推定
される構造が誤っていたり、あるいは、提示される推定
構造が複数になったりすることがある。例えば、上記エ
ッジらの文献の方法によれば、下記式（化５）：

【０００４】

【化５】

【０００５】に示す簡単な構造のものですら理論的には
２つの構造が全く同じ確からしさで提示され、結局は１
つの構造に決定することができない。この問題点は、よ
り綿密な結合特異性をもつ酵素を酵素混合物に加えるこ
とにより、解決され得ると著者らは述べているが、用い
る酵素の数を増やせば、その分だけ多くの酵素混合物を
用意する必要が生じ実用的ではない。しかも、こういっ
た特異的酵素の種類にも限界があり、データベース中の
すべての理論スペクトルが区別できるような酵素混合物
を構築することは事実上不可能である。更に、この方法
には重大な欠点が存在する。すなわち、多くの糖鎖、特
にアスパラギン結合型糖鎖は、直鎖状ではなく、複雑に
分枝しており、そのため１つの糖鎖が複数の非還元末端
残基を有している。ところがこの方法では、酵素消化に
よって、非還元末端残基の種類と数、そして結合様式が
判明したとしても、その残基が、複数存在する非還元末
端のいずれであるか、すなわちその残基がどの枝の非還
元末端残基なのかということまでは決定できず、ただ１
つの構造に決定できない。また、この方法は、実験スペ
クトルを乱すような要因、例えば用いる酵素の活性の低
下、あるいは意図せざる酵素活性の微量混入、あるいは
異種糖鎖の混入によって、スペクトルは大いに影響を受
ける。ところが、得られたスペクトルが正しいものであ
るかどうかを検定するすべがない。したがって、この方
法は、分析法自体は簡便かつ迅速ではあるが、スペクト
ルの信頼性に欠け、構造解析の手段としては決して満足
できるものではない。

【０００６】この方法の上記に挙げたような欠陥の原因
は、個々の反応生成物を同定できないことにある。同定
とは、すなわち、構造未知の物質を、クロマトグラフィ
ー等の手法を用いて、構造が既知の物質と同一であると
いうことを示すことである。したがって、同定には、存
在の可能性のあるすべての標準物質をそろえ、しかもそ
れらすべてが、何らかの方法で区別されることが必須で
ある。しかしながら、この方法で生じる可能性のある生
成物の数は膨大であり、それらすべてを標準物質として
そろえ、それらを分離区別することは不可能である。そ
れ故この方法では、実験スペクトルを理論スペクトルへ
近似することによって同定に替わるものとしているので
ある。しかしながら、本来、物質の構造決定のために
は、近似というあいまいな手法を用いるべきではなく、
近似を行う限り、構造がただ１つに決定されなかった
り、誤った構造が提示されたりする危険を常に伴ってい
た。したがって、より正確でかつ簡便な糖鎖構造決定方
法の開発が望まれていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、より
正確でかつ簡便な糖鎖構造決定方法、該方法に用いるた
めのキット、及び標準物質として有用な新規のオリゴ糖
を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はＮ−アセチルラクトサミン型糖鎖の
糖鎖構造決定方法に関し、Ｎ−アセチルラクトサミン型
糖鎖のＭ３コアのα−マンノース残基（α−Ｍａｎ）に
β結合しているＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧＮ）
のうち、選択的に除去すべきＧＮのα−Ｍａｎとの結合
の切断を酵素的処理により行ってＧＮを選択的に除去し
た後、当該Ｍ３コアに残存しているＧＮの結合位置を決
定することによって、Ｍ３コアのα−Ｍａｎにβ結合し
ているＧＮの非還元末端側の糖鎖残基を決定することを
特徴とする。本発明の第２の発明は、Ｎ−アセチルラク
トサミン型糖鎖の糖鎖構造決定方法に関し、下記工程： （１） Ｍ３コアのα−Ｍａｎにβ結合しているＧＮを
選択的に除去する工程、 （２） 工程（１）の生成物が、Ｍ３コアのα−Ｍａｎ
にβ結合しているＧＮの非還元末端側に糖残基が結合し
ている生成物である場合には、それらの糖残基を除去す
る工程、 （３） 工程（１）又は工程（２）により得られる、Ｍ
３コアのα−Ｍａｎと非還元末端側に糖残基を有しない
ＧＮとがβ結合している生成物を標準物質と比較、同定
する工程、 を含むことを特徴とする。本発明の第３の発明は第１又
は第２の発明の糖鎖構造決定方法に用いるためのキット
に関し、下記一般式（化１）：

【０００９】

【化１】

【００１０】〔式中、Ｙ₁ 、Ｙ₂ 、Ｙ₃ 、Ｙ₄ はいずれ
も水素又はβ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基（β−Ｇ
Ｎ）を示し、Ｒ₁ は下記式（化２）又は（化３）：

【００１１】

【化２】

【００１２】

【化３】

【００１３】（式中、Ｒ₂ はアルデヒド基、標識化され
たメチレン基、又は標識化されたメチン基を示す）を表
す〕で表されるオリゴ糖の少なくとも１種を含むことを
特徴とする。本発明の第４の発明は、下記一般式（化
４）：

【００１４】

【化４】

【００１５】〔式中、Ｘ₁ 、Ｘ₂ 、Ｘ₃ 、Ｘ₄ はいずれ
も水素又はβ−ＧＮ（ただし、Ｘ₁ とＸ₃ の両方が水素
の場合、あるいはＸ₂ とＸ₄ の両方がβ−ＧＮの場合を
除く）を示し、Ｒ₁ は前記式（化２）又は（化３）を表
す〕で表されるオリゴ糖に関する。

【００１６】本発明者らは鋭意研究の結果、糖鎖構造の
解析に際し、同定という工程を用いるべく生成する可能
性のある最終生成物の数が限定されるような糖鎖試料の
処理の方法を開発した。更に、該方法に用いるためのキ
ットを構築した。更に、同定の際の標準物質として有用
な新規オリゴ糖を取得し、本発明を完成した。

【００１７】以下、本発明を詳細に説明する。Ｎ−アセ
チルラクトサミン型糖鎖には、例えば下記一般式（化
６）で表されるものがある。

【００１８】

【化６】

【００１９】〔式中、ＳＡはシアル酸残基、Ｇａｌはガ
ラクトース残基、ＧＮはＮ−アセチルグルコサミン残
基、Ｆｕｃはフコース残基、Ｍａｎはマンノース残基を
表し、各残基の後の括弧中は結合様式を表す。また、ｌ
_x 、ｍ_x 、ｍ′_x 、ｎ_x 、ｎ′_x、ｐ_x （ｘ＝１、２、
３、４）及びｑは変数であり、それぞれ０又は１を表
す。ただし、ｍ_x ｍ′_x ＝ｎ_x ｎ′_x ＝ｍ′_x ｐ_x ＝
０、かつｌ_x ≧ｍ_x ，ｍ′_x ≧ｎ_x ，ｎ′_x 、かつｌ_x
≧ｐ_x である〕

【００２０】Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖はその微
細構造には多様性をもっているが、基本構造において
は、下記式（化７）：

【００２１】

【化７】

【００２２】で表される基本骨格（以後Ｍ３コアと称
す）を有しており、通常の構造は上記式（化６）ですべ
て表される。すなわち、Ｎ−アセチルラクトサミン型糖
鎖はＭ３コアから４つのＧＮによって枝別れした樹状構
造をしており、それぞれの枝（以後、枝分かれしたＧＮ
とその非還元末端側の糖残基とを合せた集団を“枝”と
表す）は、ＧＮ、Ｇａｌ、ＳＡ、Ｆｕｃの糖残基より構
成される。Ｇａｌ，ＳＡについては、Ｇａｌβ−１，３
とβ−１，４、ＳＡα−２，３とα−２，６のそれぞれ
２つの結合様式の可能性があり、それらは区別される必
要がある。各枝の構成糖残基の数は多くても１つで、し
かもその配列順序が決まっており、各枝の内容は、一般
的には下記式（化８）：

【００２３】

【化８】

【００２４】〔式中、ｌ、ｍ、ｍ′、ｎ、ｎ′、ｐは変
数であり、それぞれ０又は１を表す。ただし、ｍｍ′＝
ｎｎ′＝ｍ′ｐ＝０かつｌ≧ｍ，ｍ′≧ｎ，ｎ′かつｌ
≧ｐである〕で表される。

【００２５】各枝の各糖残基の数は０か１かに限定され
ており、しかもその配列順序が既に式（化８）のように
規定されているため、Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖
の構造を決定するためには、枝ごとの各糖残基の有無を
決定するだけでよく、糖残基の配列順序はおのずと決定
される。枝ごとの各糖残基の有無を決定することは、各
糖残基ごとに糖残基が存在する枝を決定することと同義
であるから、各糖残基ごとに、それぞれがどの枝に存在
しているかを決定することで、Ｎ−アセチルラクトサミ
ン型糖鎖の構造を決定することができる。

【００２６】次に、ある糖残基が存在する枝がどの枝な
のか（枝情報）を決定する方法について述べる。本発明
の方法の代表的な態様においては、存在を決定すべき特
定の糖残基について、該糖残基が存在しない枝を酵素的
あるいは化学的処理によって除去することによって、該
糖残基が存在する枝と存在しない枝を区別する。

【００２７】ＧＮ、Ｇａｌ、ＳＡ、Ｆｕｃのそれぞれの
糖残基が存在しない枝の除去は、例えば以下のようにし
てできる。ＧＮの存在しない枝は当然、枝そのものが存
在しないわけであるから、ＧＮの存在しない枝を選択的
に除去する必要はない。

【００２８】Ｇａｌの存在しない枝には、ＧＮ、Ｆｕｃ
が存在する可能性があるので、例えば、β−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ、α−フコシダーゼで糖鎖を処理
すれば枝を除去できる。Ｇａｌの存在する枝は、ＧＮが
Ｇａｌによって保護されているため、この処理では除去
されない。

【００２９】ＳＡの存在しない枝には、ＧＮ、Ｇａｌ、
Ｆｕｃが存在する可能性があるので、例えば、β−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
α−フコシダーゼで糖鎖を処理すれば枝を除去できる。
ＳＡの存在する枝はＧＮ、ＧａｌがＳＡによって保護さ
れているため、この処理では除去されない。Ｆｕｃの存
在しない枝にはＧＮ、Ｇａｌ、ＳＡが存在する可能性が
あるので、例えば、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、シアリダーゼで糖鎖を処理
すれば、枝を除去できる。Ｆｕｃの存在する枝はＧＮが
Ｆｕｃで保護されているので、この処理では除去されな
い。

【００３０】以上のようにして、ＧＮ、Ｇａｌ、ＳＡ、
Ｆｕｃの各糖残基が存在しない枝を選択的に除去したの
ち、次に残存している枝を判別する必要がある。そのた
めに、残存している枝を酵素的あるいは化学的な方法を
用いて最も簡単な構造、すなわちＧＮ残基のみにする。
そうすることによって、理論的に期待される生成物の数
を大幅に減らすことができ、以降の分析を容易にするこ
とができる。すなわち、Ｍ３コアにＧＮが結合しただけ
のものを挙げると、４つのＧＮそれぞれに、「有り」、
「なし」、の２つの可能性があるので、Ｍ３コアも含め
て、２×２×２×２＝１６種類になる。これらの構造
は、表１に示した。糖鎖の処理生成物を、これら１６種
のいずれかに同定することで、処理生成物の各枝の有無
が判定できる。ただし、これら１６種の糖鎖がなんらか
の方法で分離されることが前提である。

【００３１】以上のように、各枝のうち目的の糖残基の
存在する枝のＧＮのみが残るように処理することがで
き、かつ、表１に示した１６種の糖鎖を、クロマトグラ
フィーなどの方法によって分離同定することができれ
ば、枝を構成するすべての糖残基について、糖残基が存
在する枝を判別できるはずである。これらを基にして、
式（化６）に示したＮ−アセチルラクトサミン型糖鎖の
構造はただ１つに決定される。

【００３２】以下に、グリコシダーゼによる酵素消化を
糖鎖の処理の手段とした方法を説明する。通常のＮ−ア
セチルラクトサミン型糖鎖はその（ｉ）ＧＮの結合位
置、（ii）Ｇａｌの結合位置と結合様式、（iii)ＳＡの
結合位置と結合様式、（iv）Ｆｕｃの結合位置をそれぞ
れ決定すればその構造を一義的に決定することができ
る。

【００３３】ＧＮの結合可能位置は通常の糖鎖ではＧＮ
（β１−６）Ｍａｎ（α１−６）、ＧＮ（β１−２）Ｍ
ａｎ（α１−６）、ＧＮ（β１−４）Ｍａｎ（α１−
３）、ＧＮ（β１−２）Ｍａｎ（１−３）の４箇所が考
えられる。すなわちそのいずれにＧＮが結合しているか
を決定するということは式（化６）の４つの変数、
ｌ₁、ｌ₂ 、ｌ₃ 、ｌ₄ を決定することである。

【００３４】Ｇａｌの結合可能な糖残基は、上述の４個
のＧＮであり、Ｇａｌの結合様式はβ−１，３とβ−
１，４の２種類が考えられる。したがって、Ｇａｌの結
合位置と結合様式を決定するということは、式（化６）
の８つの変数、ｍ₁ 、ｍ′₁ 、ｍ₂ 、ｍ′₂ 、ｍ₃ 、
ｍ′₃ 、ｍ₄ 、ｍ′₄ を決定することである。ただし、
１つのＧＮに複数のＧａｌが結合することはないので、
任意のｘ（ｘ＝１、２、３、４）についてｍ_x ｍ′_x ＝
０である。また、Ｇａｌが結合するのはＧＮのみである
から、任意のｘについてｌ_x ＝０ならばｍ_x ，ｍ′_x ＝
０、すなわちｌ_x ≧ｍ_x ，ｍ′_x である。

【００３５】ＳＡはＧａｌにα−２，３とα−２，６の
２種類の結合様式で結合することが可能である。したが
って、ＳＡの結合位置と結合様式を決定するということ
は、前記式（化６）の８つの変数、ｎ₁ 、ｎ′₁ 、ｎ
₂ 、ｎ′₂ 、ｎ₃ 、ｎ′₃ 、ｎ₄ 、ｎ′₄ を決定するこ
とである。ただし、１つのＧａｌに複数のＳＡが結合す
ることはないので、任意のｘ（ｘ＝１、２、３、４）に
ついてｎ_x ｎ′_x ＝０である。また、ＳＡが結合するの
はＧａｌのみであるから、任意のｘについてｍ_x，ｍ′
_x ＝０ならば、ｎ_x ，ｎ′_x ＝０、すなわち、ｍ_x ，
ｍ′_x ≧ｎ_x ，ｎ′ _x である。

【００３６】ＦｕｃはＮ−アセチルラクトサミン型糖鎖
の還元未満のＧＮにα−１，６結合で、Ｍａｎの非還元
末端側の４つのＧＮにα−１，３で結合することが可能
である。したがって、Ｆｕｃの結合位置と結合様式を決
定するということは、前記式（化６）の５つの変数、
ｑ、ｐ₁ 、ｐ₂ 、ｐ₃ 、ｐ₄ を決定することである。た
だし、ＧＮにＧａｌがβ−１，３で結合している場合、
そのＧＮにＦｕｃがα−１，３で結合することはありえ
ない。すなわち、任意のｘ（ｘ＝１、２、３、４）につ
いてｐ_x ｍ′_x ＝０である。また、Ｆｕｃが結合しうる
のはＧＮのみであるからｌ_x ＝０ならばｐ_x ＝０、すな
わちｐ_x ≦ｌ_x である。

【００３７】ある糖鎖の（ｉ）ＧＮの結合位置、（ii）
Ｇａｌの結合位置と結合様式、（iii)ＳＡの結合位置と
結合様式、及び（iv）Ｆｕｃの結合位置は、糖鎖を少な
くとも１種のグリコシダーゼによって消化し、その反応
生成物を分析することによって決定することができる。
すなわち、Ｍ３コアに結合しているＧＮのみが残るよう
な酵素反応、Ｇａｌが結合していたＧＮのみが残るよう
な反応、ＳＡの還元末端側に存在するＧＮのみが残るよ
うな反応、Ｆｕｃが結合していたＧＮのみが残るような
反応をそれぞれ設定し、それぞれの反応生成物を標準物
質を用いて同定することにより、糖鎖全体の構造を決定
することができる。

【００３８】まず本発明における標準物質について述べ
る。Ｍ３コアにＧＮのみが結合している糖鎖としては、
下記式（化９）：

【００３９】

【化９】

【００４０】（式中、Ｙ₁ 、Ｙ₂ 、Ｙ₃ 、Ｙ₄ は、いず
れも水素又はβ−ＧＮを示す）で表される１６種があ
る。この１６種の標準物質と最終反応生成物を比較する
ことにより、該最終反応生成物のＭ３コアへのＧＮ結合
位置が決定される。１６種の糖鎖、すなわちオリゴ糖Ｉ
〜ＸVIとβ−ＧＮ結合位置の関係を表１に示す。

【００４１】

【表１】 表 １ ──────────────────────────────────── オリゴ糖 Ｙ₁ Ｙ₂ Ｙ₃ Ｙ₄ ──────────────────────────────────── Ｉ ： Ｈ Ｈ β−ＧＮ Ｈ II ： Ｈ β−ＧＮ β−ＧＮ Ｈ III ： Ｈ Ｈ β−ＧＮ β−ＧＮ IV ： Ｈ Ｈ Ｈ Ｈ Ｖ ： Ｈ β−ＧＮ Ｈ Ｈ VI ： Ｈ Ｈ Ｈ β−ＧＮ VII ： Ｈ β−ＧＮ Ｈ β−ＧＮ VIII ： Ｈ β−ＧＮ β−ＧＮ β−ＧＮ IX ： β−ＧＮ Ｈ Ｈ β−ＧＮ Ｘ ： β−ＧＮ β−ＧＮ β−ＧＮ Ｈ ＸＩ ： β−ＧＮ Ｈ β−ＧＮ β−ＧＮ ＸII ： β−ＧＮ Ｈ Ｈ Ｈ ＸIII ： β−ＧＮ β−ＧＮ Ｈ Ｈ ＸIV ： β−ＧＮ Ｈ β−ＧＮ Ｈ ＸＶ ： β−ＧＮ β−ＧＮ Ｈ β−ＧＮ ＸVI ： β−ＧＮ β−ＧＮ β−ＧＮ β−ＧＮ ────────────────────────────────────

【００４２】オリゴ糖Ｉ〜ＸVIはＮ−アセチルラクトサ
ミン型糖鎖を調製し、次いで、グリコシダーゼで逐次分
解することにより調製することができる。例えば、オリ
ゴ糖ＸVIはヒトのα₁ −アシッドグリコプロティン（シ
グマ社）をヒドラジン分解、Ｎ−アセチル化することに
よって得られる糖鎖をシアリダーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、フコシダーゼで完全消化することによって調製す
ることができる。更に、オリゴ糖ＸVIをウシ腎臓由来の
β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼにより部分消化す
ることにより、オリゴ糖Ｉ〜ＸVIの混合物を調製するこ
とができ、これ

【００４３】また、例えばオリゴ糖VIIIはウシフェツイ
ンをヒドラジン分解、Ｎ−アセチル化することによって
得られる糖鎖をシアリダーゼ、β−ガラクトシダーゼで
完全消化することによって調製することができる。更
に、オリゴ糖VIIIをウシ腎臓由来のβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼにより部分消化することによりオリゴ
糖Ｉ〜VIIIの混合物を調製することができ、これらはＨ
ＰＬＣ等で分取することができる。これらのオリゴ糖
は、例えばパルス電気化学的検出（ＰＡＤ）によって高
感度に検出することができる。

【００４４】これらのオリゴ糖はそのまま用いてもよい
が、下記式（化１０）：

【００４５】

【化１０】

【００４６】（式中、Ｙ₁ 、Ｙ₂ 、Ｙ₃ 、Ｙ₄ はいずれ
も水素又はβ−ＧＮであり、Ｒ₂ はアルデヒド基、標識
化したメチレン基、又は標識化したメチン基を示す）で
表されるように修飾化して用いてもよい。

【００４７】メチレン基の標識化の例としては、ＰＡ化
による方法〔アグリカルチュラルアンド バイオロジカ
ル ケミストリー〔Agricultural and Biological Chem
istry)、第５４巻、第２１６９〜２１７０頁（１９９
０）〕、パラアミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）による
方法〔アナリティカル バイオケミストリー、第１４１
巻、第３６６〜３８１頁（１９８４）〕、８−アミノナ
フタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）に
よる方法〔バイオケミカル ジャーナル（Biochemical
Journal)、第２７０巻、第７０５〜７１３頁（１９９
０）〕が挙げられる。

【００４８】また、メチン基の修飾化の例としては、ト
リチウムによる放射性標識〔メソッズ イン エンザイ
モロジー（Methods in Enzymology)、第５０巻、第５０
頁（１９７８）〕、１−フェニル−３−メチル−５−ピ
ラゾロン（ＰＭＰ）による方法〔アナリティカル バイ
オケミストリー、第１８０巻、第３５１〜３５７頁（１
９８９）〕が挙げられる。

【００４９】例えば、ＰＡ化オリゴ糖の例としては表１
のオリゴ糖Ｉ〜ＸVIをＰＡ化したものが挙げられる（以
下、オリゴ糖ＩのＰＡ化物をＩ−ＰＡと称す。II〜ＸVI
についても同様とする）。オリゴ糖Ｉ−ＰＡ〜 VII−Ｐ
Ａは例えばオリゴ糖VIIIを前記の方法でＰＡ化してVIII
−ＰＡを調製し、次いで、VIII−ＰＡをウシ腎臓由来β
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで部分消化してＨＰ
ＬＣで分取することにより調製することができる。同様
に、IX−ＰＡ〜XV−ＰＡは例えばオリゴ糖ＸVIをＰＡ化
してＸVI−ＰＡを調製し、次いで、ＸVI−ＰＡをウシ腎
臓由来β−Ｎ−アセチルグルコサニダーゼで部分消化し
てＨＰＬＣで分取することにより調製することができ
る。Ｉ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡはＨＰＬＣにより分離するこ
とができる。これらを標準物質として、前記の最終酵素
反応生成物を同定することができる。

【００５０】Ｉ−ＰＡ〜VIII−ＰＡの８種の混合物は、
例えば、パルパックタイプＲ（PALPAK TYPE R 、宝酒造
社）を用いたＨＰＬＣ〔溶離液：０．０３５％１−ブタ
ノールを含む１００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ
４．０）〕にて分離することができる。図１に、Ｉ−Ｐ
Ａ〜VIII−ＰＡの等モル混合物を分離した例を示す。な
お、図１において、縦軸は相対蛍光強度、横軸は溶出時
間（分）を示す（以下の各図においても同義である）。

【００５１】Ｉ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡの１６種の混合物に
ついてもＨＰＬＣにより分離することができる。例え
ば、まず混合物をパルパックタイプＮ（宝酒造社）を用
いたＨＰＬＣ〔溶離液：５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミ
ン（ｐＨ７．３）、アセトニトリル７０％（０分）→５
０％（３００分）のリニアグラジェント〕に供し、糖鎖
基の数の違いで分離する。図２にその例を示す。すなわ
ち、図２の１３〜１７分には、Ｍ３コアにＧＮが全く結
合していないもの、すなわちIV−ＰＡが溶出し、同様
に、１８〜２３分にＧＮが１個結合したもの（Ｉ−Ｐ
Ａ、Ｖ−ＰＡ、VI−ＰＡ、ＸII−ＰＡ）、２４〜２９分
にＧＮが２個結合したもの（II−ＰＡ、 III−ＰＡ、Ｖ
II−ＰＡ、IX−ＰＡ、ＸIII −ＰＡ、ＸIV−ＰＡ）、３
２〜３８分にＧＮが３個結合したもの（VIII−ＰＡ、Ｘ
−ＰＡ、ＸＩ−ＰＡ、ＸＶ−ＰＡ）、４２〜４６分にＧ
Ｎが４個結合したものすなわちＸVI−ＰＡが溶出する。

【００５２】次に、１８〜２３分のフラクション（フラ
クション２）を更にパルパックタイプＲを用いたＨＰＬ
Ｃ〔溶離液：０．０７％１−ブタノールを含む１００ｍ
Ｍ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ４．０）〕に供すると
ＧＮが１個結合した４種、すなわちＩ−ＰＡ、Ｖ−Ｐ
Ａ、VI−ＰＡ、ＸII−ＰＡが分離される。図３にその例
を示す。同様にして、３２〜３８分のフラクション（フ
ラクション４）についてもVIII−ＰＡ、Ｘ−ＰＡ、ＸＩ
−ＰＡ、ＸＶ−ＰＡの４種が分離される。図４にその例
を示す。２４〜２９分のフラクション（フラクション
３）についてパルパックタイプＲを用いたＨＰＬＣ〔溶
離液：０．０３５％１−ブタノールを含む１００ｍＭ酢
酸−トリエチルアミン（ｐＨ４．０）〕に供すると、II
−ＰＡ、III−ＰＡ、VII −ＰＡ、IX−ＰＡ、ＸIII −
ＰＡ、ＸIV−ＰＡの６種が分離される。図５にその例を
示す。以上のようにして、Ｉ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡの１６
種のオリゴ糖を分離することができる。

【００５３】これら１６種のＰＡ化オリゴ糖は、図２〜
図５の各ピークを分取して単離することができる。な
お、ＸIV−ＰＡに関しては図５のピークをそのまま分取
してもよいが、以下の方法によればより簡単に分取する
ことができる。すなわち、フラクション３の一部をβ−
１，２結合特異的な肺炎球菌由来β−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼで完全消化して図５と同じ条件とＨＰＬ
Ｃに供すると、III −ＰＡとＶII−ＰＡのピークが消失
し（加水分解されてそれぞれＩ−ＰＡ、IV−ＰＡが生成
する）、ＸIV−ＰＡのみが加水分解されずに残るので、
その残ったピークを分取すればよい。図６にその例を示
す。また、IX−ＰＡ〜ＸＶ−ＰＡはＸVI−ＰＡ、例えば
市販のＰＡ−シュガーチェイン００４（宝酒造社）を原
料にしてシアリルトランスフェラーゼとガラクトースオ
キシダーゼとを用いて効率よく生産することもできる。

【００５４】また、これらＩ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡの混合
物はパルパックＮを用いてＨＰＬＣ〔溶離液：５０ｍＭ
酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ７．３）、アセトニトリ
ル７０％（０分）→５０％（３００分）のリニアグラジ
ェント〕及びパルパックＲを用いたＨＰＬＣ〔溶離液：
０．０２％ １−ブタノールを含む１００ｍＭ酢酸−ト
リエチルアミン（ｐＨ４．０）〕に供し、それぞれの条
件でのオリゴ糖の溶出パターンと溶出位置を２次元的に
プロットすることにより、更に簡単に分離することがで
きる。図７にその例を示す。Ｉ−ＰＡ、II−ＰＡ、III
−ＰＡ、IX−ＰＡ、Ｘ−ＰＡ、ＸＩ−ＰＡ、ＸII−Ｐ
Ａ、ＸIII −ＰＡ、ＸIV−ＰＡの物性を以下に示す。更
に、図８及び図９にＩ−ＰＡの、図１０及び図１１にII
−ＰＡの、図１２及び図１３にIII −ＰＡの、図１４に
IX−ＰＡの、図１５及び図１６にＸ−ＰＡの、図１７に
ＸＩ−ＰＡの、図１８にＸII−ＰＡの、図１９にＸIII
−ＰＡの、図２０にＸIV−ＰＡのプロトン核磁気共鳴
（ ¹Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルを示す。なお、 ¹Ｈ−ＮＭ
Ｒでの化学シフト値は、テトラメチルシランを基準とし
たときの３７℃、重水中でのアセトンのメチルプロトン
の化学シフト値を２．２１８ｐｐｍとして表した。図
９、図１１、図１３〜１５、図１７〜２０において２．
２１８ｐｐｍに見られるシグナルは、内部標準に用いた
アセトンのメチルプロトンのシグナルである。

【００５５】（Ｉ−ＰＡの物性） 分子量 １１９２．７（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５５６（Ｈ−１、ＧＮ−７）、
２．０６７（ＮＡｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：２．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００５６】（II−ＰＡの物性） 分子量 １３９５．４（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５４１（Ｈ−１、ＧＮ−５′）、
４．５５６（Ｈ−１、ＧＮ−７）、２．０４０（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−５′）、２．０６６（ＮＡｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００５７】（ III−ＰＡの物性） 分子量 １３９５．５（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５２７（Ｈ−１、ＧＮ−５）、
４．５１５（Ｈ−１、ＧＮ−７）、２．０４５（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−５）、２．０６７（ＮＡｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００５８】（ IＸ−ＰＡの物性） 分子量 １３９５．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５５２（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５３５（Ｈ−１、ＧＮ−５）、２．０４６（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−７′）、２．０４６（ＮＡｃ、ＧＮ−５） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００５９】（Ｘ−ＰＡの物性） 分子量 １５９９．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５２８（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５４９（Ｈ−１、ＧＮ−５′）、４．５５７（Ｈ−
１、ＧＮ−７）、２．０２８（ＮＡｃ、ＧＮ−７′）、
２．０３８（ＮＡｃ、ＧＮ−５′）、２．０６７（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：４．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００６０】（ＸＩ−ＰＡの物性） 分子量 １５９８．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５４６（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５１５（Ｈ−１、ＧＮ−７）、４．５２９（Ｈ−
１、ＧＮ−５）、２．０４５（ＮＡｃ、ＧＮ−７′）、
２．０６５（ＮＡｃ、ＧＮ−７）、２．０４５（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−５） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：４．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００６１】（ＸII−ＰＡの物性） 分子量 １１９１．５（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５４２（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
２．０４３（ＮＡｃ、ＧＮ−７′） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：２．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００６２】（ＸIII −ＰＡの物性） 分子量 １１９５．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５３０（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５４８（Ｈ−１、ＧＮ−５′）、２．０２７（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−７′）、２．０３８（ＮＡｃ、ＧＮ−５′） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００６３】（ＸIV−ＰＡの物性） 分子量 １３９５．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５４５（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５５６（Ｈ−１、ＧＮ−７）、２．０４３（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−７′）、２．０６５（ＮＡｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００６４】なお、 ¹Ｈ−ＮＭＲにおける糖残基の番号
は下記式（化１１）のとおりである。

【００６５】

【化１１】

【００６６】本発明の糖鎖構造決定方法を酵素的処理に
よって行う場合は解析対象の糖鎖に対し、通常は途中に
反応停止操作を含む１段階あるいは多段階のグリコシダ
ーゼによる酵素消化を行った後、反応生成物を前出の標
準物質と比較、分析する。

【００６７】解析対象となる糖鎖は前記式（化６）で導
かれるものであればどんなものでもよい。また、前記式
（化６）に合致しないものであっても、酵素的、化学的
処理により前記式（化６）に合致させることができるも
のあれば本発明の方法による解析対象となりえる。例え
ば、Ｇａｌの非還元末端側に、Ｎ−アセチルラクトサミ
ン〔−Ｇａｌ（β１−４）ＧＮ（β１−３）−〕の繰返
し構造をもつ糖鎖が知られているが、これは式（化６）
で表記されないものである。しかし、Ｎ−アセチルラク
トサミンの繰返し構造をもつ糖鎖は、β−ガラクトシダ
ーゼ消化とβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化と
を順番に繰返すことによって、式（化６）に合致させる
ことができる〔Ｔ．オオクラ（Ohkura) ら、ジャーナル
オブバイオロジカル ケミストリー（Journal of Bio
logical Chemistry)、第２５６巻、第８４８５〜８４９
０頁、（１９８１）〕。あるいはまた、例えばエシェリ
ヒア フロインディー（Escherichia freundii) 由来の
エンド−β−ガラクトシダーゼで消化することによって
も式（化６）に合致させることができる。なお、解析対
象の糖鎖は未標識のものでも標識されているものでもよ
い。糖鎖は混合物でもよいが好ましくは８０％以上の純
度であるものがよい。

【００６８】各段階で用いるグリコシダーゼは１種でも
よいし２種以上のグリコシダーゼの混合物でもよい。用
いられるグリコシダーゼは好ましくはエキソグリコシダ
ーゼであるがエンドグリコシダーゼを用いてもよい。反
応温度は特に限定はしないが、通常は２０℃〜５０℃
で、好ましくは３７℃が用いられる。反応時間は特に限
定はしないが、通常１０分〜２０時間で、好ましくは３
〜５時間である。各段階の後に行う反応停止操作は、通
常反応液を８０〜１２０℃にて３分〜１０分間処理しグ
リコシダーゼを失活させることにより行う。こうした失
活操作は、場合によっては必要としない。すなわち、次
の段階の反応の至適温度や気圧、ｐＨ、有機溶媒の濃度
等が前の段階のものとは著しく異なり、それ故、前の段
階に用いたグリコシダーゼが働き得ないことが明らかな
場合や、あるいは抗体ビーズやイオン交換樹脂等で前の
段階に用いたグリコシダーゼを除去した場合などは上述
の熱による失活操作は必ずしも必要ではない。反応生成
物の分析方法は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動、
質量分析、ガスクロマトグラフィーなど特に限定はしな
いが、ＨＰＬＣによる分析が好ましく用いられる。

【００６９】こうした異なる反応系列は一対象につき通
常は１〜６通り行い、各々の反応生成物を分析し、得ら
れた情報が総合して糖鎖構造を決定する。以下に詳しく
説明する。

【００７０】（ｉ）ＧＮの結合位置の決定 糖鎖をβ−ガラクトシダーゼ、シアリダーゼ、α−フコ
シダーゼの混合物で消化すると、Ｇａｌ、ＳＡ、Ｆｕｃ
は糖鎖より除去されるがＧＮは除去されない。したがっ
て、反応生成物はＭ３コアにＧＮのみが結合したものの
いずれかになる。上述の標準物質を用いてこの反応生成
物を同定すれば、元の糖鎖のＧＮ結合位置すなわち式
（化６）における変数ｌ₁ 、ｌ₂ 、ｌ₃ 、ｌ₄ が決定で
きる。なお、ここで用いられるグリコシダーゼは基質特
異性の低いものが好ましく、例えば、タチナタマメのβ
−ガラクトシダーゼ（生化学工業社）、連鎖球菌のβ−
ガラクトシダーゼ（生化学工業社）、アルスロバクター
ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafacience)由
来のシアリダーゼ（ナカライテスク社）、ウシ腎臓のα
−フコシダーゼ（ベーリンガーマンハイム社）等であ
る。

【００７１】（ii）Ｇａｌの結合位置と結合様式の決定 糖鎖をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、シアリダ
ーゼ、α−フコシダーゼの混合物で消化すると、Ｇａｌ
の置換を受けていないＧＮやＦｕｃは糖鎖より除去され
るが、Ｇａｌとその還元末端側のＧＮだけは除去されず
に残る。酵素を除去、あるいは失活させた後、糖鎖を更
にβ−ガラクトシダーゼにて消化しＧａｌを除去する
と、反応生成物はＭ３コアにＧＮが結合したもののいず
れかになる。前述の標準物質を用いてこの反応生成物を
同定すれば、元の糖鎖のＧａｌ結合位置が決定できる。
この反応では、Ｇａｌの結合様式までは決定されない。
すなわち決定されるのは式（化６）の変数ｍ_x はｍ′_X
（Ｘ＝１、２、３、４）のどちらかが１であるかどうか
であり、いいかえれば（ｍ_x ＋ｍ′_x ）が０か１かが決
定される。なお、ここで用いられるグリコシダーゼは基
質特異性の低いものであり、例えば、ウシ腎臓のβ−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼ（ベーリンガーマンハイ
ム社）、タチナタマメのβ−ガラクトシダーゼ、連鎖球
菌のβ−ガラクトシダーゼ、アルスロバクターのシアリ
ダーゼ、ウシ腎臓のα−フコシダーゼ等である。

【００７２】Ｇａｌの結合様式を決定するには、結合特
異的なβ−ガラクトシダーゼを用いて上述と同様の反応
を行う。すなわち、糖鎖をβ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ニダーゼ、シアリダーゼ、α−フコシダーゼとβ−１，
４結合、あるいはβ−１，３結合特異的なβ−ガラクト
シダーゼの混合物で消化する。Ｇａｌの置換を受けてい
ないＧＮやＦｕｃ、及び結合特異的β−ガラクトシダー
ゼによって加水分解されうるＧａｌとその還元末端側の
ＧＮは糖鎖より除去されるが、用いた特異的β−ガラク
トシダーゼで加水分解され得ないＧａｌとその還元末端
側のＧＮだけは除去されずに残る。酵素を除去、あるい
は失活させた後、糖鎖を更に非特異的なβ−ガラクトシ
ダーゼにて消化しＧａｌを除去すると、反応生成物はＭ
３コアにＧＮが結合したものいずれかになる。前述の標
準物質を用いてこの反応生成物を同定すれば、用いた特
異的β−ガラクトシダーゼによって加水分解され得ない
Ｇａｌ結合位置が決定できる。例えば、β−１，４結合
特異的な肺炎球菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（ベーリ
ンガーマンハイム社）を用いた場合、この反応によって
β−１，３結合したＧａｌの結合位置、すなわち式（化
６）における変数ｍ′₁ 、ｍ′₂ 、ｍ′₃ 、ｍ′₄ が決
定できる。先の反応で、ｍ₁ ＋ｍ′₁ 、ｍ₂ ＋ｍ′₂ 、
ｍ₃ ＋ｍ′₃ 、ｍ₄ ＋ｍ′₄ が決定されているので、こ
れらを考え合せると、β−１，４結合したＧａｌの結合
位置、すなわち式（化６）における変数ｍ₁ 、ｍ₂ 、ｍ
₃ 、ｍ₄ を決定できる。

【００７３】（iii)ＳＡの結合位置と結合様式の決定 糖鎖をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、α−フコシダーゼの混合物で消化する
と、ＳＡとその還元末端側のＧａｌ、ＧＮだけは除去さ
れずに残るがその他のＧＮ、Ｇａｌ、Ｆｕｃはすべて除
かれる。酵素を除去、あるいは失活させた後、糖鎖を更
にシアリダーゼ、β−ガラクトシダーゼの混合物にて消
化し、ＳＡ、Ｇａｌを除去すると、Ｍ３コアにＧＮが結
合したもののいずかになる。前述の標準物質を用いてこ
の反応生成物を同定すれば、元の糖鎖のＳＡ結合位置が
決定できる。この反応では、ＳＡの結合様式までは決定
されない。すなわち決定されるのは式（化６）の変数ｎ
_x とｎ′_x （ｘ＝１、２、３、４）のどちらかが１であ
るかどうかであり、いいかえれば（ｎ_x ＋ｎ′_x ）が０
か１かが決定される。なお、ここで用いられるグリコシ
ダーゼは基質特異性の低いものであり、例えば、ウシ腎
臓のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、タチナタマ
メのβ−ガラクトシダーゼ、連鎖球菌のβ−ガラクトシ
ダーゼ、アルスロバクターのシアリダーゼ、ウシ腎臓の
α−フコシダーゼ等である。

【００７４】ＳＡの結合様式を決定するには、結合特異
的なシアリダーゼを用いて上述と同様の反応を行う。す
なわち、糖鎖をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、α−フコシダーゼとα−２，３
結合、あるいはα−２，６結合特異的なシアリダーゼの
混合物で消化する。この反応で、用いた特異的シアリダ
ーゼで加水分解され得ないＳＡとその還元末端側のＧａ
ｌ、ＧＮだけは除去されずに残る。酵素を除去、あるい
は失活させた後、糖鎖を更に非特異的なシアリダーゼ、
β−ガラクトシダーゼにて消化しＳＡ、Ｇａｌを除去す
ると、反応生成物はＭ３コアにＧＮが置換したもののい
ずれかになる。前述の標準物質を用いてこの反応生成物
を同定すれば、用いた特異的シアリダーゼによって加水
分解され得ないＳＡの結合位置が決定できる。例えば、
α−２，３結合特異的なサルモネラ菌由来のα−２，３
シアリダーゼ（宝酒造社）を用いた場合、この反応によ
ってα−２，６結合したＳＡの結合位置、すわなち式
（化６）における変数ｎ₁ 、ｎ₂ 、ｎ₃ 、ｎ₄ が決定で
きる。先の反応で、ｎ₁ ＋ｎ′₁ 、ｎ₂ ＋ｎ′₂ 、ｎ₃
＋ｎ′₃ 、ｎ₄ ＋ｎ′₄ が決定されているので、これら
を考え合せると、α−２，３結合したＳＡの置換位置、
すなわち式（化６）における変数ｎ′₁ 、ｎ′₂ 、ｎ′
₃ 、ｎ′₄ を決定できる。

【００７５】また、ＳＡ以外の構造が既に決定されてい
て、しかもその構造が比較的簡単である場合には、式
（化９）又は（化１０）に示されるオリゴ糖標準物質と
しなくても、以下のようにして構造決定が可能である。
例えば、式（化６）において、ＳＡ以外の構造がｌ₂ ＝
ｌ₄ ＝ｍ₂ ＝ｍ₄ ＝１、残りの変数は０である、いわゆ
る２本鎖糖鎖であることが、既に決定されている糖鎖の
ＳＡの結合位置と結合様式、すなわち、変数ｎ₂ 、ｎ′
₂ 、ｎ₄ 、ｎ′₄ を決定する場合、まず糖鎖をβ−ガラ
クトシダーゼで消化する。次に酵素を除去あるいは失活
させた後、糖鎖を更にシアリダーゼにて消化する。この
反応で生成しうる糖鎖は（ｌ₂ ＝ｌ₄ ＝１、ｍ₂ ＝ｍ₄
＝０）、（ｌ₂ ＝ｌ₄ ＝１、ｍ₂＝０、ｍ₄ ＝１）、
（ｌ₂ ＝ｌ₄ ＝１、ｍ₂ ＝１、ｍ₄ ＝０）、（ｌ₂ ＝ｌ
₄ ＝１、ｍ₂ ＝ｍ₄ ＝１）の４種がある。ＳＡが結合し
ていたＧａｌは除去されずに残るので、これら４種の糖
鎖の標準物質として最終生成物を分離、同定できればＳ
Ａの結合位置を決定できる。更に前述のようにα−２，
３結合特異的なシアリダーゼを用いれば、ＳＡの結合様
式を決定できる。

【００７６】（iv）Ｆｕｃの結合位置の決定 糖鎖をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、シアリダーゼの混合物で消化すると、Ｆ
ｕｃとＦｕｃによって置換されているＧＮだけは除去さ
れずに残るがその他のＧＮ、Ｇａｌ、ＳＡは糖鎖より除
去される。酵素を除去、あるいは失活させた後、糖鎖を
更にα−フコシダーゼにて消化しＦｕｃを除去すると、
反応生成物はＭ３コアにＧＮが結合したもののいずかに
なる。前述の標準物質を用いてこの反応生成物を同定す
れば、元の糖鎖のα−１，３結合したＦｕｃの結合位
置、すなわち式（化６）におけるの変数ｐ₁ 、ｐ₂ 、ｐ
₃ 、ｐ₄ が決定できる。なお、ここで用いられるグリコ
シダーゼは基質特異性の低いものであり、ウシ腎臓のβ
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、タチナタマメのβ
−ガラクトシダーゼ、アルスロバクターのシアリダー
ゼ、ウシ腎臓のα−フコシダーゼ等である。

【００７７】糖鎖の還元末端のＧＮにα−１，６結合し
たＦｕｃの有無すなわち式（化６）における変数ｑはα
−１，３／４結合特異的なα−１，３／４−フコシダー
ゼを用いて決定することができる。糖鎖をβ−Ｎ−アセ
チルグルコサニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、シアリ
ダーセと、例えば放線菌由来のα−１，３／４−フコシ
ダーゼ（宝酒造社）の混合物で消化すると、ＧＮ、Ｇａ
ｌ、ＳＡ、及びα−１，３結合したＦｕｃは除去される
が、α−１，６結合したＦｕｃは除去されないので糖鎖
がα−１，６結合したＦｕｃをもっていなければ、すな
わちｑ＝０ならば、生成物はＭ３コアとなるのでこれに
よってα−１，６結合したＦｕｃの有無を決定できる。

【００７８】また、Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖の
Ｆｕｃには式（化６）で表される結合様式のほかに、Ｇ
ａｌにα−１，２で結合するものもまれに存在する。α
−１，２結合したＦｕｃの位置は、α−１，２結合特異
的なフコシダーゼ、例えばアルスロバクター由来のα−
１，２フコシダーゼ（宝酒造社）を用いた同様の反応に
よって決定することができる。

【００７９】（ｖ）糖鎖構造の決定 構造解析の対象となる糖鎖が式（化６）に合致する構造
であるならば、上述の（ｉ）〜（iv）の結果よりその構
造を一義的に決めることができる。すなわち、上述
（ｉ）によってＧＮの結合位置、すなわち式（化６）に
おける変数ｌ₁ 、ｌ₂ 、ｌ₃ 、ｌ₄ が決定され、上述
（ii）によってＧａｌの結合位置と結合様式、すなわち
式（化６）におけるｍ₁ 、ｍ′₁ 、ｍ₂ 、ｍ′₂ 、ｍ
₃ 、ｍ′₃ 、ｍ₄、ｍ′₄ が決定され、上述（iii)によ
ってＳＡの結合位置と結合様式、すなわち式（化６）に
おける変数ｎ₁ 、ｎ′₁ 、ｎ₂ 、ｎ′₂ 、ｎ₃ 、ｎ′
₃ 、ｎ₄ 、ｎ′₄ が決定され、上述（iv) によってＦｕ
ｃの結合位置、すなわち式（化６）における変数ｑ、ｐ
₁ 、ｐ₂ 、ｐ₃ 、ｐ₄ が決定される。

【００８０】また、本発明の方法の別の態様において
は、存在を決定すべき特定の糖残基について、該糖残基
が存在する枝を酵素的あるいは化学的処理によって除去
することにより、該糖残基が存在する枝と存在しない枝
を区別する。例えば、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼは糖鎖
の非還元末端の２糖Ｇａｌ（β１−３）ＧＮを切り出す
酵素であるが〔Ｍ．サノ（Sano) ら、プロシーディング
ズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８９巻、第８５１２〜
８５１６頁（１９９２）〕、この酵素を用いれば、β−
１，３結合したＧａｌが存在する枝のＧＮのみを選択的
に除去することができる。すなわち、糖鎖をシアリダー
ゼ、フコシダーゼと、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼの混合
物で処理すると、Ｇａｌ（β１−３）ＧＮをもつ枝が選
択的に除去される。続いて、糖鎖をβ−ガラクトシダー
ゼで処理すれば、生成物はＭ３コアにＧＮのみが結合し
たもののうちのいずれかになる。先に述べたＧＮの結合
位置を決定するための反応の生成物には存在していて、
ラクト−Ｎ−ビオシダーゼを用いた上記反応の生成物に
は存在しない枝がＧａｌ（β１−３）ＧＮを含む枝であ
ると決定できる、いいかえれば、β−１，３結合したＧ
ａｌが存在する枝を決定できる。なお、本発明の糖鎖構
造決定方法は下記式（化１２）：

【００８１】

【化１２】

【００８２】（式中、ｚ₁ 、ｚ₂ 、ｚ₃ 、ｚ₄ 、ｚ₅ 、
ｚ₆ は、いずれも水素又はβ−ＧＮを示す）で表される
オリゴ糖を標準物質とすることにより、更に有用性が拡
大する。これは、天然に存在するＮ−アセチルラクトサ
ミン型糖鎖はその多くが式（化６）で表されるものであ
るが、その例外として式（化１２）にて表される構造を
その骨格に、ＧａｌやＳＡ、Ｆｕｃが結合したものも存
在するからである。特に有用な５種のオリゴ糖を表２に
示す。

【００８３】

【表２】 表 ２ ──────────────────────────────────── オリゴ糖 ｚ₁ ｚ₂ ｚ₃ ｚ₄ ｚ₅ ｚ₆ ──────────────────────────────────── ＸVII ： Ｈ β−GN Ｈ β−GN Ｈ β−GN ＸVIII ： Ｈ β−GN β−GN β−GN Ｈ β−GN ＸＩＸ ： β−GN β−GN Ｈ β−GN Ｈ β−GN ＸＸ ： β−GN β−GN β−GN β−GN Ｈ β−GN ＸＸＩ ： β−GN β−GN β−GN β−GN β−GN β−GN ────────────────────────────────────

【００８４】これらのオリゴ糖もオリゴ糖Ｉ〜ＸIVと同
様に、未標識のままあるいは標識して用いることができ
る。なお、本発明の方法においては、処理後の生成物を
標準物質と比較することにより同定するのが代表的な態
様であるが、他の方法、例えばＮＭＲ等によって生成物
の構造を決定することができるならば、それらの方法に
よってもよい。

【００８５】本発明の方法に用いる試薬類をまとめてキ
ット化しておくことにより、糖鎖構造の決定を更に簡便
に行うことができる。キットは式（化１）で表されるオ
リゴ糖の少なくとも１種を含有しておればよいが、式
（化９）又は式（化１０）で表される他のオリゴ糖を含
有してもよい。例えば、Ｉ−ＰＡ〜ＶＩＩＩ−ＰＡを含
有するキットは、Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖のう
ち、式（化６）において、１_１＝１_３＝０、１_２＝１_４
＝１である２本鎖、又は式（化６）において、１_１＝
０、１_２＝１_３＝１_４＝１である３本鎖の糖鎖の分析に
特に有用であり、例えばＩ−ＰＡ〜ＸＶＩ−ＰＡを含有
するキットは広くＮ−アセチルラクトサミン型糖鎖の分
析に有用である。また、キット中にはオリゴ糖のほかに
グリコシダーゼ、分析用のカラム、緩衝液等を含有して
いてもよい。なお、キットに含まれる試薬類は溶液状で
もよく、凍結乾燥物でもよい。

【００８６】

【実施例】以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【００８７】実施例１ 市販のオリゴ糖VIII−ＰＡ（ＰＡ−シュガーチェイン０
１３、宝酒造社）２００ｎｍｏｌを５０ｍＭリン酸−ク
エン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中では肺炎球菌由来のβ−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ベーリンガー社）２
０ｍＵで３７℃にて消化した。反応液の一部をＨＰＬＣ
にて分析し、未分解物が全体の約２５％になった時点で
反応液を１００℃で５分処理して反応を停止させた。次
に該反応液をＨＰＬＣに供し、Ｉ−ＰＡ（２２．４
分）、II−ＰＡ（４２．５分）、III−ＰＡ（２５．２
分）を分取、精製した。なお、ＨＰＬＣの条件は下記に
よった。

【００８８】装置： ＬＣ６Ａ型（島津製作所） カラム： パルパックタイプＲ（４．６ｍｍφ×２５０
ｍｍ）（宝酒造社） 溶離液： ０．０３５％１−ブタノールを含む１００ｍ
Ｍ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ４．０） 検出： 蛍光検出器ＲＦ−５３５（島津製作所）にて励
起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出 流速： １ｍｌ／分 カラム温度： ４０℃ （以下条件１と称す）

【００８９】次に精製した３種のオリゴ糖Ｉ−ＰＡ、II
−ＰＡ、III −ＰＡをＡＰＩ−III質量分析器（パーキ
ンエルマー・サイエンス社）を用いた質量分析、４００
ＭＨｚプロトン核磁気共鳴装置（ブルッカー社）による
ＮＭＲスペクトル分析（重水中）、及び酸加水分解によ
る糖組成分析に供した。

【００９０】各オリゴ糖の物性を以下に示す。更に、図
８及び図９にＩ−ＰＡの、図１０及び図１１にII−ＰＡ
の、図１２及び図１３にIII −ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペ
クトルを示す。なお、 ¹Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値
は、テトラメチルシランを基準としたときの３７℃、重
水中でのアセトンのメチルプロトンの化学シフト値を
２．２１８ｐｐｍとして表した。図９、図１１、図１３
において２．２１８ｐｐｍに見られるシグナルは、内部
基準に用いたアセトンのメチルプロトンのシグナルであ
る。

【００９１】（Ｉ−ＰＡの物性） 分子量 １１９２．７¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５５６（Ｈ−１、ＧＮ−７）、
２．０６７（ＮＡｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：２．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００９２】（II−ＰＡの物性） 分子量 １３９５．４¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５４１（Ｈ−１、ＧＮ−５′）、
４．５５６（Ｈ−１、ＧＮ−７）、２．０４０（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−５′）、２．０６６（ＮＡｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００９３】（ III−ＰＡの物性） 分子量 １３９５．５¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５２７（Ｈ−１、ＧＮ−５）、
４．５１５（Ｈ−１、ＧＮ−７）、２．０４５（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−５）、２．０６７（ＮＡｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【００９４】なお、 ¹Ｈ−ＮＭＲにおける糖残基の番号
は下記式（化１１）のとおりである。

【００９５】

【化１１】

【００９６】実施例２ （１）Ｉ−ＰＡ〜 VIII −ＰＡの分離 実施例１で得たＩ−ＰＡ、II−ＰＡ、 III−ＰＡと、市
販のIV−ＰＡ（ＰＡ−シュガーチェイン０１６、寳酒造
社）、Ｖ−ＰＡ（ＰＡ化標準糖鎖１００．１、中埜酢店
社）、VI−ＰＡ（ＰＡ化標準糖鎖１００．２、中埜酢店
社）、ＶII−ＰＡ（ＰＡ−シュガーチェイン０１２、寳
酒造社）、VIII−ＰＡ（ＰＡ−シュガーチェイン０１
３、寳酒造社）を各１ｐｍｏｌを含む混合液を条件１に
てＨＰＬＣに供した（図１）。８種のＰＡ化オリゴ糖が
分離された。

【００９７】（２）Ｉ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡの分離 ＸVI−ＰＡ（ＰＡ−シュガーチェイン０１４、宝酒造
社）１ｎｍｏｌを５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）中で、比較的特異性のないウシ腎臓由来β−
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ベーリンガー社）１
ｍＵで３７℃にて消化した。反応液の一部をパルパック
タイプＮを用いたＨＰＬＣ〔溶離液：５０ｍＭ酢酸−ト
リエチルアミン（ｐＨ７．３）中、アセトニトリル７０
％（０分）→５０％（３００分）のリニアグラジエン
ト、その他は条件１と同じ（以下、条件２と称する）〕
で分析し、未分解物が全体の約２０％になったところで
反応液を１００℃で５分間処理して反応を停止させ、Ｉ
−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡの混合物を調製した。該混合物を条
件２によるＨＰＬＣに供した。そのチャートを図２に示
す。１３〜１７分に溶出するフラクション１、１８〜２
３分に溶出するフラクション２、２４分〜２９分に溶出
するフラクション３、３２分〜３８分に溶出するフラク
ション４、４２分〜４６分に溶出するフラクション５の
画分に分画した。条件２は糖鎖をその糖残基の数によっ
て分離することができ、市販のIV−ＰＡ、Ｖ−ＰＡ、Ｖ
II−ＰＡ、VIII−ＰＡ、ＸVI−ＰＡの条件２のＨＰＬＣ
による溶出位置との比較により、フラクション１の１
５．４分のピークはＭ３コアにＧＮが全く結合していな
いもの、すなわちIV−ＰＡと同定された。同様にして、
フラクション２はＭ３コアにＧＮが１個結合しているも
の、すなわち、Ｉ−ＰＡ、Ｖ−ＰＡ、VI−ＰＡ、ＸII−
ＰＡの４種の混合物と同定され、フラクション３はＭ３
コアにＧＮが２個結合したもの、すなわちII−ＰＡ、II
I −ＰＡ、VII −ＰＡ、IX−ＰＡ、XIII−ＰＡ、ＸIV−
ＰＡの６種の混合物と同定され、フラクション４はＭ３
コアにＧＮが３個結合したもの、すなわちVIII−ＰＡ、
Ｘ−ＰＡ、ＸＩ−ＰＡ、ＸＶ−ＰＡの４種の混合物と同
定され、フラクション５の４４．０分のピークはＭ３コ
アにＧＮが４個結合したもの、すなわちＸVI−ＰＡと同
定された。

【００９８】フラクション１の１５．４分のピーク（IV
−ＰＡ）及びフラクション５の４４．０分のピーク（Ｘ
VI−ＰＡ）は、パルパックタイプＲを用いたＨＰＬＣ
〔溶離液：０．０７％１−ブタノールを含む酢酸−トリ
エチルアミン（ｐＨ４．０）、その他は条件１と同じ
（以下、条件３と称す）〕に供した場合でもそれぞれ１
２．０分、１５．７分の単一ピークを示した。

【００９９】フラクション２を、条件３のＨＰＬＣに供
すると、VI−ＰＡが１１．２分に、ＸII−ＰＡが１２．
８分に、Ｉ−ＰＡが１５．２分に、Ｖ−ＰＡが２０．７
分に溶出された。このパターンを図３に示す。フラクシ
ョン３を条件１のＨＰＬＣに供すると、XIII−ＰＡが１
５．０分に、IX−ＰＡが１６．８分に、 III−ＰＡが２
５．２分に、ＸIV−ＰＡが２５．９分に、ＶII−ＰＡが
２６．７分に、II−ＰＡが４２．５分に溶出された。こ
のパターンを図５に示す。フラクション４を、条件３の
ＨＰＬＣに供すると、XV−ＰＡが１０．４分に、Ｘ−Ｐ
Ａが１３．３分に、XI−ＰＡが１７．６分に、VIII−Ｐ
Ａが２５．９分に溶出された。このパターンを図４に示
す。以上のようにして、Ｉ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡの１６種
のＰＡ化オリゴ糖を分離することができた。

【０１００】なお、各ピークの同定は以下のようにして
行った。まず実施例１で得られたＩ−ＰＡ、II−ＰＡ、
III−ＰＡ、及び市販のIV−ＰＡ、Ｖ−ＰＡ、VI−Ｐ
Ａ、ＶII−ＰＡ、VIII−ＰＡ、ＸVI−ＰＡを標準物質と
し、そのピークの溶出位置を比較することにより、図２
の１５．４分のピークをIV−ＰＡと、図２の４４．０分
のピークをＸVI−ＰＡと、図３の１１．２分のピークを
VI−ＰＡと、図３の１５．２分のピークをＩ−ＰＡと、
図３の２０．７分のピークをＶ−ＰＡと、図４の２５．
９分のピークをVIII−ＰＡと、図５の２５．２分のピー
クをIII −ＰＡと、図５の２６．７分のピークを VII−
ＰＡと、図５の４２．５分のピークをII−ＰＡと同定し
た。また、図３の１２．８分のピークに関しては、分取
した後にウシ腎臓由来のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼで処理するとＭ３コアになること、出発物質がＸ
VI−ＰＡであること、及び他の３種が別の位置に溶出す
ることからＸII−ＰＡと同定した。

【０１０１】残り６種のピークに関しては、それぞれを
分取して以下の方法で同定した。なお、図５の２５．９
分のピークについては、フラクション３の一部をβ−
１，２結合特異的な肺炎球菌由来β−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼで完全消化して条件１のＨＰＬＣに供す
ると２５．２分（ III−ＰＡ）と２６．７分（ＶII−Ｐ
Ａ）のピークが消失し（加水分解されてそれぞれＩ−Ｐ
Ａ、IV−ＰＡが生成する。）２５．９分のピークのみが
加水分解されずに残るので（図６）、この２５．９分の
ピークを分取した。

【０１０２】分取したそれぞれのピークをウシ腎臓由来
のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで部分消化し、
条件２のＨＰＬＣに供し、Ｍ３コアにＧＮが１個結合し
た画分を分取した。次に、分取した画分を条件３のＨＰ
ＬＣに供し分析した。その結果、図４の１０．５分のピ
ークからＶ−ＰＡ、VI−ＰＡ、及びＸII−ＰＡが検出さ
れたので、該ピークをＸＶ−ＰＡと同定した。同様に、
図４の１３．３分のピークからＩ−ＰＡ、Ｖ−ＰＡ、及
びＸII−ＰＡが検出されたので、該ピークをＸ−ＰＡと
同定した。同様に、図４の１７．６分のピークからＩ−
ＰＡ、VI−ＰＡ、及びＸII−ＰＡが検出され、該ピーク
をＸＩ−ＰＡと同定した。同様に、図５の１５．０分の
ピークからＶ−ＰＡ及びＸII−ＰＡが検出されたので、
該ピークをXIII−ＰＡと同定した。同様に、図５の１
６．８分のピークからVI−ＰＡ及びＸII−ＰＡが検出さ
れたので、該ピークをIX−ＰＡと同定した。同様に、図
６の２５．９分のピークからＩ−ＰＡ及びＸII−ＰＡが
検出されたので、該ピークをＸIV−ＰＡと同定した。

【０１０３】実施例３ （１）４本鎖アシアロ糖鎖のＰＡ化物ＸVI−ＰＡ（ＰＡ
−シュガーチェイン００４、宝酒造社製）８５０ｎｍｏ
ｌに、２．５μｍｏｌのＣＭＰ−シアル酸（シチジン
５′−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＣＭＰ
−ＮＡＮＡ、シグマ社）を加え、０．５％トリトンＣＦ
−５４含有の１２．５ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ６．
８）中で、０．１Ｕのラット肝臓由来の２，６シアリル
トランスフェラーゼ（ペーリンガーマンハイム社）と３
７℃にて３６時間反応させた。途中、１６時間、２４時
間の時点で、反応液にＣＭＰ−ＮＡＮＡを２．５μｍｏ
ｌずつ添加した。次に、反応液を、セファデックスＧ−
１５カラムにかけて脱塩したのち、糖鎖画分をモノＱカ
ラム（ファルマシア社）にかけて、１０ｍＭから１００
ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ８．５）のグラジェント
で溶出した。溶出画分のうち、糖鎖１ｍｏｌ当り３ｍｏ
ｌのシアル酸を含む画分を回収した。回収したシアリル
糖鎖は６４６ｎｍｏｌであった。回収したシアリル糖鎖
５００ｎｍｏｌを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中
で、４．７ｍＵの牛肝臓由来カタラーゼ（シグマ社）の
存在下、１００Ｕのダクチリウム デンドロイデス（Da
ctylium dendoroides)由来のガラクトースオキシダーゼ
（宝酒造社）にて３７℃、２時間反応させた。反応液
を、沸騰水浴中で１０分間処理し、次いで１Ｕのシアリ
ダーゼ（アルスロバクター ウレアファシエンス由来、
極東製薬社）を加え、３７℃にて２時間消化し、更に２
５０Ｕのβ−ガラクトシダーゼ（麹カビ由来、東洋紡
社）を加え、３７℃で５．５時間反応を続けた。次に、
５Ｎの水酸化ナトリウムにて反応液のｐＨを約１１にし
たのち、２０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ
₄ ）を加え、室温で３０分間放置した。更に３０ｍｇの
水素化ホウ素ナトリウムを加え、室温で３０分放置し還
元反応を完了させた。還元反応液をセファデックスＧ−
１５カラムにかけて脱塩をしたのち、パルパックタイプ
Ｒカラムにかけた。溶出は０．１％ブタノール、０．０
５％トリフルオロ酢酸にて行い、３０分に溶出するメイ
ンピークを回収した。得られた糖鎖は、ＸVI−ＰＡのα
−Ｍａｎにβ−１，６結合したＧＮがＧａｌによって保
護されているものであり、回収量は３００ｎｍｏｌであ
った。

【０１０４】得られた保護糖鎖のうち２５０ｎｍｏｌを
５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５）、５０ｍＭ Ｄ−
（＋）−ガラクトノ−１，４−ラクトン〔Ｄ−（＋）−
galactono −１，４−lactone 、ナカライテスク社〕
中、２．５Ｕの牛腎臓由来Ｎ−アセチルグルコサミニダ
ーゼ（ベーリンガー社）で消化した。３．５時間反応さ
せた後、反応液を沸騰水浴中で１０分間処理し反応を停
止した。反応液をセファデックスＧ−１５カラムにか
け、脱塩したのち、下記条件ＨＰＬＣにて、Ｍ３コアに
結合しているＧＮの数によって、画分Ａ（ＧＮが１つ結
合している）、画分Ｂ（ＧＮが２つ結合している）、画
分Ｃ（ＧＮが３つ結合している）を得た。ＨＰＬＣのパ
ターンを図２１に示す。

【０１０５】ＨＰＬＣ条件 装置： ＬＣ６Ａ型（島津製作所） カラム： アサヒパック（Asahi PAK)ＮＨ２Ｐ−５０
（６ｍｍφ×１５０ｍｍ）（旭化成社） 溶離液Ａ： ７５％アセトニトリル含有５０ｍＭ酢酸−
トリエチルアミン（ｐＨ７．３） 溶離液Ｂ： ５０％アセトニトリル含有５０ｍＭ酢酸−
トリエチルアミン（ｐＨ７．３） 溶出： １００分でＢ液を１０％から２５％に上げるグ
ラジェント溶出 検出： 蛍光検出器ＲＦ−５３５（島津製作所）にて励
起波長３１５ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出 流速： １ｍｌ／分 カラム温度： ４０℃

【０１０６】それぞれの画分を７．５Ｕの麹カビ由来の
β−ガラクトシダーゼ（東洋紡社）にて３７℃で１５時
間消化した。沸騰水浴中で１０分間処理し、反応を停止
したのち、下記条件ＨＰＬＣにて、画分Ａの反応物から
ＸII−ＰＡ（２３．６分）を、画分Ｂの反応物からＸII
I −ＰＡ（１９．４分）、IX−ＰＡ（２１．４分）、Ｘ
IV−ＰＡ（３１．３分）を、画分Ｃの反応物からＸＶ−
ＰＡ（１８．９分）、Ｘ−ＰＡ（２５．４分）、ＸＩ−
ＰＡ（３３．４分）をそれぞれ分取した。

【０１０７】

【０１０８】次に、精製したオリゴ糖のうち、IX−Ｐ
Ａ、Ｘ−ＰＡ、ＸＩ−ＰＡ、ＸII−ＰＡ、ＸIII −Ｐ
Ａ、ＸIV−ＰＡをＡＰＩ−III 質量分析器（パーキンエ
ルマー・サイエクス社）を用いた質量分析、５００ＭＨ
ｚプロトン核磁気共鳴装置（日本電子社）（Ｘ−ＰＡの
み前出のブルッカー社）によるＮＭＲスペクトル分析
（重水中）、及び酸加水分解による糖組成分析に供し
た。

【０１０９】各オリゴ糖の物性を以下に示す。更に、図
１４にIX−ＰＡの、図１５及び図１６にＸ−ＰＡの、図
１７にＸＩ−ＰＡの、図１８にＸII−ＰＡの、図１９に
ＸIII −ＰＡの、図２０にＸIV−ＰＡのプロトン核磁気
共鳴（ ¹Ｈ−ＮＭＲ）のスペクトルを示す。なお、実施
例１と同様に、 ¹Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値は、テト
ラメチルシランを基準としたときの３７℃、重水中での
アセトンのメチルプロトンの化学シフト値を２．２１８
ｐｐｍとして表した。図１４、１５、１７〜２０におい
て２．２１８ｐｐｍに見られるシグナルは、内部基準に
用いたアセトンのメチルプロトンのシグナルである。ま
た、 ¹Ｈ−ＮＭＲにおける糖残基の番号は式（化１１）
のとおりである。

【０１１０】（IX−ＰＡの物性） 分子量 １３９５．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５５２（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５３５（Ｈ−１、ＧＮ−５）、２．０４６（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−７′）、２．０４６（ＮＡｃ、ＧＮ−５ ） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【０１１１】（Ｘ−ＰＡの物性） 分子量 １５９９．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５２８（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５４９（Ｈ−１、ＧＮ−５′）、４．５５７（Ｈ−
１、ＧＮ−７）、２．０２８（ＮＡｃ、ＧＮ−７′）、
２．０３８（ＮＡｃ、ＧＮ−５′）、２．０６７（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：４．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【０１１２】（ＸＩ−ＰＡの物性） 分子量 １５９８．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５４６（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５１５（Ｈ−１、ＧＮ−７）、４．５２９（Ｈ−
１、ＧＮ−５）、２．０４５（ＮＡｃ、ＧＮ−７′）、
２．０６５（（ＮＡｃ、ＧＮ−７）、２．０４５（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−５） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：４．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【０１１３】（ＸII−ＰＡの物性） 分子量 １１９１．５（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５４２（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
２．０４３（ＮＡｃ、ＧＮ−７′） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：２．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【０１１４】（ＸIII −ＰＡの物性） 分子量 １３９５．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５３０（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５４８（Ｈ−１、ＧＮ−５′）、２．０２７（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−７′）、２．０３８（ＮＡｃ、ＧＮ−５′） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【０１１５】（ＸIV−ＰＡの物性） 分子量 １３９５．０（質量分析による）¹ Ｈ−ＮＭＲ ４．５４５（Ｈ−１、ＧＮ−７′）、
４．５５６（Ｈ−１、ＧＮ−７）、２．０４３（ＮＡ
ｃ、ＧＮ−７′）、２．０６５（ＮＡｃ、ＧＮ−７） 糖組成 Ｍａｎ：ＧＮ＝３．０：３．５、Ｇａ
ｌとＦｕｃは無し。

【０１１６】（２）Ｉ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡの２次元マッ
プ Ｉ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡの１６種のオリゴ糖を各５００ｆ
ｍｏｌずつ含むサンプルを条件２及びパルパックタイプ
Ｒを用いたＨＰＬＣ〔溶離液：０．０２％ １−ブタノ
ールを含む１００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ
４．０）、その他は条件１と同じ（以下、条件４と称
す）〕に供し、それぞれの条件でのオリゴ糖の溶出パタ
ーンとそれぞれの溶出位置を２次元的にプロットした２
次元マップを作成した。図７にその図を示す。図中、縦
軸は条件４によるＨＰＬＣのチャートと溶出時間を示
し、横軸は条件２によるＨＰＬＣのチャートと溶出時間
を示し、黒丸はそれぞれのオリゴ糖の溶出位置を示す。

【０１１７】実施例４ Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖の構造決定を行うため
のキット１及びキット２を作製した（表３、表４）。な
お、キットに含有されたオリゴ糖IV−ＰＡ、及び VII−
ＰＡ、VIII−ＰＡ、ＸVI−ＰＡは前出の寳酒造社製のも
のを用いた。オリゴ糖Ｖ−ＰＡ及びVI−ＰＡは前出の中
埜酢店製のものを用いた。オリゴ糖IX−ＰＡ〜ＸＶ−Ｐ
Ａは実施例３に記載の方法、又はオリゴ糖ＸVI−ＰＡを
ウシ腎臓由来のＮ−アセチルグルコサミニダーゼによっ
て部分加水分解したものより実施例２−（２）に記載の
方法でＨＰＬＣにて精製した。

【０１１８】

【表３】 表 ３ キット１の内容（１００回分） 試 薬 内容量（ml） ──────────────────────────────────── １液：オリゴ糖Ｉ−ＰＡ〜VIII−ＰＡの混合溶液 ０．１ （各１pmol／μｌ） ２液：２５０mM クエン酸緩衝液（ｐＨ 5.0 ) ０．４ ３液：５０U/ml アルスロバクター ウレアファシエンス ０．５ 由来シアリダーゼ ４液：１５U/ml サルモネラ菌由来α−2,３シアリダーゼ ０．５ ５液：５U/ml 肺炎球菌由来β−ガラクトシダーゼ ０．５ ６液：５U/ml 直鎖球菌由来β−ガラクトシダーゼ ０．５ ７液：１００U/ml ウシ腎臓由来β−Ｎ−アセチル ０．５ グルコサミニダーゼ ８液：１０U/ml ウシ腎臓由来α−フコシダーゼ ０．５ ９液：１U/ml 放線菌由来α−1,３／４フコシダーゼ ０．５ 10液：0.035% １−ブタノール含有１００mM酢酸−トリエチル １０００ アミン（ｐＨ 4.0 ) ────────────────────────────────────

【０１１９】 ──────────────────────────────────── 付 属 品 内容量 ──────────────────────────────────── カラム１：パルパックタイプＲ（寳酒造製） １本 （４．６mmφ×２５０mm） ────────────────────────────────────

【０１２０】

【表４】 表 ４ キット２の内容（１００回分） 試 薬 内容量（ml） ──────────────────────────────────── １液：オリゴ糖Ｉ−ＰＡ〜 XVI−ＰＡの混合溶液 ０．１ （各１pmol／μｌ） ２液：２５０mM クエン酸緩衝液（ｐＨ 5.0 ) ０．４ ３液：５０U/ml アルスロバクター ウレアファシエンス ０．５ 由来シアリダーゼ ４液：１５U/ml サルモネラ菌由来α−2,３シアリダーゼ ０．５ ５液：５U/ml 肺炎球菌由来β−ガラクトシダーゼ ０．５ ６液：５U/ml 直鎖球菌由来 β−ガラクトシダーゼ ０．５ ７液：１００U/ml ウシ腎臓由来β−Ｎ−アセチル ０．５ グルコサミニダーゼ ８液：１０U/ml ウシ腎臓由来α−フコシダーゼ ０．５ ９液：１U/ml 放線菌由来α−1,３／４フコシダーゼ ０．５ 10液：0.035% １−ブタノール含有１００mM酢酸−トリエチル １０００ アミン（ｐＨ 4.0 ) 11液：0.07％ １−ブタノール含有１００mM酢酸−トリエチル １０００ アミン（ｐＨ 4.0 ) 12−Ａ液：７５％ アセトニトリル含有５０mM酢酸−トリエチル １０００ アミン（ｐＨ 7.3 ) 12−Ｂ液：５０％ アセトニトリル含有５０mM酢酸−トリエチル １０００ アミン（ｐＨ 7.3 ) ────────────────────────────────────

【０１２１】 ──────────────────────────────────── 付 属 品 内 容 量 ──────────────────────────────────── カラム１：パルパックタイプＲ（４．６mmφ×２５０mm） １本 カラム２：パルパックタイプＮ（４．６mmφ×２５０mm） １本 ────────────────────────────────────

【０１２２】実施例５ ウシフェツインは分子量約４８０００の糖タンパク質で
その重量の約２２％が糖鎖で構成されている。フェツイ
ンの糖鎖の構造は従来より詳細に解析されており糖タン
パク質糖鎖の研究には格好の材料である。フェツインの
主要なアスパラギン結合型糖鎖の構造は、表５のXXIIと
XXIII に示されるものにＳＡが０〜５個結合した構造を
している。ＳＡの結合している数、位置、結合様式によ
り、フェツインの糖鎖は非常に多様な構造を有している
がその多くが式（化６）で表される構造であるため本発
明のキットを用いて解析が可能であった。

【０１２３】（１）ウシフェツイン糖鎖の調製 ウシフェツイン（寳酒造社）１ｇをヒドラジン分解、Ｎ
−アセチル化し、遊離の糖鎖画分を得た。得られた糖鎖
画分をＰＡ化し、セファデックスＧ１５カラム（ファル
マシア社）にて余剰の試薬等を除去し、ＰＡ化糖鎖を得
た。該ＰＡ化糖鎖を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカ
ラム（１８ｍｍφ×２５０ｍｍ、東ソー社）に供し、Ｎ
ａＣｌの塩濃度０〜１００ｍＭのグラジェントで溶出し
た。これにより、ＰＡ化糖鎖は１分子にＳａが０〜４個
結合した５つの画分に分離された。このうち、ＳＡが１
個結合した画分を２個結合した画分を分取し、その１／
１００量をそれぞれ逆相カラムコスモシル（Cosmosil)
５Ｃ₁₈ＡＲ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライテス
ク社）を用いたＨＰＬＣ〔溶離液：０．１５％１−ブタ
ノール含有５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．
０）〕に供した。ＳＡが１個結合している画分から４０
分のピークを、ＳＡが２個結合した画分から３８分、４
８分、７２分のピークを分取し、更にアサヒパックＮＨ
₂ Ｐ５０を用いたＨＰＬＣによって精製した。ＳＡが２
個で４８分の画分の糖鎖をＡ、ＳＡが２個で３８分の画
分の糖鎖をＢ、ＳＡが１個で４０分の画分の糖鎖をＣ、
ＳＡが２個で７２分の画分の糖鎖をＤと命名した。各糖
鎖を蒸留水１００μｌに溶かし、サンプルとした。

【０１２４】（２）Ａの糖鎖構造決定 実施例４のキット１を用いて以下の操作を行った。 （反応１） サンプル５μｌに２液４μｌ、３液４μ
ｌ、５液４μｌと蒸留水３μｌを加え、３７℃にて５時
間反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、
２μｌを条件１のＨＰＬＣにて分析した。 （反応２） サンプル５μｌに２液４μｌ、５液４μ
ｌ、７液４μｌと蒸留水３μｌを加え、３７℃にて５時
間反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、
３液を２μｌ、５液を２μｌ添加し更に５時間反応させ
た。反応液を１００℃で１０分処理した後、２μｌを同
様にＨＰＬＣにて分析した。 （反応３） サンプル５μｌに２液４μｌ、４液４μ
ｌ、５液４μｌ、７液４μｌを加え、３７℃にて５時間
反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、３
液を２μｌ、５液を２μｌ添加し更に５時間反応させ
た。反応液を１００℃で１０分処理した後、２μｌを同
様にＨＰＬＣにて分析した。

【０１２５】結果：反応１の反応液を分析すると、生成
物はその溶出時間よりVIII−ＰＡであった。糖鎖ＡのＧ
ａｌはβ−１，４結合特異的なβ−ガラクトシダーゼす
なわち反応１で用いた５液によってすべて除去されたこ
とになる。つまり糖鎖ＡのＧａｌの結合はすべてβ−
１，４であった。したがって糖鎖Ａは式（化６）におい
てｌ₁ ＝ｍ₁ ＝ｍ′₁ ＝ｍ′₂ ＝ｍ′₃ ＝ｍ′₄ ＝ｑ＝
ｐ₁ ＝ｐ₂ ＝ｐ₃ ＝ｐ₄＝０、ｌ₂ ＝ｌ₃ ＝ｌ₄ ＝ｍ₂
＝ｍ₃ ＝ｍ₄ ＝１と決定された。次に、反応２の反応液
を分析したところ、生成物はその溶出時間より III−Ｐ
Ａであった。したがって、糖鎖Ａは表５のXXIIのＰＡ化
物（XXII−ＰＡ）のα−１，３結合で分岐したＭａｎの
側の２つのＧａｌにＳＡを有している。すなわち式（化
６）において、ｎ₁ ＝ｎ₂ ＝ｎ′₁ ＝ｎ′₂ ＝０、ｎ₃
＋ｎ′₃ ＝ｎ₄ ＋ｎ′₄ ＝１と決定された。次に、反応
３の反応液を分析したところ、生成物はその溶出時間よ
りVI−ＰＡが約８０％で III−ＰＡが約２０％であっ
た。したがって、糖鎖ＡはXXII−ＰＡのα−１，３結合
で分岐しているＭａｎの側の２個のＧａｌの両方にα−
２，６結合したＳＡを有しているもの、すなわちｎ₃ ＝
１、ｎ₄ ＝１であるものが約２０％でＧＮ（β１−２）
Ｍａｎ（α１−３）のＧＮに結合しているＧａｌにα−
２，６結合したＳＡを有しているもの、すなわちｎ₃ ＝
０、ｎ₄ ＝１であるものが約８０％であると決定され
た。これらを結合すると、Ａは表５のXXIVに示す構造の
もののＰＡ化物と、 XXVで表される構造のもののＰＡ化
物とが約４対１の比である混合物と決定された。

【０１２６】（３）Ｂの糖鎖構造決定 実施例４のキット１を用いて以下の操作を行った。 （反応１） サンプル５μｌに２液４μｌ、３液４μ
ｌ、５液４μｌと蒸留水３μｌを加え、３７℃にて５時
間反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、
２μｌを（２）と同様にＨＰＬＣにて分析した。 （反応２） サンプル５μｌに２液４μｌ、５液４μ
ｌ、７液４μｌと蒸留水３μｌを加え、３７℃にて５時
間反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、
３液を２μｌ、５液を２μｌ添加し更に５時間反応させ
た。反応液を１００℃で１０分処理した後、２μｌを同
様にＨＰＬＣにて分析した。 （反応３） サンプル５μｌに２液４μｌ、４液４μ
ｌ、５液４μｌ、７液４μｌを加え、３７℃にて５時間
反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、３
液を２μｌ、５液を２μｌ添加し更に５時間反応させ
た。反応液を１００℃で１０分処理した後、２μｌを同
様にＨＰＬＣにて分析した。

【０１２７】結果：反応１の反応液を分析すると、生成
物はその溶出時間よりＶII−ＰＡであった。したがって
糖鎖Ｂは式（化６）においてｌ₁ ＝ｌ₃ ＝ｍ₁ ＝ｍ₃ ＝
ｍ′₁ ＝ｍ′₃ ＝ｑ＝ｐ₁ ＝ｐ₂ ＝ｐ₃ ＝ｐ₄ ＝０、ｌ
₂ ＝ｌ₄ ＝ｍ₂ ＝ｍ₄ ＝１であると決定された。次に、
反応２の反応液を分析したところ、生成物はその溶出時
間よりＶII−ＰＡであった。したがって、糖鎖Ｂは表５
のXXIII のＰＡ化物（XXIII −ＰＡ）の両方のＧａｌに
ＳＡを有している。すなわち式（化６）においてｎ₂ ＋
ｎ′₂ ＝ｎ₄ ＋ｎ′₄ ＝１であると決定された。次に、
反応３の反応液を分析したところ、生成物はその溶出時
間よりVI−ＰＡであった。したがって、糖鎖ＢはXXIII
−ＰＡの２個のＧａｌのうちα−１，３結合で分岐して
いるＭａｎの側のＧａｌにα−２，６結合したＳＡを有
している、すなわちｎ₂ ＝０、ｎ₄ ＝１と決定された。
これらを結合すると、Ｂは表５のXXVIに示す構造の糖鎖
のＰＡ化物であると決定された。

【０１２８】（４）Ｃの糖鎖構造決定 実施例４のキット１を用いて以下の操作を行った。 （反応１） サンプル５μｌに２液４μｌ、３液４μ
ｌ、５液４μｌと蒸留水３μｌを加え、３７℃にて５時
間反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、
２μｌを（２）と同様にＨＰＬＣにて分析した。 （反応２） サンプル５μｌに２液４μｌ、５液４μ
ｌ、７液４μｌと蒸留水３μｌを加え、３７℃にて５時
間反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、
３液を２μｌ、５液を２μｌ添加し更に５時間反応させ
た。反応液を１００℃で１０分処理した後、２μｌを同
様にＨＰＬＣにて分析した。 （反応３） サンプル５μｌに２液４μｌ、４液４μ
ｌ、５液４μｌ、７液４μｌを加え、３７℃にて５時間
反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、３
液を２μｌ、５液を２μｌ添加し更に５時間反応させ
た。反応液を１００℃で１０分処理した後、２μｌを同
様にＨＰＬＣにて分析した。

【０１２９】結果：反応１の反応液を分析すると、生成
物はその溶出時間よりVIII−ＰＡであった。したがって
糖鎖Ｃは式（化６）においてｌ₁ ＝ｍ₁ ＝ｍ′₁ ＝ｍ′
₂ ＝ｍ′₃ ＝ｍ′₄ ＝ｑ＝ｐ₁ ＝ｐ₂ ＝ｐ₃ ＝ｐ₄ ＝
０、ｌ₂ ＝ｌ₃ ＝ｌ₄ ＝ｍ₂ ＝ｍ₃ ＝ｍ₄ ＝１と決定さ
れた。次に、反応２の反応液を分析したところ、生成物
はその溶出時間よりＩ−ＰＡ約５０％とＶ−ＰＡが約５
０％であった。したがって、糖鎖ＣはXXII−ＰＡのＧＮ
（β１−４）Ｍａｎ（α１−３）のＧＮに結合している
ＧａｌにＳＡが置換したもの、すなわち式（化６）にお
いてｎ₂ ＝ｎ₄ ＝ｎ′₂ ＝ｎ′₄ ＝０、ｎ₃ ＋ｎ′₃ ＝
１であるものと、ＧＮ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）
のＧＮに結合しているＧａｌにＳＡが結合しているも
の、すなわち式（化６）においてｎ₃ ＝ｎ₄ ＝ｎ′₃ ＝
ｎ′₄ ＝０、ｎ₂ ＋ｎ′₂ ＝１であるものとのほぼ１対
１の混合物であると決定された。次に、反応３の反応液
を分析したところ、生成物はその溶出時間よりIV−ＰＡ
であった。したがって、糖鎖Ｃは２，６結合したＳＡを
有しておらず、したがって、糖鎖ＣのＳＡはすべてα−
２，３結合で置換している、すなわち式（化６）におい
て、ｎ′₂ ＝１あるいはｎ′₃ ＝１であると決定され
た。これらを総合すると、精製糖鎖Ｃは表５のXXVII に
示す構造のもののＰＡ化物と、XXVIIIで表される構造の
もののＰＡ化物とのほぼ１対１の混合物であると決定で
きた。

【０１３０】（５）Ｄの糖鎖構造決定 実施例４のキット１を用いて以下の操作を行った。 （反応１） サンプル５μｌに２液４μｌ、３液４μ
ｌ、５液４μｌと蒸留水３μｌを加え、３７℃にて５時
間反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、
２μｌを（２）と同様にＨＰＬＣにて分析した。 （反応２） サンプル５μｌに２液４μｌ、５液４μ
ｌ、７液４μｌと蒸留水３μｌを加え、３７℃にて５時
間反応させた。反応液を１００℃で１０分処理した後、
３液を２μｌ、５液を２μｌ添加し更に５時間反応させ
た。反応液を１００℃で１０分処理した後、２μｌを同
様にＨＰＬＣにて分析した。

【０１３１】結果：反応１の反応液を分析すると、生成
物はその溶出時間よりVIII−ＰＡであった。したがって
糖鎖Ｄは式（化６）においてｌ₁ ＝ｍ₁ ＝ｍ′₁ ＝ｍ′
₂ ＝ｍ′₃ ＝ｍ′₄ ＝ｑ＝ｐ₁ ＝ｐ₂ ＝ｐ₃ ＝ｐ₄ ＝
０、ｌ₂ ＝ｌ₃ ＝ｌ₄ ＝ｍ₂ ＝ｍ₃ ＝ｍ₄ ＝１と決定さ
れた。次に、反応２の反応液を分析したところ、生成物
はその溶出時間よりII−ＰＡであった。したがって、Ｄ
はXXII−ＰＡのα−１，３結合で分岐したＭａｎにβ−
１，２置換したＧＮに結合しているＧａｌと、α−１，
６結合で分岐したＭａｎにβ−１，２置換しているＧＮ
に結合しているＧａｌはにＳＡを有している、すなわち
式（化６）においてｎ₂ ＋ｎ′₂ ＝ｎ₃ ＋ｎ′₃ ＝１で
あると決定された。したがってＤは表５のXXIXの構造の
糖鎖のＰＡ化物であると決定された。なお、オリゴ糖XX
II〜XXIXは式（化６）において変数ｌ_x 、ｍ_x 、
ｍ′_x 、ｎ_x 、ｎ′_x 、ｑ、ｐ_X （ｘ＝１、２、３、
４）について下表の条件を満たすものである。

【０１３２】

【表５】

【０１３３】（１）は２つの変数のうちどちらか一方が
１でもう一方が０であることを示す。

【０１３４】実施例６ α₁ −アシッドグリコプロテインの糖鎖構造決定 α₁ −アシッドグリコプロテイン（シグマ社）１ｍｇを
ヒドラジン分解、Ｎ−アセチル化し、遊離の糖鎖画分を
得た。得られた糖鎖画分を、０．１Ｎ塩酸で１時間処理
し、ＳＡを除去した。処理した糖鎖画分を、バイオゲル
Ｐ−４（バイオラッド社）カラム（２５ｍｍφ×９０ｃ
ｍ×２本）にインジェクトし、水にて溶出した。重合度
が２１のイソマルトオリゴ糖とほぼ同じ時間に溶出する
ピークを分取し、凍結乾燥後ＰＡ化した。更に、ＰＡ化
したオリゴ糖をパルパックタイプＲを用いたＨＰＬＣに
て精製し、糖鎖Ｅを得た。糖鎖Ｅの５０ｐｍｏｌを５ｍ
Ｕのエシェリヒア フロインディー由来のエンド−β−
ガラクトシダーゼ（生化学工業社）で３７℃にて２時間
処理した。生成物の一部を、アナリティカル バイオケ
ミストリー、第１７１巻、第７３〜９０頁（１９８８）
に記載のアミドシリカ（東ソー社）を用いたＨＰＬＣに
て分析したところ、糖鎖Ｅよりも約２．５グルコースユ
ニット相当早く溶出した。該生成物を糖鎖Ｆと命名し
た。この結果より、糖鎖Ｅは式（化６）において、ｍ₁
＝ｍ₂ ＝ｍ₃ ＝ｍ₄ ＝ｌ₁＝１₂ ＝ｌ₃ ＝ｌ₄ ＝１、残
りの変数は０のいわゆる４本鎖糖鎖の枝のいずれかに、
Ｎ−アセチルラクトサミン〔−Ｇａｌ（β１−４）ＧＮ
（β１−３）−〕が付加したものであり、エンド−β−
ガラクトシダーゼによって３糖Ｇａｌ（β１−４）ＧＮ
（β１−３）Ｇａｌが遊離し、糖鎖Ｆになったものと推
定された。

【０１３５】続いて、Ｎ−アセチルラクトサミンの付加
した枝を実施例４のキット２を用いて決定した。 （反応１） 糖鎖Ｆ、５μｌ（１０ｐｍｏｌ）に、２液
４μｌ、５液２μｌと蒸留水９μｌを加え、３７℃にて
２時間反応させた。反応液を１００℃で１０分間処理し
た後、２μｌずつを、条件２と条件４によるＨＰＬＣに
て分析した。 （反応２） 糖鎖Ｆ、５μｌ（１０ｐｍｏｌ）に、２液
４μｌ、７液４μｌと蒸留水７μｌを加え、３７℃にて
２時間反応させた。反応液を１００℃で１０分間処理し
た後、５液を２μｌ添加し、更に２時間反応させた。反
応液を１００℃で１０分間処理した後、２μｌずつを条
件２と条件４によるＨＰＬＣにて分析した。

【０１３６】（結果） 反応１の生成物は、２次元マッ
プにより標準物質Ｉ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡと比較、同定し
たところ、ＸVI−ＰＡと同定された。したがって、糖鎖
Ｆは、式（化６）において、ｌ₁ ＝ｌ₂ ＝ｌ₃ ＝ｌ₄ ＝
１であると決定された。同様にして、反応２の生成物
は、２次元マップによりXI−ＰＡと同定された。したが
って、糖鎖Ｆは、式（化６）において、ｍ₁ ＝ｍ₃ ＝ｍ
₄ ＝１、ｍ₂ ＝０であると決定された。以上より、糖鎖
Ｆは、式（化６）において、ｌ₁ ＝ｌ₂ ＝ｌ₃ ＝ｌ₄ ＝
ｍ₁ ＝ｍ₃ ＝ｍ₄ ＝１、他の変数はすべて０であると決
定された。また、この結果より、糖鎖Ｆでは、Ｎ−アセ
チルラクトサミンは、α−１，６で結合したＭａｎにβ
−１，２結合したＧＮへβ１−４で結合しているＧａｌ
に付加したものと決定された。

【０１３７】

【発明の効果】本発明により、より正確で簡便なＮ−ア
セチルラクトサミン型糖鎖の糖鎖構造決定方法、該方法
に用いるためのキット、及び標準物質として有用な新規
オリゴ糖が提供された。

【図面の簡単な説明】

【図１】８種のオリゴ糖Ｉ−ＰＡ〜VIII−ＰＡの混合物
を条件１のＨＰＬＣに供したときのチャートを示す図で
ある。

【図２】１６種のオリゴ糖Ｉ−ＰＡ〜 XVI−ＰＡの混合
物を条件２のＨＰＬＣに供したときのチャートを示す図
である。

【図３】図２のフラクション２を条件３のＨＰＬＣに供
したときのチャートを示す図である。

【図４】図２のフラクション４を条件３のＨＰＬＣに供
したときのチャートを示す図である。

【図５】図２のフラクション３を条件１のＨＰＬＣに供
したときのチャートを示す図である。

【図６】図２のフラクションを肺炎球菌由来のβ−Ｎ−
アセチルグルコサミニダーゼにて完全消化したものを条
件１のＨＰＬＣに供したときのチャートを示す図であ
る。

【図７】１６種のオリゴ糖Ｉ−ＰＡ〜ＸVI−ＰＡの混合
物を条件２と条件４のＨＰＬＣに供したときのチャー
ト、及び１６種のオリゴ糖の２次元マップを示す図であ
る。

【図８】Ｉ−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのうち、化
学シフト値が３．００ｐｐｍから５．５０ｐｐｍの範囲
のスペクトルを表す図である。

【図９】Ｉ−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのうち、化
学シフト値が１．８５ｐｐｍから２．５０ｐｐｍの範囲
のスペクトルを表す図である。

【図１０】II−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのうち、
化学シフト値が３．００ｐｐｍから５．５０ｐｐｍの範
囲のスペクトルを表す図である。

【図１１】II−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのうち、
化学シフト値が１．８５ｐｐｍから２．５０ｐｐｍの範
囲のスペクトルを表す図である。

【図１２】III −ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのう
ち、化学シフト値が３．００ｐｐｍから５．５０ｐｐｍ
の範囲のスペクトルを表す図である。

【図１３】III −ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのう
ち、化学シフト値が１．８５ｐｐｍから２．５０ｐｐｍ
の範囲のスペクトルを表す図である。

【図１４】IＸ−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのう
ち、化学シフト値が１．６０ｐｐｍから５．５０ｐｐｍ
の範囲のスペクトルを表す図である。

【図１５】Ｘ−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのうち、
化学シフト値が１．８５ｐｐｍから２．５０ｐｐｍの範
囲のスペクトルを表す図である。

【図１６】Ｘ−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのうち、
化学シフト値が３．００ｐｐｍから５．５０ｐｐｍの範
囲のスペクトルを表す図である。

【図１７】XI−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのうち、
化学シフト値が１．６０ｐｐｍから５．５０ｐｐｍの範
囲のスペクトルを表す図である。

【図１８】ＸII−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのう
ち、化学シフト値が１．６０ｐｐｍから５．５０ｐｐｍ
の範囲のスペクトルを表す図である。

【図１９】ＸIII −ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのう
ち、化学シフト値が１．６０ｐｐｍから５．５０ｐｐｍ
の範囲のスペクトルを表す図である。

【図２０】ＸIV−ＰＡの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルのう
ち、化学シフト値が１．６０ｐｐｍから５．５０ｐｐｍ
の範囲のスペクトルを表す図である。

【図２１】α−Ｍａｎにβ−１，６結合しているＧＮを
保護した糖鎖を、ウシ腎臓由来のβ−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼで部分消化したものをＨＰＬＣに供した
ときのチャートを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏｌ．６ （1992）ｐ．77／83 社団法人日本生化学会編「新生化学実 験講座３ 糖質▲Ｉ▼ 糖タンパク質 （上）」（1990−５−21）株式会社東京 化学同人 ｐ．184−187，316−317 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07H 5/04 C07H 15/00 - 15/26 C12Q 1/34 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖の糖鎖
   構造決定方法において、下記の構造式（１）： で表されるＮ−アセチルラクトサミン型糖鎖のＭ３コア
   のα−マンノース残基（α−Ｍａｎ）にβ結合している
   Ｎ−アセチルグルコサミン残基（ＧＮ）のうち、選択的
   に除去すべきＧＮのα−Ｍａｎとの結合の切断を酸素的
   処理により行ってＧＮを選択的に除去した後、当該Ｍ３
   コアに残存しているＧＮの結合位置を決定することによ
   って、Ｍ３コアのα−Ｍａｎにβ結合しているＧＮの非
   還元末端側の糖鎖残基を決定することを特徴とするＮ−
   アセチルラクトサミン型糖鎖の糖鎖構造決定方法。
2. 【請求項２】 Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖の糖鎖
   構造決定方法において、下記工程：（１）下記の構造式
   （１）： で表されるＭ３コアのα−Ｍａｎにβ結合しているＧＮ
   を選択的に除去する工程、（２）工程（１）の生成物
   が、Ｍ３コアのα−Ｍａｎにβ結合しているＧＮの非還
   元末端側に糖残基が結合している生成物である場合に
   は、それらの糖残基を除去する工程、 （３）工程（１）又は工程（２）により得られる、Ｍ３
   コアのα−Ｍａｎと非還元末端側に糖残基を有しないＧ
   Ｎとがβ結合している生成物を標準物質と比較、同定す
   る工程、 を含むことを特徴とする請求項１に記載の糖鎖構造決定
   方法。
3. 【請求項３】 工程（１）が、Ｍ３コアのα−Ｍａｎに
   β結合しているＧＮのうち、存在を決定すべき特定の糖
   残基を非還元末端側に有しないＧＮを除去する工程であ
   る請求項２に記載の糖鎖構造決定方法。
4. 【請求項４】 工程（１）が、Ｍ３コアのα−Ｍａｎに
   β結合しているＧＮのうち、存在を決定すべき特定の糖
   残基を非還元末端側に有するＧＮを除去する工程である
   請求項２に記載の糖鎖構造決定方法。
5. 【請求項５】 請求項１、２、３、又は４に記載の糖鎖
   構造決定方法に用いるためのキットであって、下記一般
   式（化１）： 【化１】 〔式中、Ｙ₁ 、Ｙ₂ 、Ｙ₃ 、Ｙ₄ はいずれも水素又はβ
   −Ｎ−アセチルグルコサミン残基（β−ＧＮ）を示し、
   Ｒ₁ は下記式（化２）又は（化３）： 【化２】 【化３】 （式中、Ｒ₂ はアルデヒド基、標識化されたメチレン
   基、又は標識化されたメチン基を示す）を表す〕で表さ
   れるオリゴ糖の少なくとも１種を含むことを特徴とする
   Ｎ−アセチルラクトサミン型糖鎖の糖鎖構造決定用キッ
   ト。
6. 【請求項６】 下記一般式（化４）： 【化４】 〔式中、Ｘ₁ 、Ｘ₂ 、Ｘ₃ 、Ｘ₄ はいずれも水素又はβ
   −ＧＮ（ただし、Ｘ₁ とＸ₃ の両方が水素の場合、ある
   いはＸ₂ とＸ₄ の両方がβ−ＧＮの場合を除く）を示
   し、Ｒ₁ は下記式（化２）又は（化３）： 【化２】 【化３】 （式中、Ｒ₂ はアルデヒド基、標識化されたメチレン
   基、又は標識化されたメチン基を示す）を表す〕で表さ
   れるオリゴ糖。