SE447872B - Metallsalt av heparin av injicerbar kvalitet och forfarande for dess framstellning - Google Patents

Description

LO 15 20 25 30 35 447 872 2 eller engångssprutor, och som följaktligen måste förbli helt kla- ra även efter flera månaders lagring. Bildningen av små avsätt- ningar eller t.o.m. lätt grumlíng gör naturligtvis nämnda lös- ningar olämpliga för terapeutisk administration.

Det är speciellt förhållandet om man beaktar, att partik- lar eller kristaller ej längre är synliga när storleken därav ligger under cirka 50 /um, och att å andra sidan kapillära kärl 3/ i människan har innerdiametrar, vilka kan vara så små som l till ä /um. Närvaron av nämnda partiklar eller kristaller i injicer- bara lösningar kan dessutom även om de ej längre är synliga utan optisk utrustning bli speciellt skadliga när det aktiva ämne som injiceras utgöres av heparin på grund av dess antikoagulerings- egenskaper. De blödningsrísker som induceras av sådana fasta partiklar injicerade på patienten kan till och med förhöjas ge- nom den i andra avseenden väsentliga aktiviteten av heparin.

Det förhållandet att lösningen förblir klar behöver ej nödvändigtvis betyda att ingen fällning bildats. Det kan fak- tiskt hända, speciollt i sådana fal] där utfällning sker mycket långsamt, att mycket små partiklar (speciellt icke synliga med storlekar under 50 /um), vilka bildas, har tendens att samman- smälta till mycket få om ej en enda relativt synliga kristaller, vilka naturligtvis ej medför förändring av lösningens totala klarhet. Följaktligen kan injicering av en sådan lösning vara minst lika skadlig som i föregående fall.

Samtliga ovannämnda risker är så mycket större när kon- centrationen av heparin i de farmaceutiska standardlösningarna förhöjes, ehuru de kan variera med injektionens art (dvs om den är subkutan, intramuskulär, intravenös etc.). Som emellertid är välkänt är det ofta önskvärt att använda så höga heparinkoncentra- tioner som möjligt, varigenom risken för utfällning eller närvaron av icke synliga partiklar i stigande antal tenderar att bli ett mycket allvarligt problem.

I ett försök att eliminera sådana svårigheter har man ofta använt sig av relativt långvarig lagring av de nyberedda heparin-. lösningarna, speciellt lösningar av heparinsalter av fysiologiskt acceptabla metaller, åtminstone delvis bildade av kalcium, varvid 'de fällningar som kan ha bildats sedan avfiltreras innan lösning- v arna vidarehanteras, exempelvis fördelade på ampuller eller en- A gångssprutor. s 10 15 25 30 35 447 872 Det är uppenbart, att ju längre lagringstiden är desto mera oekonomisk är framställningen av de slutliga farmaceutiska bered- ningarna. o Ändamålet med föreliggande uppfinning är sålunda i huvudsa att undvika samtliga ovannämnda svårigheter; ett speciellt ända- mål med uppfinningen är sålunda åstadkommande av hepariner av in- jicerbar kvalitet användbara för framställning av lösningar, spe- ciellt injicerbara lösningar, med lång lagringstid. Ett annat än- damål med uppfinningen är åstadkommande av ett förfarande för er- hållande av sådana hepariner, vilka onödiggör föregående lagring av ovan angiven karaktär.

Det har nu i själva verket visat sig, att de flesta av ovan- nämnda svårigheter kan hänföras till närvaron i lösningarna av hepariner av injicerbar kvalitet av mineralsalter av varierande slag och i varierande kvantiteter ( upp till 2,5 viktprocent)~ beroende på den testade satsens ursprung, och på det förfarande som användes för deras ektraktion från naturliga källor och/eller för missfärgning (eller blekning) av naturliga erhållna hepariner så att de uppfyller de krav beträffande färglöshet som normalt erfordras för hepariner av injicerbar kvalitet, även när sådant innehåll av mineralsalter ligger inom de gränser som tolereras i enlighet med nuvarande regler , exempelvis i enlighet med fransk Codex-standard.

Den större delen av de kvarvarande salterna utgöres av klo- rater och sulfater som kan uppgå till en 1%. Andra salter, speci- ellt karbonater, sulfiter, är närvarande i mindre mängder. Överföringen av natriumsalter av heparin till kalciumhalti- ga salter av heparin, exempelvis i enlighet med ovan angiven pro- cedur, bör reducera andelen av dessa salter med hänsyn till den låga lösligheten av kalciumsulfater, -sulfiter och -karbonater.

De senare bör i själva verket vara separerbara som fasta ämnen från den klara lösningen av kalciumhaltiga salter av heparin.

Det har nu emellertid högst överraskande observerats, att vid slutet av överföringen av natriumheparinat till kalciumhepa- rinat, speciellt i enlighet med ovanstående förfarande, innehål- let av ovannämnda kvarvarande míneralsalt modifieras endast föga jämfört med det för det ursprungliga natriumheparinatet. Ännu mera överraskande var upptäckten, att salter av hepa- rin innefattande sådana som innehåller en metall åtminstone del- 10 15 20 25 30 35 447 872 4 vis bestående av kalcium, kan solubiliseras i form av klara vatten- lösningar, ehuru_de fortfarande kan innehålla mindre men ändå ej försumbara mängder av oxalatjoner. Detta var så mycket mera över- raskande som oxalater av metaller, såsom kalcium, är kända för att vara högst olösliga i vatten.

Skälet till detta förhållande är ej helt utrett. Detta oak- tat har en förändring ilde normala löslighetsbetingelserna för kalciumoxalatet kunnat iakttas, speciellt när kalciumklorid före- ligger i överskott. Det har sålunda visat sig, att kommersiellt tillgängliga injicerbara hepariner eller heparinater kan ha kvar- varande salthalter varierande från 1,0 till 2,5 vikt-%. Ett fler- tal tester på sådana prover har visat, att deras oxalathalt all- tid överstiger 90 ppm. I ett fall befanns oxalathalten vara H0 ppm,men detta resultat visade sig senare vara felaktigt. I kommer- siellt tillgängliga injicerbara hepariner är oxalathalten mellan 90 och 300 ppm och i vissa fall till och med högre.

Det har befunnits, att eliminering av mineralsalterna, spe- ciellt av spår av oxalater, från de behandlade heparinerna resul- terar i att grumlighet och avsättningar försvinner, vilka hade benägenhet att uppträda i kalciumheparinatlösningarna efter nämn- da lösningars beredning. Det har ytterligare visat sig, att efter längre lagringstid ingen väsentlig förhöjning av osynliga partik- lar (såsom kan detekteras med konventionell optisk utrustning, så- som räknare av partiklar med förmåga att detektera partiklar med storlekar varierande från 2 till 50 /um) erhålles i sådana lös- ningar, förutsatt att deras innehåll av oxalatjoner är tillräck- ligt reducerat.

Kalcium- eller blandadekalciumheparinatlösníngar som gjorts till föremål för en reningsprocedur enligt uppfinningen, såsom den beskrives nedan förblir klara, till och med efter att ha lagrats i flera månader. Ingen grumling eller avsättning uppträder. Dess in- nehåll av osynliga partiklar förhöjes ej efter längre tids lagring, varigenom riskerna för kristallkoalescens, såsom beskrives ovan även de reduceras.

Hepariner eller heparinsalter enligt uppfinningen är sålunda sådana, vars innehåll av kvarvarande mineralsalter, speciellt av oxalater, är tillräckligt lågt för att de injicerbara lösningar som framställs utgående från sådana hepariner - och speciellt kal- ciumheparinatlösningar - och under koncentrationer normalt använda 10 15 20 25 30 35 447 872 för denna typ av administration skall kunna förbli klara, till och med efter flera månaders lagring, exempelvis minst 6 månader.

Heparinsalter enligt uppfinningen, vilka innehåller mindre än 50, företrädesvis mindre än 20 ppm eller mindre oxalatjoner, kan överföras i form av lösningar, speciellt injicerbara lösningar, vilka förblir klara, och vars innehåll av osynliga partiklar, om fortfarande sådana finnes, förblir i huvudsak konstant efter ut- sträckt lagring, vilken kan vara så lång som två år och till och med tre till fem år. Denna lagring förstås försiggå vid rumstempe- ratur, såsom inom intervallet cirka 20-2590.

De har företrädesvis ett innehåll av kvarvarande mieralsal- ter understigande 0,5 och företrädesvis under 0,3 %.

Det bör observeras, att uttrycket "mineralsalter" ej är in- skränkt till salter av mineralsyror, såsom svavelsyra eller salt- syra, utan även innefattar salterna av syror, såsom oxalsyra eller kolsyra eller till och med organiska syror av låg molekylvikt, så- som ättiksyra. Alla dessa salter kan betraktas som heparinsalter.

Det har befunnits, att sådana heparinsalter kan användas för framställning av injicerbara lösningar, vilka kan lagras eller för- varas under långa tidsperioder, till och med när metallen av hepa- rinsaltet är åtminstone delvis en sådan som liksom kalcium bildar oxalater vilka ej är vattenlösliga.

Genom uppfinningen åstadkommes även ett förfarande för fram- ställning av renade hepariner enligt uppfinningen utgående från kommersiellt tillgängliga produkter innefattande starkt miss- färgade heparinprodukter, såsom kan erhållas genom konventionella missfärgningsförfaranden, speciellt oxidativa metoder, vilka såsom det har visat sig är benägna att medföra förhöjning av oxalatinne- hållet i de behandlade heparinerna.

Genom förfarandet enligt föreliggande uppfinning tillämpbart på en heparinberedning, förening eller allmännare en blandning av heparin och andra salter, speciellt mineralsalter, som utgångsma- terial, åstadkommes en selektiv utfällning där man utnyttjar skill- naden i löslighet mellan heparinsalter och kvarvarande mineralsal- ter. Härvid sätter man till en vattenlösning innehållande heparin- -mineralsaltblandning en kvantitet av ett non-joniskt utfällnings- medel, såsom alkohol, exempelvis etanol, som är så anpassad att man erhåller selektiv utfällning av heparin eller heparinsalterna under det att mineralsalterna förblir i vattenlösning, varefter 10 15 25 30 35 447 872 6 man tillvaratar heparinet och om det är nödvändigt upprepar denna selektiva separation på en ny vattenlösning av heparinet, som se- dan tillvaratas när koncentrationen oxalat i det slutliga heparinet är mindre än ett tröskelvärde, som kan vara 70 ppm i ett antal fall men så lågt som 30 ppm, företrädesvis till och med mindre än 20 ppm när långa lagringstider (två år eller till och med tre till fem år exempelvis) erfordras och när den totala säkerheten be- träffande icke utfällning erfordras under nämnda period. Det är till och med möjligt att erhålla ett heparin som har endast spår- ämnen av oxalatjoner vid detektering genom för närvarande till- gänglig teknik. 7 Enligt en föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen användes heparinet i form av ett salt av en metall, exempelvis natrium, litium, kalium, vars oxalater som sådana år vattenlösliga. En annan metall, speciellt kalcium, vars oxalater är vattenolösliga, eller eventuellt magnesium, kan sedan åtminsto- ne delvis ersätta metallen i det slutligen renade heparinet som är i huvudsak befriat från dess oxalater.

Koncentrationen av den heparinlösning som användes för så- dan behandling kan variera inom vida gränser. Det är att föredra av praktiska skäl att lösningen ej är alltför utspädd, eftersom volymen använd etanol är proportionell mot den behandlade lösning- ens. För samma kvantitet heparin erfordras större mängd etanol ju mer utspädd lösningen är. Omvänt får heparinlösningarna ej överstiga en viss koncentrationsgrad, eftersom deras viskosi- tet snabbt stiger och heparinutfällningen utgående från dessa lös- ningar eventuellt kan medbringa en stor mängd av de ursprungliga föroreningar som avses avskiljas. 7 Med hänsyn till dessa betingelser utföres förfarandet med fördel på lösningar, vars koncentration är av samma storleksord- ning som den för lösningar som vanligen användes för injektioner, dvs innehållande från cirka H0 till cirka 250 g per liter natrium- heparinat (motsvarande cirka 5000 till 30 000 IU/ml).

Lösningens pH påverkar reningsresultatet. En sur lösning har tendens att behålla mineralsalterna i lösning, speciellt oxalater, och följaktligen förbättra separationen.

Heparin kan dessutom påverkas av starka syror. En lösning med ett pH överstigande 5,5 och företrädesvis mellan 5 och 7 kan med fördel användas. ' 10 15 20 30 7 447 872 En tillräcklig mängd etanol sättes till den sålunda beredda heparinlösningen_så att praktiskt taget hela heparinet utfälles, under det att mineralsalterna förblir i den alkoholiska lösningen.

För en volym heparinlösning användes företrädesvis 0,5 till 1,5 volymer etanol.

En praktiskt taget ren neutral alkohol (99 till l000GL) nnvåíndu-.s lned fördel .

Heparinfällningen avskiljes fran den överliggande vätskan och knådas sedan och tvättas för eliminering av kvarvarande spår- av lösning. Tvättningen utföres företrädesvis med absolut alkohol.

Heparinet filtreras sedan och torkas.

Om dessa första separationer skulle vara ofullständiga kan denna behandling av heparinfällningen eventuellt utföras upprepade gånger till dess att heparinsalter erhålles som uppfyller ovan an- givna krav.

Största delen av det ursprungliga heparinet återvinnes under loppet av ovan beskrivna utfällning. Återstoden kvarstannar i den alkoholíska lösningen. Den senare kan behandlas med en ytterligare kvantitet alkohol för bildning av en ytterligare heparinfällning.

Reningsförfarandet enligt uppfinningen har visat sig vara tillämpbart i samtliga fall för avlägsnande av de fria oxalater som ingår i kommersiella hepariner, oavsett ursprunget. Även om man genom föreliggande förfarande uppenbarligen kan avlägsna vilka som helst uppmätbara fria oxalater till bildning av hepariner, som innehåller mindre än 30 och till och med mindre än 20 ppm, vid tillämpning på ett heparinsalt av en metall, såsom natrium, varav motsvarande oxalater är vattenlösligt, har det emellertid i nâgra fall visat sig, att vid omvandling av åtmin- stone en del av sådant heparinsalt till ett salt av en metall, så- som kalcium, vars oxalater är olösliga, den erhållna produkten slut- ligen visat sig innehålla större mängder fria oxalater.

Ehuru i skrivande stund ingen vetenskaplig förklaring kan redovisas för tolkning av dessa fenomen antas det, att en del av de oxalater som ingår i de kommersiella hepariner, som erhålles från vissa källor, uppför sig som om de vore absorberade eller fixerade på heparinmolekylerna, varvid de senare uppenbarligen be- ter sig som anjonbytarel Som ett resultat av dessa fenomen kan där- för de slutliga heparinsalterna visa sig vara olämpliga för fram- ställning av injicerbara lösningar av heparin för lagring under 10 15 20 25 30 35 447 872 längre tidsperioder.

Det har emellertid vidare visat sig, att denna svårighet kan elimineras under tillämpning av det ytterligare förbättrade förfa- randet enligt föreliggande uppfinning, vid vilket man bringar nämn- da non-joniska heparinutfällningsmedel i ovan beskrivna renings- steg i kontakt med en ursprunglig vattenlösning av det heparin som skall renas (eller av heparin-mineralsaltblandningen) som innehål- ler vattenlösliga mineralsalter andra än oxalater i en koncentra- tion som är tillräcklig för att befrämja separation av oxalaterna innefattande de från början synbarligen fixerade eller adsorberade oxalaterna, som då frigöres och kvarstannar i vattenlösningen vid den efterföljande utfällningen av heparinsalterna.

Sålunda kan till och med vissa av de övriga salter som är närvarande i heparinlösningen som skall renas genom lämplig juste- ring av koncentrationen i lösningen, när detta är aktuellt, så- lunda bidra till en fullständigare extraktion av oxalatjonerna.

Vid föredragna utföríngsformer av förfarandet enligt upp- finningen är det sålunda vanligen erforderligt att preliminärt justera koncentrationen av nämnda vattenlösliga mineralsalter av den ursprungliga vattenlösningen av heparin, innan denna ïringas i kontakt med ovannämnda nonjoniska heparinutfällningsmedel.

Det har i själva verket visat sig, att tillräcklig koncen- tration, speciellt av salter innefattande tvåvärda anjoner och företrädesvis även monovalenta anjoner, synes verka så att de åstadkommer frigöringav de oxalater som eventuellt är adsorberade på eller fixerade tíla heparinet.

Om det är nödvändigt kan det därefter vara lämpligt att upp- repa utfällníngsstegen efter förnyad kontakt av en lösning av ht- parinet som utvunnits och med vattenlösliga mineralsalter andra än oxalater i justerad koncentration såsom ovan definierats till dess att totalkoncentrationen oxalater i det slutliga heparinet är mind- re än 30 ppm, företrädesvis till och med mindre än 20 ppm.

Metallen (eller metallerna) av salterna med tvåvärda anjoner andra än oxalater som ingår i eller eventuellt sättes till den ur- sprungliga heparinlösningen är företrädesvis utvalda bland sådana metaller, vars oxalater är vattenlösliga. Karbonater, speciellt natriumkarbonat, har visat sig effektivast vid förfarandet enligt uppfinningen.

Det är även föredraget att heparinet i ovannämnda lösning LO 15 20 25 30 35 447 872 föreligger i form av ett heparinsalt av samma metall som den av mineralsalterna. Eventuellt utbyten av den metall som ingår i det senare mineralsaltet mot metallen i heparinsaltet undvikes därige- nom, varigenom metallinnehâllet i de renade heparinsalterna hålles under noggrann kontroll.

Koncentrationen av nämnda mineralsalter i den lösning som bringas i kontakt med det nonjoniska utfällningsmedlet, såsom al- kohol, justeras med fördel till ett värde av från 0,5 till 2,5, exempelvis cirka 0,5 vikt-% med avseende på heparinet.

Utgångslösningen innehåller även med fördel salter med en- värda anjoner av åtminstone en metall, vars oxalat är vattenlös- ligt. Natriumklorid är representativ för sådana salter. Vid en föredragen utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen har har eller justeras koncentrationen av nämnda envärda salt till ett värde varierande från l till 7%, exempelvis cirka 2,5 vikt-%/ volym lösning.

Det har visat sig fördelaktigt ehuru ej nödvändigt, att pH för den lösning som bringas i kontakt med det nonjoniska“ utfäll- ningsmedlet ligger mellan 7 och 10, exempelvis av storleksordning- en 8,5. Detta är i själva verket ett pH som spontant inställer sig när det använda saltet med tvåvärda anjoner är natriumkarbonat.

Dessa salter med tvåvärda och/eller envärda anjoner kan se- dan lätt elimineras i slutsteget av förfarandet, exempelvis i ett sista steg där heparinlösningen bringas i kontakt med det non-jo- niska ämnet. pH justeras sedan med fördel exempelvis med saltsyra till ett något surt värde, tillräckligt förzmt förstöra karbonater- na, speciellt ett pH-värde varierande från 3 till 7. Kloridjonerna förblir i vattenlösningen när det slutliga heparinsaltet utfälles.

Heparinkompositioner, speciellt heparinsalter, erhålles så- lunda, vilka är i huvudsak oxalatfria och vilka är - antingen direkt lämpliga för framställning av farmaceutiska kompositioner, speciellt injicerbara eller perfunderbara lösningar med lång lagringstid, till och med när metalljoner av nämnda hepa- rinsalter bildas åtminstone delvis av metaller, vars oxalater är mycket olösliga, såsom kalcium, - eller lämpliga som utgångsheparinsalter, i vilka de metallis- ka katjonerna kan ersättas åtminstone delvis och företrädesvis ehuru ej nödvändigtvis, i enlighet med förfarandet enligt brittiska patentet l 471 482 som redan nämnts ovan, till bildning av andra 10 15 20 25 35 447 872 U i huvudsak oxalatfria heparinsalter, vilka sedan överföres till farmaceutiska kompositioner som kan lagras under lång tid.

Föreliggande uppfinning avser sålunda mera speciellt bland oxalatfria heparinberedningar metallsalter av heparin, dvs endera enkla salter av heparin, såsom natrium-,kalium-, kalcium- eller magnesiumsalter av heparin, eller blandade salter av heparin inne- hållande minst två av ovannämnda metallkatjoner i godtyckliga rela- tiva proportioner, varvid samtliga dessa heparinsalter är i huvud- sak fria från oxalater i det att de innehåller mindre än tröskel- värdet 70_ppm i ett antal fall och så litet som 30, företrädesvis mindre än 20 ppm oxalater totalt (i fortsättningen kallade oxalat- fria hepariner). Bland de blandade salterna kan anges den föredrag- na serien av sådana innehållande natrium och kalcium.

Uppfinningen avser även farmaceutiska beredningar, vari det oxalatfria heparinet är förenat med en farmaceutisk bärare, spe- ciellt oxalatfria, företrädesvis färglösa heparinberedningar med en aktivitet av minst 120, företrädesvis mer änfl50 internationella enheter (IU)/mg, fria från pyrogener, såväl som högkoncentrerade lösningar av heparin är användbara för tillämpning inom terapín för kontroll av blodkoagulering, speciellt oxalatfria, företrädes- vis färglösa lösningar lämpliga för subkutan injektion innehållan- de från 5000 till 35 000 IU/ml heparin, företrädesvis från 20 000 till 30 000, såsom 25 000 IU/ml, eller oxalatfria lösningar lämp- liga för intravenös injektion innehållande 1000 till lO 000, exem- pelvis 5000 IU/mi heparin, etc.

Heparinet av nämnda beredning föreligger företrädesvis i form av fysiologiskt acceptabelt metallsalt av heparin innehållan- de en eller flera metallkatjoner. Metallen utgöres åtminstone del- vis av kalcium. Kalcium är företrädesvis den enda metallen i nämnda heparinsalt, De farmaceutiska beredningarna kan med fördel till- handahållas i engångssprutor färdiga för användning vid lämplig tidpunkt.

Uppfinningen avser även ett förfarande för kontroll av blodkoagulation på människan, vid vilket förfarande man på män- niskan administrerar en effektiv dos av det oxalatfria heparinet enligt uppfinningen, såsom från 13500 till 50 000 i.u. subkutant, två gånger per dygn, allt efter behovet beroende på patientens tromboliska status, eller från 20 000 till 50 000 i.u. per 2H timmar intravenöst jämnt fördelat över dygnet, företrädesvis ge- 10 15 20 25 30 35 11 447 872 nom justerade perfusioner, eller fran 5000 till 10 000 i.u. tre gånger per vecka intramuskulärt.

Det renade heparinet enligt uppfinningen kan användas direkt för framställning av exempelvis injicerbara lösningar med sedvan- liga doser och koncentrationer. Det kan även eventuellt användas som utgångsmaterial för framställning av andra salter, såsom kal- ciumheparinatet eller blandade kalcium-magnesium-, kalcium-natrium- salter, exempelvis enligt förfarandet som beskrives i brittiska patentskriften l 471 H82.

Första exempel på föredragen reningsprocedur Vid ett föredraget alkoholiskt fraktioneringsreningsför~ farande för injicerbart natriumheparinat användes natriumheparin av bovint eller porcint ursprung av injicerbar kvalitet. Detta heparinat upplöses i avmineraliserat vatten (med en resistivitet av från 500 000 till 800 000 Q/cm, företrädesvis 500 000 0/cm.

Koncentrationen av heparinatlösningen inställes mellan 5000 och 30 000 IU/ml, företrädesvis 25 000 IU/ml. 0,3 % metakre- sol tillsättes för att förhindra eventuell kontamination. Lös- ningens pH hålles mellan 5 och 7, företrädesvis 6,5, genom till- sats av endera 5 N natriumhydroxídlösning lösning av reagensren- het eller 5 N saltsyra lösning av reagensrenhet. Lösningens led- firhwmün ningsförmåga förblir mellan 7000 och 15 000 0,7 volymer neutral etylalkohol (99 till 1000 GL) sättes till den sålunda beredda heparinatlösningen. Fällningen får sedi- mentera och eventuellt tillsättes om det är nödvändigt en liten /u Mhos-cm. mängd natriumklorid.

Fällningen avskiljes från den ovanförliggande vätskan. Den solubiliseras ytterligare en gång i avmineraliserat vatten med ovan beskrivna karakteristika till bildning av en koncentration omkring cirka 12 500 IU/ml. pH regleras till 5,5 om det är nöd- vändigt, under användning av en 5 N natriumhydroxidlösning eller 5N saltsyralösning. Lösningen filtreras på ett 0,3 um millipor- filter. 1,2 volymer neutral etylisk alkohol (99-100 GL) per l volym lösning tillsättes under omröríng. Fällningen får sedimen- tera, eventuellt under tillsats av en liten mängd natriumklorid.

Den sålunda erhållna heparinfällningen dehydratiseras genom sönderdelning i absolut etylalkohol, filtreras sedan under vakuum på en Büchner-tratt, tvättas med absolut alkohol och torkas under l torr vakuum vid en temperatur av 55/HOOC. 10 15 25 30 35 447 872 12 Om ytterligare utfällningar erfordras utföres de på samma sätt som det andra utfällningssteget; dvs heparinkoncentration av 12 500 IU/ml, pH 5,5, och 1,2 volymer absolut alkohol per l vo- lym lösning.

Andra exempel av en allmänt föredragen procedur Första alkoholiska fraktionering Ett natriumsalt av heparin av injicerbar kvalitet av bovint eller porcint ursprung upplöses i avmineraliserat vatten med en resistivitet varierande från 300 000 till 800 000 ohm, och före- trädesvis 500 000 ohm, till bildning av en lösning med en heparin- koncentration av från 5000 till 30 000 IU/ml och företrädesvis 25 000 IU/ml. Metakresol tillsättes i en mängd motsvarande en kon- centration av š/lO00. Lösningens pH justeras till ett värde av från 7 till 10, företrädesvis 8,5, genom tillsats av en natrium- karbonatlösning (vattenfritt natriumkarbonat i en mängd av 0,5% relativt ursprunglig heparinvikt).

Lösningens ledningsförmåga varieras härvid från 7000 till 15 000 /u Mhos/cm. Natriumkloridkristaller sättes därefter till lös- ningen i en mängd av 2,5 vikt-%/volym. 0,7 volymer neutral etyl- alkohol med titern 99 till 1000 GL (Gay-Lussac grader) tillföres sedan under omröring till heparinlösningen. Heparinfällningen upp- samlas därefter efter det att den fått stå 6 timmar i mediet.

Andra alkoholisk fraktionering Sålunda erhâllen heparinfällning upplöses i avmineraliserat vatten med ovannämnda karakteristika till bildning av en koncentra- tion nära 12 500 IU/ml. pH är då cirka 8,5. Kristaller av natrium- klorid tillsättes i en mängd av 2,5 % vikt/volym relativt lösning- en. En volym neutral etylalkohol med titern 99 till 1000 GL till- sättes under omröring.

Mediet får stå i 12 timmar. Den nya heparinfällningen upp- samlas.

Den “andra alkoholiska fraktioneringen" upprepas tre gånger under samma betingelser som ovan till totalt H fraktioneringssteg.

Den fällning som erhålls från den fjärde alkoholiska fraktionering- en upplöses i avmineraliserat vatten med ovannämnda karakteristika till bildning av en koncentration som är cirka 12 500 IU/ml. pH justeras till 3 med saltsyra under kraftig omröring. Omröringen upprätthålles sedan i ytterligare l5 minuter. pH_justeras därefter till 5,5 med 5N natriumhydroxid. Natriumkloridkristaller tillsättes 10 15 20 25 30 35 447 872 15 i en mängd av 2,5 % vikt/volym och lösningensom erhålles filtreras på ett 0,3 /um Millipore-membran. l volym/volym neutral etylalko- hol med titern 99 till 1000 GL tillsättes filtratet under omröring.

Mediet får stå i 12 timmar.

Den erhållna heparinfällningen dehydratiseras genom sönder- delning i absolut etylalkohol och filtreras under vakuum. Den tvättas slutligen i absolut alkohol och torkas under l torr vakuum vid en temperatur av 35/4000. Ett injicerbart natriumsalt av hepa- rin erhålles sålunda, vari proportionen totala mineralsalter är mindre än 0,5% och vars totala oxalathalt är under eller lika med 20 ppm.

Exempel I I detta exempel användes kommersiellt tillgängligt natrium- heparinat med titern 160 IU/mg.

Totalinnehållet mineralsalter är 2,5 % och oxalathalten är av storleksordningen 220 ppm (dvs 0,022%). 10 000 g av detta heparinat upplöses i ett 500 l stâlinox- reaktionskärl genom tillsats av 50 l avmineraliserat vatten med en resistivitet av 500 000 9/cm, i förväg filtrerat på ett 0,22 /um Millipore-membran.

Upplösningen uppnås efter en timmes omröring. pH uppmätes och justeras till 6,5 genom tillsats av 5 N NaOH eller 5N Hcl.

Volymen bringas till 6U 1 medelst tillsats av samma avminerali- serade vatten. Konduktiviteten som uppmätes är 15 000 /u Mhos/cm.

Temperaturen hålles mellan 15 och 3000. 192 ml nydestillerad metakresol tillsättes och 0,7 volymer av en neutral etylalkohol (99/1000 GL) tillsättes per en volym ursprungslösning, dvs ü4,8 liter. Lösningen får stå till dess att en fällning uppträder. Om det är nödvändigt kan en liten mängd natriumklorid tillsättas. Den ovanförliggande vätskan och natrium- heparinatfällningen tillvaratas separat, och mineralsaltinnehållet i den senare är under 0,5% men cirka 200 ppm oxalatjoner återfinnes fortfarande däri.

Natriumheparinatet solubiliseras åter i 50 liter av samma avmineraliserade vatten med en ledningsförmåga av 500 000 9/cm.

Om det är nödvändigt justeras pH till 5,5 genom tillsats av 5N NaOH eller 5N Hcl. Den uppmätta ledningsförmågan är 15 000 /u Mhos-cm. Volymen bringas till 128 liter med samma sorts avminera- liseradevatten, 384 g nydestillerad metakresol tillsättes och hela 10 15 25 30 35 447 872 14 beredningen får stå i 2U timmar vid rumstemperatur. Heparinlös- ningen filtreras på ett 0,5 /um CWSS Millipore-filter. Filtra- tet tillvaratas, 30 liter neutral etylalkohol (99/1000 GL), dvs 1,2 volymer, tillsättes långsamt under omröring till 25 l av fil- tratet. Produkten får sedan stå till dess att en fällning uppträ- der. Om det är nödvändigt tillsättes en liten mängd natriumklorid.

Den ovanförliggande lösningen av natriumheparinatfällningen tillvaratas separat. Den senare dehydratiseras med absolut alko- hol, krossas och filtreras under industriellt vakuum på en Büchner- tratt och torkas slutligen och lyofiliseras. 9ü00 g natriumhepari- nat erhålles sålunda, dvs ett utbyte av 94%. Detta heparinat har titern 160 IU/mg. Dess innehåll av mineralsalter är 0,15 %, inne- fattande 30 ppm oxalatjoner.

För tillvaratagande av det heparinat som fortfarande ingår i vatten-alkoholvätskan utsträckes behandlingen på följande sätt: x Under omröring tillsättes en volym neutral etylalkohol (99/1000 GL) till en volym vätska från den första alkoholiska be- redningen. Efter 2Ä timmars sedimentation överföras den klara till något opalescenta vätskan till kvarvarande alkoholer.

Fällningen avskiljes och tillvaratas i absolut etylalkohol, dehydratiseras, krossas och torkas.

Neutral etylalkohol (90/l00° GL) tillsättes under omröring till vätskan från den andra beredningen i en mängd av 0,5 volymer per en volym vätska, och lösningen får sedimentera i 24 timmar.

Natriumheparinat tillvaratas under samma betingelser som be- skrivits i anslutning till den första ovanförliggande vätskan.

Det sålunda erhållna natriumheparinatet användes vid bered- ningen av kalciumsaltet.

Beredningen utföres i enlighet med det förfarande som be- skrivs i brittiska patentskriften l H71 H82.

Som sammanfattning består sålunda behandlingen av: tillsats av kalciumklorid till en natriumheparinatlösning till bildning av ett kalciumanrikat heparinat och sedan eliminering av de fria natriumjonerna av tillsats av ytterligare kalciumjoner till bild- ning av ett kalciumjonanrikat heparinat.

Genom nämnda förfarande erhålles ett kalciumsalt av heparin med titern 160 IU/mg, 10,3 % kalcium, 0,2 % natrium och 20 ppm oxalatjoner. 10 15 20 25 30 35 15 447 872 Éšempel 2 Ett natriumheparinat bercdes enligt exempel l med titern 160 IU/mg och med en halt av cirka 30 ppm oxalat och behandlas så- som beskrives i brittiska patentskriften l H71 H82 för framställ- ning av ett kalcium-natriumheparinat. I detta exempel tillsättes kalcíumklorid endast en gång till en natriumheparinatlösning; häri- genom elimineras frigjorda natriumjoner.

Härigenom har sålunda framställts ett kalciumheparinat med titern 160 IU/mg och med en kalciumhalt av cirka 7%. Innehållet av oxalatjoner i heparinatsaltet är 18 ppm.

En lösning av detta kalcium-natriumheparinat med titern 25 000 IU/ml kan lagras i ampuller i flera månader utan att upp- visa något spår av fällning.

Exempel 3 I exempel 2 utförda procedur upprepas denna gång under full- ständig överföring av natríumheparinatet till kalciumheparinat i enlighet med det förfarande som beskrivs i brittiska patentskrif- ten l 371 H82.

Det sålunda erhållna kalciumheparinatet har titern 160 IU/mg, en kalciumhalt av cirka l0,4% och en natriumhalt understigande 0,l%. Innehållet av mineralsalterna är 0,4% innefattande 20 ppm oxalatjoner och lösningarna som beretts har titern 25 000 IU/ml och uppvisar samma karakterstika som enligt exempel 2 beträffande dess lagringskapacitet.

Exempel M Ett kommersiellt injicerbart natriumsalt av heparin med ti- term 160 IU/mg som sådant användes i detta exempel.

Dess innehåll av mineralsalter är 2,5% och dess oxalatinne- håll är 10 000 ppm (dvs 0,l%). 10 000 g av detta heparin upplöstes i 50 liter avmineraliserat vatten med en resistivitet av 500 000 Ohm som i förväg filtrerats på ett 0,22 /um Millipore-membran i ett 500 liters reaktionskärl av rostfritt stål.

Lösningen får stå under omröring i 15 minuter och volymen bríngas till 6H liter genom tillsats av avmineraliserat vatten: Koncentrationen är 25 000 IU/ml. 192 ml nydestillerad metakresol och sedan 50 g natriumkarbonat i form av en vattenlösning och slut- ligen 1600 g natriumkloridkristaller tillsättes. Lösningen får åter stå under omröring i 15 minuter. pH som då bör vara 8,5 verifieras och om det är nödvändigt justeras det till 8,5 med en natriumkar- 10 15 25 30 35 447 872 16 bonatlösning. HH liter neutral etylalkohol med titern 99 till l00° GL tillsättes under omröring (0,7 volymer alkohol per en vo- lym av den ursprungliga lösningen). Mediet får stå i 6 timmar och heparinfällningen uppsamlas.

Denna heparinfällning utsättes sedan för en andra alkohol- fraktionering efter att ha upplösts i 110 1 avmineraliserat vatten med tidigare nämnda karakteristika till bildning av en koncentra- tion som är ungefär l2 500 IU/ml. Lösningen får stå under omröring i 15 minuter och avmineraliserat vatten tillsättes upp till en vo- lym av 128 liter. 389 ml nydestillerad metakresol tillsättes. pH justeras till 8,5 med en lösning av natriumkarbonat. 5200 g natriumklorid tillsättes. Lösningen får sedan stå under omröring i 15 minuter. Neutral etylalkohol med titern från 99 till 1000 G.L. tillsättes i proportionen 1 volym per volym heparinlösning under omröring. Det erhållna mediet får stå i 12 timmar. Den bil- dade heparinfällningen tillvaratas efter avlägsnande av den ovan- förliggande vätskan.

Den alkoholiska fraktioneríngen upprepas tre gånger under samma betingelser som den andra fraktioneringen på den heparin- fällning som tillvaratas varje gång från föregående fraktioneríngs- steg.

Den slutliga heparinfällningen upplöses sedan i avminera- líserat vatten till en koncentration av cirka 12 500 IU/ml, dvs en lösning med en volym av 128 liter. pH justeras till 5 under kraf- tig omröring med saltsyra. Lösningen får stå under omröring i 15 minuter. pH justeras till 5,5 med SN natriumhydroxid. 389 ml ny- destillerad metakresol och sedan 3200 g natriumkloridkristaller tillsättes. Den erhållna lösningen filtreras på ett 0,3 /um Milli- pore-membran. Samtliga dessa operationer utföres vid en tempera- tur varierande från 15 till 3000. 1 volym neutral etylalkohol med titern från 99 till 1000 G.L. tillsättes filtratet under om- röring. Lösningen får stå i 12 timmar.

Den sålunda erhållna slutliga heparinfällningendehydratise- ras genom sönderdelning i absolut etylalkohol, filtreras under vakuum och utsättes för upprepade tvättningar med absolut alkohol och torkas sedan under 1 torr vakuum vid en temperatur av 55/4000 i 2H timmar. Pulvret krossas och torkas åter under 1 torr vakuum i 2H timmar vid en temperatur av HOOC för eliminering av de slut- liga spåren av lösningsmedel. 9100 g natriumsalt av heparin er-

Claims (9)

10 l5 25 35 447 872 17 hâlles, vars innehåll av mineralsalter är mindre än 0,5% och vars innehåll av oxalat är mindre än 20 ppm. Det av denna fraktion er- hållna utbytet är 90,43%. Titern hos det tillvaratagna är 157 IU/mg. Koncentrationen av oxalatjonerna i de renade heparinerna be- stämdes efter extraktion genom förfarandet enligt J.R. Helbert och M.A. Marini, Biochem. J. (L963) 2 (5) sid. ll0l-6, med den modifikationen att i nämnda hepariner närvarande oxalatjoner ex- traherades i närvaro av överskott natriumkarbonat före adsorption på [RA ÄO0-anjonharts, vars användning rekommenderats av författar- na. Efter eluering från hartset bestämdes oxalatjonerna enligt den fluorometriska metoden enligt P.M. Zarembski och A. Hodgkinson, Plochem.J. (1965) 96, 717-721). ggrrtrrrknAv

1. Förfarande för framställning av ett mctallsalt av hepa- rin av injicerbar kvalitet, vari åtminstone en del av metallen är kalcium, k ä n n e t e c k n a t därav, att man - i ett första steg blandar ett ursprungligt heparinsalt av en metall, vars oxalater är vattenlösliga, vilket heparin- innefattande vattenlöslíga utfällningsmedel i en vatten- selektiv utfällning av hepa- Süil lHUChÖ1lCT Syrasalter oxalater, med ett non-joniskt lösning i en mängd som medför rinsaltet från nämnda lösning under det att mineralsalterna innefattande oxalaterna kvarstannar i lösning, och tillvara- tar det utfällda saltet av heparin, varvid detta första steg upprepas till dess att ett renat heparinsalt innehållande högst ca 70 ppm oxalat tillvaratas, och - i ett andra steg bringar nämnda renade heparinsalt i kon- takt med ett kalciumsalt för att utbyta åtminstone en del av den metall som ingår i det ursprungliga heparinsaltet mot kalcium.

2. Förfarande enligt krav 1, därav, att heparinet i utgångslösningen föreligger i form av ett natríumheparinat och innehåller från 40 till 250 g/l av heparin av 500 till 30 000 IE/ml.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, n a t därav, att lösningens pH justeras till ett värde översti- gande 3,S, företrädesvis frän 5 till 7, och att utfällníngen fö- reträdesvis utföres under användning av från 0,5 till 1,5 voly- k ä n n e t e c k n a t k ä n n e t e c k- l0 15 30 35 447 872 N *mer etanol per en volym heparinlösning.

4. Förfarande enligt något av krav 1-3, k ä n n e t e c k- n a t därav, att vattenlösníngen innehåller minst ett salt med en tvåvärd anjon och en metall, vars oxalat är vattenlösligt, såsom ett karbonat, företrädesvis natríumkarbonat, lämpligen i en mängd varierande från 0,3 till 2,5, speciellt cirka 0,S% med avseende på heparinet.

5. Förfarande enligt krav 4, därav, att nämnda salter även innehaller salter med envärda anjoner, såsom en klorid av minst en metall, såsom natrium, vars oralat är vattenlösligt, varvid koncentrationen av nämnda salt med en envärd anjon i nämnda vattenlösning företrädesvis vari- erar från 1 till 7%, speciellt 2,5 viktprocent per volym lös- k ä n n e t e c k n a t ning.

6. Metallsalt av heparin av injicerbar kvalitet, vari åtminstone en del av metallen utgöres av kalcium, med en halt oxalatjoner som är tillräckligt låg för att förhindra utfäll- ning och bildning av avsättningar efter en lagringstid av flera mänader, varvid nämnda halt lämpligen är mindre än 70 ppm, före- trädesvis mindre än 30 och i synnerhet mindre än till och med 20 ppm.

7. Metallsalt av heparin enligt krav 6, k ä n n e- t e c k n a t därav, att det innehåller mindre än 0,5, före- trädesvis mindre än 0,3% 5yra5a1ter_

8. Metallsalt av heparin enligt krav 6 eller 7, n e t e c k n a t därav, att det har en aktivitet av minst 120, företrädesvis minst 150 IE/mg.

9. Metallsalt av heparin enligt något av kraven 6-8, i form av en koncentrerad lösning, som innehåller från cirka 1000 IE/ml till cirka 35 000 IE/ml heparin, och som är lämplig för injícering subkutant eller intravenöst. k ä n- 'ä S