SA112340162B1 - جزء منشأ وطريقة لمعزز النبات ubi1 التصنيعي ثنائي الاتجاه - Google Patents
جزء منشأ وطريقة لمعزز النبات ubi1 التصنيعي ثنائي الاتجاه Download PDFInfo
- Publication number
- SA112340162B1 SA112340162B1 SA112340162A SA112340162A SA112340162B1 SA 112340162 B1 SA112340162 B1 SA 112340162B1 SA 112340162 A SA112340162 A SA 112340162A SA 112340162 A SA112340162 A SA 112340162A SA 112340162 B1 SA112340162 B1 SA 112340162B1
- Authority
- SA
- Saudi Arabia
- Prior art keywords
- sequence
- gene
- lah
- mother
- yah
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 title description 135
- 101100036900 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPL40A gene Proteins 0.000 title 1
- 101150106669 UBI1 gene Proteins 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 401
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 197
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 82
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 77
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 77
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 75
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 75
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 75
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 claims description 41
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 25
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 25
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 19
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 claims description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 14
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 12
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 9
- 241000746970 Zea luxurians Species 0.000 claims description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 7
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 claims description 5
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims description 5
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- -1 where A man Chemical compound 0.000 claims description 5
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims 8
- 102100035717 Serine racemase Human genes 0.000 claims 5
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 claims 4
- 101100536354 Drosophila melanogaster tant gene Proteins 0.000 claims 4
- 241000282838 Lama Species 0.000 claims 4
- BGRDGMRNKXEXQD-UHFFFAOYSA-N Maleic hydrazide Chemical compound OC1=CC=C(O)N=N1 BGRDGMRNKXEXQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 244000275904 brauner Senf Species 0.000 claims 4
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 claims 4
- 102100035709 Acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic Human genes 0.000 claims 3
- 241001093575 Alma Species 0.000 claims 3
- 101000783232 Homo sapiens Acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic Proteins 0.000 claims 3
- 102100023231 Lysosomal alpha-mannosidase Human genes 0.000 claims 3
- 108091008717 AR-A Proteins 0.000 claims 2
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- KMKBEESNZAPKMP-UHFFFAOYSA-N Biphenylindanone a Chemical compound CC=1C(C)=C2C(=O)C(C3CCCC3)CC2=CC=1OCC(C=1)=CC=CC=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 KMKBEESNZAPKMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 claims 2
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 claims 2
- 241000764773 Inna Species 0.000 claims 2
- 241000567769 Isurus oxyrinchus Species 0.000 claims 2
- 229930186657 Lat Natural products 0.000 claims 2
- 229940110339 Long-acting muscarinic antagonist Drugs 0.000 claims 2
- 101100380295 Mus musculus Asah1 gene Proteins 0.000 claims 2
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 claims 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910019567 Re Re Inorganic materials 0.000 claims 2
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 claims 2
- KZENBFUSKMWCJF-UHFFFAOYSA-N [5-[5-[5-(hydroxymethyl)-2-thiophenyl]-2-furanyl]-2-thiophenyl]methanol Chemical compound S1C(CO)=CC=C1C1=CC=C(C=2SC(CO)=CC=2)O1 KZENBFUSKMWCJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims 2
- 108010012864 alpha-Mannosidase Proteins 0.000 claims 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims 2
- 229940096118 ella Drugs 0.000 claims 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 claims 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims 2
- 235000015108 pies Nutrition 0.000 claims 2
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 claims 2
- 108091007551 scavenger receptor class L Proteins 0.000 claims 2
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 claims 2
- MBYLVOKEDDQJDY-UHFFFAOYSA-N tris(2-aminoethyl)amine Chemical compound NCCN(CCN)CCN MBYLVOKEDDQJDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 claims 2
- ABYZSYDGJGVCHS-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-acetamido-n-(4-nitrophenyl)propanamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 ABYZSYDGJGVCHS-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims 1
- DMJXRYSGXCLCFP-LBPRGKRZSA-N (3s)-n-tert-butyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2CN[C@H](C(=O)NC(C)(C)C)CC2=C1 DMJXRYSGXCLCFP-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims 1
- WRRSFOZOETZUPG-FFHNEAJVSA-N (4r,4ar,7s,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-2,4,4a,7,7a,13-hexahydro-1h-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-ol;hydrate Chemical compound O.C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC WRRSFOZOETZUPG-FFHNEAJVSA-N 0.000 claims 1
- CWPWAQJHDDRCKP-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trimethyl-2-(2,4,6-trimethylphenyl)benzene Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1C1=C(C)C=C(C)C=C1C CWPWAQJHDDRCKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 claims 1
- PIGCSKVALLVWKU-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoacridone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC(N)=CC=C3NC2=C1 PIGCSKVALLVWKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- KRQUFUKTQHISJB-YYADALCUSA-N 2-[(E)-N-[2-(4-chlorophenoxy)propoxy]-C-propylcarbonimidoyl]-3-hydroxy-5-(thian-3-yl)cyclohex-2-en-1-one Chemical compound CCC\C(=N/OCC(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1)C1=C(O)CC(CC1=O)C1CCCSC1 KRQUFUKTQHISJB-YYADALCUSA-N 0.000 claims 1
- HNWFFTUWRIGBNM-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-9,10-dinaphthalen-2-ylanthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C3=C4C=CC=CC4=C(C=4C=C5C=CC=CC5=CC=4)C4=CC=C(C=C43)C)=CC=C21 HNWFFTUWRIGBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 4-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=NC=C1 NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101150011812 AADAC gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150082527 ALAD gene Proteins 0.000 claims 1
- 229920001621 AMOLED Polymers 0.000 claims 1
- 241001103870 Adia Species 0.000 claims 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 1
- 102100034112 Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase, peroxisomal Human genes 0.000 claims 1
- 241000024192 Aloa Species 0.000 claims 1
- 241001116389 Aloe Species 0.000 claims 1
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 claims 1
- 241001230014 Amana <moth> Species 0.000 claims 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 241000272522 Anas Species 0.000 claims 1
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 claims 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 claims 1
- MVVPIAAVGAWJNQ-DOFZRALJSA-N Arachidonoyl dopamine Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 MVVPIAAVGAWJNQ-DOFZRALJSA-N 0.000 claims 1
- 241001424309 Arita Species 0.000 claims 1
- 102100030907 Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator Human genes 0.000 claims 1
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 claims 1
- 241000726103 Atta Species 0.000 claims 1
- 241000963790 Beilschmiedia tawa Species 0.000 claims 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 claims 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 1
- 241001086826 Branta bernicla Species 0.000 claims 1
- 208000032325 CEBPE-associated autoinflammation-immunodeficiency-neutrophil dysfunction syndrome Diseases 0.000 claims 1
- 101000690445 Caenorhabditis elegans Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator homolog Proteins 0.000 claims 1
- 101100001642 Caenorhabditis elegans amt-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100256916 Caenorhabditis elegans sid-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000345998 Calamus manan Species 0.000 claims 1
- 241000272173 Calidris Species 0.000 claims 1
- 241001426544 Calma Species 0.000 claims 1
- AQFATIOBERWBDY-LNQSNDDKSA-N Carboxyatractyloside Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](OC(=O)CC(C)C)[C@@H]1O[C@@H]1CC(C(O)=O)(C(O)=O)[C@H]2CC[C@@]3([C@@H](O)C4=C)C[C@H]4CC[C@H]3[C@]2(C)C1 AQFATIOBERWBDY-LNQSNDDKSA-N 0.000 claims 1
- 240000007681 Catha edulis Species 0.000 claims 1
- 235000006696 Catha edulis Nutrition 0.000 claims 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 claims 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 claims 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 claims 1
- 241000573484 Copsychus Species 0.000 claims 1
- 241001137251 Corvidae Species 0.000 claims 1
- 102000017914 EDNRA Human genes 0.000 claims 1
- 101150062404 EDNRA gene Proteins 0.000 claims 1
- 101000867205 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin ST-2 Proteins 0.000 claims 1
- 241000238558 Eucarida Species 0.000 claims 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims 1
- OOFLZRMKTMLSMH-UHFFFAOYSA-N H4atta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC1=CC=CC(C=2N=C(C=C(C=2)C=2C3=CC=CC=C3C=C3C=CC=CC3=2)C=2N=C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)C=CC=2)=N1 OOFLZRMKTMLSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102100039981 Hairy and enhancer of split-related protein HELT Human genes 0.000 claims 1
- 241000026407 Haya Species 0.000 claims 1
- 244000301682 Heliotropium curassavicum Species 0.000 claims 1
- 235000015854 Heliotropium curassavicum Nutrition 0.000 claims 1
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 claims 1
- 101000799143 Homo sapiens Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase, peroxisomal Proteins 0.000 claims 1
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 claims 1
- 101000793115 Homo sapiens Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator Proteins 0.000 claims 1
- 101001034987 Homo sapiens Hairy and enhancer of split-related protein HELT Proteins 0.000 claims 1
- 101001091379 Homo sapiens Kallikrein-5 Proteins 0.000 claims 1
- 101000685982 Homo sapiens NAD(+) hydrolase SARM1 Proteins 0.000 claims 1
- 101001121964 Homo sapiens OCIA domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101001072091 Homo sapiens ProSAAS Proteins 0.000 claims 1
- 101000880310 Homo sapiens SH3 and cysteine-rich domain-containing protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000637792 Homo sapiens Solute carrier family 35 member G5 Proteins 0.000 claims 1
- 101000837626 Homo sapiens Thyroid hormone receptor alpha Proteins 0.000 claims 1
- 108010007666 IMP cyclohydrolase Proteins 0.000 claims 1
- 102100020796 Inosine 5'-monophosphate cyclohydrolase Human genes 0.000 claims 1
- 241001058354 Inti Species 0.000 claims 1
- 102100034868 Kallikrein-5 Human genes 0.000 claims 1
- 241000102542 Kara Species 0.000 claims 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 claims 1
- 240000002262 Litsea cubeba Species 0.000 claims 1
- 241000531897 Loma Species 0.000 claims 1
- 241000985630 Lota lota Species 0.000 claims 1
- 101710135169 Lysosomal alpha-mannosidase Proteins 0.000 claims 1
- 241001036331 Maira Species 0.000 claims 1
- 101100007427 Manduca sexta COVA gene Proteins 0.000 claims 1
- 241001440178 Massala Species 0.000 claims 1
- 241000063973 Mattia Species 0.000 claims 1
- 101100005318 Mus musculus Ctsr gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100011511 Mus musculus Elovl6 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100504379 Mus musculus Gfral gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100042271 Mus musculus Sema3b gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100205847 Mus musculus Srst gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims 1
- 244000234179 Myrtus ugni Species 0.000 claims 1
- 235000012093 Myrtus ugni Nutrition 0.000 claims 1
- 102100023356 NAD(+) hydrolase SARM1 Human genes 0.000 claims 1
- 101800001775 Nuclear inclusion protein A Proteins 0.000 claims 1
- 102100027183 OCIA domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- GFRROZIJVHUSKZ-FXGMSQOLSA-N OS I Natural products C[C@@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CO)[C@@H]2NC(=O)C)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GFRROZIJVHUSKZ-FXGMSQOLSA-N 0.000 claims 1
- 206010030924 Optic ischaemic neuropathy Diseases 0.000 claims 1
- 101001036171 Paenibacillus lautus Endoglucanase A Proteins 0.000 claims 1
- 101100271190 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) ATAT gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 claims 1
- 241000036848 Porzana carolina Species 0.000 claims 1
- 102100036366 ProSAAS Human genes 0.000 claims 1
- 241000269435 Rana <genus> Species 0.000 claims 1
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 claims 1
- 102100035729 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Human genes 0.000 claims 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 claims 1
- 244000117054 Rungia klossii Species 0.000 claims 1
- 235000002492 Rungia klossii Nutrition 0.000 claims 1
- 102100037646 SH3 and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 claims 1
- 101150101866 SRR gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000405965 Scomberomorus brasiliensis Species 0.000 claims 1
- 101710150104 Sensory rhodopsin-1 Proteins 0.000 claims 1
- 241000238370 Sepia Species 0.000 claims 1
- 244000191761 Sida cordifolia Species 0.000 claims 1
- 206010041235 Snoring Diseases 0.000 claims 1
- 102100032019 Solute carrier family 35 member G5 Human genes 0.000 claims 1
- 101000720079 Stichodactyla helianthus DELTA-stichotoxin-She4a Proteins 0.000 claims 1
- UZHDGDDPOPDJGM-UHFFFAOYSA-N Stigmatellin A Natural products COC1=CC(OC)=C2C(=O)C(C)=C(CCC(C)C(OC)C(C)C(C=CC=CC(C)=CC)OC)OC2=C1O UZHDGDDPOPDJGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241001080061 Talides Species 0.000 claims 1
- 241000736878 Tamias Species 0.000 claims 1
- 241000375392 Tana Species 0.000 claims 1
- 102100028702 Thyroid hormone receptor alpha Human genes 0.000 claims 1
- SGPGESCZOCHFCL-UHFFFAOYSA-N Tilisolol hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C(=O)N(C)C=C(OCC(O)C[NH2+]C(C)(C)C)C2=C1 SGPGESCZOCHFCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims 1
- 241001377894 Trias Species 0.000 claims 1
- 241000876472 Umma Species 0.000 claims 1
- 101000959121 Xenopus laevis Peptidyl-alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyase A Proteins 0.000 claims 1
- UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N acibenzolar-S-methyl Chemical compound CSC(=O)C1=CC=CC2=C1SN=N2 UELITFHSCLAHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000011399 aloe vera Nutrition 0.000 claims 1
- 229940060585 alora Drugs 0.000 claims 1
- 229940077927 altace Drugs 0.000 claims 1
- QSIYTPCKNAPAJY-UHFFFAOYSA-N aluminum;ethoxy-oxido-oxophosphanium;2-(trichloromethylsulfanyl)isoindole-1,3-dione Chemical compound [Al+3].CCO[P+]([O-])=O.CCO[P+]([O-])=O.CCO[P+]([O-])=O.C1=CC=C2C(=O)N(SC(Cl)(Cl)Cl)C(=O)C2=C1 QSIYTPCKNAPAJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000848 angular dependent Auger electron spectroscopy Methods 0.000 claims 1
- 238000001210 attenuated total reflectance infrared spectroscopy Methods 0.000 claims 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims 1
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims 1
- BPOZNMOEPOHHSC-UHFFFAOYSA-N butyl prop-2-enoate;prop-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)C=C.CCCCOC(=O)C=C BPOZNMOEPOHHSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N ***e Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 claims 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 1
- 235000021438 curry Nutrition 0.000 claims 1
- 230000034994 death Effects 0.000 claims 1
- JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N diethyl 2-[(dimethoxyphosphorothioyl)thio]succinate Chemical compound CCOC(=O)CC(SP(=S)(OC)OC)C(=O)OCC JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SHQNGLYXRFCPGZ-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-(2-amino-1,3-thiazol-4-yl)acetate Chemical compound CCOC(=O)CC1=CSC(N)=N1 SHQNGLYXRFCPGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 claims 1
- RZTAMFZIAATZDJ-UHFFFAOYSA-N felodipine Chemical compound CCOC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC(Cl)=C1Cl RZTAMFZIAATZDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 claims 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims 1
- ZEKANFGSDXODPD-UHFFFAOYSA-N glyphosate-isopropylammonium Chemical compound CC(C)N.OC(=O)CNCP(O)(O)=O ZEKANFGSDXODPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002721 intensity-modulated radiation therapy Methods 0.000 claims 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 claims 1
- 230000009191 jumping Effects 0.000 claims 1
- XBMIVRRWGCYBTQ-AVRDEDQJSA-N levacetylmethadol Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C[C@H](C)N(C)C)([C@@H](OC(C)=O)CC)C1=CC=CC=C1 XBMIVRRWGCYBTQ-AVRDEDQJSA-N 0.000 claims 1
- SQEHCNOBYLQFTG-UHFFFAOYSA-M lithium;thiophene-2-carboxylate Chemical compound [Li+].[O-]C(=O)C1=CC=CS1 SQEHCNOBYLQFTG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000003202 long acting thyroid stimulator Substances 0.000 claims 1
- 208000020588 necrotizing soft tissue infection Diseases 0.000 claims 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000675 plasmon resonance energy transfer Methods 0.000 claims 1
- LFULEKSKNZEWOE-UHFFFAOYSA-N propanil Chemical compound CCC(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 LFULEKSKNZEWOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000020079 raki Nutrition 0.000 claims 1
- HDACQVRGBOVJII-JBDAPHQKSA-N ramipril Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](C[C@@H]2CCC[C@@H]21)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HDACQVRGBOVJII-JBDAPHQKSA-N 0.000 claims 1
- 235000012950 rattan cane Nutrition 0.000 claims 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims 1
- 239000000849 selective androgen receptor modulator Substances 0.000 claims 1
- OUFRIWNNMFWZTM-UHFFFAOYSA-M sodium arsanilate Chemical compound [Na+].NC1=CC=C([As](O)([O-])=O)C=C1 OUFRIWNNMFWZTM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- GFWRVVCDTLRWPK-KPKJPENVSA-N sofalcone Chemical compound C1=CC(OCC=C(C)C)=CC=C1\C=C\C(=O)C1=CC=C(OCC=C(C)C)C=C1OCC(O)=O GFWRVVCDTLRWPK-KPKJPENVSA-N 0.000 claims 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 claims 1
- ONDYALNGTUAJDX-UHFFFAOYSA-N tasquinimod Chemical compound OC=1C=2C(OC)=CC=CC=2N(C)C(=O)C=1C(=O)N(C)C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 ONDYALNGTUAJDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101150075675 tatC gene Proteins 0.000 claims 1
- 229940081330 tena Drugs 0.000 claims 1
- CMJCEVKJYRZMIA-UHFFFAOYSA-M thallium(i) iodide Chemical compound [Tl]I CMJCEVKJYRZMIA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 claims 1
- VLCQZHSMCYCDJL-UHFFFAOYSA-N tribenuron methyl Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1S(=O)(=O)NC(=O)N(C)C1=NC(C)=NC(OC)=N1 VLCQZHSMCYCDJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims 1
- CZPRKINNVBONSF-UHFFFAOYSA-M zinc;dioxido(oxo)phosphanium Chemical compound [Zn+2].[O-][P+]([O-])=O CZPRKINNVBONSF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 235
- 101500015412 Zea mays Ubiquitin Proteins 0.000 abstract description 6
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 143
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 106
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 106
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 77
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 69
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 64
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 46
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 45
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 43
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 42
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 38
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 36
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 33
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 27
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 24
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 24
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 22
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 22
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 22
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 21
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 20
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 16
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 16
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 15
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 14
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 14
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 14
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 14
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 14
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 14
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 13
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 12
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 11
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 11
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 11
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 10
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 10
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 10
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 9
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 9
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 9
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 8
- 108700011325 Modifier Genes Proteins 0.000 description 8
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 8
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 8
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 8
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 8
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 8
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 8
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 7
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 6
- 101100478623 Arabidopsis thaliana S-ACP-DES1 gene Proteins 0.000 description 6
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 6
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 6
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 6
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 6
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Chemical group 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 5
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 5
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 5
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 5
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 5
- 101150003560 trfA gene Proteins 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 102100027328 2-hydroxyacyl-CoA lyase 2 Human genes 0.000 description 4
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710103719 Acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 4
- 101710182467 Acetolactate synthase large subunit IlvB1 Proteins 0.000 description 4
- 101710171176 Acetolactate synthase large subunit IlvG Proteins 0.000 description 4
- 101710176702 Acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 4
- 101710147947 Acetolactate synthase small subunit 1, chloroplastic Proteins 0.000 description 4
- 101710095712 Acetolactate synthase, mitochondrial Proteins 0.000 description 4
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 4
- 101100043725 Mus musculus Strbp gene Proteins 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 101710096655 Probable acetoacetate decarboxylase 1 Proteins 0.000 description 4
- 101710196435 Probable acetolactate synthase large subunit Proteins 0.000 description 4
- 101710181764 Probable acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 101710104000 Putative acetolactate synthase small subunit Proteins 0.000 description 4
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 4
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 4
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 101150075980 psbA gene Proteins 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 2-(4-{[3-chloro-5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy}phenoxy)propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC=C(C(F)(F)F)C=C1Cl GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical class O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 3
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 3
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 3
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 3
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 3
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 3
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 3
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 3
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 3
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 3
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 3
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 3
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 3
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 3
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 3
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150113864 pat gene Proteins 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012033 transcriptional gene silencing Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940087195 2,4-dichlorophenoxyacetate Drugs 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 2
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000104 Actin-related protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 2
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 2
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 2
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 2
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 108090000121 Aromatic-L-amino-acid decarboxylases Proteins 0.000 description 2
- 102000003823 Aromatic-L-amino-acid decarboxylases Human genes 0.000 description 2
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 2
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 2
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 2
- 241001301148 Brassica rapa subsp. oleifera Species 0.000 description 2
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 2
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 2
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 description 2
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 2
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 2
- 241000219130 Cucurbita pepo subsp. pepo Species 0.000 description 2
- 235000003954 Cucurbita pepo var melopepo Nutrition 0.000 description 2
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 2
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 2
- 102100039246 Elongator complex protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710167754 Elongator complex protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 2
- 101100508818 Mus musculus Inpp5k gene Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 2
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 2
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 2
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 2
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100366438 Rattus norvegicus Sphkap gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 2
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000019113 chromatin silencing Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 2
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 2
- PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N (+)-catechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC=C(O)C(O)=C1 PFTAWBLQPZVEMU-DZGCQCFKSA-N 0.000 description 1
- NDUPDOJHUQKPAG-UHFFFAOYSA-M 2,2-Dichloropropanoate Chemical compound CC(Cl)(Cl)C([O-])=O NDUPDOJHUQKPAG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010041188 2,4-dichlorophenoxyacetic acid monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- YUVKUEAFAVKILW-UHFFFAOYSA-N 2-(4-{[5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy}phenoxy)propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=N1 YUVKUEAFAVKILW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOLBCHYXZDXLDS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2,4-dichlorophenoxy)phenoxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OOLBCHYXZDXLDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KKADPXVIOXHVKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- SUDBRAWXUGTELR-HPFNVAMJSA-N 5-[[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OCC1=CNC(=O)NC1=O SUDBRAWXUGTELR-HPFNVAMJSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101000768857 Arabidopsis thaliana 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 1
- 102100023245 Asparagine-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- 101150040772 CALY gene Proteins 0.000 description 1
- QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N COP(O)=O Chemical class COP(O)=O QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100309447 Caenorhabditis elegans sad-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000010773 Cajanus indicus Nutrition 0.000 description 1
- 244000105627 Cajanus indicus Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 235000005633 Chrysanthemum balsamita Nutrition 0.000 description 1
- 244000260524 Chrysanthemum balsamita Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000219122 Cucurbita Species 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 239000005506 Diclofop Substances 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108700016256 Dihydropteroate synthases Proteins 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010074122 Ferredoxins Proteins 0.000 description 1
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 241001547860 Gaya Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010003774 Histidinol-phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101000624939 Homo sapiens Asparagine-tRNA ligase, cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101000642671 Homo sapiens Spermatid perinuclear RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- 241001492622 Katha Species 0.000 description 1
- 201000010743 Lambert-Eaton myasthenic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001103596 Lelia Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000005578 Mesotrione Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 241000549556 Nanos Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101150010952 OAT gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 101150025612 POLL gene Proteins 0.000 description 1
- 241001520808 Panicum virgatum Species 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101100056487 Petunia hybrida EPSPS gene Proteins 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241001417958 Phialidium Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 241000985694 Polypodiopsida Species 0.000 description 1
- 206010062519 Poor quality sleep Diseases 0.000 description 1
- 241000722195 Potamogeton Species 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 244000081426 Ranunculus ficaria Species 0.000 description 1
- 235000002226 Ranunculus ficaria Nutrition 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 102100035935 Spermatid perinuclear RNA-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000005618 Sulcotrione Substances 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 102000012883 Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member 14 Human genes 0.000 description 1
- 108010065158 Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member 14 Proteins 0.000 description 1
- 240000000260 Typha latifolia Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100020289 Xenopus laevis koza gene Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFYBTHCYPKEDQQ-UHFFFAOYSA-N [2,3-dihydroxy-3-(1h-imidazol-5-yl)propyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C1=CN=CN1 HFYBTHCYPKEDQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037007 arousal Effects 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019519 canola oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 235000013709 carrot oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N cyclohexane-1,2-dione Chemical class O=C1CCCCC1=O OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N isoxazole Chemical compound C=1C=NOC=1 CTAPFRYPJLPFDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 1
- KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N mesotrione Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O KPUREKXXPHOJQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- SLCVBVWXLSEKPL-UHFFFAOYSA-N neopentyl glycol Chemical compound OCC(C)(C)CO SLCVBVWXLSEKPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000021232 nutrient availability Nutrition 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000006887 os medium Substances 0.000 description 1
- 208000025661 ovarian cyst Diseases 0.000 description 1
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 1
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- GPKJTRJOBQGKQK-UHFFFAOYSA-N quinacrine Chemical compound C1=C(OC)C=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=C(C=CC(Cl)=C3)C3=NC2=C1 GPKJTRJOBQGKQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000005562 seed maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 101150076304 spp gene Proteins 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- PQTBTIFWAXVEPB-UHFFFAOYSA-N sulcotrione Chemical compound ClC1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C(=O)C1C(=O)CCCC1=O PQTBTIFWAXVEPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
يتعلق الاختراع بتقديم تركيبات constructs وطرق methods للتعبير الجيني expressing لجينات genes متعددة لخلايا نبات plant cells و/ أو أنسجة النبات plant tissues. تشتمل التركيبات المقدمة على معزز ثنائي الاتجاه bi directional promoter على الأقل متصل بمجموعات تعبير جيني expression cassettes للجين gene متعددة. في بعض التجسيمات، تستخدم التركيبات والطرق المقدمة معزز ثنائي الاتجاه يعتمد على عنصر معزز أساسي أدنى minimal core promoter element من جين يوبيكويتين-1 Ubiquitin-1 للذرة الشامية Zea mays، أو مكافئ وظيفي منه. في بعض التجسيمات، تسمح التركيبات والطرق المقدمة بالتعبير الجيني لجينات genes بين ثلاثة وعشرون. شكل 2
Description
— \ — جزء Line وطريقة لمعزز النبات 811ل التصنيعي ثنائي الاتجاه Construct and method for synthetic bidirectional plant promoter 1 الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق الاختراع عامة بمجال field البيولوجيا الجزيئية للنبات plant molecular biology « وبخاصة أكثر Jae التعبير الثابت للجينات genes المتعددة في النباتات المعدلة وراثياً transgenic plants 0 تعد كثير من أنواع النباتات plant species قادرة على أن تتحول بجينات التحوير من أنواع أخرى لتدخل صفات مرغوبة محصولياً أو خصائص؛ على سبيل المثال؛ تحسين نوعية القيمة الغذائية nutritional value quality » أو زيادة الغلة increasing yield « أو نقل الآفات conferring pest أو مقاومة الأمراض disease resistance « أو زيادة الجفاف increasing drought وتحمل الضغط stress tolerance أو تحسين الصفات ٠ البستانية horticultural qualities (مثل الصبغ «(growth ally pigmentation أو إضفاء 9 القدرة على مقاومة مبيدات الأعشاب herbicide resistance « أو أن تكون لها القدرة على إنتاج مركبات مفيدة صناعياً و/ أو مواد 013181215 من النبات 01801 و/ أو أن تكون لها القدرة على إنتاج المركبات الصيدلية pharmaceuticals يمكن لإدخال الجينات المتحورة وراثياً إلى خلايا النبات plant cells والاستخلاص التالي للنباتات المخصبة المعدلة وراثياً fertile transgenic plants Yo التي تحتوي على نسخة متكاملة integrated copy بشكل ثابت لجين التحوير transgene وراثياً أن تستخدم في إنتاج نباتات معدلة وراثياً والتي تمتلك الصفات المرغوبة. يمكن أن يحدث التحكم والتنظيم 8901811017" لتعبير الجين gene expression من خلال طرق متعددة. ويُعد بدء النسخ Transcription initiation للجين طريقة تحكم سائدة لتعبير الجين. ويتم Yo التحكم عامة في بدء النسخ بواسطة تتابعات البولي نيوكليوتيد polynucleotide الواقعة في ال '5- المتاخمة flanking -'5 أو المنطقة فى عكس الاتجاه upstream region للجين المراد ملا
ا
نسخه Jtranscribed gene وتشير هذه التتابعات مجتمعة إلى كونها كمعززات promoters وتحتوي المعززات عامة على إشارات RNAL signals بوليميراز polymerase لبدء النسخ ولذلك يمكن أن يتكون RNAY الناقل (MRNA) messenger ويتم ترجمة MRNA الناضج daily Mature الريبوسوم ribosome ؛ وبالتالي تخليق البروتينات synthesizing proteins © وتتفاعل البروتينات المرتبطة DNA, binding proteins بشكل خاص مع تتابعات DNA المعززة لتعزز تكوين معقد النسخ transcriptional complex وتقوم ببدء عملية التعبير الجيني .gene expression process وهناك معززات مختلفة حقيقية النواة eukaryotic 635 منفصلة ومتصفة عن النباتات التي تعد وظيفية لتدفع بالتعبير للجينات المتحورة وراثياً في النباتات. ويتم فصل ووصف المعززات التي تؤثر على تعبير الجين كرد فعل على ٠ المؤثرات البيئية environmental stimuli « أو إتاحة المواد الغذائية nutrient availability « أو الظروف المضادة adverse conditions والتي تشمل الصدمة الحرارية heat shock ؛ أو اللاهوائية anaerobiosis ؛ أو وجود معادن ثقيلة heavy metals وهناك أيضاً المعززات التي تتحكم في تعبير الجين أثناء التطور أو في نسيج tissue أو عضو 02980 معين. بالإضافة إلى انه يتم فصل ووصف معززات بدائيات النواة prokaryotic promoters المعزولة من البكتيريا
bacteria vo والفيروسات virus التي تعد وظيفية للدفع بتعبير الجين المتحور وراثياً في النباتات. ويتكون معزز حقيقيات النواة eukaryotic promoter النموذجي من معزز أدنى minimal promoter وعناصر_سيس .Cis-elements ويُعد المعزز الأدنى هو في الأساس منطقة صندوق TATA box region حيث Lay ترتبط RNA بوليميراز o(POlll) ١١ وبروتين الارتباط TATA, binding protein (180)؛ والعوامل المرتبطة TBP. associated factors (TAFS) ٠ لبدء النسخ. بالرغم من أنه في معظم الأمثلة يتطلب عناصر تتابع غير باعث Motif TATA للنسخ المضبوط. وقد وجد مثل هذه التتابع من العناصر (مثل؛ المحسنات (enhancers للتخلص من مستوى التعبير الكلي للجينات المجاورة؛ غالباً في طريقة manner لا تعتمد على الموضع position و/ أو الاتجاه orientation وربما تمد التتابعات الأخرى والتي بالقرب من مكان بدء النسخ transcription start site (مثل؛ تتابعات (INR لبعض جينات Poll بمكان Yo ارتباط بديل للعوامل التي تساهم أيضاً في النشاط النسخي transcriptional activation ؛ i>
ملا
وه أنها تمد بديلاً عن ذلك بأماكن ارتباط المعزز الأساسي core promoter للنسخ في المعززات التي تفتقد عناصر TATA الوظيفية. انظر Zenzie-Gregory et al. (1992) J.
Se .Biol.
Chem. 267: 2823-30 تشمل عناصر تنظيمية للجين gene regulatory elements أخرى على تتابعات التي تتفاعل © مع عوامل ارتباط DNA الخاصة. ويتم الإشارة لبواعث motifs التتابع تلك إلى عناصر سيس؛ وغالباً موضع وتوجه مستقل؛ بالرغم من أنه ربما يتم إيجاد '5 أو 3 إلى تتابع ترميز coding 3d sequence الجين؛ أو في إنترون intron . وربما تحدد Jie عناصر سيس» والتي يرتبط بها عوامل نسخ transcription factors خاصة بالنسيج أو خاصة بالتطوير؛ بصفة فردية أو في مجموعة؛ نمط التعبير الزماني المكاني spatiotemporal expression pattern للمعزز عند ٠ المستوى النسخي transcriptional level وبشكل نموذجي تؤسس ترتيب عناصر _ سيس الصاعدة والتالي لها من المعزز الأدنى القطبية promoter jd polarity خاص. وتعد المعززات في النباتات التي تم وضعها في مستعمرات cloned والمستخدمة بشكل واسع لكل من البحث الأساسي والتطبيق البيوتكنولوجي biotechnological application بصفة عامة أحادية الاتجاه Unidirectional ؛ موجهة فقط جين gene واحد الذي يتم دمجه عند نهايته 3 (أي؛ فى Vo نفس الاتجاه (downstream انظر على سبيل المثال Xie et al. (2001) Nat. .Biotechnol. 19(7):677-9; U.S.
Patent No. 6,388,170 وقد تم التعرف على العديد من عناصر سيس J) "تتابعات تنظيمية ضد الاتجاه upstream regulatory sequences ") في معززات النبات plant promoters وتختلف بشكل واسع عناصر سيس تلك في طريقة التحكم التي تنفذها على الجينات المرتبطة بإجراء العملية. وبعض ٠ العناصر تعمل على sab) النسخ للجينات المرتبطة بإجراء العملية كاستجابة response للاستجابات البيئية (Jie) environmental responses درجة الحرارة temperature « والرطوبة moisture « والإصابة (wounding وربما تستجيب عناصر سيس إلى الجدائل التطورية developmental cues (مثل؛ التجرثم germination ؛ ونضوج البذور seed maturation « والتزهر (flowering أو إلى معلومة مكانية spatial information (مثل؛ Yo خصوصية النسيج (tissue specificity انظر على سبيل المثال» Langridge et al. ملا
—o- وتُعد نوع التحكم لعناصر المعزز (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23 للمعزز بشكل نموذجي؛ أي يتم التعبير على الأرجح intrinsic quality الخاص ذا جودة ذاتية تحت التحكم لمثل هذه المعزز وفقاً للتحكم heterologous gene عن جين غير متجانس عنصر المعزز. وربما يتم التبديل لتلك Jie منها تم lly native gene للجينات الأصلية التعبير intrinsic control العناصر أيضاً بعناصر أخرى والحفاظ على قدرتهم بالتحكم الذاتى 5 الجيني. metabolic إنه من الضروري غالباً إدخال جينات متعددة في النباتات من أجل الهندسة الآيضية ؛ التي يتم التحكم فيها مراراً بمعززات متطابقة trait stacking وتجميع الصفات 9 على أساس التجانس gel GY أو متجانسة. _ بالرغم من أنه على الأرجح عندما تمتلك الجينات المتحورة Lam oN (HBGS) homology-based gene silencing ٠ تقوم بدفعهم. انظر على homologous promoters والتي تم إدخالها معززات متجانسة ays
HBGS وقد تم تسجيل .Mol et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:287-94 سبيل المثال
Vaucheret 800 أن تحدث بشكل كبير في النباتات المعدلة وراثياً. انظر على سبيل المثال وفقد تم اقتراح العديد من الآليات لشرح .29800 (2001) Trends Genet. 17:29-35 cellular وتشمل كل منها على الخاصية التي تحفز آليات تعرف خلوي (HBGSH ظاهرة Vo repeated genes التي تؤدي إلى إسكات الجينات المتكررة recognition mechanisms
Matzke and Matzke (1995) Plant لتتابع متجانس في المعزز. انظر على سبيل المثال
Physiol. 107:679-85; Meyer and Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol.
Plant Mol. Biol. 47:23-48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63;
Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-2; and Steimer etal. Y. .(2000) Plant Cell 12:1165-78 في النباتات المعدلة وراثياً مراراً على تطور المعززات HBGS وتشمل الاستراتيجيات لتجنب ال minimal sequence المخلقة الني تُعد مكافئة وظيفياً ولكن تمتلك التمائل الأدنى للتتابع لتعبر للجينات 57/016116 promoters وعندما يستخدم مثل تلك المعززات المخلقة .homology ؛ فربما تساعد في تجنب أو تقليل 11865. انظر crop plants المتحورة في نباتات المحاصيل Yo nq
Mourrain et al. (2007) Planta 225(2):365-79; Bhullar et al. على سبيل المثال ويمكن لهذه المعززات ان تتولد بإدخال عناصر .(2003) Plant Physiol. 132:988-98 سيس المعروفة في امتداد ال5/لا0 الجديد أو المُخلق؛ أو بديلاً عن ذلك بواسطة 'مبادلة النطاق يتم استبدال مجالات المعزز الواحد بمجالات مكافئة وظيفياً من dua .؛" domain swapping heterologous promoters المعززات الغير متجانسة الأخرى © للتعبير الجيني المستقر عن methods وطرق constructs بالتالي؛ تبقى هناك حاجة لتركيبات تمحورات وراثية متعددة بأدنى خطورة بشكل فعّال لناتج عودة الارتباط الجيني أو فقط تمحور وراثي أو الأجيال المتعددة في نباتات معدلة وراثياً. breeding dsl من خلال العام للاختراع ua olf إلى Ubil polar promoter قطبي Ubil ثم في هذه الوثيقة الكشف عن طرق لتحويل معزز ٠ ؛ بحيث يمكن لمعزز synthetic bidirectional promoters معززات ثنائية الاتجاه تخليقية توجيه جينين ترافق المعزز. في بعض التجسيمات؛ يمكن أن synthetic promoter تخليقي لتحويل معزز 011لا قطبي إلى معزز تخليقي ثنائي الاتجاه. على سبيل method تشتمل طريقة عنصر أدنى معزز nucleotide sequence المثال و بدون تقييد؛ على تعريف تتابع نيوكليوتيد يشتمل على تتابعي نيوكليوتيد nucleic acid ا لمعزز 1أطلا؛ و/ أو توفير حمض نووي _عنصر أدنى معزز 011لا موجهة في اتجاهات متقابلة. في Nucleotide sequences يشتمل حمض نيوكليوتيد على تتابعي نيوكليوتيد عنصر أدنى معزز of تجسيمات خاصة؛ يمكن بحيث تكون نهاية كل عنصر أدنى opposite directions موجهة في اتجاهات متقابلة 1 أدنى معزز عن نهاية element الأصلي المقابل أبعد من عنصر Ubi] معزز القريبة من جين متصلة بشكل عملي coding sequence حمض النيوكليوتيد التي تكون قريبة من تتابع ترميز Yo
Ubil في بعض الأمثلة؛ يتم فصل عنصر أدنى معزز promoter element بعنصر المعزز
Ubil من معزز Additional elements عن الذرة 0181268. يمكن تعديل عناصر إضافية 1أطلاء introns أصلي وراثياً ليتم تضمينها في معزز تخليقي ثنائي الاتجاه يشتمل على إنترونات upstream ضد الاتجاه jee 1أطلاء و/ أو كل أو جزء من منطقة exons إكسونات
—y—
Ubil promoter region .3 بعض ABN) يمكن أن يشتمل معزز تخليقي ثنائي الاتجاه على
أكثر من أي مما سبق.
يتم في هذه الوثيقة أيضاً الكشف عن أدنى معززات Ubi التي تكون مفيدة في تركيب
9 معززات تخليقية (على سبيل المثال؛ معززات تخليقية ثنائية الاتجاه)؛ و معززات تخليقية خاصة ناتجة بواسطة الطرق المذكورة. في بعض التجسيمات؛ يكون معزز تخليقي ثنائي
الاتجاه Ble عن معزز يكون قادر على التحكم في انتساخ transcription تتابع نيوكليوتيد
متصلة Tle في خلية نبات. على سبيل المثال» يمكن أن يكون معزز تخليقي ثنائي الاتجاه قادر
في تجسيمات خاصة على التحكم في الانتساخ في خلية نبات plant cell من تتابعي نيوكليوتيد
متصلة عملياً تجاور المعزز.
(plant cells خلايا نبات (JB سبيل Jo) WIA تشتمل تجسيمات خاصة من الاختراع على ٠ يمكن أن تشتمل التجسيمات (Jd) يتضمن معزز أدنى 811ل أو مكافئ وظيفي منه. على سبيل الخاصة على خلية تتضمن معزز تخليقي (على سبيل المثال معزز ثنائي الاتجاه تخليقي يتضمن معزز أدنى 811لا أو مكافئ وظيفي (Synthetic bidirectional promoter نبات وفقاً لتجسيمات خاصة في مزرعة WIA منه. يمكن أن توجد functional equivalent
whole أو كامل النبات [5 » plant part ؛ جزء نبات tissue ؛ نسيج cell culture خلية vo أو ثنائية الفلقة monocot بالتالي؛ يتم تضمين نباتات (على سبيل المثال؛ أحادية الفلقة .4 يتضمن خلية تتضمن معزز أدنى 811ل أو مكافئ وظيفي منه في بعض التجسيمات. (dicot لبداية الانتساخ بطريقة مستقلة الاتجاه. means تشتمل بعض تجسيمات الاختراع على وسائل .١ تشتمل وسائل لبداية الانتساخ بطريقة مستقلة الاتجاه على أدنى معزز 011لا بهوية تتابع رقم:
٠ تشتمل بعض تجسيمات من الاختراع على وسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام. تشتمل وسائل بداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام على معزز 511لا ثنائي الاتجاه التخليقي لهوية تتابع رقم: #. سوف تتضح الخواص المذكورة وخواص أخرى بشكل أكثر من الوصف المفصل التالي للتجسيمات المتعددة؛ التي تتعامل مع مراجع الأشكال الملحقة.
ملا
“A و/ أو 01301 cells يتم أيضاً تقديم تركيبات وطرق للتعبير الجيني عن جينات متعددة خلايا نبات تشتمل التركيبات المقدمة على معزز ثنائي الاتجاه على الأقل .018071 tissues النبات dal متصل بمجموعات تعبير جيني للجين متعددة. في بعض التجسيمات؛ تستخدم التركيبات والطرق minimal core promoter المقدمة معزز ثنائي الاتجاه يعتمد على عنصر معزز أساسي أدنى أو مكافئ وظيفي منه. في بعض التجسيمات؛ Zea mays Ubiquitin—1 من جين 81600801 ه٠ تسمح التركيبات وطرق المقدمة بالتعبير الجيني عن جينات بين ثلاثة وعشرون. معزز أساسي أدنى من جين pale في أحد السمات؛ يتم تقديم عديد النيوكليوتيد تخليقي يتضمن في أحد التجسيمات؛ يشتمل العنصر Zea luxurians أو Zea mays من Ubiquitin—1 9670 9665 المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد حيث تكون على الأقل أو تكملتها. في ١ مطابقة لهوية تتابع رقم: 96٠00 أو F090 966 PAS 68.2 967/5 ٠ تجسيم إضافي أو بديل؛ يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد في تجسيم إضافي؛ .39-١5و ١ منتقاة من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع أرقام: أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛ ١ يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على هوية تتابع رقم: أو تكملتها. في ١ يتكون العنصر المعزز الأساسي الأدنى بشكل أساسي من هوية تتابع رقم:
Ubiquitin—1 تجسيم آخر؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي مقدم أيضاً على إكسون من جين ١ وإنترون من جين 0190100-1لا. في تجسيم إضافي؛ يكون الإكسون أو الإنترون من جين
Zea luxurians J Zea mays من Ubiquitin—1 يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي أيضاً على تتابع تنظيمي ضد اتجاه الجين AT في تجسيم حيث يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه على تتابع عديد AT تجسيم 3.Ubiquitin-1 gene دلافىك يفك ددم 966 %90 أو (KY. النيوكليوتيد حيث تكون على الأقل د3فى ٠ مطابقة لهوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛ حيث يشتمل تتابع تنظيمي 0) ضد الاتجاه على هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛ حيث يتكون التتابع التنظيمي ضد الاتجاه بشكل أساسي من هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. على عنصر واحد على الأقل منتقى من Load في تجسيم آخر؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي «(URS) upstream regulatory sequence قائمة تتضمن تتابع تتظيمي ضد الاتجاه Yo م
عنصر محسّن enhancer element ؛ إكسون؛ إنترون؛ موقع بداية استنساخ» صندوق TATA وعنصر اتفاق صدمة الحرارة heat shock في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي أيضاً على تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بعنصر معزز أساسي أدنى. في تجسيم AT يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي أضاً على عنصر منتقى من المجموعة التي تشتمل ٠ .على تتابع تنظيمي ضد الاتجاه (88ا)؛ عنصر محسّن؛ إكسون؛ إنترون» موقع بداية استتساخ؛ صندوق (TATA عنصر اتفاق صدمة dal وتوليفات منها. في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي أيضاً على تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بالعنصر المعزز الأساسي الأدنى. في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي على عنصر معزز أساسي أدنى ثاني من Zea mays). أو Zea luxurians حيث يكون عنصري معزز أساسي أدنى في اتجاه تكامل عكسي reverse complimentary orientation بالنسبة لإحداهم الأخر في عديد النيوكليوتيد. في تجسيم AT أو بديل؛ يشتم عديد النيوكليوتيد التخليقي أيضاً على إكسون من جين Ubiquitin—1 وانترون من جين A.
Ubiquitin=1 تجسيم إضافي؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي على تتابع عديد النيوكليوتيد حيث تكون على الأقل YoYo (KV.
Yo .مك Yoho حمق P30 ١ أو 916900 مطابقة لهوية تتابع رقم: 9 أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide على هوية تتابع رقم: أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛ يتكون عديد النيوكليوتيد التخليقي بشكل أساسي من هوية تتابع رقم © أو تكملتها. في تجسيم AT أو بديل؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي Load على تتابع تنظيمي ضد الاتجاه من جين 0190100-1لا. في تجسيم آخرء حيث يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه على تتابع ٠ عديد النيوكليوتيد حيث تكون على الأقل YAS FAs Vo (KY. (Plo .61ت P30 أو 60٠ مطابقة لهوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم آخرء يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه على هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم AT يتكون تتابع تنظيمي ضد الاتجاه Jay أساسي من هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي الذي يتضمن عنصري معزز أساسي أدنى Lad Yo على عنصر واحد على الأقل منتقى من القائمة التي تتضمن تتابع تنظيم ضد الاتجاه ملا yam عنصر توافق صدمة حرارة» و (TATA إكسون؛ إنترون؛ موقع بداية انتساخ؛ صندوق (URS) ve أو بديل؛ يشتمل AT ترجمي. في تجسيم STOP و/ أو START نيوكليوتيد als النيوكليوتيد التخليقي الذي يتضمن عنصري معزز أساسي أدنى أيضاً على عنصر منتقى من إكسون؛ إنترون؛ موقع بداية (URS) المجموعة التي تشتمل على تتابع تنظيمي ضد الاتجاه « heat shock consensus element عنصر توافق صدمة حرارة TATA انتساخ؛ صندوق © يشتمل عديد AT ترجميء وتوليفات منها. في تجسيم STOP و/ أو START نيوكليوتيد als يتكون عديد النيوكليوتيد OAT النيوكليوتيد التخليقي على هوية تتابع رقم: © أو تكملتها. في تجسيم التخليقي بشكل أساسي من هوية تتابع رقم: © أو تكملتها. في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي على عنصري معزز أساسي أدنى تتضمن تتابع أول محل الاهتمام متصل عملياً بأحد عناصر معزز أساسي أدنى. في تجسيم آخرء aisles ٠ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي على تتابع نيوكليوتيد ثاني محل الاهتمام متصل عملياً بعنصر معزز أساسي أدنى الذي لا يكون متصلاً عملياً بتتابع النيوكليوتيد الأول محل الاهتمام. من UbiqUItin=1 في أحد تجسيمات عديد النيوكليوتيد التخليقي المقدم؛ يكون الإكسون من جين في أحد تجسيمات عديد النيوكليوتيد التخليقي المقدم؛ يكون الإكسون من جين .288 spp تجسيم آخرء يكون الإنترون من جين 4. Zea luxurians أو Zea mays _Ubiquitin-1 Yo من Ubiquitin—1 يكون الإنترون من جين « AT في تجسيم Zea spp Ubiquitin—1
Zea mays هو Zea يكون نوع «ay في تجسيم آخر أو .2698 luxurians أو Zea mays
Zea luxurians هو Zea يكون نوع ¢ AT في تجسيم تشتمل الطريقة على transgene cell يتم تقديم طريقة لإنتاج خلية جين تحوير og Al في سمة باستخدام عديد النيوكليوتيد التخليقي الموصوف في هذه transforming cell تحويل الخلية ٠ يتم تقديم خلية oA) الوثيقة. في أحد التجسيمات؛ تكون الخلية عبارة عن خلية نبات. في سمة نبات يتضمن عديد النيوكليوتيد التخليقي الموصوف في هذه الوثيقة. في سمة أخرى؛ يتم تقديم نبات يتضمن خلية نبات تشتمل على عديد النيوكليوتيد التخليقي الموصوف في هذه الوثيقة. م
-١١- في سمة أخرىء يتم تقديم طريقة للتعبير الجيني عن تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام في خلية نبات. تشتمل الطريقة على إدخال في خلية النبات تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي يتم تقديم طريقة للتعبير عن تتابع opal بوسائل لبداية استنساخ بطريقة مستقلة الاتجاه. في سمة نيوكليوتيد محل الاهتمام في خلية نبات. تشتمل الطريقة على إدخال خلية النبات بتتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام المتصلة بشكل عملي بوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي © تشتمل الطريقة المقدمة على إدخال في خلية النبات حمض نووي AT محل الاهتمام. في تجسيم يتضمن (أ) تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بالوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام؛ و(ب) تتابع نيوكليوتيد ثانية محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بالوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام. أو بديل؛ تشتمل الوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي AT في تجسيم أو بديل؛ تشتمل وسائل بداية AT محل الاهتمام على هوية تتابع رقم: © أو تكملتها. في تجسيم استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام على هوية تتابع رقم ©. في تجسيم آخرء؛ تشتمل الوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام على التكامل لهوية تتابع رقم: ©. في تجسيم آخرء يتم إدخال الحمض النووي في خلية النبات حتى بخلية النبات تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل DNA تستهدف موقع سابق التحديد في 10 عملي بالوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام. في تجسيم إضافي أو بديل؛ تستهدف تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بالوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام الموقع سابق التحديد باستخدام ناتج
Zinc finger ناتج عن نيوكلياز إصبع زنك mediated recombination اتحاد sale) .nuclease ٠ في أحد السمات؛ يتم تقديم تركيب حمض نووي للتعبير الجيني عن جينات متعددة خلايا و/ أو أنسجة نبات. يشتمل تركيب الحمض النووي على (أ) معزز ثنائي الاتجاه؛ و(ب) مجموعتين تعبير جيني للجين على النهايات المتقابلة للمعزز ثنائي الاتجاه؛ حيث تشتمل واحدة على الأقل من مجموعات التعبير الجيني للجين على اثنين أو أكثر من الجينات متصلة عن طريق محول ترجمة translation switch ٠٠ tive yy على تتابع nucleic acid construct في أحد التجسيمات؛ لا يشتمل تركيب الحمض النووي viral sequence فيروسي. في تجسيم آخرء لا يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على تتابع فيروسي في تجسيم آخر لا يشتمل تركيب الحمض النووي على تتابع فيروسي. في تجسيم آخرء لا يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على تتابع فيروسي. في تجسيم آخرء يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على معزز. في تجسيم VAT معزز واحد على الأقل. في تجسيم © للتحول الناتج عن الأجرعية 51081/ vector ثنائي Jib يشتمل تركيب الحمض النووي على «AT .Agrobacterium-mediated transformation في أحد التجسيمات؛ يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على عنصر منتقى من المجموعة التي تشتمل إكسون؛ إنترون؛ موقع (ana عنصر (URS) تنظيمي ضد الاتجاه lis أو Cis على عنصر عنصر اتفاق صدمة الحرارة؛ وتوليفات منها. في تجسيم آخر أو TATA بداية استنساخ» صندوق Ve
Ubiquitin من جين (URS) بديل؛ يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على تتابع تنظيمي ضد الاتجاه
Ubiquitin معزز يختلف عن معزز جين (i) في تجسيم آخرء يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على
Ubiquitin من جين (URS) تتابع تنظيمي ضد الاتجاه (ii) و يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على عنصر معزز أساسي أدنى من جين OAT في تجسيم يشتمل المعزز ثنائي « AT في تجسيم .Zea luxurians أو Zea mays من Ubiquitin-1 Yo عنصري Cus Zea luxurians أو Zea mays الاتجاه أيضاً على معزز أساسي أدنى من معزز أساسي أدنى في اتجاه تكميلي عكسي بالنسبة لبعضها البعض. في تجسيم إضافي أو بديل؛ 9670 9675 يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد على الأقل أو تكملتها. في ١ مطابقة لهوية تتابع رقم: 96٠00 أو 695 966 HAS 96/00 (VO يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد chy تجسيم إضافي أو Yo في تجسيم إضافي؛ .39-١5و ١ منتقاة من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع أرقام: يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد منتقى من المجموعة التي في تجسيم إضافي؛ يشتمل العنصر المعزز .7؛-١5و ١ على هويات تتابع أرقام: das الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد منتقى من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع ye في تجسيم إضافي؛ يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع .؟9-١5و ١ أرقام: Yo tive
س١ النيوكليوتيد منتقاة من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع أرقام: ١ و١١-؟7. في تجسيم إضافي؛ يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد منتقى من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع أرقام: ١ و١١-9١. في تجسيم إضافي؛ يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد بهوية تتابع رقم: .١ © في تجسيم إضافي أو بديل؛ يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على إكسون من جين Ubiquitin=1 و/ أو إنترون من جين Ubiquitin في تجسيم AT في تجسيم AT يشتمل معزز ثنائي الاتجاه على عديد نيوكليوتيد على الأقل 96975 KoA 96/85 960 9645 أو 96٠00 مطابقة لهوية تتابع رقم ؟ أو تكملتها. في تجسيم AT يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على عديد نيوكليوتيد بهوية تتابع رقم © أو تكملتها. في يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على إنترون من جين كحول نازع Ys للهيدروجين. في أحد التجسيمات؛ يكون تركيب الحمض النووي محوّل Why بشكل مستقر إلى نباتات معدلة وراثياً. في أحد التجسيمات؛ تكون النباتات عبارة عن نباتات أحادية الفلقات -monocotyledons plants في تجسيم AT تكون النباتات عبارة عن نباتات ثنائية الفلقة dicotyledons plants .3 تجسيم آخرء لا تكون النباتات عبارة عن نباتات أحادية الفلقة. في تجسيم آخرء لا تكون النباتات عبارة عن نباتات ثنائية الفلقة. Vo في تجسيم AT أو بديل؛ يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على تتابع تنظيم ضد الاتجاه من جين 0 . في تجسيم آخرء يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه من جين Ubiquitin على عديد نيوكليوتيد من تتابع على الأقل 9675 9680 96/5 9690 9695 أو 96٠0٠0 مطابقة لهوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم آخرء يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه من جين Ubiquitin على عديد نيوكليوتيد من هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم «AT المعزز ثنائي الاتجاه Ye تشتمل على عديد نيوكليوتيد من على الأقل 9675 .9684 YAS 960 9615 أو 96٠٠١ مطابقة لهوية تتابع رقم: © أو تكملتها. في تجسيم OAT المعزز ثنائي الاتجاه تشتمل على ye نيوكليوتيد من هوية تتابع رقم: © أو تكملتها. في أحد التجسيمات؛ تشتمل كلا مجموعتي التعبير الجيني للجين على اثنين أو أكثر من الجينات متصلة عن Gob محول ترجمة. في تجسيم إضافي أو بديل؛ يتم اختيار محول الترجمة من Yo المجموعة التي تشتمل على موقع دخول ريبوزوم داخلي internal ribosome entry site tive
-؟١- (5ع4١)؛ موقع تضفير بديل alternative splicing site ؛ موقع شطر ريبوزوم ribozyme cleavage site ؛ تتابع عديد النيوكليوتيد ترمز ببتيد 2A peptide تتابع عديد النيوكليوتيد ترمز ay polynucleotide sequence coding مشابه like peptide ل 2A تتابع عديد النيوكليوتيد ترمز إنتين 101610 ؛ تتابع عديد النيوكليوتيد ترمز موقع شطر بروتياز protease cleavage site © ؛ وتوليفات منها. في تجسيم إضافي أو بديل؛ يشتمل محول الترجمة على عنصر هيدرولياز بتأثير سيس cis-acting hydrolase element (اع01175). في تجسيم إضافي؛ يكون CHYSEL عبارة عن تتابع ببتيد 2A أو مشابه ل 28. في تجسيم آخرء لا يشتمل على جين ضد الاتجاه gene upstream بمحول الترجمة على كودون توقف ترجمة translation stop codon في تجسيم آخرء Ray تركيب الحمض النووي من أو يسمح ٠ بالتعبير الجيني على الأقل أربع جينات. في تجسيم إضافي؛ تكون كل الجينات الأربعة محورة وراثياً. في تجسيم AT يمكّن تركيب الحمض النووي من التعبير الجيني عن جينات بين ثلاثة وعشرون. في تجسيم آخرء يمكّن تركيب الحمض النووي من التعبير الجيني عن جينات بين أربعة وثمانية. في تجسيم إضافي أو بديل؛ تكون الجينات محورة وراثياً. في تجسيم آخرء على الأقل تشتمل أحد مجموعات التعبير الجيني gene expression cassette للجين على تتابع عديد Vo النيوكليوتيد يقوم بترميز بروتين دمج fusion protein في aad إضافي؛ يشتمل البروتين المندمج على ثلاث إلى خمس جينات. في بعض التجسيمات؛ يكون التعبير الجيني عن جينات من المعزز ثنائي الاتجاه أعلى أربع أضعاف على الأقل مقارنة بمعزز موحد الاتجاه. في بعض التجسيمات؛ يكون التعبير الجيني عن جينات من المعزز ثنائي الاتجاه من ثلاثة إلى عشرة أضعاف أعلى مقارنةً بمعزز موحد الاتجاه. Ye في بعض التجسيمات؛ يكون التعبير الجيني لجينات من المعزز ثنائي الاتجاه من أربعة إلى ثمانية أضعاف أعلى مقارنة بمعزز موحد الاتجاه. في بعض التجسيمات؛ يتم وضع جين واصم Marker 6 للاختيار عند نهاية بعيدة من المعزز (أي؛ عند نهاية '3 بجين مجموعة تعبير جيني gene expression cassette فى اتجاه downstream جين (AT في أحد السمات؛ يتم تقديم طريقة لتوليد نبات معدّل وراثياً يتضمن التعديل الوراثي لخلية نبات Yo باستخدام تركيب الحمض النووي مقدم في هذه الوثيقة. في سمة أخرى؛ يتم تقديم طريقة لتوليد خلية ملا yo معدلة وراثياً يتضمن التعديل الوراثي للخلية باستخدام تركيب الحمض النووي المقدم في هذه الوثيقة. يتم تقديم خلية نبات يتضمن تركيب الحمض النووي المقدم في هذه الوثيقة. في (Al في سمة تجسيم إضافي أو بديل؛ يكون تركيب الحمض النووي محوّل وراثياً بشكل مستقر إلى خلية النبات. في سمة أخرى» يتم تقديم نبات معدّل وراثياً يتضمن تركيب الحمض النووي مقدم في هذه الوثيقة. في تجسيم إضافي أو بديل؛ يكون تركيب الحمض النووي محوّل وراثياً بشكل مستقر إلى خلايا من 5 يتم في هذه الوثيقة تقديم طريقة للتعبير الجيني عن جينات (al النبات المعدل وراثياً. في سمة متعددة خلايا و/ أو أنسجة نبات؛ يتضمن إدخال في خلايا و/ أو أنسجة النبات تركيب الحمض النووي مقدم في هذه الوثيقة. في تجسيم إضافي أو بديل؛ تكون خلايا و/ أو أنسجة النبات محولة وراثياً بشكل مستقر باستخدام تركيب الحمض النووي مقدم في هذه الوثيقة. في سمة أخرى؛ يتم تقديم ناقل ثنائي للتحول الوراثي الناتج عن الأجرعية. في أحد التجسيمات؛ يشتمل الناقل الثنائي Ve يشتمل الناقل الثنائي على OAT في هذه الوثيقة. في تجسيم ade على تركيب الحمض النووي عديد النيوكليوتيد التخليقي المتوفر في هذه الوثيقة. في سمة أخرى؛ يتم تقديم استخدام المعزز ثنائي الاتجاه المقدم في هذه الوثيقة للتعبير الجيني متعدد التمحور في النباتات. شرح مختصر للرسومات الوصف المختصر للرسومات والتتابعات ١ حيث يشتمل على ((ZmUbil) يوضح معزز نموذجي (ليس بمقياس الرسم) لذرة 511لا ١ الشكل تقريباً 9060 زوج قاعدة عنصر ضد الاتجاه عند الموضع ”5 من موقع بداية الاستتساخ
TATA يحتوي العنصر ضد الاتجاه على صندوق .)155( transcription start site وعنصري اتفاق صدمة حرارة متداخلين (موضوعة (TSS زوج قاعدة من Tom (موضوع تقريباً زوج قاعدة ٠١١١ يشتمل ذلك المعزز أيضاً على حوالي (TSS زوج قاعدة من Yoon تقريباً Yo adjacent leader عند '3 من منطقة 155. تحتوي منطقة 37 هذه على تتابع موجه مجاور تمثل عناصر متوافقة للصدمة )١( ؛١ وانترون. فى شكل «(ZmUbil (إكسون sequence تمتل عنصر ضد الاتجاه؛ )0( تمثل (£) «TSS Jia (7) (TATA مربع Jia )7( الحرارية؛ إكسون 511لا200؛ 5 )1( تمثل إنترون. دما
-؟١- ١ JRE يوضح تجسيم نموذجي لمعزز 011لا التخليقي ثنائي الاتجاه adie حيث يتضمن عنصر df لب 00100050110 مستنسخ ضد الاتجاه (في اتجاه التكامل العكسي | reverse (complementary orientation من معزز .ZmUbil فى شكل ov 0 تمثل عناصر .minUbiP1 © الشكل ؟ يوضح رسم تخطيطي نموذجي ل GUS ثنائي الاتجاه و مجموعات التعبير الجيني 10لا
تحتوي على 10لا و مجموعات التعبير الجيني عن جين (GUS حيث يتصل كل منها بشكل عملي بمعزز 511لا تخليقي ثنائي الاتجاه. فى شكل )١( oF تمثل (Y) ¢ZmPer5 3' UTR تمثل (V) «GUS تمثل تتابعات موجهة فى نفس الاتجاه؛ )£( تمثل ¢yfp و(١) تمثل '3 ZmLip UTR
() PDABI05801 نموذجية من plasmid map بلازميد iad الشكل ؛ يوضح ٠ (د) ¢ZmUbil (ج) تمثل المعزز ¢ZmUbil (ب) تمثل إكسون of فى شكل (bpYYIVY) (GUS تمثل إنترون 011ل207؛ (ه) تمثل توقف إطار-؟؛ (و) تمثل تتابع توافق للذرة؛ (ز) تمتل تمثل (J) ¢kanR (ى) تمثل 00014؛ (ك) تمثل ¢attl] (ط) تمثل ¢ZmPer5 3' UTR (ح) (ع) تمثل 710؛ ¢ZmLip 3' UTR (ص) تمثل tattRS (ن) تمثل ¢gentR (م) تمثل ¢«ChIR
Vo (ف) تمثل تتابع توافق للذرة؛ (س) تمثل توقف إطار-؟؛ (ق) تمثل إنترون 011ل2010؛ (ر) تمثل إكسون 511لا200؛ و (ش) تمثل عنصر Min-UbiPl الشكل © يوضح خريطة بلازميد نموذجية من pDABLOBTO6 (أ) (47 + Va 0ط). فى شكل © Jia (Y) «GUS Jia )١( تتابع توافق للذرة؛ Jia (YF) توقف إطار-؟؛ )8( تمثل إنترون 1 )؛ )©( Jia معزز ¢ZmUbil )1( تمثل إكسون Jd )7( ¢ZmUbil عنصر
٠ | 0101لا 10/ا؛ (A) تمثل sus) 011ل2000؛ )3( Jia إنترون 511ل20؛ )٠١( تمثل توقف إطار-؟؛ (VY) تتابع توافق للذرة؛ (VY) تمثل (VF) ¢yfp تمثل «ZmLip 3' UTR (؟٠) تمثل )٠١( «T-DNA Border B تمثل استياق مفرط؛ )١١( تمثل تضارب (VV) FY تمثل ¢SPNR (VA) تمثل (V4) «trfA تمثل 011؛ (YY) T-DNA Border As Ji (YY)5¢(YV) )٠١( تمثل منطقة تماثل )¢ (Y¢) تمثل Jia (Yo) «ZmLip 3' UTR 880-1؛ (Y1) تمثل تتابع
Yo توافق للذرة؛ Jia (YY) توقف إطار-؟؛ Jia (YA) إنترون (YA) ¢ZmUbi تمثل معزز
gaye yy
ELP1 تمثل (YY) ¢) تمثل منطقة تماثل (VY) ¢ZmUbil تمثل إكسون (V+) ¢ZmUbil .ZmPer5 3' UTR تمثل (Y¢) 5 ¢ELP1 HRI تمل (YY) ¢HR2 فى شكل (bp YY AY) (ب) PDABIO1S56 الشكل 1 يوضح خريطة بلازميد نموذجية من coriV Jia 0 011؛ Rep تمتل ( coriT مضل خطت؛ )7( تمثل 0 sspecR تمثل (0 ) a
Jig (V+) «ZmLip 3' UTR تمثل (1) «T-DNA Border As تمثل (A) «(Y) «(1) © تمثل إنترون (VY) تمثل توقف إطار-؟؛ (VY) تمثل تتابع توافق للذرة؛ (VY) sadd-l 2010615 تمثل (V1) تمثل إكسون 01[1ل200؛ (V0) :+؛ )£ )( تمثل معزز 511ل200؛ 1 (Yo) تمثل توقف إطار-؟؛ (V4) تمثل تتابع توافق للذرة؛ (VA) تمثل 0آل7ا؛ (VY) '3؛ UTR (YY) تمثل إكسون 011لا20؛ (YY) تمثل معزز 011لا200؛ (YY) تمثل إنترون 511ل200؛ و(؛ 7) تمثل استياق مفرط. «T-DNA Border 8 تمثل ٠ زوج قاعدة من منطقة معزز أساسي VV حيث تشتمل على ٠ الشكل "أ يوضح هوية تتابع رقم: حيث تشتمل على oF (50110لا010). الشكل اب يوضح هوية تتابع رقم: Zea mays أدنى .2. mays Ubil إنترون reverse حيث يشتمل على التكامل العكسي oF يوضح هوية تتابع رقم: A الشكل Z. mays minUbilP لعديد النيوكليوتيد الذي يتضمن معزز أساسي أدنى complement Yo ¢(bold font خط سميك ¢ZmUDbIl (إكسون 2. mays Ubi] قائد ¢(underlined (تحته خط حيث يشتمل of (حالة سفلية). الشكل 4ب يوضح هوية تتابع رقم: 2. mays و إنترون 011لا حيث يمكن أن يكون العنصر (و/ أو 2. mays Ubil على قطعة من عنصر ضد الاتجاه تكامله العكسي) موضعاً في معزز 511لا تخليقي مع عنصر 0010105116 مجاور لنهايته '5 أو 3 ٠ الشكل 95 يوضح هوية تتابع رقم: 5؛ الذي يشتمل على معزز 011ل تخليقي ثنائي الاتجاه نموذجي؛ حيث يكون التكامل العكسي ل 0010100110 أولء و 001000116 ثاني؛ تحته خط. يوضح هوية تتابع رقم: 6؛ الذي يشتمل على حمض نووي نموذجي يتضمن مجموعات ٠١ الشكل المشتقة بواسطة معزز 011لا ثنائي الاتجاه تخليقي. GUS جينية للتعبير الجيني عن 10لا و د
-م١- هوية ١7 od) oi يشتمل على YFP Zab تقدمية GATGCCTCAG -3 : A cd) ol Le TGGGAAAGG-3 يشتمل على بادئة YFP عكسية: -5 .CCATAGGTGA GAGTGGTGAC AA-3' هوية تتابع رقم: 9 يشتمل على بادئة إنقيرتاز تقدمية TGGCGGACGA CGACTTGT-3' :Invertase Forward Primer -'5. هوية تتابع رقم: ٠١ يشتمل على بادئة إنقيرتاز عكسية Invertase Reverse Primer : ='5 GGCTGCCGT-3 11166 خلط. dye تتابع رقم: ١١ يشتمل على مسبار إنقيرتاز CGAGCAGACC GCCGTGTACT TCTACC-3' : Invertase Probe -ا5. هوية تتابع )8 ١١ يشتمل على بادثة AAD] Primer تقدمية: TGTTCGGTTC -5 LCCTCTACCAA-3' هوية_تتابع رقم: dak ١١ على بادئة 1(امطعكسية: -5 ٠ 3ححق (CAACATCCAT CACCTTGACT هوية تتابع رقم: VE يشتمل على مسبار CACAGAACCG TCGCTTCAGC AACA-3' :AAD1 Probe -5 (انظر أيضاً الجدول 7). الشكل ١١ يوضح تحليل Western dai; نموذجي يؤكد تعبير جيني عن 7 و GUS مستقر المشتق بواسطة تركيب معزز Promoter construct 01010001لا Z. mays ثنائي الاتجاه (pDAB108706) ١٠ في نباتات TO ذرة. أظهرت النباتات التمثيلية تعبير جيني ل YFP مستقر في الورق leaf المشتق بواسطة عنصر معزز أساسي أدنى 5101لا-1/10. تمت الإشارة إلى كمية البروتين protein التي تم إنتاجها كأجزاء بالمليون (PPM) الشكل ١١ يوضح تحليل Western blot analysis dai نموذجي يوضح تعبير جيني عن YFP و GUS مستقر من التركيب construct المقارن الذي يحتوي على معزز ZmUbil الذي ٠ - يحرّك فقط التعبير الجيني ل ¢(PDABIOLSS56) YFP لا تكون تتابع ترميز GUS متضمنة في التركيب هذا. يتم الإشارة إلى كمية البروتين التي تم إنتاجها كأجزاء بالمليون (PPM) الشكل DY يوضح تركيبات نموذجية لتراصات stacks مجموعة_ من أربع جينات 83 () [توضح مجموعتين من (Phiyfp J) AAD1-2A-YFP زائد -00/34 [2A-cry35 و 00008105846 (ب) [توضح مجموعتين من 2A——(Phiyfp 5) YFP Yo 01ل زائد 007/34-2-0/35]._تشير الأسهم المظللة Shaded arrows إلى اتجاه
-١4- زوج قاعدة ضد الاتجاه تتابع Yoo على Ubil-minP الاتجاه. تشتمل SW الانتساخ من المعزز على منطقة منظمة لضد الاتجاه Ubil-URS من موقع بداية الانتساخ لمعزز 011لا. تشتمل زوج قاعدة من ٠٠١ معزز ذرة 511لا تتكون من ضد الاتجاه تتابع موقع بداية انتساخ باستثناء على إنترون من معزز ذرة Ubil-Int Jai (arrow sew أدنى معزز (موضحة في صورة الشكل ١١ب يوضح تركيبات ثنائية نموذجية إضافية لتراص مجموعة من أربع جينات من WUBI © (Y) '3-نا؛ UTR تمثل )١( VY (ج) و 008108718 (د). فى شكل 7
OS) Jia (0) تمثل 73 01ل (لا توقف)؛ )2( تمثل إنترون 011لا؛ )( «YFP تمثل (2) (لا توقف)؛ Cry34 تمثل (A) تمثل 45الا-011ل؛ (VY) ¢Ubil-minP 1)؛ )1( تمثل (VV) نلفلظ؛ 1 v3 Jia (VY) ¢Per5 3' UTR تمثل (VV) «Cry35 تمثل (V+) 2A تمثل (لا توقف). YFP تمثل Vs مقدمة هنا multi-gene يوضح عروض تخطيطية نموذجية لتركيبات متعددة الجينات VE الشكل تمثل إنترون» (7) تمثل )١( حيث cola) (أ) تمثل معزز 511لا اصطناعي ثنائي »٠4 فى شكل تمثل عنصر ضد الاتجاه؛ (4؛ وكل هذه الرموز) تمثل محولات )١(و (MinUDIIP عنصر ترجمة؛ (ب) تمثل جين ١؛ (ج) تمثل جين ؟؛ (د) تمثل جين ؟؛ (ه) تمثل جين ؟؛ (و) تمثل .6 جين ©؛ و(ز) تمثل جين 5
VAATY (1) pDAB105818 plasmids تمثيلية لبلازميدات maps يوضح خرائط Vo الشكل تمثل (Y) ¢SpnR تمثل (V) «Vo فى شكل (bp YYAT.) و 00008105748 (ب) (bp
ZmLip 3' تمتل (V) «T-DNA Border As (د) )1( تمثل )4( ¢oriT تمت (¥) <trfA منطقة معزز Jia (Vr) v2 ZmUDbI] تمثل معزز (1) ¢AAD-1 v3 تمثل (A) UTR 1ب ¢«Cry35 1ط v6 تمثل (VY) ¢StPinll 3" UTR v2 تمثل (VV) v2 ZmUbil ضد الاتجاه ٠ تمثل (Vo) «ZmUbiIl تمثل معزز ضد الاتجاه (VE) v2 ZmUbil تمثل معزز (VY) (YA) v2 2000011 تمثل معزز (VV) ¢Cry34Abl v2 تمثل (V7) ¢StPinll 3" UTR v2 تمثل (Y ٠ ) «T-DNA Border B تمثل (0 1) «v2 ZmUDbil تمثل منطقة معزز ضد الاتجاه (مع إنترون). PhiYFP v3 تمثل (YY), 2000615؛ 3' UTR v2 تمثل (YV) PAT vO gv
و (bp ١7٠5( )( pDAB105803 لبلازميدات Alia يوضح خرائط ١6 الشكل (*) AMPR تمثل (Y) atl] تمثل )١( 16 شكل (bp YTV) م ر(ب) 60
ZmPer5 3' تمثل (V) تمثل 8812؛ (1) sgentR تمثل (0) ¢ChIR تمثل (¢) tkanR تمثل تمثل (V1) تمثل توقف إطار-؟؛ )٠١( تمثل تتابع توافق للذرة؛ (1) $GUS تمثل (A) (UTR تمثل منطقة معزز ضد الاتجاه 511لا207 (VF) تمثل 510لا0!؛ (VY) v2 ZmUbil معزز © ؛)١١١7( BamHI تمثل توقف إطار-؟؛ )11( تمثل موقع (V0) تمثل ©51لا00!؛ (1) v2 تمثل توقف ترجمة (V4) PEPP1141 من YFP v2 تمثل (VA) تمثل تتابع توافق للذرة؛ (VY) تمثل موقع (YY) 200118؛ 3' UTR 1 تمثل (Y)) (780)؛ Sacl تمثل موقع )7١( إطار -7؛ (Yo) (717)؛ Notl موقع (ici (Y£) §(YY0)) Xbal تمثل موقع (YF) (1714)؛ Xbal «Cry35Ab1 v5 تمثل (YY) ¢StPinll 3' UTR (isi (YT) ¢(Y+1Y) Xbal تثل موقع ٠ تمثل (FV) (777)؛ Notl تمثل موقع (T+) (لا توقف)؛ 8V6 Jia (Y3) 2A Jia (YA) كاثاة. Jia (YY); ¢()1¢) Xbal موقع و (bp £1¢Y) (I) pDAB105841 يوضح خرائط تمثيلية لبلازميدات ١١7 الشكل (Y) (3877)؛ Pstl تمثل موقع )١( OY فى شكل (bp ٠77 ١تد( رب) 2
PhiYFP (17773))؛ )1( تمثل Sacl تمثل أصل 060151؛ )0( تمثل موقع )3©( tkanR fic Vo (بدون توقف)؛ (1) تمثل تتابع توافق AAD-T v3 Jia (A) /2؛ Jia )7( إنترون)؛ ae) V3 sattL] تمثل (VY) «ZmLip 3' UTR vl تمثل (VV) ¢(YVYo) Pstl تمثل موقع (V+) للذرة؛ تمثل (VV) sattl2 تمثل (V1) gentR تمثل (10) ¢ChIR (isi (1) $AmpR تمثل (17) ¢ZmPer5 3' UTR v2 Jia (14) ¢(Vo r+) Notl موقع Jici (YA) ¢(Vo VA) Spel موقع تمثل توقف إطار-؟؛ (13) تمثل (YY) (YY) Notl تمثل موقع (Y)) (GUS تمثل (Yi) Yo تمثل (Yo) v2 ZmUbil تمثل منطقة معزز ضد الاتجاه (YE) v2 ZmUbil معزز .MinUbiP و (bp YYATY) (1) pDAB105843 لبلازميدات Alia يوضح خرائط ٠١8 الشكل tkanR (ic (Y) tAMPR تمثل )١( «VA فى شكل .(bp ١ ¢01) ر(ب) 7 (V) ¢StPinll 3' UTR v2 تمتل (1) ¢attl2 Ji (0) ¢gentR Jisi (¢) «ChIR تمثل (¥) Yo م yy تمثل تتابع توافق )٠١( (بدون توقف)؛ 87/6 Jia (3) $2A تمثل (A) «Cry35Abl تمثل 5لا تمثل منطقة معزز (VF) v2 معزز 511لا200 iss (VY) تمثل توقف إطار-؟؛ )١١( للذرة؛ تمثل (V1) تمثل توقف إطار-؟؛ (V0) تمثل ©511ل101/!؛ (V¢) 72؛ ZmUbil ضد الاتجاه
Jig (V4) 2A تمثل (VA) (بدون توقف)؛ AAD-1 73 تمثل (VV) ll تتابع توافق تمثل (YY) sattl1 تمثل (YY) منا200؛ 3' UTR تمثل 1لا )٠١( 3لا ©0017 (مع إنترون)؛ © «T-DNA Border 8 (isi (Yo) ¢attR1 تمثل موقع (Y£) كلورامفينيكول؛ (77) تمثل 6008؛ تمثل )3١( تمثل 007؛ )19( trfA تمثل (YA) ¢SpnR تمثل (YV) تمثل استياق مفرط؛ )77( attR2 Jia (VV) «PAT ول Jia (TV) «T-DNA Border A 11 شكل a. (bp YIATY) (1) pDABL08717 يوضح خريطة تمثيلية لبلازميد ١9 الشكل تمثل (V) 5 (1) تمثل 007؛ (د)؛ )4( ¢trfA تمثل )©( ¢SpnR (Y) تمثل استياق مفرط؛ )١( ٠ (V+) PAT تمثل ول (3) «ZmLip 3' UTR v1 Jia (A) T-DNA Border A عناصر Jig (VY) ¢StPinll 3' UTR v2 تمثل (VY) attB2 تمتل (1) «v2 ZmUbil تمثل معزز تتابع توافق Jia (V7) (بدون توقف)؛ 87/6 Jia (Vo) 2A Jia (V¢) ¢«Cry35Abl v5 تمثل منطقة معزز (V4) v2 ZmUbIL تمثتل معزز (VA) تمثل توقف إطار-؟؛ (VY) للذرة؛ تمثل (YY) v= jl) تمثل توقف (YY) تمثل ©511ل001/!؛ )٠١( v2 ZmUbil ضد الاتجاه 5
Jia (Yo) 2A (ia (بدون توقف)؛ (؟7) AAD-1 v3 Jia (YY) تتابع توافق للذرة؛ (YA) sattBl تمثل (YV) eZmLip 3' UTR v1 تمثل (Y1) (مع إنترون)؛ PhiYFP v3 .T-DNA Border B تمتل (bp £1¢Y) (I) pDAB105844 تمثيلية لبلازميدات Lila يوضح 70 JS تمثل موقع (Y) kanR تمثل )١( ٠١ فى شكل (bp ٠37١ 5( (ب) pDAB105845, ٠
AAD-1 ici (0) (1777)؛ Sacl gis 7)؛ )1( تمثل أصل 060151؛ (4) تمثل 5 +) Neol تمثل تتابع توافق (A) (مع إنترون) (بدون توقف)؛ ©1750 v3 تمثل (V) تمثل 28؛ ) v3 تمثل (VY) ¢ChIR تمثل (VV) ¢AmPR تمثل )٠١( (777)؛ BamHI للذرة؛ )3( تمثل موقع
Notl ads تمثل (V0) ¢(A+23) Spel تمثل موقع (V¢) تمثل 8112؛ (VV) ¢gentR
Notl تمثل موقع (VA) (GUS تمثل (VY) «ZmPer5 3' UTR v2 تمثل (V1) ¢(ArAY) 5 tive
— \ \ — (V4) ¢(0AVY) تمثل توقف إطار-؟؛ (Yo) تمثل معزز Jia (YY) v2 ZmUDIlL منطقة معزز ضد الاتجاه (YY) «v2 ZmUDbil تمثل 5 (YY) «MinUbiP+H تمثل ¢ZmLip 3' UTR v1 (Y¢) تمثل attll الشكل 7١ يوضح Lila تمثيلية لبلازميدات (bp YYATY) (I) pDABL05846 pDAB108718, © (ب) (bp YTAAY) فى شكل «YY )1( تمثل (Y) ¢AmpR تمثل tkanR «ChIR Jia (TV) (4) تمتل «attl2 Jis (0) tgentR )1( تمثل (V) ¢StPinll 3" UTR v2 تمثل Jia (1) 2A Jia (A) «Cry35Abl v5 87/6 (بدون توقف)؛ Jia (Vo) تتابع توافق للذرة؛ Jia (VY) توقف إطار-؟؛ (VY) تمثل معزز Jia (VY) v2 ZmUbil منطقة معزز ضد الاتجاه (Y ¢) ¢ZmUbil تمثل 5 (Vo) ¢Min—-UbiP+H تمثل ae) PRIYFP v3 إنترون) ٠ (بدون توقف)؛ (V1) تمثل Jic (VA) ¢ZmLip 3' UTR vl Jia (VV) ¢AAD-1 v3 1 ؛ (V4) تمثل )٠١( ¢SpnR تمثل (YV) ¢trfA تمثل (YY) ¢oriT تمثل T-DNA (Y¢) «PAT v9 Ji (YY) «Border A تمثل (Y1) eMin=UbilP Jis (Yo) «attB2 تمثل (YV) ¢attBl تمثل (YA) 5 «T-DNA Border B تمثل استياق مفرط. الشكل YY يوضح بيانات التعبير الجيني عن بروتين نموذجية (نانوجرام) ل Cry34 )1( مرسوم yo كدالة ل (Y) Cry35 من pDAB108717 (الشكل (Ivy و pDAB108718 (الشكل ١7"ب). الشكل YY يوضح تتابع حمض نووي acid sequence 0101616 لمجموعات جينية للتعبير الجيني عن 0105108717؛ حيث تم توضيح كل جين و عنصر element الأشكال YE أ-ه توضح معززات أساسية أدنى إضافية min-UbilP) أو (Ubil-minP من هوية تتابع أرقام: 31-1. ٠ الشكل Yo يوضح تتابعي نموذجيتين لبروتينات التفلور الصفراء yellow fluorescent من 51-2003 a.a., GenBank (Phiyfp) Phialidium sp. 234 1 (هوية تتابع رقم: ٠ #)؛ و Phiyfpv3 ,.8.8 234 هوية تتابع رقم: )0( الشكل 7 يوضح تجسيمات نموذجية من معزز Ubil التخليقي ثنائي الاتجاه و تركيبات مقدمة؛ بما في ذلك A ZMUbi) 0 pDAB108706 الاتجاه ))٠٠١-( و 0008108707 (ب) ملا
_ \ —
ZMUbi) ثنائي الاتجاه )-:3((. ZmUbil-YFP) (x) pDABL01556 8( و
6 رد) ZMUDIL) بدون أدنى معزز) تعمل على هيئة تركيبات مقارنة مع معززات
موحدة الاتجاه promoters [001-016011008. فى شكل 76 )١( تمثل UTR '3-منا؛ (Y)
تمتل 70؛ (©) تمثل إنترون 011لا؛ )£( تمثل Ubil-minP عند الموضع =+ + 5¢¥ )0( تمثتل
ه Ubil-minP عند الموضع -90؛ )1( تمثل 511-0045لا؛ (V) تمثل Jig (A) «GUS
UTR '08+5-3؛ )4( تمثل 1-0أطالا؛ و )٠١( تمثل 45ل011-1لا بدون Ubil-minP (السهم
الأيسر للعنصر غير وظيفى).
الشكل 7١؟أ يوضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن (V6) من أربع تركيبات موضحة في
الشكل 776 لبروتين (LCMS) YFP في نانو جرام/ Yan الشكل VY يوضح نتائج تعبير جيني ٠ نسبية نموذجية (V6) من أربع تركيبات موضحة في الشكل YT ل YFP RNA
الشكل TYA يوضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن (V6) من أربع تركيبات موضحة في
الشكل 776 لبروتين (LCMS) GUS في نانو جرام/ سم؟. الشكل OYA يوضح نتائج تعبير جيني
نسبية نموذجية (V6) من أربع تركيبات موضحة في الشكل ¥1 ل .GUS RNA
الشكل TY يوضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن (V6) من أربع تركيبات موضحة في ١ الشكل YT لبروتين 01ث// (LCMS) في نانو جرام/ Yau الشكل 79ب يوضح نتائج تعبير
جيني نسبية نموذجية (V6) من أربع تركيبات موضحة في الشكل YT ل AAD] RNA
الشكل ١؟أ يوضح تحليل إحصائي statistical analysis لنتائج التعبير الجيني (V6) من أربع
تركيبات موضحة في الشكل 76 لبروتين (LOCMS) YFP في نانو جرام/ Yau تكون القيم
المتوسطة mean values ل «pDAB101556 «pDAB108706 pDAB108707 و pDAB108716 Yo هي 7 (oY. 44.0 وصفر على التوالي. الشكل ٠ ؟"ب يوضح
تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية (V6) من أربع تركيبات موضحة في الشكل 776 ل
«pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706 تكون القيم المتوسطة ل YFP RNA
و pDAB108716 هي 1.7 أخصى ¢1.40 و ١٠.١١ على التوالي.
tive
و الشكل ١؟أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (VO) من أربع تركيبات موضحة في الشكل 76 لبروتين (LCMS) GUS في Yau faba gl تكون_القيم المتوسطة ل 6 ,م pDAB108707 088101556م و pDAB108716 هي .٠ف 7" > و 71.17 على التوالي. الشكل ١ب يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير © الجيني النسبية (V6) من أربع تركيبات موضحة في الشكل 76 ل GUS RNA تكون القيم المتوسطة ل pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706 و 008108716 هي YoY gon VA Ge على التوالي. الشكل IVY يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (VO) من أربع تركيبات موضحة في Jal 776 لبروتين 8801م (LCMS) في نانو Yau [aa تكون_القيم المتوسطة ل YY.
AA» pDABI08716 5 «pDAB101556 pDAB108707 «pDAB108706 ٠ .لال مدع و ١75.47 على التوالي. الشكل FY يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية (V6) من أربع تركيبات موضحة في الشكل 76 ل هل AADT تكون القيم المتوسطة J 088108706م «pDAB108707 088101556م ر 0/8108716م هي 1.77 LTV 1.47ء و 7.97 على التوالي. ١ الأشكال oY (FY و 77ج توضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن (VI0) من أربع تركيبات موضحة في الشكل YT ل AAD] YFP و بروتين (LCMS) GUS في نانو جرام/ Yau على التوالي. الأشكال cae (Ire و VE 2 توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (V10) من أربع تركيبات موضحة في الشكل YT ل «GUS YFP و بروتين (LCMS) AAD] في نانو جرام/ le Yau Yo التوالي. تكون القيم المتوسطة ل pDABL108706 088108707 6م ر 088108716م ل YFP (الشكل (fe هي لألا اث الى حمفكك و 7.00 على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل «pDAB108707 pDAB108706 pDAB108716 5 pDAB101556 ل Jal) GUS ؛آب) هي اتيك ser AYO de ٠7 _التوالي. adll os المتوسطة ل «pDAB108707 pDABL08706 tive
اج \ _ 6م ر 088108716 ل AAD] (الشكل (VE هي ١ فتتت GAYA ا دده و ٠١ ٠١6 على التوالي. الأشكال (Yo 5؟ب؛ و 75ج توضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن (R3) من أربع تركيبات موضحة في الشكل 76 ل «GUS YFP و بروتين (LCMS) AAD] في نانو جرام/ You على التوالي. الأشكال ea (FT و 17ج توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (R3) من أربع تركيبات موضحة في الشكل «GUS YFP 1 v1 و بروتين (LCMS) AAD] في نانو جرام/ Yau على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل «pDAB108707 (pDAB108706 6م ر pDAB108716 ل YFP (الشكل 6؟) هي الى £9.69( تلت ١١ و 26 على التوالي. تكون القيم المتوسطة «pDAB108706 J 7 تنام «pDAB101556 و pDAB108716 ل GUS (الشكل ١آب) هي عدف الضصستلف املف و 0 على dll ge Nah المتوسطة ل «pDAB108707 pDAB108706 6م ر pDAB108716 ل Jal) AAD] ١أج) هي انتم 64م 068 و دل اخحك ١ على التوالي. Yo الشكل أ يوضح نتائج تعبير جيني نسبية (V6) dad gal من Cry34 RNA من أربع تركيبات ZMUbi]~-/ZMUbil1-Cry34) pDAB105818 «(ZMUbil-YFP) pDAB105748 AW YFP/AAD-1-ZMUbil) pDAB108717 «(ZMUbil-AAD1/Cry35 الاتجاه - «(Cry34-Cry35 و YFP-ZMUbi1/AAD1) pDAB108718 ثنائي الاتجاه Cry34— .(Cry35 الشكل aly يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من بروتين Cry34 (LCMS) ٠ من نفس التركيبات الأربعة «pDAB108717 pDAB105818 pDAB105748 و .pDAB108718 «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748 و «VA Jal .pDAB108718 م
_ أ \ _
يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (VO) من بروتين (LCMS) AADT من نفس التركيبات
.pDAB108718 و «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748 الأربعة
«¥4 الشكل .pDAB108718 و «pDAB108717 pDAB105818 «pDAB105748
© يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (VO) من بروتين (LOCMS) YFP من نفس التركيبات
.pDAB108718 و «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748 الأربعة
الشكل 180 يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من Cry35 RNA من أربع تركيبات
«f+ و 088108718م. الشكل «pDAB108717 pDAB105818 «pDAB105748
يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (VO) من بروتين (ELISA) Cry35 من نفس التركيبات ٠ الأربعة «pDAB108717 «pDAB105818 (pDAB105748 و .pDAB108718
.pDAB108718 و «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748
الشكل 7؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (V6) من Cry34 RNA من أربع
تركيبات (pDAB105748 0/8105818ام؛ «pDAB108717 و 0108108718 بمتوسط Yo قيم on قات YAY و Y.Yo على التوالي. الشكل كب يوضح تحليل (ban) لنتائج التعبير
الجيني (V6) من بروتين Cry34 من نفس التركيبات الأربعة PDAB105748
047.9¢ «+ قيم Luge pDABIO8718 و «pDAB108717 +8
٠١ 4.7/7 و 4.18 1لا على التوالي.
الشكل 7؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (V6) من AAD] RNA من أربع ٠ تركيبات «pDAB108717 «pDAB105818 (pDAB105748 و 0108108718 بمتوسط
قيم للخ لف اتات و ٠.١ على التوالي. الشكل «ty يوضح تحليل (ban) لنتائج التعبير
الجيني (V6) من بروتين 8001م من نفس التركيبات الأربعة PDAB105748
777.54 66 ad و 008108718 بمتوسط «pDAB108717 +8
هل 1لا و 7714.19 على التوالي.
tive
ل الشكل ؛4؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (V6) من YFP RNA من أربع تركيبات (pDAB105748 105818 08م «pDAB108717 و 008108718 بمتوسط قيم 7.549 660 1.748 و 1.90 على التوالي. الشكل ؛ of يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (V6) من بروتين YFP من نفس التركيبات الأربعة 088105748 هه 5<pDAB108717 (pDAB105818 08108718 بمتروسط قيم 7.24 لف (YO TA 354 و 16.04 على التوالي. الشكل Teo يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (V6) من Cry35 RNA من أربع تركيبات (pDAB105748 105818 08م «pDAB108717 و 008108718 بمتوسط OLY © ad 74 و YY على التوالي. الشكل 45 ب يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير ٠ الجيني (V6) من بروتين Cry35 من نفس التركيبات الأربعة PDAB105748 «pDAB108717 «pDAB105818 و pDAB108718 بمتوسط قيم +« (YAV.0f 277 و 90.497 على التوالي. الشكل £7 يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني )٠/6( من PAT RNA من أربع تركيبات «pDAB108717 pDAB105818 «pDAB105748 و ad Lusi pDAB108718 ٠.١٠١ SOLE Gy det 5 على التوالي. الأشكال Jey /اكبء 97؛5ج؛ و 7؛د توضح نتائج تعبير جيني عن بروتين نموذجي (10/) من «Cry34 (AADL YFP و Cry35 على التوالي من أربع تركيبات 088105748 58 قم (pDAB108717 و .pDAB108718 الأشكال 8؛أ tA 4؛ج؛ و aA توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني عن بروتين (VIO) ٠ من © 1ناظهل «Cry34 و Cry35 على التوالي من أربع تركيبات pDAB105818 «pDAB105748 0088108717 و 08108718م._تكون_القيم المتوسطة ل YFP (الشكل (TEA هي YY.) OTLEY 1.14 و ١١.035 على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل AAD (الشكل (fA هي (AVA ناكا لتتت طم و AvY.on على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل Cry34 (الشكل 48؛ج) هي 6 YET.00 دما
“YA
داكا و 74.80 على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل Cry35 (الشكل (tA هي ٠؛
دلا Ted و AAA على التوالي.
الأشكال 149 cat d 49ج و 089 توضح نتائج تعبير جيني عن بروتين نموذجي (R3) من
088105748 على التوالي من أربع تركيبات Cry35 و «Cry34 (AADL YFP
.pDAB108718 0/8108717م؛ و «pDAB105818 ©
الأشكال con Jon 5200 ١٠د توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني عن بروتين
(R3) من «Cry34 (AAD1 YFP و Cry35 على التوالي من أربع تركيبات
8 os .pDAB108718 و «pDABI08717 «pDAB105818 ها 68
المتوسطة ل YFP (الشكل (fon هي تنكمت (EYLTY 7.7 و ١777.45 على ٠ التوالي. تكون القيم المتوسطة ل AAD] (الشكل ١ دب) هي 24ت ATA لفاكت
و ١774.997 على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل Cry34 (الشكل (zo هي 477.5
2710 7/5.94 و 154.720 على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل Cry35 (الشكل
200( هي 6 777.75 41.11 و 0.45 على التوالي.
(z=) ©) Jal يوضح نتائج مثالية لبقعة Western للتعبير الجيني عن بروتين Cry34 (شكل Cry35 (ley ٠ (شكل )© ب) و AADL (شكل ١دج) من 008108718 و
pDAB108717.
الوصف التفصيلي:
أصبح تطوير المنتجات المعدلة وراثياً transgenic products معقد بشكل كبير؛ التي تتطلب
تهريم pyramiding جينات متعددة متحورة إلى مكان واحد single locus ويتطل كل جين ٠ متحور We بشكل تقليدي معزز فريد Unique promoter للتعبير؛ وبذلك فإنه يتطلب معززات
متعددة لتعبر عن جينات متحورة مختلفة خلال مجموعة جين gene stack واحد.بالإضافة إلى
زيادة حجم مجموعة الجين؛ فهذا يؤدي ماراً إلى الاستخدام المتكرر لنفس المعزز للحصول على
مستويات متشابهة من أنماط التعبير الجينى expression pattems المختلفة المتحكمة في نفس
الصفة trait ومن المعروف أن بنيات متعددة الجينات مدفوعة بنفس المعزز تسبب إسكات الجين
ملا
—vq-
gene silencing ؛ وبهذا تعمل على أن تكون المنتجات الوراثية أقل كفاءة في المجال. ويمكن للكثير من مواقع الربط Jalal النسخ (TF) transcription factor بسبب تكرار المعزز أن تسبب
استتفاذ TFs] الداخلي مؤدياً إلى تخميد لعملية النسخ transcriptional inactivation يتم توفير تركيبات وطرق تقوم بتجميع نظام المعزز ثنائي bidirectional promoter system الاتجاه مع تنظيم ثنائي السيسترونات bicistronic organization للجينات على إما نهاية واحدة أو كلا النهايتين للمعززء على سبيل المثال مع استخدام تتابع 2A من فيروس زوثيا أسيجنا asigna) 170568). ويشق بروتين 2A الذي فقط يتكون من = "حمض ad البولي بروتين polyprotein عند نهايته الكربوكسيلية .carboxyl-terminus ويمكن لهذا "الانشقاق الذاتي self-cleavage " أو خاصية 'تخطي الريبوسوم ribosome skip ” لببتيد 2A أو سبيه ٠ الببتيد 2A أن يستخدم في معالجة البولي بروتينات المنتجة الصناعية في النباتات المعدلة وراثياً. وفي تجسيم واحد يتم دمج كل من الجينات Cry34 و35/© في مجموعة تعبير جيني واحدة؛ بينما يتم دمج جينات AAD] (Phiyfp S)YFP في مجموعة تعبير جيني أخرى (مع إطار قراءة مفتوح (ORF) open reading frame مع نسخة COPY من جين بروتين protein 2A gene موضوعة ما بين جينين في كل التثام). وعلى سبيل المثال يمكن لكل من مجموعات ١ التعبير الجيني تلك (أو أزواج جينية (gene pairs أن يتم وضعها على أي من النهايتين للمعزز ALS الاتجاه ليدفع ؛ جينات متحورة وراثياً باستخدام معزز فردي. وبذلك البنايات والطرق المقدمة هنا مفيدة لتجنب الاستخدام المتكرر لنفس المعزز ويقلل حجم التركيبات التجارية commercial 05 بوضوح. بالإضافة تمد أيضاً الأربع جينات أو أكثر المدفوعة بمعزز واحد القدرة
على التعبير المشترك للجينات co—-express genes المتحكمة في صفة trait واحدة. xb; ٠ معززات النباتات Plant promoters المستخدمة لأجل البحث الأساسي أو التطبيق البيوتكتولوجي biotechnological application بصفة عامة أحادية الاتجاه unidirectional ٠ موجهةً فقط جين واحد الذي يتم دمجه عند نهايته '3 (أي؛ فى نفس الاتجاه (downstream وإنه من الضروري غالباً إدخال جينات متعددة في النباتات من أجل الهندسة الآيضية metabolic 9 وتجميع الصفات trait stacking وبذلك يتطلب هذا معززات متعددة بشكل YO نموذجي في محاصيل Crops المستقبل المتحورة وراثياً لتدفع التعبير للجينات المتعددة. وإنه من
ملا
ل
المرغوب فيه تصميم الاستراتيجيات التي يمكن أن تحفظ رقم المعززات المنتشرة وتسمح بتعبير منتظم مشترك 00-16918180 في نفس الوقت لتهريم الجين Ay .gene pyramiding بعض التجسيم؛ يمكن للمعززات الثنائية الاتجاه أن تدفع نسخ وحدات النسخ المتعددة؛ مشتملة على (RNA أو MIRNA المصطنع cartificial أو تتابعات حلقة الهايبن RNA haipin-loop © تتمثل إحدى طرق خفض عدد المعززات المنتشرة في استخدام محولات تنشيط activating 5 انتساخ حرجة critical transcription يمكن أن تنقل الانتساخ في كلا الاتجاهين. يتم تسمية تلك المعززات بالمعززات ثنائية الاتجاه. (Say تصميم معززات تخليقية Synthetic Lull promoters = بمستوى متجانس homology بين معززات متعددة يتم استخدامها للتعديل الجيني الوراثي في نباتات المحاصيل crop plants ؛ حيث يمكن تجنب صمت الجين بأساس متجانس. يمكن أن تكون المعززات ثنائية الاتجاه المصممة بشكل صناعي عبارة عن أدوات ذات قيمة لتطوير النباتات المعدلة وراثياً. تم تقرير أن وظيفة ثنائية الاتجاه للمعززات في النباتات في بعض الحالات؛ بما في ذلك 355 CaMV و معززات معزز تخليق مانوبين (Mas) مع ذلك؛ لم يتم فحص قابلية استخدام تلك المعززات للتعبير القابل sill والمستقر stable والمتزامن
simultaneous للجينات في الاتجاهين.
١ تتمثل طريقة أخرى للتعبير الجيني المتساهم coordinate expression للجينات المتعددة في ترميز إطار قراءة reading frame واحد منفرد في مادة بادئة عديدة البروتين polyprotein precursor تتضمن دافع تداخل 17161760109 قصير بخواص معالجة ذاتية self processing بين تتابعي ترميز coding sequences تؤدي معالجة ذاتية التحفيز لمادة بادئة عديدة البروتين إلى إطلاق بروتينات مستقلة independent proteins متعددة مما يؤدي إلى تعبير جيني
2A تم استخدام تتابع ببتيد .57/0001001280 coordinated expression تساهمي متزامن لها ٠ في كلا من النظام النباتي والحيواني synthetic self-hydrolyzing ذاتي التحلل المائي تخليقي ببتيد بواسطة فيروسات معروفة متعددة وتتكون 2A للتعبير عن جينات معدلة. يتم استخدام تتابع self-cleaves ببتيد ذاتي الشق 2A يكون تتابع .amino acids حمض أمينو Yo -١١ من بشكل مشترك التحول عن طريق تعديل نشاط الريبوزوم (ribosome skip (أو خروج ريبوزوم
ملا
“yy بين البروتينين مما يؤدي إلى إطلاق منتجين بروتين 2A ل hydrolysis للسماح بالتحلل المائي .protein products يتم تقديم تركيبات وطرق تجميع معزز ثنائي الاتجاه تتعامل مع بولي بروتين معالج باستخدام ؛ حيث يمكن تحقيق التعبير الجيني عن ؛ جينات synthetic motifs تداخل دوافع تخليقية
YFP و 00/35؛ و جينات من ©0734 clin معدلة على الأقل باستخدام معزز واحد. تم دمج © و 001 في صورة مجموعات جينية للتعبير الجيني عن أو أزواج جينات في (Phiyfp J) protein بنسخة من جين بروتين (ORF) open reading frames إطارات قراءة مفتحة منفردة
SE الموضوع بين الجينات. يمكن وضع أزواج الجين على أي نهاية من المعزز 2A gene الاتجاه لنقل أربع جينات معدلة باستخدام معزز منفرد واحد. تكون التركيبات و/ أو الطرق المقدمة في هذه الوثيقة مفيدة لتجنب استخدام متكرر لنفس المعزز لتجنب مشاكل صمت الجين المعدل Ve المحتمل. بالإضافة إلى ذلك؛ يمكن أن تؤدي طريقة تصميم ذلك الجين المعدل بشكل كبير إلى خفض حجم تراص الجين المعدل التي تحتوي على الجينات المعدلة المتعددة. يؤدي نقل أربع جينات أو أكثر بمعزز واحد أيضاً إلى توفير قابلية للتعبير المشترك عن جينات تتحكم في صفة transgenic products منفردة تضمن كفاءة طويلة المدى للمنتجات المعدلة جينياً ونمطياً يتطلب تراص جينات معدلة (Jolie أصبح تطوير النباتات المعدلة وراثياً معقداً بشكل ١ بما Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9 متعددة في موقع واحد. انظرء» يتطلب معزز فريد للتعبير الجيني؛ يكون المطلوب معززات متعددة للتعبير Sale أن كل جين معدل عن جينات معدلة مختلفة داخل تراص جين واحد. بالإضافة إلى زيادة حجم تراص الجين؛ يؤدي ذلك بشكل متكرر إلى الاستخدام المتكرر لنفس المعزز للحصول على مستويات مماثلة لأنماط التعبير الوراصي للجينات المعدلة المختلفة. يصاحب تلك الطريقة في الغالب مشاكل؛ حيث يمكن Yo
HBGS أن يؤدي التعبير عن جينات متعددة مشتقة بواسطة نفس المعزز إلى صمت الجين أو في معززات (TF) binding sites يمكن أن تؤدي زيادة منافسة عامل انتساخ مواقع ارتباط transcriptional وتؤدي إلى توقف تنظيم انتساخي Laid) داخلي TFs متكررة إلى إضعاف سوف يؤثر صمت الجينات المعدلة بشكل محتمل إلى تأثير غير مرغوب .0014/0 regulation ناتج للتعبير للجينات المعدلة. يمكن أن تؤدي تتابعات تكرارية Why فيه على كفاءة نبات معدل Yo ملا
و داخل جين معدل إلى sale) اتحاد متجانس Jala homologous recombination موقع الجين مما يؤدي إلى إعادات لترتيب rearrangements عديد النيوكليوتيد. تكون معززات النبات المستخدمة للبحث الأساسي أو التطبيق التقني الحيوي بصفة عامة موحدة الاتجاه؛ وتنظم جين واحد فقط تم دمجه عند نهايتها '3 (فى نفس الاتجاه). حتى يتم إنتاج نباتات © معدلة Wh ذات صفات أو خصائص مرغوب فيها متعددة؛ يمكن أن يكون من add) خفض عدد المعززاتا لتي تنتشر لتنقل التعبير الجيني للجينات المعدلة التي ترمز الصفات والخصائص المرغوب led يكون من الضروري في الغالب إدخال جينات معدلة متعددة في النباتات للتعديل الوراتي الأيضي وتراص الصفات؛ بالتالي تستلزم المعززات المتعددة التي تحرك التعبير الجيني للجينات المعدلة المتعددة. بالتالي تطوير معزز ثنائي الاتجاه تخليقي منفرد الذي يمكن أن يحرك ٠ تعبير جيني لجينين معدلين تجاور dl يمكن خفض الأعداد الإجمالية للمعززات الضرورية لتطوير المحاصيل المعدلة وراثياً transgenic crops بالتالي لتقليل الاستخدام المتكرر لنفس المعزز؛ خفض حجم التركيبات المعدلة lily و/ أو خفض إمكانية HBGS تستخدم التجسيمات هنا عملية حيث lod معزز أحادي الاتجاه من جين الذرة يوبيكويتن -1 maize ubiquitin—1 gene (مثلء (ZmUDil ومعزز 811لا لتصميم معزز مخلق ثنائي ١ _ الاتجاه ؛ ومثل هذا المعزز المخلق يمكن له مباشرة التعبير للجينين الاثنين حيث يوجد واحد عند كل نهاية من المعزز. يمكن أن تشتمل عملية مستخدمة في هذه الوثيقة على تعريف عنصر معزز أساسي أدنى Ubil (0110ل00101) من جين ZmUbIL و تعديل هندسة ذلك العنصر في سياقات جديدة لتكوين معززات ثنائية الاتجاه التخليقية المعينة. يمكن أن تسمح معززات ثنائية الاتجاه مخلقة؛ Jie التي يمكن تكوينها بواسطة عملية وفقاً لبعض تجسيمات الاختراع في المجال ٠ ليتجميع الجينات المتحورة وراثياً في خلايا النبات والنباتات بينما يقوم بالتقليل الاستخدام المتكرر لنفس المعزز ويقلل من حجم البنايات المتحورة وراثياً. وعلى نحو أكثر من ذلك ربما أيضاً يمد تنظيم التعبير للجينين الاثنين مع معزز مخلق ثنائي الاتجاه بالقدرة على التعبير المشترك للجينين الاثنين تحت نفس الظروف؛ مثل هذا ربما يكون مفيد؛ فعلى سبيل المثال عندما يساهم كلا الجينين الاثنين في صفة واحدة في المضيف. وقد تم تسجيل استخدام معززات ثنائية الاتجاه من حيث Yo الوظيفة في نباتات في بعض الحالات؛ مشتملة على CaMV 35 promoters (Barfieldand tive
_ انام Pua (1991) Plant Cell Rep. 10(6-7):308-14; Xie et al. (2001)), and the mannopine synthase promoter (mas) promoters (Velten et al. (1984)
EMBO J. 3(12):2723-30; Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:3219-23) © يتم توجيه بدء النسخ وتنظيم تعبير الجين في جينات النبات بواسطة عناصر مختلفة لتتابع DNA والتي مجتمعة تم ترتيبها خلال المعزز. تتكون معززات حقيقيات النواة من عنصر قلب معزز أدنى رظمام) وتتابعات تنظيمية أكثر ضد الاتجاه upstream regulatory sequences .(URSS) ويُعد عنصر قلب المعزز امتداد أدني لتتابع DNA المجاورة التي تُعد كافية لتوجه بدء مضبوط لعملية النسخ. ويضم أيضاً معززات القلب في النباتات على مناطق مقبولة مرتبطة بالبدء ٠ في النسخ؛ Jie صناديق TATA; CAAT ويقع عنصر الصندوق We TATA تقريباً ٠ إلى Yo نيكليوتيدات ضد الاتجاه لمكان البدء في النسخ. يُعد تنشيط MINPY معتمداً على ال45الا؛ والتي بها يرتبط العديد من البروتينات ويتفاعل لاحقاً مع معقد بدء النسخ. ويضم ال455الا على تتابعات ال/لا(ا التي تحدد نمط التعبير الزمني المكاني للمعزز المشتمل على 45الا. ويتم تحديد القطبية للمعزز We بواسطة اتجاه ال0100؛ بينما يُعد URSY ١٠ ثنائي القطبية (أي أنه يقوم بوظيفته مستقلاً عن اتجاهه). على سبيل المثال؛ ربما يتم تحويل المعزز الأحادي الاتجاه القطبي المخلق 355 CaMV إلى معزز ثنائي الاتجاه بواسطة دمج MINP عند نهاية '3 من المعزز في الاتجاه المقابل. انظر على سبيل المثال» Xie et al. Nat. Biotechnol. 19(7):677-9 (2001). ويتم سرد بعض الاختصارات المعينة التي أفصح عنها في الجدول رقم .١ Yo جدول .١ الاختصارات المستخدمة في الإفصاح حمض ثنائى سينكونينك bicinchoninic acid فيروس القرنبيط الفسيفسائي cauliflower mosaic م
_ اذ اس ببتيد عبور البلاستيدات الخضراء CTP | chloroplast transit peptide إسكات .| الجين | على أساس متجانس | HBGS homology-based gene silencing قلب معزز أدنى minUbi1P ZmUbil تضخيم قلة الربط oligo ligation amplification المحلول الملحي المنظم بالفوسفات PBS | phosphate buffered saline المحلول الملحي المنظم بالفوسفات PBST | phosphate buffered saline ب9660..0 خلال (توين) ٠١ تفاعل سلسلة بوليميراز PCR | polymerase chain reaction تضخيم دائرة التدوير RCA | rolling circle amplification PCR بإنزيم ترانسكريبتاز العكسي RT-PCR | reverse transcriptase PCR امتداد بادئة النيكليوتيد المفردة SNuPE | single nucleotide primer extension i il 0 = جين يوبيكوتين -1 ZmUbil Zea mays g1ve
—yvo- (ZMmUbi1) ذرة Ubil في أمثلة خاصة لبعض التجسيمات يتم استخدام عناصر معدلة من معزز لهندسة معززات مخلق ثنائي الاتجاه التي ربما (B73 Z. mays مشتق من السلالة الطبيعية تقوم بوظيفة في النباتات لتقدم خصائص التحكم بالتعبير التي تُعد فريدة مع الأخذ في الاعتبار أصلاً المشتق من 873 تتابعات تقع ZmUDBIT معززات ثنائية الاتجاه متاحة سابقاً. يضم معزز فيما يقرب من 899 قاعدة من موقع بدء النسخ ل5؛ وفيما Maize genome الذرة agua على ©
Christensen et al. (1992) Plant Mol. قاعدة من موقع بدء النسخ ل39. ٠٠١57 يقرب من
ZmUbil ويُعد معزز .8101. 18(4):675-89 (describing a B73 ZmUbil gene) معزز ما يقرب من ؟كيلو قاعدة والذي ABN المعدل المشتق من 873 والذي يستخدم في بعض وتقود عناصر إجماع لاثنين متداخلين من الصدمات الحرارية؛ 47 أو (TATA يحتوي صندوق نيكليوتيد (معتمداً على مرجعية الجديلة) التتابع القريبة بالفعل من موقع بدء النسخ؛ التي يمكن 87 ٠ على سبيل ١ نيكليوتيد (انظر شكل ٠١٠-١٠١٠١١5 الإشارة إليها هنا كإكسون 011ل200؛ وإنترون
Zea المشتق من أنواع (ubiquitin) وربما تبرز بدائل أخرى لمعزز الذرةٍ اليوبيكويتن «(JE المتكون من MNP 68>تتابع عالية البقاء حول عنصر mays ل genotypes والأنواع الوراثية وعناصر مجتمعة ضد الاتجاه للصدمة الحرارية. وبذلك يتم توضيح تجسيمات TATA عنصر SEQ ID NO: (متلء )-200 nt) الاختراع بالأمثلة باستخدام تلك المنطقة عالية البقاء القصيرة ve لمعزز 5011لا207 كعنصر قلب معزز أدنى لإنشاء معززات نبات ثنائية الاتجاه مخلقة. (1 كالمستخدم هنا في أدوات التنكير والتعريف فإنها تشمل مرجعيات جمع إلا إذا كان السياق يملي إلى غير ذلك بوضوح وبدون لبس فيه. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "تزاوج تبادلى 58001055109 " إلى عملية والتي فيها يتخطى
Jia على سبيل ¢ parents راجعاً إلى أحد الأبوين hybrid progeny المُولد ذرية الهجين ٠ parental مع واحد من الأنواع الوراقية الأبوية F1 generation hybrid أول جيل مهجن hybrid الهجين F1 ل genotypes كالمستخدم هنا يشير المصطلح "إنترون" إلى أي تتابع حمض نووي مشتمل في جين (أو تتابع نيكليوتيد معبر عنها للفائدة) التي يتم نسخها ولا يتم ترجمتها. يكون الإنترون مختلف عن نهاية تتابع Introns لا يتم اعتبارها كجزء من جين. تشمل الانترونات Cua بتتابع غير مترجمة قائدة YO ملا
1+ (ass نووي nucleic acid sequence غير مترجمة untranslated خلال تتابع DNA معبر عنهاء بالإضافة إلى التتابع المقابل corresponding sequence .في جزيئات RNAS molecules المنسوخة من ذلك. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "معزول "isolated إلى مكون حيوي biological component ° (مشتملاً على حمض أو بروتين) قد تم فصله فعلياًء تم إنتاجه (ope تنقيته بعيداً عن المكونات البيولوجية biological components الأخرى في خلية اا66 الكائن organism all التي فيها يحدث المكون component بصورة طبيعية (أي RNA 3 DNA الكروموسومي chromosomal والفوق كروموسومي cextra-chromosomal والبروتينات)؛ بينما تؤثر على تغير وظيفي functional change أو كيميائي في المكون component (مثل؛ ربما يتم Jie الحمض ٠ النووي من كروموسوم chromosome بكسر الروابط الكيميائية chemical bonds التي تربط الحمض النووي إلى DNA المتبقي في الكروموسوم). يشمل جزيئات الحمض النووي nucleic acid molecules والبروتينات التي قد تم "عزلها" جزيئات حمض نووي وبروتينات تم تنقيتها بواسطة طرق التنقية القياسية standard purification methods ويحتوي أيضاً المصطلح 'معزول "isolated إلى الأحماض النووية والبروتينات المعدة بواسطة التعبير المؤتلف في خلية Vo المضيف host cell ؛ بالإضافة إلى جزيئات الحمض النووي المخلق كيميائياً؛ والبروتينات؛ والببتيدات peptides كالمستخدم هنا يشير المصطلح 'التعبيرالجيني” إلى عملية بها يتم تحويل المعلومات المرمزة coded information على وحدة النسخ للحمض النووي (مشتملاً؛ Sie اللا الجينومي (genomic إلى جزء عملي أو جزء غير عملي أو جزء تركيبي part 5171010181 من الخلية cell ٠ ء We مشتملاً على تخليق البروتين. يمكن أن يتم حث التعبير الجيني بالإشارات الخارجية external signals ؛ على سبيل (JB) تعرض خلية؛ أو نسيج؛ أو كائن حي إلى العامل الذي يزيد أو يقلل من التعبير الجيني. ويمكن أيضاً للتعبير للجين أن يتم تنظيمه في أي مكان في الطريق من DNA إلى RNA إلى بروتين. ويحدث تنظيم التحكم الجيني على سبيل المثال خلال التحكمات التي تحدث على النسخ؛ والترجمة؛ ونقل (RNA والمعالجة؛ وتفسخ الجزيئات الوسطية «MRNA (fie Yo أو من خلال التنشيط activation ؛ أو الإخماد inactivation ؛ أو التقسيم ملا
الا compartmentalization « أو تفسخ degradation جزيئات البروتين الخاصة بعد بعد ما تم صناعتهم؛ أو بمجموعات من ذلك كله. ويمكن أن يتم قياس التعبير الجيني عند مسترى RNA أو مستوى البروتين بواسطة أي طريقة معروفة في المجال؛ مشتملاً على وليس الحصر تبقيع نورثرن (RT-PCR; « Northern blot وتبقيع ويسترن Western blot « أو فحص 0 أوفحوصات نشاط البروتين في خارج الخلايا الحية vitro ؛ أو في مكانها situ أو في داخل الخلايا الحية Vivo كالمستخدم هنا يشير المصطلح "إسكات جين على أساس التجانس homology—based gene (HBGS) "silencing إلى مصطلح عام الذي يشمل كل من إسكات الجين النسخي واسكات الجين بعد النسخي posttranscriptional ويمكن أن ينتج إسكات مكان الهدف target locus - بواسطة مكان إسكات غير مرتبط من تثبيط النسخ (إسكات الجين النسخي transcriptional gene silencing ؛ (TGS أو تفسخ MRNA (إسكات الجين بعد النسخي؛ (RTGS مدينة بإنتاج RNA المزدوج الجديلة (dsRNA) متناظر للمعزز أو تتابعات منسوخة كل على حدى. ويقترح اشتمال المكونات الخلوية المميزة في كل عملية أن ال165 PTGS; التي يسببها dSRNAY تنتج من تنويع آلية مشهورة قديمة. بالرغم من أنه تعد المقارنة الدقيقة ما بين TGS Vo و0165 صعبة التحقيق بسبب أنها تعتمد عامة على تحليل أماكن الإسكات Sead) ويمكن لمكان الجين المتحور الواحد أن يتم توضيحه ليحفز كل من PTGS, TGS مدينة إلى إنتاج dsRNA المتناظر للمعزز والتتابعات المنسوخة للجينات المستهدفة المختلفة. انظر على سبيل المثال 225:365-79 Mourrain et al. (2007) Planta إنها أكثر أن عد siRNAs الجزيئات الحقيقية التي تحفز 165 PTGS; على التتابعات المتجانسة: يحتمل أن تحفز ٠ ال5ظلظة 5 في هذا النموذج إسكات واضافة الميثيل methylation _لتتابعات متجانسة في سيس وفي ترانس خلال انتشار إضافة الميثيل في الجين المتحور إلى المعزز الداخلي endogenous .promoter كالمستخدم هنا يشير المصطلح ”جزئ حمض نووي” (أواحمض نووي” أو "بولي نيوكليوتيد") إلى هيئة البوليميرية cpolymeric form التي ربما تشتمل كل من جديلات RNA strands في Yo اتجاه وعكس اتجاه DNA «cDNA 5 mull الجينوم؛ والأشكال المخلقة synthetic forms ملا
م والبوليميرات المختلطة Mixed polymers من السابق. وربما يشير النيكليوتيد إلى ريبونيوكليوتيد ribonucleotide ؛ أو دي أوكسي ريبونيوكليوتيد deoxyribonucleotide ؛ أو شكل معدل modified form من أي نوع من النيوكليوتيد. ويستخدم ”"جزئ الحمض النووي" هنا كمترادف ل"الحمض النووي" و"البولي نيوكليوتيد”. ويتكون الحمض النووي We على الأقل من ٠١ قواعد في © الطولء ما أن يذكر غير ذلك. Lay يشير المصطلح إلى جزئ RNA أو DNA غير محدد الطول. ويشمل المصطلح DNAN cilia المفرد الجديلة single أو المزدوج الجديلة double-stranded وربما يشمل جزئ الحمض النووي nucleic acid molecule على إما أو كل من النيوكلوتيدات المعدلة modified nucleotides والتي تحدث طبيعياً والمتصلة ببعضها بواسطة روابط نيوكليوتيد طبيعية الحدوث و/ أو غير طبيعية الحدوث.
٠ _ربما يتم تعديل جزيئات الحمض النووي كيميائياً أو بيوكيميائياً. أو ربما يحتوي قواعد نيوكليوتيد nucleotide bases غير طبيعية non-natural أو مشتقة derivatized كالذي سوف يتم اختصاره بالفعل من هؤلاء من ذوي المهارة في المجال. وتشتمل مثل هذه التعديلات على سبيل JE على علامات ترقيمية labels « أو إضافة الميثيل methylation « أوتبديل واحد أو أكثر من النيوكليوتيدات الطبيعية الحدوث بمتمائل؛ أو تعديلات بين النيوكليورتيدات internucleotide
modifications ١٠ (مثل؛ الروابط pall مشحونة uncharged linkages على سبيل المثال؛ الميتيل فوسفات methyl phosphonates ؛ وفوسفوتراي استرات phosphotriesters « والفوسفوأميدات phosphoramidates « والكربامات carbamates ؛ وهكذا؛ والروابط المشحونة :charged linkages على سبيل المثال» فوسفوروثيوات phosphorothioates « والفسفورود ايقيوات phosphorodithioates ؛ وهكذا؛ وأشطار معلقة pendent moieties فيها:
Ji ؛ والمقحمات 1716081810+5: على سبيل peptides على سبيل المثال: الببتيدات Yo ؛ والعوامل القلوية chelators ؛ وهكذا؛ والخالبات psoralen وسورالين » acridine اكريدين أحماض نووية (JED على سبيل : modified linkages ؛ والروابط المعدلة alkylators ؛ هكذا). ويشمل alpha anomeric nucleic acids للمصاوغ الكربونيلى فى الموضع الفا على أي تكيف طوبولوجي La" nucleic acid molecule المصطلح ”جزئ الحمض النووي
¢ single-stranded ؛ مشتملة على تكيفات أحادي الجديلة topological conformation Yo
ملا
4+ وثنائي الجديلة» ومضاعف SB جزئياً partially duplexed « ومضاعف ثلاثي جزئياً Ay « triplexed شكل دبوس الشعر circular aay « hairpinned ؛ والمقفلة .padlocked يجرى النسخ في اتجاه نمط من "5 إلى '3 بطول جديلة الظلاانا. ويعني هذا أن RNA مصنوعة © بواسطة LEH Ala) من ريبونيوكليوتيد “5 -تراي فوسفات ribonucleotide -5- J) triphosphates النهاية 3 من السلسلة المتكونة (مع النهاية الضرورية للبيروفوسفات Ly, (pyrophosphate تشير العناصر المنفصلة في أي من جزئ الحمض النووي الخطي linear الدائري (Jig) circular تتابعات نيوكليوتيد خاصة) إلى أن تكون am’ الاتجاه" بالتناسب إلى عنصر أخر لو كانوا مرتبطين أو ربما تكون مرتبطة إلى نفس الحمض النووي في اتجاه 5 من هذا العنصر. ومشابهاً لذلك ربما تكون العناصر المنفصلة 'في فى نفس الاتجاه" بالتناسب إلى عنصر أخر لو كانوا مرتبطين أو ربما يتم ارتباطهم بنفس الحمض النووي في اتجاه '3 من هذا العنصر. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "موضع القاعدة J)" base position مكان قاعدة معينة given J base باقي النيوكليوتيد خلال حمض نووي مصمم. وربما يتم التعرف على الحمض النووي Vo المصمم بالمحاذاة (انظر أدناه) مع الحمض النووي بمرجعية. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "تهجين hybridization " إلى عملية التي led يتهجن السلاسل القليلة من النيوكليوتيدات وأمثالها عن طريق الرابطة الهيدروجينية hydrogen bonding ؛ التي تشتمل واطسن -كريك ((Watson—Crick) أو هوجستين ((Hoogsteen) أو هوجستين العكسي (reversed Hoogsteen) للرابطة الهيدروجينية ما بين قواعد مكملة. وبصفة عامة يتكون Yo جزيئات الحمض النووي من قواعد نيتروجينية nitrogenous bases والتي إما من البريميدينات (سيتوزين cytosine ()؛ يوراسيل uracil (لا)؛ وثايمين thymine (1)) أو البيورينات purines (أدينين (A) adenine وجوانين guanine (©)). وتكون هذه القواعد النتروجينية روابط هيدروجينية ما بين البيريميدين والبيورين» ويشير الترابط ما بين البريميدين 0686 والبيورين purine إلى 'تزاوج القواعد base pairing ". وبشكل خاص أكثر A Yo سوف ترتبط هيدروجينياً To أو GU سوف ترتبط ب©. ويشير "المكمل” إلى تزاوج القواعد الذي ملا
مو يحدث ما بين تتابعي معروفتين اثنتين للحمض النووي أو منطقتين معروفتين اثنتين لنفس تتابع الحمض النووي. كالمستخدم هنا تشير المصطلحات 'من الممكن تهجينه بشكل خاص” وامكمل بشكل خاص” إلى درجة كافية من التكامل مثل هذ الترابط الخاص والثابت يحدث ما بين قليل من النيوكليوتيد © والظللة أو DNA المستهدف. ولا تحتاج سلسلة النيوكليوتيد القليلة أن تكون 96٠0٠0 متكاملة إلى التتابع المستهدفة لها لكي تكون من الممكن تهجينها بشكل خاص. وتتدخل سلسلة النيوكليوتيد القليلة التي من الممكن تهجينها بشكل خاص عندما ترتبط سلسلة النيوكليوتيد القليلة إلى جزئ RNA, DNAY المستهدف مع الوظيفة الطبيعية لل/لا0 المستهدف أو RNA المستهدف؛ وهناك درجة كافية من التكامل لتجنب الترابط الغير خاص لسلسلة النيوكليوتيد القليلة إلى تتابعات ٠ غير مستهدفة تحت الظروف التي فيها يُعد الترابط الخاص مرغوباً؛ على سبيل المثال تحت الظروف الفسيولوجية Physiological conditions في حالة الفحوصات داخل الخلايا الحية أو الأنظمة. ويشار إلى مثل هذا الترابط كونه تهجين خاص. سوف تختلف ظروف التهجين التي تؤدي إلى درجات degrees خاصة من الصرامة معتمدة على طبيعة طريقة التهجين hybridization method المختارة وتركيبة وطول تتابعات الأحماض ١ النووية المهجنة. بصفة عامة سوف تساهم درجة الحرارة temperature للتهجين والقوة الأيونية ionic strength (خاصة تركيز Na+ و/ أو تركيز (Mg2+ لمنظم التهجين hybridization )آنا في صرامة التهجين؛ بالرغم من أن أوقات الغسيل Leaf wash times تؤثر في الصرامة stringency وقد تم شرح الحسابات التي تتعلق بظروف التهجين hybridization conditions المطلوبة للحصول على درجات خاصة من الصرامة في Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring ٠٠ Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 .and 11 كالمستخدم هنا يشمل المصطلح "ظروف الصارمة "stringent conditions الظروف التي تحتها Cage تحدث التهجين فقط لو كان هناك أقل من 9650 متصل lal ما بين جزئ التهجين hybridization molecule Yo وال/لانا المستهدف. وتشمل " الظروف الصارمة" على مستويات ملا
_— \ _ خاصة أكثر من الصرامة. وبذلك كالمستخدم هناء سوف لا يتم التهجين في ظروف "الصرامة المتوسطة moderate stringency " هي التي تحتها الجزيئات التي فيها أكثر من ٠ 965 متصل sadly وسوف لا يتم التهجين في ظروف من "الصرامة العالية high stringency " التي فيها تتابعات بأكثر من 9670 اتصال بالخطاً؛ وظروف "الصرامة العالية las هي تلك التي led © تتابعات بأكثر من 96٠0 اتصال بالخطأً والتي لا يتم led التهجين. في تجسيمات خاصة يمكن للظروف الصارمة أن تشمل التهجين عند 15 درجة مئوية؛ وتالياً لذلك بعمليات غسيل عند 10 درجة مئوية ب505 556/0.196 0.1% لمدة £4 دقيقة. وتعد Jl ظروف تهجين ممثلة غير قاصرة: صرامة عالية جداً: التهجين في محلول منظم 5X SSC buffer عند 15 درجة مئوية لمدة ٠١ room في درجة حرارة الغرفة 2X SSC الغسل في محلول منظم Lhe ساعة؛ وتتم ٠ 0.5«* في محلول منظم wash دقيقة لكل واحدة؛ وتتم عملية الغسل Yo لمدة temperature دقيقة لكل واحدة. ٠٠ عند 15 درجة مثوية لمدة SSC
Yo) عند 0-75 درجة مئوية لمدة 5X-6X SSC صرامة عالية: التهجين في محلول منظم دقيقة 7 ١-ه sad في درجة حرارة الغرفة 2X SSC ساعة؛ وتتم عملية الغسل في محلول منظم ١ ٠ لمدة a she درجة Y.—00o عند 17» SSC عملية الغسل في محلول منظم als لكل واحدة؛ Yo دقيقة لكل واحدة. الغرفة إلى 00 درجة مئوية sha في درجة 6X SSC صرامة متوسطة: التهجين في محلول منظم في 27-3«* SSC ساعة؛ وتتم عملية الغسل على الأقل مرتين في محلول منظم 70-١7 لمدة ؟ دقيقة لكل واحدة. >-٠١ درجة مئوية لمدة oo درجة حرارة الغرفة إلى Ka ٠٠ أن يتبقى في بعض التجسيمات الخاصة جزيئات الحمض النووي الممكن تهجينها بخاصة مرتبطة تحت ظروف تهجين صرامة عالية جداً. ويمكن أن يتبقى في تلك التجسيمات وغيرها جزيئات الحمض النووي الممكن تهجينها بخاصة مرتبطة تحت ظروف تهجين صرامة عالية جداً. دما
وه وربما يمكن أن يتبقى في تلك التجسيمات وغيرها جزيئات الحمض النووي الممكن تهجينها بخاصة مرتبطة تحت ظروف تهجين متوسطة الصرامة. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "قليل النيوكليوتيد "oligonucleotide إلى بوليمير polymer حمض نووي قصير. وربما يتم تكوين قليل النيوكليوتيدات بكسر cleavage أجزاء الأحماض oo النووية الطويلة؛ أو ببلمرة polymerizing المواد السابقة للنيوكليوتيد الفردي. وتسمح المخلقات الآلية Automated synthesizers بتخليق قليل النيوكليوتيدات إلى العديد من مئات أزواج القواعد base pairs في الطول. lays يتم استخدام قليل النيوكليوتيد كمجسات للكشف عن الهلا والظل!»_لأنها_ربما ترتبط إلى تتابع نيوكليوتيد مكمل. lays يتم استخدام قليل النيوكليوتيدات . المتكون .من ال8ل08 . (أوليجو دي أوكسي. ريبونيوكليوتيدات (oligodeoxyribonucleotides | ٠ في «PCR والذي يُعد تقنية لتضخيم تتابعات DNA الصغيرة. وفي PCR تشير قليل النيوكليوتيد بشكل نموذجي إلى "البادئ” الذي يسمح DNAT بوليميراز polymerase ليطيل من قليل النيوكليوتيد وينسخ الجديلة المكملة .complementary strand كالمستخدم هنا يشير المصطلح Cay pd التتابع” أو "التعريف” إلى سياق فيه ربما تشير تتابعي حمض نوي اثنتين أو بولي ببتيد polypeptide اثنتين إلى المتبقي من التتابعي الاثنتين واللتان ١ يُعدا نفس التتابعي عندما يتم التراص لأجل تطابق أقصى على شباك مقارنة خاص. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "نسبة تعريف التتابع" إلى القيمة التي يتم تحديدها بمقارنة تتابعي بمحاذاة قصوى (مثل؛ تتابعات حمض نووي nucleic acid sequences ؛ وتتابعات حمض أميني (amino acid sequences من خلال شباك مقارنة حيث la) يضم جزء التتابع في شباك المقارنة على إضافات أو حذوفات (أي؛ فجوات (gaps بالمقارنة إلى التتابع المرجعية (التي ٠ لا تضم إضافات أو حذوفات) لأجل تراص أقصى للتتابعي الاثنتين. ويتم حساب النسبة بتحديد رقم المواضع التي عندها يحدث النيوكليوتيد المطابق أو متبقى الأحماض النووية في كلا المتواليتن لإنتاج عدد من المواضع المتصلة؛ وبقسمة رقم مواضع الاتصال على الرقم الكلي للمواضع في شباك المقارنة؛ ويتم ضرب النتيجة في ٠٠١ لإنتاج النسبة المثوية لتعريف التتابع. ملا
اسه وتعد الطرق لتراص التتابعات للمقارنة معروفة جيداً في المجال. ويتم توضيح البرامج ولوغاريتمات التراص في على سبيل المثال: Smith and Waterman (1981) Adv.
Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J.
Mol.
Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) © CABIOS 5:151-3; Corpet etal. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp.
Appl.
Biosci. 8:155-65; Pearson etal. (1994) Methods Mol.
Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. .Lett. 174:247-50 ويمكن أن يوجد اعتبار مفصل لطرق التراص للتتابع وحسابات التجانس Altschul et al. (1990) J.
Mol.
Biol.
Sis homology calculations A 215:403-10. يُتاح المركز القومي للمعلومات الحيوية التكنولوجية National Center for Biotechnology Altschul <BLAST™) Basic Local Alignment Search Tool (NCBI) Information (et al. (1990) من العديد من plead) بما في ذلك المركز القومي للمعلومات الحيوية ١ التكنولوجية (Bethesda, MD) وعلى شبكة الإنترنت؛ للاستخدام Lad يتعلق بالعديد من برامج تحليل التتابعات. يُتاح وصف لكيفية تحديد تطابق تتابع مستخدمًا هذا البرنامج على الإنترنت بموجب القسم 'مساعدة" ل "818517. من أجل مقارنات وظيفة تتابعات الحمض النووي؛ فإنه يمكن استخدام وظيفة 'تتابعات 2 ‘Blast لبرنامج (Blastn) BLAST™ مستخدماً المتغيرات الافتراضية. سوف تؤدي تتابعات الحمض النووي ذات التشابه الأكبر للتتابعات المرجعية إلى نسبة ٠ تطابق زائدة عند قياسها بهذه الطريقة. كالمستخدم هنا يشير المصطلح 'مرتبط عملياً” إلى سياق حيث يكون تتابع الحمض النووي الأولي مرتبطة عملياً بتتابع الحمض النووي الثانية عندما يكون تتابع الحمض النووي الأول في علاقة مع تتابع الحمض النووي الثانية. فعلى سبيل المثال؛ يكون المعزز مرتبط عملياً بتتابع الترميز عندما يؤثر المعزز على النسخ أو التعبير لتتابع الترميز. وعندما تنتج بإعادة الالتثام؛ فإنه تعد تتابعات YO الأحماض النووية المرتبطة عملياً بصفة عامة متماس وحيث يكون من الضروري لربط منطقتين م1
وه اثنتين لترميز البروتينات في نفس إطار القراءة. بالرغم من أنه لا تحتاج العناصر أن تكون متماسة لكي تكون مرتبطة عملياً. كما هو مستخدم في هذه الوثيقة يشير المصطلح "jad إلى منطقة من DNAY التي تقع بصفة عامة ضد الاتجاه (في اتجاه منطقة '5 من الجين) التي يتم احتياجها في عملية النسخ. وربما تتيح 0 المعززات التنشيط الكافي أو كبت gall التي تتحكم فيه. lays يحتوي المعزز على تتابعات خاصة التي يتم معرفتها بواسطة عوامل النسخ. وتلك العوامل ربما ترتبط إلى تتابعات معزز الهلا وتؤدي إلى إعادة توظيف الظلاا» بوليميراز» والذي عبارة عن إنزيم يخلق RNA من منطقة الترميز coding region للجين. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "يحول "transforms أو 'يقوم بتنبيغ transduces " إلى عملية ٠ حيث ينقل الفيروس أو الناقل vector جزيئات الحمض النووي إلى الخلية. والخلية التي "يتم تحويلها" بواسطة جزئ حمض نووي "يتم نقله" إلى الخلية عندما يصبح جزئ الحمض النووي يمكن مضاعفته بثبات بواسطة الخلية؛ إما بواسطو دمج جزئ الحمض النووي إلى جينوم خلوي cellular genome أو بمضاعفة يصبوغية episomal replication (جرثومية). وكالمستخدم هنا يشمل المصطلح 'تحويل” كل التقنيات التي بيها يمكن لجزئ الحمض النووي إدخاله في مثل هذه الخلية. Vo وتشمل AEN وليس الحصر: تقل sold) الوراثقية بنواقل فيروسية viral vectors ؛ وتحويل باستخدام نواقل بلازميدية plasmid vectors ؛ وعملية كهربية (Fromm et electroporation cal. (1986) Nature 319:791-3) ونقل الشحم (Felgner et al. lipofection cally ¢(1987) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 84:7413-7) المجهري ¢(Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85) microinjection ونقل بوساطة أجروباكتيريم ¢(Fraley et al. (1983) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 80:4803-7) ٠ وارتشاف DNAD المباشر؛ وتحويل بوساطة ويسكرز whiskers—mediated transformation « وانفجار بمقذوف مجهري (Klein et al. (1987) microprojectile bombardment Nature 327:70) كالمستخدم هنا يشير المصطلح "جين معدل وراثياً” إلى تتابع حمض نووي خارجية. في مثال واحد؛ Why dad gel Yo هو تتابع جين Ji) جين مقاوم لمبيدات الأعشاب ملا
هه (herbicide-resistance gene وجين يشفر لمركب مفيد صناعياً أو صيدلياً؛ أو جين يشفر لصفة مرغوبة زراعياً. وفي مثال أخرء يعد الجين المعدل وراثياً تتابع حمض نووي ضد الإحساس؛ حيث يثبط التعبير عن منوالية الحمض النووي ضد الإحساس تعبير تتابع الحمض النووي المستهدف. وربما يحتوي الجين المعدل وراثياً على تتابعات تنظيمية مرتبطة عملياً بالجين المعدل Sg) Ty 5 معزز). وفي بعض التجسيمات يعد الجين المعدل وراثياً عبارة عن تتابع حمض نووي للفائدة. بالرغم من إنه في تجسيمات أخرى يعد تتابع الحمض النووي للفائدة تتابع حمض نووي داخلي؛ حيث تكون النسخ الإضافية من الجينوم لتتابع الحمض النووي الداخلية مرغوبة؛ أو تتابع الحمض النووي التي تكون في اتجاه ضد الإحساس مع الأخذ في الاعتبار إلى تتابع جزئ الحمض النووي المستهدف في AK الحي المضيف host organism ٠ كالمستخدم هنا يشير المصطلح 'ناقل" إلى جزئ حمض نووي يمكن إدخاله إلى الخلية؛ وبذلك يتم إنتاج خلية متحولة transformed cell وربما يشمل الناقل على تتابعات حمض نووي تُتيح لها المضاعفة في الخلية المضيفة؛ حيث تكون dual المضاعفة. وتشمل الأمثلة على وليس الحصرء بلازميد plasmid ؛ أو كوزميد cosmid ؛ وباكتيريوفاج bacteriophage « أو فيروس Virus الذي يحمل DNA خارجي إلى داخل خلية. ويمكن أيضاً للناقل أن يشمل على واحد أو أكثر من Vo الجينات؛ و/ أو جزيئات مضادة للانتساخ antisense molecules و/ أو جينات واصمة منتقاه selectable marker genes ووالعناصر الجينية الأخرى المعروفة في المجال. وربما ينقل؛ أو يحول؛ أو يصيب الناقل الخلية؛ وبذلك يجعل الخلية تعبر عن جزيئات الحمض النووي و/ أوالبروتينات المرمزة proteins encoded بواسطة الناقل. Lays يشمل الناقل اختيارياً على المواد التي تساعد على تحقيق دخول جزئ الحمض النووي nucleic acid molecule إلى داخل الخلية ف (مثلاًء ليبوسوم .(liposome كالمستخدم هنا Jody المصطلح "نبات" على النباتات وأجزاء النبات plant parts مشتملاً وليس الحصر على WIA النبات وأنسجة النبات Jie الأوراق leaves ؛ والسيقان stems « والجذور roots « والأزهار 5 + وحبوب اللقاح pollen ؛ والبذور 56605. ويُعد صنف النباتات التي يمكن استخدامها في الاختراع الحالي بصفة عامة بشكل واسع كصنف النباتات الأعلى أو vo الأقل All من الممكن تعرضها للطفرة mutagenesis مشتملة على كاسيات البذور
(نباتات مونوكوتيليدونس monocotyledonous وداي كوتيليدونس «(dicotyledonous وعاريات البذور gymnosperms » والسرخسيات ferns والطحالب متعددة الخلايا multicellular algae وبذلك تشمل "نبات" على نباتات مونوكوتيليدونس ونباتات
داي كوتيليدونس. وتشمل أمثلة نباتات داي كوتيليدونس على التبغ tobacco ؛ وأرابيدوبسيس
Arabidopsis © ؛ وفول الصويا soybean ؛ والطماطم tomato ؛ والبابايا papaya ؛ والكانولا canola « والقطن cotton ؛ وعباد الشمس sunflower ؛ والبرسيم «alfalfa والبطاطس potato ؛ والعنب grapevine » والبسلة pigeon pea ؛ والبازلاء pea ؛ والكرنب Brassica
٠ والحمص chickpea ؛ وبنجر السكر sugar beet ؛ وبذور اللفت rapeseed ؛ والبطيخ watermelon ؛ والشمام melon ؛ والفلفل pepper ؛ والفول السوداني peanut « والقرع
« broccoli ؛ والبروكلي squash والكوسا « spinach ؛ والسبانخ radish ؛ والفجل 0000001600 | ٠ والكرنب » celery ؛ والكرفس cauliflower ؛ والقرنبيط carrot ؛ والجزر cabbage والملفوف والباذنجان 69901801 ؛ والخس ¢ cucumber والخيار Chinese cabbage الصيني وقصب السكر rice والأرز » corn وتشمل أمثلة نباتات مونوكوتيليدونس على الذرة lettuce ؛ وبساتين الفاكهة sorghum ؛ والذرة الرفيعة rye والجاودار » barley ؛ والشعير sugarcane
orchids Vo ؛ والخيزران bamboo « والموز banana ؛ وأعشاب الأحواض cattails ؛ والزنابق lilies ؛ والشوفان 081 ؛ والبصل onion ؛ والذرة العويجة millet (دخن)؛ والتريتيكال triticale كالمسنخدم هنا يشير المصطلح sal نبات plant material " إلى الأوراق» والسيقان» والجذورء والأزهار» أو أجزاء الزهرة؛ والفاكهة؛ وحبوب اللقاح؛ والبويضات egg cells ؛ وخلايا الزيجوت zygotes والبذور؛ والقصاصات cuttings ؛ استنباتات الخلايا أو الأنسجة؛ أو أي جزء أو
leaf أو ورقة cotyledon النبات على كوتيليدون sale منتج نبات. وفي بعض التجسيمات يشمل Yo إلى آلية عند نهاية جين تسمح بالترجمة لجين engl كالمستخدم هنا يشير المصطلح 'مفتاح
حالي في فى نفس الاتجاه. ويمكن لآلية مفتاح الترجمة أن يتم توظيفه عند مستوى الحمض النووي
eukaryotic internal سبيل المثال؛ مكان دخول الريبوسوم الداخلي لحقيقيات النواة Je)
alternative أو مكان تضفير بديل ((IRES) viral أو الفيروسى ribosome entry site أو مستوى ببتيد/ بروتين (ribozyme cleavage site أو مكان كسر ريبوزيم «splicing site Yo
ملا
- (على سبيل JE ببتيد QA شبيه البببتيد QA أوببتيد إنتاين؛ أو مكان كسر البروتياز .(protease cleavage site تكون تلك الآليات لمحول ترجمة عند مستوى حمض نيكولوتيد أو عند مستوى ببتيد/ بروتين معروفة جيداً في الفن. انظرء على سبيل المثالء li, Z., H.
M.
Schumacher, et al. J Biotechnol 145(1): 9-16; Chen, Y., K.
Perumal, et al. (2000) © )2010( Gene Expr 9(3): 133-143; Dinkova, T.
D., H.
Zepeda, et al. (2005) Plant J 41(5): 722-731; Dorokhov, Y.
L., M.
V.
Skulachev, et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99(8): 5301-5306; Fernandez-Miragall, 0. and C. Hernandez (2011) PLoS One 6(7): 622617: Groppelli, E., 6. J.
Belsham, etal. (2007) J Gen Virol 88(Pt 5): 1583-1588; Ha, 5. H., Y.
S.
Liang, et ٠ al. (2010) Plant Biotechnol J 8(8): 928-938; Karetnikov, A. and K.
Lehto Lehto .ا J Gen Virol 83(Pt 1): 286-297; Karetnikov, A. and )2007( Virology 371(2): 292-308; Khan, M.
A., H.
Yumak, et al. (2009) J )2008( Biol Chem 284(51): 35461-35470; and Koh, D.
C., S.
M.
Wong, et al. Alls (2003) J Biol Chem 278(23): 20565-20573 ١ تم تضمين محتواها في هذه الوثيقة كمراجع. ووقد تم إفشاء بنايات التعبير المتعدد الجيني المحتوي إنتينات معدلة في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 7,073,577 ء و 7,751,530 بالإضافة إلى طلب براءة الاختراع الأمريكية 47 ٠٠١/١٠١7 كالمستخدم هنا يشير المصطلح "علامة من الممكن انتقائها” أو "جين علامة من الممكن انتقائه" Ye إلى جين يتم استخدامه اختيارياً في تحويل النبات eed سبيل المثال؛ حماية WDA النبات من العامل المختار selective agent أو يمد بمقاومة/تحمل إلى العامل المختار selective 14. وتستقبل فقط هذه الخلايا أو النباتات علامة وظيفية من الممكن انتقائها والتي تعد قادرة على القسمة أو النمو تحت ظروف تشمل على عامل مختار. وتشمل أمثلة العوامل المختارة selective agents على سبيل المثال؛ المضادات الحيوية antibiotics ؛ والمشتملة على Yo سبيكتينوميسين spectinomycin » ونيوميسين 060017617 » وكاناميسين kanamycin « ذا
A
وباروميسين paromomycin ؛ وجنتاميسين gentamicin ¢ وهجيرومايسن hygromycin وتشمل العلامات التي يمكن WE على جين لإنزيم نيوميسين فوسفوترانسفيراز NEOMYCIN phosphotransferase (١١001)؛ التي تعبر عن إنزيم Jody enzyme مقاومة resistance إلى المضاد الحيوي antibiotic كاناميسين؛ والجينات للمضادات المتعلقة كالنيوميسين neomycin © « والباروميسين؛ والجنتاميسين؛ و6418؛ أو_الجين الإنزيم هيجروميسين فوسفوترانسفيراز (NPE) التي تعبر عن إنزيم مشتمل على مقاومة للهيجرومايسين. ويمكن أن تشمل جينات يتم انتقائها أخرى على جينات ترميز encoding لمقاومة مبيد الأعشاب herbicide resistance مشتملة على بار Bar (مقاومة aa 551/8 (جلوفوسينات أمونيوم «(glufosinate ammonium أو فوسفينوترايسين «((PPT) phosphinothricin واسيتولاكتات ALS) acetolactate synthase jin Ve مقاومة ضد المثبطات inhibitors مثل سلفونيل يوريا (USs) sulfonylureas واميدازولينونات «(IMIs) imidazolinones وتراي زولوبيريميدينات «(TPs) triazolopyrimidines وبيريميدنيل أوكسيبنزوات pyrimidinyl ((POBs) oxybenzoates وسلفونيل sid كربونيل تراي أزولينونات sulfonylamino carbonyl triazolinones التي تمنع الخطوة الأولى من تخليق الأحماض الأمينية متفرحة ١٠ السلسلة amino acids 51800080-0080)» والجليفوسات «D-£.Y 5 « glyphosate ومقاومة المعدن metal resistance أو الحساسية sensitivity ويشير المصطلح "علامة إيجابية marker—positive " إلى النباتات التي قد تم تحويلها لتشمل جين العلامة الذي من الممكن انتقائه. يمكن أن يتم دمج العديد من العلامات التي يمكن كشفها وانتقائها إلى ناقل التعبير المختار ليسمح ٠ بالتعرف وانتقاء النباتات المتحولة transformed plants ؛ أو المتحولين transformants وهناك العديد من الطرق المتاحة للتأكد من التعبير لعلامات markers الانتقاء في النباتات المتحولة؛ والتي تشتنل على سبيل المثال توالي اللا( PCRIs (تفاعل سلسلة بوليميراز «(polymerase chain reaction وتبقيع Southern blotting i$ « وتبقيع «(RNAI والطرق المناعية immunological methods للكشف عن البروتين المعبر عنه من BUN Sie vector Yo البروتين المترسب precipitated protein الذي يتوسط لمقاومة فوسفوينوثرسين ملا
<phosphinothricin أو بروتينات أخرى Jie جينات المسجل بيتا-جلوكرونيداز «(GUS) B-glucuronidase ولسيوفيراز luciferase ؛ وبروثين الضوء الأخضر green (DsRedy (GFP) fluorescent protein وبيتا -جالاكتوسيداز B-galactosidase « وكلورامفينيكول أسيتل ترانسفيراز ((CAT) chloramphenicol acetyltransferase وألكالين © فوسفاتيز alkaline phosphatase ؛ وأمثال ذلك (انظر Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press,
-(N.Y., 2001 وتستخدم جينات العلامة التي من الممكن انتقائها لاختيار الخلايا المتحولة أو الأنسجة. وتشمل جينات العلامة التي من الممكن انتقائها على جينات مرمزة لمقاومة المضاد الحيوي؛ Jie هؤلاء ٠ المشفرين لإتزيم نيوميسين فوسفوترانسفيراز (NEO) neomycin phosphotransferase ١١ ١١ وهيجروميسين فوسفوترانسفيراز (HPT) hygromycin phosphotransferase بالإضافة إلى جينات مائحة مقاومة لمركبات مبيدات الأعشاب herbicidal compounds وترمز جينات مقاومة لمبيد الأعشاب Herbicide resistance genes بصفة عامة لبروتين معدل مستهدف غير حساس إلى مبيد الأعشاب herbicide أو لإنزيم enzyme الذي يحلل أو يزيل سمية detoxifies ١٠ مبيد الأعشاب في النبات قبل أن يعمل. على سبيل المثال مقاومة إلى جليوفوسات glyphosate أو التي تم الحصول عليها باستخدام جينات مرمزة لإنزيمات مستهدفة مطفرة Sie « mutant target enzymes © -إينوبيروفيل شيكيمات-؟-فوسفات سنسيز (EPSPS) 5—enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase وقد تم إفشاء الجينات والمطفرات EPSPS) في براءة الاختراع الأمريكية أرقام 4,5407875 + و 8,1048147 و TY Yo 0 ارقو 4750 17,رو 17,444 ره و 1,271,247 . وقد تم الحصول على مقاومة لجليوفوسينات أمونيوم glufosinate ammonium « وبروموأوكسينيل bromoxynil « و07:؟- داي كلوروفينوأوكسي أسيتات (D-£0Y) 2,4-dichlorophenoxyacetate باستخدام جينات بكتيرية bacterial genes مرمزة لفوسفينوثريسن أستيل ترانسفيراز phosphinothricin acetyltransferase » أو نيترايليز 01071856 + أو 407 -داي كلوروفينوكسي أسيتات YO مونوأوكسجينيز 2,4-dichlorophenoxyacetate monooxygenase ¢ التي تزيل سمية
ملا
مه مبيدات الأعشاب herbicides كل على حدى. وقد تم إفشاء إنزيمات Enzymes /جينات لمقاومة/تحمل tolerance جلوفوسينات glufosinate في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 54 و YYT,YTA 50 خلا 560,00 2,211,7771. وقد تم إفشاء الإنزيمات/ الجينات سابقاً لمقاومة 0-47 في براءات الاختراع أرقام 657 Ve و0 :بقارت © بالإضافة إلى طلبات براءات الاختراع الامريكية رقم 097717 ٠009/6 و براءة الاختراع الدولية رقم 47 707/057. وقد تم إفشاء الإنزيمات/ الجينات للنيتريليز 01011856 سابقاً في براءة الاختراع الأمريكية رقم AY TEA يمكن لمبيدات الأعشاب الأخرى تثبيط نقطة النمو growing point أو النسيج الإنشائي meristem « مشتملة على إيميدازولينوان imidazolinone أو سلفونيل يوريا sulfonylurea « ٠ ووتم توضيح جينات للمقاومة/التحمل لحمض أسيتوهيدروكسي سنسيز acetohydroxyacid (AHAS) synthase وأسيتولاكتات سنسيز (ALS) acetolactate synthase لمبيدات الأعشاب تلك. وقد تم إفشاء الجينات والمطفرات AHAS] mutants والمطفرات في براءات الاختراع LE) 77ر51 الى "الأكارف FTN NY و لافار و ,2,47 . وقد تم إفشاء الجينات والمطفرات ALS] في براءة الاختراع أرقام 9,017,184 ؛ و OY EY, AY Yo تشمل جينات مقاومة لجليوفوسات Glyphosate resistance genes جينات * -إينوبيروفيل شيكيمات -؟ -فوسفات سنسيز S5—enolpyruvylshikimate—3—-phosphate synthase (EPSPS) المطفرة (بواسطة إدخال حمض نووي معاد الاتحاد و/ أو هيئات متعددة لتخليق الطفرة في الخلايا الحية لجينات EPSPs الأصلية)؛ وجينات 230/8 وجينات جليوفوسات أستيل ٠ ترانسفيراز (GAT) glyphosate acetyl transferase كل على حدى). وتشمل جينات المقاومة لمركبات الفوسفونو phosphono compounds الأخرى على جلوفوسينات glufosinate (جينات فوسفينوثريسن أسيتل ترانسفيراز phosphinothricin acetyl 086 ) من أنواع الستربتوميسات Streptomyces species ؛ مشتملة على ستربتوميسات هيجروسكوبيكس hygroscopicus 516010777065 وستريبتوميسيس Yo فيريديكروماجينات Streptomyces viridichromogenes (« وأحماض 5 بيريدينوكسي ملا
-١ه- pyridinoxy أو فينوكسي بروبيونيك 010800016 phenoxy وسيكلوهيكسونات cyclohexones (جينات ترميز متبط .(ACCasell inhibitor-encoding genes وقد تم توضيح جينات المقاومة/التحمل ad الأعشاب لأستيل كوانزيم A كربوكسيليز acetyl (ACCase) coemzyme A carboxylase في براءات الاختزراع الأمريكية أرقام 5117 .0,84A,08¢ 4 ©
يمكن الحصول على جزئ DNA مشفر @roA (pal مطفر تحت انضمام ATCC رقم 4755 ويتم إفشاء تتابع النيوكليوتيد للجين المطفر في براءة الاختراع الأمريكية رقم 4,714,051 to [20008؛ والطلب الأوروبي لبراءة الاختراع رقم to Kumada et 81. . YYY YY ؛ وبراءة الاختراع رقم 5,974/أ5,كال8 to Goodman et ؛ وافشاء تتابعات نيوكليوتيد لجينات إنزيم Ve جلوتامين سنستايز glutamine synthetase genes التي تمنح مقاومة لمبيدات الأعشاب Jie ٠-فوسفينوثريسن .L—phosphinothricin وتم تقديم تتابع النيوكليوتيد لجين PAT في الطلب الوروبي رقم to Leemans et al. 9 Y¢ « وتصف DeGreef et al., laf )1989( 7:61 لا09ا810/180000إنتاج نباتات معدلة وراثياً التي تعبر عن جينات خيمرية بار chimeric bar genes مرمزة إلى نشاط ahs PAT من BN التي توضح الجينات المائحة ٠ المقاومة إلى أحماض فينوكسي بروبيونيك phenoxy proprionic acids وسيكلوهيكسونات cyclohexones ؛ مشتملة على سيزوكسيدم (561107/017 وهالوكسيفوب haloxyfop ؛ جينات ال[001-5؛ و001-52؛ و0001-53؛ والجينات الموضحة بواسطة Marshall et al., Appl.
Genet. 83:435 (1992) .115600. وتم توضيح جينات GAT القادرة على منح مقاومة جليفوسات في براءة الاختراع الدولية 81009017819 .to Castle et وتم توضيح ٠ الجينات المائحة مقاومة لمبيدات الأعشاب 47 -0؛ وفوب. fop وبيريديل أوكسي أوكسين pyridyloxy auxin في WO 2005107437 and U.S. patent application Ser.
53 .ملا يمكن لمبيدات الأعشاب الأخرى تثبيط التخليق الضوئي photosynthesis « ومنها تراي أزين psbA) و+15) أو بنزونيتريل benzonitrile (جين نيتريليز gene 11011856 ). وتصف Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991) vo تحويل الكلاميدوموناس Chlamydomonas
ملا
وه بالبلازميدات المرمزة لجينات PSDA المطفرة. ويتم إفشاء تتابعات النيوكليوتيد لجينات النيتريليز في براءة الاختراع الأمريكية رقم 5,870,744 إلى ستوكر «Stalker وجزيئات DNAY المحتوية على تلك الجينات تعد متاحة تحت انضمام ATCC للأرقام 27475 )و 29451و 17447 وتم وصف تكون نسائل أو التعبير لل/لا00 المشفر لجلوتاثيون 5 -ترانسفيراز glutathione S-transferase © بواسطة )1992( 285:173 .Hayes et al., Biochem.
J. لأغراض الاختراع الحالي تشمل جينات العلامات المنتقاه وليس الحصر على جينات الترميز: نيوميسن فوسفوترانسفيراز Il (Fraley et al. (1986) neomycin phosphotransferase Il ¢CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1-25) وسيانميد هيدراتيز cyanamide (Maier—Greiner et al. (1991) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA hydratase ٠ )¢88:4250-4264 واسبرتات كيناز aspartate kinase ¢ وداي هيدروداي بيكولينات سنسيز (Perl et al. )1993( dihydrodipicolinate synthase Bio/Technology (11:715-718؛ وتريبتوفان ديك ربوكسيلاز (Goddiin etal. tryptophan decarboxylase gly (1993) Plant Mol.
Bio. 22:907-912) هيدرو _داي بيكولينات سنسيز dihydrodipicolinate synthase واستيرتاد كيناز kinase 350811806 المنزوع الحساسية ¢(Perl et al. (1993) Bio/Technology 11:715-718( ١٠ وجين بار (Toki bar gene et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503-1507; and Meagher et al. (1996), «Crop Sci. 36:1367) وتريبتوفان ديكربوكسيلاز tryptophan decarboxylase ¢(Goddijn et al. (1993) Plant Mol.
Biol. 22:907-912) ونيوميسن فوسفوترانسفيراز (Southern et al. (1982) J.
Mol. (NEO) neomycin phosphotransferase ( $Appl.
Gen. 1:327 | ٠ وهيجروميسين فوسفوترانسفيراز hygromycin phosphotransferase HPT) أو «(Shimizu et al. (1986) Mol.
Cell Biol. 6:1074) (HYG وداي هيدرو فولات ريداكتاز (Kwok et al. (1986) PNAS (DHFR) dihydrofolate reductase (USA 4552) وفوسفينوتزيسين استيل ترانسفيراز phosphinothricin acetyltransferase ¢(DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513) وحمض ١7 7- داي كلوروبروبيونيك Yo دييالوجيناز (Buchanan-Wollatron 2,2-dichloropropionic acid dehalogenase gv
ارج tet al. (1989) J.
Cell.
Biochem. 13D:330) وحمض أسيتوهيدروكسي سنسيز (Anderson et al., U.S.
Pat.
No. 4,761,373; acetohydroxyacid synthase tHaughn et al. (1988) Mol.
Gen.
Genet. 221:266) و © -إينوبيروفيل -شيكيمات - فوسفات مسنسيز (Comai (aroA) 5-enolpyruvyl-shikimate—phosphate synthase al. (1985) Nature 317:741) © )©؛ وهالو آريلنيتريليز (Stalker et haloarylnitrilase published PCT application WO87/04181) ,.ل8؛ واستيل -كوانزيم / كربوكسيليز (Parker et al. (1990) Plant Physiol. acetyl-coenzyme A carboxylase glas ¢92:1220) هيدرو بتيورات سنسيز (sul I) dihydropteroate synthase kD 5 ¢(Guerineau et al. (1990) Plant Mol.
Biol. 15:127) 32 نظام ضوئي ١| بولي ٠ ببتيد (Hirschberg et al. (1983) (psbA) 32 kD photosystem ١١ polypeptide .Science 222:1346) وأيضاً المشتمل هو عبارة عن جينات ترمز لمقاومة إلى: الكلورامفينيكول chloramphenicol ¢(Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992) والميثوتركسات (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer methotrexate cet al. (1991) Plant Mol Bio. 16:807-820 (1991) Ye وهيجروميسين hygromycin (Waldron et al. (1985) Plant Mol.
Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219-227; and Meijer et al. (1991) Plant Mol.
Bio. )¢16:807-820 وستربتوميسين (Jones et al. (1987) Mol.
Gen. streptomycin «Genet. 210:86-91) والسبيكتوميسين (Bretagne-Sagnard et al. spectinomycin Transgenic Res. 5:131-137) ٠ )1996(¢ والبليوميسين (Hille et al. bleomycin Plant Mol.
Biol. 7:171-176) )1986(¢ والسلفوناميد (Guerineau et sulfonamide tal. (1990) Plant Mol.
Bio. 15:127-1306) والبروموكسونيل (Stalker bromoxynil D (Streber et al. (1989) —¢,Y, cet al. (1988) Science 242:419-423) «Bio/Technology 7:811-816) والجليفوسات (Shaw et al. (1986) glyphosate gv
— جم
(DeBlock et al. phosphinothricin والفسفينوتريسين «Science 233:478-481)
.(1987) EMBO J. 6:2513-2518)
وليس تعني قائمة الجينات السابقة التي يمكن انتقائها كعلامات والمسجلة أنها قاصرة عليهم. ويتم
شمول أي جين يمكن انتقائه أو مسجل بواسطة الاختراع الحالي. ولو من الضروري فمثل هذه
0 الجينات بمكن أن تتوالى بالطرق المعروفة في المجال.
ويتم تخليق جينات العلامات التي يمكن أنتقائها أو المسجل لأجل تعبير أقصى في النبات. ولأجل
ليصبح معبراً عنه في النباتات في مستوى أعلى مؤدياً إلى كفاءة تحويل أعلى.وتعد الطرق متاحة
في المجال لأجل تحسين أقصى للجينات المخلقة. وفي الحقيقة قد تم تحسين أقصى للعديد من ٠ الجينات لزيادة التعبير لمنتج الجين في النباتات.
يمكن أن يتم تحسين تتابع جين العلامة بشكل أقصى للتعبير في أنواع نبات خاصة أو Sy عن
ذلك يمكن أن تكون معدلة للتعبير الأقصى في عائلات النبات.وربما يتم تحديد روامز النبات
المفضلة من الروامز ذات التردد العالي في البروتينات المعبر عنها بالكمية الكبرى في أنواع نبا
خاصة للفائدة. انظر على سبيل المثال براءةالاختراع الدولية رقم 1١164177 /٠1وبراءة الاختراع Vo الأوربية رقم 788437 ررقم 764417 Perlak eta |. (1991) Proc.
Natl.
Acad. :
(1989) Nucleic Acids ~~ 88:3324-3328; and Murray et . 5 Sci.
USA
¢Research 17: 477-498 وبراءة الاختراع الأمريكية رقم 0,786,871 ؛ وبراءة الاختراع
الأمريكية رقم ETT YAY ,0 وربما في هذه الطريقة يمكن أن يتم تحسين تتابعات النيوكليوتيد
J, أقصى للتعبير في أي نبات ٠. وقد ثم التعرف على أن كل أو أي جزء من تتابع الجين ربما ٠ يتم تحسينها بشكل أقصى أو تخليقها. وبهذا أيضاً ربما يمكن استخدام تتابعات محسنة كلياً أو
الجينات التي تمنح مقاومة إلى مبيد الأعشاب:
acetohydroxyacid synthase المقاومة/التحمل لحمض أسيتو هيدروكسي سنسيز A
(AHAS) وأسيتلاكتيت سنسيز (ALS) acetolactate synthase ضد مبيدات الأعشاب
م
هه إميدازولينوان imidazolinone أو سلفونيل يوريا sulfonylurea وقد تم إفشاء الجينات والطفرات AHAS) والطفرات في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 711,777 عر OX EVYY و/١٠,5,771؛ و A0F, AVY ,0 و 2,178,977. وتم إفشاء الجينات والطفرات ALS] في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 1184 رف و VEY, AY wo © جينات المقاومة/التحمل لأستيل كوانزيم A كربوكسيليز (ACCas) ضد مبيدات الأعشاب سيكلوهكسان دايونات cyclohexanediones و أو حمض آريل فينوكسي بروبانويك aryloxyphenoxypropanoic acid (مشتملاً هالوكسيفوب Haloxyfop « ديكلوفوب Diclofop + فينوكسيبروب Fluazifop «aisle +» Fenoxyprop »+ كوازالوفوب (Quizalopfop تم توضيحها في براءات الاختراع أرقام 117,107رف و 2,894,088 aa ٠ جينات لأجل جليفوسات مقاومة/تحمل. جين ل -إينوبيروفيل-؟-فوسفوشكيمات سنسيز ES3P)5—enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase سنسيز) تم توضيحه في براءة الاختراع الأمريكية رقم 5,7719,109. وجينات له -إينوبيروفيل-7-فوسفوشكيمات سنسيز (ES3PS) والطفرات تم توضيحها في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 4,555,872 ؛ و الكتأخارف و TTY ,0 تارف و رارف و LOTT,0AY 50 TFT EEA Vo ث. جينات لجلوسينات (بايالافوس bialaphos ؛ فوسفوفينوثريسن phosphinothricin (001)) مقاومة/تحمل. جينات لفوسفينوثريسن أستيل ترانسفيراز phosphinothricin (Pat) acetyltransferase تم توضيحها في براءات الاختراع الأمريكية أرقام د ال 2,711,114 و 7١6 95,©؛ وتم توضيح جين لجين المقاومة بايالافوس (Bar) bialaphos في براءات الاختراع الأمريكية أرقام YE « 0,0) YT تكارف و OTENEYY Yo و©117,171,. وتم توضيح جين لجلوتامين سينستاز (GS) glutamine synthetase في براءة الاختراع الأمريكية رقم 975,377,؛والطلب الأوروبي لبراؤة الاختراع الأوبية أ١ الف اضر x جينات المقاومة/التحمل لهيدروكسي فينيل بيروفات داي أوكسجينز hydroxy phenyl (HPPD)pyruvate dioxygenase ضد مبيدات الأعشاب ايزوأوكسازول isoxazole ملا
-1ه- ودايكيتونيتريلات diketonitriles ؛ و/ أو ترايكيتونات ctriketones و/ أو مشتملاً سالكوترايوان sulcotrione وميزوترايوان mesotrione والذي تم توضحيهم في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 089 TA ارتو 0 SLT ح. جينات D-$0Y) مقاومة/تحمل. وتم توضيح جين DEY -مونوأوكسيجنيز 2,4-D-monooxygenase © في براءة الاختراع الأمريكية رقم Ve EET و SLYOY EY وتم إفشاء cla إضافية ل07؛-0 مقاومة/تحمل في براءة الاختراع AS رقم ٠١ 73 » و براءة الاختراع الدولية رقم 487 ٠٠١/67 خ. تم توضيح جين لإميدازول جليسرول فوسفات ديهيداتاز imidazoleglycerol phosphate (IGPD) dehydratase ضد مبيدات الأعشاب imidazole sad و/ أو ترايأزول triazole ٠ في براءة الاختراع الأمريكية رقم 51,7٠١ 2,5. وتم إفشاء الجينات لإنزيمات التفسخ دايكامبا 38 (اوكسجينز OXygenase ؛ وفيرودوكسين ferredoxin ؛ وريدكتاز (reductase ضد مبيدات الأعشاب دابكامبا في براءات الاختراع أرقام 7,847 لأ وى 4 VOY La جينات لمبيدات الأعشاب التي تثبط التخليق الضوئي؛ مشتملاً ترايأزين triazine (جينات psbA و+15) أو بينزونيتريل benzonitrile (جين نيتريليز .(nitrilase gene انظر Se Przibila et al, Plant Cell 3:169 (1991) ١٠ _لإفشاء تحول الكلاميدوموناس Chlamydomonas 4 البلازميدات المرمزة لجينات psbA المطفرة. ويتم الإفشاء لتتابعات النيوكليوتيد لجينات نيتريليز nitrilase genes في البراءة الأمريكية رقم 5,8951544 وعد جزيئات اللا المحتوية على تلك الجينات متاحة تحت ملكية ATCC للأرقام 57175و AVES) و 17447. ويتم توضيح إنشاء نسائل والتعبير عن ترميز DNA لجلوتاثايون 5- ٠ ترانسفيراز glutathione S-transferase بواسطة Hayes et al., Biochem.
J. )1992( 285:173. تمتلك كل التقنيات والمصطلحات المستخدمة هنا نفس المعنى كالمفهوم بشكل واسع من هؤلاء من ذوي المهارة العادية في المجال والتي ينتمي إليها هذا الإفشاء ما أن يتم شرح غير ذلك بصفة خاصة. ويمكن أن توجد التعريفات للمصطلحات المشهورة في البيولوجية الجزيئية molecular ملا
له biology على سبيل المثال: 1994 Lewin, Genes V, Oxford University Press, (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN ٠ )1-56081-569-8. يتم تقديم تتابع نيكوليوتيد تخليقي يمكن أن تعمل في صورة معزز ثنائي الاتجاه. وربما يكون المعزز ثنائي الاتجاه المخلق في بعض التجسيمات عملياً مرتبط بواحد أو اثنين من تتابعات النيوكليوتيد للفائدة. على سبيل المثال؛ ربما يكون المعزز ثنائي الاتجاه المخلق عملياً مرتبط بواحد ٠ . أو اثنين من تتابعات النيوكليوتيد للفائدة edie) جينين؛ واحد عند كل نهاية من المعزز)؛ وبذلك لتنظيم النسخ على الأقل واحدة (مثل؛ واحدة أو كليهما) من تتابعات النيوكليوتيد للفائدة. ربما يتم تحقيق تعبير خاص وأنماط تنظيمية Jie (Jie) تلك التي يتم عرضها بواسطة الجينات تحت تحكم المعزز الأصلي) بدمج ال45الا من معزز في المعزز ثنائي الاتجاه المخلق مع الأخذ في الاعتبار إلى تتابع النيوكليوتيد للفائدة التي تكون عملياً مرتبطة بمعزز ثنائي الاتجاه مخلق. VO يتم توضيح بعض التجسيمات للاختراع بالأمثلة هنا بدمج عنصر قلب معزز أدنى من معزز جين يوبيكويتن -1 الأحادي الاتجاه للذرة (ZmUbil) unidirectional maize ubiquitin—1 gene إلى سياق جزيئي مختلف عن ذلك المعزز الأصلي لهندسة المعزز ثنائي الاتجاه المخلق. ويشير عنصر قلب معزز أدنى هنا إلى ”5115ل0101؛ ويساوي تقريباً (aisle Yoo في الطول. وقد تم التعرف من التوالي والتحليل لعناصر 0010100115 من أنواع Zeal المتعددة والتركيبات ٠ الجينية ل5/ا008 .2 على أن تكون عناصر ©011ل010 الوظيفية عالية الحفاظء Jie عنصر minUbilP هذا Lay يحتفظ بوظيفته كبادئ لعملية النسخ لو شارك؛ على سبيل JE على الأقل ما يقرب من 9675؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9680؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 6 و/ أو على الأقل ما يقرب من 9691؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9647؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9697؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9644؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من Yo 96950؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9697؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 96997؛ و/ أو على ملا
-مه- الأقل ما يقرب من 9694؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 96949؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من + تعريف تتابع إلى عنصر 010105116 ل110:1 SEQ ID وتشمل خصائص عناصر ال©511لا010 التي ربما تكون مفيدة في بعض التجسيمات للاختراع على سبيل المثال وليس الحصر على التتابع عالية الحفاظ من النيوكليوتيد سالفة الذكر؛ و/ أو وجود على الأقل صندوق TATA © واحد؛ و/ أو وجود على الأقل واحد OQ) اثنين) من عناصر إجماع الصدمة الحرارية. وبالأخص عناصر 5116ل00101؛ ربما يتم تداخل عناصر إجماع أكثر من صدمة حرارية واحدة خلال تتابع .minUbilP يمكن أن تشتمل عملية دمج عنصر 00100110 في سياق جزيئي مختلف عن ذلك المعزز الأصلى لهندسة معزز ثنائي الاتجاه مخلق على عكس اتجاه عنصر ال 10010105115 في حمض Ve نووي مع الأخذ في الاعتبار إلى التتابع المتبقية من المعزز؛ بما في ذلك معزز أساسي أدنى أصلي منه. وبالتالي؛ يمكن أن يشتمل معزز ثنائي الاتجاه تخليقي على عنصر 0010105116 أول يتضمن ”5 من عنصر معزز أساسي أدنى ثاني Jo) سبيل المثال عنصر 0010100116 ثاني) في المعزز في الاتجاه العكسي؛ لتتابع النيوكليوتيد للفائدة والواقعة على '5 من عنصر minUbilP الأول. على سبيل JE يمكن تضمن عنصر minUBIIPY الأول عند نهاية Vo "كمن المعزز 2000811 في الاتجاه العكسي orientation 616156؟]. Ly) يضم أيضاً معزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق على واحد أو أكثر من إضافية لواحدة على الأقل من التتابع بالإضافة إلى عنصر .MINUDITP في بعض التجسيمات يمكن أن يشتمل معزز 1 ثنائي الاتجاه في بعض التجسيمات على معزز 45الا؛ واإكسون (مثل؛ إشارة signal أو قائد leader ببتيد)؛ وانترون؛ وتتابع فراغ؛ و/ أو مجموعات من واحد أو أكثر من أي مما سبق. Yo وربما يضم jee 811ل ثنائي الاتجاه المخلق على سبيل المثال وليس الحصر على توالية URS من معزز 811لا (على سبيل المثال معزز 33 511لا)؛ واكسون يشفر لببتيد قائد من جين 011لا؛ وانترون من جين 011لا؛ ومجموعات من هذا كله. في بعض تلك الأمثلة المشتملة على معزز 811ل ثنائي الاتجاه المخلق المشتمل على معزز (URS ربما يتم انتقاء ال 45لالتمنح خصائص تنظيمية خاصة على المعزز المخلق. وتختلف YO المعززات المعروفة بشكل واسع في نوع التحكم التي تبذله على الجينات المرتبطة عملياً (Ji) دما
-4ه- الاستجابات البيئيةة environmental responses ؛ والضفائر التطورية developmental cues والمعلومات المكانية (spatial information ويحافظ ال5+الا المدمج في معزز غير متجانس heterologous promoter نموذجياً على نوع التحكم الذي يعرضه ال5+الا مع الأخذ في الاعتبار إلى معززه الأصلي والجين أو الجينات المرتبطة عملياً. Langridge et al. supra © ,(1989). وتشكل أمثلة عن معززات حقيقيات النواة التي قد تم وصفها وربما تحتوي على URS مشتمل خلال معزز 5811لا ثنائي الاتجاه المخلق وفقاً لبعض التجسيمات على سبيل JE وليس الحصر: تلك المعززات الموضحة في براءات الاختراع أرقام 1,577,711 (معزز 581 للذرة)؛ و 9,141,897 (معزز أكتين للأرز ¢(rice actin promoter و571 117 Ja) 4 للذرة)؛ و 1,475,717 (معزز PR-1 للذرة)؛ 1,777,577 (معزز AZ للذرة)؛ و ٠١ الفح (معززات بنيوية للذرة 1,EYY,Yo¥ ¢(constitutive maize promoters (معزز أوليسين L3 للذرة (maize L3 oleosin promoter 1,571,701 (معزز أكتين ١ actin 2 promoter وانترون أكتين ١ للأرز «(rice actin 2 intron و لكل ,لاتاره (معزز خاص بالجذر ¢(root—specific promoter و 795,714 (معززات محرضة للضوء ¢(light-inducible promoters و 1٠5.014 (معززات محرضة للملح salt-inducible ١٠ 010001815)؛ و 1,707,178 (معززات محرضة للكائنات الممرضة pathogen-inducible ¢(promoters و 1,175,610 (معززات dame لنقص الفوسفور phosphorous lies) 717١و ¢(deficiency-inducible promoters ثنائية الاتجاه)؛ و 17 (معزز جاما- كويكسين ¢(gamma—coixin promoter وطلب براءة الاختراع الأمريكية تسلسل AS) ,5/789 (معزز كلوروبلاست ألدولاز للذرة maize chloroplast .(aldolase promoter ٠٠ nopaline وتشمل أمثلة موضحة إضافية لمعززات بدائيات النواة على معزز إنزيم نوبالين سنسيز (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (NOS) synthase (الذي (OCS) octopine synthase (64)16(:5745-9؛ ومعزز إنزيم أوكتوبين سنسيز
Agrobacterium ( يحمل على بلازميدات تحدث أوراماً لأجروباكتيريم تيوميفاشينس ومعززات كوليموفيروس (681110007/10115) مثل فيروس القرنبيط الفسيفسائي (tumefaciens Yo ملا qa 19S(Lawton et al. (1987) j=; ¢(the cauliflower mosaic virus (CaMV)) 355 CaMV(Odell et al. (1985) Nature ومعزز «Plant Mol. Biol. 9:315-24) 35S(Walker et al. (1987) Proc. ومعزز فيروس فيجورت الفسيفسائي ¢313:810-2 (Yang and ومعزز سكروز سينيز (Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8)
R ومعزز معقد الجين (Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8) ٠ و 081/1/355 (براءات الاختراع «(Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83) (0,074,147 و (0,¥04,1 EY ار منترتدارف و Oo FYVAYA LB) الأمريكية (براءات_ الاختراع الأمريكية أرقام: 1,051,757 + و 77/,119,)؛ ومعزز FMV3SS (براءة الاختراع الأمريكية رقم 0,014 2,85)؛ ومعزز 5001 (براءة الاختراع الأمريكية 06117
AGRtu.nos (GenBank Accession No. VO0087; 1)؟ ومعززات 17/6 ٠ رقم ٠
Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. وأمثال ذلك. (1983) Nature 304:184-7) ثنائي الاتجاه المخلق أكثر في بعض التجسيمات على إكسون بالإضافة UBITY ربما يضم معزز ربما يكون من المرغوب في تجسيمات JB على سبيل .minUDILP إلى عنصر (عناصر) خاصة لاستهداف أو نقل بولي ببتيد المرمزة بتتابع النيوكليوتيد للفائدة والمرتبطة عملياً بالمعزز ٠5 لمكان خاص تحت مستوى الخلية و/ أو المقسم. في تلك التجسيمات وغيرها؛ ربما يتم دمج تتابع مرمزة (إكسون) إلى جزئ حمض نووي ما بين عنصر 010100115 وتتابع نيوكليوتيد مرمزة بولي ببتيد. وربما يتم تنظيم تلك العناصر وفقاً إلى حسن التصرف من الممارسين المهرة حيث أنه يعزز المعزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق التعبير للبولي ببتيد (أو واحد أو كل من متواليتي ترميز البولي ببتيد الاثنتين التي تعد عملياً متصلة بالمعزز) المشتمل على الببتيد المشفر بواسطة تتابع ٠ الترميز المدمجة في علاقة زظيفية مع المتبقي من البولي ببتيد. وفي الأمثلة بالأخص ربما يتم قائد). UbIT ببتيد (Jig) دمج إكسون مشفر لقائد؛ أو ناقل؛ أو إشارة ببتيد في معزز exon incorporated وتشمل الببتيدات التي ربما يتم ترميزها بواسطة إكسون المدمج ؛ leader exon الاتجاه المخلق؛ على سبيل المثال وليس الحصر: إكسون قائد AU Ubil ال chloroplast transit البلاستيدات الخضراء Ja ببتيد ¢(Ubil (مثل؛ Ubiquitin ويوبيكويتن YO gv
-١؟- (CTP) peptide مف the A. thaliana EPSPS CTP (Klee et al. (1987) Mol. Gen.
Genet. 210:437-42), and the Petunia hybrida EPSPS CTP «((della-Cioppa et al. (1986) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 83:6873-7) كالموضح بالأمثلة لتهديف البلاستيدات الخضراء لإنزيم داي كامبا مونوأوكسيجنيز dicamba (DMO) monooxygenase © في منشور PCT دولي رقم براءة الاختراع الدولية Noe AN «OA. ربما أيضاً يتم دمج الانترونات في معزز 811ل ثنائي الاتجاه المخلق في بعض التجسيمات للاختراع على سبيل المثال ما بين عنصر 010105110 وتتابع النيوكليوتيد للفائدة التي يتم ارتباطها عملياً بالمعزز. في بعض الأمثلة ربما يكون الانترون المدمج في المعزز 811ل ثنائي الاتجاه ٠ المخلق وليس الحصر UTR 5 التي تعمل كتتابع قائدة للترجمة وظيفياً التي توجد في mRNA معالج تماماً ضد الاتجاه لتتابع بدء الترجمة (مثل التتابع القائدة للترجمة ربما تؤثر على معالجة المنسوخ المبتدئ dMRNAD و/ أو ثبات MRNA و/ أو كفاءة الترجمة). وتشمل تتابعات قائدة للترجمة على قادة بروتين الذرة والبتونيا للصدمة الحرارية (البراءة الأمريكية رقم 5,317,875)؛ وقادة البروتين غلاف الفيروس نباتى plant virus coat protein leaders ؛ وقادة روبيسكو plant rubisco leaders cial ٠ ؛ وأخرين. انظر Turner and Foster (1995) Sie Molecular Biotech. 3(3):225-36 وتشمل أمثلة غير محدودة UTRsl "5 على GmHsp (البراءة الأمريكية رقم PhDnaK 5¢(2,109,) YY (البراءة الأمريكية رقم 5,767,875 ¢TEV (Carrington and Freed (1990) J.
Virol. 64:1590-7( ¢AtAntl 5 ¢(5 ر )1983( AGRtu.nos (GenBank Accession No.
VO0087; and Bevan et al. Nature 304:184-7) ٠ تشمل تتابعات إضافية والتي ربما تكون تم دمجها اختيارياً إلى معزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق على سبيل المثال وليس الحصر: تتابعات /3 غير مترجمة؛ مناطق انتهاء النسخ ل3؛ ومناطق تذييل بعديد الادينيلات. ويوجد عناصر وراثية تقع في فى نفس الاتجاه لتتابع النيوكليوتيد للفائدة (ie) تتابع للفائدة التي تعد مرتبطة ble بمعزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق)؛ وتشمل على dn Yo نيوكليوتيدات التي تمد بإشارة تذييل بالبولي أدينيل» و/ أو إشارات تنظيمية أخرى قادرة على د
١ أو التعبير الجيني. وربما توظف إشارة تذييل البولي أدينيل cMRNA التأثير على النسخ؛ معالجة في النباتات لتسبب إضافة نيوكليوتيدات البولي أدينيلات إلى النهاية '3 من المادة السابقة لل/ل014. وربما يتم اشتقاق تتابع التذييل بالبولي أدينيل من الجين الطبيعي؛ ومن مختلف جينات 3' للمنطقة 0008106 synthase ويُعد إنزيم نوبالين سينسيز T-DNA النباتات؛ أو من جينات مثال (nos 3’; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7( © مترجمة pall غير محدود لمنطقة نهاية النسخ '3. ويتم تقديم مثال الاستخدام للمناطق المختلفة وتشمل أمثلة غير محدودة .Ingelbrecht et al. (1989), Plant Cell 1:671-80 في 31
Pisum sativum واحد من جين polyadenylation signals لإشارات تذييل البولي أدينيلات
RbcS2 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO .ل 3:1671-9) and
AGRtu.nos (GenBank Accession No. EQ1312) ٠ يضم معزز 811ل ثنائي الاتجاه المخلق في بعض التجسيمات على واحد أو أكثر من تتابعات النيوكليوتيد التي تشمل تهديف الحمض النووي المشتمل على المعزز إلى مكان مخصص في وربما تشمل واحد أو أكثر من target organism للكائن الحي المستهدف genome الجينوم في الجينوم في المضيف DNAY التتابعات على سبيل المثال التي تعد متجانسة إلى أجزاء تتابع ترشد في بعض الأمثلة تلك Les في الجينوم نادرة أو مميزة). DNA تتابعات (Jig) host Yo التتابعات المتجانسة على عملية إعادة الالتثام والتكامل للحمض النووي المشتمل على معزز المتجانس في الجينوم المضيف. يضم المعزز DNAD ثنائي الاتجاه المخلق عند مكان 1 ثنائي الاتجاه المخلق في أمثلة بالأخص على واحد أو أكثر من تتابعات النيوكليوتيد التي 1 تسهل تهديف الحمض النووي المشتمل على المعزز إلى مكان نادر أو فريد في جيتوم المضيف engineered nuclease enzymes مستخدماً إنزيمات نيوكلييز المهندّسة 10519600006 ٠ التي تتعرف على التتابع عند مكان نادر أو فريد وتسهل التكامل عند هذا المكان النادر أو الفريد. اصبع زنك إندونيوكلييز Glad) مثل نظام التكامل المستهدف هذا والذي يقوم بتوظيف موضح في براءة 01016856 enzyme كإنزيم نيوكلييز 2106-1098 endonucleases .3/011,7758 الاختراع الأمريكية رقم ملا
اس Ly) يتم إنتاج الأحماض النووية المشتملة على معزز 811لا ثنائي الاتجاه Gl باستخدام أي تقنية معروفة في المجال؛ مشتملة على سبيل المثال وليس الحصر على: (RCA وتضخيم (PCR وتضخيم (OLA; (RT-PCR وع0دل50. وتُعد هذه التقنية والتقنيات المكافئة الأخرى معروفة Tam لهثلاء ذوي المهرة في المجال؛ وتم توضيحها أكثر بالتفصيل على سبيل المثال وليس © الحصر: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001; and Ausubel et al., Current (Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998 تشتمل كل المراجع المذكورة أعلاه على الكتيبات المذكورء بما في ذلك أي رسومات؛ الأشكال؛ و/ أو الجداول المقدمة بها.
٠ التوصيل Delivery و/ أو التحول stransformation يمد أيضاً الإفشاء الحالي الطرق لأجل تحويل خلية بما تحتويه من جزئ حمض نووي مشتمل على معزز 811لا ثمائي الاتجاه المخلق. ربما يتم استخدام أي عدد كبير من التقنيات المعروفة في المجال لإدخال جزيئات الحمض النووي إلى النباتات لتحويل النبات بما يحتويه من جزئ الحمض النووي المشتمل على معزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق وفقاً لبعض التجسيمات؛ فعلى سبيل المثال؛ لإدخال واحد أو أكثر من معززات
٠ 811ل ثنائية الاتجاه المخلقة إلى جينوم نبات مضيف؛ و/ أو لإدخال أكثر واحد أو أكثر من جزئ أو جزيئات الحمض النووي للفائدة والتي عملياً مرتبطة بالمعزز. تشمل طرق مناسبة لتحويل النباتات على أي طريقة بها يمكن أن يتم إدخال DNAD إلى الخلية؛ على سبيل المثال وليس الحصر: عملية كهربية (انظر على سبيل المثال براءة الاختراع رقم 5,707 70,)؛ وقصف مقذوف مجهري microprojectile bombardment (انظر على سبيل
٠ المثال براءات الاختراع الأمريكية رقم برقم و حا قرف و بأخرخ قرف و TT YA و ترق ة ارات و dials ¢(TL,YALTOY بوساطة الأجروباكتيريم Agrobacterium-mediated transformation (انظر على سبيل المثال براءات الاختراع رقم 0 دقرف و AVE,AVY ,0 و 0,AA Afr 500,08), T)T و ل ابكتخغارة)؛ وتحويل البروتوبلاست hail) protoplast transformation على سبيل المثال براءة الاختراع
Yo الأمريكية رقم AV AE 5,5). وخلال طلب التقنيات مثل السالف ذكره؛ فإنه يتم تحويل الخلايا من
ملا
أنواع النباتات الافتراضية؛ ومثل هذه الخلايا ربما يتم تطويرها إلى نباتات معدلة وراثياً بواسطة تقنيات معروفة إلى هؤلاء من ذوي المهارة في المجال. على سبيل المثال التقنيات التي ربما تكون مفيدة بالأخص في سياق تحول القطن الموصوف في براءة الاختراع الأمريكية رقم COAETYAY و 1595,175,؛ و 17 .,2؛» و 4,744 17,؛ والتقنيات لتحول نباتات البراسكا Brassica plants © بالأخص والموصوفة على سبيل المثال في براءة الاختراع الأمريكية رقم «AVY €0,¥0 والتقنيات لتحول نبات الصويا 8/ا50 كالموضح على سبيل المثال براءة الاختراع الأمريكية رقم 1,784,709 ؛ والتقنيات لأجل تحول الذرة كالموضحة على سبيل المثال في براءات الاختراع الأمريكية رقم 1,050,897 » و 2,241,115؛ ومنشور PCT دولي رقم براءة الاختراع الدولية Af TVYY Ve بعد تأثير توصيل حمص نووي خارجي إلى خلية مستقبلة «recipient cell فإنه يتم التعرف على بصفة عامة الخلية المتحولة من أجل زرع وتوليد أكثر للنبات. ولكي يحسن من القدرة على التعرف على المتحولين» فإنه Lay يرغب أحدانا لتوظيف جين ذو علامة من الممكن انتقائه أو فحصه مع ناقل التحول transformation vector المستخدم لتوليد المتحول. في هذه الحالة يمكن معايرة التكتل الخلوي المتحول فعلياً بتعرض الخلايا إلى عامل أو عوامل منتقاه؛ أو يمكن أن يتم فحص Vo الخلايا لجين الصفة المرغوبة ذي العلامة. ربما يتم زرع الخلايا التي تنجو من التعرض لعامل الانتقائية؛ أو الخلايا التي تم وسجلت إيجابية في تجربة الفحص في الوسط الذي تدعم توليد النباتات. في بعض التجسيمات ربما يتم تعديل أي وسط زرع culture media ملاثم لنسيج النبات plant tissue (مثل» MS ووسط (N6 بأن يشمل على مواد أكثر Jie منظمات النمو. ربما يتم الحفاظ على النسيج على وسط قاعدي مع Yo منظمي النمو حتى يكون هناك نسيج كاف متاح لبدء جهود توليد النبات؛ أو الجولات المتكررة المتتابعة للاختيار اليدوي Sa manual selection يكون شكل النسيج مناسب للتوليد (Ji) regeneration على الأقل أسبوعين)؛ ثم يتم النقل إلى وسط توصيل لتكوين النبتة. يتم JB الزروع دورياً حتى يحدث تكوين كافي للنبتة. ما أن تتكون النبتات فإنه يتم نقلهم إلى وسط موصل لتكوين النبتة. وما أن تكونت الجذور الكافية يمكن أن يتم نقل النباتات إلى التربة soil Yo لنمو ونضج maturity أكثر.
هم ربما يتم إجراء تجارب متعددة للتأكد من وجود جزئ الحمض النووي المرغوب المشتمل على معزز 1 المُخلق ثنائي الاتجاه في النباتات المتولدة. وتشمل Jie هذه التجارب على سبيل المثال: المقايسات البيولوجية biological assays مثل تبقيع نورثرن وويسترن PCR, وتجارب بيوكيميائية Jie استكشاف وجود منتج بروتيني protein product ؛ على سبيل المثال بوسائل ELISA) immunological means dela © رو( أو تبقيع ويسترن الجنوبي (Western blots أو بوظيفة إنزيمية enzymatic function ؛ وتجارب أجزاء النبات؛ مثل تجارب الورقة leaf أو الجذر root وتحليل النمط الظاهري phenotype للنبات SK المتولد whole regenerated .plant باستخدام؛ PCR يمكن فحص الحالات التكامل المستهدفة؛. على سبيل المثال؛ بواسطة تضخيم محددة لجزيئات حمض oligonucleotide primers بوادئ أوليجونيوكليوتيد JE على سبيل ٠ يتضمن؛ وليس على سبيل الحصرء PCR نووي محل الاهتمام. من المفهوم أن التنميط الجيني ل مشتقة من DNA لجينومي (PCR) polymerase—chain reaction تفاعل سلسلة بوليميراز نسيج خلين من النبات المضيف المفصول من المتوقع أن يتضمن جزيء حمض نووي محل تم PCR الاهتمام متكامل داخل الجينوم؛ يلي ذلك استنساخ عياري وتحليل تتابع منتجات تضخيم
Rios et al. (2002), جيداً (انظرء على سبيل المثال» PCR وصف طرق التنميط الجيني ل V0 مشتقة من أي أنواع نباتات أو DNA 01801)؛ ويمكن أن تنطبق على جينومي J. 32:243-3 نوع نسيج؛ بما في ذلك استنبات الخلايا. يمكن استخدام توليفات من بوادئ أوليجونيوكليوتيد التي ترتبط بكلاً من تتابع الهدف والتتابع الداخلة تتابعياً أو بشكل متعدد التضفير في تفاعلات تضخيم يمكن إنتاج بوادئ الأوليجونيوكليوتيد المصممة لتتصلب في الموقع المستهدف؛ تتابعات PCR يمكن أن تشتمل استراتيجيات التنميط JBL حمض نوي الداخلة؛ و/ أو توليفات من اثنين منها. Yo وبدون حصر: تخضيم تتابعات معينة في جينوم النبات؛ JE الجيني ل 04 على؛ على سبيل تخضيم تتابعات متعددة معينة في جينوم النبات؛ تخضيم تتابعات غير معينة في جينوم النبات؛ وتوليفات من أي مما سبق. يمكن أن يحدد أحد المهرة في الفن توليفات إضافية من بوادئ يمكن تصميم مجموعة من بوادئ (JE وتفاعلات تضخيم _ لفحص الجينوم. على سبيل ملا
أوليجونيوكليوتيد التقدمية والعكسية لتتصلب إلى تتابع (تتابعات) حمض نووي محددة للهدف خارج حدود تتابع الحمض النووي المقدمة. يمكن تصميم بوادئ أوليجونيوكليوتيد oligonucleotide primers تقدمية Forward وحكسية 6 لتتصلب بشكل خاص بجزيء حمض نيوكليوتيد مقدم؛ على سبيل المثال؛ عند تتابع © تقابل لنطاق ترميز داخل تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام متضمنة بهاء أو أجزاء أخرى من جزيء الحمض النووي. يمكن استخدام تلك البوادئ بالترافق مع البوادئ الموصوفة أعلاه. يمكن تخليق بوادئ الأوليجونيوكليوتيد وفقاً لتتابع مرغوب فيها؛ وتكون متاحة تجارياً (على سبيل JE من .(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA يمكن استتساخ التضخيم بعد ذلك وتسلسله؛ أو بواسطة منتجات تضخيم تحليل تتابع مباشر. يمكن أن يتصور أحد المهرة في الفن طرق بديلة لتحليل منتجات التضخيم المتولدة أثناء التنميط الجيني .PCR 1 genotyping في أحد التجسيمات؛ يمكن استخدام بوادئ أوليجونيوكليوتيد محددة لهدف الجين في تضخيمات .PCR تنص بعض التجسيمات الخاصة بالاختراع الحالي أيضاً على خلايا يتضمن معزز 811لا ثنائي الاتجاه تخليقي؛ على سبيل المثال؛ كما يمكن أن يوجد في تركيب حمض نووي. في أمثلة خاصة؛ Vo _يمكن استخدام معزز 0811 ثنائي الاتجاه تخليقي وفقاً لبعض التجسيمات كتتابع منظمة لتنظيم التعبير الجيني عن DA نبات ونباتات محورة وراثياً. في بعض من تلك الأمثلة؛ يمكن أن يؤدي استخدام معزز 811ل ثنائي الاتجاه تخليقي متصلة بشكل عملي بتتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام eo) سبيل المثال؛ طفرة وراثية) إلى خفض عدد المعززات المتطابقة المطلوبة لتنظيم التعبير الجيني عن عدد are من تتابعات نيوكليوتيد محل الاهتمام» و/ أو خفض حجم جزء (أجزاء) line YL للحمض النووي مطلوبة لإدخال عدد معطى من تتابعات نيوكليوتيد محل الاهتمام. علاوة على ذلك؛ يمكن أن يسمح استخدام معزز 811لا ثنائي الاتجاه تخليقي ب التعبير المشترك عن تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام تحت نفس الظروف (أي؛ الظروف التي تحتها يتم تنشيظ المعزز 811ل). يمكن أن تكون تلك الأمثلة مفيدة بشكل (pala على سبيل (JB) عندما يساهم كلا متواليتي النيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام إلى صفة واحدة YO في مضيف معدل Gauls Wily تتابعات النيوكليوتيد محل الاهتمام؛ والتعبير الجيني المشترك عن tive
تتابعات النيوكليوتيد محل الاهتمام الآثار المفيدة للتعبير الجيني عن الصفة في المضيف المعدل transgenic host Lil, في بعض التجسيمات؛ يمكن أن يكون لنبات معدّل Wh يتضمن واحد أو أكثر من معزز (معززات) 811ل ثنائي الاتجاه تخليقي و/ أو تتابع (تتابعات) نيوكليوتيد محل الاهتمام به واحدة أو أكثر من الصفات المرغوب فيها ممنوحة (على سبيل المثال؛ متقدمة؛ معززة؛ أو مساهمة في) عن طريق التعبير (التعبيرات) الوراثقي عن تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام في النبات. يمكن أن تشتمل تلك الصفات على؛ على سبيل JE وبدون حصر: مقاومة الحشرات «insects الآأفات 15 الأخرى؛ وعوامل مسببة للمرض disease-causing agents ؛ التحمل لمبيدات الأعشاب؛ وتعزيز الاستقرارء والغلة yield ؛ أو العمر الافتراضي shelf-life ؛ التحمل البيثي environmental tolerances ٠٠ « وانتاج الأدوية pharmaceutical production ؛ الإنتاج الصناعي industrial product production ؛ والتحسينات الغذائية nutritional .enhancements في بعض الأمثلة؛ يمكن منح سمة مرغوب فيها بواسطة تحول نبات باستخدام جزيء حمض نووي يتضمن معزز 811ل ثنائي الاتجاه تخليقي متصلة بشكل عملي بتتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام. في بعض AB) يمكن منح سمة مرغوب led إلى نبات منتج في صورة نبات AD عن طريق cpl حيث يمكن منح تلك الصفة بواسطة واحد أو أكثر من تتابعات نيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بمعزز 511لا ثنائي الاتجاه تخليقي الذي/ ألتي تمر إلى النبات من النبات الأصلي الذي يتضمن تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بمعزز 811لا AW الاتجاه تخليقي. يمكن أن أي نبات Jie وراثياً وفقاً لبعض التجسيمات عبارة عن أي نبات يمكن أن يكون محول ٠ باستخدام جزيء حمض نووي للاختراع؛ أو تكون مولدة باستخدام نبات المحولة باستخدام جزيء حمض نووي للاختراع. وفقاً لذلك؛ يمكن أن يكون النبات ثنائي أو أحادي الفلقة. تشتمل الأمثلة غير المقيدة للنباتات ثنائية الفلقة للاستخدام في بعض الأمثلة على: البرسيم؛ الفول؛ القرنبيط؛ الملفوف»؛ زيت الكانولاء والجزر؛ القرنبيط؛ الكرفس؛ الملفوف الصيني؛ القطن؛ الخيار؛ الباذنجان؛ الخس؛ البطيخ؛ البازلاء؛ الفلفل؛ الفول السوداني؛ البطاطا؛ اليقطين؛ الفجل؛ اللفت؛ السبانخ؛ فول Yo الصوياء الكوساء بنجر السكر؛ عباد الشمس؛ التبغ؛ الطماطم؛ والبطيخ. تشتمل الأمثلة غير المقيدة ملا
A — أ — للنباتات أحادية الفلقة للاستخدام في بعض الأمثلة على: الذرة؛ البصلء والأرزء الذرة؛ القمح؛ الجاودار؛ الدخن؛» قصب السكرء الشوفان؛ التريتيكال» التبن switchgrass ؛ والمروج turfgrass في بعض التجسيمات؛ يمكن استخدام أو زراعة نبات Jie وراثياً بأي طريقة؛ حيث يكون من المرغوب فيه وجود معزز 811لا ثنائي الاتجاه تخليقي و/ أو تتابع نيوكليوتيد متصلة عملياً محل الاهتمام. وفقاً لذلك؛ يمكن تعديل تلك النباتات المعدلة وراثياً هندسياً؛ في مجمل se) ليكون بها واحدة أو أكثر من الصفات المرغوب فيها؛ من خلال تحويلها باستخدام جزيئات حمض نووي وفقاً op lanl ويمكن اقتصاصها و/ أو زراعتها بواسطة أي طريقة معروفة لأولئك المهرة في الفن. في حين تم وصف الاختراع بالإشارة إلى الطرق والتجسيمات الخاصة؛ فإنه سوف يتم إدراك أنه يمكن إجراء التعديلات والتغيرات المختلفة بدون الحيود عن مجال الاختراع. تتم تقديم الأمثلة التالية لتوضيح السمات و/ أو التجسيمات الخاصة. يجب عدم اعتبار الأمثلة مقيدة للكشف بالسمات المحددة أو التجسيمات النموذجية. الأمثلة تحول الأجرعية المورمة :Agrobacterium tumefaciens يتم تحويل ناقل pDAB108706 Vo ثنائي إلى الأجرعية المورمة صبغة 0/8813192 ثلاثي (براءة اختراع أمريكية مؤقتة رقم /1١ 458)؟). تم فصل مستعمرات باكتيرية Bacterial colonies وبلازميد ثنائي binary DNA plasmid وتأكيدها عن طريق تصميم إنزيم تقييد restriction enzyme تحويل الذرة :Corn Transformation تعقيم كوز الذرة Ear Sterilization وفصل الأجنة [Embryo Isolation للحصول على أجنة ذرة غير ناضجة immature embryos 008126 Yo تتم إنماء نباتات من (c.v. 8104( Zea mays في الصوبة greenhouse وتلقيح ذاتي أو أشقائي لإنتاج السنبلة . تم تجميع السنابل ears تقريباً ١7-١ يوم بعد التلقيح. في يوم التجربة؛ يتم تعقيم سطح السنابل عن طريق الغمر immersion محلول 9067١0 solution من ane صوبة household bleach حيث يحتوي على 900 هيبوكلوريت صوديوم sodium ملا
-١4-
chypochlorite والهز لمدة 0-7١ دقيقة؛ يلي ذلك ثلاث شطفات rinses في ماء معقم aay sterile water التعقيم «sterilization & تشريح الأجنة الملقحة غير الناضجة Y.Y=).0) immature zygotic embryos مم) في جو معقم من كل سنبلة وتوزيعها بشكل عشوائي في أنابيب طرد مركزي tubes ©71010-081011109 دقيقة تتضمن وسط إصابة سائل (LS Basal Lug) © 47.؛ جم/ لتر؛ محلول قيتامين «[Xy +++] N6 Vitamin Solution [de ٠ لتر؛ ا- برولين Vero c proline مجم/ لتر؛ سكروز [o> 16.2 «sucrose لتر؛ جلوكوز faa 71.0 (glucose لتر؛ oY ؛- ٠.5٠0 lf مجم/ لتر. بالنسبة لمجموعة معطاة من التجارب؛ وسحب الأجنة embryos من YY ستابل تم استخدام لكل معالجة
treatment
Glycerol يتم تخطيط جليسرول :Agrobacterium Culture Initiation ددء مزرعة الأجرعية ٠ الموصوفة أعلاه على أطباق أدنى وسط binary vectors من الأجرعية تتضمن النواقل الثنائية أيام. تم التقاط =F درجة مئوية لمدة ٠١ تتضمن مضادات حيوية ملائمة وتم إنماءها عند AB تتضمن نفس المضادات الحيوية وتم احتضانها عند YEP مستعمرة واحدة وتبقيعها على أطباق يوم. 7-١ درجة مئوية لمدة YA
5 ثم أخذ مزرعة الأجرعية Agrobacterium Culture والاستنبات المشترك :Co—cultivation في يوم التجربة؛ المستعمرات الأجرعية من YEP Gila معلق في ٠١ مل من وسط إصابة في أنبوب tube يمكن التخلص dle سعة cde 5٠0 وتم تعديل كثافة الخلية cell density إلى 4١.7 = OD600 نانو je باستخدام مقياس طيف ضوئي .spectrophotometer تم وضع استنباتات الأجرعية على هزاز دوار rotary shaker عند ٠٠١ لفة بالدقيقة؛ درجة حرارة
٠ الغرفة room temperature ؛ أثناء تشريح الجنين .embryo dissection تم فصل الأجنة الملقحة غير الناضجة بين 7.7-٠.9 مم في الحجم من حبات الذرة المعقمة sterilized maize kernels ووضعها في ١ مل من وسط الإصابة وغسلها مرة واحدة في نفس الوسط. تمت إضافة معلق الأجرعية Y) Agrobacterium suspension مل) إلى كل أنبوب وتم قلب الأنابيب حوالي Yeo مرة ثم هزها لمدة ١5-٠١ دقيقة. تم نقل الأجنة على وسط الاستنبات المشترك
co—cultivation media Yo (أملاح (MS 77.؛ _جم/_لتر؛ —L برولين» 7٠٠0.٠ مجم/ لتر؛
ملا
Vm casein إنزيمى للكازين Sle مجم/ لتر؛ ناتج تحلل ٠٠٠.١ » myo=inositol إنوسيتول عضلي جم/ ٠٠٠١ مجم/ لتر؛ سكروز» 7.٠١ - مجم/ لتر؛ ديكامبا ٠٠٠.١ enzymatic hydrolysate
AgNO3 لتن [de ٠٠٠١ [XV ov] معدل MS - لتر ؛ قيتامين [aa ٠.٠١ (Gelzan™ لتر ؛ ميكرو مولار)؛ موجه باستخدام ٠٠١ ؛ Acetosyringone مجم/ لتر؛ أسيتو سيرينجون ٠ درجة مئوية. Yo عند light أيام في الضوء 6-7 sad قصيغة موجهة لأعلى؛ والاحتضان © يمكن ملاحظة GUS والتعبير الجيني العابر YFP/Phiyfp :YFP/Phiyfp عابر والتعبير عن GUS في الأجنة المحولة وبعد ؟ أيام من الاستنبات المشترك باستخدام الأجرعية. تمت ملاحظة الأجنة تحت ميكروسكوب مجسم (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) باستخدام مرشح YFP filter ومصدر ضوء 5٠0 light source نانو متر. يتم اختيار الأجنة التي تعرض ٠ التعبير الجيني عن 70/001710 لتجربة نسيجية GUS يتم تحضير محلول تلطيخ staining GUS solution كما هو موصوف في )1989( Maniatis etal. ويتم احتضان incubated الأجنة في ١ مل من محلول لمدة YE ساعة عند YY درجة مئوية. تمت ملاحظة الأجنة للتعبير الجيني GUS العابر تحت المجهر. اختيار واعادة توليد كالس ge Callus حالات مفترضة: _بعد فترة الاستنبات المشترك co—cultivation period Yo ؛ تم نقل الأجنة إلى وسط استقرار resting media (أملاح MS £.7Y جم/ لتر؛ ا- برولين» 7٠0000 مجم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ٠٠٠٠١ مجم/ MES ¢ il (aes) 7-(0- مورفولينو)- إيثان سلفونيك)» حمض حر] 500060 مجم/ لتر؛ تحلل le لكازين إنزيمي ٠٠٠٠١ مجم/ لتر؛ ديكامبا؛ 7.٠١ مجم/ لتر؛ سكروز» ٠٠٠١ جم/ لتر؛ Gelzan faa ٠ لتر؛ قيتامين- MS معدل [de ٠٠٠١ »]24٠٠0[ لتر؛ 891103 ١5.١ مجم/ لتر؛ ٠ كاربينيسيلين Carbenicillin ؛ 150.0 [ase لتر) بدون عامل انتقائي والاحتضان في YE ساعة تعرض للضوء بشدة ضوء 5٠0 light intensity ميكرو مول. متر-؟.ثانية-١ لمدة 7 all عند YA درجة مئوية. تم نقل الأجنة على وسط اختيار ١ (أملاح (MS 77.؛ fan لتر؛ 1- برولين؛ ٠6 مجم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ٠٠٠٠١ مجم/ لتر؛ MES [بحمض —N)=Y مورفولينو)- إيثان سلفونيك acid 10016ا18065©-(0-0001000100)-2) حمض حر [free acid 58 .2060.2 مجم/ لتر؛ تحلل Sle لكازين إنزيمي ٠٠٠٠١ مجم/ لتر؛ 7.٠١ Lala مجم/ لتر؛ ملا
VI
سكروزء 2٠0١ جم/ لتر؛ Gelzan™ 7.30 جم/ لتر؛ قيتامين - ٠٠٠١ [XY 000] Jae MS [a لتر؛ ١5.٠ (AgNO3 مجم/ لتر؛ كاربينيسيلين» 790.0 مجم/ لتر) تتضمن ٠٠١ نانو Jie هالوكسيفوب haloxyfop والاحتضان في YE ساعة ضوء بكثافة ضوء ٠ ٠ ميكرو مول دقيقة- ".ثانية ١- لمدة 7 أيام عند YA درجة مئوية. ao نقل الأجنة ذات كالس تخلقي تكاثري embryogenic calli على وسط اختيار ؟ (أملاح (MS 5.77 جم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ٠٠٠٠١ مجم/ لتر؛ ا- Yorn colon مجم/ لتر؛ MES [(حمض 7-(”- مورفولينو)- إيثان سلفونيك)؛ حمض حر] 5000٠ مجم/ لتر؛ تحلل مائي لكازين إنزيمي ٠٠٠٠١ مجم/ لتر؛ ديكامبا؛ 7.7٠0 مجم/ لتر؛ سكروز؛ fan ٠٠٠٠١ لتر؛ [aa 1.30 Gelzan™ لتر؛ شيتامين- [da ٠.٠١ [XY eu] Jie MS لترء؛ AGNO3 Your) مجم/_لتر؛ كاربينيسيلين»؛ 9080.0 مجم/ لتر) تتضمن 0860© نانو متر هالوكسيفوب واحتضانها في ؛ 7 ساعة ضوء بكثافة ضوء ٠٠ ميكرو مول دقيقة-7.ثانية sad ١- أخرى VE أيام عند YA درجة مئوية. تسمح خطوةٍ الاختيار هذه للنسيج اللين المعدل الوراثياً بتكاثر وتمايز إضافي. يستغرق اختيار النسيج اللين مدة ثلاث أسابيع. تم نقل كالس تخلقي تكاثري على وسط sale) توليد ١ (أملاح MS 77.؛ fan لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ٠٠٠٠١ مجم/ لتر؛ ا- برولين؛ You. No مجم/ لتر؛ MES [إ(حمض —N)=Y مورفولينو)- إيثان سلفونيك)؛ حمض ٠75٠٠0 [a مجم/ لتر؛ تحلل Ale لكازين إنزيمي 5000 مجم/ لتر ؛ ٠.503٠ NAA مجم/ لتر ؛ ٠.٠٠١ ABA مجم/_لتر؛ /8 ٠..١ مجم/ Al ¢ سكروزء ..45 faa لتر؛ Yoo Gelzan™ جم/_لتر؛ قيتامين - MS معدّل ٠.٠١ (XY ni] مل/ لتر؛ ٠.٠١ AGNO3 مجم/ لتر؛ كاربينيسيلين؛ ٠ ؟ مجم/ لتر) تتضمن ©٠0٠0 نانو jie هالوكسيفوب والاستنبات في YE ساعة ضوء بكثافة Yo ضوء ٠٠ ميكرو مول دقيقة-7.ثانية ١- لمدة 7 أيام عند YA درجة مئوية. تم نقل كالس تخلقي مع براعم buds الفسيلة shoot على وسط إعادة توليد ١ (أملاح A) fan 5.77 (MS فيتامين - MS معدّل [000٠6ل]» ٠٠٠١ مل/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ٠٠٠٠١ مجم/ لتر؛ سكروز؛ ٠٠٠٠ جم/ لتر؛ faa ٠.٠١ Gellan Gum G434™ لتر؛ كاربينيسيلين» 75٠8.0 مجم/ (A تتضمن ©٠0٠0 نانو متر هالوكسيفوب. تم احتضان الاستنبات تحت الضوء لمدة Yi ساعة بكثافة YO ضوء ٠ ميكرو مول دقيقة-7.ثانية ١- لمدة ٠١-١ أيام عند YA درجة مئوية. تم نقل الفسائل ما shoot elongation لإطالة الفسيلة primary roots بجذور أساسية Small shoots الصغيرة ل٠٠٠ ١[ معدّل MS - لتر ؛ قيتامين [ox 7١ (MS (أملاح rooting media ووسط تجذيري
Gellan Gum لتر ؛ [aa ٠٠٠١ مجم/ لتر؛ سكروز» ٠٠٠٠١ مل/ لتر؛ إنوسيتول عضلي» ٠
MAGENTA™ مجم/ لتر) في صناديق 75900.٠0 جم/_لتر؛ كاربينيسيلين» 2... G434™ ساعات ضوء/ ظلام لمدة لا A /١١ واحتضانها تحت (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ه٠ أيام عند YA درجة مئوية. تم تحليل الشتلات المعدلة وراثياً المطنونة لتحديد عدد النسخ المعدلة Ls ونقل إلى الصوبة. المثال :١ تكوين معزز 511لا AUS الاتجاه تخليقي وناقل pPDAB108706 تم عرض رسم تخطيطي نموذجي لمعزز Ubiquitin—1 للذرة (Ubil) في .١ Jal تم استنساخ PCR لبلازميد تتضمن المعزز باستخدام نظام تضخيم PCR معزز 011لا من الذرة. تم تضمين ٠ منطقة نيوكليوتيد من معزز 53 511لا في صورة معزز أساسي Yoo عالي الدقة. تم تعريف تقريباً بعد ذلك تمت إضافة .)١ (©5011لا10) (هوية تتابع رقم: Zea mays Ubil أدنى Zea يتضمن إكسون (Y إلى بولي نيوكليوتيد (هوية تتابع رقم: ١ بهوية تتابع رقم: 0100011 (إنترون Zea mays Ubiquitin—1 وانترون (ZmUbil (إكسون mays Ubiquitin—1 (ZmUDbIT ١٠ باستخدام طرق استنساخ معروفة بشكل شائع في الفن لإنتاج عديد النيوكليوتيد بهوية تتابع رقم: LY بعد ذلك تم استنساخ ضد الاتجاه عديد النيوكليوتيد الناتج في اتجاه عكسي لحمض نووي يتضمن معزز الذرة 011لا (بما في ذلك تتابع 511لا المنظمة للضد الاتجاه (5+الا))؛ (هوية تتابع رقم: 4) لإنتاج معزز 011لا ثنائي الاتجاه التخليقي بهوية تتابع رقم: © (انظر على سبيل المثال الشكل 0( ٠ تتم استتساخ تتابعات ترميز جين مراسل بعد كل نهاية من معزز 011لا SU الاتجاه التخليقي. تم إدخال تتابع ترميز بروتين تفلور أصفر (YIP) بعد شظية عديدة النيوكليوتيد حيث تتضمن عناصر معزز aminUbilP إكسون ZmUbIL وانترون 011ل200. بالإضافة لذلك؛ تتابع قائدة تالية تتضمن تتابع توقف عديدة النيوكليوتيد ذات 7 إطارات وتم إضافة تتابع عديدة النيوكليوتيد (Koza) تتوافق مع الذرة إلى شظية عناصر معزز 0115ل00101؛ إكسون 011ل2000؛ وانترون .ZmUbil 5 تم إدخال تتابع ترميز (GUS) انا بعد معزز 011لا AW الاتجاه التخليقي في ملا
اتجاه عكسي بالنسبة لتتابع Yip (هوية تتابع رقم: 6؛ انظر الشكل ١ على سبيل المثال). يتم استنساخ عديد النيولوكتيد الناتج يتضمن معزز 011لا ثنائي الاتجاه التخليقي متصلة بشكل عملي .pDAB105801 إلى بلازميد GUS, yfp بجينات تم استكمال الناقل الثنائي الذي يتضمن مجموعات التعبير الجيني للجين YFP GUS من
GATEWAY L-R CLONASETM عن طريق تفاعل pDAB105801 بلازميد © (Invitrogen, Carlsbad, CA) يحتوي الناقل الناتج» pDABI08706 على مجموعات التعبير الجيني للجين GUS 0لا و880-1 داخل منطقة سلالة T (انظر الشكل eco سبيل المثال). المثال ؟: التعبير الجيني عن جينات عابرة متصلة بشكل عملي بمعزز 1 Ubiquitin ثنائي ١ ٠ الاتجاه تخليقي يمكن تصوير الأمثلة النموذجية للتعبير الجيني العابر عن GUS, YFP في أجنة Zea mays محولة باستخدام 00/85108706. يمكن أن يحرّك كلا جانبي معزز 011لا20 ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن تتابعات ترميز GUS 5 YFP المرتبطة عملياً. يكون التعبير الجيني عن مستويات 10لا مقارناً ب التعبير عن مستويات GUS تؤكد تلك الملاحظات أن كلا من جانبي VO معزز 70011 ثنائي الاتجاه تكون بوظيفة بيولوجية. علاوة على ذلك ¢ Sas أن يعبر عنصر minUbilP لمعزز 811لا ثنائي الاتجاه التخليقي عن Yip عند مستويات تعبير مشابه مقارنة بنسيج Zea mays لين محول باستخدام بلازميد ثنائي (00/8101556) التي تتضمن معزز معزز ZmUbil ثنائي الاتجاه لتتابع ترميز 0]لا. لا يتم كشف التعبير الجيني عن 775 أو binary في أجنة غير ناضجة مقارنة سالبة التي لا تكون محولة باستخدام تركيب ثنائى GUS
GUS ؛ ولا تحتوي على تتابعات ترميز 10لا أو construct. المثال ؟: التعبير الجيني المستقر عن جينات متصلة بشكل عملي بمعزز 1 Ubiquitin الاتجاه تخليقي يمكن ملاحظة صور WIA نسيج Zea mays لين التي تكون مستقرة المحولة باستخدام ناقل م
كلا أجنة mays .2 التي تم نشرها على وسط اختيار oY يمكن أن يحرّك معزز 20100811 ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن تتابعات ترميز 10لا. تؤكد تلك النتائج أن عنصر أدنى معزز Min-UbilP من معزز 20000811 ثنائي الاتجاه يكون قادراً على التعبير عن جين مبلْغْ في خلايا نسيج MAYS .> لين محولة بشكل مستقر. تكون مستويات التعبير الجيني عن بروتين Yio © متشابهة مقارنةٌ بالتعبير عن YFP أو GUS في نسيج mays .2 اللين المحول باستخدام ناقل ثنائي مقارن الذي يحتوي على معزز ZmUbil موحد الاتجاه تتابع ترميز YFP (00/88101556). لا يتم كشف التعبير الجيني عن 10لا أو GUS في النسيج اللين المقارن السالب الذي لا يكون Yona باستخدام تركيب ثنائى ولا يحتوي على تتابع ترميز yfp أو GUS ro JE تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً باستخدام Real Time TagMan® PCR ٠ تم تحويل أجنة Zea mays باستخدام ناقل ثنائي تتضمن ire 20000811 ثنائي الاتجاه؛ 6هه وتم تحويل نباتات أخرى باستخدام ناقل ثنائي «lie 00/8101556. تم تأكيد وجود yp محورة وراثياً داخل جينوم لكل مجموعة من نباتات Mays .2 عن طريق مقايسة probe assay lw للتحلل المائي. تم الحصول على شتلات Z. mays معدلة Lily محولة بشكل مستقر نمت من النسيج اللين وتحليلها لتعريف الحالات التي تحتوي على عدد نسخ منخفض 7-١( ١ نسخة) لوليجات جديلة-1 T-strand inserts بطول كامل من ناقل PDAB108706 ثنائي وناقل 000/8101556 SUS مقارن. تم نقل الشتلات المعرفة إلى الصوبة وانماءها. تم استخدام نظام Roche للضوء "07201624807 لتحديد عدد النسخ المعدلة وراثياً للحالات التي تكون محولة باستخدام ناقل 0008108706 ثنائي؛ و لأحداث مقارنة تكون محولة باستخدام ناقل 6 ثائي. تستخدم الطريقة تفاعل TaqMan® ثنائي الضفيرة الذي يستخدم ٠ . أوليجونيوكليوتيدات محددة للجين 10لا وإلى جين مرجعي mays .2 داخلي laid إنقيرتاز 6 (رقم الانضمام لبنك الجينات: 16123.1لا)؛ في تجربة واحدة. تم تحديد عدد النسخ والتلقيح Zygosity عن طريق قياس شدة —yfp المحددة لتفلور fluorescence بالنسبة لتفلور الإنقيرتاز النوعي؛ مقارنةً بمعايير عدد النسخ المعروف.
اج 7 _ في mays .2 المحولة باستخدام ناقل 0100/8108706 ثنائي؛ يتم تضخيم شظية جين 10لا - محدد 1 DNA باستخدام مجموعة_بادئة/_مسبار TAQMAN® واحدة Jae est مرقم باستخدام صبغة تفلور FAM .وتم تضخيم إنقيرتاز باستخدام مجموعة De [Ral TAQMAN® ثانية تتضمن مسبار مرقم باستخدام HEX تفلور (الجدول 7). يتم تحضير خليط © تفاعل PCR كما هو مذكور في الجدول oF وتم تضخيم DNA Las المحدد للجين وفقاً للظروف المذكورة في الجدول 4. تم تحديد عدد النسخ لقاحات العينات عن طريق قياس الكثافة النسبية للتفلور المحدد للجين المراسل؛ 10لا؛ إلى تفلور محددة للجين المرجعي؛ lx مقارنة بمعايير عدد النسخ المعروف. الجدول LY بادئ نيوكليوتيد تقدمي وعكسي ومسبارات تفلور fluorescent probes (مخلقة ٠ بواسطة (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA بادئة YFP تقدمية هوية تتابع رقم: GATGCCTCAGTGGGAAAGG | V بادئة YFP عكسية هوية تتابع رقم: | CCATAGGTGAGAGTGGTGACAA مسبار ROCHE UPL jl YFP رقم ١١١
CTTGGAGC
Roche, ) Cat 04693604001 رقم (Indianapolis, IN
TGGCGGACGACGACTTGT | 4 هوية تتابع رقم:
AAAGTTTGGAGGCTGCCGT | ٠١ هوية تتابع رقم: 5'HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTAC | ١١ مسبار إنقيرتاز هوية تتابع رقم:
TTCTACC/3BHQ_1/3'
TGTTCGGTTCCCTCTACCAA | ١١ هوية تتابع رقم: دما
h — 7 — معزز AADT عكسي | هوية تتابع رقم: CAACATCCATCACCTTGACTGA | ٠١ مسبار AAD] هوية تتابع رقم: CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA | ١4 تم تكوين المعايير عن طريق تخفيف الناقل» 0108108706 في 5104 mays .2 جينومي (9DNA) DNA للحصول على معايير بعلاقة معروفة ل .gDNA :pDAB108706 على سبيل المثال؛ تم تحضير العينات التي بها نسخة واحدة؛ نسخيتن؛ أربع نسخ لناقل DNA لكل نسخة من mays 8104 gDNA .2. تم تقييم تخفيفات نسخة واحدة ونسختين من 8108706نام © المختلطة باستخدام معيار mays 8104 gDNA .2 مقابل حالة Zo mays مقارن تكون معروفة بأنها أحادية التلقيح» وحالة mays .2 مقارن تكون معروفة بأنها ثنائية التلقيح (حالة Z. ¢YVA mays انظر منشور براءة الاختراع الدولي PCT رقم (WO 2011/ 022469 A2 تم إجراءة تجربة TagMan® ثنائية الضفيرة باستخدام أوليجونيوكليوتيدات محددة لجين AAD] وأوليجونيوكليوتيدات محددة لجين مرجع mays .2 داخلي Gla andl عن طريق تضخيم Vo وكشف شظية DNA محددة للجين ل 01 باستخدام مجموعة بادئة/ مسبار TAQMAN® واحدة تتضمن مسبار مرقم باستخدام صبغة تفلور FAM وعن طريق تضخيم وكشف شظية DNA محددة للجين لإنقيرتاز باستخدام مجموعة بادئة/ مسبار TAQMAN® ثانية تتضمن مسبار مرقم باستخدام HEX تفلور (الجدول 7). تم تحضير خليط تفاعل AAD] TagMan® كما هو مذكور في الجدول 7 وتم تضخيم الشظايا المحددة وفقاً للظروف المذكورة في الجدول cE ١٠ الجدول ؟. خليط تفاعل .JTAQMAN® PCR عدد التفاعلات ميكرو لتر لكل | التركيز النهائي منها " م
— 7 7 — تم تحليل مستوى التفلور المولد لكل تفاعل باستخدام ™480 Roche LightCycler Thermocycler وفقاً لتوجيهات المصنّع .manufacturer’s directions تم تنفيذ شق التفلور FAM fluorescent moiety بكثافة بصرية density 001108 تبلغ ¢70[ oY. نانو مترء وتم © إثارة جزيء الفلور HEX بكثافة بصرية تبلغ OA [OV نانو متر. تم تحديد عدد النسخ عن
طريق مقارنة قيم مستهدفة/ مرجعية للعينات غير المعروفة (حصيلة بواسطة LightCycler JY) (480™ قيم مستهدفة/ مرجعية لأربع معايير عدد النسخ المعروف -١ Null) نسخة (hemi) 7- نسخة (homo) و؟ -نسخ). الجدول 4. ظروف الدورة الحرارية Thermocycler conditions لتضخيم PCR
درجة الحرارة خطوات PCR الزمن عدد الدورات
(درجة مثوية)
ملا
A —_ 7 _ A q0 ثواني 4 تم عرض النتائج من تحليل عدد النسخ المعدلة وراثياً لنباتات معدلة وراثياً تم الحصول عليها عن طريق التحويل باستخدام تركيب ثنائي الاتجاه معزز «(PDAB108706) ZmUbil construct ونباتات معدلة وراثياً تم الحصول عليها عن طريق التحويل باستخدام معزز موحد الاتجاه مقارن تركيب (pPDABL101556) ZmUbil YFP في الجدول ©. تم نقل النباتات فقط باستخدام ١-؟ © نسخة من تحويل Yip إلى الصوبة لتحليلات التعبير الجيني الإضافي. الجدول 0 تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً للنباتات المعدلة وراثياً التي تم الحصول عليها من تركيب معزز ثنائي الاتجاه وتركيب construct مقارن. . عدد الحالات تركيب عدد الأجنة المحولة 7-١ نسخة من yp الموجبة المثال 6: التعبير الجيني المستقر للنبات بالكامل عن جينات متصلة بشكل عملي بمعزز 81 ثنائي الاتجاه تخليقي. كل النباتات التي gga على عدد نسخ منخفض aed ge T-DNA الثنائي 6ه والنباتات التي تحتوي على عدد نسخ منخفض من البلازميد الثنائي المقارن 6ه تم إنماء في صوبة. تم تحليل الأمثلة النموذجية للتعبير الجيني المستقر عن YFP في الورق ونسيج جذر نباتات ذرة TO مطفرة تم الحصول عليها من أجنة Z. mays دما
-"١74- ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن 10لا ترمز تتابعات في كلا من أنسجة الورق 1 في معزز Min-UbiP1 وأنسجة الجذر. يؤكد التحليل المجهري أيضاً أن عنصر أدنى معزز ثنائي الاتجاه يمكن أن يحرّك بلازميد ثانوي مقارن (00/8101556) يحتوي على 1 توضح النباتات المقارنة أيضاً YD ثنائي يحرّك التعبير الجيني عن تتابع ترميز ZmUDIT معزز root tissues وأنسجة الجذر leaf tissues في أنسجة الورق YFP تعبير مستقر عن © ثنائي الاتجاه Ubiquitin] لجينات متصلة بشكل عملي بمعزز Western تحليل بقعة :١ المثال ذرة TO تم أخذ عينات من نباتات :Total Soluble Protein إجمالي بروتين قابل للذوبان تم أخذ عينات من إجمالي أربع ./6 developmental stage محولة عند المرحلة التنموية matrix الأصغر في أنبوبة مصفوفة unfolded leaf ورقات مشتراة من الورق غير المطوي ٠ negative بالنسبة للضابط السلبى .01811* box ووضعها داخل صندوق مصفوفة tube تم أخذ عينات من أربع ورقات مشتراة من نبتتين من ذرة 8104 غير محولة عند ¢ control في أنابيب steel bead في أنبوب مصفوف. يتم وضع كرية صلبة ١/6 المرحلة النموية إلى كل أنبوب. تم تغطية PBST المصفوفة مع العينات؛ وبعد ذلك يتم إضافة 50860 ميكرو لتر لفة بالدقيقة لمدة ١٠5٠١ عند bead الأنابيب؛ واستخلاص البروتين عن طريق تحويل إلى كريات Yo عن طريق الطرد المركزي Debris في مطحنة أنسجة 6600. يتم وضع البقايا Go .centrifugation في طبق بقياس PBST ميكرو لتر باستخدام Yo تم تخفيف عينة © ميكرو لتر من كل أنبوب إلى دقيق ذو 97 عين. تم تحليل تلك العينات للبروتين القابل للذوبان الإجمالي باستخدام أداة اختبار تم pad) وفقاً لتوجيهات (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) BCA بروتين ٠ معايير مجهزة في الأداة بصورة (BSA) Bovine serum albumin تحليل ألبومين مصل بقري متكررة؛ وتم استخدام متوسط القيم لتوليد منحنى قياسي حيث يتم استخدام بشكل متكرر لاحتساب إجمالي البروتين القابل للذوبان لكل عينة. تم معادلة إجمالي البروتين القابل للذوبان لكل عينة إلى مجم/ ميكرو لتر. ملا
A «= — الجدول 1 بروتوكول Western daa ¥ ميكرو جم/ مل مضاد - PhiYFP لأرنب ) Axxora, San التهجين (Diego, CA في 120 ٠١| Thermo ( StartingBlock™ دقائق الأسا ١ سبي (Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 0 بيروكسيداز Jad لحصان —(HRP) مقترن مضاد-106 لأرنب التهجين الثانوي © دقائق وعنزة تحليلة بقعة Western ل 70/201710: في طبق بقياس دقيق ذو AT عين؛ تم تخفيف كل 0 ميكرو لتر من عينة البروتين المستخلص باستخدام 0 ميكرو لتر XY محلول منظم Laemmli + 0-7 -ميركابتو إيثانول ا10610850م0061068-]-2. تم شراء عينات المقارنة من YFP/Phiyfp © منقاة في محلول منظم HEPES (50 مم Yoo (HEPES مم 960٠ KCI جليسرول) من (San Diego, CA) Axxora تم تحضير العينات في نفس الطبق عن طريق تخفيف diluting ١:١ باستخدام محلول منظم Laemmli لإنشاء منحنى عياري standard curve للتركيزات التالية: ٠. نانو جم/ ميكرو لترء YO نانو جم/ ميكرو evo se al نانو جم/ ميكرو لتر. تم تسخين العينات في Thermocycler عند 90 درجة مئوية لمدة ٠١ دقيقة؛ ٠ وبعد ذلك bas إلى 4 درجة مئوية. تم تجميع Bio-Rad Criterion gel™ بعد ذلك مع محلول منظم .SDS/MES تم ترك العينات لتدفاً إلى درجة حرارة الغرفة؛ وتم تحميل ٠١ ميكرو لتر من dual) على كل عين من المركبين الهلاميين. بالإضافة ذلك؛ تم تحميل عينات من YFP/Phiyfp المنقاة لمنحنى عياري؛ ومرمز عقدة بروتين»؛ في العيون من الجل. تم إدخال ملا
“AY — المركبات الهلامية بشكل رحلاني عند ١5١ قولط و١5٠١ مللي أمبير لمدة 0 دقائق بعد الدخول؛ تم فتح أغطية الجل Jay البروتينات إلى غشاء نيترو سيلولوز باستخدام Blot System™ (Invitrogen) تم نقل البروتين من الجل إلى الغشاء عن طريق مرور تيار ٠١0 قولط لمدة ٠١ دقائق. تم إزالة غشاء النيترو سيلولوز ووضعه في محلول احتجاز منظم StartingBlock T20™ | 5 طوال الليل عند ؛ درجة Aggie تم فصل محلول الاحتجاز المنظم بعد ذلك؛ ومعالجة الغشاء باستخدام البروتوكول المذوكر في الجدول 6. تم كشف ارتباط الجسم المضاد Antibody باستخدام نظام كشف تألق كيميائي Amersham ECL™ plus chemiluminescent بإتباع توجيهات ahead) تم تعريض الرقاقة ٠١ دقائق Vey دقيقة. تم استخدام الرقاقة المكشوفة exposed film لمدة ٠١ دقائق ٠ ا لتحديد كمية البروتين» وتم استخدام الرقاقة المكشوفة بشكل زائد لمدة 9٠0 دقيقة لتأكيد Cle البروتين في 8104 وعينات المقارنة الأخرى. تم تسجيل الغشاء membrane على خلفية الرقاقة المعرضة؛ وتم تحديد كمية البروتين بواسطة تحليل الكثافة بالبكسل .pixel density analysis تم أولاً استخدام الكثافة بالبكسل pixel density لمعايير البروتين المنقاة purified protein لإنشاء منحنى عياري تم استخدامه لتحديد كمية البروتين في العينات. بالرغم من أن الغشاء يعرض Ll) Yo بمونومر monomer ودايمير dimer 001770 حتى في المعيار المنقّى؛ يتم استخدام مونومر 001770 فقط لتحديد كمية التعبير الزائد عن البروتين. بعد ذلك تمت معادلة قيم البروتين إلى انو جم/ ميكرو لتر. تم احتساب نسبة البروتين القابل للذوبان الإجمالية المعادلة (TSP) PhiYFP إلى وحدات من نانو جم من [YFP مجم (TSP أو على نحو بديل» أجزاء بالمليون (PPM) ٠ تحليل GUS لبقعة :Western يتم تحديد مقدار التعبير الجيني عن بروتين GUS بطريقة مماثلة ل (PhiYFP بالاستثناء التالي: يتم تخفيف ٠١ ميكرو لتر من عنية من مستخلص ١ :١ باستخدام x ¥ 2-8 + 86001 - ميركابتو إيثانول 2—-f—mercaptoethanol ؛ محرفة عند 90 درجة Adie لمدة ٠ دقيقة؛ وبعد ذلك يتم تحميل ١١ ميكرو لتر في الجل. تم تغطية الأغشية المعالجة Processed membranes باستخدام رقاقة (تعرض لمدة دقيقة واحدة) باستخدام غشاء لتحليل vo -كثافة البكسل. ملا
تم عرض نتائج تحليل بقعة VY Western نبات ذرة TO مطفرةٍ تم الحصول عليها من أجنة Z. 5 المحولة باستخدام الناقل الثنائي؛ (pDABI08706 في الشكل .١١ يوضح معزز 1 ثائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن GUS, Yip ترمز تتابعات من نسيج الورق leaf tissue تؤكد تلك الملاحظات أن عنصر أدنى معزز 5:01ل1/10-1 من 2000511 ثنائي ٠ الاتجاه معبر عن YFP عند نفس مستويات التعبير الجيني Lae بالنسيج اللين من Z. mays المحول باستخدام بلازميد ثنائي يتضمن معزز ZMUDIL متحد الاتجاه يحرّك تتابع ترميز YIP (00/8101556؛ انظر الشكل (VY المثال tA تركيب لتراص مجموعة من أربع جينات تم استخدام تركيب pDABL05803 بلازميد كبلازميد البداية لتوليد تراص مجموعة من أربع ٠ جينات AAD1-2A-Phiyfp) و (cry34-2A-cry35 المشتق بواسطة معزز Zea mays 100-1و01لا ثنائي الاتجاه. تم عرض خريطة تمثيلية لبلازميد 0088105803 في الشكل ١ يحتوي على معزز Zea mays Ubiquitin—1 ثنائي الاتجاه. يتم استنساخ شظية AAD] -2A-Phiyfp fragment المشتقة من بلازميد 0088105841 إلى هيكل ناقل قطع BamHI cut vector backbone و Sacl البلازميد 88105803نام ١ باستخدام طرق استنساخ معروفة بشكل شائع في المجال. يدي ذلك إلى إنتاج البلازميد الوسيط 2 و(الشكل .)١١7 يتم استنساخ Notl/Xbal يهضم شظية cry34(8V6)—2A- 5 ناتج من البلازميد 0008105840 بين مواقع Notl/Spel _من _ بلازميد 2 إلى تركيب بلازميد .pDAB105843 يحتوي البلازميد PDABI05843 على مجموعات cry34(8V6)-2A-cry35 و AADI-2A-Phiyfp جينية على كل جانب من Yo معزز 011لا200 ثنائي الاتجاه (الشكل (OA تم توليد ناقل ثنائي يحتوي على معزز 511ل200 SE الاتجاه؛ و مجموعات جينية للتعبير الجيني عن ;cry34(8V6)-2A-cry35 3801-/001710-2 من بلازميد 088105842ام عن طريق فاعل (Invitrogen, Carlsbad, CA) GATEWAY L-R CLONASE من وجهة بلازميد .pDAB101917 الناقل الناتج pDAB108717 « resulting vector يحتوي م
A Ad — — على مجموعات التعبير الجيني عن «AAD1-2A-Phiyfp «cry34(8V6)-2A-cry35 و جين PAT داخل حدود T-DNA (الشكل (V4 المثال 9: تركيب لتراص مجموعة أربع جينات ثناية يتم استخدام تركيب 0108105803 بلازميد لتوليد تراص مجموعة أربع جينات ثناية Phiyfp-) © 2-8801 و (cry34-2A-cry35 المشتق بواسطة معزز Zea mays Ubiquitin—1 ثنائي الاتجاه. يتم استنساخ شظية Phiyfp—2A-aad] مشتقة من بلازميد 008105844 إلى سلسلة ناقل قطع 8800111 و Sacl البلازميد 0105105803 باستخدام طرق استنساخ معروفة بشكل شائع في المجال. يؤدي ذلك إلى إنتاج البلازميد الوسيط 0105105845 (Yr Jal) يتم استنساخ sag Notl/Xbal شظية 01735-/2-(7/34)81/6©_ناتجة_من_البلازميد ٠ 008105840 بين مواقع Notl/Spel من بلازميد pDABI05845 إلى تركيب بلازميد 6 ور(الشكل (YY يحتوي البلازميد 1088105846م على مجموعات جينية من --/2-(34)81/6/ و Phiyfp-2A-aadl على كل جانب من معزز ZmUbil ثنائي الاتجاه. ثم توليد ناقل ثنائي يحتوي على معزز 2001 ثنائي cola و مجموعات جينية cry34(8V6)-2A—cry35 ١٠ و 3801-/0017/10-2 من بلازميد PDAB105846 عن طريق تفاعل (Invitrogen, Carlsbad, CA) GATEWAY L-R CLONASE من وجهة بلازميد «Phiyfp-2A-aadl «cry34(8V6)-2A-cry35 و جين PAT داخل حدود T-DNA NARS A) ٠ المثال :٠١ تحول الأجرعية المورمة صبغة DAt13192 تم تحويل النواقل الثنائية pDABI08717 و 008108718 إلى صبغة الأجرعية المورمة الثلاثية DAE13192 (انظر طلب براءة الاختراع المؤقت الأمريكي رقم 11/7714897). تم فصل مستعمرات باكتيرية colonies 88016118 وتم استخلاص DNA بلازميد ثنائي والتحقق منها عن طريق عمليات هضم إنزيمية .enzyme digestions ملا
Af التحول إلى الذرة :١١ JE للحصول على أجنة :Embryo Isolation وفصل الأجنة Ear Sterilization تعقيم كوز الذرة في الصوبة وتلقيح ذاتي أو (Cv. 8104( Zea mays ذرة غير ناضجة؛ تم إنماء نباتات من يوم بعد التلقيح. في يوم التجربة؛ يتم تعقيم ١-4 أشقائي لإنتاج السنبلة. تم تجميع السنابل تقريباً 1765 صوبة؛ حيث يحتوي على Gane مطح السنابل عن طريق الغمر في محلول 90780 من 5 دقيقة؛ يلي ذلك ثلاث شطفات في ماء معقم. بعد 70-7١ sad صوديوم هيبوكلوريت؛ والهز مم) في جو معقم من كل سنبلة 7.7-٠١١5( التعقيم؛ تم تشريح الأجنة الملقحة غير الناضجة
LS وتوزيعها بشكل عشوائي في أنابيب طرد مركزي دقيقة تتضمن وسط إصابة سائل (وسط 7٠٠٠١ لتر؛ ا- برولين» [de ٠٠٠١ »]6٠0609[ NE لتر؛ محلول قيتامين [an 47 (Basal مجم/ لتر. ٠.5٠0 Gl لتر؛ جلوكوزء 7100 جم/ لتر؛ 7 ؛- faa 18.0 مجم/ لتر؛ سكروزء ٠ بالنسبة لمجموعة معطاة من التجارب؛ تم استخدام الأجنة المسحوبة من 7-؟ سنابل لكل معالجة. بداية استنبات الأجرعية: تم تبقيع مخزون جليسرول من سلالات الأجرعية تتضمن النواقل الثنائية ٠١ تتضمن مضادات حيوية ملائمة وتم إنماءها عند AB الموصوفة أعلاه على أطباق أدنى وسط تتضمن نفس YEP ؟"-؟؛ أيام. تم التقاط مستعمرة واحدة وتبقيعها على أطباق sad درجة مئوية يوم. 7-١ درجة مئوية لمدة YA المضادات الحيوية وتم احتضانها عند Vo استنبات الأجرعية والاستنبات المشترك: في يوم التجربة؛ تم التقاط مستعمرات الأجرعية من طبق مل؛ وتم تعديل ٠٠ مل من وسط إصابة في أنبوب يمكن التخلص منه سعة ٠١ معلق في (YEP نانو متر باستخدام مقياس طيف ضوئي. تم وضع ..4-١.7 = 000600 كثافة الخلية إلى لفة بالدقيقة؛ درجة حرارة الغرفة؛ أثناء إجراء تشريح ١١١ استنباتات الأجرعية على هزاز دوار عند مم في الحجم من حبات الذرة 7.7-٠.5 للجنين. تم فصل الأجنة الملقحة غير الناضجة بين - ٠ مل من وسط الإصابة وغسلها مرة واحدة في نفس الوسط. تمت إضافة ١ المعقمة ووضعها في ١5-٠١ مرة ثم هزها لمدة Vo مل) إلى كل أنبوب وتم قلب الأنابيب حوالي Y) معلق الأجرعية برولين؛ —L جم/ لتر؛ 5.737 (MS دقيقة. تم نقل الأجنة على وسط الاستنبات المشترك (أملاح ٠٠٠٠١ لكازين إنزيمي Sle مجم/ لتر؛ تحلل ٠٠٠٠١ مجم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ Yeon جم/ لتر؛ ٠.٠١ (Gelzan™ مجم/ لتر؛ سكروزء 0.0 جم/ لتر؛ 7.٠١ مجم/ لتر؛ ديكامبا YO tive
اج - قيتامين - MS معدّل ] Yoon JX veo مل لتر؛ Yo.
Ag No3 مجم/ لتر؛ أسيتو سيرينجون»؛ ٠٠٠0 ميكرو مولار)؛ موجه باستخدام قصيغة موجهة لأعلى؛ والاحتضان sad £07 أيام في الضوء عند Yo درجة REP يمكن ملاحظة التعبير الجيني العابر عن Phiyfp /75: التعبير الجيني عن YFP/ Phiyfp 0 العابر في الأجنة المحولة بعد ؟ أيام من الاستنبات المشترك باستخدام الأجرعية. تمت ملاحظة الأجنة تحت ميكروسكوب مجسم (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) باستخدام مرشح YFP ومصدر ضوء Owe نانو متر. اختيار واعادة توليد نسيج لين من حالات مفترضة: بعد فتزة الاستنبات المشترك؛ تم نقل الأجنة إلى وسط استقرار (أملاح (MS £77 جم/ لتر؛ 1- برولين» 70000 fame لتر؛ إنوسيتول Ye عضلي؛ ٠١١.٠ مجم/ asa] MES ¢ yl ¥ -(0- مورفولينو))- إيثان سلفونيك)؛ حمض حر]؛ 27.6 مجم/ لتر ؛ تحال ماني لكازين إنزيمي» ١٠١١.٠ مجم/ لتر ¢ 7.٠١ Lelia مجم/ yl ¢ سكروزء 7.6 جم/ لتر؛ ا ٠.١١ جم/ لتر؛ قيتامين - MS معدّل ] Yoon JX veo مل Yo.
AgNO3 ¢ yl مجم/ لتر؛ كاربينيسيلين» 6 مجم/ لتر) بدون عامل انتقائي والاحتضان في YE ساعة ضوء بكثافة ضوء ٠٠ ميكرو مول دقيقة-؟.ثانية sad ١- 7 أيام عند YA VO درجة Ade تم نقل الأجنة على وسط اختيار ١ (أملاح fan FY (MS لتر؛ —L برولين؛ م يلا مجم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ Yeon مجم/ لتر؛ Y asa] MES -(0- مورفولينو))- إيثان سلفونيك)؛ حمض حر]؛ 27.6 مجم/ لتر ؛ تحال ماني لكازين إنزيمي» ١٠١١.٠ مجم/ لتر؛ ٠.٠١ cella مجم/ لتر؛ سكروز» ٠٠٠.١ جم/ لتر؛ ٠.٠١ (Gelzan™ جم/ لتر؛ قيتامين - MS معدل ] Yor JX va مل لتر؛ ٠ AgNO3 مجم/ لتر؛ كاربينيسيلين» Yous Ye. مجم/ لتر) تتضمن 7 مجم/ لتر بايالافوس والاحتضان في Y¢ ساعة ضوء بكثافة ضوء On ميكرو مول دقيقة-7.ثانية ١- لمدة 7 أيام عند YA درجة مئوية. تم نقل الأجنة ذات كالس تخلقي تكاثري على وسط اختيار ؟ (أملاح fan 5.77 MS لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ١٠١١.٠ مجم/ -L ¢ yl برولين ل يلا مجم/ لتر ¢ Y asa] MES -(0- مورفولينو)- إيثان سلفونيك)؛ حمض over a مجم/ لتر؛ تحلل مائي لكازين إنزيمي؛ ٠١١.١ Yo مجم/ لتر؛ ١.٠١ lela مجم/ لتر؛ ٠٠.٠١ gS جم/ لتر؛ ٠.٠١ Gelzan™ جم/ tive
At _مجم/_لتر؛ 5.0 AgNO3 _مل/_لتر؛ ٠.٠١ (XVeid] Jie MS ثيتامين- ؛رتل ضوء dela YE مجم/ لتر)؛ تتضمن © مجم/ لتر بايالافوس واحتضانها في 790.٠0 كاربينيسيلين؛ تسمح Asie درجة YA أيام عند VE لمدة أخرى Y= ميكرو مول دقيقة-؟.ثانية ٠٠ بكثافة ضوء خطوة الاختيار هذه للنسيج اللين المعدل الوراثياً بتكاثئر وتمايز إضافي. يجب أن يستغرق اختيار ١ النسيج اللين فترة لا تقل عن ثلاثة أسابيع. تم نقل كالس تخلقي تكاثري على وسط إعادة توليد 0 مجم/ لتر؛ ا- برولين» 250800 مجم/ ٠٠٠٠١ (lime 77.؛ جم/ لتر؛ إنوسيتول (MS (أملاح مجم/ لتر؛ 75000 [a مورفولينو)- إيثان سلفونيك)» حمض —N)=Y [إ(حمض MES لتر؛ مجم/ ٠.٠١ (ABA مجم/ لتر ؛ ٠.503٠ (NAA تحلل مائي لكازين إنزيمي» 5000 مجم/ لتر ؛ - _لتر؛ قيتامين faa 7.5١ Gelzan™ جم/ لتر؛ 55.٠ مجم/ لتر؛ سكروزء ٠.٠١ (BA لتر؛ 750500 مجم/_لتر؛ كاربينيسيلين» ٠.٠١ (AGNO3 لتر؛ [de ٠.٠١ (XV 00h] Jee 05 ٠
Or ساعة ضوء بكثافة ضوء YE مجم/ لتر)؛ تتضمن 7 مجم/ لتر بايالافوس والاستنبات في درجة مئوية. YA لمدة 7 أيام عند ١- ميكرو مول دقيقة-7.ثانية لتر؛ fan 5.77 (MS تم نقل كالس تخلقي مع الفسيلة/ البراعم على وسط إعادة توليد 7 (أملاح مجم/ لتر؛ سكروز؛ ٠٠٠٠١ مل/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ٠٠٠١ »]6٠00٠[ معدّل MS - قيتامين لتر؛ كاربينيسيلين» 750030 مجم/ لتر)؛ faa ٠.٠٠ (Gellan Gum 64347 لتر؛ faa Tele No ساعة بكثافة ضوء VE تتضمن ؟ مجم/ لتر بايالافوس. تم احتضان الاستنبات تحت الضوء لمدة درجة مئوية. تم نقل الفسائل الصغيرة YA أيام عند ٠١-١ ميكرو مول دقيقة-7.ثانية-١ لمدة ٠
NG لتر؛ محلول قيتامين fan 5.77 145 الفسيلة ووسط تجذيري (أملاح AY بجذور أساسية جم/ لتر؛ 7٠00 gf مجم/ لتر؛ ٠٠٠٠١ مل/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ٠.٠١ (XY 0] 0 ساعات ضوء/ ظلام عند A NT لتر؛ في طبق نبات واحتضانها تحت faa 50.56 آجار ٠ درجة مئوية. تم اختيار الشتلات المعدلة وراثياً YA أيام عند ١7 sad ١- ميكرو مول دقيقة-7.ثانية ميكرو مول دقيقة- Yoo ساعات ضوء/ ظلام عند A VT المطنونة السليمة ثم احتضانها في درجة مئوية وتم تحليلها لتحديد عدد النسخ المعدلة Yo أخرى 7-ه أيام عند sad ١- ".ثانية ونقل إلى الصوبة. Ls العابر Phiyfp التعبير الجيني عن VY _المثال Yo tive
-/- تم إجراء التعبير الجيني العابر عن Phiyfp من أجنة Zea mays محولة باستخدام 7 . يمكن لمعزز ZmUbil ثنائي الاتجاه أن يعبر عن Phiyfp من مجموعة التعبير الجيني عن جين 710أ8801-28-00؛ عندما لا يوضح جنين غير محول أي تفلور 0 . يمكن ملاحظة مستوى مشابه للتعبير الجيني عن Phiyfp من أجنة Zea mays محولة © باستخدام بلازميد 0100/5105748 ثنائي (الشكل (Yo تتضمن Zea mays موحد الاتجاه معزز (Zm) 1 يحرّك تتابع ترميز Phiyfp أحادية تعرض مستوى متوقع من العبير Shall ل [YFP 10لا1ا. يمكن ملاحظة التعبير الجيني العابر عن Phiyfp من أجنة Zea mays محولة باستخدام 00/8108718؛ حيث يمكن أن يعبر معزز 011لا Zm ثنائي الاتجاه عن Phiyfo من مجموعة التعبير الجيني عن جين .Phiyfp—2a-aadl ٠ المثال YF التعبير الجيني عن Phiyfp في ذرة محولة بشكل مستقر التعبير الجيني عن 7017/10 في نسيج Zea mays لين محوّل بشكل مستقر محرك بواسطة معزز Zm 1 ثنائي الاتجاه: توضح أجنة Zea mays محولة باستخدام ناقل 0/8108717م الثنائي تتضمن مجموعة التعبير الجيني عن جين ]8801-28-07 تعبير Phiyfp جيد. يمكن أن يحرّك jee 511لا Zm ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن Phiyfp تؤكد تلك النتائج أن Vo عنصر أدنى معزز 5101لا-10// لمعزز Ubil 207 ثنائي الاتجاه يكون قادراً على التعبير عن جين cali على سبيل المثال Phiyfp أو YFP مستويات التعبير الجيني عن بروتين Phiyfp متشابهة مقارنةً بنسيج Zea mays لين محول باستخدام ناقل ثنائي مقارن حيث يتضمن Zm Ubil jee موحد الاتجاه يحرّك تتابع ترميز 150 (00/8105748). لا يتم كشف التعبير الجيني عن Phiyfp في النسيج اللين المقارن السالب الذي لا يكون محولاً باستخدام تركيب Vo ثنائى ولا يحتوي على تتابعات ترميز Phiyfp توضح أجنة Zea mays محولة باستخدام الناقل الثنائي 00/8108718 حيث يحتوي على مجموعة التعبير الجيني عن جين Phiyfp-2a-aadl تعبير Phiyfp جيد. يمكن أن يحرّك معزز 811لا 200 ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن 051710. تؤكد تلك النتائج أن عنصر أدنى معزز Min-UbiP1 لمعزز 811ل 200 ثنائي الاتجاه يكون قادراً على التعبير عن جين cali Yo على سبيل المثال Phiyfp أو YFP دما
— A A —
المثال :٠6 تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً
تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً باستخدام :Real Time TagMan™ PCR تم تحويل نباتات
Zea mays باستخدام نواقل ثنائية تتضمن معزز 011لا 200 ثنائي الاتجاه؛ 008108717 و
8ه وتم تحويل نباتات أخرى باستخدام ناقل ثنائي مقارن» 00/8105748. تم
Z. «bls داخل جينوم (Pat Phiyfp, 2801, cry34, cry35) تأكيد وجود تتابع ترميز ©
5 المعدلة وراثياً إلى 0088108717 و 0088108718 بواسطة مقايسة مسبار تحلل
TaqMan hydrolysis probe assay Ak تم تحليل النباتات المعدلة Lays إلى ناقل مقارن
8 لتحديد وجود تتابع Phiyfp تم الحصول على شتلات mays .2 المعدلة
وراثياً المحولة بشكل مستقر التي نمت من النسيج اللين وتحليلها لتعريف الحالات التي تحتوي على ٠ عدد Aud منخفض 7-١( نسخة) لوليجات تضفير T= بطول كامل من النواقل الثنائية
7 و «pDAB108718 وناقل ثنائي مقارن 010/5105748. تم تقديم الشتلات
المؤكدة إلى الصوبة وانماءها.
تم استخدام نظام Roche ضوء Cyclerd80™ لتحديد عدد النسخ المعدلة وراثياً للحالات التي
تكون محولة باستخدام الناقل الثنائي 00085108717 و 00/8108718. الطريقة التي تستخدم Vo تفاعل TagMan® ثنائي الضفيرة التي تستخدم أوليجونيوكليوتيدات خاصة لتتابع الترميز وجين
mays 2.2 مرجعي داخلي المنشاًء إنقيرتاز (رقم الانضمام لبنك الجينات: 16123.1لا)؛ في
تجربة واحدة. تم تحديد عدد النسخ والتلقيح عن طريق قياس شدة تفلور تتابع الترميز الخاصة؛
بالنسبة لتفلور الإنقيرتاز النوعي؛ مقارنةٌ بمعايير عدد النسخ المعروف.
الجدول 7. بادئ نيوكليوتيد تقدمي وعكسي ومسبارات تفلور (مخلقة براسطة Integrated DNA ¥Y. ذخا .(Technologies, Coralville,
بادئة YFP تقدمية GATGCCTCAGTGGGAAAGG (هوية تتابع رقم: (V
ملا
بادئة YFP عكسية CCATAGGTGAGAGTGGTGACAA| (هوية تتابع رقم: (A مسبار YFP مسبار ROCHE UPL رقم CTTGGAGC ١75 (هوية تتابع رقم: "(
(Roche, Indianapolis, IN) Cat 04693604001 رقم (3 (هوية تتابع رقم: TGGCGGACGACGACTTGT (V+ تتابع رقم: dyn) AAAGTTTGGAGGCTGCCGT 5'HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC/3B مسبار إنقيرتاز
10_13 (هوية تتابع رقم: )١١ TGTTCGGTTCCCTCTACCAA (هوية تتابع رقم: (VY
(VY (هوية تتابع رقم: CAACATCCATCACCTTGACTGA| عكسي 001 jin
مسبار 801م CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA (هوية تتابع رقم: ¢) (
بادئة Cry34 تقدمية | GCCAACGACCAGATCAAGAC (هوية تتابع رقم: )£(
بادئة 00/34 عكسية | ali dyn) GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG رقم: tA (
مسبار 00/34 CCGAATCCAACGGCTTCA (هوية تتابع رقم: £7(
بادئة 00/35 تقدمية | CCTCATCCGCCTCACCG (هوية تتابع رقم: %£(
بادئة Cry35 عكسية | GGTAGTCCTTGAGCTTGGTGTC (هوية تتابع رقم: £9(
مسبار CAGCAATGGAACCTGACGT Cry35 (هوية تتابع رقم: £7(
بادئة PAT تقدمية | ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT (هوية
{ive
q «= _ بادئة PAT عكسية | CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT (هوية تتابع رقم: A 0 مسبار iu») GGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGG PAT تتابع رقم: £9 ( Zo mays clued dually المحولة باستخدام النواقل الثنائية PDAB108717 و 8 يتم تضخيم شظية DNA خاصة بتتابع ترميز باستخدام مجموعة بادئة/ مسبار TagMan® تتضمن مسبار مرقّم باستخدام صبغة تفلور FAM ويتم تضخيم إنقيرتاز باستخدام © مجموعة بادئة/ مسبار TagMan® ثانية تتضمن مسبار مرقّم باستخدام تفلور HEX (الجدول .)١ تم تحضير خليط تفاعل PCR كما هو مذكور في الجدول A وتم تضخيم قظايا DNA المحدد للجين وفقاً للظروف المذكورة في الجدول 9. تم تحديد عدد نسخ وتلقيح العينات عن طريق قياس الكثافة النسبية للتفلور المحدد لتتابع الترميز للتفلور المحدد للجين المرجعي؛ إنقيرتازء مقارنة بمعايير عدد النسخ المعروف. تتم تكوين المعايير عن طريق تخفيف الناقل (0108108717 و Z.
Jala (pDAB108717 mays B104 جينومي (GDNA) DNA للحصول على معايير بعلاقة معروفة للناقل: (IDNA على سبيل (Jal يمكن تحضير العينات التي بها نسخة sans ونسختين وأربع نسخ لناقل DNA لكل نسخة من mays 8104 gDNA .2. تم التحقق من تخفيفات نسخة واحدة ونسختين من الناقل المختلط مع معيار mays 8104 gDNA .2 مقابل حالة mays .2 مقارنة التي تكون Vo معروفة بأنها أحادية اللواقح» وحالة mays .2 مقارنة التي تكون معروفة بأنها ثنائية اللواقح Ala) Z. mays 77/8؛ انظر منشور براءة الاختراع الدولي PCT رقم .)٠١١/١ 774314 YT تم shal تجربة SE TagMan® الضفيرة التي تستخدم أوليجونيوكليوتيدات محددة لجين تتابع الترميز وأوليجونيوكليوتيدات محددة لجين مرجع mays .2 داخلي Gla andl عن طريق تضخيم وكشف شظية DNA محددة للجين لتتابع الترميز باستخدام مجموعة بادئة/ مسبار TAQMAN® tive
q \ —_ _ واحدة تتضمن مسبار مرقم باستخدام صبغة تفلور FAM وعن طريق تضخيم وكشف شظية DNA محددة للجين لإنفيرتاز باستخدام de gene بادئة/ مسبار TAQMAN® ثانية تتضمن مسبار مرقم باستخدام HEX تفلور. وفقاً للجدول 7؛ تم تحضير خليط تفاعل تتابع الترميز TagMan® كما هو مذكور في الجدول A وتم تضخيم الشظايا المحددة وفقاً للظروف المذكورة في الجدول A ٠ه الجدول (A خليط تفاعل .JTAQMAN® PCR م vot ميكرو بادئة تتابع ترميز تقدمية ٠١( ميكرو ١ (Me ؛-؛ ميكرو لتر مولار vot ميكرو بادئة تتابع ترميز عكسية ٠١( ميكرو ١ (se ؛-؛ ميكرو لتر مولار مسبار تتابع ترميز 0018125 )0 ميكرو ميكرو ut ميكرو لتر مولار) مولار vot ميكرو معزز إنقيرتاز تقدمي ٠١( ميكرو مولار) ؛. ميكرو لتر مولار vot ميكرو معزز إنثيرتاز عكسي ٠١( ميكرو مولار) se et مولار لدي ميكرو مسبار إنقيرتاز )© ميكرو مولار) nt ميكرو لتر مولار £1ve
تم تحليل مستوى التفلور المتولد لكل تفاعل باستخدام 4801 Roche LightCycler Thermocycler وفقاً لتوجيهات المصنّع. تم إثارة جزيء الفلورة FAM بكثافة بصرية تبلغ [E70 9٠ نانو مترء وتم إثارة جزيء الفلورة HEX بكثافة بصرية تبلغ 0/577 8560© نانو متر. يمكن (LightCycler 480™ © إلى قيم مستهدفة/ مرجعية لأربع معايير عدد النسخ المعروف (على سبيل المثال؛ -١ (Null نسخة (hemi) 7- نسخة (homo) و4 - نسخ). الجدول 9. ظروف الدورة الحرارية لتضخيم PCR dann الحرارة خطوات PCR "0 الزمن عدد الدورات (درجة مثوية) 2 تم تلخيص النتائج من تحليل عدد النسخ المعدلة وراثياً لنباتات معدلة وراثياً تم الحصول عليها عن طريق التحويل باستخدام تركيبات معزز ZmUbil ثنائي الاتجاه PDABI08717) ٠ و00/88108718) ولنباتات معدلة وراثياً تم الحصول عليها عن طريق التحويل باستخدام تركيب معزز موحد الاتجاه [01ل2000 مقارن (pDAB105748) Phiyfp في الجدول .٠١ تم Ju النباتات فقط ذات 7-١ نسخة من كل المحورة hy إلى الصوبة لتحليلات التعبير الجيني expression analyses الأخرى. gv
q Ad —_ _ الجدول .٠١ تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً للنباتات المعدلة وراثياً التي تم الحصول عليها من معزز ثنائي الاتجاه وتركيبات مقارنة. . عدد الحالات البنية عدد الأجنة المحولة 7-١ نسخة من كل الجينات الموجبة المثال :١5 التعبير الجيني المستقر عن Phiftp في «lily ذرةٍ TO يمكن ملاحظة التعبير الجيني المستقر عن APhiftp نباتات Zea mays TO المحركة بواسطة © معزز Ubil 200 ثنائي الاتجاه: أجنة Zea mays محولة باستخدام PDAB108717 Jil ALE تتضمن مجموعة التعبير الجيني عن جين 8801-28-017]0. يمكن أن يحرّك معزز 1 200 ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن Phiftp في 98 من الفسيلة وأنسجة الجذر. تؤكد النتائج أن عنصر أدنى معزز 5101لا-10// لمعزز Zm Ubil ثنائي الاتجاه يكون قادراً على التعبير عن جين cides على سبيل المثال Phiftp أو YFP التي تكون مندمجة بشكل ثنائي ٠ السيسترونيك bicistronically مع AAD] باستخدام تتابع 2A تكون مستويات التعبير الجيني عن بروتين Phiftp مشابهة لأجنة mays .2 المحولة باستخدام ناقل ثنائي مقارن حيث يحتوي على معزز Ubil 200 موحد الاتجاه يحرّك تتابع ترميز Phiftp (00/88105748). لا يتم كشف التعبير الجيني عن Phiftp في النباتات المقارنة LL التي لا تكون محولة باستخدام تركيب ثنائى ولا تحتوي على تتابعات ترميز Phiftp (Kay V0 ملاحظة التعبير الجيني عن APhiftp الورق وأنسجة جذر نباتات Zea mays TO معدلة ia), إلى ناقل ثنائي 0088108718 حيث يحتوي على مجموعة التعبير الجيني عن جين .Phiyfp—2a-aadl يمكن أن يحرّك معزز 011لا 200 ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن .Phiftp تؤكد النتائج أن عنصر أدنى معزز 5101لا-1/10 لمعزز Zm Ubil ثنائي الاتجاه دما
يكون قادراً على التعبير عن جين مبلْغْ؛ على سبيل المثال Phiftp أو YFP مندمج ب 8680-1 مع تتابع /2. المثال :١١ تحليل 07/34» «Cry35 وبروتين AAD] تم أخذ عينات منا لنباتات في الأعمدة ٠١-١ من مصفوفة صناديق matrix box في V.0 مل © أنابيب مخروطية conical tubes إليها تمت إضافة ١ كرية صلبة يليها PBST + 96.2.5 BSA )7+ مل). بعد ذلك تمت سحن الصندوق إلى كريات لطحن 97110109 العينة في Geno sad Grinder © دقائق عند Ad ١٠5٠0 بالدقيقة ثم الطرد المركزي عند YY ev لفة بالدقيقة لمدة ١ دقائق عند ؛ درجة مثوية. تجربة :Cry34/ 35 ELISA في طبق عميق الفتحات deep well plate منفصل ذو 6 Vo عين؛ تم تخفيف عينة من المستخلص 5٠00 :١ في 96١ + PBST 510110. تم نقل الحجمين من YO ميكرو لتر من العينة المخففة إلى أطباق منفصلة ذات 976 عين تم ترتيبها باستخدام مضاد - 4 ومضاد - (Meso Scale Discovery) Cry35 في العمود ١١ و١١ من كل طبق تمت إضافة تركيزات عيارية من 0107/34 و1735 في Yo) 010116 96١ + PBST ميكرو لتر). بعد ذلك تم احتضان الأطباق أثناء الهز عند dap حرارة الغرفة sad ساعة واحدة. تم غسل ١ الأطباق بعد ذلك باستخدام Xx 3©( PBST 200 ميكرو لتر). بعد ذلك تمت إضافة YO ميكرو لتر من محلول من مضاد- Cry34 متقارن مع SulfoTAG ومضاد- Cry35 إلى كل عين والاحتضان مع الهز عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم غسل الأطباق بعد ذلك باستخدام Teo XY) PBST ميكرو لتر). بعد ذلك تمت إضافة مقدار من You ميكرو لتر (Meso Scale Discovery) Read Buffer T وقراءة الطبق مباشرةً على قارئ SECTOR® ٠ 6000. يمكن احتساب تركيزات البروتينات في العينة باستخدام المنحنى العياري للبروتين الخاص المولد من نفس الطبق. تجربة ELISA 10-1//: في طبق عميق منفصل ذو AT عين؛ تم تخفيف عينة من المستخلص 0:١ في PBST + 966.5 85/8. تم نقل الحجمين من Yoo ميكرو لتر من العينة المخففة بعد ذلك إلى أطباق ذات 97 عين منفصلة تم تغطيتها باستخدام مضاد AAD] (متوفرة بواسطة
ه40 (Acadia Bioscience LLC في العمود ١١ و١١ من كل طبق تمت إضافة تركيزات عيارية standard concentrations من AAD] في Yeo) BSA 976..5 + PBST ميكرو (A بعد ذلك تمت إضافة مقدار من 5٠ ميكرو لتر من مضاد AAD] بمجموعة بيوتين إلى كل عين وتم احتضان الأطباق أثناء الهز عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم غسل الأطباق بعد © ذلك باستخدام x 0) PBST 00 ميكرو لتر). بعد ذلك تمت إضافة ٠٠١ ميكرو لتر من محلول مقترن conjugate solution ستيبتاقيدين- فوسفات قلوي steptavidin-alkaline J phosphate كل عين والاحتضان مع الهز عند درجة حرارة الغرفة لمدة Te دقيقة. تم غسل الأطباق بعد ذلك باستخدام x 5( PBST 200 ميكرو لتر). تمت إضافة مقدار من ٠٠١ ميكرو لتر من ركيزة substrate (م- نيترو فينيل فوسفات (PNPP « p-nitrophenylphosphate ٠ بعد ذلك والاحتضان مع Gell عند درجة حرارة الغرفة لمدة £0 دقيقة. بعد ذلك تم قراءة الأطباق A405 xe plates على قارئ أطباق .(Molecular Devices) SpectraMax M5 يمكن احتساب تركيزات البروتينات في العينة باستخدام المنحنى العياري المولد من نفس الطبق. المثال :١١ تحليل بروتين نباتات ذرة TO تحليل بروتين نباتات TO ذرة مشتقة بواسطة تركيب معزز Zea mays Ubiquitin] ثنائي Veo الاتجاه (00/88108717): تم تليخص تحليل ELISA تمثيلي ل ١١ نبات ذرة TO معدل وراثياً mils من أجنة Zea mays محولة باستخدام 00/8108717 الذي يحتوي على -/01/34-2 5و 17/]0-/01-2ل// في الجدول .١١ يوضح معزز 011ل 200 ثنائي الاتجاه تعبير جيني قوي عن IS من تتابعات ترميز 617/34 و 01/35 في الورق. على نحو غير متوقع؛ تشير بيانات البروتين إلى ما يصل إلى ؛ أضعاف تعبير جيني أعلى ل Cry34 من تركيب ثنائي ٠ الاتجاه 008108717 مقارنة بتركيب محرّك ل 511لا 200 ثنائي الاتجاه. تمت ملاحظة تعبير جيني مشابه ٠١-8 أضعاف Jef لبروتينات Cry35 و 2801 Lal بشكل غير متوقع من تركيب ثنائي الاتجاه pDABLO8T17 مقارنةٌ بتركيب محرّك ل Zm Ubil ثنائي الاتجاه. توضح تلك الملاحظات أن معزز 2000510011001 ASW الاتجاه منفرد في تركيب PDAB108717 يمكن أن يعبر عن جينات متعددة (على سبيل Cry34 (Jal 00/35؛ و (AADL عند Yo مستويات أعلى بشكل غير متوقع Lhe بنباتات Zea mays محولة باستخدام بلازميد ثنائي ملا
يحتوي على معزز 1 200 موحد الاتجاه Sa نفس الجينات؛ حيث يتم اشتقاق كل تتابع ترميز بواسطة معزز 011لا Zm مستقل. يُشتق التعبير الجيني عن Cry34 و Cry35 الذي يربط نباتات )3 dad gs TO تركيب معزز Zea mays Ubiquitinl ثنائي الاتجاه (60085108717). تم عرض تحليل العلاقة بين © بروتينات Cry34 و Cry35 في ١١ نبات ذرة TO معدل ays ناتج من أجنة Zea mays محولة باستخدام 0008108717 الذي يحتوي على 017/34-2/8-017/35 في الشكل Jv تشير علاقة عالية جداً (مربع R = 094( إلى تعبير جيني قوي عن تنظيم مشترك بين 607/34 و Cry 35 من مجموعة التعبير الجيني عن جين 01735-/007/34-2 المشتق بواسطة معزز Zm 1لا ثنائي الاتجاه. ٠ الجدول .١١ التعبير الجيني عن Cry34/Cry35/AAD] في نباتات TO ذرة pDAB108717 معدلة ays هوية Cry35| sb Cry34 lll ثانو | AADL نانو [da جرام/ You جرام/ Yo Yous IE gv
YA 13% YY oe | Zm Ubi-
Cry34/Cry35 ثنائي Zea mays Ubiquitin] ذرة مشتقة بواسطة تركيب معزز TO تحليل بروتين نباتات معدل وراثياً TO 33 نبات ١١ تمثيلي ل ELISA الاتجاه (00/88108718): تم تلخيص تحليل 01/34-2/- محولة باستخدام 00/8108718 الذي يحتوي على Zea mays ناتج من أجنة ثنائي الاتجاه تعبير جيني قوي عن كلا من ZmUDIT أوضح معزز AY في الجدول 0/35 oe في الورق. تشير بيانات البروتين إلى عدة أضعاف من التعبير Cry35 تتابعات ترميز 0734© و و 1 نلق من تركيب ثنائي الاتجاه 0/35 Cry34 الجيني العالي عن بروتينات ثنائي الاتجاه. تؤكد تلك الاختصارات أن Zm Ubil مقارنة بتركيب محرّك ل 8 ثنائي الاتجاه في تركيب 00085108718 يعبر عن عدة Zea mays Ubiquitin معزز بشكل غير متوقع lel عند مستويات (AAD 010/34؛ 00/35؛ و (Jia جينات (على سبيل ٠ موحد 201 Ubi ire محولة باستخدام بلازميد ثنائي يحتوي على Zea mays مقارنةً بنباتات مستقل. Zm Ubi] معزز dad gs كل تتابع ترميز تتحرك Cua الاتجاه يحرّك نفس الجينات تركيب معزز dad gs TO 3) الذي يربط نباتات Cry35 و Cry34 يُشتق التعبير الجيني عن تم عرض تحليل العلاقة بين (PDABIO8718) ثنائي الاتجاه Zea mays Ubiquitinl
Zea mays ناتج من أجنة ays معدل TO نبات ذرة ١١ في Cry35 و Cry34 بروتينات Veo في الشكل ؟"ب. ery34-2A-cry35 محولة باستخدام 01008108718 الذي يحتوي على مشترك abi إلى تعبير جيني قوي عن (A = R علاقة عالية جداً (مربع pa د
-م؟- 60-007 بين Cry34 و 35 Cry من مجموعة التعبير الجيني عن جين cry34-2A- 5 المشتق بواسطة معزز 511لا 200 AW الاتجاه. الجدول OY التعبير الجيني عن AADL [Cry35 [Cry34 في ذرة TO نباتات هوية AAD] | sl Cry35| sb Cry34 lll نانو lL I المثال A )0 تكدس التطفير: معززات ثنائية الاتجاه التخليقية (بيانات (T1
ما
q q —_ _ التعبير الجيني عن نباتات 11 المحركة بواسطة تركيبات المعزز Zea mays Ubiquitin] ثنائي الاتجاه: تم اختيار عشر إلى إثنى de حالة نسخة منفردة لكل تركيب للتحليل باستثناء أن التركيب المقارن 01008108716 يكون به Ala واحدة فقط. تم اختبار خمس نباتات/ الحالات لمرحلة V6 وتم اختبار ثلاث نباتات/ الحالات لمراحل 10-12 و/ 43. تم إجراء تجارب © بروتين باستخدام ELISA J LCMS تم عرض التركيبات في ذلك المثال في الشكل 776. تكون ZMUbi) pDABL08706 ثنائي الاتجاه ))٠٠١-( و 0088108707 ZMUbi) ثنائي الاتجاه (-90)) هي تركيبات بمعزز ثنائي اتجاه نموذجي من الاختراع الحالى؛ ZmUbi1-YFP) pDABL01556 مقارن) و ZMUDi1) pDAB108716 بدون أدنى معزز) تعمل في صورة تركيبات مقارنة بمعززات موحدة
٠ الاتجاه. تم عرض نتائج التعبير الجيني النموذجي عن (V6) من أربع تركيبات لبروتين (LCMS) YFP في نانو جرام/ You في الشكل 7؟أ؛ و تم عرض نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من أربع تركيبات ل YFP RNA في الشكل ل١اب. تم عرض نتائج التعبير الجيني النموذجي عن (V6) من أربع تركيبات لبروتين (LCMS) GUS
Vo في نانو جرام/ سم Y في الشكل JYA و ثم عرض نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من أربع تركيبات ل GUS RNA في الشكل 8 اب. تم عرض نتائج التعبير الجيني النموذجي عن (V6) من أربع تركيبات لبروتين (LCMS) AAD] في نانو جرام/ You في الشكل 9؟أ؛ و تم عرض نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من أربع تركيبات ل AAD] RNA في الشكل 4 "ب.
(LCMS) YFP من أربع تركيبات لبروتين (V6) تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ٠ «pDAB108706 ؟أ؛ و القيم المتوسطة ل 08108707م ٠ في الشكل Yau [aha في نانو على التوالي. تم ٠ هي 17./ا 7.17 9.920 و pDABI08716 6ه و في YFP RNA من أربع تركيبات ل (V6) عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية
tive
A
و PDAB101556 pDAB108707 pDAB108706 و القيم المتوسطة ل «Fe الشكل على التوالي. ٠٠١١ دحت و Aly 4.47 هي 6
GUS من أربع تركيبات لبروتين (V6) تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني 0088108706 و القيم المتوسطة ل (YY في الشكل Yau [da sb في (LCMS) ser 57.77 ر 088108716ام هي اكتف «pDAB101556 «pDAB108707 © من أربع (V6) على التوالي. تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية 7.7 088108706 و القيم المتوسطة ل «FY Jal .في GUS RNA 1 تركيبات هي .ىب لخلاب بو .ا pDABIOS716 ر «pDABI01556 7 على التوالي.
AAD] من أربع تركيبات لبروتين (VO) تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني 0088108706 و القيم المتوسطة ل (YY الشكل 3 Yau [da sb في (LCMS)
AOT الكت (VY LAA ر 088108716ام هي «pDAB101556 ,م 7 (V6) على التوالي. تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية ١795.49 و 0A في الشكل 7”ب؛ و القيم المتوسطة ل 0/88108706م؛ AAD] RNA من أربع تركيبات ل و «VAY هي اف ات pDABI08716 و «pDAB101556 088108707م ٠ على التوالي. 7.7 من أربع (VI0) و 77ج توضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن eT (FY الأشكال على التوالي. Yau في نانو جرام/ (LCMS) GUS و بروتين AADL YFP تركيبات ل من أربع (V10) توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني 2 VE و cae (Ire الأشكال على التوالي. تكون Yau في نانو جرام/ (LCMS) و بروتين 01ل «GUS YFP تركيبات ل ٠ pDAB108716 ر «pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706 القيم المتوسطة ل على التوالي. تكون القيم 77.0٠ هي 170لا ل.ل .ةك و (ITE Jal) YFP ل ل pDAB108716 و «pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706 المتوسطة ل على التوالي. تكون القيم ١8.07 داءخاء > و OY (لشكل ؛آب) هي GUS tive
-١ ٠ \ —_ المتوسطة ل pDAB108716 «pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706 ل AAD] (الشكل (zV¢ هي فتكت ند,اأاكم لقملا و ٠٠١١6 على التوالي. الأشكال (Yo 5؟ب؛ و 75ج توضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن (R3) من أربع تركيبات ل «GUS (YFP و بروتين (LCMS) AAD] في نانو Yau faa على التوالي. © الأشكال 97 af و 71ج توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني (R3) من أربع تركيبات ل «GUS YFP و بروتين 801 (LCMS) في sil جرام/ Yau على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل pDAB108716 5 «pDAB101556 «pDAB108707 pDAB108706 YFP (الشكل (fF هي 31.78 4.44 17.اء و 40 على التوالي. تكون _القيم المتوسطة ل 108706طانام «pDAB108707 85101556منام؛ و 85108716منام ل ٠ 65 (الشكل (FT هي 5.87 OY OTA) و 1.360؛ على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل 108706طانام «pDAB108707 85101556منام؛ و 85108716منام ل AAD] (الشكل 71ج( هي فحتمل لل أماد No ge و د YAY. على التوالي. توضح النتائج أن معززات )3 011لا ثنائي الاتجاه وفقاً للاختراع الحالي يمكن أن تحرك تعبير جيني قوي عن 5لا6 و YFP حيث يكون التعبير الجيني عن YFP من معزز 53 UDIL ثنائي Yo الاتجاه مشابهاً لذرة موحدة الاتجاه Ubil المحركة ل YFP تقترح النتائج Lad أن الاستتساخ ثنائي الاتجاه bidirectional transcription لا يكون له تأثير كبير على التعبير الجيني عن (تعبير جيني عن GUS مقارنة بالتركيبات التي تفتقر لأدنى معزز بدون التعبير الجيني عن (YFP JE 4 توليفة من معزز ثنائي الاتجاه وتتابع AY ثنائية السيسترون لتحريك أربع محورات ٠ وراثية من معزز منفرد واحد (بيانات 11) التعبير الجيني عن نباتات 11 المحركة بواسطة تركيبات المعزز 06100111101 Zea mays ثنائي الاتجاه: تم اختيار عشر إلى إثنى de حالة نسخة منفردة لكل تركيب للتحليل باستثناء أن التركيبات المقارنة يكون بها أربع أو خمس حالات لكل تركيب. تم اختبار خمس نباتات/ الحالات tive
-١ ٠ Y-— وتم اختبار ثلاث نباتات/ الحالات لمراحل 10-12/ 5[ 83. تم إجراء تجارب V6 لمرحلة ELISA أو LCMS بروتين باستخدام
ZMUbi1-/ZMUbi1-Cry34) 088105818م «(ZMUbil-YFP) pDAB105748 - ثنائي الاتجاه YFP/AAD-1-ZMUbil) pDAB108717 «(ZMUbil-AAD1/Cry35 ٠
Cry34— ثنائي الاتجاه YFP-ZMUbi1/AAD1) pDAB108718 و «(Cry34-Cry35
Cry34 من بروتين (V6) يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية aly الشكل .(Cry35 088108717 088105818 pDAB105748 من نفس التركيبات الأربعة (LCMS) و 88108718م0م. أ الشكل 7 يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من AAD1 RNA من أربع تركيبات pDAB105818 pDAB105748 0088108717 و .pDAB108718 الشكل LTA يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من بروتين (LOMS) ABDI من نفس التركيبات الأربعة «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748 و .pDAB108718 «pDAB108717 pDAB105818 pDAB105748 ٠ و .pDAB108718 الشكل 1ب يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من بروتين (LEMS) YFP من نفس التركيبات الأربعة «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748 و .pDAB108718 الشكل 180 يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من Cry35 RNA من أربع تركيبات pDAB105818 pDAB105748 0088108717 و 088108718م. الشكل wt. Yo يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية (V6) من بروتين (ELISA) Cry35 من نفس التركيبات الأربعة «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748 و .pDAB108718 «pDAB105818 «pDAB105748 01088108717 و .pDAB108718 دما yrs من أربع Cry34 RNA من (V6) الشكل 7؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني بمتوسط pDAB108718 و 008108717 «pDAB105818 (pDAB105748 تركيبات على التوالي. الشكل 7؛ب يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير YoYo و 7.797 7.47 oo قيم PDAB105748 من نفس التركيبات الأربعة Cry34 من بروتين (V6) الجيني ©47.9¢ 6 088108718م_بمتوسط اقيم pDAB108717 008105818 © و 21.148 على التوالي. ٠١577 من أربع AAD] RNA من (V6) الشكل 7؟أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني بمتوسط pDAB108718 و 008108717 «pDAB105818 (pDAB105748 تركيبات يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير oF و 7.07 على التوالي. الشكل 1.14 OLA 66 قيم PDAB105748 من نفس التركيبات الأربعة AADL من بروتين (V6) الجيني ٠ 777.54 626 ad و 008108718 بمتوسط «pDAB108717 pDAB105818 هل 1لا و 7714.19 على التوالي. من أربع YFP RNA من (V6) الشكل ؛4؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني بمتوسط pDAB108718 و 008108717 «pDAB105818 (pDAB105748 تركيبات على التوالي. الشكل ؛ ؛ ب يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير ٠.90 و 1.28 6 Fed .اقيم 088105748 من نفس التركيبات الأربعة YFP من بروتين (V6) الجيني بمترسط قيم 5734ل متامت pDAB108718 088108717مر «pDAB105818 و 3.04 على التوالي. 84 من أربع Cry35 RNA من (V6) يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني Teo الشكل و 0088108718 بمتوسط 0088108717 «(pDAB105818 (pDAB105748 تركيبات ٠ 4لا.؟؛ و 2.70 على التوالي. الشكل 5 ب يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير OLY 86 قيم PDAB105748 من نفس التركيبات الأربعة Cry35 من بروتين (V6) الجيني (YAY.0f «+ قيم luge pDABL08718 088108717م؛ و pDAB105818 و 0.997 على التوالي. 2707 دما
-١ ٠ ¢— الشكل £7 يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني )٠/6( من PAT RNA من أربع تركيبات 8 هم «pDAB108717 pDAB105818 5 0088108718 _بمتوسط ad تمل خم ف لكا و Yoo على التوالي. الأشكال 7 cat 7 Js ا Xd اد توضح نتائج تعبير جيني عن بروتين نموذجي (V10) من YFP ٠ 1نطظظ 060/34؛ و Cry35 على التوالي من أربع تركيبات 088105748 pDAB105818 8108717م0م و .pDAB108718 الأشكال 8؛أ tA 4؛ج؛ و aA توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني عن بروتين (V10) من «Cry34 (AAD1 (YFP و Cry35 على التوالي من أربع تركيبات «pDAB105818 «pDAB105748 01088108717 و .pDAB108718 ٠ الأشكال 44أء 4؛كب»؛ £9 5x 089 توضح نتائج تعبير جيني عن بروتين نموذجي (R3) من «Cry34 (AADL YFP و Cry35 على التوالي من أربع تركيبات 088105748 pDAB105818 8108717م0م و .pDAB108718 الأشكال On Jo 94ج)و 26د توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني عن بروتين (R3) من Cry34 (AAD1 YFP و Cry35 على التوالي من أربع تركيبات pDAB108717 «pDAB105818 pDAB105748 eo رو .pDAB108718 الشكل )0 يوضح نتائج مثالية لبقعة juaill Western الجيني عن بروتين 5«Cry35 Cry34 AAD] من 008108718 و .pDAB108717 توضح النتائج أن الأربع محورات الوراثية كلها في تركيبات مشتقة من المعزز المنفرد تكون وظيفية بمستويات تعبير جيني جيد. توضح الجينات الثلاثة (AADL [Cry35 [Cry34) في مستويات Yo تعبير جيني قوي يوضح تكدس Ubil ثنائي الاتجاه في صورة مشابهة لمستويات التعبير الجيني المقدمة بواسطة تكدس الجين المشتق من (DEXT) Ubil بالرغم من مناقشة عدد من السمات والتجسيمات النموذجية أعلاه؛ سوف يدرك أولئك المهرة في الفن أنه يمكن إجراء تعديلات؛ وتبديلات؛ وإضافات معينة وتوليفات ثانوية منها. بالتالي يكون من tive
مج \ _ المقرر تفسير عناصر الحماية الملحقة وعناصر الحماية المقدمة في هذه الوثيقة فيما بعد بأنها تتضمن كل تلك التعديلات modifications « والتبديلات permutations « والإضافات والتوليفات الثانوية كما لو كانت ضمن مجالها وفحواها الحقيقي. ملا
Claims (1)
- -١.1- عناصر الحماية.١ عديد نيوكليوتيد تخليقي synthetic polynucleotide يشتمل على: أدنى عنصر معزز لب core promoter element 17171118 من جين Ubiquitin—1 gene «Zea luxurians J Zea mays من gene من جين JB minimal core promoter element i أدنى عنصر معزز هه Ubiquitin-1 من Zea mays أو Zea luxurians حيث يكون عنصري معزز أدنى لب reverse complimentary في اتجاه تكامل عكسي minimal core promoter elements 07 بالنسبة لإحداهم الأخر في عديد النيوكليوتيد .polynucleotide". عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية dua) ٠ تشتمل كل من عناصر معزز أدنى لب minimal core promoter elements على متوالية عديد نيوكليوتيد polynucleotide sequence التي تكون على الأقل 9675 مطابقة لهوية متوالية رقم: ١ أو تكملتها. dua) وفقا لعنصر الحماية synthetic polynucleotide عديد النيوكليوتيد التخليقي WY على متوالية minimal core promoter elements تشتمل كل من عناصر معزز أدنى لب ١ عديد نيوكليوتيد polynucleotide sequence منتقاة من المجموعة التي تشتمل على هويات متوالية أرقام: ١ و31-159.؛. عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية dua) ٠ تشتمل كل من عناصر معزز أدنى لب minimal core promoter elements على هوية متوالية رقم: ١ أو تكملتها. Lo عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية ) يشتمل كذلك على إكسون exon من جين Ubiquitin—1 gene وانترون intron من جين gene.Ubiquitin—-1 Yeo ملال -١7. عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية ١؛ يشتمل كذلك على متوالية تنظيمية في الاتجاه الصاعد Upstream regulatory sequence من جين.Ubiquitin—1 gene WV © عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية 7؛ حيث Jails المتوالية التنظيمية في الاتجاه الصاعد upstream regulatory sequence على هوية متوالية رقم: ؛ أو تكملتها. LA عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية ) يشتمل ٠ كذلك على عنصر element منتقى من المجموعة التي تتكون من متوالية تنظيمية في الاتجاه الصاعد (URS) upstream regulatory sequence عنصر محسن enhancer element إكسون cexon إنترون cintron موقع بداية الاستتساخ «transcription start site صندوق (TATA عنصر اتفاق صدمة cheat shock consensus element 3) all وتوليفات منها. Vo وفقا لعنصر الحماية ) يشتمل synthetic polynucleotide عديد النيوكليوتيد التخليقي .4 محل اهتمام متصلة عملياً بأحد عناصر Nucleotide sequence كذلك على متوالية نيوكليوتيد .minimal core promoter elements معزز أدنى لب.٠١ Yo عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية ٠ يشتمل على هوية متوالية رقم: * أو تكملتها..١ عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية «A يشتمل على هوية متوالية رقم: © أو تكملتها. Yo ملا“VW حمVY عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية ٠ يشتمل على تتضمن متوالية نيوكليوتيد أولى nucleotide sequence 1151 محل الاهتمام متصلة عملياً بأحد عناصر معزز أدنى لب core promoter elements 1010121؛ ويشتمل كذلك على تتضمن متوالية نيوكليوتيد ثانية second nucleotide sequence محل الاهتمام متصلة عملياً © بأدنى عنصر معزز اللب minimal core promoter element لا يكون متصلاً عملياً بمتواليةالنيوكليوتيد الأول first nucleotide sequence محل الاهتمام. VY عديد النيوكليوتيد التخليقي synthetic polynucleotide وفقا لعنصر الحماية © حيث يكون الإكسون €Xon من جين Ubiquitin—1 gene من luxurians J Zea mays 268.ye ملا_ \ ٠ q — y 3 ¥ 3 ْ . ذا=« \ \ — وبال لل i i yd ب بل للممق#('إلتل+”نبي , 1 5" ش شكل Y {iveARR Es x N ; ky v 9 1 3 Y 3 0 0 0 LEE of Hie ا a. fi 2 كل م = ps 2 الله 0 2 ~ ae Wo 3 بت د 2 No اي ha ST ser, * Ay LN > من * اح ها بي ان A اد أن do برا ا ض KE : EN bos PE يت Hi BERR 4 A Pd = 7 : _ > = gay SA > 3 شكل ؛ د ri H 3 To } 1 1 1 1 ~ > " ل bi er CIA 5 3 3 * ب ااا ؛ الل = 3 ب ا RR A 3 ++ FRAY oT RN Ne, NAY 0 ك ام اي ا ا الاح كذ AT ay YE IY : ناد ل« يل“ ال تح اتح $Y Ng ا “es [Ree We RAT 0 الل a oN PANE ERY hd SVN برا 5 Hig PERANG Fala SN SN TY : a 1 م حل X Loam ae % \ > 1 : 6 \ 5 Ta Qo iS a Tr A A 3 -Ye. cst . يم A E Fy, د rE ا ص A - ON Xe & ~~ sR ~ 1x , Lo = ب aR A 1 يحل ER ; § PRN y = t rt iF i لخلا انآ + ل أ a H SN ا Ny اا ا a . om gal geet , bE ood \ nN 1 FO FE : 1 5 ال [I دما“Ayo+ خوية متوالية رقم CTHGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCHTTGGACTTOUTCCGCTGTCGGCATNICAG AAATTGLGTGGUGGAGCGGCAGACHTGAGCCGHUADGGCAGGLGGCUTOUTC OTT CTCACGGCACUGBHECAGETACGOGGGATTCOTTTUCCCACCGCTOETTCGC TTTCCCTICC TOGCCCGCOGTAATAAATAGACACCOCCTCCACACCCTCTا pes م \ &by شكل رقم * حوية متوالية رقم 01 خثاناتان "الخ دم لمكن ناف د ناوا ذخان اانا طاقن ااا ما امنا 0 لتاونل سرد رفكب ] تمان الخ 0ن جات رات اضرا TCTCTACCTICTCTAGATCOLCGITCCHGTCCATOCATGG TT AGHGCCUGGTAGTICTA CTTCTGTTCATGTITGTGI TAGATCCGTETTTG TG TTAGATCCGTGUTGCTAGUGTICGT ACACOGATGUGACCTETACGTCAGACACOTICTGAT TGC AACT 03101111 TTIGGOGAATOCTGGOATGOU TCT AGOCGTTCCGCAGALGOGATCGATTICATGATTITTY TTIGTTICGTTGCATAGGGITTGO TTTGCCCTITTCC TI TAT TTC AA TATATGOCGTGCA CTIGTTIGTCGOGTCATCT TTTCATGO TT TTT ITT GTOTIGGTTGTCATG ATG TGGTCTG GTTGGGOGOTCOTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTOTTTCAAACTACCTGGTGGATTTAT TAATTTTGGATCTGTATHTGTGTGOCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATG GATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGYTGATGCGGGTTTTACTGATGUATA TACAGAGATQUTTITTGTTCGUTTIGGTTOTGATGATGTGE TG TOG TTGOGCGETOGTTC ATTCGTTCTAGATCGOAGTAGAATACTGTITCAAACTACCTGGTOTATITATTAATTTI GOAACTGTATGETOTOTGTCATACATCTICATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAAT ATCGATCTAGGATAGETATACATG I TGATGIGGHT TT TAC THATGUATATACATGATEG GUATATOCAGCATCTATICATATOU TO TAACT TTOAGTALITATCTATTATAATAAACA AGTATGTTITATAATTATTTCGATUTTGATATACTTOGATGATGGUATATECAGUAGET ATATETGEATTITTITAGECCTGCOTICATACGCTATITATTIGLI TOG TACTRTTICTY TIGTCGATGOTCACCCTERTTOTTTIGE GT TACTTOTGUAGشكل رقم ١ بدي-١؟-هوية متوالية رقم * المممهممه اعوج ع معوج ممع ماج مع متفعفته مصدج هه عماج ده مجمع مم عه موه المج مع امع معد عد ممه ماج مممععوأد glactcaagettag ممتمع دلمه أماتماتتويتاك قتدة ممما الماع مع هتمع مه cearallagoigatgostatgoeateatosastalalc gatopatattecatooatetta 0ه ممتماع apcatalgaatagatgol peatatpocatoat glalatgeateagtanaaceeacate aaa agctoptaaciaigaagatgiatgacacacacatacagitceaanattantaantacaccagptagiiteaascaptaftetacioopatciagaace aatgaacgacegoacaacacaceacateatoacaaccaape gaacaaaaapaatcictgtatatgratoagiasaacec goaicaacatgtata colatoctagate gatatifecatecateatoticaaitogtaactatgantatplatgpeacacacalacagatecaanattasiaantceaccag gta مم مجم اتج gral aga ممه مم مه ال سج aca aCe Aa عام اودوع عه عو gate ممع تمع أو مهس توالا لمعت aac saancaaaaaaaatcat gaaste مع نمه مجو مج مه عجطربيع ممسمعي مما ًممع ا تما فاج عاج ع ع ايه سمتلت د10 1-1 ممع امواج مممعه متفقه مات مومع تت بع للج عد مم اتج مود لجع ع نج عقت مع goat 011 21301000001 الا م نج اتلمعممدمه مما عتموع لمعه معد موه مادج وممعج ممع عه لعفا PGC )4 1 ماوع برو موه ونوج مو مع وري لجعي اوري مع اانا اموه عو عمموينت TET TCI GTC TCCGUTOUGAAUAALAL 1001- 710411106000041GAGGTTGGGGAGOTACCAAGAGGHTCTGURAGGGGETOTC TATT TATTACGGUGGOT GAGOAAGGOAANCOAAGTAGTUGETOGOAMSAGOAA TCC GALT TGCCOG IGE GPGAGAGUAGGAGCGAGOGCUGCCTOOCGTGUUGGUTCACGTC TOUCH ICOOCCATTC واه دلخ انان لضان ا الغ AGCAAGTCUAACHGTUOAGLUGG AACTCICHGAGAGO GOGTCCAG8 جم 1شكل رقم FAهوية متوائية رقم ؛ TU TAGAGA TAN TGAGCATIGUATOTCTAAGT 1001200001 واو الك اااي TATAAAAAATTACCACATATTITTTTTIGTCACACTIGTITGAAGTGCAGTTTATCTATUT TTATACATATATITAAACT TT ACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATA لخدا انمه TCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGO TOT GTATTTTGACAACAGGACTOTACAG TT TTATCT TT ITAGTG TGUATGTG 10111TUITCCAAATAGCTICACCTATATAATACTTICATCCA TTI TAT TAGTACATCCATITAG GOTTTAGOGTTAATGGTT 11 TATAGAUTAATTITTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTT TAGCCTCTAAATTAAGAASACTAAAACTCTATTITAGT TTI TITATTTAATAGTTTAGA TATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATT AAAAAAACTAAGGAAACATTITTTCT TG TT TCGAGTAGATAATOCCAGCCTGTTAAALG COGTCGACGAGTCTAACGRACACCAACCAGLGAACCAGCAGOGTCGOGTCGOGGCCAA GUGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGUTGCCT ow A شكل رقمد— \ \ اج هوبة متوالية رقم CTECAGAAGTAACACCAAACAACAGOGTGAGCATCGAC AA مخ نجه تمد ف خم CAAATAAATAGCOTATGAAGOCAGGGCTAAANAAATCCACATATAGCTGCTGCATAT GCCATCATCCAAGTATATCAAGATCGAAATAAT TATAAAACATACTTOTTTATTATAX TAGATAGGTACTCAAGGTTAGAGCATATGAATAGATGCTGUATATGCCATCATG TATA TGCATCAGTAAAACCCACATCAALATETATACCTATCCTAGATCGATATTTCCATCCAT CTTAAACTCGTAACTATCAAGATOTATGACACACACATACAGTICCAAAATTAATAAA TACACCAGGTAGTTTGAAACAGTATICTACTCOGATCTAGAACGAATGAACGACCGCT CAACCACACCACATCATCACAACCAAGCE AACAAAAAGCATCTOTOTATATGCATCAG TAAAACCCGCATCAACATOTATACCTATCCTAGATCGATATT INC ATCCATCATCT TCA ATTCCTAACTATGAATATGTATGGC ACACACATACAGATCCAAAATTAATAAATCCAL CAGGTAGTTIGAAACAGAATTCTACTOCGATCTAGAACGACCOULCAALCAGACCALA.TEATCACAACCAAGACAASAAANAGUATOAAAAGATOACCCHACAAADAAGTHCAL GUCATATATIGAAATAAAGOAAAAQEGCAAATCAAACCCTATECAACGAA AC AAAAA AAATCATCAAATCOATCCCHTUTGCOGAACGOGUT AGAGCCATCLCAGGATTCCCC AAA GAGAAACACTOGUAAGTTAGCAATCAGAACGTOTCTGACGTATAGH CGO ATCOGTAET ACCAACGUTAGCAGCACCOATCTAAIACAAACACGHATC TAA ACAAAT ATG AATAG AAGTAGAALTACCOGGOLCTAACCATGCATOGAICGEAALGOCOATCTAGAGAAGHT ACAGAGGGGOLGOHGGOGOHAGGACGAGOGOCGTACCTTIGAAGUGGAGG TGCCGACH GHIGGATTIGGGHGGAGATC TOOT TGTGTOTH TH TGCOUTUCGAACA ACA AGG 3 GGAGGTACCAAGAGGOTETGG AGOGO CET TC TAT TTATTACGOCOUGCOAGUAAGOS AAAGCGAAGGAGCGUTGGGAAAGGAATCCCCCGTAGCTHCCGHTGCCETGAGAGGA GOAGGAGOUCGCLTOCOQTGUCGGUTCACOTCTOCCGUICOGCCAL GC AATTTOTOGA TGCCGACAGOGUAGUAAUTCCAACGH اموت ميمه لفيا مخفو TCCAGUCG CUGAGTGIGUAGEGTOAUCCOHTCUTGLOCU TU 1 AGAGA TAATGAUCATHRATGT CTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTITTGTCACACTTGITTGAAGTOCAGTITA TCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTAL AATAATATCAGTOTTTTAGAGAATCATATAAATCAACAGTTAGACATGG TUT AAAGGA CAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTC TACAGTTTTATCTTITTAGTG TGC ATGIGTIC TCCTITTITTITGCAAATAGUTTCACCTATATAATACTTICATCCATETTATTAGTACATC CATTTAGGGTTTAGGGTTAATGOT TT TTATAGACTAAT TTTTTTAGTACATOTATTITTAT TOTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTPAGTITTTITTATITAATAG TTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAANTTAAACAAATACCOTITAAG ASATTAAAAAAACTAAGO ARACATTTTICTTGTTTC GACT AGATAATGLCAGCCTGTT AMACGUCGTCOACGAGTCTAACGOACALCAACCAGTGAACCAGCAGCGTCOUG TCO GCCAAGCHEAAMICAGACGECAUGGUATUCTUTETCGUTHCCTEIOGGACCCCTCTCRAGAG TICCOGCTCCACCOTIOEACT TOU TOCGUTOICOGCATCOAQGAAATIGCG TOGCGHART GGCAGACGTCAGCCHGCATGUUAGOUGHUUTCCTCCTCCTCTCACGOCACCOECAGLT ALCOA TT TTC CCACCOU TINCT CGC TT ICCC TOC لمخم لخت AGALACCULUTOCACACCCTE TTIUCCCAACCTCOG TG PRAT HE من ؟) ١ شكل رقم 4 (صفحة دي-١ ١ -1000001-11 تنان ادم الفكريض ااا د الم“خر خخ لاض ذل رماوا أ TAGATCGGCGT ا فى ربترتنبن لعجي نان عع عع وب لوت ال لخر TOCGGICCATGCATEOTTAGGOUUUGGTAGT ITC TACT ICTGTICATGTTIGTGTTAGATCCOTOTTTGTOTTAGATCCOGTGUTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGALTTGTACGTCA GACACOTTICTGATIGUT AAT TOCCOA TG TTTCICTTTGUGOGGAATCOTGGOATGGITUT AGCCGTTICCGCAGACGGGATCGATTITCATGATTEITITIGTI TCG TTGCATAGGGTTIGGTTTGCCOTTTTCC TT TATTTCAATATATGCCOTGCACTIGTTTGTCGGGTEATCTTTICATGETITTTTTTGTCTTGGETTGTGATGATOGTGOTCTGOGTIGGOGOGGTCOTICTAGATCGGAGTAGAATTCTOTTTCAAACTACCTGGTOGATTPATTAATI TIGGATCTGTATGTGTG TGUCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATOGATGOGATGGAAATATCGATCTAGGA TAGGHTATACATGT TGA TOCGBGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGOTT TTR TTEGO TTGGTTGTCATOATGTGE TG TOO TTGGECOGRTCGTTCATTCGTICTAGATCGGAGTAGA ATACTETTTCAAACTACCTGO TE TAT T TAT TAA TIT TGGAACTOTATG IO TETGTCATACATCTTCATFTTACGAGT ITAA TGUHATGHEAAATATCOATCTAGIHATALGTATACA TCTTGATGTGOG TT TTACTGATOUATATACATOATGGCATATGCAGCATCTATICATAT GCTCTAACTT TGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTITTATAATTATITCGATCTTGATATACT PGOATGATGGCATATGCAGCAGC TATA TG ما 111111 تلخ ا CCTTUATACGUTAT TAT TIGOTTGOTACTE IT ICT TT TG TOGA 00]TGHTGTTACTICTGCAGشكل رقم § ( صفحة ¥ من ؟) دما-١١- وية متواليةرقية AGCACTTAAAGATCTTITAGAAGAAAGUAAAGCATTTATTAATACATAACAATOTOCAG GTAGCCCAGCTGAATTACAATACGUCAAUTGCTCATAATAA TTC AAC AAACCCAAGTAG TACACAACATCCAGAAGU AAA TAAAGOCCATACGTACCAAAGCCTACATAAGCAGCA ACACTCACTOCCAGTGCCOGTGOGTUTTTAAAGCALACGGGCCTTIGACCAUGCGATCC ACCTTOAAACAAAUTTOG TAMA AATTAAAGUAAACCAGAAGCACACACALGLUA ATG AACGUTTICTOA TCGUGUGLLCCAAGGCCCHGGOOGGCCAGAACGTACGACGGACALGCA CACGUTGOGACCHGAGCTCTAGGTGATTAAGC TAACTACTCAAAGGTAGGTCTTGU GAD AGTCAACAGUTCTGACAGTTICTTTCAAGGACATGTTGICTOTGTGGTCTGTCACATCT TTGGAAAGTITCACATOOTAAGACATETGATOATACTCTGGAACATGAACTGGALLTC CACCAATOLGGATTGTICATCTGOOGTETGH TC AGC ACTATGAAGTCGIC TT 000 AGTAATCTCATGACAGATOTTIGAADGETGACTTGAGACCHTGOTTIGOCTTGG TC ACC CAGATGTAGAGGCAGTOGOGAGTOGAAUT IGAAUTCCAAGTTCTTICCC AACATATGAC CATUTTTCTTGAAGUUTTGACCATTIGAGTTIGACCCTATTIGTAGACAGACCCATTCTCA AAGGTGACTTC AGU TAGTCTTGAAGTTGUCATCTCOT YC AAAGGF GAT 000] TTGCACATAGCUCATCTOOUATACAGUHACTTIGTAGAAGTCCTTICAACTCTGGACCATAC TTOGCAAAGQCACTOTRCTCCATAGGTOAGAG TGOTGACAAGTUTGCTCCAAGHCACA GUAATCATCACCAGTIOTGCAGATGAACTGTOUATCAACCTTTUCCACTGAGGUATCIC CETAGUOTTIOCCACGTATGCTAAAGETGTGHCCATCAACATECCUTTOUATOTCCAL A AEGTAAGGAATOTTCCCATOAAAGAGAAGTGU TCL خرن توا غود 110101 امت بود اتنا رم دعساي ا امون TE AAC TAA TAU TGC AGAAGTAACACLAAAL AACAGGOTOAGCATCOATAAAAGAAACAGTACCAAGC AAA يك انه امنا لضا GCAGGOUTAAAAAAATCCACATATAGCTGCTOUATATOUUATCATCCAAGTATATCAA GATCOAAATAATTATAAAACATACTTGTTTATTATAATAGATAGGTACTCAAGGTTAG AGCATATGAATAGATGCTOUATATOCCATCATGTATATOCATCAGTAAAACCCACATC AACATGTATACCTATCUTAGATCGATATTICCATUCATCT TAAACTCG TAACTATGAAG ATCTATOACACACATATACAGT ICCAAAATIAATAAATACACCAGUTAGT TIGA AACA GTATTCTACTOCGATCTAGAACGAATOAACGALCOUCCAACCACACCACATCATCACA ACCAAGCGAACAAAAAGCATCTCTOTATATGCATCAGTAAAACCUGC ATCAACATGTA TACCTATCOTAGATCGATATTTCCATCCATCATCTTCAATTOCG TAACTATOAATATGTA TGGCACACACATACAGATCCAAAATTAATAAATCCACCAGGTAGTTITOAAACAGAATT CTACTCCGATCTAGAACGACCOGOUCAACCAGACCACATCATCACAACC AAGATAAKA AAAAGCATGAAAAGATGACCLCGACAAACAAGTGOCACGGCATATATICAAATAAAGTGA.AAMAGGGUAAACCAAACCUTATGCAACGAAACAAAAAAANTCATGAAATOGATCOTGT CTOGUGGAACOQGCTAGAGCCATCCCAGOATICODCAAAGAGAAACACTGRUAAGTTAG CAATCAGAACGTGTETGACETACAGG TCOUATCCOTETACG AACGUTAGEAGU SLOG ATCTAACALAXACACGGATCTAACATAAACATOAACAGAAGTAGAAUTACCOGGULC TAACCATGCATEGAICUGAACGICGATUTAGCAGAAGGTAGAGADGGHGGGGHOGGE GAGGACGAGCGGUATACCTTOAAGOGG AGG TOUIGALGOG TGGATTTGGGGGAGATC TEGTTGTOTETEFTGTGULECTCOGAACAACADGAGOTIGGGG AGGTACCAAGAGORTGT GUAGGGGGTGTCTATT TAT ACGGUGGHUGALGGAAGGOAANAGUGAA 0 AAAGOAATCOCCLG TAGUIGCCOGTOGUMHFTOHAGAGEAGOAGGAGOOUGCCTOUUGTG CCOUCTCALCGTCTCOCOCTUCOUIACGUAATTTCTGHATGCOUGACAGCEGAGCAAGTC CAACGOTOEALGUGOAACTCTCHAGAGGGO TCC AGROGCGH AGTH TGLAGCH THACCT GIFTUGTOCLUCO TU TCTAGAGATAATGAGCATIGUATGTOTAAGT TATAAAAANTTALC ACATATITTTTTTUTCACAUTTUTTIGAAGTGCAG { (صفحة 1 من ؟ Ya شكل رقم ذا- حا TTEATCTATCTITATACATATATITAAACTITACTCTACGAATAATATAATCTATAGTAL TACAATAATATCAFTETTITAGAGAATUATATAAATGAACAGT TAGACATOGTCTAAA GGACAATIOAGTATTITGACAACAOGACTCLACAG TIT TATC TT TTT AG TG TGUATGTG TICTCCTTIITTTTFGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTICATCCATITTATTAGTAC ATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTITTTATAGACTAA TUTTI TTAGT د TATTCTATITTAGCCTCTAAATTAAG AAAACTAAAACTOTATTITAGTTTTITTATITAA TAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAACTGAC TAA AAATTANACAAATACCUTTT AAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTITICTIOTTITCGAGTAGATAATGUCAGOCT GTTARACGLOGTOGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGUGAACCAGCABCGTCHCGT CHOGCCAAGCOAAGCAGACGGCACGOCATCTCTGTCGC TOU خا ال GAGTTCCOOTRCACCHTTOGACTTOUTCCOGOTATOGGUATCCAGAAATTGCO THON AGCGGCAGACGTGAGCCHGCACGGCAGROGGCCTCCTCCTCCTCTCACGHCACCGOT AGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGUTCCTTCGOTTICCCT TCU TOGCCOGCOGTAAT AAATAGACACCOUUTOCACACCCTCTTTOCCCAACCICGTE TTA TICHGAGCOUACAL ACACACAACCAGATUTOLCCCAAATCCACCCOGTCOGCALCTUCGUTIC AAG TACGUD GCTCOTCOTOONCCCCCCOCUUCTCTCTACCT IC TCTAGATCGUCH TICC GG TCC ATS CATGGTTAGGGUUCGGTAGTTUTACTICTGTTCATE TT TG TUT ] )نا مه TTAGATCCHTOCTOCTAGCOQTTICGTACALGCATGCOACCTOTALGTCALACACGTICT GATTIGCTAACTIOCCAGTETITIC TCT TIGEGGAATCCTIRGOGATCGCTCTAGCCHGTICCG CAGACGOGATOGATITCATOATTTITITTTGTTICGTTGCATAGHG TT TCG TIYGOCUT IT TCCTTTATTTCAATATATGCOHEIGCACTTICTTTGTICGGH TCATCTTTTCATGET TET T 010171001101404 31001 101 1000001100110 TAGATCGGAGTAGAATTCT 5111 ادم 01010101000 1 خم الفا 1001001 ففخ فخة0 او رض المتاهضفت 1 | تالكر 1 1 ا الخ TATCUATCTAGOATAGUTATALATG 111000511171 ا فته اذ اننتامغان الغا اعد 11111101 102001100110165 ت04] 00110000001001 00و41 06116 AGATCGGAGTAGANTAGTOTIICAA اي االختذة 11151010101011 الهخا 14 01613411 ناد ا اخ م TTTTACTGATGCATATACATOATGOCATATOCCAGCATCTATICATATCOTCTAACCTTG AGTACCTATCTATTATAATASACAAGTATO TI TTATAATTATITCGATCTTGATATACT TGGATGATGGCATATGUAGCAGCTATATGTGGATT TTT TAGCOCTGCUTTCATACGCT ATTFATTIGCTTGOTACTG TT ICTTTTOTCGATGUICACCCTG ITT TOG TGTTACTTCT GCAGGTACAGTAGTTAGTTOAGOTACAGCGGCCGOAGGOCACCATGGTCCGTUCTGTA GAAACCCCAACCCATAAAATCAAAASACTCOACGHCCTETGHGCA TIC AGTCTGEA TC GCOAAAACTGTGHAATIGATCAGCGTTOGTGGGAAAGCROGT تعد CAATIGCTGTOUCAGGCAG TIT TAACGATCAGTTORCCGA TGCAGATATTCG TANT TAT GOGGGCAACOTCTGOTATCAGCOUGAAGTCTTTATACCGAAAGITIGOOUAGHOCAL COTATCGTOCTGOGTTICGATGCGRTUACTCAT TACGOUCAAAGTGTGHEGTCAATAATL AGGAAGTGATOGAGCATCAGHRCGOUTATACGOCATTTGAAGCUGATGTT د ATGTTATHICCOGGAAARGTGTACGTATCACCGTI TG IG TGA ACAACGEA AL TGAACTG GOAGACTATOUCGCOLGG AATGUTGAT TACUGALGAAAACGOU AMARA AAGCALTC TTACTICCATGATTTCTTTAACTATOCCGGAATCCATCGCAGCOTAA TOU TUTACALCA CGCCOAACACCTGLOTGUACGATATCALUGTGHETGACGCATETCGCGUAAGACTETA ALTACE TCIGTTOACTGOUAGH IEG TGHCCAATGUTOA TO TC AGCO TIGAACTENG TEATGCOGGATCAACAGOTGGTTGCAXCTOUACAAGGCACTAGCGGGACTTTECAAGT GUGTGAATشكل رقم ٠١ (صفحة ؟ من ) طحا-١١- CUGCACCTCTGOUAATCOGHETGAAGGT TATUTCTATGAAUTG فاضا مأرعمنل امعان لفقم د ااا TEATATCTACCCOUTTOGCGTCGGCATCCGHTCAGTOGUAGTGAA GGGCGAACACGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACT TTACTGGO TT TCH TOG TCATG AAGATOCOGACTIGOG TOC AXNAGOATTCUATAACG TOU TOATOOTOC ATGATC ALE CATTAATGOACTGOATTOGOGCCAACTCCTACCOTACCTCGCATTACCCT TACGOTGA AGAGATGCTCCACTOOOUAGATCAACATOGUATCHTGOTOATTGATEAAACTGCTGCT GTCGGOTTTAACCTCTCTITAGGCATIGGTTTCGAAGCGGOCAACAAGUCTAAAGAAL TGTACAGCGAAGAGGCAGTCAACGHGEARACTCAGEAAGCGCACTTACAGOOGATTA AAGAGCTGATAGERIGTGACAAAAACCACCCAAGCOTEGTGATETGOAGTATTGCCA ACGAACCOGATACCCOTOCGUAAGGTGCACGGRAATATTTOGUGCCACTGROGGAAG CAACGLOTARACTCGACCCGACGUETCCOATCACCTOUG TCAA TG TATE TIUTGCGA COCTCACACCGATACCATCAGUGATCICTTTGATETGCTGTGUCTGAACCGTTATTACG GATGGTATEFICCAAAGOGGCOATT IGOAAACGGCAGAGAAGETACTGOAAAAAGAAC TICTOOCCTOLCAGGAGAAACTGCATCAGUUGATTATCATCACCEAATACGOOGTGIEA TACGTTAGCCHGGOUTGCAUTUAATGTACACCGAC ATG TOGOAGTUAAGAGTATTEAGTGT GOATGOCTGGATATGTA TCACCECGTCTTIGATOHOGTCAGCGLCE 101061] AGGTATGHAANTTOGECCOGAT TI TOUGACU TC GCAAGGUATATTIGUGCOTIGGCGH PAA CANGAAAGGGATCTICATTUGCOACCGUARACCG AAGTUGOGUGGCTITIUTGCTGCAA AXACGUTGGACTUOUATGAAC TEOGH TEAAA SACCGUAGCAGGUAGGC AA ACAXTGA GACGTCCGGTAANCCTTTAAACTGAGGGCAUTGAAGTCGCTTGATGIGUT GAA TTGETT GTGATGTTGGTGOEGTATTTTGTTTAAATAAGTAAGCATGGUTGTGATITTATCATATG ATCGATCTTTGLGUTTTTATITAACACATIOTAAARTGTGTATCTATTAATAACTCAAT GTATAAGATGIGTTCATICTICOGTTGCOCATAGATUTGCT TAT TTGACUTGIGATGTITIT GACTCCAAAAACCAAAATCACAACTCAATAAACTCATOCAA TATG TCC ACCTOTTICT TGAAGAGTTCATCTALCATTCCAGTTOOC ATT TATCAGTGTTGCAGCGGCGCTGTGCTT TCTAACATAACAATTGTTACGGCATATATOCAA(Oa © (صفحة ٠١ شكل رقم {ive“AY. — NN : 1 8 i I ْ 8 x X 8 1 : YN N ¥ § . wi 8 N 8 N 8 H 8 N § اي 8 خ NR} 1 8 لي © BB يي ¥ NN 1 i X ؟ § 3 ¥ Ni XR 1 = i nN Ne : Ya, a \ 0 : 0 3 . 3 : x 3 0 3 werent ٠ WW 8 NN aN 4 8 الخ MW زم 8 N N N 2 الم BEY AE REE 3 N NN aN RNR Nd RN NA i 8] NN 8 88 3 ج88 اللخ 8 H 8 8 N 8 8 ME 8 8 i SOUT TU: SONU. SUUURE SONU. AUN == SE So So SO 8 * 8 8 88 N NN a3 8 FER SE : NE SE BE BB {RB BB 8 FY « EE § B B HOR AR 1 NN 8 Nu SIE BE B OB a BY AN OE 1 N ONE OBE OB OB SN 1+. IY إٍْ لذن 1 نا اذ ME NE حنج © §B FB BN AR OB 1>. OR, BY OB BNE OB 8 NEN i 53 المحم EW 2 2 م ا ل a 8 H 8 الخ A 8 خخ ا BN RR = SR 3 , COENEN BNL BN OBN BB NEE 0 ... NNN 1 1 rg 0 a o> pea Nd rd i rs iS pe ~ SF 3 : & & & oF م oF م A oF سي 5 oF oF > & I A الى اي أي CL CG 1 HEC: ب ان الي #ى ا ئى آي مم له i شكل رقم ٠١ N ! : n = 1 0 : Yas 8 1 "XR | n = 1 i ا ا Poe 3 0 E } EERE ; | إٍْ 8 ROR N ءا AN I \ \ إ 3 : 8 XS Y N 88 8 : 3 ْ: ا 8 ¥ ِ: eed ل ا : 3 RB § ءا ال ال NOR RR ل 1 N 3 8 N 1 8 8 8 8 : A a N N N 8 8 : : a NY Nd 8 8 8 0 8 1 إٍْ ل ا 8 3 ل RB ل ,د a 8 8 N N 1 aN 1 1 ا 1 ا ا ا Fb SS ا ا ا ٍ]BR. ٍْ نحن OER § اننا نا FE FR BL BE. 1 لد ال»»دة BBB. عا ا CR BY Be BLURS وك : إٍْ ِ > ان نب 8" > oF ra SF BS > CS 8 JE oF ل > ٍْ ol 1 ال ACI Ww = اا ال + od i : 1 الى الى لخن الى الى ا ني لكين الى الى الى إٍْ أن امن كن لخن ان أ ام ا FF 8 1 ا ا حي اتا أ خم الل ايب شكل رقم VY ¥ tive-١١١- لبت 1 ا أ ا ا ا دا اا ا اس ؛ ؟ 1 1 را ا As te 1 a @ 3 1 ¥ ; ERS ASS i ’ Ti Ay ا AR NY شكل بج اللي ١ Vo. تسبي يا VEY PIES £1 N Ag ٠ LR ~ 1 1 سس سم للمسهام i | ل ال“ ' ْ ١ Y Rhy op aw : ١ PAAR TL شكل كاب دي-\YY-—- Bb » +H \ I 4 ro. __ eal Ee + بوسر سه a رتح 7 7 ااا اسن إسيهر د ا را دأ—\YY- 4 3 0 YA Se i ب ب ا 0 اد ب رحبا 1 ا ag تن 7 اي od Ia CH TTR i بن اا : 1 i 1 § 1 ا 7 ~ 7 الي لجا مهل do = 5 نال باTIN. 9 A Pie Ya % \ «a ER SITs ١ rE بد ب 8 يبا AS 1 0 [ 3 * ب 1 0 ِ د ne » كا 4 0 إلا JES EE وا لين > Forges om 0 2 N v و Yo شكل همات i : 5 ع ال ¥ \ 0 2 5 Ned هنا F K Mi 7 f Na ا RL 8 - ميل ~ جر ب ا 0" اح يلعا نّْ 0 اا is ١ ا Y 8“ FRE 3 FH AN “ Nu. . sd EE SE i 5 + “a pH key جب in 8 ٍٍ > Y Les ee eb 5 مإ ea Yh \ IG Ta ب بل 8 mM Was hd “8 ال آي سني +1 3 ب Wd : وين اي a TIE Pe Te 0 ١1 شكل 1 0 دما— \ \ اج to 8 [I i ST JERR TEE 2 ~ GE Ngo & 2 A h Fan La Be A 3 E we. ب" اللي 0000 د مومس 1 of AD 3> 1 ٍٍ 0 v oe INN - 1 0 2 "7 A > ا الموج جح 0 2 ا ا NL اشيج 5 Y الا ص 0 ا 8 yd EY & 1 2 8 oo . R Yio ot rs IE - A oR 3 ال 8 0 + ب ل Tag 7 6... ب الست ااانا "".. BRS 7 RN : TR 8 Fa Ty SE § «> 0 HE \ 3 YA 3 7 ب ْ LY HE VY شكل tive a 0 ب 0 ages drag” LA ¥ Ne 7 اااي 5 اج - en 1 ل“ * - ب hs ti ام. 3 ااا 1 1 i : a 0 ky 4 Vi % iN { 3, NF JN No Ei ST ~ Eh ag or<<. الا دخ ححا 2 ن 0 حا VA AN H 5 A TY YY 1 وي ie YT & ا مم الل ا # ا Aa - : © 2 Ah 1 We ve 3 aN . ¥ RA AN ed ا rl و 3 Ta A 8 > YA S83 دماERS Vode x Fi xy EON WE ب 3 eg ل pe الها ا iY = ل اا م 1 3 و جع ب > > + by i ل : BR nde ]3 . + i Tree z 3 ال eee Ae ل : © 5 كل اليا a vo “Na حا R a Ty fo A $ ا 5 ~ = oo RN ين 0 ب "4 > hk} > a 7 Slane E NN ٠ Ei Yvon مد اح /ً ذا ححا Ta YS AL Loa H ب ٠١ شكل tive nag eb 0 ا A Na Si Xe 1 3 Ev 8 1 ; oe Fd > َ ! اي اياج "ool 1 2 a Le na 0 ب 0 xr 8 ا أ اه ge ® 0 »مع اانا ب 4 A Seman, WEIL = AA hid TY ل — ب 0 : i e ww bY ae AR RY % 4 iY i % 1 ل ؟ CAN ن « ا اي EN ع : الاح : فى 7 كلا i ET \ A Te on Ye as tiveتي د 8 = al . be 8 7< مني + ا »> ae لت i ka Ys ال ل و 3 ee 0 1 § 1 4 a 3 2 "م 8 ra 1: ا - ا LS حال الى IB a 6 Wit 0 wo 5 . FAIRS 7 : لح 2 bt { TUN eyاذ . FERRE Vos vos 8 oy TA Dw EA vo Ni RR “a Sage الج ب x. oF 0 / - ا ٍِ ا لا ب yo 1 % 4 Ee 8 yy = Toe 7 ل" A oF خا NN ً كل من .اا ا نينا TR ا ال نر 0 2 ? “1# .7 3 اجا ب ب ION, ااا = دا ل“ 2ح ; Yr * \ \ \ 5 8 Vy N IS 0 FRY 5 bt + \ AES yrs شكل ١؟ دما١م للح و وال ea بت ب ا A = Yo ب Yow oT = 2 + 3 Yer ب Yee Ton Bo, Eis Ean Ta ¥ LAY B د د مريع sla 2] Fy CARY YRS أ اي .آلا 1 8 1 3 aed PE 1 5 1 ad - 1 EAR ب 1 1 ~ 1 : is 3 1 oo 1 ب اا : Yoo ب i 1 A : Yad FR i 1 ا 1 3 oe : Po 1 Bt aan teas te Steer] Poe Yaa Yea¥L at, 2a Nen YW, v 1 لمجم Roope يموق & + CARY مريع م مجاور ١ 1 ع اضرع دما3 AEB FEA EE mT Bo TL BL nnd Bf RATTFRCONAOE SERTNTATOLY اا مقا لتر الت لا الم تت لاوا GROUCOENRTR ER واج ارج وا TA TY STR ROTATING eR TOTTI LIOTTA RII RR ATION NTR لووك راف اج اير * STTTHASATT SS3AJENTIE CAATITEGHRIAT الاق مواد AXTTIGITIT مسح تدج دسا . a اح اراح بع زر جاه NRT الح ان جو اجا لحني ماحد واس لحرت لاد ل ا دج لجا ANT اا لح جد ب 11 الامو د جوتو عيماجم عدن ممع هته CHATTRASAS وجوت ود YAY ادا ا ا ATUEEGTTNY اا ان TR AARCEASIUDT FRR ISTE ssa sAasy 2 مهاج ا تمي لعجي زج ال جيه لمجا وين ريجات يجيي اجو ااي اجا خا TI Ry TR. لمعا لاجر اجا تجو CT RTO المج مدي x bd 3 تساكة اناا GTTTHTEILR ASAE THRETARTTOR UTAUSETAGT SCRTORATHY : الي الج تي را رديه الح ير جام لج الجر حا ال الج لاي ااي اليا NTI A مسد ال ا اتوي اح لاضن قر لام بجع URHRITADNY يق ارا ورا وبق لا اباد الا اا اماي لبا لمر الي واج اح ددجيو احرج ميا ا NTS ليوات اللي ميات دوت اراح GOUT ل جو مض ات لوس د المج لي سيو اي حوس زا لدميين عي اولتقت االر ام عات ام طعا الأتمداالرااناحتقة الا REINITTAAR رقت دم قتااواة اوضا الا باقر اي اه براه نيه و اداه لاه لامي ليج جايح RN حي ايا يه دياه ا رد عي ابه ليه يجيه et لط AY الحم apd $Y PRIS IRR WEE Wa x واي و ETE.STAC LTERAD RTECS EINGT SUTRA TTA ERROR Du اب وري اح لمتكم لاه تالالد دام مالالا ANNIE NGT Re iIA Ny ABT لمتكم اله anal ااي يجيد Ne Tl Sa ET اي RS XE NTE را 8 NE a وام بي ST ب ور ابه ae YIN اه SA تو عي بام باح اه a a ae ليرا ال ان لح م لقت 3 EER owl CER TI ENTE ONIN EATER الاي اح Tenor Eat NE SATIN لمن ST ETT ال ate rR مدر AY CRETARTHEATT وسح ا بق اماق لمق معت ا ات الم يع الوق العم اع ايا لاي لم بيجا يالا ايج يه A في St في لاد NE Se عي ياه مره بيه 3 NAS ب لعي باه فر ااي عه ادرو فيا رجاه م ولاه عي هام يه ايا مه ناه NE مر ميا فرع دي ل 3 OTTER wl PR RRR TROT RRA ARR, CRIT RTL العم د ماج داه Re ل RS A tol 3 ١ تمض لوست سكعي لوا ال ار الما اقم ارا لتقت لاص ما متحي ليلا أ اي يي لها ايه لاجر متها با اي لخدي تاماه كرجه هر يلاك مايه اال بار ول اماو ايك أ مايا دييكا ملح اك وكا رح يا ري بقار كناك لجيه ايج ايه اماه لمر اميه ا دوا ادح ا اا ال WAN Wa اضرع TON جين ا A تاي جور اجو أ TI الاح بتاورو حي اه TD BEIT ARS ATER A TT RE Re RIED a i خوج اتا تن UQANGRAATY UROOTOSASR JRARCTTERAT ARAATCIALE مس المحم ل ص YS Ss hr RR ae Fa vi LSA he A Se NERA ee لعجا ال الحا مات Th اح اح ال واد 3 A اج ان اا ل ATR لا اي IRR ادي لي الجا رح الجاع عد م ا حي ا ل ا ال اتات لات الكت بكست د القن ماقا CElErelind, لشم اس لجنا رضنا اح لح ا ل ل A حا ا RN A حا ا ا ا د SR SA حا اح RSA ا A اج ا ما HO ما avd جمت ١ك WIE wi xX \ TR OY EL fT TY EE cE CVI RT, ا Oe A TE ATTY را ا ل I ال hv ant a ل EL ¥ * اممو متي ممح ماع الس تق ااا CTUTCARART TROEUTUTTRY ممع جيم ع افر بم اه نيا و ياي بي ا رحا Ne ل ل مع ا وا قي جا في رياه مه تراه نيا ا بابو لاه HT Ted ا« TER عم DEA الم ا ال اجا اللا الاح Lm 2 WER WL FRATTE OWE IWATE مسد SLIT ل LIT NA NE TIAN ا SANT, IMRT VAT YR AY ا IR MRD VAN AINA الما الا تيه ASOT GUNNING للم ع ل اتا ل ل ل RT د Re د د ا ee Ka NR ا a ا الجموي جا لد 0 Sav الم وا ا TRAYFD {with ممح TIEN اضرو جو RR RT ACN TORT VRE RRA INNA IR NORTON, RTT RON يود اجون ER ey NEY ماما اساي رالا TRAREATATAT كت كان نض امت ااال تعض ان حت مضت ARS Te ترجاه RSE براي تيح او اه الا ايج Ne TY ne eT Fre Pa Ses eo ae he re ne ae رحا واه A ركه لل را مراك a ادام ايها واه ذا مح TIRE 2 لطا حو عم 0 تع مع ال اط ات مطظ intron) EER SOTTO يت و الا م سات حور RITA SARITA ا تت يا TL ROTORT تباصا م مضه لصا الست م حدق لزنام قت الج ا صو جم ا ا جاه قا رجه وا ااه ما اا وأ يا لاي جاه ار ا برجا لكي ب 7 حاط ا EN A واه ae SS Se إلا يه رهام ل يها A ليوا جل وا a Se جل عي Nr a بح واه PIER ييا Fart دجوا الكال الممحة كتوم 3 مسحي > كر لي الا را ل ا CANA ال ا را SN الا اي a SAAR ال رات ل 5 x RURTATOTDN الا لاسا لنت ا ااا الس لاقي DUPCOTICASE.PETAGABICR يداي جاه اا لي له اماه ايا ره A الاين يهل Sr ماع ييه A SA A تايا A جيه ايا يا ا وار دجي ير جيه لاوا Be A بجا TI لحي حلا اي يي الاير المموعةة a FRIVETE WE OWI مح SATE ES A CTY NSO تجا ONE SR ITI NO SN مويو NE YR OA SOIR WINER ST RT مت جا لماح تت التاق ماما الام د تمستا الامو تتم ال تتا خخ ولا ل ee A لح اح ل Rr Fe سح د Ne A الح اد ووو ال العا وا الاي اللممموميدة مت § ا BRAVES ©F متاح اندج + AY جات اللا ل a لاسا i دحت الكو ري الوا را تلب وي ديات اموت لمي لمتحي وري اند لوالاو تن مور TOR IER Cie ادج يج تاف تان ا اليا اتات ااا ليعش اااي الماع الم فالتا ند ا ل د ا ل AN ا الحا ا ا RN نه NAN Re NT الح تحن ناد ا NASER الي Jada الج ل جام 8 FRITER عمجو معدا اا ARES] DETTE الج TREN R RTT ITT BN ET ا يجيو روي الاي ايب يروي ا RT RT ااي لجيج لج عا لاض ا ال ماياو وا وان لاماي ارت لاما اا ملاعم لماك لالم ما SETIFIS امه واب وا تماد املكو اماج اماي Sr a eR Nee حت اح ا د ا ا ا Sin اح ا ا الت اللا اا Sand eh Sew ال مح كد تح متت CRT اب STII ايه TUSTIN RTI م ATO ضع وج لواب Et RE IN ET RT عاض العا ضر ال ب لماوعل eee YAY لمعم وا محفت موا شعت اناد التق وم الوا لتحت اتا AUTEN ا ل NR ا ل ا ا NATED wl ل ل لماعم جد WF ممع حو عدج bd كم 3 شك ) رقميي رجن اك جو الجا EN اموا ربوج اج St SANE حر اح NS NSN et Sy اد مي وح حي الا الات A \ BOVIS REND SUN USTROALGRY ا حار ا ا ده لد ما اك لحل لوج Rela aR AS الما وح الاق د الي يي ¥ bi NT فيل يها عي واه ايه نبا Tn We eS SNe Se ةيا عا اماي لاه NS er Pa SL هيارم احا ie ااا AE يميه جاه ار ليا موا يم يح نا ال اي تاي لاجراي لماعم SREYED EEE AR IR a angen معدي FREYEPD wd ASTRA TALID اماد حا لجرو يداوو الود اضرو باورا مج بو اج حي TOASTS انو مر اي يا xe SO ATTAGASA ARTTATASRTY لالجا يديد جديتك ا تخدة راض تتا مخضا امسا ةلالا ٍ اي ا يا حي ا Ae Re ييه A ES جاه اهاوه ا يرا به Re ب اها رجاه SS Sh A لجار ل ال اما لاي لا ie لجال ره يكاج مايه ل ا ل اما TIE aw ا اي اسمخ تكد كب تيتا ee re مره لمجاام بج ir لكاو بي Ne 1 in فيه لاي ميا مي يم مال ل ا مااي لام انح ايه ااا Somme rR Sr Pa Ha ابه الح يداد DFT A wm ES SE SSCS SION حرا SX AY FEAR Sed اه و طاح جضت م الا لاحل اي الج احا يج الاح الاك اج ا ايض ا ايع ال ايع اضرا ا رج ا روا TEAR ااه ما اح الح مون اج تاج SAE لل ميد ما الاي هاعر ارات رارح الاناستة الاق اجن AUTATAGASA عصرم كراد راي يا TEASATATRD a Re ae Fe ee RY a a ل wl Gelrh otras ال ممح عد PRITEFP v3 {with AS A Se ee Se ا i eA Ye ATA Te Sr A he ee ا Ne A م St eA NT A eh UM TT Aga aes or SW~LEL andron IX sd ATOR T TE TL LT ATR اج او ATR الوم MR لا معي عدا لمجي RT اط يسا لدي NLD ا NEE TAAL TATETATATR ات لتحم كما لمات لحم لمجم توج التقممي لأسو امت تفص تتا نا جاه م SR يام مي به ماه الك يرط بيدأو ل وا بهاو ae وليه aa, ار ياه برح a SAS وام با ماكر وام وام ل خاي ااي A كير يه لكا مايا ae بالا لحا مضي الواحم لهالل wat San لامها WEY ل الل بجممعجة تعودم SHAVED wi ا ل A ا د ل he سح لح اح ل اح ا ل RE Se Sy احا An RMA WS ا وس IT TS RAT NI A RT جمد الح اعت RAT ITE AUR ROSATI ST RNIN ال م اجو ام SEEN د ل ل ALOE SRA ا ال a يد الل ا ماع تدا د ا تع المت ا د ا ا لضا NS يد د حت ضاي اد الاي ضاي ا اي ا ا كاد د ات 0 NR كا كان ا حا حي ند د ا ا NNN DRIVER vd {with intron} ارح اا SA SAY SAA NT ترايت ايت ديه لجا لجيه ايه عم مممعجة STEEL Yay a OR NY TE Se a i راي اج Nt RR اوماد AT ENN CAN SIA اومن to NRA TIN SR ON TOA EI NR BE ا ATASCOTRAS الو ال ل اللا ات التق لاما اانا القت عع اا v oN حي د دن اا ا ان NS ا د ا ا IN اه م ا اا كاد قا اد كيد ما لاد اد NINE fed An Hw temas) للحي لجعي مج ممع وي PRATER v8 {wily Te TN Va SO ay لمر لماعي اسح eC ER a NCP TO Th ha ee AAT A ا للحي oy TON IY RR Ys ERY حا شن م ادي ل دن كا الكت سا نت كدي ال تا ات لا ا h iY hi اح ا جا د مد م اد د د د ل ل > pan i a ne ا د NAH NSN A a A SN ل Tod WED ar Tent AE % aw mie mia اح YAK TRAY a WiLL A A t i IE rT الاح دراج لسو LONE By OVE RTE, SN BUR الجاع جام توج جف ER BC ECT THRIGRETUAA الجا تياد ارقم اد انح الت ارات الست الا ات دانسا تاليا TROABERCDT ا Se Ye NS Sa ل A AL “in WR جا ع جا Ri AR a يا A a RR بوره AR ياه اه جه AA TN A يله ne a mR SRNL ow fag snap ل اع ا ل اح جح حم يعم A SUR er ل ل ل AVS TR Ta ES Art ل ب اي امد ار ا ا را بي الا الما ل ل و ا الور م جه با تي الات ا ا ا ا الما الي لايم BEOGRAD AGREEMENT مستت با ١ + Y FTATCTREAD ا ل ل i ا ا د ا Ee ل ا RE ل د RS ا ل Ee ah] اضرا ENS a BR WE IR SNR ATEN RONAN Ha SONS RIT A ROIS BR MONS ON INES TOR TA الدج احج تتام اج RAI A اح ل ودج جود ARSTURANTY موجمج م جب مودي TACTUTTICY ود ات نا لجرا ا ويه ياد وا لخدام TALS يله ا SR A ايه و ايا م يا ليد ياي ل ره A ويه لايد جا ودار AYA A ليا اك اياك جيه A ري ايه ريا AS IR يايد يها رتت ياج A AY AE اماه كني A كي REDD WE dm لكي ارد راي لاا اي ركم لاد لاا اتا الا الاير ولتت الضف عدم بقارن اللا XY ASN لدت حت Ae حك AE دا a لح لح لح SER تت ات ل ات حا د ل د ا د د ل ا ب an 2 Bed me تمك ARTI v3 {mo TY RS TRC Sr Sn Be NR ا اع ا و ادي Ae اللا ايه ا ار IVA BR ل اد TT اريت الاح الي N AER HIARARTERS TUANASNRA ال د ل كان EE RAY AUCAGTERRNT TRATTIANAT BRAGRUITTY TR TN A Ra NA TNS A Ti fm TR A a ل SS YR ا د te Se Se Ra ل HR men A BARI WI inl RRR) RN EINES MONO 3 FUE لماجي PNA NNN TON ON MAR MXN لجيج جرح جع رحد الح لب جرح حا ادي J وديم اموه لدي مجه ديع STUDUIUDTST CAUNASUSTS مموجوج | لمحا YA ل ل ماي Added WE fm شكل رف *؟ رقم ّممست SUTARAGHER AUDTGRAIRIA COHTHTHI0ASE ADR الات ارا الأو لقتال سا فش Yi اح حا د ا ل ا ند د اد د ل ل د ا eR ل ا ل ب Te oe امج لاا ا IRS SRO اانا Foie TT NN RIT وا IAT SRT جو وض COTTON TTL TE EUR OE RT. نجام لوجع ادن ا يع ا TT ا الاج تخ ار الاب اام قات الات اراي TERRIERS امام ا ار Xho STTERAGOT DUGRTEETERY A وي SA لد ري لياوع لوا ARS حيار يلا اتا SA A A SA ل ول اتاد بلا حي يلاجر ايا بايا AA A A ياي ا وا A AC يل اج Aah AY يجا ياه وله تيار ويه NA ON 3 orm Sema saan Agatl WR IWR RT) TOTO RINE ERO RAN YY ROTI ANY ROY R COR ريت اليه د ات مات لحل لت الل د لم اا ATCT الاو اف انق الي ارق ال اا ال تي لمق ارات لاطعا Yay بحل كالسا احا ا الجا لداجي واد اج لضن ل حي ل اي أجل اا رح اج الا ااا احا اح اد حم ا حي سحي الس ااا ساح لاد حي رادي دا اتات لاح اده لحت اخ ال ER ا ا اا ا ب بم {gd دب مهمع مج اشر المت ما ادا نات سا ايا وتاي لازا بثك ارما لفت الما الاش لساري 771 ا nl باج بر يواه ليا يام ا ليا وها كاي بام يد باجا با لاه بي تي ب ما Fa ب بي ST اما بل لاا أ اجا ا اج بيدا لي بحاو بي ايا تيه لجيه اااي لا A جا له لعا ايه RET any Toe, anne) Wns sna تابخ Sassi SI Re حم عي A TR NOR A لتو صا Wd المج لي و مرا لع ع دحي مص اج xX AR INTACT Y A \ EE 2 TE A EE SE TE a ا A اريك AL ار ايام ASA MAS رياه CA Se A A Se Aus A PS Va A يجا be ايا ريه CAIN Se NA A SA Se A ACA Meh Sa A eh جمدي مو AED-D WE EASE WNT SY SATIN On et ATO مج ART CATR EI SINT TET RR RIN حي ل ا SES ل ا GUAATETSIY لاق ماب وي لصوام نرت اس مد تور سم "متمق Yi يام وي ايا واي لا و ايه با A يجيه ايه جا اي AsV es ل ديا SR SR الاي براي حيار يلا ادي لجيه أي اريك اي ييه ا VA بد ينا يا تحبا رلا A SA RS A SS AS ريا ل م ey حراج لاا اج ا ا SE د اجا الا اس Ee ine جد دج MIND ANNES ند مجع SURI ITER ATE A UTILITY, A ا جو TUNING SONATE A ا بر اساي SETTING OOASRAALST AGATEROTTS STRASTATES ARGUIRTUNA في WN Ne NN A NS Ve AH NS AS AY AS A Fe ese A A AR 94 A SN re SX ae A a A A SA a يدي RAEL-L wd dw عأ وى اي SYN A WS حوري لماع لمجا SY SINS لمي ند BN RANE NY OTE NN الاي الاج VTA SNR ARES سك لحك ل A ال ل ل كد BT ا ا A اح حت ل ا SA د ا AE AAR SA i ل ا WE fo الس : > TNT IL ot Nr NN CRATES Bihar RN نر لاني اي ات ENTE TINT CYT rN STATED ND er & جيم امعد لسلست مد الج ا ةقحالتم لأسي لاما ابمهقة 3 01 Ye SA A ل ل AAR Re ل SR لد ل لح ل ل ل حجن لج اوم ا 2 8 بجوي جد SADIE اليف A و ينور SR اوحض TR TE NN د خم ماس حي DARN IN NY لماو NT ATTITUDE ا م وا ا ا لرجم م دة معد #لجوو تود تست عق امت ود زاتما الاي متمد قات 3 Yo A ا rN RRR لدو يح انمو جنيو البق كه لور الدج يي الجا جم الوصو RI RINT الو حا حب يج يا لجو لوجتي ا احج ريد جع رمات الات اااي اج ماتيا ررمي رم اضر الما A الات تيك نكاما انار NEY I ARS A ل eA A No A A Kn A SA A A AN ur A SN Ave Re A A A re rn الا ادج ا اا Taw] يا مم تقض تست ND كايح ا ا IRN REN رحج حك اح الم احا NEN يح ضحت ا SR ERE اهرت لحي الل اح RPT REN ا اج TNE اويح تح ييا المت ا ليق معدت مج امم عق تاد متمق لمجم محف 7 ات و يا اي LAER eS 8 A PEA a Tatil] Tate wd vo ولد دكت Sulina N= 2 0 LD LEE TON SORT UII aera mM ATA MR nee عب ماج TN DANE م حا ان AEN BUTT NR و SRALSCATENTT STTTESTTATA ATHCATAREST المج لتم تضم YY TOURACSTATRE TOASSETOLNE Ne د SN ST ا ا ا ما كا فا SS ااي الا ا م ا ا ا ايد د SN NN a NPR YN Pe INS wn ال ا ل جل تم تمت اتيت اد ا لاا الا ا الا ماري التي لاشيم وام اوس م الام لماو RUTURASEDT ذا RE A لوا NN 2 ER ااه ااه نح ار جا عي بجا يي A اله جيه با ياه الا اموه ا جا لا جا ARR KTR يا ليا ياي لاه تاي لاا يا ل يد د UY Tid aes wd . X And ARENT GES RE Sr Se] A Ny SNe ا TNE EN MEANT ht NN NAN ا A ON INN لج Ba SAIN RN ENS NN MANTEL TEN MTOEATATIY QCATOIETOT FARR ITIETA جرم اا ا ود امام ال لمع الاسام سد A د ا A امات لما د ا Ne ا اما اد ات ات د د اي ا لدت د ا NR Ne ا ل ل د الا لب ا YE salina d dnyren va لم يرت A احاح ا صرت الماح اح ااي ا لاع ات NAST 2 لتحم حي الا مس لح ا الض TIARA احص كم لاتحي ا ETD اح ا اتج جر اماد مت ابجع تقض مجم لضع AOTRTEAAGA TOTETGACRD er Te ae SN PS A Se ea ا Ln SALE SR SR, AT ع AWRY AWNTAGN SR INE NE الت لسكا راج TITRA وياد OTR BEY الج رج SIND الجر الجر الج Tt ال دانم لسن لم لمات اا الى الس كم ATUTRGARCES اود لا اللاي حمسا Yas SAAN Ta A aT A a ل ل د AAS AS ل ل د ASA To A TNS ا Sd ات ع ا ب wa تلد ARERR L yy 3 ig ES &وما الا يج م اك العم اي دي مح اي لدي مما حي كوج د ا وج اح حا لت ني ا حا ل ما اح ٠ THYADEIATD AGTAARADUD SIATUARIARY الأ ممم TORTARUIAS SUCRADARNNAS 4 اك ب TE RR SR Sa SR Sa Se ee ل وه SS A ب جه تجاه لاه ا يه اديه ايه TR انيه ل NAAN IR د ay يك 0 SAE TL كا لحت تيناد SWEDAL 73 متي بجيال TAT الوح ودج جود اتوي جاده مدن وى اندو قي وب و TITTTACATD دلجي ان حجار جايو اليه لبي جين جني مجاه ne اي المت الا ايت لا اس اند ال م ا الا ال م سد الا ل ا ا حي ءاج جه عا ااا جا ا اا جا ياه قي اديه ع وماج بيه ايم ع تيا نيار EE wel المح A Tanti dL Tse wa تكد TYAY SMU yd XA Tt Be A NT لمحو جا SR RA RTO AN, IIR A TAY Ra الام ا مات ا TEIN TRY ! A ME IRIN IR لال لاما تالالا SA a Se A AS ASE, ae he TAN A Se A A د a Se hee SR SAN A a Pe A A SA Ae Ea YN ean re TE | ARNIS WE المت اا vig م خط مرح خا اهما راضخ ةا اتنا تطعا اانا لمانا اباد الجا COVA ILI RRR + م AR ماه وي ee بج م ع مي الجا ياه ماج اما ا دكا SA a Nu يلم ماه a ديح توا قي مايرا بحام احا إل اي ياه مي د وتيت SANE اه اتوم بح الج ااا ماه الوا مي I ا جوم ةا © لمتحت خاي اس الا د ا اب اجن واب SN ا اناجيت اجا لصا وين SIR NITRA OTT ORIN TAT ٠ لاض وج جه مداو مضي Xd LOTTE IR RAD ¥oa 3 J RE I EE SHEE A RA TE EE I FRE SER ا يا ام A A Aen ae re A A و روا وا واه واه جا أيهم له لهام ينا A واه جا واوا تار Sh A SAY 5 ur وه اهام واه Aa RL AY Se Se Ne A A Tan weer ed د Genii AWD SL RTE Ta VR RCN RE BY SEIT EY INRA RA RS ARERR BT BINA ENT AN YN RS BT الم ا ا RUDE ا مر التق لحت اع المع لكي ل ادي ل لضفت تفع er By ٍ ara SPARE Ne eS nN Fin RAN eR 1 eae Ne ene a RE ا اا MAL NS ا TN NER اا ا لالم ع 0 RR I ام ie كلد الخد متا Se ل ل RvR ONT NAR IT RE ل و ل RA NAAN NR يا الا ا NRTA ادي اي الام تدس الوق ادب لا لقف مدت TENE التاق عات اه SETHE يد با وي ري بكتري وا ب ااي A a أ يجا ل 1 ميد REAR] NN YW atone: ard ل SMUIMLL ARITA WE RE Ny Are NI Bn AD ب نكري $A ANN SE DV SERA AURIMANIAD سالاد الست لاسن ما الود الما اما اراد المي اماي TEA FIUDESIETA اح حا اح د ا ا ل ل SU ا ا ل ا ا ا لح ل ل ard الماح + اج ييه $8 الحا اكد لخ مالك اال ري الجا ا لني NE Tr RANT الماع اين STATE ESE الت حي حا يي ل ا ني لال اوري ا ع 8 م تدا لام التق افا اا TREE MUTACGGRC لفت ا تفع فوع التالفضاات لاما ا اح لس حت حا حر حت حا دا د د لاد حا ل حا SA Te ل ا A BAA ل 282 لمك ل اليه دي ممح Fell ويم TE 2 eT A حجانو ا الجا ب en لحرت ae etm it ا NES ايحا جم اعد A اجا ب ماتيا اس لمت شتا .الت زان تاي لتم لمم FROEOCGRTD TROMGAAGHY me RO ل BE TI WL الات تناد SWELL AE A a ماري AVA A ايا جا ا يه AR RS رياه رد اا A SA A ME SR Ath تا رك RSA SE A مد رجاه A AN AA ايج Tend weer ww اانا م ما وجح تج لمتضخصة Tell حت و لجا ie لمجا يرج لاج جاع م يض الفا ليجو و NR ارد لون جوري مي الجن عدا NE بتاع دحج دوي دكات ممت اا دار الاو امار ارت لاس اتا الت لاصوا لاتوت نا تاهالا Se sn fe عبار SA A SS لاه حيار يد جيه ااا ل يا SR SA رايا يه لمانا ل ااه SA A يه ابا يح اوكا بال ب متي A Aa Can mete + ل اعم ار PERERA SIE SA ب LE mes pe يي PRATT لعن بام Re No sen امارج ا TE EE TES TA Nn RUNGE SE Satta كماما الجاع د lala اج انكر ماله Da ات اط لماحم رار انع ااانا كد لاوا ىل اذا جاجتط ارات الاي Pa Sr ne ve se Sr Ee Se ee $e رد الا مجاه لايد هركا لمكي حي ري A ATTRA YT aA LE Se ل ويم المت بوي ام تي و لل عي a حم الام IEE اا ال ا اران لتقا الفا مستا ا تاماك لكات اماف اا الم تت لا ااا وداج AT واد ريه هيل لحا ريك Ae وه با وي يك ري جار ايه ا Ae لاا ييا اه وله روا tr A Te تحر كا Ae AA كاين ايه SA لايك a AS لجيه كحي بحاو wifi TE ام Minh ily AN nt RAE Ry ASS NAY reas SN Et SRR oR SN Ry SNR, ا ah NNR An ger anaes Sn EN are را ChE a tA مكح SIRI TY GNI RR مضي أي ا ابا ARAGON جد توي بض § Ack 5 ا ا ا ا ا لا ا ea NE اي ا تح لا ا ا NE ا a NS ل ا لمتحت الاح بج عات معو بلط BN NT RTS, الح اوت بص واي محم ام RAT لكا عو A اليه حجرو ا ا ل ل و ا اا ARGTIURADG ATHREREOIER RUDITIIERGS ا م حا ا كك ال ا ا q PR ل وا ءام او ب اليم د ايه Pe ياو مي ang mn AN ال بيه لاير A ول بيع اا يها د ا أ ARR A ما A ا ع اا ييه a يا Ha ل اماه ا AE جه لاي لاني يه جا EE WYER د تسن حا الاي لاسرا وجي 2 لكات يه الم ت مع الل تتم he Aes اد و عي ا ةا نيه فز اا ره جو SAS AA نوا ذاه IR ام ره وده Si فا Tae ارده عي جاع فا اول فيكتي ور Sa فر اي رماي اما TA راي اماه ايم y 4%" nae يحي وم م ردح الححراي لاع لو اله ROTA اصرح حرم عورا اك يم SNCS ITO SIAN A PISMO ST SIAN NY لامكا عدم QUITITUTAR لأسا تا لاا . اندي اتاد لاس مستا اا سن الاي اح الج جاع لسر الكو اك ا poms wi تست ا A She SR SA Sh RS ate SA A A A Se AR ا SA ER SSR a A ل a A A 0 = شكل 1 قم AVYوجا ميج رض ANTE يات اتج مجر اام ان ND و جل NUT جورت ال BRANT NN rN RRR اح جردي SCTE ار 2 i ا ا ا ا ل ل الما لاريم اع برق فق امح ااا 8 X اج wl موده Tali مي a عي اه ميلا وك A داه A اها جيه لام ااه AAR + AR A An Ne in Ae جا ليح AE Ae ايه فيه أيه ار عاك اه عي ES SC AE بيجا تايا AY ite ATE A RT ES A A £0 ثم AR اك ال مرح OTR الصاح اصح الج سا ال حو ار ام اك اج I اميد اع صرح ايج الاي المج د اج الاب الاح ا صا ال ا لمكت اراد a RS SLT IR SS RA ااا - امه نه الم ممعت Sealed ل iy A A RAAT RA NTR REE NA SN TI RR SAT TR RR AT RS RAT SRST ATT NS A A SS RAT ATR SA Si A A ار اي الاح م حاو ل ا ا ادح Ett حك اح وات ماخر اج اي الي يج ال احج WITT ROE المح ماح ١ z ° MA NTL TOT SATII NTT A £ ممت مسأمة لسلس مقي لملسمفقة مقدحق محم GUTITASSPE اعتمم كع mae حا عابني اا اتويةا الم تتا مستت 0 x hy PI pa AEN a ele وام بيك ER SAT يلل a a SA Se aa A بيهام ما مجاه واد Se جام San aes A A RX ويه بحام ام ياه ام قبا لام Ss as ام Xe امهم a ادام احج الماح الما PRET RR STAN VOTH NIE IR TOT SNORE ONTO BORO SEIN IR لوجاك Sn TERFTATTIY اتا اقم وق TIITRCRSTT TTRTOTYTTY AGTETEORTSY TeRrrdoyyاا الو اجر ا المت لك لدعا اتاج تارل¥ YY a RIN AL تحت خا دا i Sv Se I كاج el Am EEA ve i SA a a Na RR a لجو اجن ا وعد RAO RAISIN ORR ORION ATH BION RL ONIN RO لمجم SI ROTI TN اود انك الما انما اراد مجان لخادلل TANT امالك كارن ناكرب ام الما الماك الما مالي راجا اعبات اضيا د لالضWalling 3 ل ا ey arSENSE تدس تمع VS FY See ل Rae RF A Se ve a Fr aR حي حا See Rf Sn SE Se fe I Fe ASI ee eS ge See Ae * " و اللي اح اج ال لاحت ال رم اا A امح حي NE سروت لاح د ل الموج جا NIN ETI الي اديت TE لوجم الا ا AATTARTET ا ال اا و الف حلا ميق الايae wel الا ا جا الل ا اwk للع كم SER كا تاج الاين كما رزSORA CO الما مan ot fA ا A A Ae Ae re OE Sn Ea Se Na NF YN Bh a A Se HE eRBax ¥ د و IONE EERO RD ENTER BITRE لجح ا حت جو اد CORE IIR واج وري الح TN الت رواحت لاوجت SY ا ل الا ع ا ا الا ا ا ال تام عن 2 الف لمحت اح لالد فت الا تاراق اااللحي لايع sas اد اج لاتحي نالعال تاد تب HENNE A A ليع جيه A AA AT A A SA ونه كيار SAN SS AS بيه NS كا يحاي اما ديه A يه ا Be ليه TASS ويه A EA يتات ين AA Say STN ويح لاحو ل ص A UR المح حاتت اح دا ريع NNER ا RASTER ا الاج تكح ص حا لم المح اه عاج اا مح مج ا AXRETTREADES ABTHOUOTIE ARMAAATTAR مس لماوعو ATATRAZATR SAATIHNIATR 3 £ ا الي BL حر ل AE IR Wa اللو ات نح SWNRSLE م الك نواه ye بوتا اجا مسي مايه ملم ماكو لا vn اجا ليح ديه به لي بيه وا بي يه عي لا مايا عا ناه مايا ولاب MN ايه نيل en ابي اليا بي ايا ياه له الا ايحا لا ااا يه امج جيه حت تم حي TR BR المحم وجي تاي اا عي RITTER BT الحم تح mone لمجي نصح ع د NNT خضي مع َ مسمس قد وماج واد AGTRINRTALT الت ارم المج ققد سعد لقمقهة x جا اب اعد ايحي عملت حمر جح ارح 20 اماد حت Wi لتم ا المتشياناه اد جه ايا ae اجا aN عد ااه Sem اااي يا a ae Se Se ليه اله ايا وا اجا جني يا يه اك ايا وا ايه TR با وا يا ءاي RE يه ER Sa بي PB a a الل ا ا ا ال ات رات يات اا SS ا ما سا ا ا ا ا ل د ار ا NT RN ONT ل امات اتا امتومانا ناكاتك كان لمارالا لان ماكر كران امات امل a - ¥ الي يد Fea lilnd ¥ woven SRWUTEL SL PIONS Wo Ae A ا Sir eRe NN A RL YA Rr A vi AI Sr ام Re ا Ne ا NE a rN IN Sr Sr ENSComa< ) AAA AA mts Sea SA An ابردم رم A تاي ARIAS احاح حي CANTEEN NANA دعي بعريميت اي الو ويوون ومع روي التو ون بويد مس مجر EYالها الحو واج جرجع لاوا ا LS عي انا لمحب تيتا دمج SRUTNL DL Nn ا ا ا ا لح ا م ا ا رت ا ا Re a ES Se ا TS حم بعر هي ايحي م حير كر جر اع اراي انم IAS SAAT AE ل د حص وت لحي لاسرا تي تر كر ب لمحي حل يايد لتر ين 9 ود مد ددن امد اد الك السلا الم شم ان اا لجرا ا الي الأ الا ارا فخ OE IEE Ee a SENSEI SL EDONMSTeY ViPE AN Be NN RD يه دي NS SEN SN ا ايا وه اتيك الاين TR SH SR Si YE SRSA Se A SR TY Se Se SR SA اTVX EN ACN Te NSN TRAIN ANN يح اي RY قات ل SN TL UE Sy AE NN اكيت الم ROTTED سس ل انتم يات سهدت مالسا سيAn nT ار عام جام وا ا اع wl ا لا ا ال اتاج ل ا تح Re aH ا اد ا ا Fen د ا ا 0* 3ori Ae ل ل ل ا ee ل ERE REE SCA الا اه لمحا ا AR العا اانا FE EE IBeal nh wean مراع ايم ا an gat ااا عتمتا VL ا ا ا ا ا ا ل NA ا ا Re re NH م ا A تمه 3 T احجيية myd SIENA لد VL FT VIF ا PAE ARTI, NONE IN ONTO اي ار وى RATS الم م لمن يع الحا الب ايد الج الات AN EN لمي RT أ “TY TETRIS ممح ب مت الا امو ال لضن لاديس بات ايان يعي لي اساي الاو الي Sail ll fumes wd ATA AT SAA ل د اله ل ال RN AS AS SAT Sa لاحو SCN NE CA SWELL PAWEL WE AA SN اا لحا A Nn NN با TN جره ا Se TR عا لياه NSA اد ايم اا اه A SA TN SAAS ع جا عي Sa و a ءاج ا Isader vl SRURLL LBadal Vi Sr NN NN IR Si Se a A ve ولا RS Se ¥ v 3 { شكSA AT ATA En gt RE ل ل ل ل احا ONY متت واي لام UALS WINERIES Wr ONEONTA المح ل أ انا ماي مك 3 الك الات لمات رات ل 5 معدي we لمجلا رمع لالتلا ee ع ا Fn با فاه en Re مي باه Na Sr ا لما PE ا ae a وا اه عي ا مي ماه جا روا لا ا با ماي أ ايا واه ا ليا به قي يا ا وا بالا ااا ييا دا ااا نيلا لا نا بابر أي ل و سام A a عا SARA L INT VW a STARS Ne Van NERY لحا ONY, MRT SANIT ONE rN يوا ايت لبي ا اع رد ا جيني أ ري رح TAYE SN الال اي ل م احا امات ع ا ف مد اا ا عاش م ER UE RRS IE الاح ل وار ال لاح ا ا أ A £4 Ty . NE الماع لات STIG TE geen JE RR IE EE XR A RS Pa جا بو اا وكا بجا مر با in ef Sa AT ماد ae Yin Yi زه اه Yin Yn a a en Sa ب SRS لييح و Tne بي A ره a Ne 8 اضاعه ER RE Ca زا متت اكت امتاخ Ne Nr nN Re ir Hi ene Pe ل ا ا ا ل ا ا ل ات اح ل لضو ميحد حضو المع SIA ري NS د RRR AA لمحو جد ميا TNL AAT ANA درو ايداع A و جه دي 4 الا SH له اتا الماك RIA SCR EW RF. تارك اماما الل لاله الما اذا اود ال ااال الك A I الح ل FAL ل لي لك م اللا ري يه wl الس لشي عامتسا ا nme a ER ma Ne 7 Ne re fe Re ل« بلي WATE TY INA ge SRNL INTE ve مله قي زاك فيا يواه مهاد واه لا مي تور تعد مزه لماعي ب عي لاك عي ياه قا_ بوه فل فاه دبا هه بحا ع نيام عي يام قي يخا مي رالا ما للا مزكاميات وه لبه Ne Fr عه بايا NE nN He NE تبحا لماه بح SS يه aT جين دي مهدي CR TRIN AND. ERIN RIOT يي ورب SS ا IIT رام اج OATS RN ¥ > اما Te A A ESE RCE ERR مضا اماما Al id = TRUELY Wa جاه AA A A ARIA Se et A Te he A eS يلاج نيك بيع A Se بيهر ول لجيه ايها ل A Sethe SS Ae ee A a She لا en ا راع اجاح له + انددع تان لمشت كيج SWELL الاي وري وا rin A أ ف a ناه Nr NP Ke اها وا بام كايا ما به يا Nr Sr اجا ب اج يا SN Yn vi <r Nin AX الاي كي انيح لت با لا الج يحاي له يات ااه ST دجت دحوت المع نوجي حت د رمع اح المج مدي TN I اضر RATTLER SNS NY اله موا لي مد CON ارالك دالت EO RC ARR A للدي عه FE SR مان لانت كرات BR A a لما ارج % ok ht ae end ان حاف لبي نيام Saati TT Wa الم اام تا SRL, ARS Sv a ل ا ل لح ل ا ا لتحت ل د اح د د Ne A SN ل ا wl المصض عض العصيا x a A me Ru en Ne Se Se Sie oS ars Se wh ela wn er Sma ne a i Se ee SA Sn na Au re Se 51 1 5 ان ار جر SNe Sten رواج SION حو تدر TRIOS ايد ANC RENIN ND, re IONE COTTE MeN 3 ROA YER الاج املد Slap TNE TUE TERE SE الا مالك باه امادCR.) ا ل LL راي اهار امد عا الم WEAR A وار a BR يع يك و جر يدها وا وله SAS RS اج جيك وتاج ماد A ريا ياه JRA ري ل جلا يك يه الاير اك ايحي يا لاه جر ونه A SR ينايك تجا eT وريه اوت لا ويه ee الاي aE TV andr EGE LL Intra WE HA SA RS Me NS Ten NS Sn ل NS NS SR ل Te SRA TN SRL Se ل ل NY Me AR INA HE EAA AEA A SN VA Se RSS داع i مع رع عن دم دع ERTS AA عر رقع اه م AST TAMIA SATII SEEN STI AT ليمت جاع لعي MAY 0 وجو معر حتت عر جومعيعه SY AY جات يا راجا اناتسا اه ما Ae a لاض رااان العاب يا امام اام سام اه انا ANy انه جام اتاد اليا تاها لماي قي شرع لتحا مدا اجرج ا WAITS Va ارح ست د SMTA خاي حك اج أي كا جد يا AR با ايها متايه Re ار Se AM Fr TE تالا يا مله لايك Ten ER اده جاه واج ولا حجري اميه ايه A دايا اندها SRS وتاي Ti ie تاي Elina intron Fe A SA Ne A Tt A I Sa Te A SS AT eT Sn BN Te ات ا حا A ET Tia SE IN A Se ا te A HI Sheesh اماو و رين A TOR EE EE SY ال ل رد RS Sh د لا ا . ل ل ل ل ال ا ارا لكا ا كرض بترا الاو ا العامة اللاو اح بيه مسي يمس الاي EY 2% ل لد هت ا الما أ و امسج SRUWSLL Ne A XE SA re nr تخ ea A i Ne rN Se 8 re an fre ص THIEN YT Fmt ar Amtren Wd الم IIMUDL A SA A A AA RA A Se AR SA SA SA Ai A A RS Se RS AS A A PR AR TR te A Sh A a A Re A A 2 A . لا )2% DREADGEEARA اج اعامتسا ااانا لاا با لمعا ان تباي الام تتا مااي اتحيى الجا طاحم تح اه تتم ا ل NT Ne اد ا ل Ne لح ل ل ل ا ا I Ne Nn ا NN nN Ne nS ل ard ل ا ا لاا سا جا wd ماكو SMILE أ Ne أي اا الاير اراي NN هام Re a ea NN ااه يا Nr رايا لا خاي يا ie Te FE اليه FE a NN نجنا لام بحا ل مهال اهيا اج لو Be eT A د TON ER RT NOTTS ET اجو أي DNR MOTI IT المع موحي وما ST جروا تو SET k1 SUAS Ry URE ES LE EES لت سس حك لتر RR ا bal ae) لايع الام ا واه AAR ST Yd الدبف لمكت جح الخد اتيم ل a ل ل ا ا ا ا ا in NR Nn TN NR ل wp دده Sead 0ه WAIN Smii Loastron wil NN Nob Sn A Nef ae NBA rh he Pa Fin Nn KES NT NT Re 7 YA Ee Pe Nr A Sa hee SE NY A شكل قم YYNONE TRON TR AY بحو نج ادير TY حجنو وام TSI م مح CO ماضن مرج NOONE امو ماحد دده دجت ع قلخ لدبتت دا تاه لفان جاردا إتجادا. راجا يجا ا لانتل رجا راجا المحاج دنا باسا باخ لجا دالج د الخ خلج الح يم ا إن ye ا ل ا wi الح وت راح SMAI YE Se A بر وي لا AA يا ا A ول ا أل SRA ري ايا يا AE Ae A لاي اب وله SAT انير ولاب راي أ ايا نر A Tra ول ابكرم يك اه NAA بالج ون Aa لكيه ليع REE OE SMTDI Lanne wa مر Ni Rh ia Ne ae ne EN Re a NR مه ل Re Se و ne he Ne بيه يي NA Ne Ta اماي NA را را مكايا a ACTED A TE لض لاد جع لجو UATE TTR الام جره لمجي اد عو ارج ار يا يي ا ال لع ا ا برا لكر ماد داحك متا 1د امد ها Se lHTa BT ماكر تحكها المكاماتت لزانت AST اانا متت الام oa AS الل الجاع الام حوات ع ١ EEE ب promotes تتاتاة A Sh A اااي A SA A نيعا ا لاج ايه AR LS حاار YA SR MR SA را A VR BR بلاج ارا لازي لجار لمعا ريح AS SA رك NA A CH) اب لم 5 4 EE CE EREGERE ERS: RARE EY ا حت ا ve NA Se Ye a a حت TN NL Sr SST aT A NR Xe SY خا حت د NIA SE ابد ممم ات ا عات مي TAIN عا ا IR AT ACTA IT الات جاع EY BN, CHE حي و منج مت وات خا ATUTARGRTA لسارم تنقيا OUIACHEAGTY TRASATOEEAT اتنا الك متتس سات ااا RE SES و مضا we ا لد د Se fa حم حت سا حا ا د تح د ا دح Ne حا Na اح ا ا awl المج اي جا ا الا اج و حا WL لتر SMEAR L وا با AE Gs Pn a مله جه وا باه اك اه sn a Se اوكا اا Se وار Ee ae Ni واوا لا لا rE SE A Fe ne, Si ie ايه اي وكا Nt \ SRCUSR AANA CY ARNT) MANN DR STINTS RT TIT IT TA TIE ME AY ET SIN TI IITA AT SN RT TN GUATNIACRT GATERIATART GUARIRTITR الس ا اا جسني لبج لقالا سات عات الا hl ب WEN Zoe Seed ب NS لالحا اا wi لخدم م العام ميا ياه TE AS TR TER با ااه ادا يا ابيا لا يا نيعا احا RS RE RAR ايب لج ايحا باج ايه ا جه ايده اير يله يا اع AN ياي SR مايا يتاي دي ard اموا د ا 3 WAIVING SMIFRALL Ameen vd Ne AS BT AN I SR Nr AN Ee SER ee RS I i IR a NS RS Re EA Se es a TOT MR ATTY جنوي ودج لجاب اج TREN SMTA ROWENTA, CNA SUNT A NR OR AINA RN ادس جو يتا ATL ASA Ad ال ادك الوا اوقا لجا اناك انا اراد ASIANS AGC ا ارا الراك مالا ما 3 34 ب > لعي مواد الاج احيحاا ايا ادح اج ا ا A Se ل AIA ST SR Se A A ل A SEE ا ا SA SA ل د حا ا A AN ل ار IEFhAL anbrun ا nA eS AS SR Ta re a NS 7A Se Pe TN NS 5 - ESR STERN دا الما كايا تا لاا ايداكا الخلا لجاجة االماحة ااكمة WRN مدت الاك اليف ال اانا لاسا ل ام ال الور لبج ا ا ا ام ال اجاج EH WL ادا كت داح LENA ا Ba a ا ا د ا BE د a اح ا ل ا IR ee A A i ل ا الاي EET ير ليسمتتردد| لما ا TR ae Re Sa Ko Re TT ل ا د م ل NI اك IRANI ATE اجر يد لحري ON ان وجي اتوي يي لضم Se اداه ا VAM NTN ل AY ا ل ل ل ال ا ال لا ال ATRCSITATY اناتسا ااا اينات المي ليح ل ويم ae I SIR We امسا متدرا SEARS والاا Se كاير NS لواب احا لوا رايا NA NN اي SVP للك اجات Wad وج مالدنتيكد لمر كدر A يناي ياه لحي ار Ba Se eA A الاي جلي Ca RENTON CN RR CN لماجا مساج مسج EON TE RTE SIE ROR RCD ار ها . اران ان ان لاا لاي اللاي GUTREIIGRE الت اسايق TERETE ابتار ااانا EES ered ليسا مجع لد ادك اح ايحا عي اباد يه يام اا أل مي بات A PR يها هاه ليا er عي :نوه لا مه أب rr Se با وما وا محا ا ليه ااا + يا اوه أي جام يح لاله اي را اليا م اااي له لم جم د لجال و NY SDE AARNE SRDS OR دي جو وا RUT يي بياج ني الجا يد دج اجون RN SALON, TALLINN UAR العا رخ a Ie BS راك لحتنا Bs x AEE Ra GY Aaah ee مستي WEE In 3 a RE a A ا SR Sn Se SR a ا SN TA RT SR Se د A a NT NT NS اح w N SAN NT SN RTECS COSINE CEA RETR اد لامك SiS UITAERGIY ال ا ل SWE {ae Shon [RACECIINE Pr CORR Rare وا ae مل ره he لوكا i, + باد وا ايحا هك جيك ما he, HA وه واه CE RN Ye ne NS as ور ره Se a FE Pe ee هيه لحري انم امت ان ديم el Pa جد الو الي اد امج الما لاد ات re ra الوا للحي ا ERR! ااال ترا الجا رتت ال مااي لاطا كال ناا ال امات اليه ماما ليما مكب جاه انه اله كان تالت ناا اتا AALS ل ال RIE RNR لج SARE A SSR AN RIN SN Se ThA Sy د د NA A TA NR RR INNS Th RA Sh AIR Sh AR IAN Sn Fo AS SRE SAR SVR RETIN ee لوي ارتعيي جتحا حت NEY A AT SSN يي تي CNN XL SUNS RIT RT لمجي و x RT ب باللا ١ A BE Et ER I EE EE \ FO + ans I RE IR Sa NN ل ,2 وب شكل قم TYY SES 0اجا مي اللي م الما بتري MURR MTN MUA الولف تحت ال ادج يلجي DIT ASK التو رج SIE > اما اذا ملام ال اياك ارات ااانا لكك لامالا لمانا EE Tl I A ار الود مارت كا اذاه لدان مانالا : 3 i الم وم الما الا لا ANE لخد ا RA ا ل AR FL سن Se a اس اح ا ا حا ا ا ا ا ل ل ل Sn va a ا ل ل ل ا د ST لاج لمجا ب اج ا ال لير الاح ا لا د en لسارت الا لا الا ار ل ا او حا سا RCRA الاق لدنم رقا GENES GUARANTEE OCR CRTRADNT اليا ا 1 RAEN Ne ra mr A a a es a Sa nr en ee ae A ZH a ev AR ve 2 Ae ae ra Re ne oe 0 Ne A ee Se: Sf a الات جيه Si SAA A fA pn XY RE BT CA EEE SI EBT BT A | (A Tf AT ITAL MRA lnm Sami ماتنتماد لم ال اا TTT الكت مادام انك يلاتان الالماضك انك اتا Np لم اااي men Sree RIL veh MENSAANL WR ا a mh Sa ae i ا No Na Nn SN Nh Ar FF a SNR A fn Nn Re SN Ke Sr Xe A BARLEY Se NE م يا د حك ا RT OR اي لج ل الي ا TD تاي AOR ا ولا ادا اندي لالس لتنا انلق لاما ارقت TUGACHITRA لاما لاا ا hy 4[ مه انتج اليك WR المت ا لالد لا ايا RS لوالاب هام ما ادام رجاه a Ae وا بجا وا بها وام بي تاه i Si مالاب تو م لام مي A ارح ااه وا اا SE توا اي a مااي وا لتحا ا ولج تيا ب لجيه لجخي ا م ال DY لج دا التو SIE اي AAS لاو عي لجرت عع جع دوع د كاج المت دا ا مم ري ري لات DIA TERACAR سات بار الات اي ا الا ري الأ اناا ااا 4 a Fa A ال ال ا Swe و VE ا ل ا ا ا بح زياج ارلا اط ريم حي a محا ااي 5 Re مي جا ألا FN مح يا مي a ب اتيك en ب لاا برطي a Nw الحا Nur in لطا ان ةرجا نابا نحا TEE A EN AE RTE ENE To UH RSE RR rh, SE RE Sh IE a A TER SEE CSTE TI EAE, SRR EARP لمكن اشام نغ انيدان الكت لط wl تنعت تي مث We اتنا الإ لعن خا اجام مي جا ا ها وا اه ا با اماه ور قي A AE A وام ا وأ بي اول مااي ره با لح ا وكا متا واي مكاي جيه ل Ae a FS اح لحا An را لت لات الات يي ليه ل جر رج لح لا EVENT RNIN ال خلس« Sel Walia UA لط Wada تداتعا مارجا ah 3 FATAL EASY MARU ag LRALTIERISAl Aen HEARTY eri SRD PRS REC KE fa مي ا عه AR مااي fa مايا مي اكه Ne مي بيج جاه بجا SN اجام ب وا اي ا اا عا ليه مااي 7 لد ا RE مي جا FE Nr SR Re ب A Nr a لكام تالايخ ا ما ل الاي الاج ال اي اليا حر ال ا را ااي أ I ا وا اح Ee ا ا الع الل ا ا ا ا الس امد تمدق اد ميقت امن 7 تق اللا اتيم السام ااا 159“ RINT ell تحن اح مد تك اللمتص تا الإ لدب ليا خا د حت نيد ماح ند اد لتحت حافت ان NEE eS NS دح NVA اد NN CMR aN ea حي حك بوي الا واي ادي اجيج اج الاب ا A AI الاج aE ALTA لحن جع تح لوا ا ل اح الت ا ORG احادة لنتجم تجا انا معنا امريد اجاراجا متو اجاج اللمجرية لمعا ا تج ارده لحار شرا 203 ال تي RA Saver BEART LXE IAS.Va باب Be Re a Re اح ا جه Se Re Re re A ne me dn a ا a ly ie va meh TL Se an ha Se nl TR ينه بها a رتح rn ene eg لوي المت يات متا ee SE OR INE, اح ا حي ET اجاج حي TV AY AT NT TI RE I ES SE RE ايان تا RAN cath حي ا WaEEAASL Wa INES SE NS A A Sa NS Se ا SA SR RM A Ya Ne Be ل ا ا ا FI INNA RTT SE NATE Ny a Se oY الاج اين الواح لاوا SOR EY جع ANAS IN راي جرت جا نحن جر حي ا “AS DARKEARITAD اكه حمر ل كم اماد اد لادان ONCE REAS الا اه لاي ري ارد تكب تدا اما TALLY ل WTA ا يا VR اماما ا لام a Tra لاا ا ae ااام يا ا ملكا يله او يكاج يح لخدا نر جيه A يار نا A SA وااو لا Ta Te a INS SN NEY أي جما نه نا تداج ييه ححا ان جح امع ون حو rn TR صا اه الا اكات اي اد الا عضا د د اج CRONE SIT ONIN EN لمجا مد QUSUEMREIT مقي A.) CEREBALTEOT OOUDRSIGEE DRANRTUGAD % A AN att : كي TRIAL را لو ايه اللا نوا الجا را NS ريا لد ميا NN NSN Va ويا اوم ري NR راح تياولا ريك يلا NN VN I NL NE SN RRS NN RR A . THA مفو امد ا اام ب التق انق السام ا قسن نقتت نابت كرد ااانا لاا ااانا a TE A = wh امتح Sec AE VR لالش ال ا Se د ha Aa لاا كد اا سيت ا a تست نه a eS ا ا . 1 1 : اا Je حا NN See 6h et الات يات TI NE NN SNL i ا NEE NE AT GNIAR جد لاي AGLI تدا الابما تسق ROTHER TLLTY CAANASETAD الاج الت Yeh wl ا ل ا م ند ا ند عي يد حا لا SR Yn نت لا ان حا ا ا NY كد د ا ايت احا تي ل ل ل ا VY AS جب ديا لوم جو انحل الي لجسي TTI RNA مواد حي اتوي تداج تاي A NRT ا م 0 GUTHRIE BERGAJETD TRIARIUCATE ACTEREAIAT CERSATIERTY مسلاا A] ا Tey ikali wd Ti A AS Sa Ae ا A TAT Ti Ta AN SL ALORA Sh A ل NEA AAT AT STA Ta RE FRAN SA A RETA NT RIND TS RA Be NITY SVR WT EL oT It eT hae eta نمضي لماجا لمث دار ارماك ادا الام ام عا اماما انا الات امت تام ات ا CAERADALCE 7% ؟ KEN YY RR I. ade a WR اتاد عد اد د ا Tr ما عا اي ميد الي ا ا اي ايد ا ا ما Nm حا كيد كاد ال ا د د ان ا ا ل a &الجر الت قالطال و SVS A SONNEI en ar nny Gn VSN on ST CN SRNR, SE IN TR لان لوي SVR اسارج ميدن & الوا AF DE BREE NE BEE LE SHEEN S055 CANE POS MOET TIE SEHD SE SC ES DRE SF LOREM FST FDU اع جار لناب شا كوا ا تا اا yy Xx » ١ Cre YRERAT wh SEPIA WR SS SR A A SN Ne SR RE Se TA a IN SE Se Ae Te Sa a Se ei Se Ae ا Ch Be الا لا TY SIN Sa dy TRA لحي ل STR EA NEY AT NOT ND ee متكت ال نيتيلاتتم الك أرق NRARSCUIARE MUOATGERES اال تارتم مسترت لشن ان LA Bel aE اتاج Fram GEYER OWE A At A Sa Te AT A A AR TA SA AA A Sa Se A eA A Re SA Sa A Sev Se a A يعاو Ae A A As ARAL Ye A درا ل ا بي ادم SN NI a ادام ريق STR AMINE HEN الل TON NEN SME PMT SST SNE NENA SATS CROIPIOITE ال ال ارا TOURER امف الت مقي لمي الالالال [ho AY i 0 oer OE TAY eal EO ERLL WR A A Se AR TA SA Re Se St RS Tr A Se A د SR Sa RE NN AI RN Set AR ل NA TNA TT RS أي ا SO لاحن MITER TIN ERS لم اجو دجي حي CURIE SN UTR OVE BTS OVER STRICT لكر امد اناا لتقا لاق CROATIAN الالال رمات ااا اليا اق الات د لتقا ال الفط VA ل ارد د AT لكاي لا يدت FeAl لدان لا مان د ا تدان ميد ا د ا ا ا د IN اد د ا ل SR ل ا ل اا ل EI A سا لت ل ا ا التي BIN IN جع ل اله اتام TUTTE ART AGT لاج تاي لت بات ااا “لاس لمكم بات وات الج ترج اا م ااي لجا متا ا لي لين السام Sami WTT ORY RAR oR Sa JAGR I Wa Wa ااا جيم an A Ara يه ايم AN en At Be يا TAA Re ايم المي AR جما لاي ريا AAR با iy Rs 2 A ROE TRY ER TL Th الوح A See ONO TOT, مي تراك وسو KTR RANT ILL لمجت ERR TE ? TTHRATRIRTS امساح لماي TTOTHRGEATIT: ارا تان ان انط عا راض Veh TIRRTUAGDT aed المحم الا لاحي ماخ WE VIR vs اك اتوك اح اح اد الم ا لحا مد م ا i يد ا م ل سر مد TN nN a اح دي اسه ل ا ل ل ا SNE لا ا TANS ار وج AN BEN Te اي SVAN AMINE SVE ST ني ري رن aM WAAR NR NCS aWTRTGEICE TUARMFTIET لمان قفا الست نقتا APRCATACAT افق قغة Yai دود YT IEE الج نا اير WAR ا ا ا اس nN ل ل iar rT Fy SNE TTR CVE rn IE NILE NY I EARN BB RnR Se To Rene ne NEY STETTATETE TRETIAOTRE TTATOTEARY AASAGAGAR:E GREATUADID ST&TINITTE ae الحم WEE ATT TY SEFInII OB Wee Ye Tea Re Se Ta NN NS ا A ال Pa AS a NR hr A A eA Ne SA ا rons RAR خا لا ا التق ا اا ا لزني اي اانا الا الال FOIDARATESE ااي السمجواة الوا ال ne دي EY DIR تتمتقدة مه ابد عي را Se باه SRT Arne he ae a Se ع NA جاع عا ايا هاا جا بر جا اداع بيه يه ee م لاع نيا ta Ri تا ليا متايه لاي $a لكاي له انيه يديه :1 ل ¥VEY المحم المع دج المج داتع ما CREQTOORTA TROATATES: TATTIARTOAY ام i لدان لواب لماي ماك WARN 3 كن ا ie A حا eS رايا لح ايا يا وا ازا ولحاي NER مايه خاي NN AR رايا Fey y Ar SURRY UNA STOTT TRON CRITI RT TNR ROTOR IR aOR ANT TR SR Bre تخي SE SEAN RE OSE REE.CRRA WEE RA لماداد مرج تل اماك داه الأمالمر I EE لابب ب" ia nti ع جا الات ول ا الح ا يج حو اتروع عمج ta اع اموت حم 2 لمان لمم تجا ااال تيا الما DUTTRARRGY اق لت الاتكتطام AEEIPACENT ATSECRSTRED احم 4 تيا ديدي TURIN A FUR TRATES Re جايح a اساي لعي موا وحمي اوح لد يو ETI RVR NR مدت ملا م يو رود THOSSCOGUT TAMITARATT TSAATGITIO عيضم «مسوموود ١لا كوي رحد ea ححا حي يحم ا المي نيمدح لمتتايت A ل Se A INS ا حت اا اه ا تا ا د ا اح ا ديدي NR اع امن ال ا اتات لجيه وي لانم ا ال رت ار اما ا STERIC لاحن اي اا ار الت الجا ا ل خخ قاب A EE ER لامتكا توا A مضا افكت Sean vet دجم مرح Weta Tw اشاح تدس ست د متهت NN ee اح ا اي اح د ا لي Ne لاا ان RR ل د د Ne ال لح ANN NV RN SR UOTE YY MR ay هوحن لضت رص لوج جود ماي SITAR GL BAD STAM A CNSR ENN ل STON TNO = 8 الجخ مضاعوواج امس مضا ساسا_ لالجب "تتم ممما فعحقع متماتدى مج ااي لما 0 AE nt ل ا الت الم ال ل ل ل STR L اد د لح ا لح حا تت ل اد د ل ادن لحن حت Re د لس ل لد لد ا ل د ل ل اندي اد لوجي جر لني يوا لحي ونا لبو لوو ووس Ee BAY CTR لمجا للدي اي ني اديدج RAT جا اي لوج دج اللا ا ارال اي اانا حم عق ATATTIARMY TIRTARITUIAT لالت تان ااا قتا لحا الا يم كج ححا اع دحوي دادر + لمتحم Fo ل ست دب لمات وح ا م لحي ا a ل اد د د SS لا ااا ل اي د ف ا ا لذي كد ا م NR NT NN TN ل ا 3 A لكاي ري رج لجا ب ا ا ا بل جاه لبر الحا اك ند كردا يد اتاد كك POT ال الك جه اج ارم الح اد اك ايج PTET ارج حي اب NTR ادي يه لكي اا SEE IT 0 مض لامجا باصت TATASRIGAR اا تمي ال الور نا لقم لضا نا اق لمات يدي ادن تا an TY واي Tay ل Su A A NE VA Ve A A A وت هار أرب A نيعم و لج بار NV محا ار A Su ويك ري تاي يه را مار تيك VA رحا ل اريك لا اح يتا لتحا رجاه TVA CITI RT TET TT Se RT me لوجي وجي RAT CNTR أي ارج مم رو ار ا احا و ا LAINE الاج لاما لحتنم د د كنا انمد د لخاد متحااةت حاتي حاتت الت الم انض اا لاض مداه لالت ال 6 0 ب ل ا مي الا ل ا 1م LROWMOTEY WI تتم SN Ye eS a الس م SS TN ا م Fe Pe كي Ne Te i ا حي اي ا Tl اي a Ne TN TN a ا ww 1 شكل رقم *؟ ط—\é a — ANN MUN CVMINRNT yh AI INNER AMIN SANK RN NY ا لمجال YS NON ONIN, ناس x ANNISTON I ATAY TRTOTTTOTY TYDHTRANTH.GUTTTRCOTR TATAATEITY CATIUATIUY NITAGTALEX المي جحي دجي Eh vd الست دصرت ال تست ااه واج امات وا تار واي اد ميا Fe اير وا اتير و لامي ea Sr a A لاوا يها وا Fe ا اوكا مي SS Ne بير Ae وا تحال مح وا اكه Ve لك ويه اه كاه اجات CROADTR NDE ITE TAY RITE نالمعي ممصي وروم لق , ا ا ا ا ل ال انها ا ان الال راي الوا اد المت رايا لاج ات يق الا لاا لماجا ذا ANGE اا العامة gy AY LH NER : الا الح OO ا 0 ماود تو ا لذ ماع دج SWEAR AL مرح امام ا ديا اما ابي لوا ما Ta Em ماه ابا دايع يها لواب جام م SBA SW باد ee بجا اجا في افيح الم لي A SP بجا يام بي أوام لحا ا ييح ياه Se HS الي الا ايح 0 معدم مي اج جع 6 تنكم NNER STR المي SOY ANH الدج الجا جم RS A الج ال وا د دين المج اوج جم سا ال الج عدت لمج حر TIRTOTRATH الحاث عاك د متك مالالا AASAUTUITAT الها اماما ف الفحض اه TIVTATYONS GIUDUIARAT ااا اليد مجان او لاي الاجر لوا السك الدع SRNL ند اتنب نانج ان ات كانت لج اد عدف جات لدلك rt Th a Th الداتة لست د ند نا تلت د لين لد تند لت ا تدا دا كنت حا لبد حا د تداج داه OCIA لامجو احج حا وي الج وا لتر اح ARLATELEST البو ادي وا وح لواحي ا الج ا الا الم اكه دالا لتاانا ارق خض HARASALASSEY DANIARSANY اام مدت للخت المع ماحم دا يم ' wld ا ا ا ا ل ا ل ا ات د ا د ا ل ا ا ل a د Se Area ee وج SN VINA حي ا و CAMEO Te SEs SATE ATEN NL CVE NIAAA EN REL.PI IR : امك جح GATANTRIOR الات الاي تو اا المت الم تدع ممعم مق Ao EY math الى PPL, SR a a 29 احج مجو Ail Wd المج مع تسمه ا ل ا AR Se ل د A SR ل اح د ده د ل ل ا ل ل ا 0 4 1 7 نخمة re NN لجن ل يي اج د لي ري ا ا ا TEN ليح رج ا اي ا ا ا ل A أده الا المتعية لاي صقرم عطي العكة تقد GRETOTARDS متا جا - 1 3 امتح wd اصع : أتنتمة اتات ا م لا ا A يه اه اد ااا ان ا لما دن دا م ام اا اد تا اي ا ا حا AER ا NAN TN ا لاا ل OC INLAY OC EINER ال م د تت اج ا لها م ا را ال الا ا ANY ا ل ان اع الح اا ات وا اس ا ل ل محر ال ادا اح حا لل ا الو لمحا حم امح الت اج ال ا ا wd ا ا * ¥ a Se ل a Sa د NATE A NR AR SS TR RR ST Se PIN rae Rg NARI حي حت MLN SR SS ع جام An ON حرجت ييز الح NA AN الحا RY) A رسكتا ااا TETIEEIATTY CAGRARATTET الا مسالا كاماد لاسا ANY كحو الى ل مي ا ل اتا شاد لسعم مساج الاسم Sie PC Pe re TR SS IN Te PR Re Sad ص I rw. ال ا ا قات ل الا لي ل | Cv بصم را اللمة ااي اويا ااام ماج سات لاا لاوا اماق عات لا الاي ااا اا ا ادن مم Svein dT wi ندر ل ل ا ا ا ا د i ل ا د RL ل ا ا ا ات د TA ST ا SRR ا ا اللي ا ا ال لي اح اب يات SIL AION انه NSTI ملي الي لماجي جه اي لتقا FANE NE ThOQOOITD الم اااي لمان ات امات الما ا مايا وام اماه ماع اناما مام TPDCCCRAOY ا AES WaT Ypres me x LIRA PIOWOTNEL Wa a NA NI Ne fa A SA Nr Nae a NY Bu NS Rr NE Na aes aT Se a Re SN Nr eX a SN ANNAN CRERTIITOIC لتم التق الف ااا GRABER اللا ارا لاا الاي الا الاق ااانا ناتاس اناا AAAS را ال را الا ا م مراك ال سا تكد رن الم تتا الباداجية لوا بي أو A ny ااا بيك واه NE A in الاي rN زوه بيه ae وام ا امل Ne لخدام إل مي اكه وب اذا بادا با الاي يا يا AR يتاي بك يحي اي NT لكاي يحاي TIMELY AR ron wl AMELIE ADVI VL A An لاد يجا جه AS ايع ايحا A NR A SI A يدايع NN SR مي ا ل مره اا حي لسن ا عي ادي ان TE, ا مرا لل لحك واي عي أ حون ا ا ص SRO الأ ات اتح ب تن OTNIGITTOR ال ا اا AEN CUNRATOOAD wR ا Weald ذا RRR Ne دا يه اه لام a اد ماس اتات RET NAR د ا Sa ان NR A NN NN RS RT ATi Rh dg ee a SEED L LWTEIM WL و ا ا ا ع Ne Ti SA Sa NR اد اا الت TN ا و ا ا ب a NN TL ا ل i NR RNA nN SL NO VE Sn ل ERI DUSTRY لاوم داكي لاسا لتر TTP IVITRGES الست الال ER REE ar ra] vd ممع SMTA I A Aa رب اي لز Sh اام ب ارك يي لاع لج NS Ne بام A لمر NS AL eh لاخر يه AA es تج رت حار اتح را Ne حرا NN wd اجو محرة ل اتمرتسةة اتا د اماد ما د ا ارات ما ا اي د لماه أ ما NER ان ااا ما دان ا ا ا ديد ا لي MAE ل Sn صرحي أي حا TE TITTY AON RITTER.TO ON eT Oot SA CRASS LENA OL ah عو t ONLINE ١ ذا رامال تلا WUT الخالكتالدكانة ارما ل رخ كات داح انرا تتا خياد WAIDNER ماغنا تمه % 54 > 1 RE EE gr ae) Wl ل ل SWMUAL Sa A ar an د Re SAT د i د ل ا ات SN RAR د A SN AAS TR د ل SS NN Tents hd adres ae VL نالحد SWUNAL a مااي وا بحا وه مي NT a وه يح وتم و م ها باحك TE واي YE ايح اه محا محا محا محا لتو NE 8 NE a الحا لجراي تيه NN تاي شكل 0 A رقم ؟1 ييERAS DERISION الل اا د الوكش اي اراي انور ااي نعي اا اتات الما Snip المتاتنتة promoter wl ing ot ie an RF Tn NT ea اد ا Se Sa aan NR Sn A SE eo, Se ee اح ie en ee ee ER rE لاما اج دوه 7 لدبا حت اتات YL TYAS a a rH HE onan Ri He Fa i FT Fa SAA a va NE a I A a Ae ee fa Se a Ne te SD Ar a ha a Se A Se Rex ترا ا RT المح ضح ودج خوج مجح مج جاجح رج عا SONATOGEDTT CANNER TTT ا الل ا الاش كد ان تق ع ال د ا ا ا ال ات ل ير ال ا الاو اجات وات يا الا مكحت wel [Dhl لايد لعي بيع جيك جلي دجي لي بد لاي يايد ماي نواه A Re جيه ا Sa جيه a ور Nf رجاه لد Ia A INN ياه ا يح جا يا بير جه اا يله نا Re man ا جيم ب ا ب يي Ceal¥in dT Sadar we متناو Lowen wa i Re mn HR Fn TR An Be SR ra IN Hn Re Tr Nn Nr Re SR Nee TR Ne a Re Re ae me Rn RE Ee A a ا Ha Fae Se I 3 ¥ i hi IRIN ITI NTT INN ATID AN TO OTT ONTO NPN RII ITS.TINT A RT LT AT Teh أت للا متخ اف لمات ليوات لما ard تنخ شال له الام الما الام ام ا ل راتت مرا اا WIR AR AAA TARY SHAN LA الام يدان كا ال اسلا جات ERO SE RTS ا SERIE Wa a Ny Ya a ES SN Nn NG nN Fn Sr Ne NE WE, NN ee SN NE SN RN VR Ya A RE EE EE الجا ey SERIA ART ICR VL SIN RA Se دح es hs Ne Ne oe sa te SrA a a اح a Ne ine ee ev ATCT اود اج نجي BTIOMIIN الج وجوج سيو لحووا لج د لزع رحج ابي اتج SITS TY, TT ean 3 سس ا ساي متا اا الأ لاا راتما وى سس ا ا الح ا م انتج ع 8 قا المسمتمموممج اتات لماي دمحالا امه الحم ايج i de nn Fe لاط محرو a لي يها يا لامي الوا ايد الا يحاي حال باتع يي يا i عع اه عدا rh 0 اماه و رح a ما ب ا بعرو جود تت او لتحي > ال LATER Wa Ay a ar 2 rN a <r Pr PRN SNe Ae in aN Re Pn oN Nea A ا Be a a ا ae ee he اماق مجو مياه اجا ان re ASR rE ا ماي ل ميد حو اكوا TSE SRR جين ا OTT BTR FRR he دام لاي اللا اكيم اذا الماا دالا لاحك كناد مالم ايد ملكت د«نختانتنة الملكمت ييا إكانة لمانا اماس ادام يه الو وجا ني م الم لاتجيد Smidaii الدج الست WL ححا ATA AN د الك اح رايا حا ايد دا الا AR الج حا ات ا SI STI أ ا اج رحد TI يض احا ان لكلا اا رجا TN TIN اي اين رجلا اا رج الما A TA اه أ ا ار SA ابح لح احا راجيا ؟ ليتع Fam aren me SLO اح ا ال WO OP ا 45 ا الج يودي يا TT لوت لوي له ددن مووي حي )قينا هون حل رابوم نبي تلجياح وي TANI ATTA Ar ANIL TRE الداع ل لأا اله a RE EB I لمجي قا ححمتة حجان خخخ تكد لالط لخاد اغا درجم جد يحي الخ اكت Aa wand درم [£358 i a» > نات ND مل Nd AN وا باد وا يوام با لامالا لإا اميه Sy ادا a ee Pa اي اجام a اجام جا بجا لح توا ea جا تاه م جاه عا أجل eS eB ar ie yr دا يهاه او مواد نواه توا وا مجاه Ne ال تتح 0 Amana ae SILL Antren wd EN Yn Sn rN Xe ys a ا ne rh Se TA us he A a Pie ee se SA ا ee ee ae ee 0 تج ال AVENE ا HEM ا ا ال أ لتر ال فوا الى را كي A ON الا ا SA أدب جد دن اج ا ا ايو A5AY انمق تمستا SATDEFAICAT الدب لماو الو التي لص بترا الا م الم اليم PROATATAROR Went A ا cs WR اليا م Dud ZeTil لوستم سوج wi ea ARR AR AE SAR Sh EA SA SAN SE SA fe SN SRE ل د I RR SE A AY SE A Sh IR bs A VR SARA SA A Eo oS MICE J SPN SUR ب ال RE اا ل 0 لباه دي مايوه له لملا لي دي اهمايا ايا SR اليل ءا يها مكاج جا عا تور فيح ويه لبج rn يفاعي لوا ل يا ما جا عا A ا فيا رو جا جبحا يده عي زه AR ag ليد يع ايا ee جاه جيه امج مه بي Foy SR ادم اج TR VIN سور ا eT اام اجيج الودج اع د وي لاي SR عو الما جا لجا جاد مجاجا :تان امارد ادم نامتك RTI UTES ماية #الماكنا #الجانة Saat AE ae patna يا اع EMILE power wi Ar rr ere Ar A A Se Ae SE Se S70 Arete 8 Ere ne ee ee Sn A Se Se A Sr A re Se A +e Ae A Soe ten Ar Ae ane A a Talini lo oaumiires wi i NY a Ta Sa AY EE a Fn Ee en XE Ne د NAR ا a اح تح حا ا ا NTE - جاع د err اع PAY لد أو ليرا تراج لمجي SR Yt TNA ددمي اليم دي ارم اا تو كرا AY, رميو CA Non مارت م ام كام ما اماما ارك كراد متو اجا سام جتحا 1 ااا OTROITEEDE TRATITATIAR ا اله لماه الم ااا الا مرا تج الما ل م ال ل ل ا ل رايا كاك راي ليجل كدي on a ااي الاي اي لكالا ne لخبي ايا Nein Se Nr me A امائرة كاري ة اا ايه يا زر تايا جا ب يا زعا خاي كي كا بي خاي الخال ااي الم اماج ل لعجت aed ل wd LEY NE AN AR aA a I i re A a NR ee Sn RG SN PRR Ne NR A SN ا AY NS SS AR YO A Nr KY الج رتكا دجوي SARAIVA RITA CUIACTINMTRALY ري لاع در حون روات IRN يح عاج ات ا ال الا را اا م اتام م ا ازا اللا ام الا انو الاو ااا لاا nT SE a اليه الا عم اموه دع اللخطا wd يا اه رايا تحجر ين A يتاه AE A جا SN Th IR Tn A دازي A Sr Ts Sa rr ا واه يع بل ييه بج وال ال ايه A ميا يل ايا يا يل ا مل aT ا 5a ee Ts WARNES RANEY.Wa AA A RF AN FAS RR SN A SN EN ا ال ا اد للحن NN TN Vie NA ل د ا د Ya SN A 2 = bt Pn 2 قم : haat يبا 0 ؟اج ena لدي بجي اي RY, م عير ENN A OR NN وبري ا لجيج مد ميا مي حي و لي ا ص MANOA جو ا اي AYA امتح ماسقا الت .الت دوعي لأسا ساس الى اتات ترا الست تم تاي 1 ¥ ¥ 43 الال الج الي ا يح جح اج حاتجي Va ا ا بماد ع لبا re no ve ما با Se in Ne بجا وي جاه وله a با اا لاوا لاوا نيا a ا بي رجا عر اا en با ايا وه بي الا ليا اااي كلك يد كدي لكالا مكالم الل ار اي مح الا ا ا Wa تشع حر اتات Ne Yr Br Re م Ne Ne مد ا HN Nr Nr a لا ا NN د ا EN Br nN ا aS A NNN ل AVAL NN x3 MII لماجي AMR RATTAN RT RD, المي لوج مجحو RIN RTT ضر و تجن يي برعا نو اجاج يد ناه لا تا TRATARKOAR امسج لا الس لتنا انمالسا CHRPITRTICR wn الوا ل رد + Tal ردي لمجت سمج للتمطنا مزه ري بد با ا ايا ا و احا توا ب a Sire, اح ا ل ااه أي ها اه اح وا مايا NR ياي SER NE, يزه ا لاه ايا وا يا لايك RN كاه SA شار يها لا يا wd جم جو تنطاسة لح حا Aa اح ا د د ا ل AEA Sn A San A i Re ah A RT Ren RR حي اج ا ا GAN RN URL TENT RNIN TR ALT NY ETN I MRI hed داه لالتحا الت اكد نات لعا بتكت مادا ALY TEATTATITIC Gaile ts TROTTER y wd اجون عه Soild اد حا ue ا ا ص ا ا اح ا Se ae ve SR د NE eee Ne RG SR ا EN احير ةمتع wR لاجد Sambal A د تمد دن مه لي لد SR AR Sr RN SE د A ا مر ندا الات تدا د IN OA ل ا SoA SN SNA مع وجي ضمي مر مدا اموجن اجججي ادج حون اود أو لحت جا جنم اه ادج جوع الود دوع لضام ام فر يض تف دجي فوا ADA اوج معان STORIE الم دالج جاب د جراد الكت باج لم يجا ZOTETTTATY ملظم اراد اناد اانا لام ال دا 48.3 Cp — جا 0 ؟ لمتحت : Wa الج اتاج انيتا دن ما اما لي اي اد ا د ا ا ل ل wd EXT wd حم كمد التختتاسة الاك a A NA أي يد NN NR SE AN NT SN Sy eR 443% ra aa sae gs he fr ياج erie اميت الا re hes TRS اتن هاي Se cv Sr prs مام اا vy AGSTTGATACE NTATIRTARD لاسا ا اتا تاجات امار م ماي CIETY لماجي لاما اام دي حب Se د ا nN م م مد كا مد اح لكر لضا ان ا كد ا اي د ما Nn ل لضا ل ل ل ب BI eS np حا جات NE Se SA Sn الات NL A SNARE eS TAT اكرات تيم vy 0 اس صا الا العام لضا رن ARITACAGIA اريم ا لجيه DL SS eS AGACTASTTE لا ا ¥ Fay دي جوع SENN و اا يا با وكا كاري لامي جام اي SAT كه مر ااه في باه يا ايا Nr ب Ya ا تاه اا Nr اجا ع كايا با كيرا اا لاا بارا لا A كي لكايه لحي له يه لش اح ا لو RTO ااا دجي الوا TN أو خا مات TTY MRR لاض ضاي امجن الج اوري ASSN لمجا الوح جاجح EA كما لب نك SEE SENS الا نا الوا اذ الما متكي اتا الكوام اناكم لال اك ارايت تمض ال a اما أ bY FP A حي PED الح د ا د يد ند ا ا ا د ا د د م د د ا م ا ا ا د د ا ل 0 كج RET ير ا توم لوعي ااي ATR وا او BTR ا را ال ا ل ياي صا TTY د STR الاي ا ARTI راضخو مرا نا نيا لاه بتكي اماك الل اكيت لاير دام نكرت لضت لضام اماه ترا ممالل Er DED wh YN Ne NS ا م ال م الا امد in INE مما Re, اا NSN A NEN Sn Ne NHN NS NS AN RN ل ا ل ل ا ل ل لاد باد UTA RRA اماقم جا وا اليكل ED WTEREERGITNRD THRILLER م عار متا مات تادامض WE ل A جا يا بد يي نب ايه Sa جاه بات ا جيه عا اجا جات تا يا A SA جد جيه A SS ER ايه با ااا جا د AS اه AT اداه SARA ااه اي ل تجاه به لم لاح Re TY لحي BN اع حر RE St PN RI NR aN TR IT Brn رحج TET لحمب LEY وو لد AGSUATIRSR لمعم لاض ا مااي ADASTTUARS امات قا مار Yay ad PAD wh eee ان a a A a Ra Sr ae Sa he Re fae SN fe Aare تا AN Rei Ae a Sa Nein IN SN AN Sn Si A a A دومج حو مض اب يي NA CT REY TUN RR, USOC RANTES CR RT الم ولحاي لاض BUTE UTRAFNTEY الالتسقة تا UTEFACATAD ATTITUDES SDIUSTAGRS امت اضاتمنة 3 Yo x FRY wi بجا لام رجي حجري TE SLD ATT اجام COTTE RR CIE NAR OR RRS TE TNS RIOT ITER ثرا TWAT INTIS اتيك لاا لاه ATAGRERITTD DAMACEATNY لاتغا الا لتنا YAY حي SEA ا FRE OWE يه A A a ااه Se RE TN A TR A واي TR A Ti i Se لا يا بايا يه NE ال له TN لحا ب اي جاجد AT A Se و ene EE rR لماع ا TS الي AES Cr AEE WLITHEL AIT EET STA UGRRET ERT ATEETLTRSE الا تا لت الت BAD wl a ie ل A ar د د يد د Nea ل eR Si م RN Sn re ne eR i a a ا TN RN JERTRINIA ا لا ل ANRGATTITS SENTENCES ا AEE Th] Toei aed 3 لبا a اميش FART wi TwLay 37 UTE wl ب 2 3 Pw رقمA ve Eri 5 . ا ا i. - 5 ال FET عر OE Sa EC جوج PA مدن لجرت مج لان دجي امج موجن Ch وي ارا واد من لمجا IR CT I Lo Np جد عي و حا LRN ترك ECR LER ACPI ST مالا الما لا الزن له للا ترات يا لاه ارا تلات لقال ET 3 ماما تاها لمات ب جمدي ل لمحتي د لاا اد يمسج ان ل زاتما لمان امه لم ارات م ده أيه لحا تيه و اح تي د ماد ترايت اتا حا لا اد مان REN ان حي ا ل ل بام Ye 3 TL TTT Br ROR {Tf hn TV IIE Th SN BY ILS uN I pe WY BR I CR TE At EL Rp te Seat X orem we SALAD ET UTE Ya املا NE ايك بي داه RE ae ا Re NE لماي مل RE Se Fn a Pe A و ايا SE Yl Si Vn بريه ب يخا له يداه ايه RE A NNR ليح NR Sr Se - SAA Sa Ae ايع جيم ا لاجراي اج حم لدابتم اي بي SCARE, YAMA مااي A ACSA EN ري اج Ys AN EAN AON SR ATEN دا دا ادلي الددامة ال ملاتا ا مادا SSN NREL اكالم RU RESIST الماك ااا مدال كاك الك اكات الاي ني 7 wed اماج THE اماي عات WIE Wa تدم Ne NR eR Re ae Re SR Ae Re a RRA ee RS SN Si Sir Sn Sir Tarn fa Ae A NA ا ين NIN EAR ON SAT (AI يت لم ارات Ea) AT NS SAN SUNTAN, YA SN AN AY OTEITTSTETY توج مما تكسا لق عم الست اتام been CTCARGGURT CTEIEITITA Res STII ra اذا كمرح ERGETE SR LOW اد SE ال ل ا الم د A اد اكات ا ود الا ل ان A د IN ATS AT SE A Se SR Se fh A ME A CIN RIE a TT ابنج حو ا وميا لضي لمجي احير واي ا م لوصا الدج مدت ل 0 Veda d I TIRE المالللك لكر اانا لارام اجات ران لا الاباك دا هاج امال RULTRATESRC لاسرا الام ارجات > IR ard اج الاناتمة Gali 3 UTR wid مها ادا ب بها جا وا ns ne Rn en ne أي فم با جرم SS mn Se ne a SN افو اه مايه عرد AR RS تاي بات ل لضي لاا F a : - = ~ ع اي ولح اج : TOA الا و ليده لمحم لجخي نجي + الج توي المي ب ضرا مضيو اجا ميجن ATR الما ميدي اوحض اموا در SATA لدج يي مادج اذاي م 0 AR BE RE ER RE SE ASRS SUBIR ASE 3 CR NE SRE LR GOERS BE TIER ad اا ا Cap OE TW WL ا Raa A Ae Sa Kr he Ae 2 A Se Fs ا ا on KE ATE EN NER ال لجا ب COTE R لاح ا اليك SONA بع اك دع دري عل لجيه لتحي ع TINIE لعي يي الاج دج لوج ا لجل 4 . TOCTARAETE DRIACATAGA اكرات ضار لاني تضم دض نيالنوا الا لزان ٠١1 TTRACRIZATEG ا ا لي AO TOO ا ا الس ا ا د ل ا Os I ل RE ال ل NNN 0 3 TAB IMEALaY rated WR LS Wess iaaas ade المااي باكرا عاد ناكا لاما تادالق ALAN, الكت ال A 4 + التو لق لجرا الس با ري اماق عقا لاض ا BATOREIORY ااا المتساقة 111 SUR RRNA NTO ل تت ل WN A EATEN DH الما يا NOIR الج را ا MR TR AVIARY AL 13 3 لاحت لاخر العو ااا ااه ااا امود اا لايق لوا ول لامالا مالا لقم خأو إلا ان aN ا اع Nate الحا و ماي ا لي جار ل رسيي ا TVR الاي ار ا ماي ا م IN ل اي ENTAIL الا بان TSS EIN Ren Ce a شما اشح الخد الام الشركة GID AMER AIRS ما اط 7 3 4 ابد واب BEY ONT AA Sn tS at اد رد ار ENCINITAS اواج WR A WSR الجا a NGS 3 : الم ضمي اال تالاقب موت امم صا ريد ابسحت ور اي اال جرح رجي لاسي لجن 111 ع فعا لات السك قف الكت ااي TARPTIEIYT ATTENDS الم كعة اضيا الس تتا 1 INT TET يجي اليل الوط رن افر واي تاد DE الس AR ارا سر ا رجت ارك موا لجرا NT STIR TONNE, يحت سج جح ا ا ا ا اللا ا اا ا ال مات اللاو رادار TERATTIENNG DITTSTIRAR. ا را ا تام ري CTY AEM لدي SN ENR دتمت مات اجون SOWIE pnd AEA احا د جح زم سمي أ رجي تا خأ ل ال ا الا اتا راتوا امت محقم لامعا اا ٠4 اجن لو لب اجن ENS SDR ابوت لديم YAR OI OD ORI NAR أنه NOSE A الح حيجن اميه حي المج وجي الدج او ايا الا التي مات RR PS IE 2 RE Re لا مايه A ER tN NIE Ee ENA SS اا 203 تام ممه Prev a 11 شكل .قو ؟؟ 4 1 25 ا للب-.6؟1- هوية Youd; ih CTGUALCCCTCTCGAGTH I TCCHUTTCACOGTTGGACT TG TACGUTG TCAGCATCGA “ربا عب GATGTTOCGTOGLGOAGUUGLAGACTICAGCLG TCACGGUAGHCG GCC TCTCACGGCATCTGTAGUTACGGGGGATTCCTTTCHC ACCGCTCGTTCGCTTTCCCTT CCTCOTCIGCCGAAATAATETTACACCCOUTCCATAGLCTCT هوية متوالية ركم 16 CTGOACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCOGTTIGRACTAGCTCTGCTGTCOGUATUCA GAAAATGOTIGGCAGTGUGGCAGACGTGAGLUGGCACGGUAGGGGERCOTCCTCC TG CTOTCACGGOACATOAAGOTACGHGTGATAGCTTGCCCACCHCTCCAACGCTTIOLCC TTACTCTCACGUCOTAATAAATACGAL ACCLCT TCC ACAACCTCT هوية متوالية رقم 17 10100001 تامع CTGEACCTCTCTCOAGAGT HCG ICC ACCGATEOACT TGC ATAATTTCCGTGOCGHAGCGOCAGACOGOAGCCOGCACGOCAGGGAGCLTLGTCOT CCTCTCACGGUACCTOCAACTACGOGUGEATTCCTATCCCADCGUTCCTTCGCTITCAC TRCTTCOOUC TCCTTAA TAAGTAGAC ACCOU ATCC GAGUCC TOY هوية ge الي YA as TCUGCTATCTGLATCC وو CAAGACCCCTCTCOAGAGTICCGCACCACCGTTOHRACG AGAAATTGOOTGHCOGAACGH TAAACGTGAGCCE TCACGGCAGHCGGCCTCCTELT CUTCTCATGACACCGOUAGL TACGHGGUATACCTETCACACAGCTCCTTCEOTTITNT TTCCTCGUCCGUOGTAATATGTATACACTOCCTCCGLACCCTCT هوية متوالية رقم 14 معد دوموك امو اوت الاق و0 ]0011 الوا وخا 1 قا لخم 00010000001001 وا لخ ا لمنقد 000 و ات تاليا الف CTATCACAGCACCGOCAGCTATGGRAGATTCCATTCCCACCGRTCCTGUGCTTTICACT GGOTGGCCCGLCGTEATAGATAGACACTCCOTCUACACCCTICT شكل رقم 1Y¢ دمااج ¢ \ _ جوية متوالية رقم + قات المعوا و0 وعم اق GTTGGCTTCTICTIGTGAFTTCTGCTICACGHATGHACTIUG GAATTTGCOTHGOOTAGCGHCOGACGTGATUCGHCGUGHUAGGCHGCITEC TOO IOC TCTCACTTAAGCGACAGCTACAGGOGATICCTTITCCCACCGCTCOTTCGOTTGCOGTA CUTCGOUCGICGTAATAAATAGACACCCLCTTCCACTCOCTCT هوية مثوالية رقم 7 ناتخ CTGGATCCCTCTICOAGAGTGCGOCTCOGACGTTGGACTTIGUTCCG AAG TEGGC AAAAATTGOGTGOTGGAGAGGCAGACTTRAGCCGOC ACG GCAGGAGHCCTCGTOCT ACTCGCACGUTATCGGCAGLAACGEGAGAATCCTIGCACTCTGUTCCT ICG TG TAL CTTICCTOOCCOROCTOATATTOA TAGACALCCOCOTECATACCOTCY هوية متوالية رقم TX كنا عمقت لمم معان رار غم ATGQACOUTTOICGAGTYGTTCOGCTOC ACOIFT ]00002010 4 )تن AGAAATTOGUGAGACHGAGUTACAAACETAAGARATC CCE لجف 0001010011 101:201 00114000005 00خ تا ACCU CCTCOGC ALTCTCT اح ]نض ا اكه لماعي ااال هوية ge الي قم ون CTGOACCCUTUTAAAGAGTTCCACGUCACCETTATAATOHCTCCOUTGTCHGUATCC AUTAAATTACTTIOGOGOGATCAGUALG ACEH TGAGCCAGE ATGOUTGOUGHGUC TCC TOOT CTUTCALGATOCCOTCAGUTACGGGHOATTCOTTICCCAACGUTCOCTTCGUTTTECTA TOCGCGUOTGCCGGATTAAATAGGCAGCTICTCGTCACCCICT هوية متوالية رقم VE ذعد ا معاماان العف 000 0001 اوعد ]0ن 171 لخر ود تافالا GAAATTGCTTOGCGAAGCOUCAGAL ATGAGCUGEUACGACATGCOTCCTCATTCTOC TOTCATGGCACCGOCAGTTACTGOTGAATCCTATOGCACCGOTCCTTCGUTRTCCCTT AATCGCCCOGUCGAAAATAATTGACACCCCATCCACALCCTICY شكل رقم VE ب هماتw= 3 متوالية J قم Agel GAGGACCUCTCTCOTOTGTATCGCTCCACCTITOOHAG TI TGOTOCACTATCGHLUGTALA GAAAATTCGTTGLOAAGUGGUAGACGTHAGCCTACACOGCAGTCGGCCTUTACCICE TOACAAGGCACGTGCAGCTACAGATOGATGUCTTTCCC ACCACTCCTTCGCGTTCCTTT ان مكنا نان اكات انخاس ا كاذ اناا انال هوية مثوالية رقم 16 CTGAACCCATCTCGAGTATGCCGCACGATCGATTIGACATGCTCCACTGGLAGUATOC ACGAAATTGCATTGGGHGAGCATCAGGUGTGAGUCTGCACGOGCAGOUGGACTATTCCT COTCGLGUGGCALCOECAACTACGGOGRATRO TTOACCG ALC GOTUCATCOATTICC CAATCTCROTTGOCOTATTAAATAGATAACCCOTTCACACOUTOT هوية متوالية رقم TY خخضب العو ملظت عدوت الت انعا ىق الفقه 0 1 7ن خاي TOUT ATCCAT ون الا وو عفن 00240 )و لاوح وى مضكضرقووو و0 لجان تتاف لمم مااع تنس اععف0 300000310010 الف 0000 تت عضخ ااال مغ وو اف الم مكمه ACCTCGTCTGUCATAT هوية ge الي Tih as و انه هة 001110111001 وو االمافحففقاة ا لانن ا TGC 011 “قم AGCGAATTGUGOGLGGUGGAGHGTCAGATGTGTHOCGGCACAGC CUTCACAAGGEACTEECAACTAUGGOTGATTCAT TICOTICAGC ACC TATGCTTACC CTGOCACGCCCTCCOTATTATAATGACACCCCUTCCALUACCTTAT هوية متوالية رقم 4؟ CTGOACCCCACGUGGGOGTTTICETTCCTCOGTTIGOEATAGOICCHG TG TC AGUATAL AGAGAATATATGTCOGOAGCGOAAGACGTGAGCOGACACGGCOGGUTGOOGUCTCET COTGTCACGACACUGLCAGGTACGGUGGGATICCGTTICCCECCGUACAGTCACTTTICG CTTCCTTGUCOGTCOTATT AAA TAGACACCHTGTCCACAGOUTCY شكل رقم ¢¥ z ذا—-\¢V- *١ متوالية رقي See CTTGAGOUCACTOTAGAGTTCCHT TTUACCG AN [ خاب لم لتقت رت تالاه الف TTAAGTGOEAGGCAGAACGTUATATGAGAGTCGGUACGGGAGGCOTTCGCCACGTE CHCGCACTACAGLGOGAGUTOCGGAATATACCTGTCCCAATGCTGCTACGCTTITCCC TTCCGCECCCACCHTAGAAANATEACAGTCOUTTCACALCCTICT 77 هوية مثوالية رقم TAGGAGGCCTCTCGAAAGGTCCGGAAUTCCGTAGGACGTGO TCCGOTGACAGCATCC AGGAATATCATGGOGGAGCTGC AGACGAGAGCCTOGACGACAAGOGGTCACCTCGEG CCGUTGACAGUTGCGOCAGUAACGOAGTATROTTTICTCACCGUTCCHGORCTTTCC CTTCGACOLAGGCCAGAATAAGTAGACATCAGCOCCACACOOTEY 7* هوية متوالية رقم 07100101 ده 110101452004 ]0 زرفي 1 ] م اجمعة لالن لالاان4ى GTTATIGGOGOACTOATCHRHCAGAUG TG AGU AGCACTOCA AACGGO CA ADTOCTICE TETOTCGACTAAGQUATTAATTAAGOATACCTTACCCGCOGCTCCTICTOTTICOCTA, CCTAGCCLGCOTTATTAAN TAO AGACCOUUTCCALAGLCGUT vy a. الي ge هوية بصمجنماو ىر لفوت ابوت 01ت تنما اا ممتي مقف 1 اعفان 0 106»: وجمكعواة مقن ا المت 00110060610 عات لاض CGC CTORUICCTC CTUTGGGAGCACCGOC AACAATGOGGGATTCCAAGCCCEC AGG “رعو 61746 GTCUTCGCLCGCCHTAGTATGTAGGUATCCLAGAGATTALCTCT Tid هوية متوالية CAGUAACCOTAACGAGGOTICCGCACGACCASATHEACTIGATCTTCTOTCGOUATCE AGAAATEGOGTGTCAGAGCGGCATOCGTGAGUCOOOGGGLGCOTGCGGOCTCATGOT GOTCTCGUGGGACTAGRAGTTACGOGGGATACCTGTATTGCCGCTCCGACACTETAL CATCCTCTCCCGOCGGAGTATAGAGACACCCOUTCHACGUCATAT شكل رقم 5 هد همأ-١ 0 Yo جوية متوالية رقم 001104046171 معو 001101001 الالفغانة روما لعفف GAAATTOUG “ووو TGATCTGOTGACGTTAAAGOGCTICTGCAGLGCOGCTTCOTTOGHE TATGAAGOTACTGGUOTCTGOAAGTGATOCTTTTIGE TAACTCGCCTICGATGTCCCTT الغا اتاو انان TAA TAGGTTGTUAGLUUGUTUUAGACCATTT 77 هوية متوالية رقم CTGOTCCCATOGCTAGTGOTACGUTCCACCGOTCGAGTAGUTCAGATHTCTGAAGGEG TGGAATTTAGAGGTGOAGAGACAGACGTOAGUTAGAGCGOGLCATOGGACETGGTOCA CCGOTCOAGUGCAATGGCAACGACTETTGAAACCTTGUCCACCALTCCTGOAATTTIC CATOCCTCACCGOCCGOANTHAATTAARACCCALGTCAC AALCTCT TY هوية ستوالية رقم COTGACAGGROTCGOGTHRTTUGEUTCCATUGTAGTGCATGCOUCGATGTAAGTAT AC AAGAAQTACOTOGCTTGOGOGTUTCACGAGOGGCOG TC AAGORCAGGUOGOOTCCTTICTA.AGUTTACGHCGLLGGC ARG TTICOTAGETTACCTTACACTO AAUTCATAGTCTATCTAT TACTOGT ALT ICOTIATAAANTTGTCATUCCOU TUCADACCOC TUT ha as الي ge هوية AGGAACGOCTIC TN GATOOTTOUGCACATAGOAGLGGACTTGATAGTOGOTOGAAANTCT AAGAATTGUATATCAGATETGCAGACGTTAGCCHACATGHU TAG وين عم مقس TICACACGTCAGCHAAAGUGACGOAGGATTTICT TOC UA مجم ممع وان لالد TTCOTCGUCOGTUCOGAAGAAAGATACTCCOCTIGOACACCCTCT هوية متوالية رقم 4؟ CTTGACTIGGOTCGAGAGTICTGOGUTIUCATIGTAGTIGCAGUGATGTCOGAG TCC AGGOTTGEGTGOCGETHCHECAGALGTOOGCAGATACGACTOTATGECAGCALCCTA AACATACOGGTACCAGAAGCTGOGUTGUOATACCTTTCCCGACGUATATACGTTITCCG TGQCOTCICACGCCGTAGTAAATAAACTCCCLCTCCTGTTOCTIT A YE شكل رقم هماتVea or هوية مثوالية رقم MESGALLFHG KIPYYVEMEG NVDGHTFSIR GRGYGDASVG KVDADTICTT GRVPVPWRTL VITLTYGAQU FARYGPELKD FYKSCMPEGY VOQERTITFREG DGVERTRAEV TEENGSVY NR VKLNGQGYRE DGHVLGKNLE FNFTPHCLYL WOEDOANHGLK SAFRKIMHEIT تلخ اموت عرق HTOMNTPIGE GPYVHVPEY HH ITYHVTLSKD VTDHRDMNMSL VETVRAVDCR KTYL 37 A هوية متوالية 155 اا انض KIPYVYEMEG بي 131117511 0010451 0 0100717115711 371 1717 و04 FAEYGEELKD لطا قاو امورو وى جاص EG DENFETBRAEV TFENGSVYNR VKLNGOQGFEK DGHVLOGKNLE 210 WODQANHGLE SAFRICHEIT GSKGDRETVAD HTOMNTPIGE GPVHVYPEY HH MSYHVELSKD 17151 KETVRAVDUR KIX 8 0 يج ad) Jed همأوج -١ - #سس 077 ] ال ا 1 — ا : ب ض > a 1 اس fo JA v 2 #8 TE ١ ض ##ااااي» ......... ب" ا Ce A ا بحسب Co : st iilht: You TE ١ ٍ ا - me جه ايج & شكل I م_ \ o \ —_ gor (WEI BAVA NAY ean يو ii SRE Re oe ٍ ! See ذا : i إٍْ ; لك وج ف i : 1 3 1 : 1.م ل 3 i N i i إْ B Tra 0 : مقع 1 : 1 > 1 1 با 0 0 1 5 : 1 & يخ &£ : 8: 1 ىن : 1 تب ل oo { Po * إٍْ ٍْ ف * ia 1 لأس اااي أ لاجلا ١ 7 شكل رقم : : ; يي 5 ' ل ير 1 1 ا حو ; 0 1 py 1 لش للد TAREE AE 3 i fe i 8 & ! x i & : Eo , 0 8 i Yeo 0 5 & i م م i & 3 £ i س0 ْ' ا باعل » حر Yi ® شكل رقم YY ب ذا_ \ o \ — لي BRET لضفا Bed¥e¥ RaW H : H H : : H H : : 1 i : : 1 H : 1 Ser 1 H : H H H H H Ere : i 1 i 1 a 1 : 1 4 i : 1 es ل 1 & 1 i 8 ' 3 i : 1 : « H & 1 ْ: . <0 ws You 4 : 3 0 اام = H : 1 Fd : & 1 ; | 0 ' i : $ i Ae * 4 ٍ : 1 1 إٍْ 1 H : H i : 1 : إٍْ i LJ on ~ ~ 1 i : i H H H H i : 1 Yes i 1 1 1 شكل رقم 8؟ أ i 4 § A ¥ BAT BAYS اتدل ادا 3 ts} : " ¢ N wn = : : م ا : 8 :& . ¥ ) . 2Yo. Fi R 8 # 7 > x LEN oe د : 3 لاا الهم اا كك & ® five_ \ o Ad —_ لا اد الما IO WHT ضام BAY warn ¥ LN J, Rest 3 3 ¥ 3 1 i 1 i 1 i i i i i 3 i ow 1 : H 13 i Fd 1 i = 1 Wer ذا E i 1 i 1 ; : 2 3 > 1 > 1 إ x Pos 1 3 HI 1 LN H 3 EY + ~ a x 2 : إْ ُ i : Ld ) OX i $ 5 4 1 ب HN Ek i = i £ § 1 RX 8 1 i i Bes i 1 i 1 i 1 i 1 4 i H 13 i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 ان نا 1 i 1 i 1 i 1 i 1 i 13 Frere ree ee لب يي: . f va ad 3 شكل Gi a i Ro i 1 1 pan a 1 0 : 5 ا ا 5 gin BRIT BAU LARS avn 1 ب : i i 1 ) 7 i i i 0 i i i 1 td i i i 3 i i = i له 0# ا ٍ 8 ل . he § 0 : = i < . Lr 1 N © ن 0 ب a H » 1 1 0 ٍ : - ~ ¥ § 3 0 i R ; 1 ب 5 3 3 & 0 i » 5 م ببس ا 8 “ل > i = & H oo F i \ { i i * I I a شكل قم 4 ؟ . رقم \ tive— \ o ¢ — + gaan mmm AAA ا NanayYY. i . . i [RE ١ R i Youd 7 إٍْ أ ا ; : i الج 3 § i 43 i i a FURIE SOV SRC oe يي ood ال Es Jove لاا St I HE Sine لأست EE B ١ I v Tol Ja ب زا ا ١ 1 1 - سس به بيات شكل .أ ١ + : يسَعَعْعهستمي لبد٠|[|[|[_ديتت ا ب : : ) i i : إٍ ا H carn, 1 & 0 1 1 == ? Tw do »َ I ا ؛ ا م الا مم Ee : ‘ الح ب ا N الب ب PR EA! K تحجر لاحك ب الال" . . ig Re tive— 00 \ _ nanan ص3 8 - re 2 SN . 3 Teo 3 2 14 الك .تا 3 مسيم سي ا كحك LAY eT ١ الخ اعم IEEE مكب شكل 1١ 1 [ ار ) gt | 2 مج سي 0 . الما . rei 7 تسوت ATE ا لد ا نو زاج لك سلا ل شكل TY tive_ أ o \ _ Yous ee : PR حيبت اميه 0 ا 3 3 5 gens : & الال اا 5 CE 8 ا 1 a The sii, > EN = سات تاج oo bat g A 0 بي« يأرب ١ يليا + ملعا الاين شكل رقم PY y 8 ك4 : سد ب a ل $ Le 5 Fe . srry - ¥ < ب Ea ENE = wed = #8 إ hook 3 0 0 = م od re 1 1 : £3 pr ¥ FERN 8 i wg Tee = > + . ا تحن ال > حا تن لاحت اح RS EN # ا ٍ yoo 3 0 ل جو و جا و مج جا وج سه ِ* ASOT ١ LAY PAY RAY =« 8 ير 1 ب ¥ of : شكل رقم ١ با دما_ \ o 7 _ قفا Sant WARY tam gu] 08 5 ب oN x a < The i Yer J 3 * ب 1 ا 4, 2 0 . g 4 > هدجلا & 3 08 ٍ 8 x > > ص" 5 5A . م « > fo LR 1 موا pS ig ® vad شكل ا لاما كالما لوقا Lav ريو i ds Libalh SRR aR fi TERI i i i i 1 i k| > i i i J i i i E ا | i Ye xv ا i 0 > i i i 3 i 3 > | i 5 4 N i kd 1 . i & i £ * i i | ا ب حمر ب i 0 اب i i . i [ye A ~ : i i i i i i i i i i i i i i i i i 1 i * i i i i i i i i i i i Ed 5 >, 0 ad 3 0 ot vy شكل رقم دماo A —_ \ _ — جر ا ا ب يد 0 ال ا 5 0 TE : م م" ض 0 i | : ٍLY. : oF x *® - من as Ws a ينا fee ض Se سمي :8 تب أ اا سحلي رقم ¥ 08 ذا_ \ o q —_ ا jt [+N eo وب A ; . PRN . + 4 > 4 on ادا الا SP 8 ناا الات م LANL YY دكا اند AVY 3 3 * 2 = مج 1 ب 4 اي A5 . FN© x. 1 0 ¢ A اي حي ware اماف£i.. ل NA 8 > ENE رج 0 ™N TT Ta SES 4 شكل tive-م7؟5- حيبت ay . 4 ا كا حب : TNQa. 2 . شي ERIE لأست FB es Sl NL ٍّ .ام 4 ل ا ta. 4 0 I TR TN RY ae خا خا ل ind ماج five-١11- vs BMI BAY BAY han ar 4 DW اكلام W ay fae df ٍْ مو ٍْ إل اوج : 3 ; 3 i ; % We 4 0 4 Lo 1 fF 1 »> Rey ل 3 1 : 8 ال A “© 01 . : & 1 9 J + يك : * ~ - iw " 7 av <* د ~ ٠ شكل رقم {of oe 5 THEL BAG BANE arn 3 Rew & : 2 8 1 0 a : pA =: 2 » a ; i ب PR >. ال" ل جر 0 Ye شكل ب Toad, همات-١١7- ا ا ل Yie Tin : 5 1 We ض . : i We ض * . « We : ved J 0 اث علا | * : WW ض اا ال امل . : ’ 5 8 a Yo al ذلا sneer ary LPYa. Eos > z 44 ؛ رجا 7 , ~ Nin, > Ya ct, 1 SN i = 7 i a Ah EE 7 ICN a LANE em لحل لات سمت بعت سام Vora) AA THAN لحا AVES Sem re م + كل اس سي أ خخ راعجVE.Sh. teed : :904.4 . ERR 4 خض ؛ ساسع ا ال درف متا اك ا ا ال 5 ال امس صب د H 3 م Fo, jg ] EN ا i > تع خب ّّ iLa. tsa الام اا ل ا د ال te a . ؟ فب ١ نك دمادب بريه ا ال أ اي ا 1 Si أ املا you Na Ra ES x, ب ١ ب 8 3 8 ب & i od it EY ا 8 FEY wad rsd 8 3X 8 3 0 RS RY SF 8 x es ge 0 8 8 و( x: ey ¥ خا 0 ا ب 8 :8 Haman = + Bi # KC ب : 0 يس YAY 5 8 1 * الاي * يو : ّّ EN ال eg ey ايك 0 غ8 لضن a : ل أ ا امسا a Ts a RN جلا اي os ing & aa Ra =» a ESN 8 تا Vie of Pu Sm Teg = اااي Saosin i E Nie a on م ال EN oF Ty, PE Fe ال اا اي ig wn 1 a HE Na fay a ا بي ل ال مط اين SF EE Fe ا 0 fons TR 1 8 16 TR ور Bm RR EE ¥ % A : 1: F L ب ا 1 1 % 0 2 x S : ا اب 1 MR الخد تداز اا ل 007 ig Se | ا اا ٍ الما 7 ل ال + ذا-١؟0- woo للف MAM 0 الما 000 لما ّ 9 a = : on I > BH zt . ; won N 7 3 ب : : : 3 2 ; al 1 ke & & م > د 3 . J #ْ . 2 0 ا ١ ١ S 3¥. ل $ x Ps PY رقع LA " اللا moa لوهم anh 7 ana ¥ TUN 1 اوددج مسر = . 3 : ل 3 LEE ) . hod Fon ب 5 ¥ava | . LER TY . : : م 2: H ¥ a N 4 - ¥ Rew a i KA ا 1 | م 8 ب TV شكل رقم همأ-١١7- RR IR+ . 4 : ) . 2 2 a > = £ i0 . N + ب : 3 x 4 ل“ . 0 5MN . ¢ , § 5 0 *ِ 0 E 7 y تت م & . . E x = on B FEA شكل رقم 0 لحن اذ 2 4 IIIT0 .= . C4 Yon uf : مرج : 5 . Ks 0 # 8 é A 0 i : 8 2 , y 3 2 ب TA شكل رقم دما-أ١- ban GA اانا للف Yo | : 2 g of : - : : 1 = : : :ْ أ & N i 4 ¢ ~ ra ¥ | Ly : 7 i N : 0 8 سب 3 | ’ SE ¢ F إٍْ مر 0م ض . 6 & : إٍْ ol - لمسممسسساسمسسابلللللسبسسسأة ١ شكل رقم 4 أ : ام ال on : ا ايل on : ب ل - ; ny ST 1 3 إٍ 8 0 5 0 أ eve * يح ® بيقع » N % »اج & iy ل er 3 * ® 1 د LB 8 » ¥a. # & & 3 # حلا gene 0 § 0 Ax aa ® & : م اليد با ب x ا اجام ملا م {Le ا ا Jed رقم أل ا دما-١ حم لاما لضفا 0 للا ل Bana * 4 N "te . of : N : = i : 8 0 7 [a] i 3 Fe i + ‘ ¢ 4 $ i Pa : : § O i 3 ; vd 1 0 قْ : إٍْ 0 إٍْ = 3 3 = a نع i N & اي Vo KN N i & CL بتشسس_سس تسسا ل = ب ل ٍ : شكل رقم ف التق الل NMA BAW hav Wes : 3 " 3 : <3 3 1 3 يحل با ا 0 N : : Ses ا H . 0 ; 0 0 0 N 7 م با« pees) : 5 ® ht & شكل رقم همأSRLS . BOYER لما هذا BAM 0 ف م \ A J — <I0. To ) ض : : ب ؟ : H { - & & 0 0 pr] 2 م } ١ £ F & 7 . > * _ od ٠- ض ل 3 ber بم 51 رقم ذا_ \ 7 «= ليميالا لمعا متا لس ما ا 1 ‘ ; i1 . ٠ وا i 2 Lo : * 8 oy 5 i : Lvs 8 اا H jog a a cad i. >< ادح اللاو مات حت FO B= = == . : H Ae : H H RN 3 vee لاا a Tras VORWEA LY SAYA Xe AVINTLOAVY شكل تا ا re 1 ¥ Noa : - : ع Fee - [3 FENN " .Re... ١ . By 4 3 | RRP . pee H Fron A wks SCN AER Do 3 3 a TOTTI TI VEYA VaR A !جح ل تجا1 . NET. شكل ؟ tiveل ا : 34 . : - سس 3 LA ١ 4 i FRE S| لي ER I Se ae Ee Sa . لق سس ا i H i ا 3 ; : جم SR iN وان ور I ل يا BRA SR IND A RR RE a ال HIS شكل ؟؟! من د ا أ م , | 2 eid “© : 2 T ] i oo 1 الس حا 1 3 R 1 1 4 مم . > - اسن St DU] ACN "7 1 ال ا ا شسكل لامب دما‘ I لاا نسي اي ب -i! . ad : 5 31 : : & i ta } ارد ع جور لكا 0 : لمجت مها بيع جز 1 ik vill PY = واج اسه سا ؟ S| N H td : 1 i ne, : H . rene pT, = توا سار ل تح L.A RA وجرا ١ ذا تكح لشيس اا Daw | > [EI - HY > 0 = : . Son . Trias 1 : . 2 § 3 . < : ّ 8 اا الب : 3 الح 1 H < > oer oe [J EN ag ال ORIEIERRE 3 الاي .ل — امت ١ متم ١ خا خا لطب EPI N wi Sl tiveالم ا اا اس : 4 ‘ لد H - . = a 8 : Toa 4 : 0 H 1 4 2 Fei a i eed Tw SR . 579 : ا مل 3 : 3 7 :0 ١ 1 ¥ ,: . الج حب ha : 3“ 9 Pate I Prana c Sa Seana امف ع ل بارت خب 3 اطي ل لمحتا داك اا = دخ 3 Ie 3 BE) 0 8 i Fa - SN N أ 1 0 ]8[ R 3 = he 2a . 0 3 3 has H اج ae - ب اسح حا SE =i SR الع تحب ب 1 ا ا > لحك ١ كلاخ محم ا عر اج 8 شي > El دي-١١76- 3 - ZV : 2 B . & 00 1 = 1 2 & a : Bo H 1 حم لكت 1 1 Ll : of Po HE acs Fe NAV EA YL 2A LAVIN OY Lay لسك 5ج ٍ دي-١/ه- لتاق اي MBAR رما tag معجا - : Tuow Yan + دجولا = ea 3 LEE J N - fi XE +: ُّ * : > ) - ب 0 a N i ب ّ با = لق TN TARE SRR, 2 م » EY ad Jed Vas LoTR الها لاد “rey REESE Ras Ea Ra thes د . Fos 0 ; ‘ : ; Ber | , ; & : : p | 9 bey | 1 ٍْ N {ve 4 . . : i seed + = . . om 3 eM نل لسلساة 0 يب LV شكل رقم اب EV aly دما-\Vi- ree ROMA امامت BAVEY bana Yee 4 : Yoon . . م » 4 ; > fore : : 3 إٍْ : 0 إٍْ جٍ : : L%] Ke > i 0 8 fu TS [3 | rr باجا ات اليب : Ey ج 5١ رقم Jed yoo oo 40 LOAM Wave wav We - ) م ٍْ ‘ 9 . = يهلا wd > N 8 2 H 5 5 S | £3 & 01 . N 8 ٍ ;] . 1 : . pe B 36 شكل رقم ذاٍ ابيع ١ رك « اط > iin ae dE Ee :a . 1 I 3 8 ومس د د a اكد نا ل ل د ال ل ا1 . < اس 1 A 1 - 8 انا LJ 5 ١ 3 3 N Ba : H ابن اص ا “ با عي : + الف ]= Sar” ب Ly . 9 a To ETE ) AAA SE re dE : 0" Sect أ EA ALI وي ا ا د ل ا ل BUN FS tiveEE نا : 1 Toad . 1 : ٍْ 2 : نارم wT 1 J : . 3 : المت 8 Eh 2 2 جيه + ل : : 5 = هيا مي الب Pa [REA . B SARA اا 00 الما اماه LLAYEY VLAN iA دحا جه EAS ب سكسس مسسسببسسهاآتآ1 Xa. v * » de, 1 : . و اسح ححص مي TT emt لتب RE | 5 z H rT ~~ ER سي مليف VAIN ١ اممف ؟ املف شكل SEA دما-١4- LOMA MAY bavw جيرج جاو ; & Tena ~ : N > N ا م جح 2 50 Ll > 7 0 1 {£4 رقم Jed ones DOVER BAM BAW havi ا 8 8 د وجول تا xe > : : & of Sten * ا A Yo“ Gree UO لمسمسسسس £8 اه tex رقم 8 لبا Jed دما_ \ A «= eee HONEA BOA BAY AYR i Wass 4 ْ * م 8 by > > كم يريم . 5 N EH i : $ 1 o ] ’ & & ةا i N . $ : : ’ N Os XX 4 : :i . i Fa + ب . 1 a & z £8 رقم Jed pees الفلا BOA GARY wav HEL : Yared © i = 1 : Seed N £ 1 3 0 i 0 + 1 08 J & 4 8 8 A El UU UU UE. - شكل رقم 4 د دماأ فارع ٍ و27 ACIRS BY . i احا لامبa. SS 7 3 [ral SN 5 ٍ 0 aa 58 5 ميت : ا " 1 0 Ne cll i 3 : SIU Se نس تسسا ٠٠.١ 8 ف 0 اا ا Sana م ا ا م الاك LLANE ١ زكر اها BS 7 ا نش =e Yau ——— ١ : \ . ا 8 LI LF AD A ز حو »ب y اد د : ل ان لاطا : ERE fre 0 = اك إلا 7 با Saab EAT RANA YL ARI AYA SS .دب tiveSUSU M H : .4 . . : H ¥ Ral . a : i R و : & اه 3 =o G Eee TRE ad al . ~. : ON ولحت . TSR ا ا ا as mney كام ولأ EATA ب AVEY Yaa ~~ RS or rt Wo Ta 5 م ١ IEE© . fe Veo . & ١ i § Fe oie > انق “ته ممم 7 Rai لنت - ee soll 01 اتا ناا سسا ل م Se دا ل ا لجاب تجا م الي ميد 7 1 CLEYEA LEAN YAY yy Lavy SF us 7 tiveمدة سريان هذه البراءة عشرون سنة من تاريخ إيداع الطلب وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها أو سقوطها لمخالفتها لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية صادرة عن مدينة الملك عبدالعزيز للعلوم والتقنية ؛ مكتب البراءات السعودي ص ب TAT الرياض 57؟؟١١ ¢ المملكة العربية السعودية بريد الكتروني: patents @kacst.edu.sa
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161582138P | 2011-12-30 | 2011-12-30 | |
US201261617252P | 2012-03-29 | 2012-03-29 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SA112340162B1 true SA112340162B1 (ar) | 2016-02-22 |
Family
ID=48698500
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SA112340162A SA112340162B1 (ar) | 2011-12-30 | 2012-12-30 | جزء منشأ وطريقة لمعزز النبات ubi1 التصنيعي ثنائي الاتجاه |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9422569B2 (ar) |
EP (1) | EP2797406B1 (ar) |
JP (1) | JP6220794B2 (ar) |
KR (1) | KR20140107334A (ar) |
CN (1) | CN104135851B (ar) |
AR (1) | AR089510A1 (ar) |
AU (1) | AU2012363062B2 (ar) |
BR (1) | BR112014014037B8 (ar) |
CA (1) | CA2855902C (ar) |
HK (1) | HK1201121A1 (ar) |
IL (1) | IL233452A0 (ar) |
RU (1) | RU2639538C2 (ar) |
SA (1) | SA112340162B1 (ar) |
TW (1) | TWI601739B (ar) |
WO (1) | WO2013101343A1 (ar) |
ZA (1) | ZA201402992B (ar) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR102014021330A2 (pt) * | 2013-08-30 | 2015-09-22 | Dow Agrosciences Llc | construtos para expressão de transgenes usando elementos reguladores de genes de ubiquitina de panicum |
TW201527316A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(五) |
TW201527314A (zh) * | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(三) |
TW201527312A (zh) | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(一) |
TW201527313A (zh) * | 2013-12-31 | 2015-07-16 | Dow Agrosciences Llc | 新穎玉米泛素啓動子(二) |
TW201617451A (zh) * | 2014-11-11 | 2016-05-16 | 陶氏農業科學公司 | 合成雙向植物啓動子 |
TW201619386A (zh) * | 2014-11-11 | 2016-06-01 | 陶氏農業科學公司 | 合成性雙向植物啓動子 |
US10563220B2 (en) * | 2015-12-21 | 2020-02-18 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for efficient targeting of transgenes |
CN105624163B (zh) * | 2016-04-06 | 2018-07-06 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种来源于棉花的双向启动子及其应用 |
CN106676107B (zh) * | 2016-04-28 | 2019-04-05 | 华中农业大学 | 水稻内源双向表达启动子的分离克隆及功能分析 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5750866A (en) * | 1994-09-08 | 1998-05-12 | American Cyanamid Company | AHAS promoter useful for expression of introduced genes in plants |
US6072050A (en) | 1996-06-11 | 2000-06-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Synthetic promoters |
US6388170B1 (en) | 2000-04-07 | 2002-05-14 | University Of Kentucky Research Foundation | Bidirectional promoters and methods related thereto |
AU2002250064B2 (en) | 2001-02-13 | 2008-01-17 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | A bi-directional dual promoter complex with enhanced promoter activity for transgene expression in eukaryotes |
WO2005019459A1 (de) * | 2003-07-22 | 2005-03-03 | Sungene Gmbh & Co. Kgaa | Expressionskassetten zur bidirektionalen transgenen expression von nukleinsäuren in pflanzen |
US8344211B2 (en) | 2008-08-13 | 2013-01-01 | Ceres, Inc. | Plant nucleotide sequences and corresponding polypeptides |
ATE482277T1 (de) * | 2003-12-31 | 2010-10-15 | Council Scient Ind Res | Künstlicher bidirektionaler promotor zur aktivierung der genexpression |
US7235652B2 (en) | 2004-03-31 | 2007-06-26 | Council Of Scientific And Industrial Research | Artificial bidirectional promoter for activation of gene expression |
WO2006005023A2 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Ceres Inc. | Promoter, promoter control elements and combinations, and uses thereof |
EP2166104B1 (en) * | 2004-08-02 | 2013-06-12 | BASF Plant Science GmbH | Method for isolation of transcription termination sequences |
EP1910544A2 (en) * | 2005-07-27 | 2008-04-16 | BASF Plant Science GmbH | Selection system for maize transformation |
TWI361220B (en) | 2005-08-02 | 2012-04-01 | Univ Nat Taiwan | A plant shsp gene bi-directional promoter and uses thereof |
CN101351555A (zh) * | 2005-09-13 | 2009-01-21 | 巴斯福植物科学有限公司 | 用于小麦的新选择*** |
DK2205749T3 (en) * | 2007-09-27 | 2016-08-22 | Dow Agrosciences Llc | MODIFIED PROTEINS zinc finger, which target the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes |
EP2379723A1 (en) * | 2008-12-17 | 2011-10-26 | BASF Plant Science GmbH | Bidirectional promoter from z. mais |
CN102573452B (zh) | 2009-08-19 | 2015-07-22 | 陶氏益农公司 | Aad-1事件das-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件特异性鉴定 |
EP2385129A1 (en) * | 2010-05-03 | 2011-11-09 | BASF Plant Science Company GmbH | Enhanced methods for gene regulation in plants |
CN102933712A (zh) * | 2010-06-09 | 2013-02-13 | 纳幕尔杜邦公司 | 用于在植物中调节转基因表达的调控序列 |
BR112014014029B1 (pt) * | 2011-12-30 | 2021-12-14 | Dow Agrosciences Llc | Polinucleotídeo compreendendo um promotor bidirecional |
-
2012
- 2012-11-12 JP JP2014550292A patent/JP6220794B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-11-12 CA CA2855902A patent/CA2855902C/en active Active
- 2012-11-12 BR BR112014014037A patent/BR112014014037B8/pt active Search and Examination
- 2012-11-12 KR KR1020147017801A patent/KR20140107334A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-11-12 CN CN201280070882.8A patent/CN104135851B/zh active Active
- 2012-11-12 US US13/674,606 patent/US9422569B2/en active Active
- 2012-11-12 RU RU2014131448A patent/RU2639538C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-11-12 EP EP12861436.9A patent/EP2797406B1/en active Active
- 2012-11-12 WO PCT/US2012/064683 patent/WO2013101343A1/en active Application Filing
- 2012-11-12 AU AU2012363062A patent/AU2012363062B2/en not_active Ceased
- 2012-11-27 TW TW101144314A patent/TWI601739B/zh not_active IP Right Cessation
- 2012-12-27 AR ARP120105034A patent/AR089510A1/es active IP Right Grant
- 2012-12-30 SA SA112340162A patent/SA112340162B1/ar unknown
-
2014
- 2014-04-24 ZA ZA2014/02992A patent/ZA201402992B/en unknown
- 2014-06-29 IL IL233452A patent/IL233452A0/en unknown
-
2015
- 2015-02-16 HK HK15101716.4A patent/HK1201121A1/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2012363062A1 (en) | 2014-05-15 |
IL233452A0 (en) | 2014-08-31 |
RU2014131448A (ru) | 2016-02-20 |
CN104135851B (zh) | 2018-05-01 |
CA2855902A1 (en) | 2013-07-04 |
TW201329097A (zh) | 2013-07-16 |
AR089510A1 (es) | 2014-08-27 |
AU2012363062B2 (en) | 2018-04-12 |
EP2797406B1 (en) | 2020-01-08 |
ZA201402992B (en) | 2015-11-25 |
US9422569B2 (en) | 2016-08-23 |
BR112014014037B8 (pt) | 2023-05-16 |
CA2855902C (en) | 2022-06-21 |
HK1201121A1 (en) | 2015-08-28 |
EP2797406A4 (en) | 2015-07-15 |
JP6220794B2 (ja) | 2017-10-25 |
BR112014014037B1 (pt) | 2022-06-21 |
WO2013101343A1 (en) | 2013-07-04 |
KR20140107334A (ko) | 2014-09-04 |
BR112014014037A2 (pt) | 2020-11-03 |
US20130254943A1 (en) | 2013-09-26 |
JP2015503342A (ja) | 2015-02-02 |
EP2797406A1 (en) | 2014-11-05 |
RU2639538C2 (ru) | 2017-12-21 |
TWI601739B (zh) | 2017-10-11 |
CN104135851A (zh) | 2014-11-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SA112340162B1 (ar) | جزء منشأ وطريقة لمعزز النبات ubi1 التصنيعي ثنائي الاتجاه | |
Escobar et al. | RNAi-mediated oncogene silencing confers resistance to crown gall tumorigenesis | |
Nishimura et al. | Isolation of a rice regeneration quantitative trait loci gene and its application to transformation systems | |
AU2017203177B2 (en) | Constructs for expressing transgenes using regulatory elements from Setaria ubiquitin genes | |
DeYoung et al. | The CLAVATA1‐related BAM1, BAM2 and BAM3 receptor kinase‐like proteins are required for meristem function in Arabidopsis | |
Schaker et al. | RNAseq transcriptional profiling following whip development in sugarcane smut disease | |
Chen et al. | Evolutionary and molecular analysis of D of transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking | |
AU2019246914A1 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
KR20080083145A (ko) | 구성적 식물 프로모터 | |
Yoro et al. | PLENTY, a hydroxyproline O-arabinosyltransferase, negatively regulates root nodule symbiosis in Lotus japonicus | |
SA112340163B1 (ar) | طريقة وجزء منشأ لمعزز النبات scbv التخليقي ثنائي الاتجاه | |
Royo et al. | Two maize END-1 orthologs, BETL9 and BETL9like, are transcribed in a non-overlapping spatial pattern on the outer surface of the developing endosperm | |
US20230203522A1 (en) | Compositions and methods for expressing transgenes using regulatory elements from chlorophyll binding ab genes | |
Luo et al. | The MYB family transcription factor TuODORANT1 from Triticum urartu and the homolog TaODORANT1 from Triticum aestivum inhibit seed storage protein synthesis in wheat | |
Jian et al. | The miR319/TaGAMYB3 module regulates plant architecture and improves grain yield in common wheat (Triticum aestivum) | |
Zhang et al. | Genome-wide identification, characterization and expression analysis of TCP transcription factors in Petunia | |
Yang et al. | GRP23 plays a core role in E-type editosomes via interacting with MORFs and atypical PPR-DYWs in Arabidopsis mitochondria | |
Grogg et al. | Callus induction from diverse explants and genotypes enables robust transformation of perennial ryegrass (Lolium perenne L.) | |
Ma et al. | GmTNRP1, associated with rhizobial type‐III effector NopT, regulates nitrogenase activity in the nodules of soybean (Glycine max) | |
Yuan et al. | Evolution and functional divergence of SUN genes in plants | |
CN103255165B (zh) | Soar1蛋白及其编码基因在调控植物抗逆境胁迫中的应用 | |
Zhang et al. | Functional conservation and divergence of five AP1/FUL-like genes in marigold (Tagetes erecta L.) | |
CN103232536B (zh) | Soar1蛋白及其编码基因在调控植物对aba耐受性中的应用 | |
Sun et al. | TsMIP6 enhances the tolerance of transgenic rice to salt stress and interacts with target proteins | |
Xiao et al. | SiPLATZ12 transcript factor regulates multiple yield traits and salt tolerance in foxtail millet (Setaria italica) |