RU2820088C1 - Выделенный модифицированный белок VPI капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе - Google Patents
Выделенный модифицированный белок VPI капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2820088C1 RU2820088C1 RU2021124727A RU2021124727A RU2820088C1 RU 2820088 C1 RU2820088 C1 RU 2820088C1 RU 2021124727 A RU2021124727 A RU 2021124727A RU 2021124727 A RU2021124727 A RU 2021124727A RU 2820088 C1 RU2820088 C1 RU 2820088C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- capsid
- insdqualifier
- insdseq
- modified
- amino acid
- Prior art date
Links
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 title claims abstract description 208
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title claims abstract description 145
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 87
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 title claims description 72
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 title claims description 72
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 269
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 184
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 claims abstract description 166
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 24
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 166
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 163
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 101
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 67
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 67
- 101710197665 Capsid protein VP2 Proteins 0.000 claims description 62
- 101800001319 Capsid protein VP3 Proteins 0.000 claims description 43
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 claims description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 25
- 102220584357 GTP cyclohydrolase 1_G90V_mutation Human genes 0.000 claims description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 22
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 22
- 102200044877 rs28931589 Human genes 0.000 claims description 22
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 13
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 9
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 7
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 26
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 20
- 238000010361 transduction Methods 0.000 abstract description 18
- 230000026683 transduction Effects 0.000 abstract description 18
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 202
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 173
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 145
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 102
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 102
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 92
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 73
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 57
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 54
- 101000805768 Banna virus (strain Indonesia/JKT-6423/1980) mRNA (guanine-N(7))-methyltransferase Proteins 0.000 description 52
- 101000686790 Chaetoceros protobacilladnavirus 2 Replication-associated protein Proteins 0.000 description 52
- 101000864475 Chlamydia phage 1 Internal scaffolding protein VP3 Proteins 0.000 description 52
- 101000803553 Eumenes pomiformis Venom peptide 3 Proteins 0.000 description 52
- 101000583961 Halorubrum pleomorphic virus 1 Matrix protein Proteins 0.000 description 52
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 45
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 22
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 14
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 8
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 8
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 7
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 5
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 4
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 4
- 102100021947 Survival motor neuron protein Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 3
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 3
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 3
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 3
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 2
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 101000617738 Homo sapiens Survival motor neuron protein Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101710171779 Survival motor neuron protein Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- VJUSDOIKMJHJPN-UHFFFAOYSA-N diseptal B Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)NC)=CC=C1NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 VJUSDOIKMJHJPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 2
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101150057323 sar gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 1
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000689227 Cora <basidiomycete fungus> Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 208000027219 Deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000121256 Densovirinae Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710195291 Hemoglobin subunit gamma-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101000801619 Homo sapiens Long-chain-fatty-acid-CoA ligase ACSBG1 Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015178 Hurler syndrome Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 206010056886 Mucopolysaccharidosis I Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241000121250 Parvovirinae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 1
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 101800001295 Putative ATP-dependent helicase Proteins 0.000 description 1
- 101800001006 Putative helicase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 241001420369 Thosea Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 201000009628 adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007345 glycogen storage disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000007180 physiological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- -1 without limitation Proteins 0.000 description 1
Abstract
Настоящая заявка относится к области биотехнологии, в частности к генной терапии и молекулярной биологии. Изобретение раскрывает выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который содержит одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые повышают эффективность трансдукции, повышают эффективность упаковки вирусных геномов AAV препаратами на основе rAAV5, а также повышают эффективность продукции (сборки) вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5). Указанные аминокислотные замены выбираются из группы: a) G226V, b) S2A, G226V и T711S, c) Т614А, d) S2A, Т614А и T711S, e) T614V, или f) S2A, T614V и T711S, где аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. Изобретение может быть применимо в генной инженерии при получении векторов для доставки генетических продуктов нуждающемуся в этом субъекту. 9 н. и 51 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая заявка относится к области генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который содержит одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые повышают эффективность трансдукции, повышают эффективность упаковки вирусных геномов AAV препаратами на основе rAAV5, а также повышают эффективность продукции (сборки) вектора на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), капсиду и вектору на основе вышеуказанного VP1, а также к их применению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой (25 нм), неспособный к самостоятельной репликации, безоболочечный вирус. У человека и приматов описано множество различных серотипов AAV. Геном аденоассоциированного вируса содержит (+ или -) одноцепочечную ДНК (ssDNA) длиной около 4,7 тысяч нуклеотидов. На концах молекулы геномной ДНК располагаются инвертированные концевые повторы (англ. inverted terminal repeats, ITRs). Геном содержит две открытые рамки считывания (англ. ORF): Rep и Сар, содержащие в себе несколько альтернативных рамок считывания, кодирующих различные белковые продукты. Продукты Rep имеют важное значение для репликации AAV, при этом ген Сар, помимо других альтернативных продуктов, кодирует 3 капсидных белка (VP 1, VP2 и VP3). Белки VP1, VP2 и VP3 находятся в соотношении 1:1:10, образуя икосаэдрический капсид (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:10405-10410). При образовании рекомбинантного вектора AAV (rAAV) кассета экспрессии, фланкированная ITR, упаковывается в капсид AAV. Гены, необходимые для репликации AAV, не входят в кассету. Рекомбинантный AAV считается самым безопасным и одним из наиболее широко используемых вирусных векторов для переноса генов in vivo. Векторы могут инфицировать клетки множества типов тканей, обеспечивая эффективную и устойчивую экспрессию трансгена. Они также являются непатогенными и имеют низкий профиль иммуногенности (High KA et al., «rAAV human trial experience» Methods Mol Biol. 2011; 807:429-57).
Одной из насущных целей исследований в области разработки эффективной генотерапии является оптимизация векторов для улучшения тех или иных свойств данных векторов.
Известно, что различные серотипы AAV характеризуются сродством к различным рецепторам на поверхности клеток-хозяев, к которым они обладают тропизмом. Так основным известным рецептором для AAV2 является гепарансульфат-протеогликан, корецепторами выступают интегриновый гетеродимер aVβ5, рецептор фактора роста фибробластов первого типа и рецептор фактора роста гепатоцитов, с-Met. AAV12 связывается с гепарансульфат-протеогликанами и сиаловой кислотой. AAV4 и AAV5 связываются с N- и О-связанными сиаловыми кислотами соответственно. AAV5 задействует рецептор фактора роста тромбоцитов. При этом установлена связь между аминокислотной последовательностью белков капсида AAV с процессом его сборки, инкапсидирования генома и сродством к различным типам рецепторов, репрезентированных на поверхности клеток-хозяев (Govindasamy L. et. al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 2013 Oct; 87(20):11187-99).
В международной заявке WO 2012145601 описаны вирионы аденоассоциированного вируса (AAV) с вариантным капсидным белком, где вирионы AAV демонстрируют большую инфекционность ретинальных клеток, когда вводятся интравитреальной инъекцией, по сравнению с AAV дикого типа.
В международной заявке WO 2013158879 описан вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей капсидный белок VP1, который содержит одну или несколько замен лизина, где одна замена лизина представляет K137R, где упомянутая замена лизина является эффективной для ингибирования убиквитинилирования упомянутого капсидного белка, и тем самым увеличивается трансдукция упомянутого вектора AAV в клетке-мишени.
На данный момент существует потребность в AAV с улучшенными свойствами по сравнению с AAV дикого типа, например, которые обладают увеличенной трансдуцирующей способностью, увеличенной эффективностью упаковки вирусных геномов AAV, а также увеличенной эффективностью наработки за счет высокоэффективной продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV). Улучшение тканевой трансдукции позволяет минимизировать дозы вводимого субъекту вектора.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких аминокислотных замен в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S,
приводит к повышению эффективности трансдукции клеток-мишеней с помощью вектора на основе AAV серотипа 5 с данной(ыми) модификацией(ями) и существенному увеличению эффективности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких аминокислотных замен в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S,
приводит к повышению эффективности упаковки вирусных геномов AAV препаратами на основе rAAV5.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких аминокислотных замен в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S,
приводит к увеличению продукции (сборки) инкапсидированных вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) по сравнению со сборкой инкапсидированных вирусных векторов на основе rAAV5 дикого типа (без вышеуказанных мутаций), то есть при сборке инкапсидированных вирусных векторов на основе rAAV5. содержащих вышеуказанные модификации в капсиде AAV5, получают вирусные вектора на основе rAAV5, которые содержат трансген (инкапсидированную гетерологичную нуклеиновую кислоту), значительно чаще чем при сборке инкапсидированных вирусных векторов на основе rAAV5 дикого типа (без вышеуказанных мутаций).
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), который содержит аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одной или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A, G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S,
где аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену в положении G226V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, G226V и T711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену Т614А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, Т614А и T711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену T614V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, T614V и T711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, использующихся для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой G226V, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 11 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, G226V и T711S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 12 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой Т614А и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 13 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP 1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, Т614А и T711S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 14 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой T614V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 15 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, T614V и T711S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 16 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному капсиду для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа, который включает любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены Т478А и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок AAV5, который содержит замены Т478А и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует любой из вышеуказанных капсидов, использующихся для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа или любой из вышеуказанных капсидов, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор на основе rAAV5 включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, которая содержит:
a) любой из вышеуказанных векторов на основе rAAV5; и
b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
В некоторых вариантах осуществления применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5, который включает трансфекцию клеток-продуцентов, соответственно, любой из вышеуказанных нуклеиновых кислот, которые содержат последовательность, кодирующую модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), или вышеуказанной нуклеиновой кислотой, кодирующей капсид.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-linker, предназначенной для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV девятого серотипа.
GFP- последовательность, кодирующая зеленый флуоресцентный белок,
PolyA - сигнал полиаденилирования,
ITR - инвертированный концевой повтор аденоассоциированного вируса,
Т2А - последовательность, кодирующая пептид способный к самовырезанию из полипептидной цепи получен от вируса thosea asigna,
HBG intron - интрон бета-глобина человека,
CMVpromoter - промотор цитомегаловируса человека,
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину,
pUC origin - высококопийный ориджин репликации бактерий.
Фигура 2 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-GFP.
EGFP- последовательность кодирующая модифицированный зеленый флуоресцентный белок,
PolyA - сигнал полиаденилирования,
ITR - инвертированный концевой повтор аденоассоциированного вируса,
HBG intron - интрон бета-глобина человека,
CMV promoter - промотор цитомегаловируса человека,
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину,
pUC origin - высококопийный ориджин репликации бактерий.
Фигура 3 представляет собой кольцевую схему плазмиды pAAV-Rep, предназначенной для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV пятого серотипа из библиотеки случайных вариантов.
AmpR- последовательность гена бета-лактамазы обеспечивающая устойчивость E.coli к ампициллину,
pUC origin - высококопийный ориджин репликации бактерий,
AAV Rep genes - последовательность кодирующая белки Rep, необходимые для жизненного цикла вируса.
Фигура 4 представляет собой кольцевую схему плазмиды pHelper, предназначенной для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV пятого серотипа из библиотеки случайных вариантов.
AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину,
Ori- ориджин репликации в бактериях,
Adeno Е2А - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno Е4 - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno VARNA - последовательность гена хелперного аденовируса, отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов.
Фигура 5 представляет собой график, который показывает анализ эффективности трансдукции клеток CHO-K1-S вирусными препаратами на основе rAAV5-GFP с мутациями в последовательности белка VP1 при использовании различных MOI (вирусных геномов на клетку).
AAV5-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и T711S.
AAV5-02Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями T614V, S2A и T711S.
AAV5-03Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями Т614А, S2A и T711S.
AAV5-04Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями G226V, S2A и T711S.
AAV5-NullMut-GFP обозначает вектор на основе аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающий белок VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Фигура 6 представляет собой схему расположения гибридизации зондов на векторном геноме.
Probe 1 - точка детекции участка оцДНК, на последовательности непосредственно у 3' ITR минус цепи ДНК;
Probe 3 - точка детекции участка оцДНК, который располагается на середине экспрессионной кассеты минус цепи (~2400-2500 по) ДНК;
Probe 5 - точка детекции участка оцДНК, который располагается непосредственно у 5' ITR минус цепи ДНК.
Probe 2 - точка детекции участка оцДНК, который располагается непосредственно у 5' ITR плюс цепи ДНК.
Probe 4 - точка детекции участка оцДНК, который располагается на середине экспрессионной кассеты плюс цепи (-2400-2500 по) ДНК;
Probe 6 - точка детекции участка оцДНК, который располагается непосредственно у 3' ITR плюс цепи. ДНК.
Фигура 7 представляет собой данные Саузерн блот гибридизации векторной ДНК.
pDNA-GFP - Стандартный образец, двукратное серийное разведение стандартной плазмидной ДНК pAAV-GFP.
vgDNA-NullMut-GFP - Контрольный образец, двукратное серийное разведение векторной геномной ДНК экстрагированной из контрольного препарата rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа.
vgDNA -02Mut-GFP - Двукратное серийное разведение векторной геномной ДНК экстрагированной из препарата rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего мутации S2A, T614V и T711S.
vgDNA -04Mut-GFP - Двукратное серийное разведение векторной геномной ДНК экстрагированной из препарата rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего мутации S2A, G226V и T711S.
Фигура 8 представляет собой схему положения структурных белков капсида AAV5 в аминокислотной последовательности гена Сар.
1-725 ак - VP1
137-725 ак - VP2
193-725 ак - VP3
Фигура 9 представляет собой график, который показывает анализ эффективности наработки векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5).
AAV5-01Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями S2A и T711S.
AAV5-02Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями T614V, S2A и T711S.
AAV5-03Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями Т614А, S2A и T711S.
AAV5-04Mut-GFP обозначает вектор на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающего модифицированный белок VP1 капсида AAV5 с мутациями G226V, S2A и T711S.
AAV5-NullMut-GFP обозначает вектор на основе аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), включающий белок VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Vg/ml кж обозначает количество вирусных геномов на миллилитр культуральной жидкости.
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
«Выделенный» означает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природе присутствующие в живых организмах, не являются «выделенными», но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, сопутствующих им в их природном состоянии, являются «выделенными». Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать, по существу, в очищенной форме или могут существовать в неприродном окружении, таком как, например, генетически модифицированной клетке.
Определения «встречающийся в природе», «нативный» или «дикого типа» используют для описания объекта, который можно обнаружить в природе как отличающийся от получаемого искусственно. Например, белок или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирус), которые можно изолировать из источника в природе, и которые не модифицированы умышленно специалистом в лаборатории, являются встречающимися в природе.
Термин «геном» относится к полному генетическому материалу организма.
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.
Белок (Пептид)
В настоящем описании термины «пептид», «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не существует ограничений по максимальному количеству аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Как применяют в настоящем описании, термин относится и к коротким цепям, также общепринято обозначаемым в этой области, например, как пептиды, олигопептиды и олигомеры, и к более длинным цепям, как правило, обозначаемым в этой области как белки, множество типов которых существует. «Полипептиды» включают, помимо прочего, например, биологически активные фрагменты, по существу, гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитные белки. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.
Молекулы нуклеиновых кислот
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.
Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ПЦР и т.п., и способами синтеза.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.
Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.
Аденоассоциированный вирус (AAV)
Вирусы семейства Parvoviridae представляют собой небольшие ДНК-содержащие вирусы животных. Семейство Parvoviridae может быть разделено на два подсемейства: Parvovirinae, представители которого инфицируют позвоночных животных, и Densovirinae, представители которого инфицируют насекомых. К 2006 году были описаны 11 серотипов аденоассоциированного вируса (Mori, S. ET AL., 2004, «Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein», Virology, T. 330 (2): 375-83). В 2008 году был описан 12 серотип аденоассоциированного вируса (Michael Schmidt ET AL., Adeno-associated virus type 12 (AAV12): a novel AAV serotype with sialic acid- and heparan sulfate proteoglycan-independent transduction activity, J Virol. 2008 Feb; 82(3): 1399-406. doi: 10.1128/JVI.02012-07). Все известные серотипы могут инфицировать клетки многих видов тканей. Тканевая специфичность определяется серотипом белков капсида, поэтому векторы на основе аденоассоциированого вируса конструируют, задавая необходимый серотип.Дополнительная информация по парвовирусам и другим представителям Parvoviridae описана в литературе (Kenneth I. Berns, «Parvoviridae: The Viruses and Their Replication)), Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)).
Геномная организация всех известных серотипов AAV очень сходна. Геном AAV представляет собой линейную одноцепочечную молекулу ДНК, которая содержит менее чем примерно 5000 нуклеотидов (нт) в длину. Инвертированные концевые повторы (ITR) фланкируют уникальные кодирующие нуклеотидные последовательности белков (Rep), необходимых для обеспечения жизненного цикла вируса, а также последовательности перекрывающихся белков капсида (Сар). Ген Сар кодирует белки VP (VP1, VP2 и VP3), которые образуют капсид, а также белки ААР (белок, активирующий сборку аденоассоциированного вируса (AAV) Sonntag F, Schmidt K, et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 2011; 85(23): 12686-12697. doi: 10.1128/JVI.05359-11) и МААР (вспомогательный белок связывания с мембраной Ogden PJ, Kelsic ED, Sinai S, Church GM. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 2019; 366(6469): 1139-1143. doi: 10.1126/science.aaw2900). Фланкирующие последовательности генома AAV длиной в 145 нуклеотидов являются самокомплементарными и организованы таким образом, что может быть сформирован энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпилечную структуру. Такие шпилечные структуры функционируют как точки начала репликации ДНК вируса, являясь праймерами для клеточного ДНК-полимеразного комплекса. После инфекции клеток млекопитающих AAV дикого типа (wtAAV) гены Rep (например, Rep78 и Rep52) экспрессируются с помощью Р5 промотора и Р19 промотора, соответственно, и оба белка Rep выполняют определенную функцию в репликации генома вируса. Сплайсинг в открытой рамке считывания Rep (Rep ORF) приводит к экспрессии фактически четырех белков Rep (например, Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40). Однако было показано, что несплайсированная мРНК, кодирующая белки Rep78 и Rep52, является достаточной для продукции вектора AAV в клетках млекопитающих.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAA V)
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Кроме того, термин «вектор» в данном настоящем документе означает вирусную частицу, способную транспортировать нуклеиновую кислоту.
Как применяют в настоящем описании, термин «экспрессия» определяют как транскрипцию и/или трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемую ее промотором.
Применение
«Генная терапия» представляет собой вставку генов в клетки и/или ткани субъекта для лечения заболевания, обычно, наследственных заболеваний, при этом дефектный мутантный аллель заменяется или дополняется функциональным аллелем.
«Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению.
«Заболевание» является состоянием здоровья субъекта, где субъект не может поддерживать гомеостаз, и где, если заболевание не облегчают, то здоровье субъекта продолжает ухудшаться.
Термин «субъект», «пациент», «индивидуум» и т.п. используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к любому животному, которое поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект, пациент или индивидуум является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Подробное описание изобретения
Выделенной модифицированной белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5)
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), который содержит аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одной или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
G226V,
S2A. G226V и T711S,
Т614А,
S2A, Т614А и T711S,
T614V,
S2A, T614V и T711S,
где аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену в положении G226V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, G226V и T711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность. представленную
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену Т614А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, Т614А и T711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замену T614V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, T614V и T711S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
Выделенные модифицированные белки VP2 и VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (ААV5)
«Правая часть» (+)-цепи геномной ДНК аденоассоциированного вируса содержит перекрывающиеся последовательности, кодирующие три белка капсида - VP1, VP2 и VP3. Транскрипция этих генов начинается с одного промотора, р40. Молекулярная масса соответствующих белков составляет 87, 72 и 62 кДа, соответственно. Все три белка транслируются с одной мРНК. После транскрипции пре-мРНК может подвергаться сплайсингу двумя разными способами, при этом вырезается более длинный или более короткий интрон и образуются мРНК длиной 2300 или 2600 нуклеотидов.
Таким образом, введение мутаций в ген Сар будет влиять не только на белок VP1 капсида AAV5, но и на VP2 и VP3 капсида AAV5.
На фигуре 8 приведено схематичное изображение положения структурных белков капсида AAV5 в последовательности гена Cap AAV:
1-725 ак - VP1
137-725 ак - VP2
193-725 ак - VP3
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена Т614А в VP1 будет соответствовать:
аминокислотной замене в положении Т478А в VP2;
аминокислотной замене в положении Т422А в VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена T614V в VP1 будет соответствовать:
аминокислотной замене в положении T478V в VP2;
аминокислотной замене в положении T422V в VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена G226V в VP1 будет соответствовать:
аминокислотной замене в положении G90V в VP2;
аминокислотной замене в положении G34V в VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена S2A в VP1 будет отсутствовать в VP2 и VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида - VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена T711S в VP1 будет соответствовать:
аминокислотной замене в положении T575S в VP2;
аминокислотной замене в положении T519S в VP3.
Заявитель также считает целесообразным указать окружение найденных мутаций путем указания краткой аминокислотной последовательности, включающей данные мутации в VP 1/VP2/VP3:
Для Т614А в VP1 (Т478А в VP2/ Т422А в VP3) - IPEAGAHFHP;
Для T614V в VP1 (T478V в VP2/ T422V в VP3) - IPEVGAHFHP;
Для G226V в VP1 (G90V в VP2/ G34V в VP3) - TWMVDRV;
Для S2A в VP1 (отсутствует в VP2 и в VP3) - MAFVDHP;
Для T711S в VP1 (T575S в VP2/ T519S в VP3) - EYRSTRP.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность белка VP2 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену G90V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену G90V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены G90V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены G90V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену Т478А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит Т478А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены Т478А и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены Т478А и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену T478V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замену T478V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены T478V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP2 капсида AAV5 содержит замены T478V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность белка VP3 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену G34V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену G34V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены G34V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены G34V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену Т422А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену Т422А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены Т422А и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены Т422А и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену T422V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замену T422V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены T422V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность модифицированного белка VP3 капсида AAV5 содержит замены T422V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40.
Капсид
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному капсиду для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа, который включает любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены Т478А и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок AAV5, который содержит замены Т478А и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40.
Выделенная нуклеиновая кислота
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, использующихся для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP 1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой G226V, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 11 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G226V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 11, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 3. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, G226V и T711S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 12 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, G226V и T711S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 12, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 4. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой Т614А и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 13 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т614А» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 13, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 5. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, Т614А и T711S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 14 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью. кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, Т614А и T711S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 14, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 6. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой T614V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 15 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T614V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 15, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 7. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, T614V и T711S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 16 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, T614V и T711S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 16, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 8. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G90V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 27 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G90V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 27, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 19. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами G90V и T575S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 28 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами G90V и T575S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 28, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 20. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т478А и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 29 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т478А» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 29, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 21. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами Т478А и T575S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 30 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами Т478А и T575S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 30, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 22. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T478V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 31 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T478V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 31, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 23. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами T478V и T575S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 32 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами T478V и T575S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 32, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 24. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G34V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 43 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой G34V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 43, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 35. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами G34V и T519S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 44 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами G34V и T519S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 44, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 36. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т422А и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 45 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой Т422А» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 45, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 37. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами Т422А и T519S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 46 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами Т422А и T519S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 46, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 38. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T422V и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 47 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T422V» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 47, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 39. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами T422V и T519S и представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 48 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
Под «другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами T422V и T519S» подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 48, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 40. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный капсид, включает любую из вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот или их комбинацию.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5)
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) или любой из вышеуказанных капсидов, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных модифицированных белков VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) любой из вышеуказанных капсидов, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
Термины «вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа», «рекомбинантный вирус на основе AAV5», «вирусоподобная частица на основе AAV5», «рекомбинантный вирусный штамм AAV5», «рекомбинантный вектор AAV5» или «вектор на основе rAAV5» в контексте настоящего описания имеют одинаковое значение.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор на основе rAAV5 включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
Вектор на основе rAAV по изобретению не содержит нуклеотидные последовательности генов, кодирующих последовательности белков (Rep), необходимых для обеспечения жизненного цикла вируса, а также последовательности перекрывающихся белков капсида (Сар).
Характеристика капсида подробно описана в вышеуказанном разделе описания.
Под «регуляторными последовательностями, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках» подразумевается в рамках данного изобретения полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они клонированы. Регулирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких регулирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «регуляторные последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, последовательности лидерных пептидов.
В контексте настоящего описания термин «промотор» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который контролирует транскрипцию одной или нескольких кодирующих последовательностей, а также который структурно идентифицируется по наличию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и других последовательностей ДНК, включающих, без ограничения, сайты связывания фактора транскрипции, сайты связывания репрессора и активатора белка, а также любые другие последовательности нуклеотидов, известные специалистам в данной области, которые непосредственно или опосредованно регулируют уровень транскрипции с данным промотором. «Конститутивный» промотор представляет собой такой промотор, который активен в большинстве тканей в обычных физиологических условиях и условиях развития. «Индуцибельный» промотор представляет собой промотор, который подвергается физиологической регуляции или регуляции в ходе развития, например, при воздействии химического индуктора. «Тканеспецифичный» промотор активен только в конкретных типах тканей или клеток.
Промоторы, которые используются для продукции высокого уровня полипептидов в эукариотических клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, должны быть сильными и, предпочтительно, должны быть активными в широком диапазоне типов клеток. Сильные конститутивные промоторы, которые способны запускать экспрессию во многих типах клеток, хорошо известны в данной области и, поэтому, нет необходимости в их подробном описании в данном документе. В соответствии с идеей настоящего изобретения предпочтительно использовать промотор цитомегаловируса (CMV). Промотор или промотор/энхансер, полученные из немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека, в особенности подходят в качестве промотора для вектора на основе rAAV5 по настоящему изобретению. Немедленная ранняя (IE) область цитомегаловируса (hCMV) человека и полученные из нее функциональные запускающие экспрессию фрагменты и/или функциональные усиливающие экспрессию фрагменты, например, описаны в ЕР0173177 и ЕР0323997, а также хорошо известны в данной области. Таким образом, несколько фрагментов немедленной ранней (IE) области hCMV могут использоваться в качестве промотора и/или промотора/энхансера.
Термины «энхансеры» или «энхансер», используемые в изобретении, могут относиться к последовательности ДНК, которая расположена как смежная с последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантный продукт. Энхансерные элементы обычно расположены в 5'-направлении от промоторного элемента или могут быть расположены ниже или в пределах кодирующей последовательности ДНК (например, последовательности ДНК, транскрибированной или транслированной в рекомбинантный продукт или продукты). Таким образом, энхансерный элемент может быть расположен на расстоянии 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или больше пар оснований перед последовательностью ДНК, которая кодирует рекомбинантный продукт, или после этой последовательности. Энхансерные элементы могут увеличивать количество экспрессируемого рекомбинантного продукта от последовательности ДНК, превышая экспрессию, обусловленную одиночным промоторным элементом. Специалистам в данной области техники доступно множество энхансерных элементов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках может включать следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:
левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);
CMV (цитомегаловирусный) энхансер;
CMV (цитомегаловирусный) промотер;
интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1);
нуклеиновая кислота, кодирующая продукт;
сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека);
правый (второй) ITR.
В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, кодирующая продукт (трансген) представляет собой по меньшей мере один ген, кодирующий белок. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну небольшую нуклеиновую кислоту-ингибитор. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну репортерную молекулу. В некоторых вариантах реализации малая ингибирующая нуклеиновая кислота представляет собой miRNA. В некоторых вариантах реализации малая ингибирующая нуклеиновая кислота представляет собой sponge miRNA или TuD-RNA, которая ингибирует активность по меньшей мере одной miRNA у животного. В некоторых вариантах реализации miRNA экспрессируется в клетке ткани-мишени. В некоторых вариантах реализации ткань-мишень представляет собой ткань печени, центральной нервной системы (ЦНС), глаз, желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, молочной железы, поджелудочной железы, мочевыводящих путей или ткани матки.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 имеет продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой терапевтический полипептид, где терапевтический полипептид представляет собой фактор свертывания крови, выбираемый из группы, состоящей из фактора VIII, фактора IX или их функционального варианта.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой белок SMN1 (белок выживаемости моторных (двигательных) нейронов)
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой полипептид RBD-S (рекомбинантный рецептор-связывающий домен гликопротеина S) вируса SARS-cov2 (коронавирус 2 типа, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром).
Фармацевтическая композиция
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, которая содержит:
a) любой из вышеуказанных векторов на основе rAAV5; и
b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вирусную частицу на основе rAAV5 по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или в других лекарственных соединениях, фармацевтические агенты, носители, адъюванты, разбавители и т.д. Носитель для инъекций обычно является жидким. Носитель для других способов введения может быть или твердым, или жидким, таким как стерильная апирогенная вода или стерильный апирогенный фосфатно-солевой буферный раствор. Для введения путем ингаляции носитель является вдыхаемым и предпочтительно находится в твердой или жидкой дисперсной форме. В качестве инъекционной среды предпочтительно использовать воду, содержащую добавки, общепринятые для инъекционных растворов, такие как стабилизирующие агенты, соли или солевые растворы и/или буферы.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей клетку, в которой вектор на основе rAAV5 интегрирован в геном, в фармацевтически приемлемом носителе или других лекарственных соединениях, фармацевтических агентах, носителях, адъювантах, разбавителях и т.д.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя вышеуказанный вектор на основе rAAV5, согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксципиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики). Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы.
«Фармацевтически приемлемым» считается материал, который не имеет биологических или других противопоказаний, например, материал можно вводить субъекту без каких-либо нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такие фармацевтические композиции можно использовать, например, для трансфекции клетки ех vivo или для введения in vivo вирусной частицы или клетки непосредственно субъекту.
Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.
Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента.
Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение рН, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату вектора на основе rAAV5, проявлять устойчивость к изменениям рН. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8°С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.
Способ доставки генного продукта
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции.
Под субъектом подразумевают любой живой организм, который поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Любой способ введения вектора на основе rAAV5, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для вышеуказанного вектора на основе rAAV5, по данному изобретению.
Примеры способов введения включают в себя местное применение, интраназальное, ингаляционное, чрезслизистое, трансдермальное, энтеральное (например, пероральное, ректальное), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное) введения, а также инъекции непосредственно в ткань или в орган.
Инъекционные препараты могут быть приготовлены в общепринятых лекарственных формах: в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для приготовления растворов или суспензий в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Альтернативно, можно вводить вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV5 по данному изобретению локально, а не системно, например, в виде депо или в композиции с замедленным высвобождением.
Рекомбинантный вирус на основе AAV5 вводят в организм в эффективном количестве. Рекомбинантный вирус на основе AAV5 предпочтительно вводят в организм в биологически эффективном количестве. «Биологически эффективное» количество рекомбинантного вируса представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать инфекцию (или трансдукцию) и экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке. Если вирус вводят в клетку in vivo (например, вирус вводят субъекту, как описано ниже), «биологически эффективное» количество вирусного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать трансдукцию и экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-мишени.
Клетка для введения вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе AAV5 по изобретению может быть клеткой любого типа, включая в себя без ограничения, моторные нейроны или прочие ткани нервной системы, эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки кожи, дыхательных путей и кишечника), печеночные клетки, мышечные клетки, клетки селезенки, фибробласты, эндотелиальные клетки и тому подобное.
Вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV5 по изобретению не используется для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.
Применение
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
В некоторых вариантах осуществления применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови, заболевания центральной нервной системы, заболевания метаболизма, заболевания мышц, наследственные заболевания.
Под субъектом подразумевают любое животное, которое поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Введение вектора на основе rAAV5 по настоящему изобретению субъекту-человеку или животному, нуждающемуся в этом, можно проводить любым известным в данной области способом для введения вирусных векторов.
Примеры способов введения включают в себя местное применение, интраназальное, ингаляционное, чрезслизистое, трансдермальное, энтеральное (например, пероральное, ректальное), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное) введения, а также инъекции непосредственно в ткань или в орган.
Инъекционные препараты могут быть приготовлены в общепринятых лекарственных формах: в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для приготовления растворов или суспензий в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Альтернативно, можно вводить вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV5 по данному изобретению локально, а не системно, например, в виде депо или в композиции с замедленным высвобождением.
В некоторых вариантах применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание крови.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание мышц.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой наследственное заболевание.
В некоторых вариантах осуществления применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах осуществления применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах осуществления применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой белок SMN1 (белок выживаемости моторных (двигательных) нейронов)
В некоторых вариантах осуществления применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой полипептид RBD-S (рекомбинантный рецептор-связывающий домен гликопротеина S) вируса SARS-cov2 (коронавирус 2 типа, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром).
В некоторых вариантах осуществления применения любой из вышеуказанных векторов на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции используются в терапевтически эффективном количестве.
Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается количество, которое достаточно для облегчения (например, для смягчения, уменьшения, снижения) по меньшей мере одного из симптомов, связанных с патологическим состоянием. Другими словами, «терапевтически эффективное» количество представляет собой количество, которое достаточно для обеспечения некоторого улучшения состояния субъекта.
Дозировки вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе AAV5 по данному изобретению будут зависеть от способа введения, конкретного вирусного вектора и их можно определять рутинными способами. Примерными дозами для достижения терапевтического эффекта являются вирусные титры, составляющие по меньшей мере примерно 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 трансдуцирующих единиц или больше, предпочтительно приблизительно от 109 до 1015 трансдуцирующих единиц, еще более предпочтительно 1014 трансдуцирующих единиц на килограмм.
Таким образом, рекомбинантный вирус на основе AAV5, реагенты и способы по настоящему изобретению можно использовать для направления нуклеиновой кислоты в делящиеся или неделящиеся клетки и для стабильной экспрессии в этих клетках гетерологичной нуклеиновой кислоты. С использованием этой векторной системы стало возможно вводить в клетки в условиях in vivo гены, которые кодируют белки, влияющие на физиологию клеток. Таким образом, векторы по настоящему изобретению могут быть полезными в генной терапии при патологических состояниях.
Настоящее изобретение можно использовать для доставки любой чужеродной нуклеиновой кислоты с биологическим эффектом для лечения или ослабления симптомов, связанных с каким-либо расстройством, обусловленным генной экспрессией. Примеры патологических состояний включают в себя без ограничения кистозный фиброз (и другие заболевания легких), гемофилию А, гемофилию В, талассемию, анемии и другие нарушения свертываемости крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, сахарный диабет, мышечные дистрофии (например, Дюшенна, Беккера, спинальная мышечная атрофия (SMA)), болезнь Гоше, болезнь Херлера, дефицит аденозиндеаминазы, болезни накопления гликогена и другие метаболические дефекты, заболевания солидных органов (например, мозга, печени, почек, сердца) и тому подобное.
Перенос генов обладает значительным потенциалом применения для понимания и создания способов лечения патологических состояний. Существует ряд наследственных заболеваний, для которых были изучены и клонированы дефектные гены. В некоторых случаях известна функция этих клонированных генов. В целом упомянутые выше патологические состояния делятся на два класса: дефицитные состояния, как правило, дефицит ферментов, которые обычно наследуются рецессивным образом, и состояния нарушения баланса, иногда с вовлечением по меньшей мере регуляторных или структурных белков, которые наследуются доминантным образом. При дефицитных заболеваниях можно использовать перенос генов, чтобы внести нормальный ген в пораженные ткани для заместительной терапии. При патологических состояниях нарушения баланса перенос генов можно использовать для создания патологического состояния в смоделированной системе, которую затем можно использовать для разработки мер против этого патологического состояния. Таким образом, способы по настоящему изобретению позволяют лечить генетические заболевания. Согласно изобретению, патологическое состояние лечится путем частичного или полного устранения дефекта или дисбаланса, который вызывает заболевание или усугубляет степень его тяжести. Также возможно использование сайт-специфичной интеграции нуклеиновых последовательностей для запуска мутаций или исправления дефектов.
Способ получения вектора на основе rAA V5
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любого из вышеуказанных векторов на основе rAAV5, который включает трансфекцию клеток-продуцентов любой из вышеуказанных нуклеиновых кислот, кодирующей модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), или вышеуказанной нуклеиновой кислотой, кодирующей капсид.
Белки капсида могут быть экспрессированы из рекомбинантного вируса, вектора экспрессии или из линии клеток, в которую стабильно интегрированы гены описанных модифицированных капсидов AAV или кодирующие последовательности. Кроме того, изобретение обеспечивает получение капсидов AAV с описанными мутациями in vitro из белков капсидов AAV и конструирование упакованных капсидов in vitro. Изобретение также обеспечивает получение модифицированных капсидов AAV, которые были генетически сконструированы для экспрессии гетерологичных эпитопов клинически важных антигенов, чтобы вызвать иммунный ответ.
Способ получения вектора на основе rAAV5 подробно описан в примерах.
Трансгенное животное
Согласно некоторым аспектам раскрытия предоставляется способ создания модели соматических трансгенных животных. В некоторых вариантах реализации способ включает введение любого из вышеупомянутых rAAV не являющемуся человеком животному, где rAAV содержит по меньшей мере один трансген, и где rAAV инфицирует клетки ткани-мишени животного, не являющегося человеком.
В некоторых вариантах возможно использование описанных вариантов капсидов для создания модели соматических трансгенных животных, которые включают введение любого из вышеупомянутых rAAV не относящемуся к человеку животному, где rAAV содержит по меньшей мере один трансген. В некоторых вариантах реализации трансген представляет собой по меньшей мере один ген, кодирующий белок. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну небольшую нуклеиновую кислоту-ингибитор. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует по меньшей мере одну репортерную молекулу.
Соматической трансгенной животной моделью может быть млекопитающее, такое как мышь, крыса, кролик, собака, кошка, овца, свинья, примат, не являющийся человеком.
В некоторых вариантах реализации предполагаемый терапевтический агент можно вводить модели соматического трансгенного животного для определения эффекта предполагаемого терапевтического агента на патологическое состояние животного.
Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Материалы и общие методы
Методы рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.
Синтез генов
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.
Определение последовательностей ДНК
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру.
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях
Применяли пакет программ SnapGene версии 5.1.4.1 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.
Статистический анализ данных
Результаты представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение (SD), для сравнения результатов теста и контроля использовали дисперсионный анализ (ANOVA), и они были определены как статистически значимые.
Пример 1. Получение библиотек вариантов капсидов rAAV5
Получение библиотек вариантов капсидов rAAV5 производили методом случайного мутагенеза последовательности гена Cap (Davidsson М. et al., 2016). Вкратце, последовательность гена Сар пятого серотипа содержащую мутации S2A и T711S в VP1 полученные в предыдущем раунде отбора (заявка на патент № RU 2019126509), фрагментировали с использованием урацил-ДНК-гликозилазы, полученные фрагменты собирали в полноразмерный ген Сар с помощью ДНК-полимеразы, не обладающей корректирующей активностью (в результате в последовательности возникали случайные мутации). Полноразмерные мутантные варианты клонировали в плазмиду-носитель pAAV-linker (Фигура 1) по сайтам рестрикции AscI/EcoRI в общую рамку считывания с зеленым флуоресцентным белком (GFP), продуцируя многообразную случайную библиотеку капсидов rAAV5, которую затем использовали для отбора вариантов капсидов с повышенной трансдуцирующей активностью.
Положительный отбор вирусных частиц с повышенной трансдуцирующей активностью проводили in vitro на клетках линии CHO-K1-S. При этом для трансдукции использовали частицы, очищенные с помощью УЦФ в градиенте йодиксанола. Спустя 48 часов клетки собирали и выделяли геномную ДНК для последующей амплификации последовательностей геномов вирусов, способных к эффективной трансдукции. Полученные последовательности затем переклонировали и повторно нарабатывали для последующих итераций отбора с целью обогащения библиотеки вариантами с наибольшей эффективностью трансдукции. После 5 раундов отбора капсидные гены 100 клонов просеквенировали для определения наиболее успешных мутаций и их сочетаний. По результатам секвенирования преобладающими сочетаниями мутаций оказались S2A, T711S, T614V в VP1 AAV5- порядка 30% клонов. Также были отобраны варианты капсидов, содержащие мутации S2A, T711S, Т614А в VP1 AAV5 и S2A, T711S, G226V в VP1 AAV5. Данные варианты капсидов клонировали в вектора для наработки вирусных частиц и в дальнейшем использовали для визуализации и сравнения профилей трансдукции относительно AAV5 дикого типа.
Пример 2. Наработка и последующий отбор рекомбинантных вирусных частиц из полученной библиотеки последовательностей
Для наработки и последующего отбора рекомбинантных вирусных частиц из полученной библиотеки последовательностей была разработана серия плазмид: плазмида-носитель, плазмида, содержащая последовательность гена Rep, а также конструкция, содержащая аденовирусные гены, необходимые для репликации вирусных частиц.
Плазмида-носитель pAAV-linker (Фигура 1) предназначенная для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV пятого серотипа в одну рамку считывания с репортерным белком, была получена путем замены последовательности модифицированного зеленого флуоресцентного белка в исходной конструкции pAAV-GFP (Фигура 2), с помощью рестриктазно-лигазного метода клонирования по сайтам HindIII/EcoRI, на последовательность T2A-GFP, синтезированную de novo с добавлением сайтов рестрикции EcoRI с 5'-конца и HindIII с 3'-конца.
Плазмида pAAV-Rep, содержащая последовательность гена Rep (Фигура 3), была получена путем клонирования de novo синтезированной последовательности гена Rep AAV второго серотипа (GenBank ID AF043303.1) по сайтам рестрикции PciI/PsiI с последующей обработкой Т4 DNA Polymerase для получения «тупых» концов, в плазмиду pGem-T Easy (Promega, США) так же обработанную рестриктазами PciI/PsiI.
В качестве источника аденовирусных генов для наработки рекомбинантных вирусных частиц была использована конструкция pHelper (Фигура 4), содержащая AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, Ori- ориджин репликации в бактериях, Adeno Е2А - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno Е4 - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno VARNA последовательность гена хелперного аденовируса отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов.
Пример 3. Способ получения векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5)
Для получения частиц rAAV с модифицированным капсидом 5 серотипа, клетки-продуценты трансфецировали одновременно 3 плазмидами:
1) Плазмидой, содержащей нуклеотидные последовательности аденовируса, кодирующие белки и РНК, необходимые для сборки частиц rAAV (хелперная плазмида);
2) Плазмидой, содержащей нуклеотидную природную последовательность гена Rep аденоассоциированного вируса, а также последовательность модифицированного гена Сар, которую выбирают из группы: нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или любая другая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, и белки VP2 и VP3 с альтернативных рамок считывания используемой нуклеотидной последовательности, где
VP2 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 18, 19, 20,21,22,23 или 24;
a VP3 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 34, 35. 36, 37, 38, 39 или 40;
3) Плазмидой, содержащей гетерологичный геном частицы rAAV, кодирующий целевой ген, предназначенный для доставки в клетки пациента.
Данный набор генов обеспечивает сборку вирусных частиц rAAV и инкапсидирование в них целевого генома в течение 72 часов. Через 72 часа после трансфекции клетки-продуценты подвергают лизису с высвобождением частиц rAAV и очищают последовательными стадиями фильтрации и хроматографии. Титр очищенных частицы rAAV проверяют с помощью иммуноферментного анализа и количественной ПЦР.
Пример 4. Увеличение эффективности трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5 при наличии мутаций S2A, T614V/T614A/G226V, T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Дизайн эксперимента:
В лунки 12-луночных планшетов были посеяны клетки линии CHO-K1-S. Посев проводили в ростовую среду: ДМЕМ/F12 с глутамином, содержание глюкозы 4,5 г/л, 5% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 500, 1250 и 2500 вг/клетка. Все образцы были поставлены в трех повторностях. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
В роли контрольных препаратов были использованы препараты на основе rAAV5 с мутациями S2A и T711S в белке капсида VP1, а также препарат на основе rAAV5 с капсидом дикого типа. Ранее было показано (заявка на патент № RU 2019126509), что наличие в белке VP1 капсида AAV5 мутаций S2A и T711S приводит к достоверно большей эффективности трансдукции клеток CHO-K1-S по сравнению с капсидом дикого типа.
Анализ эффективности трансдукции проводили с помощью проточного цитометра Guava EasyCyte и программного обеспечения GuavaSoft.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы T614V, Т614А и G226V в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, уже содержащего мутации S2A и T711S, приводило к существенному увеличению эффективности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными мутациями (T614V, Т614А и G226V). К примеру, при помощи метода проточной цитометрии удалось выявить изменение количества GFP позитивных клеток спустя 48 часов после трансдукции линии CHO-K1-S препаратами на основе rAAV5 с белком VP1 дикого типа, с белком VP1, содержащего мутации S2A и T711S или белком VP1, несущим мутации S2A, T711S и T614V или Т614А или G226V (Фигура 5).
При наличии мутаций T614V, S2A и T711S (AAV5-02Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,31 раза с 24,92% до 32,84% при MOI 500, в 1,47 раза с 43,44% до 63,89% при MOI 1250 и в 1,17 раза с 65,56% до 78,01% при MOI 2500 вг/клетка по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации T614V, S2A и T711S (AAV5-02Mut-GFP), и капсида VP1 дикого типа (AAV5-NullMut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,74 раза с 11,97% до 32,84% при MOI 500, в 3,18 раза с 20,11% до 63,89% при MOI 1250 и в 1,85 раза с 42,26% до 78,01% при MOI 2500
При наличии мутаций Т614А, S2A и T711S (AAV5-03Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,18 раза с 24,92%) до 29,62% при MOI 500, в 1,27 раза с 43,44% до 55,22% при MOI 1250 и в 1,1 раза с 65,56% до 72,05% при MOI 2500 вг/клетка по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации Т614А, S2A и Т71 lS(AAV5-03Mut-GFP), и капсида VP1 дикого типа (AAV5-NullMut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,47 раза с 11,97% до 29,62%» при MOI 500, в 2,74 раза с 20,11% до 55,22% при MOI 1250 и в 1,7 раза с 42,26% до 72,05% при MOI 2500.
При наличии мутаций G226V, S2A и Т71 IS (AAV5-04Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, было ниже в 1,41 раза с 24,92% до 17,67% при MOI 500, в 1,09 раза с 43,44% до 39,69% при MOI 1250 и в 1,05 раза с 65,56% до 61,85% при MOI 2500 вг/клетка по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида, содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации Т614А, S2A и T711S (AAV5-03Mut-GFP), и капсида VP1 дикого типа (AAV5-NullMut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,48 раза с 11,97% до 17,67%) при MOI 500, в 1,97 раза с 20,11% до 39,69% при MOI 1250 и в 1,46 раза с 42,26% до 61,85% при MOI 2500.
Пример 5. Эффективность упаковки вирусных геномов AAV препаратами на основе rAAV5 при наличии мутаций S2A, T614V/G226V, T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа.
В данном изобретении под понятиями «векторный геном» и «векторная ДНК» следует понимать оцДНК упакованную в капсид рекомбинантного аденоассоциированного вируса (далее rAAV). Такая оцДНК может быть как смысловой (далее плюс цепь ДНК), так и антисмысловой (далее минус цепь ДНК). Препарат rAAV является смесью капсидов часть из которых содержит плюс цепь оцДНК, а часть содержит минус цепь оцДНК. Векторный геном rAAV представляет собой нуклеотидную последовательность экспрессионной кассеты, окруженную последовательностью инвертированных концевых повторов - ITR (inverted terminal repeats, далее ITR).
В данном изобретении под понятием «образец» или «исследуемый образец» следует понимать оцДНК экстрагированную из соответствующего препарата rAAV.
По данным литературы AAV капсиды эффективно упаковывают кассеты до 4.8 kb, кассеты же большего размера в процессе упаковки в капсид фрагментируются с 5'- или 3'-концов ДНК и в результате упаковываются с меньшей эффективностью, образую неоднородную популяцию вирусных геномов rAAV. При этом чаще всего делетированию подвергается 5'- конец одноцепочечной ДНК (далее оцДНК) (Zhijian Wu, 2010.). Таким образом, значительная часть препаратов rAAV содержат фрагментированные цепи оцДНК, что в свою очередь приводит к снижению эффективности экспрессии. Для оценки эффективности упаковки оцДНК капсидами rAAV был использован метод саузерн-дот блота. Для проверки целостности 5' - и 3'- концов оцДНК в исследуемом образце на участки ДНК максимально близкие к последовательности 5' - ITR и 3' - ITR подбирали олигонуклеотидные зонды. Зонды должны строго специфично связываться с выбранными участками оцДНК. Также зонды были подобраны на участки ДНК, соответствующие середине экспрессионной кассеты (~2400-2500 по), такая точка детекции является контрольной для исследуемой цепи оцДНК, т.к. данная область реже подвергается фрагментации при упаковке в капсид (Фиг. 6.). Олигонуклеотидные зонды подбирали как для «плюс», так и для «минус» цепи ДНК экспрессионной кассеты. Зонды отличаются от обычных олигонуклеотидов тем, что на их 5'-конце последовательности находится молекула биотина.
В процессе выполнения работ, исследуемый образец - ДНК экстрагированная из анализируемых rAAV препаратов, наносили на предварительно смоченную в 20XSSC буфере нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовали с выбранными зондами. Для каждого зонда использовалась отдельная мембрана с исследуемыми образцами, таким образом обработке подвергались 6 мембран, на каждой из которых находились исследуемые образцы ДНК экстрагированные из 2.5×1010 вирусных частиц (измеренных как GC - genome сору) с предварительной обработкой вирусного препарата DNAse I для удаления примесей не инкапсидированной ДНК и последующей обработкой Протеиназой К, согласно протоколу описанному в статье (Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice Mariacarmela Allocca, J Clin Invest. 2008 May 1; 118(5): 1955-1964.)
Нанесение образцов на мембрану осуществлялось с помощью вакуумного коллектора Bio-Dot® Microfiltration Apparatus (Bio-Rad). Экстрагированную ДНК из 2,3×109 векторных геномов наносили в первую лунку коллектора. В оставшиеся шесть лунок коллектора наносили двукратные серийные разведения данного образца, получая таким образом ряд разведений, соответствующий 7, 3.5, 1.7, 0.86, 0.43, 0.21 и 0.11 нг векторной ДНК. Стандартную пДНК, полученную при расщеплении pAAV-GOI по сайтам SmaI, разбавляли таким же образом. Количество стандартной пДНК, в калибровочной кривой, составляло 50, 25, 12.5, 6.25, 3.1, 1.6, 0.78 соответственно.
В данном изобретении под термином «Стандартная пДНК» следует понимать расщепленную по сайтам SmaI плазмидную ДНК (далее пДНК), нуклеотидная последовательность которой в точности соответствует нуклеотидной последовательности исследуемого векторного генома.
Зонды, используемые для гибридизации, синтезированы и помечены биотином. Гибридизацию проводили в течение ночи при температуре на 10°С ниже температуры плавления каждого зонда.
На следующий день мембраны отмывали сначала раствором 2 х SSC/0,1% SDS, а затем TBSTxl. Далее мембраны инкубировали с 1% BSA и TBSTx1 в течение 40 минут и снова отмывали TBSTxl. Затем, мембраны инкубировали с HRP-конъюгированным стрептавидином в течение часа для связывания биотинилированного зонда с HRP-конъюгированным стрептавидином. После финальной отмывки мембран 1% BSA TBSTxl добавляли субстрат для хемилюминесцентной детекции и детектировали люминесцентный сигнал на мембранах (Фигура 7). Дальнейшую обработку полученных изображений проводили с помощью ПО «Image Lab». Оценку интенсивности люминесцентного сигнала от зондов определяли по уровню интенсивности люминесцентного сигнала стандартной пДНК. Интенсивность люминесцентного сигнала разведений стандартной пДНК принимали за калибровочную кривую (далее стандартный образец).
Авторами изобретения было установлено, что подобранные биотинилированные зонды связываются с ДНК-матрицей, находящейся на мембране с одинаковой эффективностью, что очевидно из окрашивания разведений стандартной пДНК в каждой точке. Детекция фрагментов ДНК, соответствующих 5'- и 3'-концам плюс цепи и 5'- и 3'-концам минус цепи исследуемой ДНК наблюдалась для всех испытуемых образцов. При одинаковой нагрузке ДНК исследуемых образцов на мембраны наблюдались различия в интенсивности детектируемых сигналов люминесценции.
В области детекции зонда "Probe 1" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции третьего разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на шестом разведении, седьмое разведение данного образца детектируется на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 1" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции третьего и четвертого разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 1" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируется на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда "Probe 1", образцы vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведения относительно контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP.
В области детекции зонда "Probe 3" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится за пределами разведения стандартного образца pDNA-GFP. Интенсивность сигнала люминесценции во второй точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции первого и второго разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 3" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится за пределами разведения стандартного образца pDNA-GFP. Интенсивность сигнала люминесценции во второй точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции первого и второго разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 3" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP находится за пределами разведения стандартного образца pDNA-GFP. Интенсивность сигнала люминесценции во второй точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции второго и третьего разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируется на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда "Probe 3", образцы vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведения относительно контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP.
В области детекции зонда "Probe 5" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции пятого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 5" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на седьмом разведении.
В области детекции зонда "Probe 5" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции пятого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда "Probe 5", образец vgDNA-04Mut-GFP не отличается от контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP. Образец vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведениях относительно контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP.
В области детекции зонда "Probe 2" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 2" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируется на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 2" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда "Probe 2", образец vgDNA-04Mut-GFP не отличается от контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP. Образец vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведения относительно контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP.
В области детекции зонда "Probe 4" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится за пределами разведения стандартного образца pDNA-GFP. Интенсивность сигнала люминесценции во второй точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции первого и второго разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на шестом разведении, седьмое разведение данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 4" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции первого и второго разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на шестом разведении, седьмое разведение данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 4" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции первого и второго разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на пятом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда "Probe 4", образцы vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-02Mut-GFP имеют большую силу сигнала люминесценции в сравнении с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP. И детектируется на более поздних разведениях относительно контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP.
В области детекции зонда "Probe 6" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-04Mut-GFP находится в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-04Mut-GFP обнаруживается на шестом разведении, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 6" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-02Mut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-02Mut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
В области детекции зонда "Probe 6" интенсивность сигнала люминесценции в первой точке разведения образца vgDNA-NullMut-GFP соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP. Предел детекции образца vgDNA-NullMut-GFP обнаруживается на четвертом разведении, пятое, шестое и седьмое разведения данного образца детектируются на уровне фонового сигнала.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образцов в области детекции зонда "Probe 6", образец vgDNA-02Mut-GFP не отличается от контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP, а образец vgDNA-04Mut-GFP имеет большую силу сигнала люминесценции и детектируется на более поздних разведениях в сравнении с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-04Mut-GFP в точках детекции зонда "Probe 1" (3' область минус цепи ДНК) и "Probe5" (5' область минус цепи ДНК). Наибольшую интенсивность сигнала люминесценции имеет 3' - область минус цепи ДНК (Probe 1), которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции третьего разведения стандартного образца pDNA-GFP, по сравнению с детектируемой 5' областью минус цепи ДНК (Probe5), которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции пятого разведения стандартного образца pDNA-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-02Mut-GFP в точках детекции зонда "Probe 1" (3' область минус цепи ДНК) и "Probe5" (5' область минус цепи ДНК). Наибольшую интенсивность сигнала люминесценции имеет 3' - область минус цепи ДНК, которая находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции третьего и четвертого разведений стандартного образца pDNA-GFP, по сравнению с детектируемой 5' областью минус цепи ДНК, которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP в точках детекции зонда "Probe 1" (3' область минус цепи ДНК) и "Probe5" (5' область минус цепи ДНК). Наибольшую интенсивность сигнала люминесценции имеет 3' - область минус цепи ДНК, которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP, по сравнению с детектируемой 5' областью минус цепи ДНК, которая соответствует интенсивности сигнала люминесценции пятого разведения стандартного образца pDNA-GFP.
Для образцов vgDNA-04Mut-GFP, vgDNA-02Mut-GFP, vgDNA-NullMut-GFP эффективность упаковки минус цепей оценивалась по отличиям в интенсивности сигнала люминесценции в области детекции 3'-конца минус цепи ДНК и интенсивности сигнала люминесценции в области детекции 5'-конца минус цепи ДНК. Для всех исследуемых образцов показана тенденция к преобладанию интенсивности сигнала люминесценции в области детекции 3'-конца минус цепи ДНК над интенсивностью сигнала люминесценции в области детекции 5'-конца минус цепи ДНК. Однако, при сравнении интенсивности сигналов люминесценции в области детекции 3'-конца минус цепи ДНК и интенсивностью сигналов люминесценции в области детекции 5'-конца минус цепи ДНК образцов выявлено, что образцы vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-02Mut-GFP имеют более эффективную упаковку минус цепи ДНК по сравнению с контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP, т.к. имеют имеет большую силу сигнала люминесценции как для области детекции 3'-конца минус цепи ДНК, так и для области детекции 5'-конца минус цепи ДНК и детектируется на более поздних разведениях относительно контрольного образца vgDNA-NullMut-GFP. Образец vgDNA-02Mut-GFP имеет более эффективную упаковку минус цепи ДНК по сравнению с vgDNA-04Mut-GFP и контрольным образцом vgDNA-NullMut-GFP, т.к. в области детекции 3'-конца минус цепи ДНК интенсивность сигнала люминесценции находится в диапазоне интенсивности сигналов люминесценции третьего и четвертого разведений стандартного образца pDNA-GFP, а интенсивность сигнала люминесценции в области детекции 5'-конца минус цепи ДНК соответствует интенсивности сигнала люминесценции четвертого разведения стандартного образца pDNA-GFP, тогда как для образцов vgDNA-04Mut-GFP и vgDNA-NullMut-GFP интенсивность сигнала люминесценции в области детекции 5'-конца минус цепи ДНК значительно уступает интенсивности сигнала люминесценции в области детекции 3'-конца минус цепи ДНК этих образцов. Данный факт свидетельствует о более эффективной упаковке полноразмерных минус цепей ДНК в образце vgDNA-02Mut-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-04Mut-GFP в точках детекции зонда "Probe 6" (3' область плюс цепи ДНК) и "Probe 2" (5' область плюс цепи ДНК) различий не обнаружено, интенсивности люминесценции этих точек находятся в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-02Mut-GFP в точках детекции зонда "Probe 6" (3' область плюс цепи ДНК) и "Probe 2" (5' область плюс цепи ДНК) различий не обнаружено, интенсивности люминесценции этих точек находятся в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP.
При сравнении интенсивности сигналов люминесценции образца vgDNA-NullMut-GFP в точках детекции зонда "Probe 6" (3' область плюс цепи ДНК) и "Probe 2" (5' область плюс цепи ДНК) различий не обнаружено, интенсивности люминесценции этих точек находятся в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP.
Для образцов vgDNA-04Mut-GFP, vgDNA-02Mut-GFP, vgDNA-NullMut-GFP эффективность упаковки плюс цепей оценивачась по интенсивности сигналов люминесценции в области детекции 3'-конца плюс цепи ДНК и в области детекции 5'-конца плюс цепи ДНК. Выявлено, что для всех образцов в области детекции 3'-конца плюс цепи ДНК сигнал люминесценции исследуемых образцов детектируется в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP также, как и сигнал люминесценции от детекции 5' области плюс цепи ДНК исследуемых образцов детектируется в диапазоне интенсивности сигнала люминесценции четвертого и пятого разведений стандартного образца pDNA-GFP. Таким образом упаковка плюс цепей ДНК в исследуемых образцах имеет равную эффективность.
Пример 6. Эффективность наработки векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5)
Для получения частиц rAAV с модифицированным капсидом 5 серотипа, клетки-продуценты HEK293 трансфецировали с использованием полиэтиленимина одновременно
3 плазмидами:
1) Плазмидой, содержащей нуклеотидные последовательности аденовируса, кодирующие белки и РНК, необходимые для сборки частиц rAAV (хелперная плазмида);
2) Плазмидой, содержащей нуклеотидную природную последовательность гена Rep аденоассоциированного вируса, а также последовательность модифицированного гена Сар, которую выбирают из группы: нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или любая другая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, и белки VP2 и VP3 с альтернативных рамок считывания используемой нуклеотидной последовательности, где
VP2 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 18, 19. 20,21,22, 23 или 24;
a VP3 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 34, 35,36,37,38, 39 или 40;
3) Плазмидой, содержащей гетерологичный геном частицы rAAV, кодирующий целевой ген, предназначенный для доставки в клетки пациента.
Данный набор генов обеспечивает сборку вирусных частиц rAAV и инкапсидирование в них целевого генома в течение 72 часов. Через 72 часа после трансфекции клетки-продуценты подвергали лизису с высвобождением частиц rAAV, полученные вектора обрабатывали ДНКазой I в течение 2 часов при 37°С, затем еще 2 часа протеиназой K при 56°С. Титр полученных частиц rAAV определяли с помощью количественной ПЦР с использованием сета олигонуклеотидов состоящего из прямого праймера 5'-ACCACATGAAGCAGCACGAC -3', обратного праймера 5'- TCAGCTCGATGCGGTTCAC -3', и зонда 5'- HEX-CATGCCCGAAGGCTACGTCCAG-BHQ1 -3' специфичного к последовательности GFP.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, выбранных из группы, которая состоит из T614V, Т614А или G226V, в белке VP1 капсида rAAV5 дикого типа или в белке VP1 капсида rAAV5, уже содержащего мутации S2A и T711S, приводило к существенному повышению выхода инкапсидированных вирусных частиц на основе rAAV5 с указанными мутациями (T614V, Т614А и G226V) по сравнению с капсидом rAAV5 дикого типа. К примеру, при помощи метода количественной ПЦР удалось выявить изменение количества копий упакованного гетерологичного генома частицы rAAV, кодирующего целевой ген GFP (Фигура 9).
При наличии мутаций T614V, S2A и T711S (AAV5-02Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 7,09 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,78E+10 вг/мл по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации T614V, S2A и T711S (AAV5-02Mut-GFP), и капсида VP1 содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,31 раза с 1,36Е+10 вг/мл до 1,78Е+10 вг/мл
При натичии мутаций Т614А, S2A и T711S (AAV5-03Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 4,78 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,20Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации Т614А, S2A и T711S (AAV5-03Mut-GFP), и капсида VP1 содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, статистически достоверно не изменялось.
При наличии мутаций G226V, S2A и T711S (AAV5-04Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 6,77 раза с 2,51Е+09 вг/мл до 1,70Е+10 вг/мл по сравнению с контрольным препаратом rAAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP). При сравнении препарата rAAV5 с белком капсида VP1, содержащего мутации G226V, S2A и T711S (AAV5-04Mut-GFP), и капсида VP1 содержащего только мутации S2A и T711S (AAV5-01Mut-GFP) количество упакованных вирусных геномов, увеличивалось в 1,25 раза с 1,36Е+10 вг/мл до 1,70Е+10 вг/мл.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"
dtdVersion="V1_3" fileName="AAV5.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-08-15">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>RU2021124727</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2021-08-20</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>AAV5 - 2021124727</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ
ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "АНАБИОН"</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>LIMITED LIABILITY COMPANY
"ANABION"</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Выделенный модифицированный белок
VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и
вектор на его основе</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>48</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>724</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..724</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Adeno-associated dependoparvovirus
B</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGY
NYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQ
AKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLG
ADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSN
ANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTS
TVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTG
NNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM
GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTT
ATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWA
KIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKEN
SKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>724</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..724</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGY
NYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQ
AKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLG
ADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSN
ANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTS
TVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTG
NNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM
GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTT
ATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWA
KIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKEN
SKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>724</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..724</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGY
NYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQ
AKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLG
ADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSN
ANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTS
TVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTG
NNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM
GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTT
ATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWA
KIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKEN
SKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>724</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..724</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGY
NYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQ
AKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLG
ADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSN
ANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTS
TVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTG
NNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM
GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTT
ATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWA
KIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKEN
SKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>724</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..724</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGY
NYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQ
AKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLG
ADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSN
ANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTS
TVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTG
NNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM
GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTT
ATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWA
KIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKEN
SKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>724</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..724</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGY
NYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQ
AKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLG
ADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSN
ANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTS
TVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTG
NNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM
GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTT
ATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWA
KIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKEN
SKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>724</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..724</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGY
NYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQ
AKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLG
ADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSN
ANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTS
TVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTG
NNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM
GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTT
ATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWA
KIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKEN
SKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>724</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..724</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGY
NYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQ
AKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLG
ADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSN
ANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTS
TVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTG
NNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM
GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTT
ATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWA
KIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKEN
SKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2175</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2175</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Adeno-associated dependoparvovirus
B</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaag
gtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatca
agcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcct
gtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagaca
acccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgg
gggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagag
ggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccg
aagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaat
cccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgac
aataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggggg
acagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagat
caaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtacttt
gactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggct
tcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccac
caccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctac
gtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacg
gttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagta
ctttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttc
cactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtacc
gcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacac
ctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgc
gccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgc
agccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaa
cagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagc
gagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctcca
ccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagaggga
cgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggcc
atgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaata
tcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtgga
gatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactac
aacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaa
cccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2175</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2175</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaag
gtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatca
agcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcct
gtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagaca
acccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgg
gggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagag
ggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccg
aagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaat
cccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgac
aataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggggg
acagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagat
caaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtacttt
gactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggct
tcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccac
caccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctac
gtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacg
gttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagta
ctttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttc
cactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtacc
gcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacac
ctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgc
gccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgc
agccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaa
cagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagc
gagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctcca
ccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagaggga
cgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggcc
atgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaata
tcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtgga
gatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactac
aacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaa
cccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2175</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2175</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaag
gtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatca
agcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcct
gtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagaca
acccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgg
gggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagag
ggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccg
aagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaat
cccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgac
aataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggtcg
acagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagat
caaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtacttt
gactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggct
tcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccac
caccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctac
gtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacg
gttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagta
ctttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttc
cactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtacc
gcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacac
ctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgc
gccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgc
agccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaa
cagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagc
gagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctcca
ccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagaggga
cgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggcc
atgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaata
tcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtgga
gatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactac
aacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaa
cccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2175</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2175</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaag
gtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatca
agcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcct
gtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagaca
acccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgg
gggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagag
ggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccg
aagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaat
cccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgac
aataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggtcg
acagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagat
caaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtacttt
gactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggct
tcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccac
caccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctac
gtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacg
gttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagta
ctttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttc
cactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtacc
gcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacac
ctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgc
gccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgc
agccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaa
cagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagc
gagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctcca
ccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagaggga
cgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggcc
atgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaata
tcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtgga
gatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactac
aacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaa
cccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2175</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2175</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaag
gtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatca
agcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcct
gtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagaca
acccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgg
gggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagag
ggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccg
aagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaat
cccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgac
aataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggggg
acagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagat
caaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtacttt
gactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggct
tcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccac
caccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctac
gtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacg
gttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagta
ctttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttc
cactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtacc
gcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacac
ctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgc
gccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgc
agccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaa
cagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagc
gagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctcca
ccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagaggga
cgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagaggccggggcgcactttcacccctctccggcc
atgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaata
tcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtgga
gatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactac
aacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaa
cccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2175</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2175</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaag
gtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatca
agcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcct
gtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagaca
acccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgg
gggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagag
ggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccg
aagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaat
cccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgac
aataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggggg
acagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagat
caaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtacttt
gactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggct
tcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccac
caccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctac
gtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacg
gttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagta
ctttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttc
cactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtacc
gcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacac
ctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgc
gccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgc
agccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaa
cagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagc
gagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctcca
ccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagaggga
cgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagaggccggggcgcactttcacccctctccggcc
atgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaata
tcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtgga
gatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactac
aacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaa
cccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2175</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2175</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaag
gtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatca
agcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcct
gtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagaca
acccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgg
gggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagag
ggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccg
aagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaat
cccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgac
aataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggggg
acagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagat
caaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtacttt
gactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggct
tcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccac
caccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctac
gtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacg
gttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagta
ctttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttc
cactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtacc
gcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacac
ctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgc
gccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgc
agccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaa
cagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagc
gagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctcca
ccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagaggga
cgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagaggtcggggcgcactttcacccctctccggcc
atgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaata
tcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtgga
gatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactac
aacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaa
cccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>2175</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..2175</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q32">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggcttttgttgatcaccctccagattggttggaagaagttggtgaag
gtcttcgcgagtttttgggccttgaagcgggcccaccgaaaccaaaacccaatcagcagcatcaagatca
agcccgtggtcttgtgctgcctggttataactatctcggacccggaaacggtctcgatcgaggagagcct
gtcaacagggcagacgaggtcgcgcgagagcacgacatctcgtacaacgagcagcttgaggcgggagaca
acccctacctcaagtacaaccacgcggacgccgagtttcaggagaagctcgccgacgacacatccttcgg
gggaaacctcggaaaggcagtctttcaggccaagaaaagggttctcgaaccttttggcctggttgaagag
ggtgctaagacggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaagaaggctcggaccg
aagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatcccagcagctgcaaat
cccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgac
aataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggggg
acagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagat
caaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtacttt
gactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggct
tcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccac
caccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctac
gtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacg
gttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagta
ctttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttc
cactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtacc
gcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacac
ctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgc
gccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgc
agccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaa
cagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagc
gagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctcca
ccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagaggga
cgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagaggtcggggcgcactttcacccctctccggcc
atgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaata
tcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtgga
gatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactac
aacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaa
cccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q34">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Adeno-associated dependoparvovirus
B</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPA
SSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSV
DGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIAN
NLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKM
LRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWF
PGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPAN
PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQG
PIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWEL
KKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q36">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPA
SSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSV
DGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIAN
NLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKM
LRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWF
PGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPAN
PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQG
PIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWEL
KKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q38">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPA
SSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSV
DGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIAN
NLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKM
LRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWF
PGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPAN
PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQG
PIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWEL
KKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q40">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPA
SSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSV
DGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIAN
NLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKM
LRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWF
PGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPAN
PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQG
PIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWEL
KKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="21">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q42">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPA
SSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSV
DGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIAN
NLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKM
LRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWF
PGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPAN
PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQG
PIWAKIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWEL
KKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="22">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q44">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPA
SSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSV
DGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIAN
NLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKM
LRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWF
PGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPAN
PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQG
PIWAKIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWEL
KKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="23">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q46">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPA
SSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSV
DGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIAN
NLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKM
LRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWF
PGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPAN
PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQG
PIWAKIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWEL
KKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="24">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q48">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPA
SSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSV
DGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIAN
NLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKM
LRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWF
PGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPAN
PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQG
PIWAKIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWEL
KKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="25">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1767</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1767</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q50">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Adeno-associated dependoparvovirus
B</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaaga
aggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatccca
gcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggc
ccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattcca
cgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccacca
gtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccc
tgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaaca
actactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggt
gcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactac
cagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgc
tgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttctt
ctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgag
gaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggacc
agtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggag
atacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctcc
ggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttacc
aggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacac
tatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatc
accagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaaca
accagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtg
gatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcac
ccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctg
tgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggca
ggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtac
acaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccacca
gacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="26">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1767</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1767</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q52">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaaga
aggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatccca
gcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggc
ccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattcca
cgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccacca
gtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccc
tgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaaca
actactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggt
gcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactac
cagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgc
tgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttctt
ctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgag
gaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggacc
agtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggag
atacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctcc
ggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttacc
aggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacac
tatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatc
accagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaaca
accagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtg
gatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcac
ccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctg
tgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggca
ggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtac
acaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcacca
gacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="27">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1767</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1767</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q54">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaaga
aggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatccca
gcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggc
ccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattcca
cgtggatggtcgacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccacca
gtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccc
tgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaaca
actactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggt
gcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactac
cagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgc
tgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttctt
ctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgag
gaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggacc
agtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggag
atacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctcc
ggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttacc
aggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacac
tatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatc
accagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaaca
accagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtg
gatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcac
ccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctg
tgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggca
ggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtac
acaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccacca
gacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="28">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1767</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1767</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q56">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaaga
aggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatccca
gcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggc
ccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattcca
cgtggatggtcgacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccacca
gtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccc
tgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaaca
actactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggt
gcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactac
cagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgc
tgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttctt
ctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgag
gaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggacc
agtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggag
atacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctcc
ggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttacc
aggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacac
tatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatc
accagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaaca
accagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtg
gatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcac
ccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctg
tgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggca
ggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtac
acaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcacca
gacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="29">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1767</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1767</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q58">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaaga
aggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatccca
gcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggc
ccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattcca
cgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccacca
gtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccc
tgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaaca
actactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggt
gcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactac
cagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgc
tgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttctt
ctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgag
gaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggacc
agtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggag
atacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctcc
ggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttacc
aggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacac
tatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatc
accagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaaca
accagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtg
gatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagaggccggggcgcactttcac
ccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctg
tgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggca
ggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtac
acaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccacca
gacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="30">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1767</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1767</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q60">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaaga
aggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatccca
gcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggc
ccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattcca
cgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccacca
gtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccc
tgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaaca
actactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggt
gcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactac
cagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgc
tgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttctt
ctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgag
gaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggacc
agtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggag
atacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctcc
ggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttacc
aggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacac
tatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatc
accagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaaca
accagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtg
gatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagaggccggggcgcactttcac
ccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctg
tgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggca
ggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtac
acaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcacca
gacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="31">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1767</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1767</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q62">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaaga
aggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatccca
gcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggc
ccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattcca
cgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccacca
gtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccc
tgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaaca
actactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggt
gcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactac
cagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgc
tgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttctt
ctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgag
gaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggacc
agtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggag
atacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctcc
ggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttacc
aggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacac
tatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatc
accagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaaca
accagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtg
gatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagaggtcggggcgcactttcac
ccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctg
tgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggca
ggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtac
acaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccacca
gacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="32">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1767</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1767</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q64">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acggcccctaccggaaagcggatagacgaccactttccaaaaagaaaga
aggctcggaccgaagaggactccaagccttccacctcgtcagacgccgaagctggacccagcggatccca
gcagctgcaaatcccagcccaaccagcctcaagtttgggagctgatacaatgtctgcgggaggtggcggc
ccattgggcgacaataaccaaggtgccgatggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattcca
cgtggatgggggacagagtcgtcaccaagtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccacca
gtaccgagagatcaaaagcggctccgtcgacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccc
tgggggtactttgactttaaccgcttccacagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaaca
actactggggcttcagaccccggtccctcagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggt
gcaggactccaccaccaccatcgccaacaacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactac
cagctgccctacgtcgtcggcaacgggaccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgc
tgccgcagtacggttacgcgacgctgaaccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttctt
ctgcctagagtactttcccagcaagatgctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgag
gaggtgcccttccactccagcttcgctcccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggacc
agtacttgtaccgcttcgtgagcacaaataacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggag
atacgccaacacctacaaaaactggttcccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctcc
ggggtcaaccgcgccagtgtcagcgccttcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttacc
aggtgcccccgcagccgaacggcatgaccaacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacac
tatgatcttcaacagccagccggcgaacccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatc
accagcgagagcgagacgcagccggtgaaccgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaaca
accagagctccaccactgcccccgcgaccggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtg
gatggagagggacgtgtacctccaaggacccatctgggccaagatcccagaggtcggggcgcactttcac
ccctctccggccatgggcggattcggactcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctg
tgcccggaaatatcaccagcttctcggacgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggca
ggtcaccgtggagatggagtgggagctcaagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtac
acaaacaactacaacgacccccagtttgtggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcacca
gacctatcggaacccgataccttacccgacccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="33">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q97">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Adeno-associated dependoparvovirus
B</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS
YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQV
KEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTE
RSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNK
NLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY
ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIV
PGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQ
YSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="34">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q68">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS
YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQV
KEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTE
RSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNK
NLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY
ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIV
PGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQ
YSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="35">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q70">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVVTKSTRTWVLPS
YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQV
KEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTE
RSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNK
NLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY
ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIV
PGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQ
YSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="36">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q72">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMVDRVVTKSTRTWVLPS
YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQV
KEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTE
RSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNK
NLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY
ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIV
PGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQ
YSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="37">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q74">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS
YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQV
KEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTE
RSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNK
NLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY
ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIV
PGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQ
YSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="38">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q76">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS
YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQV
KEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTE
RSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNK
NLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY
ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIV
PGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEAGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQ
YSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="39">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q78">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS
YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQV
KEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTE
RSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNK
NLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY
ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIV
PGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQ
YSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="40">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>532</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..532</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q98">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS
YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQV
KEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTE
RSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNK
NLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTY
ALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIV
PGSVWMERDVYLQGPIWAKIPEVGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQ
YSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="41">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1599</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1599</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q82">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Adeno-associated dependoparvovirus
B</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccg
atggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaa
gtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtc
gacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttcc
acagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccct
cagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaac
aacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacggga
ccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaa
ccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatg
ctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctc
ccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaa
taacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttc
ccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgcct
tcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgac
caacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaac
ccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtga
accgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgac
cggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaagga
cccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggac
tcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcgga
cgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctc
aagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttg
tggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaacccgataccttacccg
acccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="42">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1599</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1599</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q84">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccg
atggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaa
gtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtc
gacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttcc
acagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccct
cagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaac
aacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacggga
ccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaa
ccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatg
ctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctc
ccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaa
taacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttc
ccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgcct
tcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgac
caacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaac
ccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtga
accgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgac
cggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaagga
cccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggac
tcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcgga
cgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctc
aagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttg
tggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaacccgataccttacccg
acccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="43">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1599</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1599</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q86">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccg
atggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggtcgacagagtcgtcaccaa
gtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtc
gacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttcc
acagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccct
cagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaac
aacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacggga
ccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaa
ccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatg
ctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctc
ccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaa
taacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttc
ccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgcct
tcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgac
caacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaac
ccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtga
accgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgac
cggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaagga
cccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggac
tcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcgga
cgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctc
aagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttg
tggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaacccgataccttacccg
acccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="44">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1599</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1599</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q88">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccg
atggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatggtcgacagagtcgtcaccaa
gtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtc
gacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttcc
acagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccct
cagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaac
aacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacggga
ccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaa
ccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatg
ctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctc
ccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaa
taacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttc
ccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgcct
tcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgac
caacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaac
ccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtga
accgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgac
cggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaagga
cccatctgggccaagatcccagagacgggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggac
tcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcgga
cgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctc
aagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttg
tggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaacccgataccttacccg
acccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="45">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1599</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1599</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q90">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccg
atggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaa
gtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtc
gacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttcc
acagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccct
cagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaac
aacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacggga
ccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaa
ccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatg
ctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctc
ccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaa
taacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttc
ccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgcct
tcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgac
caacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaac
ccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtga
accgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgac
cggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaagga
cccatctgggccaagatcccagaggccggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggac
tcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcgga
cgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctc
aagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttg
tggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaacccgataccttacccg
acccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="46">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1599</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1599</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q92">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccg
atggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaa
gtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtc
gacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttcc
acagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccct
cagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaac
aacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacggga
ccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaa
ccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatg
ctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctc
ccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaa
taacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttc
ccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgcct
tcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgac
caacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaac
ccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtga
accgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgac
cggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaagga
cccatctgggccaagatcccagaggccggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggac
tcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcgga
cgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctc
aagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttg
tggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaacccgataccttacccg
acccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="47">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1599</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1599</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q94">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccg
atggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaa
gtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtc
gacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttcc
acagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccct
cagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaac
aacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacggga
ccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaa
ccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatg
ctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctc
ccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaa
taacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttc
ccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgcct
tcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgac
caacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaac
ccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtga
accgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgac
cggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaagga
cccatctgggccaagatcccagaggtcggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggac
tcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcgga
cgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctc
aagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttg
tggactttgccccggacagcaccggggaatacagaaccaccagacctatcggaacccgataccttacccg
acccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="48">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1599</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1599</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q96">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtctgcgggaggtggcggcccattgggcgacaataaccaaggtgccg
atggagtgggcaatgcctcgggagattggcattgcgattccacgtggatgggggacagagtcgtcaccaa
gtccacccgaacctgggtgctgcccagctacaacaaccaccagtaccgagagatcaaaagcggctccgtc
gacggaagcaacgccaacgcctactttggatacagcaccccctgggggtactttgactttaaccgcttcc
acagccactggagcccccgagactggcaaagactcatcaacaactactggggcttcagaccccggtccct
cagagtcaaaatcttcaacattcaagtcaaagaggtcacggtgcaggactccaccaccaccatcgccaac
aacctcacctccaccgtccaagtgtttacggacgacgactaccagctgccctacgtcgtcggcaacggga
ccgagggatgcctgccggccttccctccgcaggtctttacgctgccgcagtacggttacgcgacgctgaa
ccgcgacaacacagaaaatcccaccgagaggagcagcttcttctgcctagagtactttcccagcaagatg
ctgagaacgggcaacaactttgagtttacctacaactttgaggaggtgcccttccactccagcttcgctc
ccagtcagaacctcttcaagctggccaacccgctggtggaccagtacttgtaccgcttcgtgagcacaaa
taacactggcggagtccagttcaacaagaacctggccgggagatacgccaacacctacaaaaactggttc
ccggggcccatgggccgaacccagggctggaacctgggctccggggtcaaccgcgccagtgtcagcgcct
tcgccacgaccaataggatggagctcgagggcgcgagttaccaggtgcccccgcagccgaacggcatgac
caacaacctccagggcagcaacacctatgccctggagaacactatgatcttcaacagccagccggcgaac
ccgggcaccaccgccacgtacctcgagggcaacatgctcatcaccagcgagagcgagacgcagccggtga
accgcgtggcgtacaacgtcggcgggcagatggccaccaacaaccagagctccaccactgcccccgcgac
cggcacgtacaacctccaggaaatcgtgcccggcagcgtgtggatggagagggacgtgtacctccaagga
cccatctgggccaagatcccagaggtcggggcgcactttcacccctctccggccatgggcggattcggac
tcaaacacccaccgcccatgatgctcatcaagaacacgcctgtgcccggaaatatcaccagcttctcgga
cgtgcccgtcagcagcttcatcacccagtacagcaccgggcaggtcaccgtggagatggagtgggagctc
aagaaggaaaactccaagaggtggaacccagagatccagtacacaaacaactacaacgacccccagtttg
tggactttgccccggacagcaccggggaatacagaagcaccagacctatcggaacccgataccttacccg
acccctttaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (71)
1. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5), содержащий аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одной или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
G226V;
S2A, G226V и T711S;
Т614А;
S2A, Т614А и T711S;
T614V; или
S2A, T614V и T711S;
где аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.
2. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1, который включает замену в положении G226V.
3. Выделенный модифицированный белок VP 1 капсида AAV5 по п. 2, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.
4. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1, который включает замены S2A, G226V и Т711S.
5. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 4, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4.
6. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1, который включает замену Т614А.
7. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 6, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5.
8. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1, который включает замены S2A, Т614А и Т711S.
9. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 8, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6.
10. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1, который включает замену T614V.
11. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 10, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7.
12. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 1, который включает замены S2A, T614V и Т711S.
13. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п. 12, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.
14. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа по любому из пп. 1-13, который используется для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
15. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой G226V, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 11 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
16. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, G226V и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 12 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
17. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой Т614А, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 13 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
18. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, Т614А и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 14 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
19. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотной заменой T614V, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 15 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
20. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа с аминокислотными заменами S2A, T614V и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 16 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.
21. Выделенный капсид для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа, который включает модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа по любому из пп. 1-13.
22. Выделенный капсид по п. 21, который включает модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа по любому из пп. 1-13, белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
23. Выделенный капсид по п. 22, который включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
24. Выделенный капсид по п. 23, который включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17.
25. Выделенный капсид по п. 22, который включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
26. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V.
27. Выделенный капсид по п. 26, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену G90V, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19.
28. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S.
29. Выделенный капсид по п. 28, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены G90V и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20.
30. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А.
31. Выделенный капсид по п. 30, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену Т478А, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21.
32. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены Т478А и T575S.
33. Выделенный капсид по п. 32, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены Т478А и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22.
34. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V.
35. Выделенный капсид по п. 34, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T478V, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23.
36. Выделенный капсид по п. 25, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S.
37. Выделенный капсид по п. 36, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены T478V и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24.
38. Выделенный капсид по п. 22, который включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
39. Выделенный капсид по п. 38, который включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33.
40. Выделенный капсид по п. 22, который включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
41. Выделенный капсид по п. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V.
42. Выделенный капсид по п. 41, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену G34V, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35.
43. Выделенный капсид по п. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S.
44. Выделенный капсид по п. 43, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены G34V и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 36.
45. Выделенный капсид по п. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А.
46. Выделенный капсид по п. 45, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену Т422А, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 37.
47. Выделенный капсид по п. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S.
48. Выделенный капсид по п. 47, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены Т422А и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 38.
49. Выделенный капсид по п. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V.
50. Выделенный капсид по п. 49, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T422V, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 39.
51. Выделенный капсид по п. 40, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S.
52. Выделенный капсид по п. 51, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены T422V и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40.
53. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая капсид по любому из пп. 21-52, который используется для получения вирусных векторов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа.
54. Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа по любому из пп. 1-13 или капсид по любому из пп. 21-52, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
55. Вектор на основе rAAV5 по п. 54, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
56. Фармацевтическая композиция для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, содержащая:
a) вектор на основе rAAV5 по любому из пп. 54-55; и
b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
57. Способ доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту вектора на основе rAAV5 по любому из пп. 54-55 или фармацевтической композиции по п. 56.
58. Применение вектора на основе rAAV5 по любому из пп. 54-55 или фармацевтической композиции по п. 56 для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
59. Применение по п. 58, где заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
60. Способ получения вектора на основе rAAV5 по любому из пп. 54-55, который включает трансфекцию клеток-продуцентов нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа, по любому из пп. 14-20 или нуклеиновой кислотой, кодирующей капсид, по п. 53.
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ARP220102251A AR126840A1 (es) | 2021-08-20 | 2022-08-19 | Proteína de la cápside vp1 modificada aislada del virus adeno-asociado de serotipo 5 (aav5), cápside y vector basado en esta |
| MA64619A MA64619A1 (fr) | 2021-08-20 | 2022-08-21 | Protéine modifiée séparée vp1 de capside aav5 |
| AU2022329630A AU2022329630A1 (en) | 2021-08-20 | 2022-08-21 | Isolated modified aav5 capsid protein vp1 |
| IL310961A IL310961A (en) | 2021-08-20 | 2022-08-21 | Adapted and isolated VP1 envelope protein of adeno-associated virus serotype 5, envelope and vector based on it |
| PCT/RU2022/050257 WO2023022633A1 (ru) | 2021-08-20 | 2022-08-21 | Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 |
| CA3229587A CA3229587A1 (en) | 2021-08-20 | 2022-08-21 | Isolated modified capsid protein vp1 from adeno-associated virus serotype 5 (aav5), capsid and vector based thereon |
| EP22858843.0A EP4389759A1 (en) | 2021-08-20 | 2022-08-21 | Isolated modified aav5 capsid protein vp1 |
| CN202280056600.2A CN117881689A (zh) | 2021-08-20 | 2022-08-21 | 分离的修饰的aav5衣壳蛋白vp1 |
| TW111131554A TW202315947A (zh) | 2021-08-20 | 2022-08-22 | 血清型５的腺伴隨病毒（ａａｖ５）的分離的修飾的ｖｐ１衣殼蛋白、基於其的衣殼和載體 |
| CONC2024/0001681A CO2024001681A2 (es) | 2021-08-20 | 2024-02-16 | Proteína vp1 modificada y aislada de la cápside del virus adenoasociado del serotipo 5 (aav5), cápside y vector basados en esta |
| ECSENADI202413075A ECSP24013075A (es) | 2021-08-20 | 2024-02-19 | Proteina de cápside de aav5 modificada aislada vp1 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2820088C1 true RU2820088C1 (ru) | 2024-05-28 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070238684A1 (en) * | 1998-06-19 | 2007-10-11 | Medigene Aktiengesellschaft | AAV scleroprotein, production and use thereof |
| US20150023924A1 (en) * | 2013-07-22 | 2015-01-22 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues |
| US20160201088A1 (en) * | 2001-12-17 | 2016-07-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences, vectors containing same, and uses therefor |
| RU2019126509A (ru) * | 2019-08-22 | 2021-06-04 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Анабион" | Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070238684A1 (en) * | 1998-06-19 | 2007-10-11 | Medigene Aktiengesellschaft | AAV scleroprotein, production and use thereof |
| US20160201088A1 (en) * | 2001-12-17 | 2016-07-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences, vectors containing same, and uses therefor |
| US20150023924A1 (en) * | 2013-07-22 | 2015-01-22 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues |
| RU2019126509A (ru) * | 2019-08-22 | 2021-06-04 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Анабион" | Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NASO M. et al. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy, BioDrugs, 2017, v. 31(4): 317-334. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210040156A1 (en) | Capsid-modified raav vectors and methods of use | |
| US11767346B2 (en) | Modified AAV capsid proteins and uses thereof | |
| CN116209768A (zh) | 用于通过高变区交换工程化新杂合aav衣壳的方法 | |
| US20220306696A1 (en) | Isolated modified vp1 capsid protein of aav5 | |
| RU2820088C1 (ru) | Выделенный модифицированный белок VPI капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе | |
| TW202208407A (zh) | 使用質膜修復蛋白(dysferlin)雙載體之基因療法 | |
| EP4389759A1 (en) | Isolated modified aav5 capsid protein vp1 | |
| EP4389760A1 (en) | Isolated modified aav9 capsid protein vp1 | |
| EA045824B1 (ru) | Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 | |
| EA045749B1 (ru) | Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая белок smn1, и ее применение |