EA045824B1 - Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 - Google Patents
Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 Download PDFInfo
- Publication number
- EA045824B1 EA045824B1 EA202290647 EA045824B1 EA 045824 B1 EA045824 B1 EA 045824B1 EA 202290647 EA202290647 EA 202290647 EA 045824 B1 EA045824 B1 EA 045824B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- aav5
- capsid
- isolated
- modified
- protein
- Prior art date
Links
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 title description 3
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 title description 3
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 title description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 137
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 124
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 104
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 99
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 claims description 98
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 96
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 85
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 82
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 65
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 62
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 62
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 59
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 59
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 claims description 59
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 41
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 41
- 101710197665 Capsid protein VP2 Proteins 0.000 claims description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 37
- 101800001319 Capsid protein VP3 Proteins 0.000 claims description 35
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 35
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 35
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 25
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 23
- 101000805768 Banna virus (strain Indonesia/JKT-6423/1980) mRNA (guanine-N(7))-methyltransferase Proteins 0.000 claims description 21
- 101000686790 Chaetoceros protobacilladnavirus 2 Replication-associated protein Proteins 0.000 claims description 21
- 101000864475 Chlamydia phage 1 Internal scaffolding protein VP3 Proteins 0.000 claims description 21
- 101000803553 Eumenes pomiformis Venom peptide 3 Proteins 0.000 claims description 21
- 101000583961 Halorubrum pleomorphic virus 1 Matrix protein Proteins 0.000 claims description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 11
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 9
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 8
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 8
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 8
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 8
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 claims description 7
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 4
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 claims 1
- 229960000027 human factor ix Drugs 0.000 claims 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 54
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 23
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 9
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Chemical group 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Chemical group 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 6
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 5
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 4
- -1 without limitation Proteins 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Chemical group 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- YUXKOWPNKJSTPQ-AXWWPMSFSA-N (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoic acid;(2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O.C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O YUXKOWPNKJSTPQ-AXWWPMSFSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- GQOKIYDTHHZSCJ-UHFFFAOYSA-M dimethyl-bis(prop-2-enyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C=CC[N+](C)(C)CC=C GQOKIYDTHHZSCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 241000649047 Adeno-associated virus 12 Species 0.000 description 1
- 101100524317 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 208000027219 Deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000121256 Densovirinae Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101001128634 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015178 Hurler syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 206010056886 Mucopolysaccharidosis I Diseases 0.000 description 1
- 102100032194 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241000121250 Parvovirinae Species 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 1
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 201000009628 adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009025 developmental regulation Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000007345 glycogen storage disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000009116 palliative therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000007180 physiological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 101150057323 sar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области генной терапии и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который содержит одну или несколько аминокислотных замен по сравнению с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые повышают эффективность трансдукции, а также к капсиду и вектору на его основе.
Уровень изобретения
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой (20 нм), неспособный к самостоятельной репликации, безоболочечный вирус. У человека и приматов описано множество различных серотипов AAV. Геном аденоассоциированного вируса содержит (+ или -) одноцепочечную ДНК (ssDNA) длиной около 4,7 тысяч нуклеотидов. На концах молекулы геномной ДНК располагаются инвертированные концевые повторы (англ. inverted terminal repeats, ITRs). Геном содержит две открытые рамки считывания (англ. ORF): Rep и Сар, содержащих в себе несколько альтернативных рамок считывания, кодирующих различные белковые продукты. Продукты Rep имеют важное значение для репликации AAV, при этом ген Сар, помимо других альтернативных продуктов, кодирует 3 капсидных белка (VP1, VP2 и VP3). Белки VP1, VP2 и VP3 находятся в соотношении 1:1:10, образуя икосаэдрический капсид (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:10405-10410). При образовании рекомбинантного вектора AAV (rAAV) кассета экспрессии, фланкированная ИКП, упаковывается в капсид AAV. Гены, необходимые для репликации AAV, не входят в кассету. Рекомбинантный AAV считается самым безопасным и одним из наиболее широко используемых вирусных векторов для переноса генов in vivo. Векторы могут инфицировать клетки из тканей множества типов, обеспечивая мощную и устойчивую трансгенную экспрессию. Они также являются непатогенными и имеют низкий профиль иммуногенности (High KA et al., rAAV human trial experience Methods Mol Biol. 2011; 807:429-57).
Одной из насущных целей исследований в области разработки эффективной генотерапии является оптимизация векторов для максимальной тканевой трансдукции при минимизации дозы вектора.
Известно, что различные серотипы AAV характеризуются сродством к различным рецепторам на поверхности клеток-хозяев, к которым они обладают тропизмом. Так основным известным рецептором для AAV2 является гепарансульфат-протеогликан, корецепторами выступают интегриновый гетеродимер aVe5, рецептор фактора роста фибробластов первого типа и рецептор фактора роста гепатоцитов, сMet. AAV12 связывается с гепарансульфат-протеогликанами и сиаловой кислотой. AAV4 и AAV5 связываются с N- и О-связанными сиаловыми кислотами соответственно. AAV5 задействует рецептор фактора роста тромбоцитов. При этом установлена связь между аминокислотной последовательностью белков капсида AAV с процессом его сборки, инкапсидирования генома и сродством к различным типам рецепторов, репрезентированных на поверхности клеток-хозяев (Govindasamy L. et. al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 2013 Oct;87(20):11187-99).
В международной заявке WO 2012145601 описаны вирионы аденоассоциированного вируса (AAV) с вариантным капсидным белком, где вирионы AAV демонстрируют большую инфекционность ретинальной клетки, когда вводятся интравитреальной инъекцией, по сравнению с AAV дикого типа.
В международной заявке WO 2013158879 описан вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей капсидный белок VP1, который содержит одну или несколько замен лизина, где одна замена лизина представляет K137R, где упомянутая замена лизина является эффективной для ингибирования убиквитинирования упомянутого капсидного белка, и тем самым увеличивается трансдукция упомянутого вектора AAV в клетке-мишени.
На данный момент существует потребность в AAV с улучшенной трансдуцирующей способностью, которые включают в своей структуре различные трансгены, в том числе клинически важные трансгены, для нуждающихся в этом пациентов. Улучшение тканевой трансдукции позволяет минимизировать дозы вводимого субъекту вектора.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких аминокислотных замен в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, которые выбраны из группы:
S651A,
S2A и T711S или
S2A, S651A и T711S, приводит к повышению эффективности трансдукции клеток-мишеней с помощью вектора на основе AAV серотипа 5 с данной(ыми) модификацией(ями) и существенному увеличению эффективности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями.
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, содержащему аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одой или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
- 1 045824
S651A,
S2A и T711S,
S2A, S651A и T711S.
В некоторых вариантах аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает одну замену в положении S651A.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A и T711S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, S651A и T711S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651A, представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 5 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651A.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и T711S, представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 6 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и T711S.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок капсида VP1 аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и T711S, представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 7 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и T711S.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному капсиду для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, который включает вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах выделенный капсид включает вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ IDNO: 11.
- 2 045824
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T519S.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и T519S.
В некоторых вариантах выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный капсид, который используется для высокоэффективной трансдукции клетокмишеней.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) вышеуказанный капсид, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой терапевтический полипептид, где терапевтический полипептид представляет собой фактор свертывания крови, выбираемый из группы, состоящей из фактора VIII, фактора IX или их функционального варианта.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, которая содержит:
a) вышеуказанный вектор на основе rAAV5; и
b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту вышеуказанного вектора на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции.
В некоторых вариантах способ доставки генного продукта используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного вектора на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
В некоторых вариантах применение используется для лечения заболевания у нуждающегося в этом человека.
В некоторых вариантах применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание крови.
В некоторых вариантах применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание мышц.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой наследственное заболевание.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанного век
- 3 045824 тора на основе rAAV5, который включает трансфекцию клеток-продуцентов вышеуказанной нуклеиновой кислотой, кодирующей вышеуказанный капсид.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Кольцевая схема плазмиды pAAV-linker, предназначенной для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV пятого серотипа.
AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, pUC origin- pUC ориджин репликации в бактериях, ITR - инвертированные терминальные повторы, CMV-Promoter - промотор ранних генов цитомегаловируса,
Poly A - последовательность сигнала полиаденилирования, для повышения стабильности мРНК, HBG Intron - (human beta globine intron), фрагмент гена β глобина человека, несущий интрон, GFP- ген зеленого флуоресцентного белка,
Т2А - 2А расщепляющийся пептид, позволяет осуществлять коэкспрессию целевого и репортерного белков.
Фиг. 2. Кольцевая схема плазмиды pAAV-Rep, предназначенной для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV пятого серотипа из библиотеки случайных вариантов.
AmpR- ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, pUC origin- pUC ориджин репликации в бактериях,
Rep genes - последовательность гена Rep, кодирующая белки репликации AAV.
Фиг. 3. Кольцевая схема плазмиды pHelper, предназначенной для наработки рекомбинантных вирусных препаратов дикого типа AAV пятого серотипа из библиотеки случайных вариантов.
AmpR- ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, Ori- ориджин репликации в бактериях,
Adeno E2A - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno E4 - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК,
Adeno VARNA - последовательность гена хелперного аденовируса, отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов.
Фиг. 4. Анализ эффективности трансдукции клеток CHO-K1-S вирусными препаратами на основе AAV5-GFP, где белок VP1 капсида AAV5 дикого типа, включает одну или несколько аминокислотных замен.
Фиг. 5. Анализ концентрации белка hFIX в среде, собранной с клеток CHO-K1-S спустя 7 дней после трансдукции вирусными препаратами на основе AAV5-hFIX, где белок VP1 капсида AAV5 дикого типа, включает одну или несколько аминокислотных замен.
Фиг. 6. Положение белков капсида AAV5 в геноме. 2087-4258 п.н-VPI, 2495-4258 п.н-VP2, 26634258 п.н-VP3.
Описание изобретения
Определения и общие методы.
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
Выделенный означает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природе присутствующие в животном, не являются выделенными, но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, сопутствующих им в их природном состоянии, являются выделенными. Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать, по существу, в очищенной форме или могут существовать в неприродном окружении, таком как, например, генетически модифицированной клетке.
Определения встречающийся в природе, нативный или дикого типа используют для описания объекта, который можно обнаружить в природе как отличающийся от получаемого искусственно. Например, белок или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирус), которые можно изолировать из источника в природе, и которые не модифицированы умышленно специалистом в лаборатории, являются встречающимися в природе.
Термин геном относится к полному генетическому материалу организма.
- 4 045824
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова включать и содержать или их вариации, такие как имеющий, включает, включающий, содержит или содержащий, следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.
Белок (пептид).
В настоящем описании, термины пептид, полипептид и белок используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не существует ограничений по максимальному количеству аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Как применяют в настоящем описании, термин относится и к коротким цепям, также общепринято обозначаемым в этой области, например, как пептиды, олигопептиды и олигомеры, и к более длинным цепям, как правило, обозначаемым в этой области как белки, множество типов которых существует. Полипептиды включают, помимо прочего, например, биологически активные фрагменты, по существу, гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитные белки. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.
Термины трасформация, трансфекция, трансдукция относятся к любому способу или средствам, с помощью которых нуклеиновая кислота вводится в клетку или организм-хозяин, и могут быть использованы взаимозаменяемо для передачи аналогичного значения. Такие способы включают в себя без ограничения трансфекцию, электропорацию, микроинъекции, инфицирование, ПЭГ-сплавление и тому подобное.
Молекулы нуклеиновых кислот.
Термины нуклеиновая кислота, нуклеиновая последовательность или нуклеиновокислотная последовательность, полинуклеотид, олигонуклеотид, полинуклеотидная последовательность и нуклеотидная последовательность, которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.
Специалист в этой области имеет общие знания о том, что нуклеиновые кислоты являются полинуклеотидами, которые можно гидролизовать до мономерных нуклеотидов. Мономерные нуклеотиды можно гидролизовать в нуклеозиды. Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ПЦР и т.п., и способами синтеза.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислотыпримеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты нуклеазы. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия нуклеазы, например, в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.
Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.
Аденоассоциированный вирус (AAV).
Вирусы семейства Parvoviridae представляют собой небольшие ДНК-содержащие вирусы животных. Семейство Parvoviridae может быть разделено на два подсемейства: Parvovirinae, представители которого инфицируют позвоночных животных, и Densovirinae, представители которого инфицируют насе
- 5 045824 комых. К 2006 году были описаны 11 серотипов аденоассоциированного вируса (Mori, S. ET AL., 2004, Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein, Virology, T. 330 (2): 375-83). Все известные серотипы могут инфицировать клетки многих видов тканей. Тканевая специфичность определяется серотипом белков капсида, поэтому векторы на основе аденоассоциированого вируса конструируют, задавая необходимый серотип. Дополнительная информация по парвовирусам и другим представителям Parvoviridae описана в литературе (Kenneth I. Berns, Parvoviridae: The Viruses and Their Replication, Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)).
Геномная организация всех известных серотипов AAV очень сходна. Геном AAV представляет собой линейную одноцепочечную молекулу ДНК, которая содержит менее чем примерно 5000 нуклеотидов (нт) в длину. Инвертированные концевые повторы (ITR) фланкируют уникальные кодирующие нуклеотидные последовательности репликации неструктурных белков (Rep) и структурных белков (Сар). Ген Сар кодирует белки VP (VP1, VP2 и VP3), которые образуют капсид. Концевые 145 нуклеотидов являются самокомплементарными и организованы таким образом, что может быть сформирован энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпилечную структуру. Такие шпилечные структуры функционируют как точки начала репликации ДНК вируса, являясь праймерами для клеточного ДНК-полимеразного комплекса. После инфекции клеток млекопитающих AAV дикого типа (wtAAV) гены Rep (например, Rep78 и Rep52) экспрессируются с помощью Р5 промотора и Р19 промотора, соответственно, и оба белка Rep выполняют определенную функцию в репликации генома вируса. Сплайсинг в открытой рамке считывания Rep (Rep ORF) приводит к экспрессии фактически четырех белков Rep (например, Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40). Однако было показано, что несплайсированная мРНК, кодирующая белки Rep78 и Rep52, является достаточной для продукции вектора AAV в клетках млекопитающих.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).
Термин вектор при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена.
Фраза рекомбинантный вектор AAV (или вектор rAAV) в контексте настоящего описания относится к вектору, содержащему одну или несколько интересующих полинуклеотидных последовательностей, интересующих генов или трансгенов, которые фланкированы парвовирусными или инвертированными концевыми повторяющимися последовательностями (ITR).
Термины инфекционная единица (ие), инфекционная частица или репликационная единица, как используется в отношении вирусного титра, относятся к числу инфекционных частиц рекомбинантного вектора AAV, которое измеряют посредством анализа инфекционных центров, также известного как анализ репликационных центров, описанный, например, в публикации McLaughlin et al., J. Virol. (1988) 62:1963-1973.
Термин гетерологичный, когда он относится к последовательностям нуклеиновых кислот, таким как кодирующие последовательности и последовательности регуляции, обозначает последовательности, которые обычно не соединены вместе и/или обычно не связаны с конкретной клеткой. Таким образом, гетерологичная область конструкции нуклеиновой кислоты или вектора представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, расположенный внутри или присоединенный к другой молекуле нуклеиновой кислоты, которая в природе не найдена совместно с другой молекулой. Например, гетерологичная область конструкции нуклеиновой кислоты может содержать кодирующую последовательность, фланкированную последовательностями, которые в природе не найдены совместно с кодирующей последовательностью. Другой пример гетерологичной кодирующей последовательности представляет собой конструкцию, где сама кодирующая последовательность не найдена в природе (например, синтетические последовательности, которые содержат кодоны, отличные от нативного гена).
В контексте настоящего описания термин функционально связанный относится к связи полинуклеотидных (или полипептидных) элементов в функциональную связь. Нуклеиновая кислота является функционально связанной, если она находится в условиях функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, регуляторная последовательность транскрипции функционально связана с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию указанной кодирующей последовательности. Термин функционально связанный означает, что связанные последовательности ДНК являются, как правило, непрерывными, и при необходимости соединения двух участков, кодирующих белок, являются также непрерывными и находятся в рамке считывания.
В контексте настоящего описания термин промотор или регуляторная последовательность транскрипции или регуляторная последовательность относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который контролирует транскрипцию одной или нескольких кодирующих последовательностей, и который расположен против направления считывания информации относительно направления транскрипции от сайта инициации транскрипции кодирующей последовательности, а также который структурно идентифицируется по наличию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и других последовательностей ДНК, включающих, без ограничения, сайты связывания фактора транскрипции, сайты связывания репрессора и активатора белка, а также любые другие последовательности нуклеотидов, известные специалистам в данной области, которые непосредственно или
- 6 045824 опосредованно регулируют уровень транскрипции с данным промотором. Конститутивный промотор представляет собой такой промотор, который активен в большинстве тканей в обычных физиологических условиях и условиях развития. Индуцибельный промотор представляет собой промотор, который подвергается физиологической регуляции или регуляции в ходе развития, например, при воздействии химического индуктора. Тканеспецифичный промотор активен только в конкретных типах тканей или клеток.
Термины энхансеры или энхансер, используемые в изобретении, могут относиться к последовательности ДНК, которая расположена как смежная с последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантный продукт. Энхансерные элементы обычно расположены в 5'-направлении от промоторного элемента или могут быть расположены ниже или в пределах кодирующей последовательности ДНК (например, последовательности ДНК, транскрибированной или транслированной в рекомбинантный продукт или продукты). Таким образом, энхансерный элемент может быть расположен на расстоянии 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или больше пар оснований перед последовательностью ДНК, которая кодирует рекомбинантный продукт, или после этой последовательности. Энхансерные элементы могут увеличивать количество экспрессируемого рекомбинантного продукта от последовательности ДНК, превышая экспрессию, обусловленную одиночным промоторным элементом. Специалистам в данной области техники доступно множество энхансерных элементов.
Термин селектируемый маркерный ген относится к гену, который при экспрессии придает трансформированной клетке селектируемый фенотип, например, устойчивость к антибиотикам.
Как применяют в настоящем описании, термин экспрессия определяют как транскрипцию и/или трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемую ее промотором.
Применение для лечения.
Генная терапия представляет собой вставку генов в клетки и/или тканей субъекта для лечения заболевания, обычно, наследственных заболеваний, при этом дефектный мутантный аллель заменяется или дополняется функциональным аллелем.
Лечить, лечение и терапия относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, термин облегчить болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на лечение включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Термин нарушение означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения.
Заболевание является состоянием здоровья животного, где животное не может поддерживать гомеостаз, и где, если заболевание не облегчают, то здоровье животного продолжает ухудшаться.
Термин субъект, пациент, индивидуум и т.п. используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к любому животному, поддающемуся воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект, пациент или индивидуум является человеком.
Терапевтически эффективным количеством считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.
Понятие хроническое применение относится к непрерывному (продолжительному) применению агента(ов) в противоположность острому (кратковременному) пути введения, так чтобы поддерживать первоначальное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени.
Прерывистое применение обозначает лечение, которое не осуществляют последовательно без перерывов, но которое скорее по своей природе является периодическим.
Подробное описание изобретения
Выделенной модифицированной белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному модифицированному белку VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, содержащий аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одой или несколькими заменами, которые выбраны из группы:
S651A,
S2A и T711S,
S2A, S651A и T711S.
Под аминокислотной заменой S2A подразумевается замена серина (Ser, S) в положении 2 белка VP1
- 7 045824 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа дикого типа на аланин (Ala, A).
Под аминокислотной заменой S651A подразумевается замена серина (Ser, S) в положении 651 белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа дикого типа на аланин (Ala, A).
Под аминокислотной заменой T711S подразумевается замена треонина (Thr, T) в положении 711 белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа дикого типа на серина (Ser, S).
В некоторых вариантах аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGN GLDRGEPVNRADEVAREHDTSYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGN LGK A VF Q AKKR VLEPF GL VEEGAKT APTGKRIDDHFPKRKK ARTEEDSKP STS SD АЕ AGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTW MGDRVVTKSTRTWVEPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFH SHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTD DDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPS KMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFN KNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQV PPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRV AYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGA HFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWE LKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 1).
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает одну замену в положении S651A.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGN GLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGN LGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAE AGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTW MGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFH SHWSPRDWQRE1NNYWGFRPRSLRVKIFN1QVKEVTVQDSTTT1ANNLTSTVQVFTD DDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPS KMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFN KNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQV PPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMTFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRV AYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGA HFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFADVPVSSFITQYSTGQVTVEMEW ELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 2).
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A и T711S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPG NGLDRGEP VNR ADE VAREHDIS YNEQLE AGDNP YLK YNH AD AEFQEKL ADDTSF GG
- 8 045824
NLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDA EAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDST WMGDRVVFKSTRTWVLPSYNNHQYRE1KSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRF HSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNTQVKEVTVQDSTTTTANNLTSTVQVFT DDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFP SKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQF NKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQ VPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNR VAYNVGGQMATNNQSSFFAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETG AHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEME WELKKENSKRWNPEIQ YTNNYNDPQF VDF APDSTGE YRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 3).
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 включает замены S2A, S651A и T711S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MAFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPG NGLDRGEPVNRADEVAREHD1SYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGG NLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDA EAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDST WMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRF HSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFT DDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNFENPTERSSFFCLEYFP SKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQF NKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQ VPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNR VAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETG AHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNFPVPGN1FSFADVPVSSFITQYSTGQVTVEME WELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRSTRP1GTRYLTRPL (SEQ ID NO: 4).
Выделенные модифицированные белки VP2 и VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
Правая часть (+)-цепи геномной ДНК аденоассоциированного вируса содержит перекрывающиеся последовательности, кодирующие три белка капсида - VP1, VP2 и VP3.
Транскрипция этих генов начинается с одного промотора, р40. Молекулярная масса соответствующих белков составляет 87, 72 и 62 кДа, соответственно. Все три белка транслируются с одной мРНК. После транскрипции пре-мРНК может подвергаться сплайсингу двумя разными способами, при этом вырезается более длинный или более короткий интрон и образуются мРНК длиной 2300 или 2600 нуклеотидов.
Таким образом, введение мутаций в ген Cas будет влиять не только на белок VP1 капсида AAV5, но и на VP2 и Vp3 капсида AAV5.
На фиг. 6 приведено схематичное изображение положения белков капсида AAV5 в геноме AAV:
2087-4258 п.н-VPI,
2495-4258 п.н-VP2,
2663-4258 п.н-VP3.
Из вышеизложенного следует, что мутация аналогичная мутации S2A в VP1 будет отсутствовать в VP2 и VP3, а, в свою очередь, мутации аналогичные мутациям S651A и/или T711S в VP1 будет присутствовать и в VP2, и в VP3.
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида -VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена S651A в VP1 будет соответствовать:
аминокислотной замене в положении S515A в VP2;
аминокислотной замене в положении S459A в VP3.
- 9 045824
С учетом перекрывающейся последовательности, кодирующей три белка капсида -VP1, VP2 и VP3, аминокислотная замена Т71Щ будет соответствовать:
аминокислотной замене в положении T575S в VP2;
аминокислотной замене в положении T519S в VP3.
Заявитель также считает целесообразным указать окружение найденных мутаций путем указания краткой аминокислотной последовательности, включающей данные мутации в VP1/VP2/VP3:
для S2A в VP1 (отсутствует в VP2 и VP3) - MSFVDHP; для S651A в VP1 (S515A в VP2/ S459A в VP3) - TSFSDVP; для T711S в VP1 (T575S в VP2/ T519S в VP3) - EYRTTRP.
В некоторых вариантах аминокислотная последовательность белка VP2 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную
TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGA
DTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYN NHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFR PRSLRVK1FNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAF PPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFH SSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALE NTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMM LIKNTPVPGN1TSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYN DPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 8)
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP2 капсида AAV5 включает замену T575S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP2 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGA DTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYN NHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQREINNYWGFR PRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAF PPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFH SSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALE NTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQETVPGSVWMERDVYLQGPTWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMM LIKNTPVPGN1TSFSDVPVSSF1TQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYN DPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 9)
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP2 капсида AAV5 включает замены S515A и T575S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP2 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
TAPTGKR1DDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGA DTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYN NHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFR PRSLRVK1FN1QVKEVTVQDSTTT1ANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAF
- 10 045824
PPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFH SSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPM GRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALE NTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAK1PETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMM LIKNTPVPGNITSFADVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNY
NDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 10)
В некоторых вариантах аминокислотная последовательность белка VP3 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYN NHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRS LRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVF TLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQ NLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNL GSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPAN PGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGS VWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDV PVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTT RPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 11)
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP3 капсида AAV5 включает замену T519S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP3 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWG FRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLP AFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVP FHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGP MGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYAL ENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMM LIKNTPVPGN1TSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPE1QYTNNYN DPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 12)
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP3 капсида AAV5 включает замены S459A и T519S.
В некоторых вариантах выделенный модифицированный белок VP3 капсида AAV5 имеет аминокислотную последовательность, представленную
- 11 045824
MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPS YNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWG FRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLP AFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVP FHSSFAPSQNLFKLANPEVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGP MGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYAL ENTM1FNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAP ATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMM LIKNTPVPGNITSFADVPVSSF1TQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNY NDPQFVDFAPDSTGEYRSTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO: 13)
Капсид.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному капсиду для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, который включает вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В одном из вариантов выделенный капсид включает вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
Особенно предпочтительные варианты включают замены, которые являются консервативными по природе, т.е. те замены, которые имеют место в семействе аминокислот, которые объединены по их боковым цепям. В частности, аминокислоты обычно делят на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Например, достаточно обосновано предсказание о том, что выделенная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или схожая консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не окажет важного влияния на биологическую активность. Например, полипептид, представляющий интерес, может включать вплоть до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или даже вплоть до приблизительно 15-25 или 50 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или любое число от 5 до 50 при условии, что желаемая функция молекулы остается незатронутой.
В одном из вариантов выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.
В одном из вариантов выделенный капсид включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.
В одном из вариантов выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
В одном из вариантов выделенный капсид включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T519S.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12.
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и T519S.
- 12 045824
В одном из вариантов выделенный капсид включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13.
Выделенная нуклеиновая кислота.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651A, представлена нуклеиновой последовательностью
ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCCAGATTGGTTGGAAGAAGTTGGTGAAGGTCTTC
GCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGC
ATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGG
AAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGA
GCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAA
GTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTT
CGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACC
TTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGA
CGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTC
CACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCC
AGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGG
CCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGA
TTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCG
AACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGG
CTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGG
GTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGA
CTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCA
- 13 045824
ACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACA ACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGT CGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACG CTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAATCCCACC GAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACG GGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCT TCGCTCCCAGTCAGAACCTGTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTT GTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCT GGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCG AACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTT CGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCA GCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAA CACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACCT CGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGT GGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGC CCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGAT GGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGG GGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCG CCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCgCGG ACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGG AGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATC CAGTAC ACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGC ACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCC CTTTAA (SEQ ID NO: 5) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651A.
Под другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651A подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 5, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 2. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью
- 14 045824
ATGGCTTTTGTTGATCACCCTCCAGATTGGTTGGAAGAAGTTGGTGAAGGTCTTC GCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGC ATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGG AAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGC AGACGAGGTCGCGCGAGA GCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAA GTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTT CGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACC TTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGA CGACCACTTTCC AAA AAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTC CACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCC AGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGG CCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGA TTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCG AACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGG CTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGG GTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGA CTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCA ACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACA ACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGT CGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACG CTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAATCCCACC GAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACG GGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCT TCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTT GTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCT GGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCG AACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTT CGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCA GCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAA CACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACCT CGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGT GGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGC CCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGAT GGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGG GGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCG CCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGG ACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGG AGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATC CAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGC ACCGGGGAATACAGAAGCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCC CTTTAA (SEQ ID NO: 6) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и T711S.
- 15 045824
Под другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и T711S подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 6, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 3. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
- 16 045824
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью
ATGGCTTTTGTTGATCACCCTCCAGATTGGTTGGAAGAAGTTGGTGAAGGTCTTC GCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGC ATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGG AAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGA GCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAA GTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTT CGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACC TTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGA CGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTC CACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCC AGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGG CCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGA TTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCG AACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGG CTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGG GTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGA CTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCA ACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACA ACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGT CGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACG CTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAATCCCACC GAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACG GGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCT TCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTT GTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCT GGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCG AACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTT CGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCA GCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAA CACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACCT CGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGT GGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGC CCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGAT GGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGG GGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCG CCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCgCGG ACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGG AGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATC CAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGC ACCGGGGAATACAGAAGCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCC СТТТАА (SEQ ID NO: 7)
- 17 045824 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и T711S.
Под другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и T711S подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 7, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 4. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа, представлена нуклеиновой последовательностью ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCCAGATTGGTTGGAAGAAGTTGGTGAAGGTCTTC
GCGAGTTTTTGGGCCTTGAAGCGGGCCCACCGAAACCAAAACCCAATCAGCAGC ATCAAGATCAAGCCCGTGGTCTTGTGCTGCCTGGTTATAACTATCTCGGACCCGG AAACGGTCTCGATCGAGGAGAGCCTGTCAACAGGGCAGACGAGGTCGCGCGAGA GCACGACATCTCGTACAACGAGCAGCTTGAGGCGGGAGACAACCCCTACCTCAA GTACAACCACGCGGACGCCGAGTTTCAGGAGAAGCTCGCCGACGACACATCCTT CGGGGGAAACCTCGGAAAGGCAGTCTTTCAGGCCAAGAAAAGGGTTCTCGAACC TTTTGGCCTGGTTGAAGAGGGTGCTAAGACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGA CGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCTCGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTC CACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCCAGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCC AGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCTGATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGG CCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGA
- 18 045824
TTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCG AACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGG CTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGG GTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGA CTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCA ACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACTCCACCACCACCATCGCCAACA ACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGT CGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACG CTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGCGACAACACAGAAAATCCCACC GAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACG GGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCT TCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTT GTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCT GGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCG AACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTT CGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCA GCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAA CACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACCCGGGCACCACCGCCACGTACCT CGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGT GGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGC CCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGAT GGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGG GGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCG CCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGG ACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGG AGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATC CAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGC ACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCTATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCC CTTTAA (SEQ ID NO: 14) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа.
Под другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 14, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНКпоследовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 1. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T575S, представлена нуклеиновой последовательностью
- 19 045824
ACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGACGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCT CGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTCCACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCC AGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCCAGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCT GATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCC GATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGG GACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAAC CACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCC TACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCC ACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGAC CCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGC AGGACTCCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTAC GGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCT GCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTG AACCGCGACAACACAGAAAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAG TACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACT TTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCT GGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACT GGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAA AACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGG GTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAG GGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAG
GGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCG AACCCGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAG AGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCC ACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAG GA AATC GTGC CCGGC AGC GTGTGGATGG AG AGGG ACGTGT AC С TCC AAGGACCC ATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATG GGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCT GTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCC AGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAA AACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCC CAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAAGCACCAGACCT ATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA (SEQ ID NO: 15) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T575S.
Под другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T575S подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 15, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 9. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S515A и
- 20 045824
T575S имеет любую нуклеиновую последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 10. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа, представлена нуклеиновой последовательностью
ACGGCCCCTACCGGAAAGCGGATAGACGACCACTTTCCAAAAAGAAAGAAGGCT
CGGACCGAAGAGGACTCCAAGCCTTCCACCTCGTCAGACGCCGAAGCTGGACCC
AGCGGATCCCAGCAGCTGCAAATCCCAGCCCAACCAGCCTCAAGTTTGGGAGCT
GATACAATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCC
GATGGAGTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGG
GACAGAGTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAAC
CACCAGTACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCC
TACTTTGGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCC
ACTGGAGCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGAC
CCCGGTCCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGC
AGGACTCCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTAC
GGACGACGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCT
GCCGGCCTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTG
AACCGCGACAACACAGAAAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAG
TACTTTCCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACT TTGAGGAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCT GGCCAACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACT GGCGGAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAA AACTGGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGG GTCAACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAG GGCGCGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAG GGCAGCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCG AACCCGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAG AGCGAGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCC ACCAACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAG GAAATCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCC ATCTGGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATG GGCGGATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCT GTGCCCGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCC AGTACAGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAA AACTCCAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCC CAGTTTGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCT
ATCGGAACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA (SEQ ID NO: 16) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа.
Под другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 16, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНКпоследовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 8. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтерна
- 21 045824 тивных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T519S, представлена нуклеиновой последовательностью
ATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGA GTGGGCAATGCCTCGGGAGATTGGCATTGCGATTCCACGTGGATGGGGGACAGA GTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAG TACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTT GGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGA GCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGT CCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACT CCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGA CGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGC CTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGC GACAACACAGA AAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTT CCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAG GAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCA ACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCG GAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACT GGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCA ACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCG CGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCA GCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACC CGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCG AGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCA ACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAA TCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCT GGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCG GATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCC CGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTAC AGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTC CAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTT TGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAAGCACCAGACCTATCGG AACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA (SEQ ID NO: 17) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T519S.
Под другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность модифицированного белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой T519S подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 17, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 12. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме на
- 22 045824 стоящего изобретения.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S459A и T519S имеет любую нуклеиновую последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 13. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа, представлена нуклеиновой последовательностью
ATGTCTGCGGGAGGTGGCGGCCCATTGGGCGACAATAACCAAGGTGCCGATGGA
GTGGGC A ATGC СТС GGG AG ATTGGC ATTGC GATTC С ACGTGG ATGGGGGAC AG А
GTCGTCACCAAGTCCACCCGAACCTGGGTGCTGCCCAGCTACAACAACCACCAG
TACCGAGAGATCAAAAGCGGCTCCGTCGACGGAAGCAACGCCAACGCCTACTTT
GGATACAGCACCCCCTGGGGGTACTTTGACTTTAACCGCTTCCACAGCCACTGGA
GCCCCCGAGACTGGCAAAGACTCATCAACAACTACTGGGGCTTCAGACCCCGGT
CCCTCAGAGTCAAAATCTTCAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGGTGCAGGACT
CCACCACCACCATCGCCAACAACCTCACCTCCACCGTCCAAGTGTTTACGGACGA
CGACTACCAGCTGCCCTACGTCGTCGGCAACGGGACCGAGGGATGCCTGCCGGC
CTTCCCTCCGCAGGTCTTTACGCTGCCGCAGTACGGTTACGCGACGCTGAACCGC
GACAACACAGAAAATCCCACCGAGAGGAGCAGCTTCTTCTGCCTAGAGTACTTT
CCCAGCAAGATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAGTTTACCTACAACTTTGAG
GAGGTGCCCTTCCACTCCAGCTTCGCTCCCAGTCAGAACCTCTTCAAGCTGGCCA
ACCCGCTGGTGGACCAGTACTTGTACCGCTTCGTGAGCACAAATAACACTGGCG
GAGTCCAGTTCAACAAGAACCTGGCCGGGAGATACGCCAACACCTACAAAAACT
GGTTCCCGGGGCCCATGGGCCGAACCCAGGGCTGGAACCTGGGCTCCGGGGTCA
ACCGCGCCAGTGTCAGCGCCTTCGCCACGACCAATAGGATGGAGCTCGAGGGCG
CGAGTTACCAGGTGCCCCCGCAGCCGAACGGCATGACCAACAACCTCCAGGGCA
GCAACACCTATGCCCTGGAGAACACTATGATCTTCAACAGCCAGCCGGCGAACC
CGGGCACCACCGCCACGTACCTCGAGGGCAACATGCTCATCACCAGCGAGAGCG
AGACGCAGCCGGTGAACCGCGTGGCGTACAACGTCGGCGGGCAGATGGCCACCA
ACAACCAGAGCTCCACCACTGCCCCCGCGACCGGCACGTACAACCTCCAGGAAA
TCGTGCCCGGCAGCGTGTGGATGGAGAGGGACGTGTACCTCCAAGGACCCATCT
GGGCCAAGATCCCAGAGACGGGGGCGCACTTTCACCCCTCTCCGGCCATGGGCG
GATTCGGACTCAAACACCCACCGCCCATGATGCTCATCAAGAACACGCCTGTGCC
CGGAAATATCACCAGCTTCTCGGACGTGCCCGTCAGCAGCTTCATCACCCAGTAC
AGCACCGGGCAGGTCACCGTGGAGATGGAGTGGGAGCTCAAGAAGGAAAACTC
CAAGAGGTGGAACCCAGAGATCCAGTACACAAACAACTACAACGACCCCCAGTT
TGTGGACTTTGCCCCGGACAGCACCGGGGAATACAGAACCACCAGACCTATCGG
AACCCGATACCTTACCCGACCCCTTTAA (SEQ ID NO: 18) или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа.
Под другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность белка VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) дикого типа подразумевается нуклеиновая последовательность, которая альтернативна нуклеиновой последовательности с SEQ ID NO: 18, так как с учетом вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНКпоследовательностей может кодировать аминокислотную последовательность, раскрытую в данном документе как SEQ ID NO: 11. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности.
- 23 045824
Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанный капсид, который используется для высокоэффективной трансдукции клетокмишеней.
В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вышеуказанный капсид, включает любую из вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот.
Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:
1) вышеуказанный капсид, и
2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию целевого продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.
Вектор rAAV по изобретению не содержит нуклеотидные последовательности генов, кодирующих неструктурные белки (Rep) и структурные белки (Сар).
Характеристика капсида подробно описана в вышеуказанном разделе описания.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 имеет продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой терапевтический полипептид, где терапевтический полипептид представляет собой фактор свертывания крови, выбираемый из группы, состоящей из фактора VIII, фактора IX или их функционального варианта.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах вектор на основе rAAV5 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт, который представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
Фармацевтическая композиция.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, которая содержит:
a) вышеуказанный вектор на основе rAAV5; и
b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вирусную частицу на основе rAAV5 по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или в других лекарственных соединениях, фармацевтические агенты, носители, адъюванты, разбавители и т.д. Носитель для инъекций обычно является жидким. Носитель для других способов введения может быть или твердым, или жидким, таким как стерильная апирогенная вода или стерильный апирогенный фосфатно-солевой буферный раствор. Для введения путем ингаляции носитель является вдыхаемым и предпочтительно находится в твердой или жидкой дисперсной форме. В качестве инъекционной среды предпочтительно использовать воду, содержащую добавки, общепринятые для инъекционных растворов, такие как стабилизирующие агенты, соли или солевые растворы и/или буферы.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей клетку, в которой вектор на основе rAAV5 интегрирован в геном, в фармацевтически приемлемом носителе или других лекарственных соединениях, фармацевтических агентах, носителях, адъювантах, разбавителях и т.д.
Фармацевтическая композиция обозначает композицию, включающую в себя вышеуказанный вектор на основе rAAV5, согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики). Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы.
Фармацевтически приемлемым считается материал, который не имеет биологических или других
- 24 045824 противопоказаний, например, материал можно вводить субъекту без каких-либо нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такие фармацевтические композиции можно использовать, например, для трансфекции клетки ех vivo или для введения in vivo вирусной частицы или клетки непосредственно субъекту.
Термин эксципиент или вспомогательное вещество используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.
Под стабилизатором понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента.
Под термином буфер, буферная композиция, буферный агент понимается раствор, способный сохранять значение рН, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату вектора на основе rAAV5, проявлять устойчивость к изменениям рН. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является стабильной, если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8°С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин единичная стандартная доза означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.
Способ доставки генного продукта.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту вышеуказанного вектора на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции.
В некоторых вариантах способ доставки генного продукта используется для доставки генного продукта нуждающемуся в этом человеку.
Любой способ введения вектора на основе rAAV5, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для вышеуказанного вектора на основе rAAV5, по данному изобретению.
Рекомбинантные вирусные векторы на основе rAAV5 предпочтительно вводят в клетку в биологически эффективном количестве. Биологически эффективное количество вирусного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать инфекцию (или трансдукцию) и экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке. Если вирус вводят в клетку in vivo (например, вирус вводят субъекту, как описано ниже), биологически эффективное количество вирусного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать трансдукцию и экспрессию гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-мишени.
Клетка для введения вирусного вектора на основе rAAV5 по изобретению может быть клеткой любого типа, включая в себя без ограничения нервные клетки (включающие в себя клетки периферической и центральной нервной системы, в частности, клетки головного мозга), легочные клетки, эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки кишечника и дыхательных путей), мышечные клетки, клетки поджелудочной железы (в том числе островковые клетки), печеночные клетки, клетки миокарда, костные клетки (например, стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки, клетки селезенки, кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки предстательной железы, половые клетки и тому подобное. Альтернативно, клетка для введения вирусного вектора на основе rAAV5 может быть любой клеткой-предшественником. В качестве дополнительной альтернативы, клетки могут представлять собой стволовые клетки (например, нервные стволовые клетки, стволовые клетки печени). Кроме того, клетки могут происходить от любых видов, как указано выше.
Применение
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного вектора на основе rAAV5 или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.
В некоторых вариантах применение используется для лечения заболевания у нуждающегося в этом человека.
- 25 045824
Введение вектора на основе rAAV5 по настоящему изобретению субъекту-человеку или животному, нуждающемуся в этом, можно проводить любым известным в данной области способом для введения вирусных векторов.
Примеры способов введения включают в себя местное применение, пероральное, ректальное, чрезслизистое, трансдермальное, ингаляционное, парентеральное введение (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное и внутрисуставное) и т.п., а также инъекции непосредственно в ткань или в орган и, альтернативно, интратекальные, непосредственно внутримышечные, внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции. Инъекционные препараты могут быть приготовлены в общепринятых лекарственных формах: в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для приготовления растворов или суспензий в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Альтернативно, можно вводить вектор на основе rAAV5 локально, а не системно, например, в виде депо или в композиции с замедленным высвобождением.
В некоторых вариантах применения заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание крови.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой заболевание мышц.
В некоторых вариантах применения заболевание представляет собой наследственное заболевание.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рассматриваемая нуклеотидная последовательность, которая доставляется вектором на основе rAAV5 в печень субъекта. Введение в печень можно осуществлять любым способом, известным в данной области и включающим в себя без ограничения внутривенное введение, внутрипортальное введение, интрабилиарное введение, внутриартериальное введение и непосредственную инъекцию в паренхиму печени.
Предпочтительно клетки (например, клетки печени) инфицируются вектором на основе rAAV5, кодирующим пептид или белок, эти клетки экспрессируют кодированный пептид или белок и выделяют его в кровеносную систему в терапевтически эффективном количестве (как описано ниже). Альтернативно, доставка и экспрессия вектора происходит в другой клетке или ткани, включающей в себя без ограничения головной мозг, поджелудочную железу, селезенку или мышцы.
Под терапевтически эффективным количеством подразумевается количество, которое достаточно для облегчения (например, для смягчения, уменьшения, снижения) по меньшей мере одного из симптомов, связанных с патологическим состоянием. Другими словами, терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое достаточно для обеспечения некоторого улучшения состояния субъекта.
В некоторых вариантах применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.
В некоторых вариантах применения продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.
В других предпочтительных вариантах осуществления вектор на основе rAAV5 по изобретению вводят внутримышечно, более предпочтительно, путем внутримышечной инъекции или путем местного применения (как описано выше). В других предпочтительных вариантах осуществления парвовирусные частицы по настоящему изобретению вводят в легкие.
Вектор на основе rAAV5, раскрытый в изобретении, можно вводить в легкие субъекта с помощью любых подходящих способов, но предпочтительным является введение в форме аэрозольной суспензии вдыхаемых частиц, состоящих из парвовирусного вектора на основе rAAV5 по изобретению, который вдыхается субъектом. Вдыхаемые частицы могут быть жидкими или твердыми. Аэрозоли из жидких частиц, содержащих парвовирусные векторы на основе rAAV5 по изобретению, можно делать любыми подходящими способами, например, в виде аэрозольного ингалятора под давлением или ультразвукового распылителя, которые известны специалистам в данной области техники. Также можно делать аэрозоли твердых частиц, содержащие вирусные векторы на основе rAAV5 по изобретению, с любым генератором твердых лекарственных аэрозольных частиц с помощью известных в фармацевтической области технологий.
Дозировки парвовирусных частиц на основе rAAV5 по изобретению будут зависеть от способа введения, заболевания или состояния, подлежащего лечению, от состояния субъекта, конкретного вирусного вектора и доставляемого гена, и их можно определять рутинными способами. Примерными дозами для достижения терапевтического эффекта являются вирусные титры, составляющие по меньшей мере примерно 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 трансдуцирующих единиц или больше, предпочтительно приблизительно от 108 до 1013 трансдуцирующих единиц, еще более предпочтительно 1012 трансдуцирующих единиц.
Таким образом, парвовирусные векторы на основе rAAV5, реагенты и способы по настоящему изобретению можно использовать для направления нуклеиновой кислоты в делящиеся или неделящиеся клетки и для стабильной экспрессии в этих клетках гетерологичной нуклеиновой кислоты. С использованием этой векторной системы стало возможно вводить в клетки в условиях in vivo гены, которые кодируют белки, влияющие на физиологию клеток. Таким образом, векторы по настоящему изобретению мо
- 26 045824 гут быть полезными в генной терапии при патологических состояниях.
Настоящее изобретение можно использовать для доставки любой чужеродной нуклеиновой кислоты с биологическим эффектом для лечения или ослабления симптомов, связанных с каким-либо расстройством, обусловленным генной экспрессией. Примеры патологических состояний включают в себя без ограничения кистозный фиброз (и другие заболевания легких), гемофилию А, гемофилию В, талассемию, анемии и другие нарушения свертываемости крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, сахарный диабет, мышечные дистрофии (например, Дюшенна, Беккера), болезнь Гоше, болезнь Херлера, дефицит аденозиндеаминазы, болезни накопления гликогена и другие метаболические дефекты, заболевания солидных органов (например, мозга, печени, почек, сердца) и тому подобное.
Перенос генов обладает значительным потенциалом применения для понимания и создания способов лечения патологических состояний. Существует ряд наследственных заболеваний, для которых были изучены и клонированы дефектные гены. В некоторых случаях известна функция этих клонированных генов. В целом, упомянутые выше патологические состояния делятся на два класса: дефицитные состояния, как правило, дефицит ферментов, которые обычно наследуются рецессивным образом, и состояния нарушения баланса, иногда с вовлечением по меньшей мере регуляторных или структурных белков, которые наследуются доминантным образом. При дефицитных заболеваниях можно использовать перенос генов, чтобы внести нормальный ген в пораженные ткани для заместительной терапии. При патологических состояниях нарушения баланса перенос генов можно использовать для создания патологического состояния в смоделированной системе, которую затем можно использовать для разработки мер против этого патологического состояния. Таким образом, способы по настоящему изобретению позволяют лечить генетические заболевания. Согласно изобретению, патологическое состояние лечится путем частичного или полного устранения дефекта или дисбаланса, который вызывает заболевание или усугубляет степень его тяжести. Также возможно использование сайт-специфичной интеграции нуклеиновых последовательностей для запуска мутаций или исправления дефектов.
Способ получения вектора на основе rAAV5.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанного вектора на основе rAAV5, который включает трансфекцию клеток-продуцентов вышеуказанной нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, кодирующую капсид, включающий модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).
В некоторых вариантах способа получения вектора на основе rAAV5 используется вышеуказанная нуклеиновая кислота, которая содержит последовательность, кодирующую вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), белок VP2 капсида AAV5 или его модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.
Под модифицированными вариантами белка VP2 капсида AAV5 дикого типа и белка VP3 капсида AAV5 подразумеваются варианты белка VP2 капсида AAV5 дикого типа и белка VP3 капсида AAV5, которые включают одну или несколько аминокислотных замен.
Особенно предпочтительные варианты включают замены, которые являются консервативными по природе, т.е. те замены, которые имеют место в семействе аминокислот, которые объединены по их боковым цепям. В частности, аминокислоты обычно делят на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Например, достаточно обосновано предсказание о том, что выделенная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или схожая консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не окажет важного влияния на биологическую активность. Например, полипептид, представляющий интерес, может включать вплоть до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или даже вплоть до приблизительно 15-25 или 50 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или любое число от 5 до 50 при условии, что желаемая функция молекулы остается незатронутой.
В некоторых вариантах способа получения вектора на основе rAAV5 используется вышеуказанная нуклеиновая кислота, которая содержит последовательность, кодирующую вышеуказанный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), белок VP2 капсида AAV5 дикого типа и белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.
Модифицированные варианты белков VP2 и VP3 капсида AAV5, а также нуклеиновые кислоты их кодирующие, подробно описаны в соответствующих разделах описания.
Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем
- 27 045824 иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Материалы и общие методы.
Методы рекомбинантной ДНК.
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.
Синтез генов.
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.
Определение последовательностей ДНК.
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру.
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях Применяли пакет программ Infomax's Vector NTI Advance suite, версия 8.0 и SnapGene Viewer для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.
Пример 1. Получение библиотек вариантов капсидов AAV5.
Получение библиотек вариантов капсидов AAV5 производили методом случайного мутагенеза последовательности гена Cap (Davidsson M. et al., 2016). Вкратце, последовательность дикого типа гена Сар пятого серотипа (GenBank ID AF085716.1) была собрана de novo, после чего синтезированный геном капсида AAV5 дикого типа фрагментировали с использованием урацил-ДНК-гликозилазы, полученные фрагменты собирали в полноразмерный ген Сар с помощью ДНК-полимеразы, не обладающей корректирующей активностью (в результате в последовательности возникали случайные мутации). Полноразмерные мутантные варианты клонировали в плазмиду-носитель pAAV-linker (фиг. 1.) по сайтам рестрикции AscI/EcoRI в общую рамку считывания с зеленым флуоресцентным белком (GFP), продуцируя многообразную случайную библиотеку капсидов AAV5, которую затем использовали для отбора вариантов капсидов с повышенной трансдуцирующей активностью.
Положительный отбор вирусных частиц с повышенной транедуцирующей активностью проводили in vitro на клетках линии CHO-K1-S. При этом для трансдукции использовали частицы, очищенные с помощью УЦФ в градиенте йодиксанола. Спустя 48 ч клетки собирали и выделяли геномную ДНК для последующей амплификации последовательностей геномов вирусов, способных к эффективной транедукции. Полученные последовательности затем переклонировали и повторно нарабатывали для последующих итераций отбора с целью обогащения библиотеки вариантами с наибольшей эффективностью транедукции. После 5 раундов отбора капсидные гены 30 клонов просеквенировали для определения наиболее успешных мутаций и их сочетаний. По результатам секвенирования преобладающими сочетаниями мутаций оказались S2A, T711S в VP1 AAV5 и варианты капсидов содержащие S2A, T711S, S651A в VP1 AAV5 - порядка 20% клонов. Также были отобраны варианты капсидов, содержащие мутацию S651A в VP1 AAV5. Данные варианты капсидов клонировали в вектора для наработки вирусных частиц и в дальнейшем использовали для визуализации и сравнения профилей транедукции относительно AAV5 дикого типа.
Пример 2. Наработки и последующий отбор рекомбинантных вирусных частиц из полученной библиотеки последовательностей.
Для наработки и последующего отбора рекомбинантных вирусных частиц из полученной библиотеки последовательностей была разработана серия плазмид: плазмида-носитель, плазмида, содержащая последовательность гена Rep, а также конструкция, содержащая аденовирусные гены, необходимые для репликации вирусных частиц.
Плазмида-носитель pAAV-linker (фиг. 1.), предназначенная для клонирования библиотек случайных вариантов гена капсида AAV пятого серотипа в одну рамку считывания с репортерным белком, была получена путем замены последовательности модифицированного зеленого флуоресцентного белка в исходной конструкции pAAV-GFP Control plasmid (VPK-402) от CellBiolab (США), с помощью рестриктазно-лигазного метода клонирования по сайтам HindIII/EcoRI, на последовательность T2A-GFP, синтезированную de novo с добавлением сайтов рестрикции EcoRI с 5'-конца и HindIII с З'-конца.
Плазмида pAAV-Rep, содержащая последовательность гена Rep (фиг. 2.), была получена путем клонирования de novo синтезированной последовательности гена Rep AAV второго серотипа (GenBank ID AF043303.1) по сайтам рестрикции PciI/PsiI (New England Biolabs, США) с последующей обработкой Т4 DNA Polymerase (New England Biolabs, США) для получения тупых концов, в плазмиду pGem-T Easy (Promega, США) так же обработанную рестриктазами PciI/PsiI (New England Biolabs, США)
В качестве источника аденовирусных генов для наработки рекомбинантных вирусных частиц была
- 28 045824 использована конструкция pHelper (фиг. 3) из коммерческого набора AAV-2 Packaging System (VPK-402) от CellBiolab (США), содержащая AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, Ori- ориджин репликации в бактериях, Adeno E2A - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno E4 - последовательность гена хелперного аденовируса, участвующая в репликации вирусной ДНК, Adeno VARNA - последовательность гена хелперного аденовируса отвечающая за стимуляцию трансляции как ранних, так и поздних вирусных генов
Пример 3. Способ получения векторов на основе модифицированного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV).
Для получения частиц rAAV с модифицированным капсидом 5 серотипа, клетки-продуценты трансфецировали одновременно 3 плазмидами:
1) плазмидой, содержащей нуклеотидные последовательности аденовируса, кодирующие белки и РНК, необходимые для сборки частиц rAAV (хелперная плазмида);
2) плазмидой, содержащей нуклеотидную природную последовательность гена Rep аденоассоциированного вируса 2 серотипа, а также последовательность модифицированного гена Сар, которую выбирают из группы: нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 5, 6 или 7 или любая другая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP1 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2, 3 или 4 и белки VP2 и VP3 с альтернативных рамок считывания используемой нуклеотидной последовательности, где
VP2 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, 9 или 10;
a VP3 может иметь любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 или 13;
3) плазмидой, содержащей гетерологичный геном частицы rAAV, кодирующий целевой ген, предназначенный для доставки в клетки пациента.
Данный набор генов обеспечивает сборку вирусных частиц rAAV и инкапсидирование в них целевого генома в течение 72 ч. Через 72 ч после трансфекции клетки-продуценты подвергают лизису с высвобождением частиц rAAV и очищают последовательными стадиями фильтрации и хроматографии. Титр очищенных частицы rAAV проверяют с помощью иммуноферментного анализа и количественной ПЦР.
Пример 4. Увеличение эффективности трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5 при наличии мутаций S2A, S651A, T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Дизайн эксперимента.
В лунки 12-луночных планшетов были посеяны клетки линии CHO-K1-S. Посев проводили в ростовую среду: ДМЕМ/F12 с глутамином, содержание глюкозы 4,5 г/л, 5% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10 000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 100 000 вг/клетка. Все образцы были поставлены в трипликатах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
Анализ эффективности трансдукции проводили с помощью проточного цитометра Guava EasyCyte и программного обеспечения GuavaSoft.
Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы S2A, S651A или T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, приводило к существенному увеличению эффектиновности доставки трансгена векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями. К примеру, при помощи метода проточной цитометрии удалось выявить изменение количества GFP позитивных клеток спустя 48 ч после трансдукции линии CHO-K1-S препаратами на основе rAAV с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа или белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, несущим одну или несколько мутаций, которые выбраны из группы: S2A, S651A, T711S (фиг. 4).
При наличии мутации S651A (AAV5-01Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 2,2 раза с 22,54% до 49,45% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A и T711S (AAV5-02Mut-GFP) количество клеток, экспремировавших GFP, увеличивалось в 2,6 раза с 22,54% до 58,51% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
При одновременном наличии мутаций S2A, S651A и T711S (AAV5-03Mut-GFP) количество клеток, экспрессировавших GFP, увеличивалось в 1,7 раз с 22,54% до 38,27% по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).
Пример 5. Увеличение продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, после трансдукции клеток препаратами на основе rAAV5 при наличии мутаций S2A, S651A, T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа.
Дизайн эксперимента.
В лунки 12-луночных планшетов были посеяны клетки линии CHO-K1-S. Посев проводили в ростовую среду: ДМЕМ/Б12 с глутамином, содержание глюкозы 4,5 г/л, 5% сыворотки крупного рогатого скота. Плотность посадки клеток составила 10 000 клеток/см2. При постановке трансдукции подготовленные заранее клетки были трансдуцированы при MOI 100 000 вг/клетка. Все образцы были поставлены в трипликатах. Для негативного контроля были использованы интактные клетки.
Анализ количества белка FIX в культуральной жидкости 7 дней спустя после трансдукции оцени
-
Claims (2)
- вался при помощи набора ИФА Human Factor IX ELISA Kit. Использованное разведение образцов - 1:25. Процедура была проведена согласно инструкции производителя.Авторами изобретения было неожиданно установлено, что наличие одной или нескольких мутаций, которые выбраны из группы: S2A, S651A, T711S в белке VP1 капсида AAV5 дикого типа, приводило к существенному увеличению продукции белка hFIX после трансдукции клеток линии CHO-K1-S векторами на основе rAAV с указанными выше мутациями. К примеру, метод иммуноферментного анализа (ИФА) позволил выявить повышение количества белка hFIX в среде культивирования спустя 7 дней после трансдукции клеток линии CHO-K1-S препаратами на основе rAAV с белком VP1 капсида AAV5 дикого типа или белком VP1 капсида AAV5 дикого типа, несущим одну или несколько мутаций, которые выбраны из группы: S2A, S651A, T711S (фиг. 5.).При наличии мутации S651A (AAV5-01Mut-FIX) количество продуцируемого белка увеличивалось в 4,6 раза с 0,17 нг/мл до 0,74 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).При одновременном наличии мутаций S2A и T711S (AAV5-02Mut-GFP) количество продуцируемого белка увеличивалось в 7,1 раза с 0,17 нг/мл до 1,24 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).При одновременном наличии мутаций S2A, S651A и T711S (AAV5-03Mut-GFP) количество продуцируемого белка увеличивалось в 3,3 раза с 0,17 нг/мл до 0,57 нг/мл по сравнению с контрольным AAV5 с белком VP1 капсида дикого типа (AAV5-NullMut-GFP).ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, содержащий аминокислотную последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа, кодируемую геном Сар, с одной или несколькими заменами, которые выбраны из группы:S651A,S2A и T711S,S2A, S651A и T711S, где аминокислотная последовательность белка VP1 капсида AAV5 дикого типа имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1.2. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п.1, который включает одну замену в положении S651A.3. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п.2, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.4. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п.1, который включает замены S2A и T711S.5. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п.4, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.6. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п.1, который включает замены S2A, S651A и T711S.7. Выделенный модифицированный белок VP1 капсида AAV5 по п.6, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4.8. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) по любому из пп.1-7, который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.9. Выделенная нуклеиновая кислота по п.8, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотной заменой S651A, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 5 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.10. Выделенная нуклеиновая кислота по п.8, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 6 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.11. Выделенная нуклеиновая кислота по п.8, кодирующая модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) с аминокислотными заменами S2A, S651A и T711S, которая представлена нуклеиновой последовательностью с SEQ ID NO: 7 или любой другой последовательностью, кодирующей соответствующую аминокислотную последовательность.12. Выделенный капсид для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней, который включает модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) по любому из пп.1-7.13. Выделенный капсид по п.12, который включает модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5) по любому из пп.1-7, белок VP2 капсида AAV5 или его- 30 045824 модифицированный вариант и белок VP3 капсида AAV5 или его модифицированный вариант.14. Выделенный капсид по п.13, который включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа.15. Выделенный капсид по п.14, который включает белок VP2 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8.16. Выделенный капсид по п.13, который включает модифицированный белок VP2 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).17. Выделенный капсид по п.16, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S.18. Выделенный капсид по п.17, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замену T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9.19. Выделенный капсид по п.16, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S.20. Выделенный капсид по п.19, который включает модифицированный белок VP2 капсида AAV5, который содержит замены S515A и T575S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.21. Выделенный капсид по п.13, который включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа.22. Выделенный капсид по п.21, который включает белок VP3 капсида AAV5 дикого типа, который имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11.23. Выделенный капсид по п.13, который включает модифицированный белок VP3 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5).24. Выделенный капсид по п.23, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T519S.25. Выделенный капсид по п.24, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замену T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12.26. Выделенный капсид по п.23, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и T519S.27. Выделенный капсид по п.26, который включает модифицированный белок VP3 капсида AAV5, который содержит замены S459A и T519S, и имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13.28. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая капсид по любому из пп.12-27, который используется для высокоэффективной трансдукции клеток-мишеней.29. Вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 5 серотипа (rAAV5) для доставки субъекту гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, который включает:1) капсид по любому из пп.12-27, и
- 2) гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторные последовательности, которые обеспечивают экспрессию продукта, кодируемого гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, в целевых клетках.30. Вектор на основе rAAV5 по п.29, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты представляет собой терапевтический полипептид или репортерный полипептид.31. Вектор на основе rAAV5 по п.30, где терапевтический полипептид представляет собой фактор свертывания крови, выбираемый из группы, состоящей из фактора VIII, фактора IX или их функционального варианта.32. Вектор на основе rAAV5 по п.31, где терапевтический пептид представляет собой фактор VIII или его функциональный вариант.33. Вектор на основе rAAV5 по п.31, где терапевтический пептид представляет собой фактор IX или его функциональный вариант.34. Фармацевтическая композиция для доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, содержащая:a) вектор на основе rAAV5 по любому из пп.29-33; иb) фармацевтически приемлемый эксципиент.35. Фармацевтическая композиция по п.34, где субъект представляет собой человека.36. Способ доставки генного продукта нуждающемуся в этом субъекту, который включает введение субъекту вектора на основе rAAV5 по любому из пп.29-33 или фармацевтической композиции по п.34.37. Способ доставки генного продукта по п.36, где субъект представляет собой человека.38. Применение вектора на основе rAAV5 по любому из пп.29-33 или фармацевтической композиции по п.34 для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта.39. Применение по п.38, где субъект представляет собой человека.40. Применение по п.38, где заболевание выбирают из группы: заболевания крови; заболевания центральной нервной системы; заболевания метаболизма; заболевания мышц; наследственные заболевания.41. Применение по п.40, где заболевание представляет собой заболевание крови.42. Применение по п.41, где продукт экспрессии гетерологичной последовательности нуклеиновой-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019126509 | 2019-08-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045824B1 true EA045824B1 (ru) | 2023-12-28 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6619454B2 (ja) | キャプシド | |
| US20220331409A1 (en) | Factor ix gene therapy | |
| Doria et al. | AAV2/8 vectors purified from culture medium with a simple and rapid protocol transduce murine liver, muscle, and retina efficiently | |
| EP4019642A1 (en) | Isolated modified vp1 capsid protein of aav5 | |
| JP2023504735A (ja) | ヒトｍｅｃｐ２遺伝子を発現するように設計されたトランスジーンカセット | |
| JP2022553307A (ja) | プログラニュリン関連神経変性疾患または障害の治療のためのアデノ随伴ウイルス（ａａｖ）システム | |
| EP4159863A1 (en) | Codon-optimized nucleic acid encoding smn1 protein | |
| CA3195553A1 (en) | Improved adeno-associated virus (aav) vector and uses therefor | |
| EA045824B1 (ru) | Выделенный модифицированный белок vp1 капсида aav5 | |
| EP4389760A1 (en) | Isolated modified aav9 capsid protein vp1 | |
| RU2820088C1 (ru) | Выделенный модифицированный белок VPI капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе | |
| EP4389759A1 (en) | Isolated modified aav5 capsid protein vp1 | |
| OA21075A (en) | Codon-optimized nucleic acid that encodes SMN1 protein, and use thereof | |
| EA045749B1 (ru) | Кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая белок smn1, и ее применение | |
| AU2022230548A1 (en) | Codon-optimized nucleic acid encoding the fix protein | |
| CN116179605A (zh) | 一种重组腺相关病毒载体及其应用 | |
| JP2021527418A (ja) | ジストログリカノパチーおよびラミニン欠損筋ジストロフィーを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス生成物および方法 |