RU2800607C1 - Elisa test system for the detection of antibodies to blv in blood serum and milk of cattle - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology; veterinary medicine.

SUBSTANCE: immunoassay test system and a method of its use are described. The test system contains a set of the following reagents: Immunosorbent, Conjugate-1, Conjugate-2, RRK-1, RRK-2, K+, K-, PR, Stop reagent and TMB-substrate solution. The invention can be used for qualitative detection of total antibodies to bovine leukemia virus (BLV) in individual or combined samples of blood serum and individual samples of milk of cattle.

EFFECT: increase of the sensitivity of detection of antibodies to BLV through the use of a “sandwich” ELISA format with biotin-streptavidin system and the detection of all classes of antibodies to 11 known BLV genotypes.

3 cl, 1 dwg, 7 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии. Может быть использовано для качественного выявления суммарных антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (BLV) в индивидуальных или сборных образцах сыворотки крови и индивидуальных образцах молока крупного рогатого скота (КРС). Рекомендуется для клинической лабораторной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности выявления антител к BLV за счет использования «сэндвич» формата ИФА с биотин-стрептавидин системой и выявления всех классов антител к 11 известным генотипам BLV. За счет использования в изобретении рекомбинантного антигена р24 повышается специфичность выявления антител к BLV, не требуется верификация результата в подтверждающем тесте и уменьшаются производственные затраты.The invention relates to the field of biotechnology and veterinary medicine. It can be used for the qualitative detection of total antibodies to the bovine leukemia virus (BLV) in individual or collective samples of blood serum and individual samples of bovine milk. Recommended for clinical laboratory diagnosis of bovine leukemia. EFFECT: invention provides increased sensitivity of detection of antibodies to BLV due to the use of "sandwich" ELISA format with biotin-streptavidin system and detection of all classes of antibodies to 11 known BLV genotypes. Due to the use of the recombinant p24 antigen in the invention, the specificity of detection of antibodies to BLV is increased, verification of the result in a confirmatory test is not required, and production costs are reduced.

Возбудителем лейкоза крупного рогатого скота является РНК-содержащий вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV), относящийся к семейству Retroviridae, роду Deltaretrovirus. Вирус в организме инфицированного животного присутствует пожизненно в форме провируса, интегрированного в ДНК клеток хозяина. Вирус поражает клетки лимфоидной ткани. Инкубационный период болезни составляет от 2 месяцев до 6 лет. В развитии болезни различаются бессимптомная, гематологическая и клиническая стадии. Клинические признаки проявляются, как правило, в заключительной стадии развития болезни, поэтому в диагностике заболевания они имеют лишь вспомогательное значение. Основу прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота составляют серологические методы исследования - реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА).The causative agent of bovine leukemia is the RNA-containing bovine leukemia virus (BLV) belonging to the Retroviridae family, Deltaretrovirus genus. The virus in the body of an infected animal is present for life in the form of a provirus integrated into the DNA of the host cells. The virus infects the cells of the lymphoid tissue. The incubation period of the disease ranges from 2 months to 6 years. In the development of the disease, asymptomatic, hematological and clinical stages are distinguished. Clinical signs appear, as a rule, in the final stage of the development of the disease, therefore, in the diagnosis of the disease, they are only of auxiliary importance. The basis of in vivo diagnosis of bovine leukemia is serological research methods - immunodiffusion reaction (RID) and enzyme immunoassay (ELISA).

Лабораторная диагностика BLV-инфекции базируется на исследовании проб биологического и (или) патологического материала с помощью серологических, гистологических, молекулярно-биологических и гематологических методов.Laboratory diagnosis of BLV infection is based on the study of samples of biological and (or) pathological material using serological, histological, molecular biological and hematological methods.

Согласно, ПРИКАЗУ МИНИСТЕРСТВА СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ от 24 марта 2021 г. N 156 «ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРАВИЛ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ, ДИАГНОСТИЧЕСКИХ, ОГРАНИЧИТЕЛЬНЫХ И ИНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ, УСТАНОВЛЕНИЯ И ОТМЕНЫ КАРАНТИНА И ИНЫХ ОГРАНИЧЕНИЙ, НАПРАВЛЕННЫХ НА ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ И ЛИКВИДАЦИЮ ОЧАГОВ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА» серологическая диагностика должна проводиться методами иммуноферментного анализа (ИФА) и (или) иммунодиффузии (РИД). Диагноз на лейкоз считается установленным в одном из следующих случаев: получен положительный результат при гематологическом исследовании; обнаружены патологоанатомические изменения, характерные для лейкоза при гистологическом исследовании; получен положительный результат при серологических исследованиях.According to ORDER OF THE MINISTRY OF AGRICULTURE OF THE RUSSIAN FEDERATION dated March 24, 2021 N 156 "ON APPROVAL OF VETERINARY RULES FOR THE IMPLEMENTATION OF PREVENTIVE, DIAGNOSTIC, RESTRICTIVE AND OTHER MEASURES, ESTABLISHING AND CANCELING QUARANTINE AND OTHER RESTRICTIONS TO PREVENT THE SPREAD AND ELIMINATE BORN LEUKEMIA POSITIONS » serological diagnosis should be carried out by enzyme immunoassay (ELISA) and (or) immunodiffusion (RID). The diagnosis of leukemia is considered established in one of the following cases: a positive result is obtained in a hematological examination; revealed pathoanatomical changes characteristic of leukemia in histological examination; received a positive result in serological studies.

Среди серологических тестов, ИФА является более предпочтительным из-за его более высокой чувствительности, есть данные, что чувствительность РИД ниже на 30%. Для серологических методов диагностики BLV, мишенями являются антитела, распознающие капсидный белок р24, кодируемый геном gag и поверхностный гликопротеин gp51, кодируемый env [Bai L. et al., 2019; Marawan M.A. et al., 2021].Among serological tests, ELISA is preferred due to its higher sensitivity, there is evidence that the sensitivity of RID is lower by 30%. For serological methods for diagnosing BLV, the targets are antibodies that recognize the capsid protein p24 encoded by the gag gene and the surface glycoprotein gp51 encoded by env [Bai L. et al., 2019; Maravan M.A. et al., 2021].

Белок gp51 необходим для проникновения вируса в клетки хозяина, из-за своей поверхностной локализации является мишенью для нейтрализующих антител. Конформационные эпитопы F, G и Н, расположенные в N-конце gp51, важны для формирования синцития. Env gp51 часто используется для филогенетического анализа BLV, выделяют 11 генотипов вируса. Генотип-1 является наиболее доминирующим генотипом BLV и распространен практически на всех континентах, вторым по распространенности генотипом является генотип-4, который преимущественно выявляется в Европе и некоторых странах Америки [Ruiz V. et al., 2018].The gp51 protein is necessary for the virus to enter host cells, and due to its surface localization, it is a target for neutralizing antibodies. The conformational epitopes F, G, and H located at the N-terminus of gp51 are important for syncytium formation. Env gp51 is often used for phylogenetic analysis of BLV, 11 genotypes of the virus are isolated. Genotype-1 is the most dominant BLV genotype and is distributed on almost all continents, the second most common genotype is genotype-4, which is predominantly detected in Europe and some American countries [Ruiz V. et al., 2018].

В России распространены 4, 7 и 8 генотипы вируса. Изучение нуклеотидных последовательностей BLV важно не только для установления филогенетических связей, но и для выяснения потенциального влияния изолятов из разных географических областей на серодиагностику вируса [ 2013].In Russia, 4, 7 and 8 genotypes of the virus are common. The study of BLV nucleotide sequences is important not only to establish phylogenetic relationships, but also to elucidate the potential influence of isolates from different geographical areas on the serodiagnosis of the virus [ 2013].

Капсидный белок р24 обладает высокой иммуногенностью и присутствует как в вирионах, так и в инфицированных клетках в концентрациях, превышающих концентрации gp51. Белок gp51 локализуется на поверхности вирусной частицы и, поскольку он содержит сайт распознавания рецепторов, необходимых для проникновения вируса, считается естественной мишенью для нейтрализующих антител, он может вызывать сильный иммунный ответ у инфицированного крупного рогатого скота [Bai L. et al., 2019].The p24 capsid protein is highly immunogenic and is present both in virions and in infected cells at concentrations exceeding those of gp51. The gp51 protein is localized on the surface of the viral particle and, since it contains the recognition site of the receptors necessary for virus entry, is considered a natural target for neutralizing antibodies, it can cause a strong immune response in infected cattle [Bai L. et al., 2019].

Разработано множество тестов для определения антител к BLV. Все они отличаются друг от друга форматом ИФА, типом диагностической мишени, выявляемым спектром антител, типом и объемом исследуемого образца, процедурой постановки. В таблице 1 собраны характеристики имеющихся на рынке основных ИФА тестов для диагностики BLV-инфекции.Many tests have been developed to detect antibodies to BLV. All of them differ from each other in the ELISA format, the type of diagnostic target, the antibody spectrum detected, the type and volume of the test sample, and the setting procedure. Table 1 summarizes the characteristics of the main ELISA tests available on the market for diagnosing BLV infection.

Анализ инструкций по применению некоторых зарубежных и отечественных иммуноферментных тест-систем для определения антител к BLV показал, что для скрининга лейкоза КРС используется метод непрямого ИФА или конкурентный ИФА, в качестве подтверждающего теста используется непрямой ИФА, в состав которого входят стрипы с BLV антигеном и стрипы с контрольным антигеном. Результаты, полученные в наборах реагентов, в состав которых входят высоко очищенный антиген - не требуют дополнительной верификации. Все тест-системы с двухстадийным форматом постановки.An analysis of the instructions for the use of some foreign and domestic ELISA test systems for the determination of antibodies to BLV showed that the indirect ELISA method or competitive ELISA is used for screening bovine leukemia, indirect ELISA is used as a confirmatory test, which includes strips with BLV antigen and strips with control antigen. The results obtained in reagent kits containing highly purified antigen do not require additional verification. All test systems with a two-stage setting format.

В составе большинства тест-систем ИФА используют лизат вируса или лизатный антиген gp51, в 1 тест-системе используются антигены gp51 и р24. Тест-системы определяют антитела класса G к BLV или общие антитела.As part of most ELISA test systems, a virus lysate or gp51 lysate antigen is used; in 1 test system, gp51 and p24 antigens are used. Test systems detect class G antibodies to BLV or total antibodies.

Были исследованы релевантные документы, связанные с диагностикой вирусных инфекций иммуноферментным методом. В тест-системах ИФА используется лизат вируса или антиген gp51 BLV, которые получают из культуральной жидкости клеточной линии эмбриональной почки ягненка (FLK), инфицированной BLV (FLK-BLV). Многоэтапная процедура очистки вируса или его антигенов требует дорогостоящей сложной аппаратуры. Для культивирования клеток FLK, инфицированных BLV, обычно используют телячью сыворотку, содержащую иммуноглобулины КРС, из-за этого происходит контаминация gp51 антигена, несмотря на сложные этапы очистки, что приводит к ложноположительным результатам ИФА. Технологии, описанные в патентах PL 214884 B1, ЕР 2328912 А1 позволяют использовать среды для культивирования клеток, не содержащие бычьей сыворотки и получить антиген gp51 BLV без контаминации антителами КРС.Relevant documents related to the diagnosis of viral infections by enzyme immunoassay were examined. The ELISA assays use a virus lysate or BLV gp51 antigen, which is obtained from the culture fluid of a BLV-infected lambskin fetal (FLK) cell line (FLK-BLV). A multi-stage procedure for purification of a virus or its antigens requires expensive complex equipment. BLV-infected FLK cells are usually cultured with calf serum containing bovine immunoglobulins, which results in contamination of the gp51 antigen despite complex purification steps, leading to false positive ELISA results. The technologies described in patents PL 214884 B1, EP 2328912 A1 allow the use of cell culture media that do not contain bovine serum and obtain the BLV gp51 antigen without contamination with bovine antibodies.

В патенте RU 2377962 C1 было предложено другое решение, для того чтобы избежать сложной процедуры очистки и повысить специфичность и чувствительность анализа проводят иммобилизацию лизатного gp51 антигена на твердом носителе в три этапа с помощью моноклональных антител. Первый этап - неспецифическая адсорбция моноклональных антител мыши к глобулинам овцы 1Н8, не реагирующих с иммуноглобулинами крупного рогатого скота. Второй этап - специфическое иммунологическое связывание с указанными антителами моноклональных антител овцы к антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота 8С12. Третий этап - специфическое иммунологическое связывание gp51 BLV с моноклональными антителами овцы к этому антигену.In patent RU 2377962 C1, another solution was proposed, in order to avoid a complex purification procedure and increase the specificity and sensitivity of the analysis, the lysate gp51 antigen is immobilized on a solid support in three stages using monoclonal antibodies. The first stage is the nonspecific adsorption of mouse monoclonal antibodies to sheep 1H8 globulins that do not react with bovine immunoglobulins. The second stage is the specific immunological binding of sheep monoclonal antibodies to the antigen of the bovine leukemia virus 8C12 with the indicated antibodies. The third stage is the specific immunological binding of gp51 BLV to sheep monoclonal antibodies to this antigen.

В патенте CN 110078820 А описано получение рекомбинантного р24 BLV в системе экспрессии Escherichia coli и мышиных моноклональных антител (МКА) к р24 BLV, в патенте KR 100576170 B1 получение рекомбинантного р24 BLV в бакуловирусной системе экспрессии.In patent CN 110078820 A, the production of recombinant p24 BLV in the expression system of Escherichia coli and mouse monoclonal antibodies (MAB) to p24 BLV is described, in patent KR 100576170 B1, the production of recombinant p24 BLV in the baculovirus expression system.

В патенте KZ 25695 изложен способ детекции специфических антител к BLV, в котором для приготовления иммуносорбента используют антиген р24, сенсибилизированный на поверхности носителя посредством моноклональных антител к р24.In patent KZ 25695, a method for detecting specific antibodies to BLV is described, in which the p24 antigen sensitized on the surface of the carrier by means of monoclonal antibodies to p24 is used to prepare an immunosorbent.

Недостатком использования серологических тестов только на основе gp51, является то, что этот поверхностный гликопротеин является высоко вариабельным, то есть животные, инфицированные другим генотипом вируса, могут не иметь антител к уникальному эпитопу и возможен ложноотрицательный результат. В тестах, основанных на высоко консервативном р24 BLV, такая проблема отсутствует [Andreolla А.Р., 2018].A disadvantage of using gp51-only serological tests is that this surface glycoprotein is highly variable, i.e. animals infected with a different virus genotype may not have antibodies to the unique epitope and a false negative result is possible. In tests based on the highly conserved p24 BLV, this problem is absent [Andreolla A.R., 2018].

Использование систем экспрессии Escherichia coli или бакуловируса для получения рекомбинантных антигенов BLV было бы очень полезным для улучшения стандартизации тестов и снижения их производственных затрат [Larsen A. et al., 2017].The use of Escherichia coli or baculovirus expression systems to produce recombinant BLV antigens would be very useful to improve test standardization and reduce their production costs [Larsen A. et al., 2017].

В некоторых публикациях показано удачное получение и использование для серодиагностики рекомбинантного р24, полученного в системе Escherichia coli [Bai L. et al., 2019; Gutiérrez G. et al., 2009; Andreolla A.P., 2018].Some publications show the successful production and use of recombinant p24 obtained in the Escherichia coli system for serodiagnosis [Bai L. et al., 2019; Gutierrez G. et al., 2009; Andreolla A.P., 2018].

До конца не ясно, какие антитела появляются раньше, по одним данным антитела к gp51 появляются первыми [Ruiz V. et al., 2018], по другим данным антитела к р24 обнаруживаются раньше. По всей видимости, первоочередность образования антител к одному или другому белку и их титры зависят от конкретного животного [Bai L. et al., 2019] и/или от чувствительности тест-системы, используемой для детекции этих антител [Larsen A. et al., 2017].It is not completely clear which antibodies appear earlier, according to some data, antibodies to gp51 appear first [Ruiz V. et al., 2018], according to other data, antibodies to p24 are detected earlier. Apparently, the priority of the formation of antibodies to one or another protein and their titers depend on the specific animal [Bai L. et al., 2019] and/or on the sensitivity of the test system used to detect these antibodies [Larsen A. et al. , 2017].

Широко обсуждается опасность вируса лейкоза крупного рогатого скота для здоровья человека, так как провирусная ДНК BLV обнаруживается в молочных и мясных продуктах. В нескольких сообщениях показано, что BLV может нанести вред человеку из-за возможной связи между BLV-инфекцией и развитием рака молочной железы у женщин, а также других гемопоэтических неопластических заболеваний [Marawan MA, 2021, Andreolla АР, 2018].The human health risk of bovine leukemia virus has been widely discussed, as BLV proviral DNA is found in dairy and meat products. Several reports have shown that BLV can harm humans due to a possible association between BLV infection and the development of breast cancer in women, as well as other hematopoietic neoplastic diseases [Marawan MA, 2021, Andreolla AR, 2018].

BLV проникает в клетку хозяина, используя белок AP3D1 в качестве рецептора, который консервативен у большинства видов млекопитающих. ДНК BLV обнаружена у овец и буйволов, что свидетельствует о циркуляции вируса среди нескольких видов, что может быть связано с распространением вируса в условиях совместного содержания животных. Из-за присутствия вируса у нескольких видов и наблюдаемых высоких показателей распространенности следует рассмотреть комплексные стратегии профилактики и контроля в животноводстве, чтобы уменьшить распространение BLV [Olaya-Galán NN, 2022].BLV enters the host cell using the AP3D1 protein as a receptor, which is conserved in most mammalian species. BLV DNA has been found in sheep and buffalo, suggesting that the virus is circulating among several species, which may be related to the spread of the virus in co-housing environments. Due to the presence of the virus in several species and observed high prevalence rates, comprehensive prevention and control strategies in animal production should be considered to reduce the spread of BLV [Olaya-Galán NN, 2022].

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention

Предлагаемое техническое решение заключается в создании иммуноферментной тест-системы для выявления суммарных антител к капсидному белку BLV. Включает иммуносорбент на основе рекомбинантного р24 антигена и детектирующие реагенты.The proposed technical solution is to create an enzyme immunoassay test system for the detection of total antibodies to the BLV capsid protein. Includes immunosorbent based on recombinant p24 antigen and detection reagents.

Технический результат заключается в повышении чувствительности выявления антител к BLV за счет использования «сэндвич» формата ИФА с биотин-стрептавидин системой и выявления всех классов антител к 11 известным генотипам BLV. За счет использования в изобретении рекомбинантного антигена р24 повышается специфичность выявления антител к BLV, не требуется верификация результата в подтверждающем тесте и уменьшаются производственные затраты.The technical result is to increase the sensitivity of detection of antibodies to BLV through the use of a "sandwich" ELISA format with biotin-streptavidin system and the detection of all classes of antibodies to 11 known BLV genotypes. Due to the use of the recombinant p24 antigen in the invention, the specificity of detection of antibodies to BLV is increased, verification of the result in a confirmatory test is not required, and production costs are reduced.

Иммуноферментная тест-система содержит следующий набор реагентов: Иммуносорбент - Планшет полистироловый 96-луночный разборный до стрипов (или до лунок), в лунках которого сорбирован рекомбинантный р24 антиген BLV (BLV р24, кат. № ABLV 1010, ООО «НПО «Диагностические системы»); Конъюгат-1 - Концентрат (×11). Рекомбинантный антиген BLV, конъюгированный с биотином (BLV p24-Biotin, кат. № ABLV-b-101, ООО «НПО «Диагностические системы»); Конъюгат-2 - Концентрат (×11). Стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (rec Streptavidin-HRP, кат. № ASTREP-p-919b, ООО «НПО «Диагностические системы»); РРК-1 - Раствор для разведения Конъюгата-1; РРК-2 - Раствор для разведения Конъюгата-2; К+ - Контрольный положительный образец; К- - Контрольный отрицательный образец; ПР - Промывочный раствор. Концентрат (×25) фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т); Стоп-реагент - Раствор серной кислоты (0,2М); ТМБ-Субстратный раствор - Раствор, содержащий 3,3', 5,5' -тетраметилбензидин и раствор перекиси водорода.The ELISA test system contains the following set of reagents: Immunosorbent - 96-well polystyrene plate, collapsible to strips (or to wells), in the wells of which the recombinant p24 BLV antigen (BLV p24, cat. No. ABLV 1010, NPO Diagnostic Systems LLC) is adsorbed ); Conjugate-1 - Concentrate (×11). Recombinant BLV antigen conjugated with biotin (BLV p24-Biotin, cat. No. ABLV-b-101, NPO Diagnostic Systems LLC); Conjugate-2 - Concentrate (×11). Streptavidin conjugated with horseradish peroxidase (rec Streptavidin-HRP, cat. No. ASTREP-p-919b, NPO Diagnostic Systems LLC); RRK-1 - Solution for breeding Conjugate-1; RRK-2 - Solution for breeding Conjugate-2; K+ - Control positive sample; K- - Control negative sample; PR - Washing solution. Concentrate (×25) phosphate-buffered saline solution with tween (FSB-T); Stop reagent - Sulfuric acid solution (0.2M); TMB-Substrate solution - A solution containing 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide solution.

Метод основан на твердофазном иммуноферментном «сэндвич» анализе. Твердая фаза покрыта рекомбинантным р24 антигеном BLV. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют с Конъюгатом-1 (рекомбинантный антиген BLV, конъюгированный с биотином). Присутствующие в исследуемом образце антитела к BLV взаимодействуют одновременно с антигеном BLV в составе Иммуносорбента и Конъюгата-1. На второй стадии после отмывки образовавшиеся комплексы выявляют с помощью конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена. После отмывки не связавшихся компонентов визуализация происходит в химической реакции пероксидазы с ТМБ-Субстратным раствором с образованием цветной реакции. Интенсивность окрашивания раствора в лунках после внесения Стоп-реагента измеряют спектрофотометрически. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству содержащихся в исследуемом образце антител к BLV.The method is based on enzyme-linked immunosorbent "sandwich" analysis. The solid phase is coated with recombinant p24 BLV antigen. In the first stage of the analysis, the test and control samples are incubated with Conjugate-1 (recombinant BLV antigen conjugated with biotin). Antibodies to BLV present in the test sample interact simultaneously with the BLV antigen in the Immunosorbent and Conjugate-1. At the second stage, after washing, the formed complexes are detected using the conjugate of streptavidin with horseradish peroxidase. After washing off the unbound components, visualization occurs in the chemical reaction of peroxidase with TMB-substrate solution with the formation of a color reaction. The color intensity of the solution in the wells after the addition of the Stop Reagent is measured spectrophotometrically. The intensity of staining is proportional to the amount of antibodies to BLV contained in the test sample.

Данное техническое решение отличается от известных тем, что предлагаемый тест разработан на основе рекомбинантного р24 антигена BLV в «сэндвич» формате ИФА, с использованием биотин-стрептавидин системы.This technical solution differs from the known ones in that the proposed test was developed on the basis of the recombinant p24 BLV antigen in the "sandwich" ELISA format, using the biotin-streptavidin system.

Данные уникальные особенности изобретения обуславливают его преимущества:These unique features of the invention determine its advantages:

- использование рекомбинантного р24 антигена BLV позволяет выявлять антитела ко всем генотипам BLV и уменьшить производственные затраты, исключить верификацию результата в подтверждающем тесте;- the use of recombinant p24 BLV antigen makes it possible to detect antibodies to all BLV genotypes and reduce production costs, exclude verification of the result in a confirmatory test;

- использование «сэндвич» формата ИФА позволяет выявлять суммарные антитела (классов G, М и А) к капсидному белку BLV и определять антитела к BLV у других видов животных. Возможность определения антител к BLV у других видов животных особенно актуальна, в связи с открытием способности вируса преодолевать межвидовые барьеры и в экспериментальных условиях вызывать заболевание у овец, коз, свиней, лошадей, кроликов, хомяков, морских свинок и обезьян, в естественных условиях - инфицировать овец при совместном содержании животных. Выявление антител к BLV у человека может быть дополнительным инструментом в исследовании возможной связи между BLV-инфекцией и развитием онкологических заболеваний человека;- the use of "sandwich" ELISA format allows to detect total antibodies (classes G, M and A) to the BLV capsid protein and to determine antibodies to BLV in other animal species. The possibility of detecting antibodies to BLV in other animal species is especially relevant, in connection with the discovery of the ability of the virus to overcome interspecies barriers and, under experimental conditions, cause disease in sheep, goats, pigs, horses, rabbits, hamsters, guinea pigs and monkeys, and under natural conditions - infect sheep when animals are kept together. The detection of anti-BLV antibodies in humans may be an additional tool in investigating the possible association between BLV infection and the development of human cancers;

- использование биотин-стрептавидин системы - позволяет амплифицировать сигнал за счет наличия у стрептавидина нескольких сайтов связывания с биотином;- the use of the biotin-streptavidin system - allows you to amplify the signal due to the presence of several binding sites for streptavidin with biotin;

- возможность исследования индивидуальных или сборных образцов сыворотки крови и индивидуальных образцов молока КРС;- the possibility of studying individual or combined samples of blood serum and individual samples of cattle milk;

Предложенное решение характеризуется:The proposed solution is characterized by:

- высокой чувствительностью и специфичностью определения антител в сыворотке крови КРС;- high sensitivity and specificity of detection of antibodies in the blood serum of cattle;

- высокой чувствительностью и специфичностью определения антител в молоке КРС.- high sensitivity and specificity of detection of antibodies in cattle milk.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

Фиг. 1 - представлены ROC кривые - кривые параметрического типа соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов для каждого теста в сравнительном анализе.Fig. 1 - ROC curves are presented - curves of the parametric type of the ratios of the correct and false detection of signals for each test in a comparative analysis.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

«Набор реагентов для выявления антител к BLV в сыворотке крови и молоке КРС методом иммуноферментного анализа» («ДС-ИФА-АНТИ-BLV»), предназначен для выявления суммарных антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (КРС) в индивидуальных или сборных образцах сыворотки крови и индивидуальных образцах молока КРС."Reagent kit for detection of antibodies to BLV in blood serum and milk of cattle by enzyme immunoassay" ("DS-ELISA-ANTI-BLV"), designed to detect total antibodies to the bovine leukemia virus (bovine) in individual or combined serum samples blood and individual samples of cattle milk.

Предназначен для качественного анализа. Рекомендуется для клинической лабораторной диагностики лейкоза крупного рогатого скота.Designed for qualitative analysis. Recommended for clinical laboratory diagnosis of bovine leukemia.

Учет результатов проводят спектрофотометрически при двух длинах волн - 450 нм и при референс-длине волны в диапазоне от 620 до 680 нм с настройкой прибора по «воздуху». Допустим учет результатов при одной длине волны - 450 нм.The results are taken into account spectrophotometrically at two wavelengths - 450 nm and at a reference wavelength in the range from 620 to 680 nm with the instrument set to "air". Let's take into account the results at one wavelength - 450 nm.

Наличие антител к BLV оценивается сравнением оптической плотности (ОП), измеряемой для каждого образца, с расчетной величиной ОП критической (ОП крит.).The presence of anti-BLV antibodies is assessed by comparing the optical density (OD) measured for each sample with the calculated OD critical (OD critical).

Результаты анализа учитывать, если среднее значение ОП в лунках с К- (ОПср.К-) не более 0,200, значение ОП в лунках с К+ - не менее 0,600.The results of the analysis should be taken into account if the average value of OD in wells with K- (OPav.K-) is not more than 0.200, the value of OD in wells with K+ is not less than 0.600.

ОП крит. рассчитывать по формуле:OP crit. calculate according to the formula:

ОП крит. = ОПср.К- + А,OP crit. \u003d OPsr.K- + A,

где А - коэффициент, определяемый производителем методом статистической обработки результатов постановки ИФА.where A is the coefficient determined by the manufacturer by the method of statistical processing of the results of the ELISA.

Исследуемые образцы расценивать как положительные: если ОП ≥ ОП крит.The studied samples should be regarded as positive: if OD ≥ OD crit.

Исследуемые образцы расценивать как отрицательные: если ОП < ОП крит.The studied samples should be regarded as negative: if OD < OD crit.

Возможен учет результатов по коэффициенту позитивности (КП) по формуле:It is possible to take into account the results by the coefficient of positivity (KP) according to the formula:

КП=ОП/ОП крит.CP=OP/OP crit.

Исследуемые образцы расценивать как положительные: если КП≥1,0.The studied samples should be regarded as positive: if CP≥1.0.

Исследуемые образцы расценивать как отрицательные: если КП<1,0The studied samples should be regarded as negative: if CP<1.0

Если сборный образец сыворотки крови КРС был определен, как положительный, то сыворотки, входящие в состав пула, должны быть протестированы индивидуально.If a pooled bovine serum sample has been determined to be positive, then the pooled sera must be tested individually.

Пример 1.Example 1

Диагностическая чувствительность и специфичность по образцам сыворотки крови КРСDiagnostic sensitivity and specificity for bovine serum samples

В наборе реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» были протестированы 140 образцов сыворотки крови КРС в диагностическом наборе для обнаружения антител к BLV иммунодиффузным методом в агаровом геле (РИД анти-BLV) и методом ИФА в тест-системе «IDEXX Leukosis Serum Х2», IDEXX Laboratories, США кат. № ЕВТ1132Т, серия SN АС081, годен до 05-09-2023.In the DS-ELISA-ANTI-BLV reagent kit, 140 samples of bovine blood serum were tested in the diagnostic kit for the detection of antibodies to BLV by the immunodiffusion method in agar gel (RID anti-BLV) and by ELISA in the IDEXX Leukosis Serum X2 test system. ”, IDEXX Laboratories, USA cat. No. EBT1132T, SN AC081 series, valid until 09/05/2023.

Диагностическая чувствительность «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» составила 100% (95%CI: 94,7-100%), диагностическая специфичность - 100% (95%CI: 94,9-100%), общее совпадение с «IDEXX Leukosis Serum Х2» составило 100% (95%CI: 97,33-100%).The diagnostic sensitivity of "DS-ELISA-ANTI-BLV" was 100% (95% CI: 94.7-100%), the diagnostic specificity was 100% (95% CI: 94.9-100%), overall agreement with "IDEXX Leukosis Serum X2" was 100% (95% CI: 97.33-100%).

Исследована диагностическая эффективность (точность) «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» с помощью ROC анализа, в котором сравнивали между собой ROC кривые, построенные для «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» и для других тестов/методов, отраженные на фиг.1.The diagnostic efficiency (accuracy) of "DS-ELISA-ANTI-BLV" was studied using ROC analysis, in which the ROC curves plotted for "DS-ELISA-ANTI-BLV" and for other tests/methods shown in Fig. 1.

ROC кривая - это кривая параметрического типа соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов. ROC кривая строится таким образом по оси ординат откладывается чувствительность, а по оси абсцисс значение 1-специфичность, т.е. другими словами неспецифичность. Чувствительность отображает долю истинно положительных результатов, а неспецифичность - частоту ложно положительных результатов.The ROC curve is a parametric type curve of true and false signal detection ratios. The ROC curve is plotted in this way, along the y-axis, sensitivity is plotted, and along the abscissa, the value is 1-specificity, i.e. in other words, nonspecificity. Sensitivity refers to the proportion of true positives, while nonspecificity refers to the rate of false positives.

Наиболее четкое разграничение между больными и здоровыми обследуемыми достигается при использовании тестов, которые имеют характеристическую кривую результатов, сдвинутую в сторону левого верхнего угла графика.The clearest distinction between sick and healthy subjects is achieved using tests that have a characteristic curve of results shifted towards the upper left corner of the graph.

Для получения численного значения диагностической эффективности (точности) теста, а также для сравнения двух тестов, используется показатель AUC (Area Under Curve), который может быть рассчитан при помощи численных методов, например, метода трапеций. Судить о качестве теста можно по экспертной шкале для значений AUC, где 0,9 - 1 это хороший показатель значения AUC. Показатель AUC равный 0,5 и менее, считается неудовлетворительным.To obtain a numerical value of the diagnostic efficiency (accuracy) of the test, as well as to compare two tests, the AUC (Area Under Curve) indicator is used, which can be calculated using numerical methods, for example, the trapezoidal method. The quality of the test can be judged by an expert scale for AUC values, where 0.9 - 1 is a good indicator of the AUC value. An AUC of 0.5 or less is considered unsatisfactory.

У всех исследованных тестов значение площади под кривой было выше 0,9.All tests studied had an area under the curve greater than 0.9.

Пример 2.Example 2

Диагностическая чувствительность и специфичность по образцам молока КРС.Diagnostic sensitivity and specificity for cattle milk samples.

В наборе реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» были протестированы 39 образцов молока КРС, с известным результатом исследования сыворотки крови КРС в «IDEXX Leukosis Serum Х2» от того же животного и забранные в то же время, что и исследуемый образец молока.In the kit of reagents "DS-ELISA-ANTI-BLV" 39 samples of cattle milk were tested, with a known result of the study of blood serum of cattle in "IDEXX Leukosis Serum X2" from the same animal and taken at the same time as the test milk sample.

Диагностическая чувствительность «ДС-ИФА-АНТИ-BLV» по образцам молока КРС составила 100% (95%CI: 83,2-100%), диагностическая специфичность - 100% (95%CI: 83,9-100%), общее совпадение с результатами тестирования образцов сыворотки крови от одного и того же животного, забранных в одно и то же время в «IDEXX Leukosis Serum Х2» составило 100% (95%CI: 91,0-100%).The diagnostic sensitivity of "DS-ELISA-ANTI-BLV" for cattle milk samples was 100% (95% CI: 83.2-100%), diagnostic specificity - 100% (95% CI: 83.9-100%), total the agreement with the results of testing serum samples from the same animal taken at the same time in "IDEXX Leukosis Serum X2" was 100% (95% CI: 91.0-100%).

Claims (9)

1. Иммуноферментная тест-система для выявления суммарных антител к капсидному белку BLV у крупного рогатого скота, содержащая: Иммуносорбент - планшет полистироловый 96-луночный разборный до стрипов или до лунок, в лунках которого сорбирован рекомбинантный р24 антиген BLV; Конъюгат-1 - Концентрат (×11) рекомбинантный антиген BLV, конъюгированный с биотином; Конъюгат-2 - Концентрат (×11) Стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена; раствор для разведения Конъюгата-1 (РРК-1); раствор для разведения Конъюгата-2 (РРК-2); контрольный положительный образец (К+); контрольный отрицательный образец (К-); промывочный раствор (ПР); Стоп-реагент; ТМБ-субстратный раствор - раствор, содержащий 3,3', 5,5'-тетраметилбензидин, и раствор перекиси водорода.1. ELISA test system for the detection of total antibodies to the BLV capsid protein in cattle, containing: Immunosorbent - a polystyrene 96-well collapsible tablet to strips or to wells, in the wells of which recombinant p24 BLV antigen is adsorbed; Conjugate-1 - Concentrate (×11) recombinant BLV antigen conjugated with biotin; Conjugate-2 - Concentrate (×11) Streptavidin conjugated with horseradish peroxidase; solution for diluting Conjugate-1 (RRK-1); solution for diluting Conjugate-2 (RRK-2); control positive sample (K+); control negative sample (K-); washing solution (PR); Stop reagent; TMB-substrate solution - a solution containing 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, and a solution of hydrogen peroxide. 2. Иммуноферментная тест-система по п. 1, где Стоп-реагент представляет собой раствор серной кислоты 0,2 М, ПР представляет собой концентрат (×25) фосфатно-солевого буферного раствора с твином.2. Enzyme immunoassay test system according to claim 1, where the Stop reagent is a solution of sulfuric acid 0.2 M, PR is a concentrate (×25) of a phosphate-buffered saline solution with tween. 3. Способ применения тест-системы по пп. 1, 2 для выявления суммарных антител к капсидному белку BLV, включающий внесение в лунки Иммуносорбента по 50 мкл раствора Конъюгата-1 непосредственно перед добавлением контрольных и исследуемых образцов; внесение в лунки Иммуносорбента по 50 мкл контрольных образцов:3. The method of using the test system according to paragraphs. 1, 2 for the detection of total antibodies to the BLV capsid protein, including the introduction of 50 μl of the Conjugate-1 solution into the wells of the Immunosorbent immediately before adding the control and test samples; adding 50 µl of control samples to the wells of the Immunosorbent: 1-2 стрипа - К+ - 1 лунка, К- - 2 лунки,1-2 strips - K+ - 1 hole, K- - 2 holes, 3 стрипа и более - К+ - 2 лунки, К- - 3 лунки;3 strips and more - K+ - 2 holes, K- - 3 holes; внесение в лунки Иммуносорбента исследуемых образцов:introduction of test samples into the wells of the Immunosorbent: - по 50 мкл индивидуальных или сборных образцов сыворотки крови КРС и/или- 50 µl of individual or combined samples of blood serum of cattle and / or - по 100 мкл индивидуальных образцов молока КРС;- 100 µl of individual samples of cattle milk; тщательное перемешивание контрольных и исследуемых образцов пипетированием, при этом время внесения образцов не должно превышать 15 мин; заклеивание планшета защитной пленкой и выдерживание его 60 мин при температуре 20,0-25,0°С; удаление содержимого лунок с помощью автоматического устройства для промывания планшетов и промывка планшета 4 раза ПР; внесение во все лунки 100 мкл раствора Конъюгата-2; заклеивание планшета защитной пленкой и выдерживание его 60 мин при температуре 20,0-25,0°С; удаление содержимого лунок с помощью автоматического устройства для промывания планшетов и промывка планшета 4 раза ПР; внесение во все лунки по 100 мкл ТМБ-субстратного раствора; выдерживание планшета 20 мин в защищенном от света месте при комнатной температуре; внесение во все лунки по 150 мкл Стоп-реагента, встряхивание стрипов в течение 5-10 с и измерение ОП при двух длинах волн 450 и 620-680 нм; проведение спектрофотометрического учета результатов реакции не позднее чем через 20 мин после внесения Стоп-реагента, значения ОП в лунках с (К+) должны быть не менее 0,600, а среднее значение ОП в лунках с (К-) - не более 0,200.thorough mixing of the control and test samples by pipetting, while the time of introducing the samples should not exceed 15 minutes; sealing the tablet with a protective film and keeping it for 60 minutes at a temperature of 20.0-25.0°C; remove the contents of the wells using an automatic plate washer and wash the plate 4 times PR; adding 100 µl of Conjugate-2 solution to all wells; sealing the tablet with a protective film and keeping it for 60 minutes at a temperature of 20.0-25.0°C; remove the contents of the wells using an automatic plate washer and wash the plate 4 times PR; adding 100 µl of TMB-substrate solution to all wells; keeping the tablet for 20 minutes in a dark place at room temperature; adding 150 µl of Stop Reagent to all wells, shaking the strips for 5-10 s and measuring OD at two wavelengths of 450 and 620-680 nm; carrying out spectrophotometric accounting of the results of the reaction no later than 20 minutes after the introduction of the Stop Reagent, the OD values in the wells with (K+) should be at least 0.600, and the average OD value in the wells with (K-) should not exceed 0.200.

Images