RU2800470C1 - Method of obtaining a monoclonal peroxidase conjugate for the identification of typical and atypical strains of vibrio cholerae o1, including r-variants in dot-elisa - Google Patents

Abstract

FIELD: microbiology; biotechnology.

SUBSTANCE: method implies using monoclonal peroxidase conjugate as a diagnostic reagent. The method includes the following technological steps: activation of peroxidase, conjugation of activated peroxidase with specific immunoglobulins, purification of unbound proteins, storage and control. The difference of the invention is as follows: the activation is carried out in the following sequence: the enzyme horseradish peroxidase is dissolved in 0.3 M carbonate-bicarbonate buffer with pH 9.5 at the rate of 5 mg per 1 ml. At certain intervals — 1 h, 30 min, 1 h, respectively, 100 μl of 1% 2,4-dinitro1-fluoro-benzene, 1.0 ml of 0.08 M sodium periodate, 1.0 ml of 0.16 M ethylene glycol, then the mixture of reagents is incubated for 3 hours in the darkness at room temperature with constant stirring on a magnetic stirrer at a speed of 80–100 rpm. After that, for conjugation, the activated peroxidase solution is combined with monoclonal antibodies dissolved in 0.1 M phosphate-buffered saline with pH 7.2–7.4 in a ratio of 1:3, namely: 5 mg of peroxidase and 15 mg of MCA, the mixture is adjusted to pH 9.5 by adding 10 μl of 0.5 M carbonate-bicarbonate buffer. The conjugation is continued for 3 hours in the darkness at room temperature on a magnetic stirrer at a speed of 80–100 rpm, periodically monitoring the pH to be kept at 9.5. After the reaction is stopped after 3 hours by adding 5 mg of dry sodium bromide and left overnight at a temperature of 4°C. Purification of the conjugate from unbound components is carried out by dialysis in 0.1 M phosphate-buffered saline with pH 7.2–7.4 at a temperature of 4°C, changing the buffer during the day. The final purification of the conjugate is carried out using gel filtration on Sephadex G-50, obtaining a conjugate with a titer of 1:64–1:128.

EFFECT: invention can be used to identify strains of vibrio cholerae O1 serogroup and R-variants isolated in the process of cholera monitoring studies on the territory of the Russian Federation.

1 cl, 1 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицинскойThe present invention relates to medical

микробиологии, в частности гибридомной биотехнологии, и может быть использовано с целью идентификации штаммов холерных вибрионов O1 серогруппы и R- вариантов, выделяемых в процессе мониторинговых исследований холеры на территории РФ.microbiology, in particular hybridoma biotechnology, and can be used to identify strains of Vibrio cholerae O1 serogroup and R-variants isolated in the process of cholera monitoring studies in the Russian Federation.

При проведении мониторинговых исследований холеры из объектов внешней среды нередко выделяются атипичные штаммы, отличающиеся низкой агглютинабельностью в отношении О-сывороток или агглютинирующиеся только RO-сывороткой. Появление таких штаммов связано с их длительным пребыванием в воде открытых водоемов на ряде территорий РФ, фенотип которых зависит от условий данной экосистемы, способствующей формированию определенных антигенных вариантов. При этом штаммы, агглютинирующиеся RO-сывороткой, делят на две группы: R и SR-варианты, принципиально отличающиеся по свойствам. Штаммы R-фенотипа (способны агглютинироваться только RO-сывороткой) и никогда не выделялись от людей, они полностью авирулентны, в их составе отсутствуют гены ctx и tcp. В тоже время SR- варианты характеризуются способностью вступать в реакцию агглютинации (РА) с видоспецифическими и сероварныи сыворотками, включая и РО-сыворогку. Обычно такие субкультуры взаимодействуют с сыворотками в низком разведении [1].When conducting monitoring studies of cholera, atypical strains are often isolated from environmental objects, which are characterized by low agglutinability in relation to O-sera or agglutinated only by RO-serum. The appearance of such strains is associated with their long stay in the water of open reservoirs in a number of territories of the Russian Federation, the phenotype of which depends on the conditions of this ecosystem, which contributes to the formation of certain antigenic variants. At the same time, strains agglutinating with RO serum are divided into two groups: R and SR variants, which fundamentally differ in their properties. The R-phenotype strains (capable of being agglutinated only by RO-serum) have never been isolated from humans, they are completely avirulent, they lack the ctx and tcp genes. At the same time, SR-variants are characterized by the ability to enter into an agglutination reaction (RA) with species-specific and serovar sera, including RO-serum. Typically, such subcultures interact with low dilution sera [1].

Как известно, агглютинирующие свойства вибрионов обусловлены строением ЛПС. Отрицательная реакция агглютинации вибрионов с О-сывороткой свидетельствует об утрате полноценного синтеза диагностически значимого О-антигена. У вибрионов с дефектом синтеза О-боковых цепей, серологическая специфичность агглютинирующей сыворотки определяется концевыми детерминантами кор-олигосахарида (R-ЛПС) и они индуцируют образование соответствующих им антител, составляющих основной пул RO-сыворотки, которая используется для обнаружения R-вариантов.As is known, the agglutinating properties of vibrios are due to the structure of LPS. A negative agglutination test of vibrios with O-serum indicates the loss of a full-fledged synthesis of a diagnostically significant O-antigen. In vibrios with a defect in the synthesis of O-side chains, the serological specificity of agglutinating serum is determined by the terminal determinants of core-oligosaccharide (R-LPS) and they induce the formation of their corresponding antibodies, which make up the main pool of RO-serum, which is used to detect R-variants.

Причем реакция агглютинации RO-сывороткой на сегодняшний день является единственным методом обнаружения R- вибрионов. Несмотря на то, что реакция агглютинации представляет собой наиболее простой и широко применяемый метод определения серопринадлежности и идентификации холерных вибрионов O1, она имеет отдельные недостатки, к которым относится невысокая чувствительность, субъективность оценки результатов, возможность ложноположительных реакций в случае спонтанной агглютинации или вследствие перекрестной реактивности при использовании поликлональных адсорбированных сывороток. Очевидно, что эффективность серологических методов зависит от качества используемых специфических иммунореагентов, в связи с чем остается актуальной оптимизация технологии их получения и несомненно в этом направлении перспективно использование гибридомной технологии, являющейся источником высокоаффинных антител уникальной специфичности. Следовательно, повысить чувствительность и специфичность иммунологических реакций возможно с помощью моноклональных антител, которые характеризуются строгой специфичностью (направлены к отдельной антигенной детерминанте диагностически значимого антигена), высокой активностью, стандартностью, стабильностью и возможностью получения в неограниченных количествах.Moreover, the agglutination test with RO-serum is currently the only method for detecting R-vibrios. Despite the fact that the agglutination test is the simplest and most widely used method for determining serobelonging and identifying Vibrio cholerae O1, it has certain disadvantages, which include low sensitivity, subjectivity in the evaluation of results, the possibility of false positive reactions in the case of spontaneous agglutination or due to cross-reactivity with using polyclonal adsorbed sera. Obviously, the effectiveness of serological methods depends on the quality of the specific immunoreagents used, and therefore the optimization of the technology for their production remains relevant, and the use of hybridoma technology, which is a source of high-affinity antibodies of unique specificity, is undoubtedly promising in this direction. Therefore, it is possible to increase the sensitivity and specificity of immunological reactions with the help of monoclonal antibodies, which are characterized by strict specificity (directed to a separate antigenic determinant of a diagnostically significant antigen), high activity, standardity, stability, and the possibility of obtaining in unlimited quantities.

Из иммунологических методов в настоящее время хорошо себя зарекомендовал иммуноферментный анализ (ИФА), как высокочувствительный, воспроизводимый, наглядный и современный диагностический метод. Экономически оправданным являетсяOf the immunological methods, enzyme immunoassay (ELISA) has now proven itself well as a highly sensitive, reproducible, visual and modern diagnostic method. It is economically justified

использование более простого варианта ИФА - дот-иммуноанализа (дот-ИФА, dot-Elisa, точечный твердофазный иммуноферментный анализ). Он в большей степени отвечает требованиям экспрессности, относительно невысокой стоимости, отличается простотой технического исполнения и учета результатов. Его преимущества в том, что на нитроцеллюлозную подложку (мембрану) наносят минимальные количества антигена или антител в виде серии точек, что дает возможность выполнить большее число анализов с тем же количеством реагентов., Кроме того, простота постановки, малые расходы антигена и других компонентов, необходимых для проведения реакции, позволяет использовать ее в полевых условиях.the use of a simpler variant of ELISA - dot-immunoassay (dot-ELISA, dot-Elisa, dot enzyme-linked immunosorbent assay). It meets the requirements of rapidity to a greater extent, relatively low cost, and is distinguished by the simplicity of technical execution and accounting of results. Its advantages are that minimal amounts of antigen or antibodies are applied to the nitrocellulose substrate (membrane) in the form of a series of dots, which makes it possible to perform a larger number of analyzes with the same amount of reagents. In addition, ease of setup, low consumption of antigen and other components, necessary for the reaction, allows you to use it in the field.

Известна многокомпонентная тест-система [2], представляющая собой модифицированный вариант дот-иммуноанализа на основе специфичных поликлональных сывороток для определения наличия О-антигена в составе клеток холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, токсинкорегулирующих пилей, холерного токсина, его В-субъединицы и оценки экспрессии генов, кодирующих данные антигены.A multicomponent test system is known [2], which is a modified version of dot-immunoassay based on specific polyclonal sera to determine the presence of O-antigen in the cells of Vibrio cholerae serovars Ogawa and Inaba, toxin-regulating pili, cholera toxin, its B-subunit and expression assessment genes encoding these antigens.

Известна комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система[3], позволяющая одновременно проводить идентификацию холерных вибрионов O1 и 0139 серогрупп в ИФА и определять их вирулентность на основе тестирования присутствия в геноме диагностически значимых генов, генов вирулентности и оценки их экспрессии.A complex geno- and immunodiagnostic test system is known [3], which allows simultaneously identifying Vibrio cholerae O1 and 0139 serogroups in ELISA and determining their virulence based on testing the presence of diagnostically significant genes, virulence genes in the genome and assessing their expression.

Известен способ обнаружения некультивируемых форм Vibrio cholerae O1, O139 серогрупп и прогнозирования их потенциальной способности к реверсии методом иммуноферментного анализа [4], в котором используют набор специфических моноклональных антител (МКА), полученных к различным эпитопам О-антигена ЛПС холерных вибрионов O1, O139 серогрупп.A known method for detecting non-culturable forms of Vibrio cholerae O1, O139 serogroups and predicting their potential for reversion by enzyme immunoassay [4], which uses a set of specific monoclonal antibodies (MCA) obtained to various epitopes of the LPS O-antigen of Vibrio cholerae O1, O139 serogroups .

Однако, в данном способе МКА применяются как самостоятельные диагностические реагенты.However, in this method, MCAs are used as independent diagnostic reagents.

Использование различных вариантов ИФА и препаратов на основе МКА является также перспективным в случае изучения антигенных взаимосвязей типичных и R-форм холерных вибрионов и для диагностики глубоко измененных по антигенной структуре вибрионов [5].The use of various ELISA variants and preparations based on MCA is also promising in the case of studying the antigenic relationships of typical and R-forms of V. cholerae and for the diagnosis of V. cholera deeply changed in antigenic structure [5].

За прототип выбрана иммунохроматографическая тест-система на основе видоспецифических МКА к О-антигену, разработанная в ФГУН ГНЦ ПМБ (г.Оболенск) и предназначенная для идентификации типичных холерных вибрионов O1 серогруппы [6, 7]. Ее применение позволяет выявлять штаммы V.cholerae O1, если их концентрация в исследуемых пробах будет не ниже 10⁸ м.к./мл. В случае атипичных штаммов (низкоагглютинабельных) содержание вибрионов в пробах должно быть не меньше 10⁹ м.к./мл.For the prototype, an immunochromatographic test system based on species-specific MCA for the O-antigen, developed at the FGUN SRC PMB (Obolensk) and designed to identify typical Vibrio cholerae O1 serogroup [6, 7]. Its use makes it possible to detect strains of V.cholerae O1 if their concentration in the test samples is not lower than 10 ⁸ mc/ml. In the case of atypical strains (low-agglutinable), the content of vibrios in the samples must be at least 10 ⁹ mc/ml.

К числу недостатков данной тест-системы относится: невозможность использования ее для детекции атипичных и R-вариантов холерных вибрионов O1 серогруппы, количественного определения О-антигена в составе клеток, не всегда удовлетворительная чувствительность, колеблющаяся в пределах 67-95%, высокая экономическая затратность в связи с необходимостью для производства тест-полосок коллоидного золота.The disadvantages of this test system include: the impossibility of using it for the detection of atypical and R-variants of vibrio cholerae O1 serogroup, the quantitative determination of the O-antigen in the composition of cells, not always satisfactory sensitivity, ranging from 67-95%, high economic cost in due to the need for the production of colloidal gold test strips.

Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка нового способа получения диагностического реагента на основе пероксидазы, конъюгированной с МКА, направленными к специфическим детерминантам О-антигена ЛПС, для идентификации в дот-ИФА типичных, атипичных штаммов и R-вариантов V.cholerae O1.The technical objective of the proposed invention is the development of a new method for obtaining a diagnostic reagent based on peroxidase conjugated with MCA directed to specific determinants of the LPS O-antigen to identify typical, atypical strains and R-variants of V. cholerae O1 in dot-ELISA.

Поставленная задача достигается тем, что для идентификации в дот-ИФА типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae 01, включая и Инварианты, разработан способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата,, включающий следующие технологические приемы: активацию пероксидазы, конъюгацию активированной пероксидазы соThe task is achieved by the fact that in order to identify typical and atypical strains of Vibrio cholerae 01 in dot-ELISA, including Invariants, a method has been developed for obtaining a monoclonal peroxidase conjugate, including the following technological methods: activation of peroxidase, conjugation of activated peroxidase with

специфическими иммуноглобулинами, очистку несвязавшихся белков, хранение и контроль, отличающийся тем, что активирование проводят в следующей последовательности: фермент пероксидазу хрена растворяют в 0,ЗМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 из расчета 5 мг в 1 мл, при этом через определенные промежутки времени - 1 час, 30 мин., 1 час добавляют соответственно 100 мкл 1% 2,4-динитро1-флуор-бензола, 1,0 мл 0,08 М периодата натрия, 1,0 мл 0,16 М этиленгликоля, затем смесь реагентов инкубируют 3 часа в темноте в условиях комнатной температуры при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, после этого активированный раствор пероксидазы соединяют с моноклональными антителами, растворенными в 0,1М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 в соотношении 1:3, а именно: 5 мг пероксидазы и 15 мг МКА, смесь доводят до рН 9,5 путем прибавления 10 мкл 0,5М карбонат-бикарбонатного буфера и проводят конъюгацию в течение 3-х часов в темноте при комнатной температуре на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, периодически контролируя показателъ рН, чтобы он оставался на уровне 9,5, реакцию останавливают спустя 3 часа путем внесения 5 мг сухого бромида натрия и оставляют на ночь при температуре 4°С, затем очищают конъюгат от несвязавшихся компонентов путем диализа в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 при температуре 4°С, проводя замену буфера в течение суток, а окончательную очистку конъюгата осуществляют при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-50, получая конъюгат с титром 1:128 -1:256.specific immunoglobulins, purification of unbound proteins, storage and control, characterized in that the activation is carried out in the following sequence: the enzyme horseradish peroxidase is dissolved in 0.3M carbonate-bicarbonate buffer pH 9.5 at the rate of 5 mg per 1 ml, while at certain intervals time - 1 hour, 30 minutes, 1 hour, respectively, 100 μl of 1% 2,4-dinitro1-fluoro-benzene, 1.0 ml of 0.08 M sodium periodate, 1.0 ml of 0.16 M ethylene glycol are added, then the mixture reagents are incubated for 3 hours in the dark at room temperature with constant stirring on a magnetic stirrer at a speed of 80-100 rpm, after which the activated peroxidase solution is combined with monoclonal antibodies dissolved in 0.1 M phosphate-buffered saline pH 7.2-7 ,4 in a ratio of 1:3, namely: 5 mg of peroxidase and 15 mg of MCA, the mixture is adjusted to pH 9.5 by adding 10 μl of 0.5 M carbonate-bicarbonate buffer and conjugation is carried out for 3 hours in the dark at room temperature. temperature on a magnetic stirrer at a speed of 80-100 rpm, periodically monitoring the pH so that it remains at the level of 9.5, the reaction is stopped after 3 hours by adding 5 mg of dry sodium bromide and left overnight at a temperature of 4 ° C, then the conjugate is purified from unbound components by dialysis in 0.1 M phosphate-buffered saline pH 7.2-7.4 at a temperature of 4°C, changing the buffer during the day, and the final purification of the conjugate is carried out using gel filtration on Sephadex G -50, obtaining a conjugate with a titer of 1:128 -1:256.

Способ осуществляется следующим образом:The method is carried out as follows:

Источником видоспецифических MKA-O1 служила гибридома TX-F8/01, депонированная в «Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института цитологии (г. Санкт-Петербург) под номером РККК(П) 386Д. Схема получения пероксидазного конъюгата по Nakane Р.K. et al. [8]. предложена в отношении иммуноглобулинов, выделенных из поликлональных сывороток. В связи с тем, что заявитель использовал для конъюгации моноклональные антитела, этапы активации и конъюгации известной технологии были модифицированы, а именно: 1- этап - активация пероксидазы. Активируют пероксидазу следующим образом: фермент растворяют в 0,ЗМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 (КББ) из расчета 5 мг в 1 мл, затем через определенные промежутки времени (1 час, 30 мин., 1 час) добавляют соответственно 100 мкл 1% 2,4-динитро1-флуор-бензола (ФДНБ), 1,0 мл 0,08М периодата натрия, 1,0 мл 0,16М этиленгликоля. Смесь реагентов инкубируют 3 часа в темноте в условиях комнатной температуры при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин. Активированный раствор пероксидазы соединяют с моноклональными антителами, растворенными в 0,1М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) рН 7,2-7,4 в соотношении 1:3, т.е. 5 мг пероксидазы и 15 мг МКА. В предварительных исследованиях было установлено оптимальное для МКА и пероксидазы соотношение, равное 1:3, так как в этом случае получен пероксидазный конъюгат с максимальным титром 1-128-1-256.The source of species-specific MKA-O1 was the TX-F8/01 hybridoma deposited in the Specialized Collection of Transplanted Somatic Vertebrate Cells of the Institute of Cytology (St. Petersburg) under the number RKKK(P) 386D. Scheme for obtaining a peroxidase conjugate according to Nakane R.K. et al. [8]. proposed in relation to immunoglobulins isolated from polyclonal sera. Due to the fact that the applicant used monoclonal antibodies for conjugation, the stages of activation and conjugation of the known technology were modified, namely: 1st stage - peroxidase activation. Peroxidase is activated as follows: the enzyme is dissolved in 0.3M carbonate-bicarbonate buffer pH 9.5 (CBB) at the rate of 5 mg per 1 ml, then at certain intervals (1 hour, 30 minutes, 1 hour), respectively, 100 μl are added 1% 2,4-dinitro1-fluorobenzene (FDNB), 1.0 ml 0.08M sodium periodate, 1.0 ml 0.16M ethylene glycol. The mixture of reagents is incubated for 3 hours in the dark at room temperature with constant stirring on a magnetic stirrer at a speed of 80-100 rpm. The activated peroxidase solution is combined with monoclonal antibodies dissolved in 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.2-7.4 in a ratio of 1:3, i.e. 5 mg peroxidase and 15 mg MCA. In preliminary studies, the optimal ratio for MCA and peroxidase was found to be 1:3, since in this case a peroxidase conjugate with a maximum titer of 1-128-1-256 was obtained.

2- этап - конъюгация. Для конъюгации растворы активированной пероксидазы и МКА объединяют, затем смесь доводят до рН 9,5 путем прибавления 10 мкл 0,5М КББ. Конъюгацию проводят в течение 3-х часов в темноте при комнатной температуре на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, периодически контролируя показателъ рН, чтобы он оставался на уровне 9,5. Реакцию останавливают спустя 3 часа путем внесения 5 мг сухого бромида натрия и оставляют на ночь при t-4°C.Stage 2 - conjugation. For conjugation, solutions of activated peroxidase and MCA are combined, then the mixture is adjusted to pH 9.5 by adding 10 μl of 0.5 M CBB. Conjugation is carried out for 3 hours in the dark at room temperature on a magnetic stirrer at a speed of 80-100 rpm, periodically monitoring the pH to keep it at 9.5. The reaction is stopped after 3 hours by adding 5 mg of dry sodium bromide and left overnight at t-4°C.

3- этап - очистка. Для удаления несвязавшихся компонентов полученный конъюгат ставят на диализ против 0,1М ФСБ рН 7,2-7,4 при t-4°С, осуществляя замену буфера в течение суток. Окончательную очистку конъюгата проводят при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-50.3 stage - cleaning. To remove unbound components, the resulting conjugate is dialyzed against 0.1 M FSB pH 7.2-7.4 at t-4°C, replacing the buffer during the day. The final purification of the conjugate is carried out using gel filtration on Sephadex G-50.

4- этап - хранение. К очищенному моноклональному пероксидазному конъюгату добавляют 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА) и с целью хранения замораживают при -30°С.4 stage - storage. 0.1% bovine serum albumin (BSA) is added to the purified monoclonal peroxidase conjugate and frozen at -30°C for storage.

Применение полученного диагностического реагента в ИФА и дот-ИФА обеспечивает высокую специфичность в отношении холерных вибрионов O1 серогруппы при отсутствии перекрестных реакций с представителями V.cholerae 0139, V.cholerae поп O1/ nonO139. Salmonella spp., Brucella spp., E.coli и, как следствие, исключается процедура адсорбции близкородственными микроорганизмами.The use of the obtained diagnostic reagent in ELISA and dot-ELISA provides high specificity for V. cholerae O1 serogroup in the absence of cross-reactions with representatives of V. cholerae 0139, V. cholerae pop O1 / nonO139. Salmonella spp., Brucella spp., E. coli and, as a result, the procedure of adsorption by closely related microorganisms is excluded.

Постановка дот-иммуноанализа. ДИА выполняют по общей схеме: нанесение образцов в определенные точки на НЦМ, инкубация образцов в блокирующем растворе, в промывочном растворе, в рабочем разведении конъюгата, в отмывочном растворе, в субстрате для проявления метки, в дистиллированной воде. Все стадии инкубации и промывки выполняются при комнатной температуре. Постановка реакции включает следующие основные приемы:Setting up a dot-immunoassay. DIA is performed according to the general scheme: applying samples at certain points on the NCM, incubating samples in a blocking solution, in a wash solution, in a working dilution of the conjugate, in a wash solution, in a substrate for label development, in distilled water. All steps of incubation and washing are performed at room temperature. The formulation of the reaction includes the following basic techniques:

1. Подготовку образцов: для этого выращивают штаммы V.cholerae O1 и R- варианты на чашках Петри с твердой питательной средой, используемой для культивирования холерных вибрионов (щелочной агар, рН 8,0, агар Хоттингера рН 7,6, LB-arap рН 7,6), которые инкубируют при 37°С в течение 18 ч. Затем 10 млрд. суспензию инактивируют посредством кипячения в течение 30 мин при 100°С.1. Sample preparation: for this, V. cholerae O1 and R-variant strains are grown on Petri dishes with a solid nutrient medium used for cultivating Vibrio cholerae (alkaline agar, pH 8.0, Hottinger agar pH 7.6, LB-arap pH 7.6), which are incubated at 37°C for 18 hours. The 10 billion suspension is then inactivated by boiling for 30 minutes at 100°C.

2. Сенсибилизацию твердой фазы (НЦМ): наносят на мембрану микробные клетки в количестве 10⁶ на точку в объеме 2 мкл, высушивают при комнатной температуре в течение 30 мин. При условии нанесения живой культуры НЦМ помещают в 96° этанол на 30 мин для обеззараживания. Отмывают НЦМ от несвязавшегося антигена 0,01 М натрий-фосфатным буфером, 0,1% твин-20 (ФСБ-Т рН 7,2-7,4) 3-х кратно.2. Solid phase sensitization (SCM): microbial cells are applied to the membrane in an amount of 10 ⁶ per dot in a volume of 2 μl, dried at room temperature for 30 minutes. If a live culture is applied, the NCM is placed in 96° ethanol for 30 min for disinfection. NCM is washed from unbound antigen with 0.01 M sodium phosphate buffer, 0.1% tween-20 (FSB-T pH 7.2-7.4) 3 times.

3. Блокирование свободных сайтов на твердой фазе: обрабатывают мембрану 1%-м раствором БСА в 0,01М ФСБ-Т в течение 30 мин на шейкере. Отмывают мембрану ФСБ-Т 3-х кратно.3. Blocking free sites on the solid phase: treat the membrane with 1% BSA solution in 0.01 M FSB-T for 30 min on a shaker. Wash the membrane FSB-T 3 times.

4. Обработка НЦМ моноклональным пероксидазным конъюгатом: мембрану инкубируют в растворе видоспецифического моноклонального пероксидазного конъюгата в течение 40 мин. при комнатной температуре на шейкере, рабочее разведение конъюгата 1:64-1:128 готовят на ФСБ-Т. Отмывают мембрану ФСБ-Т 3-х кратно и 1 раз дистиллированной водой.4. Treatment of NCM with a monoclonal peroxidase conjugate: the membrane is incubated in a solution of a species-specific monoclonal peroxidase conjugate for 40 min. at room temperature on a shaker, a working dilution of the conjugate 1:64-1:128 is prepared on the FSB-T. Wash the FSB-T membrane 3 times and 1 time with distilled water.

5. Проявление специфических пятен на НЦМ: мембрану помещают на несколько минут до проявления точек-дотов в хромогенную смесь, содержащую 0,01М натрий-фосфатный буфер, рН 7,2-7,4 (ФСБ), 0,025%о раствор перекиси водорода, 0,0125% 3,3-диаминобензидин 4-гидрохлорида (ДАБ). Останавливают реакцию промыванием мембраны в дистилированной воде. Высушивают на воздухе.5. The manifestation of specific spots on the NCM: the membrane is placed for several minutes before the appearance of dots-dots in a chromogenic mixture containing 0.01 M sodium phosphate buffer, pH 7.2-7.4 (PBS), 0.025% hydrogen peroxide solution, 0.0125% 3,3-diaminobenzidine 4-hydrochloride (DAB). Stop the reaction by washing the membrane in distilled water. Air dry.

6. Проводят визуальный учет реакции: за положительный результат принимают четко окрашенные коричневые пятна на белом фоне, отрицательный результат - отсутствие окрашенных пятен или еле заметные пятна на НЦМ.6. A visual record of the reaction is carried out: clearly colored brown spots on a white background are taken as a positive result, a negative result is the absence of colored spots or barely noticeable spots on the NCM.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполненияThe invention is illustrated by the following examples of specific implementation

Пример1.Example1.

Апробация видоспецифического моноклонального пероксидазного конъюгата в планшетном варианте ИФА на наборе штаммов V. cholerae O1 и V.cholerae R -варианты.Approbation of a species-specific monoclonal peroxidase conjugate in an ELISA tablet version on a set of V. cholerae O1 and V. cholerae R-variants.

Все штаммы взяты из коллекции живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора. Для исследования выбраны 27 типичных штаммов V.cholerae биовара Эль Тор, из них 17 относятся к серовару Огава, 10-Инаба и в таблице они обозначены как 1 и 2 группа. Начиная с 3 группы по 6-ю - это 22 атипичных штамма, они агглютинируются в низких титрах видоспецифической и сероварными сыворотками, как это видно из таблицы. В 7-ую группу входит 15 штаммов, представляющих V.cholerae R-варианты и агглютинирующихся только RO-сывороткой. Планшетный вариант иммуноферментного метода и видоспецифический моноклональный пероксидазный конъюгат используют для количественной оценки содержания специфического О-антигена в клетках испытуемых штаммов по показателю оптической плотности (ОП).All strains were taken from the collection of living cultures of the Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor. For the study, 27 typical strains of V.cholerae biovar El Tor were selected, of which 17 belong to the serovar Ogawa, 10-Inaba, and in the table they are designated as groups 1 and 2. Starting from groups 3 to 6, these are 22 atypical strains, they are agglutinated in low titers with species-specific and serovar sera, as can be seen from the table. The 7th group includes 15 strains representing V.cholerae R-variants and agglutinating only with RO-serum. The tablet version of the enzyme immunoassay method and the species-specific monoclonal peroxidase conjugate are used to quantify the content of specific O-antigen in the cells of the tested strains in terms of optical density (OD).

Таким образом, полученные результаты показывают (см. таблицу), что у типичных штаммов 1 и 2 групп, агглютинирующихся в диагностическом титр видоспецифибеской или одной из сероварных сывороток, зарегистрирована положительная реакция с достаточно высокими значениями ОП, как свидетельство значительного содержания О-антигена. Что касается штаммов, включенных в 3-6 группу, то они агглютинируются упомянутыми сыворотками в пределах 1/4-1/8 диагностического титра, но несмотря на это у них положительная реакция со специфическим моноклональным конъюгатом и подтверждение тому - показатели ОП, превышающие в несколько раз отрицательный контроль, на основании которых можно констатировать их принадлежность к V.cholerae O1. Штаммы из 7-ой группы, агглютинирующиеся только RO-сывороткой, не связывались с моноклональным пероксидазным конъюгатом, т.е. реакция отрицательная, что дает основание говорить об отсутствии О-антигена в составе R- штаммов и вполне вероятно, что это может быть самостоятельная группа, не имеющая отношение к V.cholerae 01.Thus, the obtained results show (see table) that in typical strains of groups 1 and 2, agglutinating in the diagnostic titer of a species-specific or one of the serovar sera, a positive reaction with sufficiently high OD values was registered, as evidence of a significant content of O-antigen. As for the strains included in the 3-6 group, they are agglutinated by the mentioned sera within 1/4-1/8 of the diagnostic titer, but despite this, they have a positive reaction with a specific monoclonal conjugate and confirmation of this is the OD indicators exceeding several times negative control, on the basis of which it is possible to ascertain their belonging to V.cholerae O1. Strains from the 7th group, agglutinating only with RO-serum, did not bind to the monoclonal peroxidase conjugate; the reaction is negative, which gives grounds to speak about the absence of the O-antigen in the R-strains and it is likely that this may be an independent group that is not related to V.cholerae 01.

Пример 2.Example 2

Апробация тест-системы дот-ИФА на лабораторных штаммах V.cholerae.Approbation of the dot-ELISA test system on laboratory strains of V.cholerae.

В качестве примера, подтверждающего диагностическую значимость моноклонального пероксидазного конъюгата в тест -системе дот-ИФА, были использованы следующие штаммы: 1 -типичные холерные вибрионы O1 серогруппы биовара Эль Тор (1-10); 2 - штаммы V.cholerae R-варианты (11-20); 3 - штаммы V.cholerae nonO1/nonO139 (21-29); 4-атипичные штаммы (низкоагглютинабельные) V.cholerae O1 (30-39); 5 - V.cholerae O139 (40).As an example confirming the diagnostic significance of the monoclonal peroxidase conjugate in the dot-ELISA test system, the following strains were used: 1 - typical Vibrio cholerae O1 of the El Tor biovar serogroup (1-10); 2 - strains of V.cholerae R-variants (11-20); 3 - V.cholerae nonO1/nonO139 strains (21-29); 4-atypical strains (low agglutination) V.cholerae O1 (30-39); 5 - V. cholerae O139 (40).

Результаты взаимодействия испытуемых штаммов с моноклональным конъюгатом в дот-ИФА представлены на Фиг. 1. Коричневые пятна на НЦМ регистрируют у типичных холерных вибрионов O1 (1-10) и штаммов, агглютинирующихся в низких титрах диагностическими сыворотками (30-39). Данный факт свидетельствует о положительной реакции и наличии в их клетках О-антигена. Окрашенные пятна на НЦМ не обнаружены у штаммов V.cholerae R-вариант - это показатель отрицательной реакции дот-ИФА и отсутствия О-антигена в их составе. Моноклональный пероксидазный конъюгат отличается высокой специфичностью и не вступает в реакцию с близкородственными штаммами V.cholerae O139, V.cholerae nonO1/nonO139, имеющих О-антиген другой структурной организации.The results of the interaction of the test strains with the monoclonal conjugate in dot-ELISA are shown in Fig. 1. Brown spots on NCM are registered in typical Vibrio cholerae O1 (1-10) and strains that agglutinate in low titers with diagnostic sera (30-39). This fact indicates a positive reaction and the presence of O-antigen in their cells. Stained spots on NCM were not found in strains of V.cholerae R-variant - this is an indicator of a negative dot-ELISA reaction and the absence of O-antigen in their composition. The monoclonal peroxidase conjugate is highly specific and does not react with closely related strains of V.cholerae O139, V.cholerae nonO1/nonO139, which have an O-antigen of a different structural organization.

Таким образом, предлагаемое изобретение осуществимо практически и использование видоспецифического моноклонального пероксидазного конъюгата в тест-системе дот-ИФА позволяет выявлять штаммы V.cholerae O1, агглютинирующиеся видоспецифической и сероварными сыворотками, начиная с диагностического и до 1/4-1/8 титра. В случае взаимодействия R-вариантов холерных вибрионов с моноклональным пероксидазным конъюгатом реакция дот-ИФА отрицательная в связи с отсутствием у них полноценного диагностически значимого О-антигена. Положительная агглютинация с RO-сывороткой обусловлена наличием в ее составе специфических антител к R-олигосахариду. Все вышеприведенные данные указывают на возможность использования дот-ИФА с моноклональным пероксидазным конъюгатом для идентификации типичных и атипичных штаммов V.cholerae O1, включая и R-варианты.Thus, the proposed invention is practicable and the use of a species-specific monoclonal peroxidase conjugate in the dot-ELISA test system makes it possible to detect V.cholerae O1 strains that are agglutinated by species-specific and serovar sera, starting from diagnostic and up to 1/4-1/8 titer. In the case of the interaction of R-variants of V. cholerae with a monoclonal peroxidase conjugate, the dot-ELISA reaction is negative due to the lack of a full-fledged diagnostically significant O-antigen. Positive agglutination with RO-serum is due to the presence in its composition of specific antibodies to R-oligosaccharide. All of the above data indicate the possibility of using dot-ELISA with a monoclonal peroxidase conjugate to identify typical and atypical strains of V. cholerae O1, including R-variants.

Источники информации:Information sources:

1. Алексеева Л.П., Черепахина И.Я., Сальникова О.И., Бурлакова О.С. Изучение антигенных взаимосвязей типичных и R-форм холерных вибрионов на основе моноклональных антител. Журн. микробиол., эпидемиолог., иммунобиол. 1998;4:9-11.1. Alekseeva L.P., Cherepakhina I.Ya., Salnikova O.I., Burlakova O.S. Study of antigenic relationships of typical and R-forms of V. cholerae based on monoclonal antibodies. Journal. microbiol., epidemiologist, immunobiol. 1998;4:9-11.

2. Захарова Т.Л., Заднова С.П., Ливанова З.Л. Создание многокомпонентной диагностической иммуноферментной тест-системы для оценки экспрессии основных генов вирулентности и иммуногенности у холерных вибрионов. Биотехнология. 2008; 2: 88-9.2. Zakharova T.L., Zadnova S.P., Livanova Z.L. Creation of a multicomponent diagnostic ELISA test system for assessing the expression of the main genes of virulence and immunogenicity in V. cholerae. Biotechnology. 2008; 2:88-9.

3. «Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп и оценки их вирулентности» патент 2404257 С1, опубл. 20.11.2010 бюл. №323. "Integrated geno- and immunodiagnostic test system for identification of Vibrio cholerae 01 and 0139 serogroups and assessment of their virulence" patent 2404257 C1, publ. 20.11.2010 bul. #32

4. « Способ обнаружения некультивируемых форм Vibrio cholerae 01 и 0139 серогрупп и прогнозирования их потенциальной способности к реверсии», пат. №2287824, кл. G01N 33 /569, опубл. 10.04.2006 г.4. "A method for detecting non-culturable forms of Vibrio cholerae 01 and 0139 serogroups and predicting their potential for reversion", US Pat. No. 2287824, class. G01N 33 /569, publ. 04/10/2006

5. Евдокимова В.В., Алексеева Л.П., Якушева О.А., Левченко Д.А., Кругликов В.Д., Зюзина В.П., Яговкин М.Э. Изучение с помощью панели МКА поверхностных антигенных детерминант атипичных по агглютинабельности штаммов Vibrio cholerae. Проблемы особо опасных инфекций. 2022; 1: 77-85. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-1-77-85.5. Evdokimova V.V., Alekseeva L.P., Yakusheva O.A., Levchenko D.A., Kruglikov V.D., Zyuzina V.P., Yagovkin M.E. The study of surface antigenic determinants of Vibrio cholerae strains with atypical agglutinability using the MCA panel. Problems of especially dangerous infections. 2022; 1:77-85. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-1-77-85.

6. Алексеева Л.П., Телесманич Н.Р., Ломов Ю.М. и др. Сравнительная оценка методов дот- иммуноанализа и иммунохроматографии при выявлении вибрионов O1 серогруппы. Журн. микробиолог., 2010; 6: 88.6. Alekseeva L.P., Telesmanich N.R., Lomov Yu.M. Comparative evaluation of methods of dot-immunoassay and immunochromatography in the detection of vibrio O1 serogroup. Journal. microbiology., 2010; 6:88.

7. Иммунохроматографический тест для идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы РЗН №2013 24.11.2021.7. Immunochromatographic test for the identification of Vibrio cholerae O1 of the RZN serogroup No. 2013 11/24/2021.

8. Nakane Р.К., Kawaoi A.J. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. Histochem Cytochem. 1974; 22: 1084-1091.8. Nakane R.K., Kawaoi A.J. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. Histochem Cytochem. 1974; 22:1084-1091.

Claims (1)

Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА, содержащий следующие технологические приемы: активацию пероксидазы, конъюгацию активированной пероксидазы с специфическими иммуноглобулинами, очистку несвязавшихся белков, хранение и контроль, отличающийся тем, что активирование проводят в следующей последовательности: фермент пероксидазу хрена растворяют в 0,3 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 из расчета 5 мг в 1 мл, при этом через определенные промежутки времени - 1 ч, 30 мин, 1 ч добавляют соответственно 100 мкл 1% 2,4-динитро1-флуор-бензола, 1,0 мл 0,08 М периодата натрия, 1,0 мл 0,16 М этиленгликоля, затем смесь реагентов инкубируют 3 ч в темноте в условиях комнатной температуры при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, после этого для конъюгации активированный раствор пероксидазы соединяют с моноклональными антителами, растворенными в 0,1 М фосфатно-солевом буфере pH 7,2-7,4 в соотношении 1:3, а именно: 5 мг пероксидазы и 15 мг МКА, смесь доводят до рН 9,5 путем прибавления 10 мкл 0,5 М карбонат-бикарбонатного буфера и конъюгацию продолжают в течение 3 ч в темноте при комнатной температуре на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, периодически контролируя показателъ рН, чтобы он оставался на уровне 9,5, после реакцию останавливают спустя 3 ч путем внесения 5 мг сухого бромида натрия и оставляют на ночь при температуре 4°С, при этом очистку конъюгата от несвязавшихся компонентов осуществляют путем диализа в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 при температуре 4°С, проводя замену буфера в течение суток, а окончательную очистку конъюгата проводят при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-50, получая конъюгат с титром 1:64-1:128.A method for producing a monoclonal peroxidase conjugate for identifying typical and atypical strains of Vibrio cholerae O1, including R-variants in dot-ELISA, containing the following technological methods: activation of peroxidase, conjugation of activated peroxidase with specific immunoglobulins, purification of unbound proteins, storage and control, characterized in that that activation is carried out in the following sequence: the enzyme horseradish peroxidase is dissolved in 0.3 M carbonate-bicarbonate buffer pH 9.5 at the rate of 5 mg per 1 ml, while at certain intervals - 1 h, 30 min, 1 h are added, respectively 100 μl of 1% 2,4-dinitro1-fluorobenzene, 1.0 ml of 0.08 M sodium periodate, 1.0 ml of 0.16 M ethylene glycol, then the reagent mixture is incubated for 3 hours in the dark at room temperature with constant stirring on a magnetic stirrer at a speed of 80-100 rpm, after which, for conjugation, the activated peroxidase solution is combined with monoclonal antibodies dissolved in 0.1 M phosphate-buffered saline pH 7.2-7.4 in a ratio of 1:3, namely : 5 mg of peroxidase and 15 mg of MCA, the mixture is adjusted to pH 9.5 by adding 10 μl of 0.5 M carbonate-bicarbonate buffer and conjugation is continued for 3 hours in the dark at room temperature on a magnetic stirrer at a speed of 80-100 rpm min, periodically monitoring the pH so that it remains at the level of 9.5, after the reaction is stopped after 3 hours by adding 5 mg of dry sodium bromide and left overnight at a temperature of 4 ° C, while the conjugate is purified from unbound components by dialysis in 0.1 M phosphate-buffered saline pH 7.2-7.4 at a temperature of 4°C, changing the buffer during the day, and the final purification of the conjugate is carried out using gel filtration on Sephadex G-50, obtaining a conjugate with a titer of 1 :64-1:128.