RU2737776C1 - Test kit for detecting cholera toxin in cultivation medium - Google Patents
Test kit for detecting cholera toxin in cultivation medium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2737776C1 RU2737776C1 RU2020106784A RU2020106784A RU2737776C1 RU 2737776 C1 RU2737776 C1 RU 2737776C1 RU 2020106784 A RU2020106784 A RU 2020106784A RU 2020106784 A RU2020106784 A RU 2020106784A RU 2737776 C1 RU2737776 C1 RU 2737776C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cholera toxin
- dipstick
- test kit
- monoclonal antibodies
- reagents
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
- C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения наличия холерного токсина (XT), продуцируемого штаммами Vibrio cholerae и рекомбинантными штаммами бактерий-продуцентов.The invention relates to medical microbiology and can be used in laboratory diagnostics to determine the presence of cholera toxin (XT) produced by Vibrio cholerae strains and recombinant strains of producer bacteria.
Сущность выявления растворимых продуктов жизнедеятельности бактерий, обладающих антигенными свойствами, заключается в образовании комплексов со специфическими антителами, фиксированными на твердом носителе, с последующим обнаружением таких комплексов специфическими антителами, конъюгированными с ферментной, радиоизотопной, люминесцентной или оптической меткой.The essence of the detection of soluble products of the vital activity of bacteria with antigenic properties consists in the formation of complexes with specific antibodies fixed on a solid support, followed by the detection of such complexes with specific antibodies conjugated with an enzyme, radioisotope, luminescent or optical label.
Известен способ индикации XT, основанный на методе его нейтрализации специфическими антисыворотками на культуре клеток опухоли надпочечников мыши [1]. Суть метода заключается в том, что супернатант культуральной среды, в которой выращивались V. cholerae, смешанный со специфической сывороткой, добавляется в культуру ткани клеток опухоли надпочечников мыши. Параллельно проводится анализ с не обработанным супернатантом и с холерным токсином, выступающим в роли положительного контроля. Результат оценивается по отсутствию цитопатического эффекта на культуре ткани.The known method of indication of XT, based on the method of neutralizing it with specific antisera on a culture of cells of a tumor of the adrenal glands of a mouse [1]. The essence of the method is that the supernatant of the culture medium in which V. cholerae was grown, mixed with a specific serum, is added to the tissue culture of mouse adrenal tumor cells. In parallel, an analysis is carried out with an untreated supernatant and with cholera toxin acting as a positive control. The result is assessed by the absence of a cytopathic effect on tissue culture.
Недостатком такого подхода является:The disadvantage of this approach is:
- необходимость работы с культурой ткани в условиях хорошо оснащенной дорогостоящим оборудованием лаборатории (например, инвертированный микроскоп, CO2-инкубатор и т.д.);- the need to work with tissue culture in a laboratory well equipped with expensive equipment (for example, an inverted microscope, a CO 2 incubator, etc.);
- длительность проведения анализа. Так, только для подготовки монослоя культуры ткани требуется не менее 1 недели, а проведение собственно анализа занимает 3 дня.- the duration of the analysis. So, just for the preparation of a tissue culture monolayer it takes at least 1 week, and the actual analysis takes 3 days.
Указанные недостатки делают данный подход дорогостоящим и не пригодным для работы в условиях ограниченного времени.These disadvantages make this approach expensive and unsuitable for work in limited time conditions.
Известен способ иммуноферментного определения продукции XT штаммами V. cholerae, который включает подготовку исследуемого образца, внесение его в лунки планшета, сенсибилизированных GM1 ганглиозидами, инкубацию образца при 37°С в течение 2 часов, отмывку буферным раствором, внесение коньюгата, с последующей инкубацией и учетом результатов по оптической плотности (ОП).There is a known method for the enzyme immunoassay for the determination of XT production by V. cholerae strains, which includes the preparation of the test sample, its introduction into the wells of the plate sensitized with GM1 gangliosides, the incubation of the sample at 37 ° C for 2 hours, washing with a buffer solution, adding a conjugate, followed by incubation and taking into account results on optical density (OD).
Подготовка образца заключается в индуцировании выхода XT из клеток вибрионов классического и Эль Тор биоваров. Культивирование осуществляют в разных средах, в зависимости от принадлежности V. cholerae к одному из указанных выше биоваров. Холерный вибрион классического биовара культивируют при постоянном помешивании в среде Крейга при температуре 30°С в течение 48 ч, а холерный вибрион биовара Эль Тор культивируют в статичных условиях в среде AKI при температуре 37°С в течение 20 ч или среде Крейга при температуре 30°С в течение 48 ч. [1].Sample preparation consists in inducing XT release from the cells of vibrios of classical and El Tor biovars. The cultivation is carried out in different media, depending on the belonging of V. cholerae to one of the above biovars. Vibrio cholerae of the classical biovar is cultivated with constant stirring in Craig's medium at a temperature of 30 ° C for 48 h, and Vibrio cholerae biovar El Tor is cultivated under static conditions in AKI medium at 37 ° C for 20 hours or Craig's medium at 30 ° C for 48 hours [1].
Недостатками описанного подхода для выявления XT являются:The disadvantages of the described approach for detecting XT are:
- необходимость предварительного определения принадлежности тестируемого штамма V. cholerae к конкретному биовару и в зависимости от этого применение разных сред и условий для индукции продукции холерного токсина, что сопряжено с длительностью и трудоемкостью процесса индукции, высоким риском биологической опасности из-за больших объемов культуральной среды;- the need for a preliminary determination of the belonging of the tested V. cholerae strain to a specific biovar and, depending on this, the use of different environments and conditions for the induction of cholera toxin production, which is associated with the duration and laboriousness of the induction process, a high risk of biological hazard due to large volumes of the culture medium;
- необходимость сенсибилизации лунок иммунологического планшета GM1 ганглиозидами непосредственно перед началом анализа, что существенно увеличивает трудозатраты на его проведение;- the need to sensitize the wells of the GM1 immunological plate with gangliosides immediately before the start of the analysis, which significantly increases the labor costs for its implementation;
- при данном способе выявления XT используются дорогостоящие реагенты (GM1 ганглиозиды, поликлональная сыворотка против XT) и увеличивается длительность проведения этапа подготовки образца и постановки ИФА;- this method of detecting XT uses expensive reagents (GM1 gangliosides, polyclonal serum against XT) and increases the duration of the stage of sample preparation and ELISA;
- антигенное сходство холерного токсина с термолабильным энтеротоксином Escherichia coli не обеспечивает специфичность прикрепления холерного токсина к GM1 ганглиозидам, и, следовательно, не обеспечивает специфичность анализа, направленного на обнаружение холерного токсина.- the antigenic similarity of cholera toxin to the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli does not provide the specificity of cholera toxin attachment to GM1 gangliosides, and, therefore, does not provide the specificity of an assay aimed at detecting cholera toxin.
Известен набор VET-RPLA (Oxoid Limited, Hampshire, England) для реакции латекс-агглютинации, предназначенный для выявления холерного токсина или термолабильного энтеротоксина Escherichia coli. Особенностью этого набора является то, что частицы латекса сенсибилизированы поливалентными иммуноглобулинами, полученными из сыворотки кроликов иммунизированных очищенным холерным токсином [2].Known kit VET-RPLA (Oxoid Limited, Hampshire, England) for the reaction of latex agglutination, designed to detect cholera toxin or heat-labile enterotoxin Escherichia coli. A feature of this kit is that latex particles are sensitized with polyvalent immunoglobulins obtained from the serum of rabbits immunized with purified cholera toxin [2].
Недостатками данного набора являются:The disadvantages of this set are:
- отсутствие специфичности, так как частицы латекса агглютинируют как в присутствии холерного токсина, так и при наличии в супернатанте термолабильного энтеротоксина Escherichia coli;- lack of specificity, since latex particles agglutinate both in the presence of cholera toxin and in the presence of heat-labile enterotoxin Escherichia coli in the supernatant;
- к общим недостаткам латексных диагностикумов относят то, что партии латекса разнятся по сорбционной активности, что затрудняет стандартизацию диагностикума; гидрофилизированные участки латексного носителя экранируют полимерные цепи иммунореагентов в поверхностном слое латексных частиц, что снижает чувствительность диагностикума; при использовании сорбционных методов нагрузки латексных частиц диагностикум снижает свою чувствительность в 4-8 раз уже в течение месяца; зачастую срок использования латексных диагностикумов сокращается за счет десорбции специфического белка с поверхности полимера из-за конкуренции с балластным белком, содержащимся в диагностикуме [3, 4, 5, 6].- the general disadvantages of latex diagnosticums include the fact that batches of latex differ in sorption activity, which makes it difficult to standardize the diagnosticum; hydrophilized areas of the latex carrier shield the polymer chains of immunoreagents in the surface layer of latex particles, which reduces the sensitivity of the diagnosticum; when using sorption methods of loading latex particles, the diagnosticum reduces its sensitivity by 4-8 times already within a month; often the period of use of latex diagnosticums is reduced due to the desorption of a specific protein from the polymer surface due to competition with the ballast protein contained in the diagnosticum [3, 4, 5, 6].
Известна сконструированная на основе поликлональных антител к холерному токсину иммунохроматоргафическая тест-полоса для выявления холерного токсина. Чувствительность иммунохроматографических тест-полосок составляла - 10 нг/мл. [7].Known constructed on the basis of polyclonal antibodies to cholera toxin immunochromator-tragic test strip for the detection of cholera toxin. The sensitivity of the immunochromatographic test strips was 10 ng / ml. [7].
Недостатками данной тест-полосы являются:The disadvantages of this test strip are:
- высокая вероятность получения ложноположительных результатов из-за использования поликлональных антител, которые являются причиной выявления термолабильного энтеротоксина Escherichia coli, на что указывают сами авторы;- a high probability of obtaining false positive results due to the use of polyclonal antibodies, which are the cause of the detection of heat-labile enterotoxin Escherichia coli, as indicated by the authors themselves;
- производство иммунохроматографических полосок является экономически затратным и их себестоимость в итоге получается достаточно высокой.- the production of immunochromatographic strips is economically costly and, as a result, their cost is quite high.
Описана тест-система на основе специфичных к холерному токсину моноклональных антител в формате гидрогелевых биочипов, изготовленные по технологии полимеризационной иммобилизации. Предел обнаружения токсина составил 0,44 нг/мл. Представленная тест-система апробирована на пробах, содержащих коммерческий препарат холерного токсина (Sigma, США). Применение современной технологии биомикрочипов дает точные результаты в сжатые сроки [8].A test system based on cholera toxin-specific monoclonal antibodies in the format of hydrogel biochips, manufactured using polymerization immobilization technology, is described. The detection limit of the toxin was 0.44 ng / ml. The presented test system was tested on samples containing a commercial preparation of cholera toxin (Sigma, USA). The use of modern technology of biomicrochips provides accurate results in a short time [8].
Недостатками данной тест-системы являются:The disadvantages of this test system are:
- сложная технология изготовления биомикрочипов: требуется проверка качества биочипов с помощью биочип-анализатора со специальным программным обеспечением (TestChip и QualityControl);- complex technology for the manufacture of biomicrochips: it is required to check the quality of biochips using a biochip analyzer with special software (TestChip and QualityControl);
- для учета результатов требуется дополнительное оборудование -флуоресцентный анализатор.- to take into account the results, additional equipment is required - a fluorescent analyzer.
Известна «Тест-система иммуноферментная для определения продукции холерного токсина штаммами Vibrio cholerae (ИФАХолХТ-М)». Тест-система представляет собой: полистироловый планшет однократного применения для иммуноферментного анализа 12 стрипов по 8 лунок, сенсибилизированнный моноклональными иммуноглобулинами к холерному токсину, и набор компонентов для проведения анализа [9, 10].Known "Test system enzyme immunoassay for determining the production of cholera toxin by strains of Vibrio cholerae (IFAHolKhT-M)". The test system consists of a single-use polystyrene plate for enzyme immunoassay, 12 strips of 8 wells, sensitized with monoclonal immunoglobulins to cholera toxin, and a set of components for analysis [9, 10].
Основными недостатками данной тест-системы являются:The main disadvantages of this test system are:
- сравнительно не экономное расходование дорогостоящих ингредиентов при изготовлении тест-системы и при проведении анализа;- relatively inexpensive consumption of expensive ingredients in the manufacture of the test system and in the analysis;
- при учете результатов реакции предусмотрено фотометрическое измерение изменения окраски в лунках, т.е. требуется дополнительное дорогостоящее оборудование;- when taking into account the results of the reaction, a photometric measurement of the color change in the wells is provided, i.e. additional expensive equipment is required;
- необходимость использования стоп-реагента при проведении анализа;- the need to use a stop reagent during the analysis;
- невозможность проведения внутреннего контроля реакции в каждой лунке планшета.- impossibility of internal control of the reaction in each well of the plate.
Проведенный анализ патентной и научно-технической информации показал, что в настоящее время отсутствуют тест-системы, предназначенные для выявления холерного токсина в среде культивирования методом дот-иммуноанализа на дипстиках. Это говорит об актуальности разработки такой тест-системы, технически простой в использовании и удобной для проведения анализа, в том числе, при эпидемических вспышках холеры в условиях ограниченного доступа к дорогостоящему оборудованию.The analysis of patent and scientific and technical information showed that currently there are no test systems designed to detect cholera toxin in the culture medium by the method of dot-immunoassay on dipsticks. This indicates the relevance of the development of such a test system, which is technically easy to use and convenient for analysis, including during epidemic outbreaks of cholera in conditions of limited access to expensive equipment.
Задачей изобретения является разработка эффективной тест-системы для выявления холерного токсина в среде культивирования.The objective of the invention is to develop an effective test system for detecting cholera toxin in a culture medium.
Техническим результатом заявляемого изобретения является высокоспецифичное, простое, биологически менее опасное, быстрое и высокоэффективное выявление холерного токсина в среде культивирования. Кроме того, заявляемое изобретение позволяет сократить время анализа по выявлению холерного токсина, что особенно важно в ургентных ситуациях. Экономический эффект использования заявляемого изобретения состоит в снижении стоимости анализа за счет уменьшения трудозатрат и расхода реактивов (ингредиентов).The technical result of the claimed invention is a highly specific, simple, biologically less dangerous, fast and highly efficient detection of cholera toxin in the culture medium. In addition, the claimed invention allows to reduce the analysis time for the detection of cholera toxin, which is especially important in urgent situations. The economic effect of using the claimed invention is to reduce the cost of analysis by reducing labor costs and consumption of reagents (ingredients).
Указанный технический результат достигается тест-системой, которая представляет собой комплект содержащий дипстики; навеску среды AKI; коньюгат моноклональных антител, специфичных к В-субъединице холерного токсина изотипа G1 с пероксидазой хрена; реагенты для разведения конъюгата (глицерин, лактальбумин, Tween); реагенты для приготовления субстратной смеси (кислота лимонная, натрия цитрат, 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), мочевина пероксид).The specified technical result is achieved by a test system, which is a set containing dipsticks; hinge of the AKI medium; a conjugate of monoclonal antibodies specific to the B-subunit of cholera toxin isotype G1 with horseradish peroxidase; conjugate dilution reagents (glycerol, lactalbumin, Tween); reagents for the preparation of substrate mixture (citric acid, sodium citrate, 2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), urea peroxide).
Дипстики, входящие в тест-систему, представляют собой полоски пластика или другого материала, устойчивого к водным растворам солей, с фиксированными на них фрагментами мембраны, имеющими участок, сенсибилизированный специфическими к холерному токсину моноклональными антителами и холерным токсином (положительный контроль).Dipsticks included in the test system are strips of plastic or other material resistant to aqueous salt solutions, with membrane fragments fixed on them, having a site sensitized by cholera toxin-specific monoclonal antibodies and cholera toxin (positive control).
На дипстике дополнительно иммобилизован внутренний положительный контроль реакции, представленный холерным токсином.An internal positive control of the reaction represented by cholera toxin is additionally immobilized on the dipstick.
Приготовление дипстика заявляемой тест-системы состоит из нескольких этапов:The preparation of a dipstick of the claimed test system consists of several stages:
1. На полоске пластика (изготовленной, например, из синтетической бумаги «Polylith» марки GH-1 с плотностью 340 г/м2) размером 70×5 мм специальным клеем фиксируется полоска нитроцеллюлозной мембраны с сеткой с размером пор 0,2-0,45 мкм., как показано на фиг. 1.1. A strip of nitrocellulose membrane with a mesh with a pore size of 0.2-0 is fixed on a strip of plastic (made, for example, from synthetic paper "Polylith" GH-1 with a density of 340 g / m 2 ) measuring 70 × 5 mm with a special glue, 45 µm as shown in FIG. one.
2. На дипстик (в отдельный квадратик) наносятся связывающие моноклональные антитела к холерному токсину (МКАХТ) 2Е5 (получены в ФКУЗ «РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора. Патент №2583306 опубл. 10.05.2016 г. бюл. №13) в объеме 1-2 мкл. Концентрация МКАХТ составляет 15-25 мкг/мл.2. On the dipstick (in a separate square) are applied binding monoclonal antibodies to cholera toxin (MCAHT) 2E5 (obtained in the Federal State Institution of Healthcare of the Russian Federation “Microb” of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Wellbeing. Patent No. 2583306 publ. 10.05.2016, bul. No. 13) 2 μl. The concentration of MCAHT is 15-25 μg / ml.
3. В другой отдельный квадратик наносится раствор холерного токсина (получен в ФКУЗ «РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора) в объеме 1-2 мкл. Концентрация холерного токсина составляет 40-80 мкг/мл. Холерный токсин выступает в роли внутреннего контроля тест-системы и положительного контроля.3. In another separate square, a solution of cholera toxin is applied (obtained from the Federal State Institution "RosNIPCHI" Microbe "of Rospotrebnadzor) in a volume of 1-2 µl. The concentration of cholera toxin is 40-80 μg / ml. Cholera toxin acts as an internal control of the test system and a positive control.
В качестве отрицательного контроля выступает вся остальная поверхность мембраны, фиксированной на дипстике.The rest of the membrane surface, fixed on the dipstick, acts as a negative control.
Схема нанесения МКАХТ и холерного токсина представлена на фиг. 2, гдеThe scheme for applying MCAHT and cholera toxin is shown in Fig. 2, where
- «А» - рукоятка дипстика;- "A" - dipstick handle;
Рабочая зона дипстика:Dipstick working area:
- «Зона 1» - зона нанесения холерного токсина (внутренний положительный контроль);- "
- «Зона 2» - зона нанесения моноклональных антител к холерному токсину.- "
4. После нанесения МКАХТ и холерного токсина дипстик высушивается в течении 30 минут при температуре 37°С.4. After application of MCAFT and cholera toxin, the dipstick is dried for 30 minutes at 37 ° C.
5. Свободные участки связывания в рабочей зоне дипстика блокируются путем погружения в раствор для блокировки (1-2% раствор Бычьего сывороточного альбумина (БСА), содержащего 0,05% раствора твина) в течение 1-2 часов при комнатной температуре.5. Free binding sites in the working area of the dipstick are blocked by immersion in the blocking solution (1-2% Bovine Serum Albumin (BSA) solution containing 0.05% Tween solution) for 1-2 hours at room temperature.
6. Дипстик промывают в фосфатно-солевом буфере с рН-7,2 путем ополаскивания рабочей зоны, высушивают при комнатной температуре и хранят до использования.6. The dipstick is washed in phosphate-buffered saline with pH-7.2 by rinsing the working area, dried at room temperature and stored until use.
Оценка результатов исследования на дипстиках.Evaluation of research results on dipsticks.
Правила учета результатов анализа, с использованием описанных дипстиков, приведены в таблице 1.The rules for accounting for the analysis results using the described dipsticks are given in Table 1.
Внешний вид дипстиков после проведения анализа направленного на выявление холерного токсина в среде культивирования представлен на фиг. 3 и фиг. 4.The appearance of the dipsticks after analysis aimed at detecting cholera toxin in the culture medium is shown in FIG. 3 and FIG. 4.
На фиг. 3 представлены дипстики с положительным результатом анализа на наличие холерного токсина в среде культивирования с использованием разного объема среды AKI по полной и сокращенной схемам. Использованы токсигенные штаммы V.cholerae. Дипстики 1, 4, 10 при проведении анализа по схеме из примера 1; дипстики 2, 5, 7 - из примера 2; дипстики 3, 8, 11 - из примера 3; дипстики 6, 9, 12 - из примера 4.FIG. 3 shows dipsticks with a positive test result for the presence of cholera toxin in the cultivation medium using different volumes of AKI medium according to the complete and reduced schemes. We used toxigenic V. cholerae strains.
Верхнее пятно - положительный внутренний контроль, свидетельствующий о правильности работы тест-системы.The upper spot is a positive internal control, indicating that the test system is working correctly.
Наличие нижнего пятна, свидетельствует о наличии холерного токсина в среде культивирования (в концентрации не менее 2 нг/мл), т.е. о способности исследуемого штамма к продукции холерного токсина (Правила учета результатов приведены в таблице 1).The presence of the lower spot indicates the presence of cholera toxin in the cultivation medium (at a concentration of at least 2 ng / ml), i.e. about the ability of the investigated strain to produce cholera toxin (The rules for recording the results are given in Table 1).
На фиг. 4. пример дипстика с отрицательным результатом на холерный токсин. Использован нетоксигенный штамм V.cholerae КМ-26. Выражено только верхнее пятно положительного внутреннего контроля (в соответствии с правилами, приведенными в таблице 1).FIG. 4. An example of a dipstick with a negative result for cholera toxin. The nontoxigenic V. cholerae KM-26 strain was used. Only the top spot of positive internal control was expressed (in accordance with the rules given in Table 1).
Применение заявляемой тест-системы осуществляется в соответствии со схемой:The application of the claimed test system is carried out in accordance with the scheme:
- Этап А) Первичное подращивание агаровой культуры исследуемого штамма в среде AKI, разлитой по 10 мл в стеклянные пробирки, в течение 2,5 часов при температуре 37°С.- Stage A) Primary growing of the agar culture of the investigated strain in AKI medium, poured 10 ml into glass tubes, for 2.5 hours at 37 ° C.
- Этап Б) Вторичное подращивание. Осуществляют путем посева 0,2-1 мл исследуемой культуры из среды AKI после первичного подращивания в 1-5 мл среды AKI и инкубация посевов при 37° 16 часов. Варианты выполнения вторичного подращивания указаны в конкретных примерах выполнения анализа.- Stage B) Secondary rearing. It is carried out by sowing 0.2-1 ml of the test culture from the AKI medium after primary growth in 1-5 ml of the AKI medium and incubating the crops at 37 ° for 16 hours. The options for performing the secondary rearing are indicated in the specific analysis examples.
- Этап В) Собственно выявление холерного токсина,- Stage B) The actual identification of cholera toxin,
п. 1. Обработка дипстика в бульонной культуре.p. 1. Processing of dipsticks in broth culture.
п. 2. Обработка дипстика конъюгатом МКХТ с пероксидазой хрена.p. 2. Treatment of a dipstick with a conjugate of MKHT with horseradish peroxidase.
п. 3. Обработка дипстика в субстрате,p. 3. Processing the dipstick in the substrate,
п. 4. Учет результатов анализаp. 4. Consideration of analysis results
Возможно сокращение схемы исследования за счет совмещения этапов «Б» и «В п. 1». Сокращенная схема исследования:It is possible to reduce the research scheme by combining stages "B" and "C p. 1". Abbreviated study design:
- Этап А.- Stage A.
- Этап Б и этап В, п. 1. При этом сразу после посева в пробирку помещали подготовленный дипстик и инкубацию посевов осуществляли вместе с ним. Это позволяет сократить весь цикл анализа на 45 минут (по сравнению с полной схемой).- Stage B and stage C, p. 1. In this case, immediately after inoculation, a prepared dipstick was placed in a test tube, and the incubation of the inoculations was carried out with it. This allows the entire analysis cycle to be shortened by 45 minutes (compared to the complete scheme).
- Этап В, пп. 2, 3, 4.- Stage B, p. 2, 3, 4.
Возможность осуществления заявляемого изобретения поясняется следующими примерами.The possibility of implementing the claimed invention is illustrated by the following examples.
Пример 1.Example 1.
Использование тест-системы для выявления холерного токсина в среде культивирования микроба. Исследование по полной схеме.Use of a test system for detecting cholera toxin in the culture medium of the microbe. Study according to the complete scheme.
Этап А) Первичное подращивание исследуемого штамма осуществляли путем посева агаровой культуры (1/2 бактериологической петли №2) в 10 мл среды AKI с последующей инкубацией при 37°С 2,5 часа.Stage A) Primary rearing of the investigated strain was carried out by inoculating agar culture (1/2 bacteriological loop No. 2) in 10 ml of AKI medium, followed by incubation at 37 ° C for 2.5 hours.
Этап Б) Вторичное подращивание осуществляли путем пересева 1 мл подращенной культуры в центрифужную пробирку с 5 мл AKI (объем пробирки - 15 мл). Пробирку располагали в термостате наклонном положении (без касания жидкости крышки пробирки). Посев инкубировали при 37°С в течение 16 часов.Stage B) Secondary rearing was carried out by subculting 1 ml of the grown culture into a centrifuge tube with 5 ml of AKI (tube volume - 15 ml). The test tube was placed in an incubator in an inclined position (without touching the liquid to the tube lid). The inoculation was incubated at 37 ° C for 16 hours.
Этап В) После вторичного подращивания готовые дипстики (удерживая за рукоятку) погружали в бульонную культуру таким образом, чтобы в кулыуральную среду была погружена только рабочая зона, с дальнейшей инкубацией при комнатной температуре 45 мин. Здесь и далее дипстик удерживается за рукоятку.Stage B) After the secondary growth, the finished dipsticks (holding the handle) were immersed in the broth culture so that only the working zone was immersed in the culyural medium, with further incubation at room temperature for 45 minutes. Hereinafter, the dipstick is held by the handle.
Затем дипстик промывали в фосфатно-солевом буфере рН 7,2 путем ополаскивания.Then the dipstick was washed in phosphate-buffered saline pH 7.2 by rinsing.
Дипстик помещали в раствор конъюгата МКАХТ с пероксидазой хрена на 45 минут. Дипстик промывали в фосфатно-солевом буфере рН 7,2 путем ополаскивания.The dipstick was placed in a solution of the MCAHT conjugate with horseradish peroxidase for 45 minutes. The dipstick was washed in phosphate-buffered saline pH 7.2 by rinsing.
Затем дипстик помещали в раствор субстрата (приготовлен ex tempore) до появления цветных пятен в рабочей зоне, что происходит через 3-5 минут. Дипстик промывается путем ополаскивания и высушивается. Учет результата возможен до высушивания.Then the dipstick was placed in a substrate solution (prepared ex tempore) until colored spots appeared in the working area, which occurs after 3-5 minutes. The dipstick is rinsed and dried. The result can be taken into account before drying.
При необходимости длительного хранения результата исследования или их денситометрической обработки возможно фотографирование дипстика.If a long-term storage of the test result or their densitometric processing is required, photographing of the dipstick is possible.
Пример 2.Example 2.
Использование тест-системы для выявления холерного токсина в среде культивирования микроба с совмещение этапов «Б» и «В п. 1». Исследование по сокращенной схеме.The use of a test system for detecting cholera toxin in the culture medium of the microbe with the combination of stages "B" and "C p. 1". Study on an abbreviated scheme.
Этап А) Первичное подращивание осуществляли как в примере 1.Stage A) Primary rearing was carried out as in example 1.
Этав Б и этап В п. 1) Вторичное подращивание осуществляли, как и в примере 1, но сразу после посева в пробирку помещали подготовленный дипстик и инкубацию посевов осуществляли вместе с ним. Это позволяет сократить весь цикл анализа на 45 минут (по сравнению с примером 1).Etav B and stage C, item 1) Secondary rearing was carried out as in example 1, but immediately after inoculation, a prepared dipstick was placed in a test tube and the incubation of the cultures was carried out with it. This reduces the entire analysis cycle by 45 minutes (compared to example 1).
Этап В, пп. 2-4) После культивирования дипстик промывали в фосфатно-солевом буфере рН 7,2 путем ополаскивания. И все дальнейшие манипуляции проводили как в примере 1.Stage B, p. 2-4) After culturing, the dipstick was washed in phosphate-buffered saline pH 7.2 by rinsing. And all further manipulations were carried out as in example 1.
Пример 3.Example 3.
Использование тест-системы для выявления холерного токсина в среде культивирования микроба со средним количеством использованной среды AKI (2 мл) для вторичного подращивания, средним количеством посевного материала, взятого после первичного подращивания и с совмещение этапов «Б» и «В п. 1». Исследование по сокращенной схеме.Use of a test system for detecting cholera toxin in a microbe cultivation medium with an average amount of used AKI medium (2 ml) for secondary rearing, an average amount of inoculum taken after primary rearing and with the combination of stages "B" and "C p. 1". Study on an abbreviated scheme.
Этап А) Первичное подращивание осуществляли как в примере 1.Stage A) Primary rearing was carried out as in example 1.
Этап Б и этап В п. 1) Вторичное подращивание осуществляли как в примере 2, но для пересева брали 0,4 мл первично подращенной культуры, которую засевали в центрифужную пробирку с 2 мл AKI (объем пробирки - 5 мл). Так же как и в примере 2, сразу после посева в пробирку помещали подготовленный дипстик и инкубацию посевов осуществляли вместе с ним. Пробирку располагали в термостате наклонном положении (без касания жидкости крышки пробирки). Посев инкубировали при 37°С в течение 16 часов. Весь цикл анализа короче на 45 минут по сравнению с примером 1.Stage B and stage C of item 1) Secondary growing was carried out as in example 2, but for reseeding 0.4 ml of the first grown culture was taken, which was inoculated into a centrifuge tube with 2 ml AKI (tube volume - 5 ml). As in example 2, immediately after inoculation, a prepared dipstick was placed in a test tube, and the incubation of the inoculations was carried out with it. The test tube was placed in an incubator in an inclined position (without touching the liquid to the tube lid). The inoculation was incubated at 37 ° C for 16 hours. The entire analysis cycle is shorter by 45 minutes compared to example 1.
Этап В, пп. 2-4) После культивирования дипстик промывали в фосфатно-солевом буфере рН 7,2 путем ополаскивания. И все дальнейшие манипуляции проводили как в примере 1.Stage B, p. 2-4) After culturing, the dipstick was washed in phosphate-buffered saline pH 7.2 by rinsing. And all further manipulations were carried out as in example 1.
Пример 4.Example 4.
Использование тест-системы для выявления холерного токсина в среде культивирования микроба с минимальным количеством использованной среды АК1(1 мл) для вторичного подращивания, минимальным количеством посевного материала, взятого после первичного подращивания и с совмещением этапов «Б» и «В п. 1». Исследование по сокращенной схеме.Use of a test system for detecting cholera toxin in a microbe cultivation medium with a minimum amount of AK1 medium used (1 ml) for secondary rearing, a minimum amount of inoculum taken after primary rearing and with the combination of stages "B" and "C p. 1". Study on an abbreviated scheme.
Этап А) Первичное подращивание осуществляли как в примере 1.Stage A) Primary rearing was carried out as in example 1.
Этап Б и этап В п. 1) Вторичное подращивание осуществляли как в примере 2, но для пересева брали 0,2 мл первично подращенной культуры, которую засевали в центрифужную пробирку с 1 мл AKI (объем пробирки - 2 мл). Так же как и в примере 2, сразу после посева в пробирку помещали подготовленный дипстик и инкубацию посевов осуществляли вместе с ним. Пробирку располагали в термостате в наклонном положении (без касания жидкости крышки пробирки). Посев инкубировали при 37°С в течение 16 часов. Весь цикл анализа короче на 45 минут по сравнению с примером 1.Stage B and stage C of item 1) Secondary growing was carried out as in example 2, but 0.2 ml of the first grown culture was taken for reseeding, which was inoculated into a centrifuge tube with 1 ml of AKI (tube volume - 2 ml). As in example 2, immediately after inoculation, a prepared dipstick was placed in a test tube, and the incubation of the inoculations was carried out with it. The tube was placed in an incubator in an inclined position (without touching the liquid on the tube lid). The inoculation was incubated at 37 ° C for 16 hours. The entire analysis cycle is shorter by 45 minutes compared to example 1.
Этап В, пп. 2-4) После культивирования дипстик промывали в фосфатно-солевом буфере рН 7,2 путем ополаскивания. И все дальнейшие манипуляции проводили как в примере 1.Stage B, p. 2-4) After culturing, the dipstick was washed in phosphate-buffered saline pH 7.2 by rinsing. And all further manipulations were carried out as in example 1.
Пример 5.Example 5.
Сравнение эффективности анализа с использованием дипстиков и классического ИФА на иммунологических планшетах.Comparison of the efficiency of the assay using dipsticks and classical ELISA on immunological plates.
Все этапы исследования проводят, как описано в примерах 1 или 2-4. При этом проведение анализа с объединением этапов Б и В п. 1 (примеры 2-4) не влияет на качество результатов исследования, но влияет на время полного исследования (этапы А-В), которое сокращается на 45 минут.All stages of the study are carried out as described in examples 1 or 2-4. At the same time, the analysis with the combination of stages B and C in clause 1 (examples 2-4) does not affect the quality of the research results, but affects the time of the complete study (stages A-C), which is reduced by 45 minutes.
Результат сравнения классического ИФА и анализа на дипстиках приведен в таблице 2, из которой видно, что заявляемая тест-система по чувствительности и специфичности не уступает методу ИФА, но позволяет сократить время исследования за счет сокращения последнего этапа в 1,8 раза, что достигается путем совмещения вторичного подращивания (этап Б) с обработкой дипстика в бульонной культуре (этап В, п. 1).The result of comparison of classical ELISA and dipstick analysis is shown in Table 2, from which it can be seen that the claimed test system in sensitivity and specificity is not inferior to the ELISA method, but it allows to reduce the study time by reducing the last stage by 1.8 times, which is achieved by combining the secondary rearing (stage B) with the processing of dipstick in broth culture (stage C, p. 1).
Литература.Literature.
1. Detection of Cholera Toxin: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. - Atlanta, JA, 1994. - P. 62-88.1. Detection of Cholera Toxin: Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. - Atlanta, JA, 1994. - P. 62-88.
2. Almeida RJ, Hickman-Brenner FW, Sowers EG, Puhr ND, Farmer JJ III, Wachsmuth IK. Comparison of a latex agglutination assay and an enzyme-linked immunosorbent assay for detecting cholera toxin. J Clin Microbiol 1990;28:128-30.2. Almeida RJ, Hickman-Brenner FW, Sowers EG, Puhr ND, Farmer JJ III, Wachsmuth IK. Comparison of a latex agglutination assay and an enzyme-linked immunosorbent assay for detecting cholera toxin. J Clin Microbiol 1990; 28: 128-30.
3. Патент РФ 2199750. Способ получения диагностикума суспензионного антигенного на основе фракции 1. / Зайцев А.А. - Опубликовано 27.02.2003.3. RF patent 2199750. A method of obtaining a suspension antigenic diagnosticum based on
4. Патент РФ 2298798. Способ контроля биологической пробы в реакции латекс-агглютинации и аналитическая система осуществления./ Зимина Т.М. с соавт. - Опубликовано 10.05.2007.4. RF patent 2298798. Method for monitoring a biological sample in the reaction of latex agglutination and analytical implementation system. / Zimina TM. et al. - Published on May 10, 2007.
5. Патент РФ 2231366. Иммунодиагностикум на основе полистирольного латекса./ Леонова В.Б., Розенфельд М.А. - Опубликован 27.06.2004.5. RF patent 2231366. Immunodiagnosticum based on polystyrene latex./ Leonova VB, Rosenfeld MA - Published on June 27, 2004.
6. Вершигора А.Е. Общая иммунология //Киев «Выща школа». - 1990. - 736 с. 6. Vershigora A.E. General immunology // Kiev "High school". - 1990 .-- 736 p.
7. Eiki Yamasaki, Ryuta Sakamoto, Takashi Matsumoto, Fumiki Morimatsu, Takayuki Kurazono, Toyoko Hiroi, G. Balakrish Nair, and Hisao Kurazono. Development of an Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cholera Toxin // BioMed Research International. Volume 2013, Article ID 679038, 7 pages http://dx.doi.Org/10.1155/2013/679038.7. Eiki Yamasaki, Ryuta Sakamoto, Takashi Matsumoto, Fumiki Morimatsu, Takayuki Kurazono, Toyoko Hiroi, G. Balakrish Nair, and Hisao Kurazono. Development of an Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cholera Toxin // BioMed Research International. Volume 2013,
8. Петрова, Е.Э. Получение и характеристика моноклональных антител к холерному токсину / Е.Э. Петрова, Р.Л. Комалева, О.Е. Лахтина и др. // Биоорганическая химия. - 2009. - Т. 35, №3. - С. 357-367.8. Petrova, E.E. Obtaining and characterization of monoclonal antibodies to cholera toxin / E.E. Petrova, R.L. Komaleva, O.E. Lakhtina et al. // Bioorganic chemistry. - 2009. - T. 35, No. 3. - S. 357-367.
9. Патент RU 2611359. Способ и набор для определения продукции холерного токсина и дифференциации эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов классического и эльтор биоваров / Михеева Е.А. с соавт. - Опубликовано - 21.02.2017.9. Patent RU 2611359. Method and kit for determining the production of cholera toxin and differentiation of epidemically significant strains of classical Vibrio cholerae and Eltor biovar / Mikheeva E.A. et al. - Published on February 21, 2017.
10. Тест-система иммуноферментная для определения продукции холерного токсина штаммами Vibrio cholerae (ИФАХолХТ-М) по ТУ 9388-052-01898109-2015. Регистрационное удостоверение на медицинское изделие от 15 ноября 2016 года №РЗН 2016/5013.10. Immunoassay test system for determining the production of cholera toxin by Vibrio cholerae strains (IFAHolKhT-M) according to TU 9388-052-01898109-2015. Registration certificate for a medical device dated November 15, 2016 No. RZN 2016/5013.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020106784A RU2737776C1 (en) | 2020-02-12 | 2020-02-12 | Test kit for detecting cholera toxin in cultivation medium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020106784A RU2737776C1 (en) | 2020-02-12 | 2020-02-12 | Test kit for detecting cholera toxin in cultivation medium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2737776C1 true RU2737776C1 (en) | 2020-12-02 |
Family
ID=73792795
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020106784A RU2737776C1 (en) | 2020-02-12 | 2020-02-12 | Test kit for detecting cholera toxin in cultivation medium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2737776C1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997023773A1 (en) * | 1995-12-22 | 1997-07-03 | Universal Healthwatch, Inc. | Device for collecting and testing samples |
| US20130267433A1 (en) * | 2012-04-10 | 2013-10-10 | Postech Academy-Industry Foundation | Carbohydrate Chip for Detection of Pathogen Vibrio Cholerae and Method of Preparing the Same |
| CN102375059B (en) * | 2010-08-19 | 2015-01-14 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | Cholera detecting method |
| RU2611359C1 (en) * | 2016-03-15 | 2017-02-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Method and set for determination of cholera toxin production and differentiation of epidemiologically significant strains of cholera vibrios of classical and el tor biovars |
| RU2703282C1 (en) * | 2019-01-10 | 2019-10-16 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for producing a diagnosticum for detecting a toxin of a cholera vibrio recovered from environmental objects |
-
2020
- 2020-02-12 RU RU2020106784A patent/RU2737776C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997023773A1 (en) * | 1995-12-22 | 1997-07-03 | Universal Healthwatch, Inc. | Device for collecting and testing samples |
| CN102375059B (en) * | 2010-08-19 | 2015-01-14 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | Cholera detecting method |
| US20130267433A1 (en) * | 2012-04-10 | 2013-10-10 | Postech Academy-Industry Foundation | Carbohydrate Chip for Detection of Pathogen Vibrio Cholerae and Method of Preparing the Same |
| RU2611359C1 (en) * | 2016-03-15 | 2017-02-21 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ("РосНИПЧИ "Микроб") | Method and set for determination of cholera toxin production and differentiation of epidemiologically significant strains of cholera vibrios of classical and el tor biovars |
| RU2703282C1 (en) * | 2019-01-10 | 2019-10-16 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for producing a diagnosticum for detecting a toxin of a cholera vibrio recovered from environmental objects |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4497900A (en) | Immunoassay for Neisseria gonorrhoeae antigens | |
| CN101925819B (en) | Immunodetection assay for mycobacterium tuberculosis complex | |
| CN104628833B (en) | A kind of tuberculosis infection cellular immunization detectable antigens composition and application thereof | |
| CN109030823B (en) | Colloidal gold test strip for detecting ralstonia solanacearum and preparation method and application thereof | |
| CN110646614B (en) | ELISA kit and test method for IBDV antibody and effective antibody titer determination method | |
| Manocha et al. | Frequency of leptospirosis in patients of acute febrile illness in Uttar Pradesh | |
| JP2018526625A (en) | Method for evaluating cell surface receptors of blood cells | |
| RU2737776C1 (en) | Test kit for detecting cholera toxin in cultivation medium | |
| EP0150567B1 (en) | Process for detecting beta-hemolytic streptococcus antigens | |
| US20230160887A1 (en) | Flow Cytometry System and Methods for the Diagnosis of Infectious Disease | |
| Stamm et al. | A cellulose acetate membrane precipitin (CAP) test for amoebiasis | |
| Cox | Salmonella methodology update | |
| US20040132211A1 (en) | Isolation and confirmation of analytes from test devices | |
| CN1098460C (en) | Detection of antibody production | |
| US4814269A (en) | Diagnostic testing for antibodies against microorganisms | |
| CN104628834B (en) | A kind of tuberculosis infection T cell immunodetection antigen and application thereof | |
| EP0532737A1 (en) | Assay device and method of detecting chitin | |
| CN115166239A (en) | Integrated antibody detection test strip for primary screening and accurate diagnosis of bovine brucellosis | |
| US4677080A (en) | Rapid particle agglutination test for enterotoxigenic bacteria | |
| RU2611359C1 (en) | Method and set for determination of cholera toxin production and differentiation of epidemiologically significant strains of cholera vibrios of classical and el tor biovars | |
| RU2703282C1 (en) | Method for producing a diagnosticum for detecting a toxin of a cholera vibrio recovered from environmental objects | |
| KR101503830B1 (en) | Bio sensing method using animal cell and bio kit for diagnosis of infection using animal cell | |
| RU2769578C1 (en) | Method for producing a fluorescent immunoglobulin diagnostic agent for detecting pathogens of rickettsioses and coxielloses, fluorescent immunoglobulin diagnostic agent and application thereof | |
| Parratt et al. | A fluorescent antibody test in the diagnosis of farmer's lung | |
| US20080032315A1 (en) | Method and Kit for Determining the Immunisation Status of a Person |