RU2238565C1 - Method for predicting ovine and caprine variola due to histochemical immunoenzymatic assay based upon monoclonal antibodies - Google Patents

Abstract

FIELD: veterinary virology.

SUBSTANCE: the suggested method deals with histochemical immunoenzymatic assay by applying peroxidase conjugate based upon monoclonal antibodies of 010.2 clone. Antibodies of this clone are of specificity to antigenic determinants of polypeptides of 36-40 kD molecular weight in ovine and caprine variola viruses. Moreover, detection of antigens of ovine and caprine variola viruses takes place in cytoplasms of infected cells either of primary or passage cell culture of ovine origin. The suggested method is more simplified, sensitive, specific, it provides reliable detection of antigens of ovine and caprine variola viruses and differentiate them against disease agents with clinically similar picture. This method could be applied at research institutes and veterinary laboratories.

EFFECT: higher accuracy of diagnostics.

1 ex, 1 tbl

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и оспы коз путем выявления специфических антигенов вышеуказанных возбудителей в цитоплазме инфицированных культур клеток гистохимическим иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.The invention relates to the field of veterinary virology, in particular to a method for the diagnosis of sheep pox and goat pox by identifying specific antigens of the above pathogens in the cytoplasm of infected cell cultures by histochemical immunoassay analysis based on monoclonal antibodies, and can be used in research institutes and veterinary laboratories.

Одним из условий постановки достоверного диагноза при различных инфекционных вирусных болезнях, в том числе и при оспе овец и оспе коз, является выделение возбудителя с использованием чувствительных биологических систем - восприимчивых животных или пермиссивных линии первичных и перевиваемых культур клеток с последующей идентификацией вирусспецифических антигенов в различных серологических реакциях.One of the conditions for making a reliable diagnosis for various infectious viral diseases, including sheep pox and goat pox, is the isolation of a pathogen using sensitive biological systems - susceptible animals or permissive lines of primary and transplanted cell cultures with subsequent identification of virus-specific antigens in various serological reactions.

Принимая во внимание тот факт, что при выделении вирусов идет постепенная адаптация возбудителей к используемой биологической системе, вследствие чего на первых пассажах отмечается минимальное накопление вируса, для ранней диагностики требуется использование более чувствительных методов. Такими методами, позволяющими обнаруживать антигены вирусов оспы овец и оспы коз в цитоплазме инфицированных клеток и используемыми при диагностике оспы овец и оспы коз, являются реакция прямой иммунофлюоресценции, реакция непрямой иммунофлюоресценции и иммуногистохимический метод иммуноферментного анализа.Taking into account the fact that pathogens are gradually adapted to the used biological system during virus isolation, as a result of which the virus accumulation is minimal in the first passages, the use of more sensitive methods is required for early diagnosis. The direct immunofluorescence reaction, the indirect immunofluorescence reaction and the immunohistochemical enzyme-linked immunosorbent assay are such methods that detect the antigens of sheep pox and goat pox viruses in the cytoplasm of infected cells and are used in the diagnosis of sheep pox and goat pox.

Реакция как прямой, так и непрямой иммунофлюорерценции (Sarkar Р., Singh S.P., Pandey A.K., Kathuria В.К., Kumar S. Application of fluorescent antibody test in the diagnosis of sheep-pox, and study of sheep-pox virus multiplication in cell-culture. // Indian. J. Anim. Sci. - 1980. - V. 50 - №5. - P.428-433; OIE Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. - 1996. - P.119-127) предусматривает использование тест-препаратов, представляющих собой фиксированные ацетоном мазки-отпечатки из отечной жидкости оспин. Для детекции антигенов вирусов оспы овец используют иммуноглобулины, выделенные из гипериммунной сыворотки, либо конъюгированные с флюорисцин-изотиоцианатом для реакции прямой иммунофлюорисценции, либо выделенные иммуноглобулины из гипериммунной сыворотки с последующим обнаружением иммунных комплексов с помощью антивидового (анти-овечьего) флюорисцин-изотиоцианатного конъюгата в случае реакции непрямой иммунофлюорисценции.The reaction of both direct and indirect immunofluorescence (Sarkar R., Singh SP, Pandey AK, Kathuria V.K., Kumar S. Application of fluorescent antibody test in the diagnosis of sheep-pox, and study of sheep-pox virus multiplication in cell-culture. // Indian. J. Anim. Sci. - 1980. - V. 50 - No. 5. - P.428-433; OIE Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. - 1996. - P.119- 127) provides for the use of test preparations, which are acetone-fixed smear smears from the edematous edema of smallpox. For the detection of sheep pox virus antigens, immunoglobulins isolated from hyperimmune serum are used, either conjugated to fluoriscin-isothiocyanate for direct immunofluorescence reactions or isolated immunoglobulins from hyperimmune serum, followed by the detection of immune complexes using an antiviral (anti-conjugate) form indirect immunofluorescence reactions.

Недостатками данных методов является необходимость использования люминесцентного микроскопа для учета результатов реакции и недостаточная специфичность вследствие использования специфических иммуноглобулинов, выделенных из поликлональных гипериммуиных сывороток, для детекции иммунных комплексов.The disadvantages of these methods are the need to use a luminescent microscope to take into account the results of the reaction and insufficient specificity due to the use of specific immunoglobulins isolated from polyclonal hyperimmune sera for the detection of immune complexes.

Принципиально иной метод - метод иммуногистохимического иммуноферментного анализа - для диагностики оспы овец был предложен Gulbahara M.Y. et al. (Gulbahara M.Y., Calabar M., Gul Y., Icen H. Immunohistochemical detection of antigen in lamb tissues naturally infected with sheep-pox virus // J. Vet. Med. B. - 2000. - V. 47. - №3. - P.173-181).A fundamentally different method - the method of immunohistochemical enzyme immunoassay for the diagnosis of sheep pox, was proposed by Gulbahara M.Y. et al. (Gulbahara MY, Calabar M., Gul Y., Icen H. Immunohistochemical detection of antigen in lamb tissues naturally infected with sheep -ox virus // J. Vet. Med. B. - 2000. - V. 47. - No. 3 . - P.173-181).

Суть метода состоит в том, что обнаружение антигенов вирусов оспы овец, находящихся в цитоплазме клеток органов и тканей овец, пораженных оспой, проводят непосредственно в отобранных образцах. Для этого пораженные оспой органы и ткани овец фиксируют формалином и готовят парафиновые блоки. После приготовления срезов из тканей и органов и их депарафинизации проводят детекцию антигенов. С этой целью вначале на поверхность среза наносятся специфические к антигенам вируса оспы овец иммуноглобулины, выделенные из гипериммунной сыворотки кролика. Затем для усиления положительного сигнала на поверхность среза наносятся биотинилированные анти-кроличьи антитела. Детекцию образовавшегося комплекса антиген - специфическое антитело - биотинилированные анти-кроличьи антитела проводят стрептавидиновым пероксидазным конъюгатом.The essence of the method is that the detection of sheep smallpox virus antigens located in the cytoplasm of cells of organs and tissues of sheep affected by smallpox is carried out directly in the selected samples. For this, the organs and tissues of sheep affected by smallpox are fixed with formalin and paraffin blocks are prepared. After preparation of sections from tissues and organs and their dewaxing, antigens are detected. For this purpose, first immunoglobulins specific for sheep pox virus antigens, isolated from rabbit hyperimmune serum, are applied to the section surface. Then, to enhance the positive signal, biotinylated anti-rabbit antibodies are applied to the cut surface. Detection of the resulting antigen-specific antibody-biotinylated anti-rabbit antibody complex is carried out with streptavidin peroxidase conjugate.

Данный метод наряду с положительными сторонами - экспрессность и относительная простота постановки реакции - имеет и ряд недостатков. К ним относятся применение поликлональных иммуноглобулинов, выделенных из гипериммунных сывороток, которые вступают в перекрестные реакции с антигенами вируса контагиозного пустулезного дерматита овец и коз и могут быть причинами фонового неспецифического окрашивания, вследствие применения низкоочищенных антигенов при получении гипериммунных сывороток. Данные причины приводят к снижению диагностической ценности метода, однако устранить их возможно, используя моноклональные антитела, обладающие специфичностью к антигенным детерминантам вирусов оспы овец и коз. Способ получения пригодных для этих целей моноклональных антител и их характеристика описаны ранее (Машнин А.В.,

, Стрижаков А.А., Стрижакова О.М., Новикова М.Б., Середа А.Д. Разработка средств диагностики оспы овец на основе моноклональных антител // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных. Сб. статей Междунар. научно-практич. конфер. – Покров. - 2000. - С.141-143).This method, along with the positive aspects - expressivity and relative simplicity of the reaction formulation - has several disadvantages. These include the use of polyclonal immunoglobulins isolated from hyperimmune sera that cross-react with the antigens of the contagious papular dermatitis virus of sheep and goats and can be the causes of non-specific background staining due to the use of low-purified antigens in the preparation of hyperimmune sera. These reasons lead to a decrease in the diagnostic value of the method, but they can be eliminated using monoclonal antibodies that are specific for the antigenic determinants of sheep and goat smallpox viruses. The method of obtaining monoclonal antibodies suitable for these purposes and their characteristics are described previously (A. Mashnin,

, Strizhakov A.A., Strizhakova O.M., Novikova M.B., Sereda A.D. Development of diagnostic tools for sheep pox based on monoclonal antibodies // Diagnostics, prevention and control measures for especially dangerous, exotic and zooanthroponic animal diseases. Sat Articles Intern. scientific and practical confer. - Veil. - 2000. - S.141-143).

Целью настоящего изобретения является разработка способа диагностики оспы овец и оспы коз гистохимическим иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител.The aim of the present invention is to develop a method for the diagnosis of sheep pox and goat pox by histochemical enzyme-linked immunosorbent assay based on monoclonal antibodies.

Указанная цель достигается тем, что обнаружение, антигенов вирусов оспы овец и оспы коз осуществляется гистохимическим иммуноферментным анализом, предусматривающим использование пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител клона 010.2, обладающих специфичностью к антигенным детерминантам полипептидов молекулярной массы 36-40 кД вирусов оспы овец и оспы коз.This goal is achieved by the fact that the detection of sheep pox and goat pox viruses antigens is carried out by enzyme-linked immunosorbent assay, using a peroxidase conjugate based on monoclonal antibodies of clone 010.2, which are specific for the antigenic determinants of the polypeptides of the molecular weight of 36-40 kD sheeppox and smallpox viruses.

Пример конкретного выполненияConcrete example

При постановке гистохимического иммуноферментного анализа готовили тест-препараты. Для этого к монослойным первично-трипсинизированной культуре клеток тестикул ягненка (ТЯ) и перевиваемой культуры клеток почки овцы (ПО), выращенным на покровных стеклах в пробирках, после удаления культуральной среды и трехкратного омовения монослоя средой для культивирования без сыворотки добавляли осветленные суспензии двукратных разведении контрольных культуральных (нормального и специфического) и исследуемых органотканевых антигенов. Контакт клеток с исследуемыми материалами осуществляли в течение 1 ч при 37(±1)°С. После чего супернатант удаляли, клетки двукратно омывали средой для культивирования без сыворотки. Дальнейшее культивирование клеток осуществляли с добавлением 2% сыворотки овцы и антибиотиков (100 ЕД/см³ пенициллина, 100 мг/см³ стрептомицина) при 37(±1)°С на протяжении 5-6 сут. Затем клеточный монослой, выращенный на предметных стеклах, фиксировали в течение 10 мин при комнатной температуре 100%-ным ацетоном, охлажденным до минус 20°С. Стекла высушивали на воздухе и в дальнейшем использовали в качестве тест-препаратов.When staging a histochemical enzyme-linked immunosorbent assay, test preparations were prepared. For this purpose, after removing the culture medium and washing the monolayer three times with a serum-free culture medium, clarified suspensions of twofold dilutions of the control were added to the monolayer primary trypsinized culture of lamb testicle (TH) cells and transplanted culture of sheep kidney cells (PO) grown on coverslips in test tubes cultural (normal and specific) and studied organotissue antigens. Cell contact with the studied materials was carried out for 1 h at 37 (± 1) ° С. After the supernatant was removed, the cells were washed twice with serum-free culture medium. Further cell cultivation was carried out with the addition of 2% sheep serum and antibiotics (100 IU / cm ³ penicillin, 100 mg / cm ³ streptomycin) at 37 (± 1) ° C for 5-6 days. Then the cell monolayer grown on glass slides was fixed for 10 min at room temperature with 100% acetone, cooled to minus 20 ° C. The glasses were dried in air and subsequently used as test preparations.

Перед постановкой реакции тест-препараты, закрепленные в спичках, омывали в течение 5 мин отмывочным буфером (забуференный фосфатный раствор рН 7,2-7,4 (ЗФР); 0,05% Твин 20). После чего на край предметного стекла наносили по капле специфичного к вирусам оспы овец и оспы коз пероксидазного конъюгата на основе монрклональных антител клона 010.2 в рабочем разведение и размещали в них покровные стекла фиксированным монослоем вниз. Конъюгат инкубировали в течение 1 ч при 37(±1)°С в условиях влажной камеры. Непровзаимодействовавший конъюгат двукратно отмывали по 3-5 мин в отмывочном буфере и однократно ЗФР. Затем стекла погружали в хромогенный субстратный раствор и через 30 мин инкубирования при комнатной температуре покровные стекла размещали в капле глицерина, расположенной на предметном стекле, и проводили учет результатов реакции при помощи светового инвертированного микроскопа.Before setting up the reaction, test preparations fixed in matches were washed for 5 min with washing buffer (buffered phosphate solution, pH 7.2-7.4 (PBS); 0.05% Tween 20). Then, a drop of virus-specific sheep pox and goat pox virus peroxidase conjugate based on monoclonal antibodies of clone 010.2 was applied dropwise to the edge of the slide in the working dilution and the coverslips were placed in them with a fixed monolayer down. The conjugate was incubated for 1 h at 37 (± 1) ° C in a humid chamber. Unreacted conjugate was washed twice for 3-5 minutes in washing buffer and once PBS. Then, the glasses were immersed in a chromogenic substrate solution, and after 30 minutes of incubation at room temperature, the coverslips were placed in a drop of glycerin located on a glass slide and the results of the reaction were recorded using an inverted light microscope.

О специфическом взаимодействии пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител клона 010.2 с антигенами вирусов оспы овец и оспы коз в инфицированных клетках судили по наличию характерного темно-коричневого окрашивания клеток в местах локализации вирусспецифических антигенов.The specific interaction of the peroxidase conjugate based on monoclonal antibodies of clone 010.2 with the antigens of sheep pox and goat pox viruses in infected cells was judged by the presence of a characteristic dark brown staining of cells at the sites of localization of virus-specific antigens.

В работе по определению чувствительности и специфичности данного метода использовали тест-препараты, представляющие фиксированные интактные и инфицированные культуры клеток ТЯ и ПО гомологичными вирусами, выделенными из подкожной клетчетки с мест оспенного поражения, хоан и пораженных участков легких инфицированных животных, а также гетерологичными вирусами мелких жвачных (вирусом контагиозного пустулезного дерматита овец и коз, катаральной лихорадки овец, чумы мелких жвачных). Результаты по определению чувствительности и специфичности данного метода представлены в таблице.In the work on determining the sensitivity and specificity of this method, test preparations were used that represented fixed intact and infected cultures of TB and PO cells with homologous viruses isolated from the subcutaneous cell from the sites of smallpox lesions, choanas and affected areas of the lungs of infected animals, as well as heterologous viruses of small ruminants (a virus of contagious pustular dermatitis of sheep and goats, catarrhal fever of sheep, plague of small ruminants). The results for determining the sensitivity and specificity of this method are presented in the table.

Результаты исследований, представленные в таблице, свидетельствуют, что предлагаемый способ иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител позволяет проводить диагностику оспы овец и оспы коз и дифференцировать данное заболевание от других заболеваний мелких жвачных, протекающих с клинически сходной картиной.The research results presented in the table indicate that the proposed enzyme-linked immunosorbent assay based on monoclonal antibodies allows the diagnosis of sheep pox and goat pox and to differentiate this disease from other diseases of small ruminants occurring with a clinically similar picture.

Предлагаемый способ обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, по сравнению с существующими методами. Он доступен, прост в использовании и может быть применен в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.The proposed method has a higher sensitivity and specificity, compared with existing methods. It is affordable, easy to use and can be used in research institutes and veterinary laboratories.

Claims (1)

Способ диагностики оспы овец и оспы коз, включающий использование гистохимического иммуноферментного анализа для выявления специфических антигенов вирусов оспы овец и оспы коз, отличающийся тем, что обнаружение антигенов вирусов оспы овец и оспы коз осуществляется в цитоплазме инфицированных клеток первичной или перевиваемой культур клеток овечьего происхождения с помощью пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител клона 010.2, обладающих специфичностью к антигенным детерминантам полипептидов молекулярной массы 36-40 кД вирусов оспы овец и оспы коз.A method for the diagnosis of sheep and smallpox goats smallpox, including the use of histochemical enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of specific antigens of sheeppox and goat pox viruses, characterized in that the detection of sheep and smallpox virus antigens of goats and smallpox goats is carried out in the cytoplasm of infected cells of primary or transplanted cell cultures of sheep origin using peroxidase conjugate based on monoclonal antibodies of clone 010.2 with specificity for antigenic determinants of polypeptides of molecular weight 36-40 kD sheep pox viruses and goat pox viruses.