RU2729018C1 - Method to close tympanic membrane perforation - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, particularly to otorhinolaryngology. Immediately before the operation, whole patient's venous blood in amount of 2 ml is centrifuged in sterile test tube with anticoagulant 3.8 % sodium citrate in 230 rpm for 8 minutes. Plasma enriched with thrombocyte growth factors is selectively separated from the remaining blood components. Blood plasma is activated with catalyst - 10 % calcium chloride in amount of 4 drops of solution per 1 ml of plasma. It is followed by application of 0.5 ml of blood autoplasma enriched with thrombocyte growth factors in the tympanic membrane perforation area.

EFFECT: method enables improving the treatment results of the tympanic membrane perforation by accelerating tissue regeneration in the absence of allergic reactions, reducing the length of the pre- and postoperative period.

1 cl, 1 tbl

Description

Уровень техникиState of the art

При травматической перфорации барабанной перепонки в оториноларингологии имеется большой опыт использования различных способов закрытия перфорации (пластики) с применением различных материалов ([Семенов Ф.В. Отомикроскопическое обследование больных с патологией среднего уха. «Вестник оториноларингологии» 2001:4: 48-50.) Столь большое разнообразие методик пластики и многообразие применяемых для этого материалов указывает на нерешенность данной проблемы. При использовании как аутологичных, так и синтетических пластических материалов сохраняется достаточно высокая частота рецидивов перфорации перегородки и развития гнойных отитов (Onal К., Kazikdas K.С., Uquz M.Z., Gursoy S.T. A multivariate analysis of otological, surgical and patient-related factors in determining success in myringoplasty. Clin Otolaryngol.2005:30 (2): 115-20. doi: 10.1111/j. 1365-2273.2004.00947.x).With traumatic perforation of the tympanic membrane in otorhinolaryngology, there is extensive experience in using various methods of closing perforation (plastics) using various materials ([Semenov FV Otomicroscopic examination of patients with middle ear pathology. "Bulletin of Otorhinolaryngology" 2001: 4: 48-50.) Such a wide variety of plastic techniques and the variety of materials used for this indicates that this problem has not been resolved. When using both autologous and synthetic plastic materials, a rather high frequency of recurrences of septal perforation and the development of purulent otitis remains (Onal K., Kazikdas K.S., Uquz MZ, Gursoy ST A multivariate analysis of otological, surgical and patient-related factors in determining success in myringoplasty. Clin Otolaryngol. 2005: 30 (2): 115-20. doi: 10.1111 / j. 1365-2273.2004.00947.x).

Существует способ закрытия перфорации барабанной перепонки при помощи нанесения на края перфорации геля из гиалуроната цинка на стерильном ватном зонде в течение 7-ми дней. Гель, содержащий гиалуронат цинка, при наружном применении обладает регенерирующим действием, за счет гиалуроновой кислоты, которая является основным компонентом соединительной ткани, и обладает противомикробным действием за счет цинка (RU2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки). Недостатком данного способа является дороговизна геля, необходимость ежедневного контроля пациентов, продолжительность и кратность процедур.There is a way to close the perforation of the tympanic membrane by applying zinc hyaluronate gel to the edges of the perforation on a sterile cotton probe for 7 days. A gel containing zinc hyaluronate, when applied externally, has a regenerating effect due to hyaluronic acid, which is the main component of connective tissue, and has an antimicrobial effect due to zinc (RU2256434 Method of closing a perforation of the tympanic membrane). The disadvantage of this method is the high cost of the gel, the need for daily monitoring of patients, the duration and frequency of procedures.

Другой способ представляет собой использование тромбоцитарного сгустка крови в качестве «опоры» для неотимпанальной мембраны состоящей из височной фасции. Тромбоцитарный сгусток помещают в барабанную полость, при нахождении в которой он способствует ускорению регенерации тканей, приживлению неотимпанальной мембраны (RU 2441632 Способ тимпанопластики). Недостатками данного способа являются дополнительная травматизация в месте забора материала для неотимпанальной мембраны (височная фасция), временное ограничение подвижности слуховых косточек с возможным последующим ухудшением слуха.Another method is to use a platelet blood clot as a "support" for the nontympanic membrane of the temporal fascia. The platelet clot is placed in the tympanic cavity, in which it helps to accelerate tissue regeneration, engraftment of the nontympanic membrane (RU 2441632 Tympanoplasty method). The disadvantages of this method are additional trauma at the site of material sampling for the nontympanic membrane (temporal fascia), temporary limitation of the mobility of the auditory ossicles with possible subsequent hearing impairment.

В качестве ближайшего аналога принят способ закрытия перфорации барабанной перепонки при помощи аллофибробластов, которые наносили на коллагеновую мембрану (синтетическая повязка) в области дефекта барабанной перепонки. Это ускоряло процесс регенерации тканей барабанной перепонки (RU №2165765 Способ устранения травматического дефекта барабанной перепонки). Недостатками способа являются: его дороговизна, необходимость дополнительной травматизации кожи при дермопластике, длительность процесса культивирования фибробластов в предоперационном периоде, возможность возникновения аллергических реакций на синтетический материал.As the closest analogue, a method of closing the perforation of the tympanic membrane using allofibroblasts, which was applied to the collagen membrane (synthetic dressing) in the area of the tympanic membrane defect, was adopted. This accelerated the process of tissue regeneration of the tympanic membrane (RU No. 2165765 Method of eliminating a traumatic defect of the tympanic membrane). The disadvantages of this method are: its high cost, the need for additional trauma to the skin during dermoplasty, the duration of the process of culturing fibroblasts in the preoperative period, the possibility of allergic reactions to synthetic material.

До настоящего времени плазма крови, обогащенная тромбоцитарными факторами роста, не использовалась для лечения перфорации барабанной перепонки.So far, platelet-rich plasma growth factors have not been used to treat tympanic membrane perforation.

Задачей изобретения является создание высокоэффективного и безопасного способа лечения травматической перфорации барабанной перепонки.The object of the invention is to provide a highly effective and safe method for treating traumatic perforation of the tympanic membrane.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат. Способ является высокоэффективным. Он позволяет улучшить результаты лечения перфорации барабанной перепонки за счет ускорения регенерации тканей при отсутствии аллергических реакций на введение аутоплазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, сокращает продолжительности пред- и послеоперационного периода, уменьшает финансовые затраты на лечение больных с перфорациями барабанных перепонок.The use of the invention makes it possible to obtain the following technical result. The method is highly effective. It allows to improve the results of treatment of perforation of the tympanic membrane by accelerating tissue regeneration in the absence of allergic reactions to the introduction of blood autoplasma enriched with platelet growth factors, reduces the duration of the pre- and postoperative period, and reduces the financial costs of treating patients with perforation of the tympanic membranes.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе закрытия перфорации барабанной перепонки 0.5 мл аутоплазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, аппликационно однократно вводят в область перфорации барабанной перепонки.The essence of the invention lies in the fact that in the method of closing the perforation of the tympanic membrane, 0.5 ml of autoplasma of blood enriched with platelet growth factors is injected once into the area of the tympanic membrane perforation.

Технический результат достигается за счет того, что плазма крови, обогащенная факторами роста, обладает аутологичностью (биосовместимостью), безопасна с точки зрения переноса инфекционных возбудителей. Поскольку факторы роста взаимодействуют с мембранными рецепторами, а не с ядерными рецепторами клеток, применение плазмы крови обогащенной тромбоцитарными факторами роста не влияет на гиперплазию, канцерогенез и рост опухолей. Вторичные посредники факторов роста инициируют нормальную экспрессию генов в клетках. Факторы роста не блокируют механизмов обратной связи процессов регенерации и репарации тканей, и не являются мутагенами. При этом авторы исходят из того факта, что результатом воздействия плазмы крови обогащенной факторами роста является экспрессия белков, регулирующих процессы хемотаксиса, адгезии, пролиферацию клеток, ангиогенеза, синтеза компонентов внеклеточного матрикса, дифференцировку клеток участвующих в регенерации тканей. Тем самым, использование данного изобретения способствует улучшению результатов лечения перфорации барабанной перепонки, сокращению продолжительности послеоперационного периода. Применение данного изобретения возможно даже в условиях стационара дневного пребывания.The technical result is achieved due to the fact that blood plasma enriched with growth factors is autologous (biocompatible), safe from the point of view of the transfer of infectious pathogens. Since growth factors interact with membrane receptors, and not with nuclear receptors of cells, the use of blood plasma enriched with platelet growth factors does not affect hyperplasia, carcinogenesis and tumor growth. Secondary messengers of growth factors initiate normal gene expression in cells. Growth factors do not block feedback mechanisms of the processes of tissue regeneration and repair, and are not mutagens. The authors proceed from the fact that the result of exposure to blood plasma enriched with growth factors is the expression of proteins that regulate the processes of chemotaxis, adhesion, cell proliferation, angiogenesis, synthesis of extracellular matrix components, and differentiation of cells involved in tissue regeneration. Thus, the use of this invention improves the results of treatment of perforation of the tympanic membrane, shortening the duration of the postoperative period. The application of this invention is possible even in a day hospital environment.

Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.

Плазму крови, обогащенную тромбоцитарными факторами роста, получают непосредственно перед операцией из собственной крови пациента путем центрифугирования цельной венозной крови (2 мл) в стерильной пробирке с антикоагулянтом 3,8% цитратом натрия. Пробирку помещают в центрифугу, в режиме 23 rpm в течение 8 минут. Происходит отделение эритроцитов от плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов. Верхний слой содержит плазму с тромбоцитами, средний - слой с лейкоцитами и последний, нижний слой, - с эритроцитами. Плазму, обогащенную тромбоцитарными факторами роста, селективно отделяют от остальных компонентов крови. После активации тромбоцитов катализатором - 10% хлоридом кальция, происходит образование биологически совместимой матрицы, из тромбоцитов которой освобождается содержимое гранул в окружающую среду. Количество катализатора из расчета 4 капли раствора на 1 мл плазмы. Фибрин, содержащийся в плазме, после активации полимеризуется, выступая в качестве матрицы для направленной регенерации тканей, и в последующем оказывает стимулирующее действие на заживление ран, обеспечивая миграцию фибробластов. Активная секреция факторов роста начинается в первые 10 минут после свертывания крови. Затем они секретируются еще в течение 3-5 дней, но в меньшей концентрации. Плазма крови, обогащенная тромбоцитарными факторами роста, должна быть активирована непосредственно перед использованием. Полученный сгусток из плазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, однократно аппликационно вводят в наружный слуховой проход в область перфорации барабанной перепонки.Blood plasma enriched with platelet growth factors is obtained immediately before the operation from the patient's own blood by centrifuging whole venous blood (2 ml) in a sterile test tube with an anticoagulant 3.8% sodium citrate. The tube is placed in a centrifuge at 23 rpm for 8 minutes. There is a separation of erythrocytes from plasma, leukocytes and platelets. The upper layer contains plasma with platelets, the middle layer contains leukocytes, and the last, lower layer contains erythrocytes. Plasma enriched with platelet growth factors is selectively separated from the rest of the blood components. After activation of platelets with a catalyst - 10% calcium chloride, a biologically compatible matrix is formed, from which platelets the contents of the granules are released into the environment. The amount of catalyst is based on 4 drops of solution per 1 ml of plasma. Fibrin contained in plasma, after activation, polymerizes, acting as a matrix for targeted tissue regeneration, and subsequently has a stimulating effect on wound healing, ensuring the migration of fibroblasts. The active secretion of growth factors begins in the first 10 minutes after blood clotting. Then they are secreted for another 3-5 days, but at a lower concentration. Blood plasma enriched with platelet growth factors must be activated immediately before use. The resulting clot from blood plasma enriched with platelet growth factors is injected once by application into the external auditory canal in the area of perforation of the tympanic membrane.

Эффективность нового способа закрытия перфорации барабанной перепонки была доказана экспериментально.The effectiveness of the new method of closing the tympanic membrane perforation has been proven experimentally.

Эксперименты выполнили на крысах самцах, линии Wistar, возраст 3 мес., массой тела 230-250 гр, в количестве 36 голов (оценивали 72 барабанных перепонок). Все работы с животными провели в соответствии с законодательством Российской Федерации, положениями Директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях (статья 27), а также требованиями и рекомендациями «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных» («Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» National Academy Press, USA 2011). Выделили 2 группы: 1-ю (экспериментальную, 18 голов) и 2-ю (контрольную, 18 голов). Рандомизацию животных проводили методом «конвертов». Животные сравниваемых групп не различались по массе тела. Масса тела составила 239±6 г и 242±5 г в первой и второй группе, соответственно. До исследования провели отоскопию на наличие воспалительных процессов, перфораций барабанной перепонки, инородных тел в наружном слуховом проходе. Травматическую перфорацию барабанной перепонки выполняли в условиях общей анестезии стерильной иглой размерами (0,6 мм × 30 мм) 23 G (СФМ Госпитал Продактс ГмбХ, Зегельфлигердамм, Берлин, Германия) в задне-нижнем квадранте барабанной перепонки. Общую анестезию провели препаратами «Золазепам» и «Ксилазин» из расчета 5 мг препарата /1 кг массы тела животного в/и стерильной иглой размером 25 G (СФМ Госпитал Продактс ГмбХ, Зегельфлигердамм, Берлин, Германия). В экспериментальной группе у каждой особи произвели забор 1 мл аутокрови из хвостовой вены стерильной иглой 30 G U-40 Insulin 0,30 мм × 8 мм (СФМ Госпитал Продактс ГмбХ, Зегельфлигердамм, Берлин, Германия). Кровь помещали в стерильную вакуумную пробирку объемом 1,8 мл с цитратом натрия 3,8% (PUTH ООО «Вита Хели», Ижевск). Этап центрифугирования крови с 3,8% цитратом натрия проводили в режиме 230 rpm 8 мин (центрифуга СМ-12-0-6, фабрика «НК Групп», Россия). После центрифугирования происходило разделение крови на 3 части: плазма крови с тромбоцитами, лейкоцитами и эритроцитами. Часть плазмы крови с тромбоцитами отбирали с помощью стерильной пипетки Пастера, добавляли катализатор (1 капля 10% раствора CaCl), через 15 минут происходило образование сгустка, обогащенного тромбоцитарными факторами роста. Полученный тромбоцитарный сгусток однократно аппликационно вводили в наружный слуховой проход в область перфорации барабанной перепонки животных экспериментальной группы. Визуальную оценку регенерации барабанной перепонки произвели при помощи отоскопа Welch Allyn Surgitek, США ежедневно. Эвтаназию животных провели с помощью помещения их в камеру с насыщенным углекислым газом, затем произвели микроскопическую оценку.The experiments were performed on male rats, Wistar line, age 3 months, body weight 230-250 g, in the amount of 36 heads (72 tympanic membranes were assessed). All work with animals was carried out in accordance with the legislation of the Russian Federation, the provisions of Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of the European Union dated September 22, 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (Article 27), as well as the requirements and recommendations of the Guidelines on the maintenance and use of laboratory animals "(" Guide for the Care and Use of Laboratory Animals "National Academy Press, USA 2011). Allocated 2 groups: 1st (experimental, 18 goals) and 2nd (control, 18 goals). Animals were randomized using the envelope method. The animals of the compared groups did not differ in body weight. Body weight was 239 ± 6 g and 242 ± 5 g in the first and second groups, respectively. Before the study, an otoscopy was performed for the presence of inflammation, perforation of the tympanic membrane, foreign bodies in the external auditory canal. Traumatic perforation of the tympanic membrane was performed under general anesthesia with a sterile (0.6 mm × 30 mm) 23 G needle (SFM Hospital Products GmbH, Seegelfligerdam, Berlin, Germany) in the postero-inferior quadrant of the tympanic membrane. General anesthesia was performed with Zolazepam and Xylazine at the rate of 5 mg of the drug / 1 kg of animal body weight IV and a sterile 25 G needle (SFM Hospital Products GmbH, Seegelfligerdam, Berlin, Germany). In the experimental group, 1 ml of autologous blood was taken from each individual from the tail vein with a sterile 30 G U-40 Insulin 0.30 mm × 8 mm needle (SFM Hospital Products GmbH, Seegelfliegerdam, Berlin, Germany). The blood was placed in a sterile 1.8 ml vacuum tube with sodium citrate 3.8% (PUTH LLC "Vita Heli", Izhevsk). The stage of blood centrifugation with 3.8% sodium citrate was carried out at 230 rpm for 8 min (CM-12-0-6 centrifuge, NK Group factory, Russia). After centrifugation, the blood was divided into 3 parts: blood plasma with platelets, leukocytes and erythrocytes. Part of the blood plasma with platelets was collected using a sterile Pasteur pipette, the catalyst was added (1 drop of 10% CaCl solution), after 15 minutes a clot enriched with platelet growth factors was formed. The obtained platelet clot was once applied by application into the external auditory canal in the area of the tympanic membrane perforation of the animals of the experimental group. The visual assessment of the tympanic membrane regeneration was performed using the Welch Allyn Surgitek otoscope, USA daily. The animals were euthanized by placing them in a chamber filled with saturated carbon dioxide, then microscopically evaluated.

Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 7.0 методомThe data were statistically processed using the Statistica 7.0 software using the

ANOVA и критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни. Анализируемые величины представили в цифровом виде и в виде: Me (25%; 75%). Различия между группами на этапах эксперимента считали достоверными при р≤0,05.ANOVA and Wilcoxon-Mann-Whitney U test. The analyzed values were presented in digital form and in the form: Me (25%; 75%). Differences between the groups at the stages of the experiment were considered significant at p≤0.05.

В экспериментальной группе на 5-е сутки после операции признаков острого отита не было, закрытие ПБП выявили в 4 случаях, «сухая» перфорация барабанной перепонки (без признаков воспаления) сохранилась в 8 случаях (табл.). В контрольной группе на 5-е сутки после операции признаки острого отита выявили в 9 случаях, закрытие перфорации барабанной перепонки не отметили, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 3 случаях. Частота развития острого среднего отита с ПБП в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й (р<0,01).In the experimental group, on the 5th day after the operation, there were no signs of acute otitis media, closure of the PBP was revealed in 4 cases, “dry” perforation of the tympanic membrane (without signs of inflammation) remained in 8 cases (Table). In the control group, on the 5th day after the operation, signs of acute otitis media were detected in 9 cases, closure of the tympanic membrane perforation was not noted, “dry” perforation of the tympanic membrane was preserved in 3 cases. The incidence of acute otitis media with PBP in the 1st group was significantly less than in the 2nd (p <0.01).

Прим. * - достоверность различий в группах, (р<0,01).Approx. * - reliability of differences in groups, (p <0.01).

На 10 сутки после операции в 1-й группе развитие острого отита выявили в 1 случае, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 1 случае, закрытие перфорации барабанной перепонки выявили в 10 случаях. На 10 сутки после операции во 2-й группе развитие острого отита выявили в 6 случаях, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 6 случаях, закрытия перфорации барабанной перепонки не было. Частота закрытия перфорации барабанной перепонки в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й (р<0,01).On the 10th day after the operation in the 1st group the development of acute otitis media was revealed in 1 case, “dry” perforation of the tympanic membrane was preserved in 1 case, the closure of the perforation of the tympanic membrane was revealed in 10 cases. On the 10th day after surgery, in the 2nd group, the development of acute otitis media was detected in 6 cases, "dry" perforation of the tympanic membrane was preserved in 6 cases, there was no closure of the perforation of the tympanic membrane. The frequency of closure of the tympanic membrane perforation in the 1st group was significantly less than in the 2nd (p <0.01).

На 15 сутки после операции в 1-й группе не было признаков острого среднего отита, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 1 случае, закрытие перфорации барабанной перепонки выявили в 11 случаях. На 15 сутки после операции во 2-й группе наличие признаков острого среднего отита определили в 1 случае, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 10 случае, закрытий перфорации барабанной перепонки отметили в 1 случае. Частота закрытия перфорации барабанной перепонки в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й (р<0,05). Частота сохранения перфорации барабанной перепонки без признаков воспаления («сухая» перфорация) в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й (р<0,05).On the 15th day after the operation in the 1st group there were no signs of acute otitis media, “dry” perforation of the tympanic membrane was preserved in 1 case, closure of the perforation of the tympanic membrane was revealed in 11 cases. On the 15th day after the operation in the 2nd group the presence of signs of acute otitis media was determined in 1 case, “dry” perforation of the tympanic membrane was preserved in 10 cases, closure of the perforation of the tympanic membrane was noted in 1 case. The frequency of closure of tympanic membrane perforation in the 1st group was significantly less than in the 2nd (p <0.05). The frequency of persistence of tympanic membrane perforation without signs of inflammation ("dry" perforation) in group 1 was significantly less than in group 2 (p <0.05).

Медиана общего числа случаев закрытия ПБП на всех этапах эксперимента в 1-й группе составила 10 и была достоверно (р≤0,01) больше, чем во 2-й- единичный случай из 36 наблюдений.The median of the total number of cases of PBP closure at all stages of the experiment in the 1st group was 10 and was significantly (p≤0.01) more than in the 2nd - a single case of 36 observations.

Полученные результаты свидетельствуют о благоприятном влиянии плазмы крови обогащенной тромбоцитарными факторами роста на регенерацию барабанной перепонки в условиях ее травматической перфорации. Это проявляется в достоверном уменьшении частоты развития острого среднего отита на 5 день после перфорации и в увеличении сравнительной частоты закрытия перфорации барабанной перепонки как на 10 и 15 день, так и в общем в экспериментальной группе.The results obtained indicate a favorable effect of blood plasma enriched with platelet growth factors on the regeneration of the tympanic membrane under conditions of its traumatic perforation. This is manifested in a significant decrease in the incidence of acute otitis media on day 5 after perforation and in an increase in the comparative frequency of closure of the tympanic membrane perforation both on days 10 and 15, and in general in the experimental group.

Claims (1)

Способ закрытия перфорации барабанной перепонки, включающий однократное аппликационное введение в область перфорации барабанной перепонки 0,5 мл аутоплазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, отличающийся тем, что плазму крови, обогащенную тромбоцитарными факторами роста, получают непосредственно перед операцией из собственной крови пациента путем центрифугирования цельной венозной крови в количестве 2 мл в стерильной пробирке с антикоагулянтом 3,8% цитратом натрия в режиме 230 rpm в течение 8 минут; плазму, обогащенную тромбоцитарными факторами роста, селективно отделяют от остальных компонентов крови, непосредственно перед использованием осуществляют активацию плазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, с помощью катализатора - 10% хлорида кальция из расчета 4 капли раствора на 1 мл плазмы.A method of closing a perforation of the tympanic membrane, including a single application introduction into the area of perforation of the tympanic membrane of 0.5 ml of autoplasma of blood enriched with platelet growth factors, characterized in that blood plasma enriched with platelet growth factors is obtained immediately before the operation from the patient's own blood by centrifuging whole venous blood in an amount of 2 ml in a sterile test tube with an anticoagulant 3.8% sodium citrate at 230 rpm for 8 minutes; Plasma enriched with platelet growth factors is selectively separated from other blood components, immediately before use, blood plasma enriched with platelet growth factors is activated using a catalyst - 10% calcium chloride at the rate of 4 drops of solution per 1 ml of plasma.