RU2663725C2 - Многоцепочечный химерный антигенный рецептор и его применения - Google Patents
Многоцепочечный химерный антигенный рецептор и его применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2663725C2 RU2663725C2 RU2015112125A RU2015112125A RU2663725C2 RU 2663725 C2 RU2663725 C2 RU 2663725C2 RU 2015112125 A RU2015112125 A RU 2015112125A RU 2015112125 A RU2015112125 A RU 2015112125A RU 2663725 C2 RU2663725 C2 RU 2663725C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- cells
- chain
- alpha
- tcr
- Prior art date
Links
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 121
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 458
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 95
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 90
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 58
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 253
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 151
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 110
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 110
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 89
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 75
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 66
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 64
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 59
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 56
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 56
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 56
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 claims description 48
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 claims description 48
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 41
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 41
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 29
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 29
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 29
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 19
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 10
- -1 ICOS Proteins 0.000 claims description 9
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 8
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 7
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 6
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims 2
- 102100022132 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Human genes 0.000 claims 1
- 108091010847 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit gamma Proteins 0.000 claims 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 claims 1
- 108010065816 zeta chain antigen T cell receptor Proteins 0.000 claims 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 abstract description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 35
- 230000011664 signaling Effects 0.000 abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 150
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 128
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 68
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 55
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 52
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 52
- 102000013135 CD52 Antigen Human genes 0.000 description 52
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 51
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 50
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 49
- 101710129866 Pre T-cell antigen receptor alpha Proteins 0.000 description 46
- 102100039824 Pre T-cell antigen receptor alpha Human genes 0.000 description 46
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 41
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 40
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 39
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 39
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 37
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 36
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 35
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 35
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 34
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 31
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 30
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 30
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 28
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 27
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 26
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 24
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 24
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 24
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 24
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 22
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 21
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 21
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 21
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 21
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 20
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 19
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 19
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 18
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 16
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 16
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 16
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 15
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 15
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 15
- 108010082091 pre-T cell receptor alpha Proteins 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 13
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 13
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 13
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 13
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 12
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 11
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 101150088639 csm4 gene Proteins 0.000 description 9
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 9
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 description 8
- 101150075629 CSM2 gene Proteins 0.000 description 8
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 8
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 description 8
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 101150022488 csm5 gene Proteins 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 8
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 7
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 7
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 7
- 101150064365 csm6 gene Proteins 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 102100024263 CD160 antigen Human genes 0.000 description 6
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 6
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 6
- 101000761938 Homo sapiens CD160 antigen Proteins 0.000 description 6
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 6
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 6
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 description 6
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 6
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 6
- 102100020943 Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Human genes 0.000 description 6
- 108700042076 T-Cell Receptor alpha Genes Proteins 0.000 description 6
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 description 6
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 6
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 6
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 6
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 6
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 description 6
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 101150090505 cas10 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 6
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 6
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 description 5
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 5
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 5
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 5
- 101150046249 Havcr2 gene Proteins 0.000 description 5
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 5
- 101000836954 Homo sapiens Sialic acid-binding Ig-like lectin 10 Proteins 0.000 description 5
- 101000662909 Homo sapiens T cell receptor beta constant 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000662902 Homo sapiens T cell receptor beta constant 2 Proteins 0.000 description 5
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 description 5
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 5
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 5
- 102100027164 Sialic acid-binding Ig-like lectin 10 Human genes 0.000 description 5
- 102100037272 T cell receptor beta constant 1 Human genes 0.000 description 5
- 102100037298 T cell receptor beta constant 2 Human genes 0.000 description 5
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 5
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 5
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 102220470959 Amiloride-sensitive sodium channel subunit delta_D22A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102220470179 Aryl hydrocarbon receptor repressor_R102A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 4
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 4
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 4
- 102220510044 FAS-associated death domain protein_R117A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 4
- 101001138062 Homo sapiens Leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 4
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 4
- 102220467016 Tubulin monoglutamylase TTLL4_K24A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 4
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 4
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 4
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 102220294968 rs778300481 Human genes 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 101100244725 Caenorhabditis elegans pef-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 101150043916 Cd52 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 3
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101000926939 Homo sapiens Glucocorticoid receptor Proteins 0.000 description 3
- 101001071608 Homo sapiens Glutathione reductase, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 3
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 101000934342 Mus musculus T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 3
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 2
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 2
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 2
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 102100039554 Galectin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 description 2
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 2
- 101000608769 Homo sapiens Galectin-8 Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000984189 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000984186 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000606310 Homo sapiens Pre T-cell antigen receptor alpha Proteins 0.000 description 2
- 101100207070 Homo sapiens TNFSF8 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000830950 Homo sapiens Three prime repair exonuclease 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000597785 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Proteins 0.000 description 2
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102100025583 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100025578 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 4 Human genes 0.000 description 2
- 102000018170 Lymphotoxin beta Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010091221 Lymphotoxin beta Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100030301 MHC class I polypeptide-related sequence A Human genes 0.000 description 2
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100207071 Mus musculus Tnfsf8 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 description 2
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108700042077 T-Cell Receptor beta Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- 102100032100 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Human genes 0.000 description 2
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 2
- 102100035284 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Human genes 0.000 description 2
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010317 ablation therapy Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 description 2
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010025001 leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 2
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 2
- 230000032965 negative regulation of cell volume Effects 0.000 description 2
- 238000001208 nuclear magnetic resonance pulse sequence Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 101150083745 preT gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 2
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFILOTSTFMXQJC-QCFYAKGBSA-N (2r,4r,5s,6s)-2-[3-[(2s,3s,4r,6s)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-5-[(2s,3r,4r,5r,6r)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2-[(2r,3s,4r,5r,6r)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(e)-3-hydroxy-2-(octadecanoylamino)octadec-4-enoxy]oxan-3-yl]oxy-3-hy Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OCC(NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)C(O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)C2)C(O)C(O)CO[C@]2(O[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)C2)C(O)C(O)CO)C(O)=O)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 FFILOTSTFMXQJC-QCFYAKGBSA-N 0.000 description 1
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIYAVKIYRIFSCZ-CYEMHPAKSA-N 5-(methylamino)-2-[[(2S,3R,5R,6S,8R,9R)-3,5,9-trimethyl-2-[(2S)-1-oxo-1-(1H-pyrrol-2-yl)propan-2-yl]-1,7-dioxaspiro[5.5]undecan-8-yl]methyl]-1,3-benzoxazole-4-carboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H](C)[C@H]1O[C@@]2([C@@H](C[C@H]1C)C)O[C@@H]([C@@H](CC2)C)CC=1OC2=CC=C(C(=C2N=1)C(O)=O)NC)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-CYEMHPAKSA-N 0.000 description 1
- 108010013238 70-kDa Ribosomal Protein S6 Kinases Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100370338 Bos taurus TREX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091058539 C10orf54 Proteins 0.000 description 1
- 102000004631 Calcineurin Human genes 0.000 description 1
- 108010042955 Calcineurin Proteins 0.000 description 1
- 229940122739 Calcineurin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710192106 Calcineurin-binding protein cabin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024123 Calcineurin-binding protein cabin-1 Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 102100025466 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- VWFCHDSQECPREK-LURJTMIESA-N Cidofovir Chemical compound NC=1C=CN(C[C@@H](CO)OCP(O)(O)=O)C(=O)N=1 VWFCHDSQECPREK-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000008265 DNA repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 241001379910 Ephemera danica Species 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000652 Flap endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004150 Flap endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- YPINZEGNLULHHT-UHFFFAOYSA-N Fujimycin Natural products COC1CC(CCC1O)C=C(/C)C2OC(=O)C3CCCCCN3C(=O)C(=O)C4(O)OC(C(CC4C)OC)C(OC)C(C)CC(=CC(CC=C)C(=O)CC(O)C2C)C YPINZEGNLULHHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052907 GIY-YIG endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108700035841 GIY-YIG endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150047053 GR gene Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000000310 HNH endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108050008753 HNH endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010007707 Hepatitis A Virus Cellular Receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100383049 Homo sapiens CD52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100061678 Homo sapiens CTLA4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914337 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 1
- 101000874179 Homo sapiens Syndecan-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 description 1
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 1
- 101000830956 Homo sapiens Three-prime repair exonuclease 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 description 1
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229940121740 Inosine monophosphate dehydrogenase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010028275 Leukocyte Elastase Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- 101100370340 Mus musculus Trex1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100268066 Mus musculus Zap70 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 102400000058 Neuregulin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000556 Neuregulin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 241000702244 Orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100027913 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229940123934 Reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000713880 Spleen focus-forming virus Species 0.000 description 1
- 241000713675 Spumavirus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 1
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 description 1
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108010006877 Tacrolimus Binding Protein 1A Proteins 0.000 description 1
- 102100024872 Three prime repair exonuclease 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102100024855 Three-prime repair exonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000000160 Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010080432 Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100033726 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007720 allelic exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 description 1
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960005520 bryostatin Drugs 0.000 description 1
- MJQUEDHRCUIRLF-TVIXENOKSA-N bryostatin 1 Chemical compound C([C@@H]1CC(/[C@@H]([C@@](C(C)(C)/C=C/2)(O)O1)OC(=O)/C=C/C=C/CCC)=C\C(=O)OC)[C@H]([C@@H](C)O)OC(=O)C[C@H](O)C[C@@H](O1)C[C@H](OC(C)=O)C(C)(C)[C@]1(O)C[C@@H]1C\C(=C\C(=O)OC)C[C@H]\2O1 MJQUEDHRCUIRLF-TVIXENOKSA-N 0.000 description 1
- MUIWQCKLQMOUAT-AKUNNTHJSA-N bryostatin 20 Natural products COC(=O)C=C1C[C@@]2(C)C[C@]3(O)O[C@](C)(C[C@@H](O)CC(=O)O[C@](C)(C[C@@]4(C)O[C@](O)(CC5=CC(=O)O[C@]45C)C(C)(C)C=C[C@@](C)(C1)O2)[C@@H](C)O)C[C@H](OC(=O)C(C)(C)C)C3(C)C MUIWQCKLQMOUAT-AKUNNTHJSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003710 calcium ionophore Substances 0.000 description 1
- HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N calcium ionophore A23187 Natural products N=1C2=C(C(O)=O)C(NC)=CC=C2OC=1CC(C(CC1)C)OC1(C(CC1C)C)OC1C(C)C(=O)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 229960000724 cidofovir Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000007931 coated granule Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N dihydrofolic acid Chemical compound N=1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OZRNSSUDZOLUSN-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000002961 echo contrast media Substances 0.000 description 1
- 229960000284 efalizumab Drugs 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002616 endonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 description 1
- 210000003386 epithelial cell of thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N ethyl 12-[[2-[(2r,3r)-3-[2-[(12-ethoxy-12-oxododecyl)-methylamino]-2-oxoethoxy]butan-2-yl]oxyacetyl]-methylamino]dodecanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCCCCCCCCCN(C)C(=O)CO[C@H](C)[C@@H](C)OCC(=O)N(C)CCCCCCCCCCCC(=O)OCC CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011347 external beam therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 150000004000 hexols Chemical class 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 102000045960 human DNA2 Human genes 0.000 description 1
- 102000054586 human TREX2 Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006450 immune cell response Effects 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000002348 inosinate dehydrogenase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000003287 lymphocyte surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940014456 mycophenolate Drugs 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000009438 off-target cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001126 phototherapy Methods 0.000 description 1
- 108010058237 plasma protein fraction Proteins 0.000 description 1
- 229940002993 plasmanate Drugs 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 229960003452 romidepsin Drugs 0.000 description 1
- OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N romidepsin Chemical compound O1C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H]2CSSCC\C=C\[C@@H]1CC(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000009131 signaling function Effects 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010036169 three prime repair exonuclease 1 Proteins 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000019432 tissue death Effects 0.000 description 1
- 210000003014 totipotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 229960003853 ultrasound contrast media Drugs 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 108010015889 zeta receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/99—Coculture with; Conditioned medium produced by genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению химерных антигенных рецепторов (CAR), называемых многоцепочечными CAR, и может быть применено в медицине для противоопухолевой терапии. Многоцепочечный CAR направлен против маркера клеточной поверхности, представленного на целевой клетке и содержит два нековалентно связанных трансмембранных полипептида. Предложенная структура CAR обеспечивает оптимальную передачу сигнала. Первый трансмембранный полипептид содержит трансмембранный домен и одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), который способен связываться с маркером клеточной поверхности, представленным на целевой клетке. Второй трансмембранный полипептид содержит трансмембранный домен и передающий сигнал домен. Изобретение позволяет получить CAR, перенаправляющий специфичность и реактивность иммунных клеток в направлении выбранной мишени с использованием свойств лигандсвязывающего домена. 6 н. и 16 з.п. ф-лы, 26 ил., 15 табл., 6 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к химерным антигенным рецепторам (CAR). CAR способны перенаправлять специфичность и реактивность иммунной клетки в направлении выбранной мишени с помощью свойств лигандсвязывающего домена. В частности, настоящее изобретение относится к многоцепочечному химерному антигенному рецептору, в котором внеклеточные лигандсвязывающие и сигнальные домены разделены по различным трансмембранным полипептидам для улучшения их функций. Различные трансмембранные полипептиды, составляющие многоцепочечный CAR по настоящему изобретению, когда собраны вместе, могут специфически связываться с одним или несколькими лигандами в мишени и индуцировать активацию иммунных клеток, в которых они экспрессируются, и иммунный ответ. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, векторам, кодирующим такие трансмембранные полипептиды, и выделенным клеткам, экспрессирующим указанный многоцепочечный CAR на своей поверхности, для иммунотерапии. Настоящее изобретение также относится к способам получения иммунных клеток способами генной инженерии, экспрессирующих многоцепочечный CAR на своей поверхности. Изобретение открывает путь эффективным стратегиям адоптивной иммунотерапии для лечения злокачественной опухоли и вирусных инфекций.
Уровень техники изобретения
Адоптивная иммунотерапия, которая включает перенос аутологичных антиген-специфических Т-клеток, полученных ex vivo, является многообещающей стратегией для лечения вирусных инфекций и злокачественных опухолей. T-клетки, используемые для адоптивной иммунотерапии, могут быть получены или путем размножения антиген-специфических T-клеток, или путем перенаправления T-клеток посредством генной инженерии (Park, Rosenberg et al., 2011). Перенос специфичных к вирусному антигену T-клеток является хорошо отлаженной процедурой, используемой для лечения связанных с трансплантатами вирусных инфекций и редких связанных с вирусами злокачественных опухолей. Кроме того, было показано, что выделение и перенос специфичных к опухоли T-клеток являются успешными при лечении меланомы.
Новые специфичности T-клеток были успешно созданы посредством генетического переноса трансгенных Т-клеточных рецепторов или химерных антигенных рецепторов (CAR) (Jena, Dotti et al., 2010). CAR представляют собой синтетические рецепторы, состоящие из направляющего участка, который связан с одним или несколькими сигнальными доменами в одной молекуле слияния. Обычно связывающий участок CAR состоит из антигенсвязывающего домена одноцепочечного антитела (scFv), содержащего легкие и вариабельные фрагменты моноклонального антитела, присоединенные посредством гибкого линкера. Также успешно применялись связывающие участки, основанные на доменах рецептора или лиганда. Сигнальные домены для первого поколения CAR получают из цитоплазматического участка цепей CD3-дзета или Fc-рецептора-гамма. Было показано, что CAR первого поколения успешно перенаправляют цитотоксичность T-клеток, однако они не могли обеспечивать продолжительное размножение и противоопухолевую активность in vivo. Для повышения выживаемости и улучшения пролиферации модифицированных CAR T-клеток присоединяли сигнальные домены из костимулирующих молекул, включая CD28, OX-40 (CD134) и 4-1BB (CD137), по отдельности (второе поколение) или в комбинации (третье поколение). CAR успешно позволяли перенаправление T-клеток против антигенов, экспрессированных на поверхности опухолевых клеток из различных злокачественных опухолей, включая лимфомы и солидные опухоли (Jena, Dotti et al., 2010).
Современные архитектуры CAR построены на конструкции, в которой все нужные домены содержатся в одном полипептиде (US 7741465). Такая конструкция требует последовательного присоединения сигнальных доменов, что требует переместить некоторые домены из их природных околомембранных положений, удаленных от плазматической мембраны. Тем не менее, архитектуры, в которых лиганды и сигнальные домены отделены в своих нормальных околомембранных положениях (т.е. поблизости от клеточной мембраны на ее внутренней стороне), были бы более желательными, и считается, что они позволят улучшенное функционирование костимулирующих доменов. Высокоаффинный рецептор для IgE (FcεRI) мог бы обеспечивать такую архитектуру. В самом деле, FcεRI, который присутствует на тучных клетках и базофилах, представляет собой тетрамерный комплекс, состоящий из лигандсвязывающей альфа-субъединицы, бета-субъединицы и гомодимера двух передающих сигнал гамма-субъединиц (Metzger, Alcaraz et al., 1986). FcεRI-альфа домен состоит из внеклеточного домена, содержащего два Ig-подобных домена, которые связывают IgE, трансмембранный домен и короткий цитоплазматический хвост. Бета-субъединица содержит четыре трансмембранных сегмента, разделяющих амино- и карбоксиконцевые цитоплазматические хвосты. Гамма-цепь состоит по существу из трансмембранного участка и цитоплазматического хвоста, содержащего один иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM) (Cambier, 1995).
Современный протокол для лечения пациентов с помощью адоптивной иммунотерапии основан на переносе аутологичных клеток. При таком подходе T-лимфоциты получают от пациентов, генетически модифицируют или отбирают ex vivo, культивируют in vitro, для того чтобы увеличить количество клеток, если необходимо, и, наконец, вводят в пациента. В дополнение к введению лимфоцитов на хозяина можно воздействовать другими способами, которые поддерживают приживление Т-клеток или их участие в иммунном ответе, например, посредством предварительного кондиционирования (с помощью излучения или химиотерапии) и введения факторов роста лимфоцитов (таких как IL-2). Каждый пациент получает индивидуально подобранное лечение с использованием собственных лимфоцитов пациента (т.е. аутологическую терапию).
Аутологические терапии сталкиваются со значительными техническими и логистическими препятствиями для практического применения, их создание требует дорогостоящих специализированных технических средств и высококвалифицированного персонала, они должны быть созданы в течение короткого времени после диагностики пациента, и, во многих случаях, предварительная обработка пациента приводит к ухудшению иммунной функции, так что лимфоциты пациента могут становиться малофункциональными и присутствовать в очень малых количествах. Из-за этих препятствий каждый препарат аутологичных клеток пациента является по существу эффективным новым продуктом, что ведет к существенной вариативности в эффективности и безопасности. В идеале, хотелось бы использовать стандартизированную терапию, в которой аллогенные терапевтические клетки можно было бы создавать заранее, подробно характеризовать и делать доступными для немедленного введения пациентам. Под аллогенными подразумевается, что клетки получают от индивидуумов, принадлежащих к одному и тому же виду, но генетически разнородных. Однако, использование аллогенных клеток имеет в настоящее время много недостатков. В иммунокомпетентных хозяевах аллогенные клетки быстро отторгаются, процесс называется отторжением хозяин против трансплантата (HvG), и это существенно ограничивает эффективность перенесенных клеток. В иммунонекомпетентных хозяевах аллогенные клетки могут приживаться, но их эндогенные специфичности TCR распознают ткань хозяина как чужие, что приводит к заболеванию трансплантат против хозяина (GvHD), которое может приводить к серьезному повреждению тканей и смерти. Для того, чтобы эффективно использовать аллогенные клетки, нужно преодолеть обе эти проблемы.
В иммунокомпетентных хозяевах аллогенные клетки быстро отторгаются иммунной системой хозяина. Было продемонстрировано, что аллогенные лейкоциты, присутствующие в необлученных продуктах крови, сохраняются в течение не больше чем от 5 до 6 дней. (Boni, Muranski et al., 2008). Таким образом, чтобы предотвратить отторжение аллогенных клеток, иммунная система хозяина должна быть эффективно подавлена. Глюкокортикостероиды широко используются терапевтически для иммуносупрессии (Coutinho and Chapman, 2011). Этот класс стероидных гормонов связывается с глюкокортикоидным рецептором (GR), присутствующим в цитозоле T-клеток, что ведет к транслокации в ядро и связыванию специфических мотивов ДНК, которые регулируют экспрессию ряда генов, участвующих в иммунологическом процессе. Обработка T-клеток с помощью глюкокортикоидных стероидов приводит к пониженному уровню производства цитокинов, что ведет к Т-клеточной анергии и препятствию к активации Т-клеток. Алемтузумаб, также известный как CAMPATH1-H, представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, направленное на CD52, 12-аминокислотный гликопротеин, соединенный с гликозилфосфатидилинозитолом (GPI) (Waldmann and Hale, 2005). CD52 экспрессируется в больших количествах на T и B-лимфоцитах и в малых количествах на моноцитах, при этом отсутствуя на гранулоцитах и предшественниках костного мозга. Было показано, что лечение с помощью алемтузумаба, гуманизированного моноклонального антитела, направленного против CD52, индуцирует быстрое истощение циркулирующих лимфоцитов и моноцитов. Его часто используют при лечении Т-клеточных лимфом и в некоторых случаях как часть режима кондиционирования для трансплантации. Однако, в случае адоптивной иммунотерапии использование иммуносупрессивных препаратов также будет иметь отрицательное воздействие на введенные терапевтические T-клетки. Следовательно, для эффективного использования подхода адоптивной иммунотерапии в данных условиях введенные клетки должны быть резистенстными к иммуносупрессивной обработке.
С другой стороны, T-клеточные рецепторы (TCR) представляют собой рецепторы клеточной поверхности, которые участвуют в активации Т-клеток в ответ на презентацию антигена. TCR, как правило, состоит из двух цепей, альфа и бета, которые собираются с образованием гетеродимера и связываются с передающими субъединицами CD3 с образованием комплекса T-клеточного рецептора, присутствующего на клеточной поверхности. Каждая альфа и бета-цепь TCR состоит из иммуноглобулин-подобного N-концевого вариабельного (V) и константного (C) участка, гидрофобного трансмембранного домена и короткого цитоплазматического участка. Что касается молекул иммуноглобулина, вариабельный участок альфа и бета-цепей создается посредством V(D)J-рекомбинации, создающей большое разнообразие антиген-специфичностей в популяции T-клеток. Однако, в отличие от иммуноглобулинов, которые распознают интактный антиген, T-клетки активируются процессированными пептидными фрагментами, связанными с молекулой MHC, что вводит дополнительное измерение в распознавание антигена T-клетками, известное как MHC-рестрикция. Распознавание несовместимостей MHC между донором и реципиентом посредством T-клеточного рецептора приводит к пролиферации T-клеток и потенциальному развитию GVHD. Было показано, что нормальная поверхностная экспрессия TCR зависит от согласованного синтеза и сборки всех семи компонентов комплекса (Ashwell and Klusner, 1990). Инактивация TCR-альфа или TCR-бета может приводить к элиминации TCR с поверхности T-клеток, что предотвращает распознавание аллоантигена и, следовательно, GVHD. Однако, разрушение TCR приводит к элиминации сигнального компонента CD3 и изменяет способы дальнейшего размножения T-клеток.
Опосредованный T-клетками иммунитет включает несколько последовательных стадий, регулируемых равновесием между костимулирующими и ингибирующими сигналами, которые точно настраивают иммунный ответ. Ингибирующие сигналы, называемые иммунными контрольными точками, являются существенными для поддержания аутотолерантности, а также для ограничения иммунно-опосредованного сопутствующего повреждения ткани. Экспрессия белка иммунных контрольных точек может быть дерегулирована опухолями. Способность опухолей присваивать данные ингибирующие пути представляет собой важный механизм в иммуннорезистентности и ограничивает успех иммунотерапии. Одним из перспективных подходов к активации терапевтического T-клеточного иммунного ответа является блокада этих иммунных контрольных точек (Pardoll, 2012). Иммунные контрольные точки представляют значительные препятствия для активации функционального клеточного иммунитета при раке, и антагонистические антитела, специфичные для ингибирующих лигандов на T-клетках, включая CTLA4 и белок программируемой смерти-1 (PD-1), являются примерами направленных средств, исследуемых в клиниках.
Антиген 4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA-4; также известный как CD152) снижает амплитуду активации T-клеток, и было показано, что лечение с помощью антагониста антител к CTLA4 (ипилимумаба) дает эффект выживаемости пациентов с меланомой (Robert and Mateus, 2011). Белок программируемой клеточной смерти 1 (PD1 или PDCD1, также известный как CD279) представляет собой другую очень перспективную мишень для иммунотерапии (Pardoll and Drake, 2012; Pardoll, 2012). В отличие от CTLA-4, PD1 ограничивает T-клеточные эффекторные функции в периферической ткани в момент воспалительного ответа на инфекцию и для ограничения аутоиммунитета. Первое клиническое испытание антитела PD1 продемонстрировало несколько случаев регрессии опухоли (Brahmer, Drake et al., 2010). Многие дополнительные белки иммунных контрольных точек, судя по недавним исследованиям, представляют собой перспективные мишени для терапевтической блокады.
В нормальных T-клетках T-клеточные рецепторы получаются из рецепторов пре-T-клеток (pTCR), которые экспрессируются незрелыми тимоцитами и имеют решающее значение для развития Т-клеток из двойной отрицательной (CD4- CD8-) в двойную положительную (CD4+ CD8+) стадии. Пре-T-клетки, которые успешно прошли продуктивные реаранжировки локуса TCR-бета, экспрессируют функциональную цепь TCR-бета, которая образует пару с инвариантной цепью preT-альфа и сигнальными компонентами CD3 с образованием комплекса пре-TCR. Экспрессия пре-TCR на клеточной поверхности является необходимой для запуска бета-селекции, процесса, который индуцирует размножение развивающихся T-клеток, обеспечивает аллельное исключение локуса TCR-бета и приводит к индукции реаранжировок в локусе TCR-альфа (von Boehmer, 2005). После продуктивных реаранжировок TCR-альфа и замещения pT-альфа на TCR-альфа с образованием зрелых TCR, тимоциты подвергаются второй стадии селекции, называемой положительной или TCR-альфа/бета селекцией при связывании комплексов аутопептида и MHC, экспрессированных на эпителиальных клетках тимуса. Таким образом, зрелые T-клетки распознают и отвечают на комплекс антиген/MHC посредством своих TCR. Наиболее непосредственным следствием активации TCR является инициирование сигнальных путей посредством связанных CD3-субъединиц, которые приводят к нескольким событиям, включая клональное размножение T-клеток, повышающую регуляцию активации маркеров на клеточной поверхности и индукцию цитотоксичности или секрецию цитокинов.
Благодаря характеру селекции цепей TCR-бета посредством образования пары с preT-альфа во время развития в тимусе в T-клетках, в которых TCR-альфа была инактивирована, гетерологичное введение трансгена pT-альфа может приводить к образованию пре-TCR. Этот pTCR может служить в качестве средства активации или стимуляции Т-клеток таким образом, который не является зависимым от MHC, тем самым позволяя, например, непрерывное размножение альфа/бета T-клеток после инактивации TCR-альфа. Важно отметить, что комплекс pTCR демонстрирует такой же биохимический состав, что и TCR, в отношении связанных CD3-субъединиц (Carrasco, Ramiro et al., 2001). Кроме того, в отличие от TCR, сигнализация пре-TCR может происходить частично в связи с независимыми от лигандов событиями. Кристаллическая структура внеклеточного домена pTCR обеспечивает структурную основу для возможной независимости сигнализации pTCR от лигандов. Было показано, что pTCR образует димер голова к хвосту, в котором связаны два гетеродимера pT-альфа-TCR-бета (Pang, Berry et al., 2010).
В контексте разработки сконструированных иммунных клеток терапевтического качества, которые могут быть направлены на злокачественные или инфицированные клетки, изобретатели стремились к улучшенным архитектурам CAR, который были бы близки к природным и, вероятно, вели бы себя соответственно, используя любые внеклеточные моно- или мультиспецифические лигандсвязывающие домены.
В результате, авторы разработали новое поколение CAR, использующих отдельные полипептидные субъединицы в соответствии с настоящим изобретением, именуемых "многоцепочечные CAR".
Сущность изобретения
Химерные антигенные рецепторы (CAR) в предшествующем уровне техники присутствуют в виде одиночных молекул слияния, которые требуют последовательного присоединения сигнальных доменов. Однако, удаление сигнальных доменов из их природного околомембранного положения препятствует их функции. Таким образом, чтобы преодолеть этот недостаток, изобретатели смогли сконструировать так называемые многоцепочечные CAR, которые делают возможным околомембранное положение всех соответствующих сигнальных доменов. В многоцепочечных CAR сигнальные домены помещены на различных полипептидных цепях, так что они размещены в околомембранных положениях. Например, многоцепочечный CAR может быть получен из FcεRI посредством замены высокоаффинного IgE-связывающего домена альфа-цепи FcεRI на внеклеточный лигандсвязывающий домен, такой как scFv, в то время как N- и/или C-концевые хвосты бета- и/или гамма-цепи FcεRI используются для помещения передающего сигнал домена в нормальные околомембранные положения. Внеклеточный лигандсвязывающий домен выполняет задачу перенаправления специфичности T-клеток в направлении клеток-мишеней, тогда как передающие сигнал домены, оставленные в околомембранных положениях, активируют иммунный клеточный ответ.
Тот факт, что сигнальные домены в околомембранном положении присутствуют на полипептиде(ах), отличающемся от несущего внеклеточный лигандсвязывающий домен, обеспечивает более гибкую архитектуру для CAR. Соответственно, дополнительные сигнальные домены или костимулирующие домены могут быть присоединены или отсоединены от CAR в зависимости от интенсивности взаимодействия, наблюдаемого между лигандсвязывающим доменом CAR и его рецептором. Такая гибкость в архитектуре CAR также позволяет вводить дополнительный внеклеточный лигандсвязывающий домен(ы). Это может быть сделано путем слияния второго лигандсвязывающего домена с полипептидом, несущим первый лигандсвязывающий домен, или путем введения дополнительных внеклеточных лигандсвязывающих доменов. Если данный второй лигандсвязывающий домен имеет другую специфичность, это образует биспецифический многоцепочечный CAR, а если имеют место дополнительные специфичности, то мультиспецифический многоцепочечный CAR. Это особенно выгодно с точки зрения нацеливания на заданные клетку или вирус, несущие два или более различных рецептора, присутствующих на их поверхности. Это увеличивает специфичность такого многоцепочечного CAR в направлении указанных клетки или вируса. С другой стороны, количество сигнальных доменов может позволять модуляцию сигнала в соответствии с различными связывающими доменами. Кроме того, каждый рекомбинантный полипептид, образующий CAR, может быть экспрессирован независимо с различными уровнями экспрессии для дополнительной модуляции активности CAR.
Настоящее изобретение относится к данной новой архитектуре CAR, к рекомбинантным полинуклеотидам, кодирующим их, а также к способам конструирования иммунных клеток для специфичного распознавания клеток, какими бы ни были цель и природа иммунных клеток.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает способы получения таких иммунных клеток, более подходящих для целей иммунотерапии.
Например, иммунные клетки могут быть дополнительно сконструированы так, чтобы быть неаллореактивными и/или резистентными к иммуносупрессивным средствам, в частности, посредством инактивации генов TCR-альфа или бета в первичных клетках и/или посредством соединения инактивации генов, кодирующих мишени для различных иммуносупрессивных средств, в частности, CD52 и GR (глюкокортикоидных рецепторов), и последующей селекции клеток, устойчивых к упомянутым иммуносупрессивным средствам.
В дополнение к вышеуказанной концепции генетически модифицированных иммунных клеток настоящее изобретение также относится к вариантам осуществления, в которых иммунные клетки конструируют так, чтобы позволять пролиферацию, когда TCR-альфа инактивирована, например, путем временной экспрессии preT-альфа в клетках, посредством чего восстанавливается функциональный комплекс CD3 в отсутствие функциональной альфа/бета-TCR.
Для того, чтобы сконструировать генетически высоко активные модифицированные иммунные клетки, изобретение также предлагает способы, в которых иммунные контрольные точки блокированы недостаточной экспрессией генов, таких как PD1 и CTLA-4.
Настоящая заявка дополнительно раскрывает сконструированные иммунные клетки, в частности, T-клетки, для применения в качестве лекарственного средства, более конкретно, для лечения или профилактики злокачественных опухолей посредством введения таких иммунных клеток в живой организм.
Краткое описание фигур и таблиц
В дополнение к вышеуказанным признакам изобретение дополнительно содержит другие признаки, которые будут следовать из следующего описания, а также из прилагаемых чертежей. Более полное понимание настоящего изобретения и многих его сопутствующих преимуществ будет легко получено, поскольку оно станет более понятным с помощью ссылки на следующие фигуры в сочетании с подробным описанием ниже.
Фигура 1: Схематическое представление нормального отношения между T-клетками и антиген-презентирующей клеткой.
Фигура 2: Схематическое представление генетически модифицированных терапевтических T-клеток в соответствии с настоящим изобретением и опухолевых клеток пациента.
Фигура 3: Схематическое представление многоцепочечного CAR.
Фигура 4: Схема различных вариантов многоцепочечных CAR. A. Схема рецептора FcεRI. B-C. Различные варианты многоцепочечных CAR (от csm1 до csm10), содержащие scFv и участок в виде ножки CD8, слитый с трансмембранным доменом альфа-цепи FcεRI. По меньшей мере один из доменов 41BB, CD28 и/или CD3-дзета может быть слит с FcεRI-альфа, бета и/или гамма-цепью.
Фигура 5: Схематическое представление одного примера способа получения аллогенных клеток человека способами генной инженерии для иммунной терапии.
Фигура 6: Концентрация в клетках на миллилитр живых CD52-положительных или CD52-отрицательных клеток после лечения с помощью анти-CD52 антитела (CAMPATH1-H) с комплементом или контролем.
Фигура 7: Сравнение распределения прямого светорассеяния (FSC), индикатора размера клеток, между TCR-положительными и TCR-отрицательными клетками или между CD52-положительными и CD52-отрицательными клетками и не активированными клетками в качестве контроля.
Фигура 8: Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии CD107a (маркер дегрануляции) на целевых инактивированных по CD52 и TCR-альфа T-клетках. Экспрессию CD107 анализировали на CD52+TCRαβ+ клетках (первая колонка), CD52-TCRαβ- клетках (вторая колонка), CD52-TCRαβ+ клетках (третья колонка) и CD52+TCRαβ- клетках (четвертая колонка) перед (A) и после инкубации с клетками Дауди (B); C) представляет анализ с помощью проточной цитометрии T-клеток, дополнительно трансфицированных CAR и инкубированных с клетками Дауди; D) представляет анализ с помощью проточной цитометрии T-клеток, трансфицированных CAR, но не инкубированных с клетками Дауди, и E) представляет анализ с помощью проточной цитометрии T-клеток, трансфицированных CAR и обработанных PMA/иономицином (положительный контроль).
Фигура 9: Анализ с помощью глубокого секвенирования потенциальных мишеней вне сайта TALE-нуклеаз CD52 и TRAC. Фигура 9 раскрывает последовательности "левой полумишени" как SEQ ID NO:149-165 и последовательности "правой полумишени" как SEQ ID NO:166-182, все, соответственно, в порядке изображения.
Фигура 10: Анализ геномного локуса PDCD1 и CTLA-4 посредством T7-эндонуклеазного анализа. Стрелки показывают на расщепленные продукты ПЦР.
Фигура 11: Схематическое представление некоторых примеров конструктов preT-альфа.
Фигура 12: Анализ с помощью проточной цитометрии эффективности трансдукции (% BFP+ клеток) и активность конструктов FL, Δ18, Δ48 pT-альфа (% поверхностной экспрессии CD3) в TCR-альфа-инактивированных клетках Jurkat.
Фигура 13: Схематическое представление лентивирусного конструкта, кодирующего белок pT-альфа (пре-TCRα).
Фигура 14: A. Изображение экспериментального протокола. B. Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии TCR-альфа/бета, CD3 и экспрессии BFP на TCR-альфа-инактивированных T-клетках (KO), трансдуцированных или BFP-2A-pT-альфа-Δ48 (KO/Δ48), или контрольным лентивирусным вектором BFP (KO/BFP), до и после очистки. C. Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии TCR-альфа/бета и CD3 на очищенных TCR-альфа-инактивированных клетках, трансдуцированных (BFPpos) или не трансдуцированных (BFPneg) лентивирусным вектором BFP-2A-pT-альфа-Δ48. NEP представляет не электропорированные клетки с TRAC-TALE-нуклеазами.
Фигура 15: A-B. Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии маркера ранней активации CD69 (A), маркера поздней активации CD25 (B) через 24 и 48 часов после реактивации с помощью гранул с анти-CD3/CD28, соответственно, на не электропорированных клетках (NEP) и TCR-альфа-инактивированных клетках (KO), трансдуцированных лентивирусным вектором BFP-2A-pΤα-Δ48 (pΤα-Δ48), лентивирусным вектором BFP-2A-pΤα-Δ48.41BB (pΤα-Δ48.ΒΒ) или контрольным вектором BFP (BFP). Гистограммы pΤα-Δ48 соответствуют сигналу, детектируемому в TCR-инактивированных клетках, экспрессирующих pΤα-Δ48 (BFP+ клетки), тогда как гистограммы KO соответствуют TCR-альфа-инактивированным клеткам, которые не экспрессируют pΤα-Δ48 (BFP- клетки). Гистограммы pΤα-Δ48.ΒΒ соответствуют сигналу, детектируемому в TCR-инактивированных клетках, экспрессирующих pΤα-Δ48.41ΒΒ (BFP+ клетки), тогда как гистограммы KO соответствуют TCR-альфа-инактивированным клеткам, которые не экспрессируют pΤα-Δ48.41ΒΒ (BFP-клетки). Гистограммы NEP (не электропорированные) соответствуют сигналу, детектируемому в неинженерных клетках. C. Анализ с помощью проточной цитометрии размера клеток через 72 часа после реактивации с помощью гранул с анти-CD3/CD28 на не электропорированных клетках (NEP) и TCR-альфа-инактивированных клетках (KO), трансдуцированных лентивирусным вектором BFP-2A-pΤα-Δ48 (pΤα-Δ48), лентивирусным вектором BFP-2A-pΤα-Δ48.41BB (pΤα-Δ48.ΒΒ) или контрольным вектором BFP (BFP). Значения, указанные в верхней части каждого графика, соответствуют среднему геометрическому флуоресценции каждой популяции.
Фигура 16: Анализ клеточного роста TCR-альфа-инактивированных клеток (KO), трансдуцированных pT-альфа-Δ48 (pTaΔ48) или контрольным вектором BFP (BFP), выдерживаемых в IL2 или в IL2 с гранулами анти-CD3/CD28, в различных временных точках (ось x). Количество BFP+ клеток определяли в различных временных точках для каждого варианта и определяли, во сколько раз изменится индукция данных клеток (ось y) по отношению к значению, полученному на день 2 после реактивации. Результаты получали с двумя независимыми донорами. Для второго донора клеточный рост также определяли для клеток, трансдуцированных pT-альфа-Δ48.41BB (pΤα-Δ48.BB) и полноразмерным pT-альфа (pΤα-FL).
Фигура 17: Анализ с помощью проточной цитометрии GFP-положительных клеток на PBMC, электропорированных с помощью пяти различных программ CytoPulse. A. NEP, EP#1 (GFP) и EP#2 (GFP); B. EP#3 (pUC), EP#4 (GFP) и EP#5 (GFP). Верхняя линия соответствует трансфекции 6×106 клеток на кювету, в то время как нижняя линия соответствует трансфекции 3×106 клеток на кювету.
Фигура 18: Анализ с помощью проточной цитометрии смертности очищенных T-клеток с помощью красителя для определения жизнеспособности (eFluor-450) и GFP-положительных клеток среди жизнеспособной популяции после электропорации мРНК GFP, ДНК GFP и контрольной ДНК pUC. A. NT и NEP; B. EP (нет ДНК) и ДНК GFP; C. ДНК pUC и мРНК GFP. NEP соответствует клеткам, которые выдерживали в буфере для электропорации, но не электропорировали, и NT соответствует не электропорированным клеткам, выдерживаемым в культуральной среде.
Фигура 19: Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии TCR-альфа/бета и CD3 на первичных T-клетках человека после электропорации мРНК TRAC-TALE-нуклеазы (сверху). Анализ с помощью глубокого секвенирования геномной ДНК, экстрагированной из первичных T-клеток человека после электропорации мРНК TRAC-TALE-нуклеазы (снизу) (SEQ ID NO:183-192, соответственно, в порядке изображения).
Фигура 20: A. Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии CAR (анти-F(ab')2) после электропорации T-клеток с или без мРНК, кодирующей одноцепочечный CAR. B. Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии CD107a (маркер дегрануляции) на электропорированных T-клетках, совместно культивированных с клетками Дауди.
Фигура 21: A. Изображение мРНК, кодирующей многоцепочечный CAR. B. Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии CAR (анти-F(ab')2) на жизнеспособных T-клетках, электропорированных с или без полицистронной мРНК, кодирующей многоцепочечный CAR. C. Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии CD107a (маркер дегрануляции) на электропорированных T-клетках, совместно культивированных с клетками Дауди.
Фигура 22: Экспрессия многоцепочечных CAR в T-клетках человека после электропорации полицистронных мРНК.
Фигура 23: Экспрессия мультисубъединичных CAR обусловливается экспрессией трех цепей: α, β и γ.
Фигура 24: T-клетки человека, временно экспрессирующие многоцепочечные CAR, подвергаются дегрануляции после совместного культивирования с клетками-мишенями.
Фигура 25: T-клетки человека, временно экспрессирующие многоцепочечные CAR, секретируют цитокины после совместного культивирования с клетками-мишенями.
Фигура 26: T-клетки человека, временно экспрессирующие многоцепочечные CAR, лизируют клетки-мишени.
Таблица 1: Описание GR-TALE-нуклеаз и последовательности сайтов-мишеней TALE-нуклеаз в гене GR человека.
Таблица 2: Расщепляющая активность GR-TALE-нуклеаз в дрожжах. Значения лежат между 0 и 1. Максимальное значение составляет 1.
Таблица 3: Процентная доля направленного мутагенеза в сайтах-мишенях эндогенных TALE-нуклеаз в клетках 293.
Таблица 4: Процентная доля направленного мутагенеза в сайтах-мишенях эндогенных TALE-нуклеаз в первичных T-лимфоцитах.
Таблица 5: Описание TALE-нуклеаз CD52, TRAC и TRBC и последовательности сайтов-мишеней TALE-нуклеаз в соответствующих генах человека.
Таблица 6: Дополнительные последовательности-мишени для TALE-нуклеаз TRAC и CD52.
Таблица 7: Процентная доля вставок-делеций для TALE-нуклеазы, нацеленной на мишени CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 и TRBC_T02.
Таблица 8: Процентные доли CD52-отрицательных, TCR-отрицательных и CD52/TCR-двойных отрицательных T-лимфоцитов после трансфекции соответствующих экспрессирующих TALE-нуклеазу полинуклеотидов.
Таблица 9: Процентные доли TCR-отрицательных T-лимфоцитов после трансфекции экспрессирующих TRBC-TALE-нуклеазу полинуклеотидов.
Таблица 10: Описание TALE-нуклеаз CTLA4 и PDCD1 и последовательности сайтов-мишеней TALE-нуклеаз в соответствующих генах человека.
Таблица 11: Описание выборки конструктов pT-альфа.
Таблица 12: Активность различных конструктов pT-альфа в TCR-альфа-инактивированных клетках Jurkat. Активность измеряли посредством анализа с помощью проточной цитометрии экспрессии CD3 на TCR-альфа-инактивированных клетках Jurkat, трансфицированных различными конструктами preT-альфа.
Таблица 13: Различные программы CytoPulse, использованные для определения минимального напряжения, требуемого для электропорации в происходящих от PBMC T-клетках.
Таблица 14: Программа CytoPulse, использованная для электропорации очищенных T-клеток.
Таблица 15: Описание составов цепей FcR вариантов многоцепочечных CAR.
Подробное описание изобретения
Если специально не определено в настоящем документе, все используемые технические и научные термины имеют то значение, которое обычно понимается специалистом в областях генной терапии, биохимии, генетики и молекулярной биологии.
Все способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут быть использованы в осуществлении на практике или тестировании настоящего изобретения, причем подходящие способы и материалы описаны в настоящем документе. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, указанные в настоящем документе, включены в качестве ссылки во всей их полноте. В случае конфликта, настоящее описание изобретения, включая определения, будет иметь преимущество. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения, если не указано иное.
Осуществление настоящего изобретения на практике будет использовать, если не указано иное, обычные методы клеточной биологии, клеточной культуры, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе. См., например, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, США); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., патент США № 4683195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); серия Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), особенно тома 154 и 155 (Wu et al. eds.) и том 185 "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); и Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Многоцепочечный химерный антигенный рецептор (CAR)
Настоящее изобретение относится к многоцепочечному химерному антигенному рецептору (CAR), в частности, к приспособленному к иммунным клеткам, применяемым в иммунотерапии.
Многоцепочечный CAR в соответствии с настоящим изобретением обычно содержит по меньшей мере:
- один трансмембранный полипептид, содержащий по меньшей мере один внеклеточный лигандсвязывающий домен и;
- один трансмембранный полипептид, содержащий по меньшей мере один передающий сигнал домен;
так что указанные полипептиды собирают вместе с образованием многоцепочечного химерного антигенного рецептора.
Термин "внеклеточный лигандсвязывающий домен", как используется в настоящем документе, определяется как олиго- или полипептид, который способен к связыванию с лигандом. Предпочтительно, данный домен будет способен к взаимодействию с молекулой клеточной поверхности. Например, внеклеточный лигандсвязывающий домен может быть выбран для распознавания лиганда, который действует в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, связанных с конкретным состоянием заболевания. Таким образом, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут действовать как лиганды, включают связанные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками. В частности, внеклеточный лигандсвязывающий домен может содержать антигенсвязывающий домен, происходящий от антитела против антигена мишени. В качестве неограничивающих примеров, антиген мишени может представлять собой опухолеассоциированный поверхностный антиген, такой как ErbB2 (HER2/neu), карциноэмбриональный антиген (CEA), молекула адгезии эпителиальных клеток (EpCAM), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), EGFR вариант III (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, дисиалоганглиозид GD2, дуктально-эпителиальный муцин, gp36, TAG-72, гликосфинголипиды, глиома-ассоциированный антиген, β-хорионический гонадотропин человека, альфафетопротеин (AFP), лектин-реактивный AFP, тиреоглобулин, RAGE-1, MN-CA IX, обратная транскриптаза теломеразы человека, RU1, RU2 (AS), кишечная карбоксилэстераза, mut hsp70-2, M-CSF, простаза, простатический специфический антиген (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, простеин, PSMA, выживание и теломераза, опухолевый антиген-1 карциномы простаты (PCTA-1), MAGE, ELF2M, нейтрофил-эластаза, эфрин B2, CD22, инсулиноподобный фактор роста (IGF1)-I, IGF-II, рецептор IGFI, мезотелин, молекула главного комплекса гистосовместимости (MHC), презентирующая эпитоп опухолеспецифического пептида, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, опухолевые стромальные антигены, экстра домен A (EDA) и экстра домен B (EDB) фибронектина, и домен A1 тенасцина-C (TnC A1), и связанный с фибробластами белок (fap); линиеспецифический или тканеспецифический антиген, такой как CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), эндоглин, молекула главного комплекса гистосовместимости (MHC), BCMA (CD269, TNFRSF 17), или вирусоспецифический поверхностный антиген, такой как ВИЧ-специфический антиген (такой как HIV gp120); EBV-специфический антиген, CMV-специфический антиген, HPV-специфический антиген, специфический к вирусу Ласса антиген, специфический к вирусу гриппа антиген, а также любое производное или вариант этих поверхностных маркеров.
Внеклеточный лигандсвязывающий домен может также содержать пептид, связывающий антиген мишени, пептид или белок, связывающий антитело, которое связывает антиген мишени, пептидный или белковый лиганд, такой как фактор роста, цитокин или гормон в качестве неограничивающих примеров, связывающий рецептор на мишени, или домен, происходящий от рецептора, такого как рецептор фактора роста, цитокиновый рецептор или рецептор гормона в качестве неограничивающих примеров, связывающий пептидный или белковый лиганд на мишени. Предпочтительно, мишень представляет собой клетку или вирус.
В предпочтительном варианте осуществления указанный внеклеточный лигандсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), содержащий легкий (VL) и тяжелый (VH) вариабельный фрагмент специфического к антигену мишени моноклонального антитела, соединенные гибким линкером. В предпочтительном варианте осуществления указанный scFv представляет собой анти-CD19 scFV, предпочтительно, scFV-4G7 (Peipp et al., J Immunol Methods., 2004, Feb 15;285(2):265-80) (VH: SEQ ID NO:193 и VL: SEQ ID NO:194, scFV: SEQ ID NO:195).
Можно также использовать связывающий домен, отличный от scFv, для заранее определенного нацеливания на лимфоциты, такой как фрагменты однодоменных антител верблюда или лиганды рецепторов, такие как полипептид фактор роста сосудистого эндотелия, интегрин-связывающий пептид, херегулин или мутеин IL-13, антителосвязывающие домены, гипервариабельные петли или CDR антител в качестве неограничивающих примеров.
В предпочтительном варианте осуществления указанный трансмембранный полипептид дополнительно содержит участок в виде ножки между упомянутым внеклеточным лигандсвязывающим доменом и упомянутым трансмембранным доменом. Термин "участок в виде ножки", используемый в настоящем документе, в общем означает любой олиго- или полипептид, который функционирует так, чтобы связывать трансмембранный домен с внеклеточным лигандсвязывающим доменом. В частности, участок в виде ножки используют для обеспечения большей гибкости и доступности для внеклеточного лигандсвязывающего домена. Участок в виде ножки может содержать вплоть до 300 аминокислот, предпочтительно, от 10 до 100 аминокислот и, наиболее предпочтительно, от 25 до 50 аминокислот. Участок в виде ножки может быть получен из всей или части природной молекулы, как, например, из всего или части внеклеточного участка CD8, CD4 или CD28 или из всего или части константного участка антитела. Альтернативно, участок в виде ножки может представлять собой синтетическую последовательность, которая соответствует природной последовательности ножки, или может представлять собой полностью синтетическую последовательность ножки. В предпочтительном варианте осуществления указанный участок в виде ножки является частью альфа-цепи CD8 человека (например, NP_001139345.1) (SEQ ID NO:196).
Таким образом, экспрессия многоцепочечного CAR в иммунных клетках приводит к модифицированным клеткам, которые селективно элиминируют определенные мишени, включая, но без ограничения, злокачественные клетки, несущие соответствующий опухолеассоциированный поверхностный антиген, или инфицированные вирусом клетки, несущий вирусоспецифический поверхностный антиген, или клетки-мишени, несущие линиеспецифический или тканеспецифический поверхностный антиген.
Обычно в злокачественных клетках наблюдается понижающая регуляция или мутация антигенов мишени, создающая варианты ускользания благодаря потере антигенов. Таким образом, для компенсации ускользания опухоли и придания иммунной клетке большей специфичности к мишени многоцепочечный CAR может содержать несколько внеклеточных лигандсвязывающих доменов для одновременного связывания различных элементов в мишени, посредством этого увеличивая активацию и функционирование иммунных клеток. В одном из вариантов осуществления внеклеточные лигандсвязывающие домены могут быть размещены в тандеме на одном трансмембранном полипептиде и, необязательно, могут быть разделены с помощью линкера. В другом варианте осуществления указанные различные внеклеточные лигандсвязывающие домены могут быть размещены на различных трансмембранных полипептидах, составляя многоцепочечный CAR. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к популяции многоцепочечных CAR, причем все они содержат различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения иммунных клеток способом генной инженерии, включающему наличие иммунной клетки и экспрессию на поверхности указанной клетки популяции многоцепочечных CAR, причем все они содержат различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения иммунной клетки способами генной инженерии, включающему наличие иммунной клетки и введение в указанную клетку полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, составляющие популяцию многоцепочечных CAR, причем все они содержат различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В конкретном варианте осуществления способ получения иммунной клетки способами генной инженерии включает экспрессию на поверхности клетки по меньшей мере части бета и/или гамма-цепи FcεRI, слитой с передающим сигнал доменом, и нескольких частей альфа-цепей FcsRI, слитых с различными внеклеточными лигандсвязывающими доменами. В более конкретном варианте осуществления указанный способ включает введение в указанную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида, который кодирует часть бета и/или гамма-цепи FcsRI, слитой с передающим сигнал доменом, и несколько альфа-цепей FcεRI, слитых с различными внеклеточными лигандсвязывающими доменами. Под популяцией многоцепочечных CAR имеется в виду по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть или больше многоцепочечных CAR, причем все они содержат различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. Различные внеклеточные лигандсвязывающие домены в соответствии с настоящим изобретением могут, предпочтительно, одновременно связывать различные элементы в мишени, посредством этого увеличивая активацию и функционирование иммунных клеток.
Настоящее изобретение также относится к выделенной иммунной клетке, которая содержит популяцию многоцепочечных CAR, причем все они содержат различные внеклеточные лигандсвязывающие домены.
Передающий сигнал домен или внутриклеточный сигнальный домен многоцепочечного CAR по настоящему изобретению отвечает за внутриклеточную сигнализацию после связывания внеклеточного лигандсвязывающего домена с мишенью, что приводит к активации иммунной клетки и иммунному ответу. Другими словами, передающий сигнал домен отвечает за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которой экспрессируется многоцепочечный CAR. Например, эффекторная функция T-клетки может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин "передающий сигнал домен" относится к части белка, которая передает сигнал эффекторной сигнальной функции и направляет клетку к выполнению специализированной функции.
Предпочтительные примеры передающего сигнал домена для использования в многоцепочечном CAR могут представлять собой цитоплазматические последовательности Fc-рецептора или T-клеточного рецептора и корецепторов, которые действуют согласованно, чтобы инициировать передачу сигнала после контакта антигенного рецептора, а также любое производное или вариант данных последовательностей и любую синтетическую последовательность, которая обладает той же функциональной способностью. Передающий сигнал домен содержит два различных класса цитоплазматической сигнальной последовательности, те, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию, и те, которые действуют антиген-независимым образом для обеспечения вторичного или костимулирующего сигнала. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность может содержать сигнальные мотивы, который известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы ITAM. ITAM представляют собой хорошо определенные сигнальные мотивы, обнаруженные во внутрицитоплазматическом хвосте множества рецепторов, которые служат в качестве сайтов связывания для тирозинкиназ класса syk/zap70. Примеры ITAM, используемых в настоящем изобретении, могут включать в качестве неограничивающих примеров происходящие от TCR-дзета, FcR-гамма, FcR-бета, FcR-эпсилон, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В предпочтительном варианте осуществления передающий сигнал домен многоцепочечного CAR может содержать сигнальный домен CD3-дзета или внутрицитоплазматический домен бета или гамма-цепей FcεRI.
В конкретном варианте осуществления передающий сигнал домен многоцепочечного CAR по настоящему изобретению содержит костимулирующую сигнальную молекулу. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая требуется для эффективного иммунного ответа. "Костимулирующий лиганд" обозначает молекулу на антиген-презентирующей клетке, которая специфически связывает распознанную костимулирующую молекулу на T-клетке, посредством этого обеспечивая сигнал, который, в дополнение к первичному сигналу, обеспечиваемому, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой MHC, нагруженной пептидом, опосредует T-клеточный ответ, включая, но без ограничения, активацию пролиферации, дифференцировку и тому подобное. Костимулирующий лиганд может включать, но без ограничения, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, рецептор лимфотоксина-бета, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, которое связывает рецептор толл-лиганда, и лиганд, который специфически связывается с B7-H3. Костимулирующий лиганд также охватывает, в числе прочего, антитело, которое специфически связывается с костимулирующей молекулой, присутствующей на T-клетке, такой как, но без ограничения, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, функционально-связанный антиген-1 лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83.
"Костимулирующая молекула" обозначает распознанного партнера по связыванию на T-клетке, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, тем самым опосредуя костимулирующий ответ клетки, такой как, но без ограничения, пролиферация. Костимулирующие молекулы включают, но без ограничения, молекулу MHC класса I, BTLA и рецептор толл-лиганда. Примеры костимулирующих молекул включают CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, функционально-связанный антиген-1 лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 и лиганд, который специфически связывается с CD83, и тому подобное.
В другом конкретном варианте осуществления указанный передающий сигнал домен представляет собой связывающие мотивы TNFR-ассоциированного фактора 2 (TRAF2), внутрицитоплазматический хвост костимулирующего члена семейства TNFR. Цитоплазматический хвост костимулирующего члена семейства TNFR содержит связывающие мотивы TRAF2, состоящие из основного консервативного мотива (P/S/A)X(Q/E)E) или минорного мотива (PXQXXD), где X представляет собой любую аминокислоту. Белки TRAF рекрутируются во внутриклеточные хвосты многих TNFR в ответ на тримеризацию рецептора.
В предпочтительном варианте осуществления домен передачи сигнала многоцепочечного CAR по настоящему изобретению содержит часть костимулирующей сигнальной молекулы, выбранной из группы, состоящей из 4-1BB (GenBank: AAA53133) и CD28 (NP_006130.1). В частности, домен передачи сигнала многоцепочечного CAR по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:200 и SEQ ID NO:201.
Отличительные признаки соответствующих трансмембранных полипептидов включают способность к экспрессии на поверхности иммунной клетки, в частности, клетках лимфоцитов или клетках природных киллеров (NK), и к совместному действию для направления клеточного ответа иммунной клетки против заранее определенной клетки-мишени. Различные трансмембранные полипептиды многоцепочечного CAR по настоящему изобретению, содержащие внеклеточный лигандсвязывающий домен и/или передающий сигнал домен, совместно действуют для участия в передаче сигнала после связывания с целевым лигандом и индуцируют иммунный ответ. Трансмембранный домен может происходить или из природного, или из синтетического источника. Трансмембранный домен может происходить от любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. В качестве неограничивающих примеров, трансмембранный полипептид может представлять собой субъединицу T-клеточного рецептора, такую как α, β, γ или δ, полипептид, образующий комплекс CD3, p55 (α-цепь), p75 (β-цепь) или γ-цепь IL2-рецептора, субъединичную цепь Fc-рецепторов, в частности, Fcγ рецептор III или CD-белки. Альтернативно, трансмембранный домен может быть синтетическим и может содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В предпочтительном варианте осуществления трансмембранный полипептид, происходящий от цепей рецептора Fcε или их варианта, содержит, в частности, часть цепей α (SEQ ID NO:202), β (SEQ ID NO:203) и/или γ (SEQ ID NO:204) FcεRI или их вариант.
Термин "происходящий от" обозначает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая эквивалентна последовательности рецептора Fcε, которая включают одну или несколько аминокислотных модификаций последовательности рецептора Fcε. Такая аминокислотная модификация(и) может включать аминокислотную замену(ы), удаление(я), добавление(я) или комбинацию любых таких модификаций, и может изменять биологическую активность связывающего участка Fc по отношению к Fc-рецептору. С другой стороны, связывающие участки Fc, происходящие от конкретного Fc-рецептора, могут включать одну или несколько аминокислотных модификаций, которые по существу не изменяют биологическую активность связывающего участка Fc по отношению к Fc-рецептору. Аминокислотная модификация(и) такого типа, как правило, содержит замену(ы) консервативной аминокислоты.
В конкретном варианте осуществления многоцепочечный CAR содержит трансмембранный полипептид, происходящий от цепи FcεRI. В более специальном варианте осуществления FcεRI цепь представляет собой α-цепь FcεRI, в которой внеклеточный домен заменен внеклеточным лигандсвязывающим доменом, предпочтительно scFV, более предпочтительно scFv-4G7 (SEQ ID NO:195).
В более специальном варианте осуществления указанный многоцепочечный CAR может содержать часть альфа-цепи FcεRI и часть бета-цепи FcεRI или их вариант, так что указанные цепи FcεRI спонтанно димеризуются вместе с образованием димерного химерного антигенного рецептора. В другом варианте осуществления многоцепочечный химерный антиген может содержать часть альфа-цепи FcεRI и часть гамма-цепи FcεRI или их вариант, так что указанные цепи FcεRI спонтанно тримеризуются вместе с образованием тримерного химерного антигенного рецептора, и в другом варианте осуществления многоцепочечный химерный антигенный рецептор может содержать часть альфа-цепи FcεRI, часть бета-цепи FcεRI и часть гамма-цепи FcεRI или их варианты, так что указанные цепи FcεRI спонтанно тетрамеризуются вместе с образованием тетрамерного химерного антигенного рецептора.
Другими словами, многоцепочечный CAR, содержащий по меньшей мере два из следующих компонентов:
a) один полипептид, содержащий часть альфа-цепи FcεRI и внеклеточный лигандсвязывающий домен,
b) один полипептид, содержащий часть бета-цепи FcεRI, и/или
c) один полипептид, содержащий часть гамма-цепь FcεRI, в результате чего различные полипептиды мультимеризуются вместе спонтанно с образованием димерного, тримерного или тетрамерного CAR.
В предпочтительном варианте осуществления многоцепочечный CAR по настоящему изобретению содержит часть полипептида с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из от SEQ ID NO:202 до SEQ ID NO:204.
Термин "часть", используемый в настоящем документе, относится к любому сокращенному варианту молекулы, который представляет собой более короткий пептид. Альтернативно, функциональные варианты аминокислотной последовательности полипептида могут быть получены посредством мутаций в ДНК, которая кодирует полипептид. Такие варианты или функциональные варианты включают, например, удаления, или вставки, или замены остатков в аминокислотной последовательности. Любая комбинация удаления, вставки и замены может также приводить к конечному конструкту, при условии, что конечный конструкт обладает желаемой активностью, в частности, проявляет специфическую клеточную иммунную активность против мишени. Функциональность многоцепочечного CAR по настоящему изобретению в клетке-хозяине может быть детектирована в анализе, подходящем для демонстрации сигнального потенциала указанного многоцепочечного CAR после связывания конкретной мишени. Такие анализы доступны специалисту в данной области. Например, данный анализ позволяет детектировать сигнальный путь, запускаемый при связывании мишени, как, например, анализ, включающий измерение повышения высвобождения ионов кальция, внутриклеточного фосфорилирования тирозина, оборота инозитолфосфата или производства интерлейкина (IL) 2, интерферона-γ, GM-CSF, IL-3, IL-4, вызываемых при этом.
В качестве неограничивающего примера, различные варианты многоцепочечного CAR проиллюстрированы на фигуре 4. В более предпочтительном варианте осуществления многоцепочечный CAR по настоящему изобретению содержит полипептид с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из от SEQ ID NO:206 до SEQ ID NO:213. В предпочтительном варианте осуществления многоцепочечный CAR содержит полипептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из от SEQ ID NO:206 до SEQ ID NO:213.
Полинуклеотиды, векторы:
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, векторам, кодирующим вышеописанный многоцепочечный CAR в соответствии с настоящим изобретением. Настоящее изобретение предлагает полинуклеотиды, включая молекулы ДНК и РНК, которые кодируют трансмембранные полипептиды, раскрытые в настоящем документе, которые могут быть включены в многоцепочечный CAR. В частности, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один трансмембранный полипептид, составляющий многоцепочечный CAR, как описано выше. Более конкретно, настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему две или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие трансмембранные полипептиды, составляющие многоцепочечный CAR, как описано выше. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из от SEQ ID NO:214 до SEQ ID NO:223. В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из от SEQ ID NO:214 до SEQ ID NO:223.
Полинуклеотид может содержаться в кассете экспрессии или векторе экспрессии (например, плазмиде для введения в бактериальную клетку-хозяина, или вирусном векторе, таком как бакуловирусный вектор, для трансфекции клетки-хозяина из насекомых, или плазмиде или вирусном векторе, таком как лентивирусный, для трансфекции клетки-хозяина млекопитающих).
В конкретном варианте осуществления различные последовательности нуклеиновой кислоты могут быть включены в один полинуклеотид или вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность рибосомного прыжка, такую как последовательность, кодирующую пептид 2A. Пептиды 2A, которые были идентифицированы в подгруппе афтовирусы пикорнавирусов, вызывают рибосомный "прыжок" от одного кодона к следующему без образования пептидной связи между двумя аминокислотами, кодируемыми данными кодонами (см. Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)). Под "кодоном" понимаются три нуклеотида на мРНК (или на смысловой цепи молекулы ДНК), которые транслируются рибосомой в один аминокислотный остаток. Таким образом, два полипептида могут быть синтезированы из одной сплошной открытой рамки считывания в мРНК, когда полипептиды разделены последовательностью олигопептида 2A, которая находится внутри рамки. Такие механизмы рибосомного прыжка хорошо известны в данной области, и известно, что они используются некоторыми векторами для экспрессии нескольких белков, кодируемых одной матричной РНК. В качестве неограничивающего примера, в настоящем изобретении пептиды 2A применялись для экспрессии в клетке различных полипептидов многоцепочечного CAR. В более предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, выбранным из группы, состоящей из от SEQ ID NO:224 до SEQ ID NO:232.
Для направления трансмембранного полипептида, такого как FcεR, на секреторный путь клетки-хозяина, в полинуклеотидной последовательности или векторной последовательности предусмотрена последовательность секреторного сигнала (также известная как лидерная последовательность, препро-последовательность или пре-последовательность). Последовательность секреторного сигнала может представлять собой последовательность из FcεR или может происходить от другого секретируемого (например, t-PA) или впервые синтезированного белка. Последовательность секреторного сигнала функционально связана с последовательностью трансмембранной нуклеиновой кислоты, т.е. данные две последовательности соединены в правильной рамке считывания и расположены так, чтобы направлять вновь синтезированный полипептид на секреторный путь клетки-хозяина. Последовательности секреторного сигнала обычно расположены со стороны 5' от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес полипептид, хотя некоторые последовательности секреторного сигнала могут быть расположены в другом месте представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты (см., например, Welch et al., патент США № 5037743; Holland et al., патент США № 5143830). В предпочтительном варианте осуществления сигнальный пептид содержит остатки с 1 по 25 альфа-цепи FcεRI (NP_001992,1) и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:205.
Специалистам в данной области будет понятно, что, с учетом вырожденности генетического кода, возможна значительная изменчивость последовательности среди данных полинуклеотидных молекул. Предпочтительно, последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения являются кодон-оптимизированными для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно, для экспрессии в клетках человека. Кодонная оптимизация обозначает замену в представляющей интерес последовательности кодонов, которые, как правило, редки в высоко экспрессированных генах данного вида, на кодоны, которые, как правило, часты в высоко экспрессированных генах таких видов, причем такие кодоны кодируют те же аминокислоты, что и кодоны, которые подвергают замене.
В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из от SEQ ID NO:214 до SEQ ID NO:223. Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% с последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из от SEQ ID NO:214 до SEQ ID NO:222.
Способы получения иммунной клетки способами генной инженерии:
В охватываемом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения иммунных клеток для иммунотерапии, включающему введение в указанные иммунные клетки полипептидов, составляющих указанный многоцепочечный CAR, и размножение указанных клеток. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения иммунной клетки способами генной инженерии, включающему наличие клетки и экспрессию на поверхности указанной клетки по меньшей мере одного многоцепочечного CAR, как описано выше. В конкретном варианте осуществления данный способ включает трансформацию клетки с помощью по меньшей мере одного полинуклеотида, кодирующего полипептиды, составляющие по меньшей мере один многоцепочечный CAR, как описано выше, и экспрессию указанных полинуклеотидов в указанной клетке.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения клеток для иммунотерапии, включающему введение в указанные клетки различных полипептидов, составляющих указанный многоцепочечный CAR, и размножение указанных клеток. В предпочтительном варианте осуществления указанные полинуклеотиды включают в лентивирусные векторы, поскольку они стабильно экспрессируются в клетках.
В другом варианте осуществления указанный способ дополнительно включает стадию генетической модификации указанных клеток посредством инактивации по меньшей мере одного гена, экспрессирующего один компонент TCR, мишень для иммуносупрессивного средства, ген HLA и/или ген иммунной контрольной точки, такой как PDCD1 или CTLA-4. В предпочтительном варианте осуществления указанный ген выбирают из группы, состоящей из TCR-альфа, TCR-бета, CD52, GR, PD1 и CTLA-4. В предпочтительном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает введение в указанные T-клетки редкощепящей эндонуклеазы, способной к селективной инактивации посредством расщепления ДНК указанных генов. В более предпочтительном варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу. Предпочтительными TALE-нуклеазами в соответствии с настоящим изобретением являются распознающие и расщепляющие последовательность-мишень, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO:1-6 (GR), SEQ ID NO:37, 57-60 (TCR-альфа), SEQ ID NO:38 или 39 (TCR-бета) и SEQ ID NO:40, от SEQ ID NO:61 до SEQ ID NO:65 (CD52), от SEQ ID NO:74 до SEQ ID NO:78 (PD1 и CTLA-4).
Предполагается, что благодаря инактивации гена представляющий интерес ген не экспрессируется в форме функционального белка. В конкретном варианте осуществления генетическая модификация данного способа основана на экспрессии в клетках, предлагаемых для получения способами генной инженерии, одной редкощепящей эндонуклеазы, так что указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одном целевом гене, посредством этого инактивируя указанный целевой ген. Разрывы нити нуклеиновой кислоты, вызываемые редкощепящей эндонуклеазой, обычно исправляются посредством отличающихся механизмов гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов (NHEJ). Однако, NHEJ является несовершенным процессом репарации, который часто приводит к изменениям в последовательности ДНК в сайте расщепления. Механизмы включают повторное соединение того, что остается от двух концов ДНК, посредством прямого повторного лигирования (Critchlow and Jackson, 1998) или посредством так называемого опосредованного микрогомологией соединения концов (Ma, Kim et al., 2003). Репарация посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) часто приводит к небольшим вставкам или делециям и может быть использована для создания специфических генных нокаутов. Указанная модификация может представлять собой замену, делецию или присоединение по меньшей мере одного нуклеотида. Клетки, в которых происходит событие индуцированного расщеплением мутагенеза, т.е. событие мутагенеза, следующее за событием NHEJ, могут быть идентифицированы и/или отобраны посредством хорошо известного в данной области способа.
В другом варианте осуществления дополнительный каталитический домен может быть дополнительно введен в клетку с указанной редкощепящей эндонуклеазой для усиления мутагенеза, для того чтобы усилить способность инактивировать целевые гены, описанные в настоящем описании. В частности, указанный дополнительный каталитический домен представляет собой обрабатывающий концы ДНК фермент. Неограничивающие примеры обрабатывающих концы ДНК ферментов включают 5-3' экзонуклеазы, 3-5' экзонуклеазы, 5-3' щелочные экзонуклеазы, 5' флэп-эндонуклеазы, геликазы, фосфатазы, гидролазы и независимые от шаблона ДНК-полимеразы. Неограничивающие примеры такого каталитического домена содержат белковый домен или каталитически активное производное белкового домена, выбранного из группы, состоящей из hExol (EXO1_HUMAN), Exol дрожжей (EXO1_YEAST), Exol E.coli, TREX2 человека, TREX1 мыши, TREX1 человека, бычьего TREX1, TREX1 крысы, TdT (концевой дезоксинуклеотидтрансферазы) DNA2 человека, DNA2 дрожжей (DNA2_YEAST). В предпочтительном варианте осуществления указанный дополнительный каталитический домен обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью, и в более предпочтительном варианте осуществления указанный дополнительный каталитический домен представляет собой каталитический домен TREX, более предпочтительно TREX2 (WO2012/058458). В другом предпочтительном варианте осуществления указанный каталитический домен кодируется одноцепочечным TREX-полипептидом. Указанный дополнительный каталитический домен может быть слит с нуклеазным слитым белком или химерным белком в соответствии с настоящим изобретением, необязательно с помощью пептидного линкера.
Известно, что эндонуклеолитические разрывы увеличивают скорость гомологичной рекомбинации. Таким образом, в другом варианте осуществления стадия генетической модификации данного способа дополнительно включает стадию введения в клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере последовательность, гомологичную части целевой последовательности нуклеиновой кислоты, так что происходит гомологичная рекомбинация между целевой последовательностью нуклеиновой кислоты и экзогенной нуклеиновой кислотой. В конкретных вариантах осуществления указанная экзогенная нуклеиновая кислота содержит первую и вторую части, которые, соответственно, гомологичны участку 5' и 3' целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Указанная экзогенная нуклеиновая кислота в данных вариантах осуществления также содержит третью часть, расположенную между первой и второй частями, которая не содержит гомологии с участками 5' и 3' целевой последовательности нуклеиновой кислоты. После расщепления целевой последовательности нуклеиновой кислоты вызывается событие гомологичной рекомбинации между целевой последовательностью нуклеиновой кислоты и экзогенной нуклеиновой кислотой. Предпочтительно, в указанной донорной матрице используют гомологичные последовательности из по меньшей мере 50 п.о., предпочтительно, больше, чем 100 п.о., и, более предпочтительно, больше, чем 200 п.о. Следовательно, экзогенная нуклеиновая кислота составляет, предпочтительно, от 200 п.о. до 6000 п.о., более предпочтительно от 1000 п.о. до 2000 п.о. Действительно, общие гомологии нуклеиновой кислоты расположены в участках, фланкирующих в прямом и в обратном направлении сайт разрыва, и подлежащая введению последовательность нуклеиновой кислоты должна быть расположена между двумя плечами.
В частности, указанная экзогенная нуклеиновая кислота последовательно содержит первый участок гомологии с последовательностями, расположенными в обратном направлении от указанного расщепления, последовательность для инактивации одного целевого гена, выбранного из группы, состоящей из TCR-альфа, TCR-бета, CD52, GR, генов иммунных контрольных точек, и второй участок гомологии с последовательностями, расположенными в прямом направлении от расщепления. Указанная стадия введения полинуклеотида может выполняться одновременно, до или после введения или экспрессии указанной редкощепящей эндонуклеазы. В зависимости от расположения целевой последовательности нуклеиновой кислоты, в которой произошло событие разрыва, такая экзогенная нуклеиновая кислота может использоваться для нокаута гена, например, когда экзогенная нуклеиновая кислота расположена в пределах открытой рамки считывания указанного гена, или для введения новых последовательностей или генов, представляющих интерес. Вставки последовательностей с использованием такой экзогенной нуклеиновой кислоты можно использовать для модификации целевого существующего гена посредством коррекции или замены указанного гена (обмен аллелями в качестве неограничивающего примера) или регулировать экспрессию целевого гена повышающим или понижающим образом (обмен промоторами в качестве неограничивающего примера) посредством коррекции или замены указанного целевого гена. В предпочтительном варианте осуществления инактивация генов из группы, состоящей из TCR-альфа, TCR-бета, CD52, GR, генов иммунных контрольных точек, может быть осуществлена в точной геномной локализации, на которую воздействует специфическая TALE-нуклеаза, причем указанная специфическая TALE-нуклеаза катализирует расщепление, и причем указанная экзогенная нуклеиновая кислота последовательно содержит по меньшей мере участок гомологии и последовательность для инактивации одного целевого гена, выбранного из группы, состоящей из TCR-альфа, TCR-бета, CD52, GR, генов иммунных контрольных точек, которые интегрированы посредством гомологичной рекомбинации. В другом варианте осуществления несколько генов могут быть, последовательно или в одно и то же время, инактивированы с использованием нескольких TALE-нуклеаз, соответственно и специфически направленных на один определенный ген, и нескольких специфических полинуклеотидов для специфической инактивации генов.
Посредством стадии дополнительной геномной модификации может быть предусмотрена также инактивация другого гена, выбранного из группы, состоящей из TCR-альфа, TCR-бета, CD52, GR, генов иммунных контрольных точек. Как упомянуто выше, указанная стадия дополнительной геномной модификации может представлять собой стадию инактивации, включающую:
(a) введение в указанные клетки по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазы, так что указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одной целевой последовательности генома указанной клетки.
(b) необязательно, введение в указанные клетки экзогенной нуклеиновой кислоты, последовательно содержащей первый участок гомологии с последовательностями в обратном направлении от указанного расщепления, последовательность, подлежащую вставке в геном указанной клетки, и второй участок гомологии с последовательностями в прямом направлении от указанного расщепления,
причем указанная вводимая экзогенная нуклеиновая кислота инактивирует ген и интегрирует по меньшей мере одну экзогенную полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один представляющий интерес рекомбинантный белок. В другом варианте осуществления указанная экзогенная полинуклеотидная последовательность интегрирована в ген, выбранный из группы, состоящей из TCR-альфа, TCR-бета, CD52, GR, генов иммунных контрольных точек.
- Резистентные к иммуносупрессивным средствам T-клетки:
В конкретном аспекте одна из стадий генетической модификации клеток может представлять собой способ, включающий:
(a) модификацию T-клеток посредством инактивации по меньшей мере одного гена, экспрессирующего мишень для иммуносупрессивного средства, и
(b) размножение указанных клеток, необязательно в присутствии указанного иммуносупрессивного средства.
Иммуносупрессивное средство представляет собой средство, которое подавляет иммунную функцию посредством одного из нескольких механизмов действия. Другими словами, иммуносупрессивное средство представляет собой роль, исполняемую соединением, которая проявляется в способности уменьшать степень и/или ненасытность иммунного ответа. В качестве неограничивающего примера иммуносупрессивное средство может представлять собой ингибитор кальциневрина, мишень рапамицина, блокатор α-цепи интерлейкина-2, ингибитор инозинмонофосфатдегидрогеназы, ингибитор редуктазы дигидрофолиевой кислоты, кортикостероид или иммуносупрессивный антиметаболит. Классические цитотоксические иммуносупрессанты действуют посредством ингибирования синтеза ДНК. Другие могут действовать посредством активации T-клеток или посредством ингибирования активации хелперных клеток. Способ в соответствии с настоящим изобретением позволяет придавать T-клеткам резистентность к иммуносупрессивным средствам для иммунотерапии посредством инактивации мишени иммуносупрессивного средства в T-клетках. В качестве неограничивающих примеров, мишени для иммуносупрессивного средства могут представлять собой рецептор для иммуносупрессивного средства, такой как: CD52, глюкокортикоидный рецептор (GR), ген члена семейства FKBP и ген члена семейства циклофилинов.
Предполагается, что благодаря инактивации гена представляющий интерес ген не экспрессируется в форме функционального белка. В конкретном варианте осуществления генетическая модификация данного способа основана на экспрессии в клетках, предлагаемых для получения способами генной инженерии, одной редкощепящей эндонуклеазы, так что указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одном целевом гене, посредством этого инактивируя указанный целевой ген. В конкретном варианте осуществления указанный способ получения клеток способами генной инженерии включает по меньшей мере одну из следующих стадий:
(a) Наличие T-клетки, предпочтительно, из клеточной культуры или из образца крови;
(b) Выбор гена в указанной T-клетке, экспрессирующего мишень для иммуносупрессивного средства;
(c) Введение в указанную T-клетку редкощепящей эндонуклеазы, способной селективно инактивировать посредством расщепления ДНК, предпочтительно, посредством двухнитевого разрыва, указанный ген, кодирующий мишень для указанного иммуносупрессивного средства, и
(d) Размножение указанных клеток, необязательно в присутствии указанного иммуносупрессивное средства.
В более предпочтительном варианте осуществления указанный способ включает:
(a) Наличие T-клетки, предпочтительно, из клеточной культуры или из образца крови;
(b) Выбор гена в указанной T-клетке, экспрессирующего мишень для иммуносупрессивного средства;
(c) Трансформацию указанной T-клетки с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей редкощепящую эндонуклеазу, способную селективно инактивировать посредством расщепления ДНК, предпочтительно, посредством двухнитевого разрыва, указанный ген, кодирующий мишень для указанного иммуносупрессивного средства, и
(d) Экспрессию указанных редкощепящих эндонуклеаз в указанных T-клетках;
(e) Размножение указанных клеток, необязательно в присутствии указанного иммуносупрессивного средства.
В конкретном варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически воздействует на один ген, выбранный из группы, состоящей из CD52, GR. В другом варианте осуществления указанный ген стадии (b), определенный для иммуносупрессивной обработки, представляет собой CD52, и иммуносупрессивная обработка стадии (d) или (e) содержит гуманизированное антитело, направленное на антиген CD52.
В другом варианте осуществления указанный ген стадии (b), определенный для иммуносупрессивной обработки, представляет собой глюкокортикоидный рецептор (GR), и иммуносупрессивная обработка стадии d) или (e) содержит кортикостероид, такой как дексаметазон.
В другом варианте осуществления указанный целевой ген стадии (b), определенный для иммуносупрессивной обработки, представляет собой ген члена семейства FKBP или его варианта, и иммуносупрессивная обработка стадии (d) или (e) содержит FK506, также известный как такролимус или фуджимицин. В другом варианте осуществления указанный ген члена семейства FKBP представляет собой FKBP12 или его вариант.
В другом варианте осуществления указанный ген стадии (b), определенный для иммуносупрессивной обработки, представляет собой ген члена семейства циклофилинов или его варианта, и иммуносупрессивная обработка стадии (d) или (e) содержит циклоспорин.
В другом варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза может представлять собой мегануклеазу, цинковопальцевую нуклеазу или TALE-нуклеазу. В предпочтительном варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу. Предпочтительными TALE-нуклеазами в соответствии с настоящим изобретением являются распознающие и расщепляющие последовательность-мишень, выбранную из группы, состоящей из:
- SEQ ID NO:1-6 (GR), и
- SEQ ID NO:40, 61-65 (CD52).
Упомянутые TALE-нуклеазы, предпочтительно, содержат полипептидную последовательность, выбранную из от SEQ ID NO:7 до SEQ ID NO:18 и от SEQ ID NO:47 до SEQ ID NO:48, для того чтобы расщеплять соответствующие последовательности-мишени SEQ ID NO:1-6 и SEQ ID NO:40.
- Высокоактивные T-клетки для иммунотерапии
В конкретном аспекте одна конкретная стадия генетической модификации клетки может представлять собой способ, включающий:
(a) модификацию T-клеток посредством инактивации по меньшей мере одного гена иммунных контрольных точек; и
(b) размножение указанных клеток.
Опосредованный T-клетками иммунитет включает несколько последовательных стадий, включающих клональную селекцию антиген-специфических клеток, их активацию и пролиферацию во вторичную лимфоидную ткань, их направленную миграцию к участкам антигена и воспаления, выполнение прямой эффекторной функции и предоставление помощи (посредством цитокинов и мембранных лигандов) для множества эффекторных иммунных клеток. Каждая из данных стадий регулируется посредством уравновешивания стимулирующего и ингибирующего сигнала, что точно регулирует ответ. Средним специалистам в данной области будет понятно, что термин "иммунные контрольные точки" обозначает группу молекул, экспрессируемых T-клетками. Данные молекулы эффективно служат в качестве "тормозов" для понижающей модуляции или ингибирования иммунного ответа. Молекулы иммунных контрольных точек включают, но без ограничения, белок программируемой смерти 1 (PD-1, также известный как PDCD1 или CD279, номер доступа: M_005018), антиген 4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA-4, также известный как CD152, номер доступа GenBank AF414120.1), LAG3 (также известный как CD223, номер доступа: NM_002286,5), Tim3 (также известный как HAVCR2, номер доступа GenBank: JX049979.1), BTLA (также известный как CD272, номер доступа: NM_181780.3), BY55 (также известный как CD160, номер доступа GenBank: CR541888.1), TIGIT (также известный как VSTM3, номер доступа: NM_173799), B7H5 (также известный как C10orf54, гомолог мышиного гена vista, номер доступа: NM_022153.1), LAIR1 (также известный как CD305, номер доступа GenBank: CR542051.1), SIGLEC10 (номер доступа GeneBank: AY358337.1), 2B4 (также известный как CD244, номер доступа: NM_001166664.1), которые непосредственно ингибируют иммунные клетки. Например, CTLA-4 представляет собой белок клеточной поверхности, экспрессируемый на некоторых CD4 и CD8 T-клетках; при контакте с его лигандами (B7-1 и B7-2) на антиген-презентирующих клетках ингибируется активация и эффекторная функция T-клеток. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения T-клеток, особенно для иммунотерапии, включающему генетическую модификацию T-клеток посредством инактивации по меньшей мере одного белка, задействованного в иммунной контрольной точке, в частности, PD1 и/или CTLA-4.
В конкретном варианте осуществления указанный способ получения клеток способами генной инженерии включает по меньшей мере одну из следующих стадий:
(a) наличие T-клетки, предпочтительно, из клеточной культуры или из образца крови;
(b) ведение в указанную T-клетку редкощепящей эндонуклеазы, способной селективно инактивировать посредством расщепления ДНК, предпочтительно, посредством двухнитевого разрыва, один ген, кодирующий белок иммунных контрольных точек,
(c) размножение указанных клеток.
В более предпочтительном варианте осуществления указанный способ включает:
(a) наличие T-клетки, предпочтительно из клеточной культуры или из образца крови;
(b) трансформацию указанной T-клетки с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей редкощепящую эндонуклеазу, способную селективно инактивировать посредством расщепления ДНК, предпочтительно посредством двухнитевого разрыва, ген, кодирующий белок иммунных контрольных точек;
(c) экспрессию указанных редкощепящих эндонуклеаз в указанных T-клетках;
(d) размножение указанных клеток.
В конкретном варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически воздействует на один ген, выбранный из группы, состоящей из: PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCR-альфа и TCR-бета. В другом варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза может представлять собой мегануклеазу, цинковопальцевую нуклеазу или TALE-нуклеазу. В предпочтительном варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза представлять собой TALE-нуклеазу. Под TALE-нуклеазой понимается слитый белок, состоящий из ДНК-связывающего домена, происходящего от подобного активатору транскрипции эффектора (TALE), и одного нуклеазного каталитического домена для расщепления целевой последовательности нуклеиновой кислоты. (Boch, Scholze et al., 2009; Moscou and Bogdanove, 2009; Christian, Cermak et al., 2010; Cermak, Doyle et al., 2011; Geissler, Scholze et al., 2011; Huang, Xiao et al., 2011; Li, Huang et al., 2011; Mahfouz, Li et al., 2011; Miller, Tan et al., 2011; Morbitzer, Romer et al., 2011; Mussolino, Morbitzer et al., 2011; Sander, Cade et al., 2011; Tesson, Usal et al., 2011; Weber, Gruetzner et al., 2011; Zhang, Cong et al., 2011; Deng, Yan et al., 2012; Li, Piatek et al., 2012; Mahfouz, Li et al., 2012; Mak, Bradley et al., 2012).
В настоящем изобретении были разработаны новые TALE-нуклеазы для точного нацеливания на соответствующие гены для стратегий адоптивной иммунотерапии. Предпочтительными TALE-нуклеазами в соответствии с настоящим изобретением являются распознающие и расщепляющие последовательность-мишень, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO:77 и SEQ ID NO:78 (PD1), от SEQ ID NO:74 до SEQ ID NO:76 (CTLA-4). Настоящее изобретение также относится к полипептидам TALE-нуклеаз, которые содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из от SEQ ID NO:79 до SEQ ID NO:88.
Настоящее изобретение также относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 99% с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из от SEQ ID NO:79 до SEQ ID NO:88. Также в объем настоящего изобретения включены полинуклеотиды, векторы, кодирующие вышеописанные редкощепящие эндонуклеазы в соответствии с настоящим изобретением. Данный способ может быть связан с любым из различных способов, описанных в настоящем раскрытии.
- Неаллореактивные T-клетки:
В другом варианте осуществления настоящее изобретение может особенно подходить для аллогенной иммунотерапии. В таком случае одна из стадий генетической модификации клетки может представлять собой способ, включающий:
(a) модификацию T-клеток посредством инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент T-клеточного рецептора (TCR)
(b) размножение указанных клеток.
В конкретном варианте осуществления генетическая модификация способа основана на экспрессии в клетках, предлагаемых для получения способами генной инженерии, одной редкощепящей эндонуклеазы, так что указанная редкощепящая эндонуклеаза специфически катализирует расщепление в одном целевом гене, посредством этого инактивируя указанный целевой ген. В конкретном варианте осуществления указанный способ получения клеток способами генной инженерии включает по меньшей мере одну из следующих стадий:
(a) наличие T-клетки, предпочтительно, из клеточной культуры или из образца крови;
Введение в указанную T-клетку редкощепящей эндонуклеазы, способной селективно инактивировать посредством расщепления ДНК, предпочтительно посредством двухнитевого разрыва, по меньшей мере один ген, кодирующий компонент T-клеточного рецептора (TCR).
(b) Размножение указанных клеток.
В более предпочтительном варианте осуществления указанный способ включает:
(a) наличие T-клетки, предпочтительно, из клеточной культуры или из образца крови;
(b) Трансформацию указанной T-клетки с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей редкощепящую эндонуклеазу, способную селективно инактивировать посредством расщепления ДНК, предпочтительно, посредством двухнитевого разрыва, по меньшей мере один ген, кодирующий компонент T-клеточного рецептора (TCR);
(c) Экспрессию указанных редкощепящих эндонуклеаз в указанных T-клетках;
(d) Сортировку трансформированных T-клеток, которые не экспрессируют TCR на своей клеточной поверхности;
(e) Размножение указанных клеток.
В другом варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза может представлять собой мегануклеазу, цинковопальцевую нуклеазу или TALE-нуклеазу. В предпочтительном варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу. Предпочтительными TALE-нуклеазами в соответствии с настоящим изобретением являются распознающие и расщепляющие последовательность-мишень, выбранную из группы, состоящей из:
- SEQ ID NO:37, 57-60 (TCR-альфа),
- SEQ ID NO:38 или 39 (TCR-бета).
Упомянутые TALE-нуклеазы, предпочтительно, содержат полипептидную последовательность, выбранную из от SEQ ID NO:41 до SEQ ID NO:48, для того чтобы расщеплять соответствующие последовательности-мишени SEQ ID NO:37-39.
- PreT-альфа
В другом аспекте еще одна стадия генетической модификации клеток может представлять собой способ размножения TCR-альфа-дефицитных T-клеток, включающий введение в указанную T-клетку pT-альфа (также называемой пре-TCRα) или ее функционального варианта и размножение указанных клеток, необязательно посредством стимуляции комплекса CD3. В предпочтительном варианте осуществления данный способ включает:
a) Трансформацию указанных клеток с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере фрагмент pT-альфа, для поддержания поверхностной экспрессии CD3
b) Экспрессию указанной pT-альфа в указанных клетках
c) Размножение указанных клеток, необязательно посредством стимуляции комплекса CD3.
Настоящее изобретение также относится к способу получения T-клеток для иммунотерапии, содержащему стадии способа размножения T-клеток.
В конкретном варианте осуществления полинуклеотидная последовательность pT-альфа может быть введена случайным образом или же посредством гомологичной рекомбинации, в частности, вставка может быть связана с инактивацией гена TCR-альфа.
В соответствии с настоящим изобретением используют различные функциональные варианты pT-альфа. "Функциональный вариант" пептида обозначает молекулу, по существу аналогичную или всему пептиду, или его фрагменту. "Фрагмент" pT-альфа или ее функционального варианта настоящего изобретения относится к любому сокращенному варианту молекулы, то есть более короткому пептиду. Предпочтительные pT-альфа или функциональный варианты могут представлять собой полноразмерную pT-альфа или C-концевой усеченный вариант pT-альфа. В C-концевой усеченной pT-альфа с C-концевого конца отсутствуют один или несколько остатков. В качестве неограничивающих примеров, в C-концевом усеченном варианте pT-альфа отсутствуют 18, 48, 62, 78, 92, 110 или 114 остатков с C-конца белка (от SEQ ID NO:107 до SEQ ID NO:114). Кроме того, варианты аминокислотной последовательности пептида могут быть получены посредством мутаций в ДНК, которая кодирует пептид. Такие функциональные варианты включают, например, удаления, или вставки, или замены остатков в аминокислотной последовательности. Любая комбинация удаления, вставки и замены может также приводить к конечному конструкту, при условии, что конечный конструкт обладает желаемой активностью, в частности, восстанавливает функциональный комплекс CD3. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одну мутацию вводят в различные варианты pT-альфа, как описано выше, для воздействия на димеризацию. В качестве неограничивающего примера, мутировавший остаток может представлять собой по меньшей мере W46R, D22A, K24A, R102A или R117A белка pT-альфа человека или выровненные с помощью метода CLUSTALW положения на члене семейства pT-альфа или гомологе. Предпочтительно, pT-альфа или ее вариант, как описано выше, содержат мутировавший остаток W46R (SEQ ID NO:123) или мутировавшие остатки D22A, K24A, R102A и R117A (SEQ ID NO:124). В конкретном варианте осуществления указанные pT-альфа или варианты также слиты с передающим сигнал доменом, таким как CD28, OX40, ICOS, CD27, CD137 (4-1BB) и CD8, в качестве неограничивающих примеров (от SEQ ID NO:115 до SEQ ID NO:120). Внеклеточный домен pT-альфа или вариантов, как описано выше, может быть слит с фрагментом белка TCR-альфа, в частности, с трансмембранным и внутриклеточным доменом TCR-альфа (SEQ ID NO:122). Варианты pT-альфа также могут быть слиты с внутриклеточным доменом TCR-альфа (SEQ ID NO:121).
В другом варианте осуществления указанные варианты pT-альфа слиты с внеклеточным лигандсвязывающим доменом, и, более предпочтительно, pT-альфа или ее функциональный вариант слиты с одноцепочечным фрагментом антитела (scFV), содержащим легкий (VL) и тяжелый (VH) вариабельный фрагмент специфического к антигену мишени моноклонального антитела, соединенные гибким линкером. В качестве неограничивающего примера, аминокислотную последовательность pT-альфа или ее функционального варианта выбирают из группы, состоящей из от SEQ ID NO:107 до SEQ ID NO:124.
Поскольку некоторая изменчивость может возникать из геномных данных, из которых эти полипептиды происходят, а также принимая во внимание возможность замены некоторых из аминокислот, присутствующих в этих полипептидах, без значительной потери активности (функциональные варианты), настоящее изобретение охватывает полипептидные варианты вышеуказанных полипептидов, которые имеют идентичность по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90% и, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95% с последовательностями, предлагаемыми в данной патентной заявке.
Настоящее изобретение, таким образом, обращается к полипептидам, содержащим полипептидную последовательность, которая имеет идентичность по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, 95% 97% или 99% с последовательностями с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из от SEQ ID NO:107 до SEQ ID NO:124.
Под TCR-альфа-дефицитной T-клеткой понимается выделенная T-клетка, в которой отсутствует экспрессия функциональной цепи TCR-альфа. Это может быть достигнуто с помощью различных средств, в качестве неограничивающих примеров, посредством получения способом генной инженерии T-клетки таким образом, что она не экспрессирует никакой функциональной TCR-альфа на своей клеточной поверхности, или посредством получения T-клетки таким образом, что она производит очень мало функциональной цепи TCR-альфа на своей поверхности, или посредством получения T-клетки для экспрессии мутировавшей или усеченной формы цепи TCR-альфа.
TCR-альфа-дефицитные клетки больше не могут распространяться посредством комплекса CD3. Таким образом, для преодоления данной проблемы и для предоставления возможности пролиферации TCR-альфа-дефицитным клеткам в указанные клетки вводят pT-альфа или ее функциональный вариант, тем самым восстанавливая функциональный комплекс CD3. В предпочтительном варианте осуществления данный способ дополнительно включает введение в указанные T-клетки редкощепящих эндонуклеаз, способных селективно инактивировать посредством расщепления ДНК один ген, кодирующий один компонент T-клеточного рецептора (TCR). В конкретном варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу. В качестве неограничивающих примеров, TALE-нуклеаза направлена против одной из последовательностей-мишеней гена TCR-альфа, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:37 и SEQ ID NO:57-60. Предпочтительно, TALE-нуклеазы выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:42.
Также в настоящее изобретение включены полипептиды, кодирующие pT-альфа, в частности, функциональные варианты, описанные выше. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к pT-альфа или ее функциональному варианту, слитому с передающим сигнал доменом, таким как CD28, OX40, ICOS, CD137 и CD8. Более конкретно, настоящее изобретение относится к функциональному варианту pT-альфа, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из от SEQ ID NO:107 до SEQ ID NO:124. Также в настоящее изобретение включены полинуклеотиды, векторы, кодирующие pT-альфа или ее функциональные варианты, описанные выше.
Объем настоящего изобретения также включает выделенные клетки или клеточные линии, допускающие получение посредством указанного способа. В частности, указанные выделенные клетки или клеточные линии получают посредством введения в указанные клетки pT-альфа или ее функционального варианта для поддержания поверхностной экспрессии CD3. В предпочтительном варианте осуществления указанная выделенная клетка или клеточная линия дополнительно генетически модифицированы посредством инактивации гена TCR-альфа. Данный ген, предпочтительно, инактивируется посредством по меньшей мере одной редкощепящей эндонуклеазы. В предпочтительном варианте осуществления указанная редкощепящая эндонуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу.
Объем настоящего изобретения также включает выделенные клетки или клеточные линии, допускающие получение посредством указанного способа получения клеток способами генной инженерии, в частности, T-клеток, в которых инактивирован по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из TCR-альфа, TCR-бета, CD52, GR, генов иммунных контрольных точек.
- Биспецифические антитела
В соответствии со следующим вариантом осуществления сконструированные T-клетки, полученные различными способами, как описано выше, могут быть дополнительно подвергнуты воздействию биспецифических антител. Упомянутые T-клетки могут быть подвергнуты воздействию биспецифических антител ex vivo до введения пациенту или in vivo после введения пациенту. Упомянутые биспецифические антитела содержат два вариабельных участка с различными антигенными свойствами, которые позволяют приводить сконструированные клетки в непосредственную близость к антигену мишени. В качестве неограничивающего примера, упомянутое биспецифическое антитело направлено против опухолевого маркера и лимфоцитарного антигена, такого как CD3, и имеет возможность перенаправлять и активировать любые циркулирующие T-клетки против опухолей.
Способы доставки
Различные способы, описанные выше, включают введение многоцепочечного CAR, pT-альфа или ее функциональных вариантов, редкощепящей эндонуклеазы, TALE-нуклеазы, CAR, необязательно с обрабатывающим концы ДНК ферментом или экзогенной нуклеиновой кислотой, в клетку.
В качестве неограничивающего примера, указанные многоцепочечный CAR, pT-альфа или ее функциональный вариант, редкощепящие эндонуклеазы, TALE-нуклеазы или CAR, необязательно с обрабатывающим концы ДНК ферментом или экзогенной нуклеиновой кислотой, могут быть введены в виде трансгенов, кодируемых одним или различными плазмидными векторами. Различные трансгены могут быть включены в один вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность рибосомного прыжка, такую как последовательность, кодирующую пептид 2A. Пептиды 2A, которые были идентифицированы в подгруппе афтовирусы пикорнавирусов, вызывают рибосомный "прыжок" от одного кодона к следующему без образования пептидной связи между двумя аминокислотами, кодируемыми данными кодонами (см. Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)). Под "кодоном" понимаются три нуклеотида на мРНК (или на смысловой цепи молекулы ДНК), которые транслируются рибосомой в один аминокислотный остаток. Таким образом, два полипептида могут быть синтезированы из одной сплошной открытой рамки считывания в мРНК, когда полипептиды разделены последовательностью олигопептида 2A, которая находится внутри рамки. Такие механизмы рибосомного прыжка хорошо известны в данной области, и известно, что они используются некоторыми векторами для экспрессии нескольких белков, кодируемых одной матричной РНК. В качестве неограничивающего примера, в настоящем изобретении пептиды 2A применялись для экспрессии в клетке редкощепящей эндонуклеазы и обрабатывающего концы ДНК фермента или различных полипептидов многоцепочечного CAR.
Указанный плазмидный вектор может также содержать маркер селекции, который предназначен для идентификации и/или селекции клеток, которые получили указанный вектор.
Полипептиды могут быть синтезированы in situ в клетке в результате введения полинуклеотидов, кодирующих указанные полипептиды, в клетку. Альтернативно, указанные полипептиды могут быть получены вне клетки и затем введены в нее. Способы введения полинуклеотидного конструкта в клетки животных известны в данной области и включают, в качестве неограничивающих примеров, способы стабильной трансформации, когда полинуклеотидный конструкт интегрируют в геном клетки, способы временной трансформации, когда полинуклеотидный конструкт не интегрируют в геном клетки, и способы, опосредуемые вирусами. Упомянутые полинуклеотиды могут быть введены в клетку с помощью, например, рекомбинантных вирусных векторов (например, ретровирусов, аденовирусов), липосом и тому подобного. Например, способы временной трансформации включают, например, микроинъекцию, электропорацию или бомбардировку частицами. Упомянутые полинуклеотиды могут быть включены в векторы, более конкретно в плазмиды или вирус, для экспрессии в клетках.
- Электропорация
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотиды, кодирующие полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой мРНК, которую вводят непосредственно в клетки, например, посредством электропорации. Изобретатели определили оптимальные условия для электропорации мРНК в T-клетку.
Изобретатель использовал метод CytoPulse, который позволяет посредством использования импульсных электрических полей временно делать проницаемыми живые клетки для доставки материала в данные клетки. Метод, основанный на использовании форм сигналов электропорации PulseAgile (собственность Cellectis) обеспечивает точный контроль продолжительности, интенсивности импульсов, а также интервала между импульсами (патент США 6010613 и международная заявка PCT WO2004083379). Все эти параметры могут быть изменены, для того чтобы достигать наилучших условий для высокой эффективности трансфекции с минимальной смертностью. В основном, первые сильные импульсы электрического поля делают возможным образование пор, тогда как последующие слабые импульсы электрического поля делают возможным движение полинуклеотида в клетку. В одном из аспектов настоящего изобретения изобретатель описывает стадии, которые ведут к достижению эффективности трансфекции мРНК в T-клетки >95%, и использование протокола электропорации для временной экспрессии различных типов белков в T-клетках. В частности, настоящее изобретение относится к способу трансформации T-клетки, включающему приведение указанной T-клетки в контакт с РНК и прикладывание к T-клетке адаптивной импульсной последовательности, состоящей из:
(a) одного электрического импульса с напряжением в диапазоне от 2250 до 3000 В на сантиметр, шириной импульса, равной 0,1 мс, и интервалом между импульсами, равным от 0,2 до 10 мс, между электрическими импульсами стадий (a) и (b);
(b) одного электрического импульса с напряжением в диапазоне от 2250 до 3000 В, с шириной импульса, равной 100 мс, и интервалом между импульсами, равным 100 мс, между электрическим импульсом стадии (b) и первым электрическим импульсом стадии (c); и
(c) 4 электрических импульсов с напряжением, равным 325 В, с шириной импульса, равной 0,2 мс, и интервалом между импульсами, равным 2 мс, между всеми 4 электрическими импульсами.
В конкретном варианте осуществления способ трансформации T-клетки, включающий приведение указанной T-клетки в контакт с РНК и прикладывание к T-клетке адаптивной импульсной последовательности, состоящей из:
(a) одного электрического импульса с напряжением, равным 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 или 3000 В на сантиметр, шириной импульса, равной 0,1 мс, и интервалом между импульсами, равным 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мс, между электрическими импульсами стадий (a) и (b);
(b) одного электрического импульса с напряжением в диапазоне от 2250, равным 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 или 3000 В, с шириной импульса, равной 100 мс, и интервалом между импульсами, равным 100 мс, между электрическим импульсом стадии (b) и первым электрическим импульсом стадии (c); и
(c) 4 электрических импульсов с напряжением, равным 325 В, с шириной импульса, равной 0,2 мс, и интервалом между импульсами, равным 2 мс, между всеми 4 электрическими импульсами.
Любые значения, включенные в диапазон значений, описанный выше, раскрыты в настоящей заявке. Среда для электропорации может представлять собой любую подходящую среду, известную в данной области. Предпочтительно, среда для электропорации имеет проводимость в диапазоне, охватывающем от 0,01 до 1,0 миллисименс.
В конкретных вариантах осуществления, в качестве неограничивающих примеров, указанная РНК кодирует редкощепящую эндонуклеазу, один мономер редкощепящей эндонуклеазы, такой как половина TALE-нуклеазы, химерный антигенный рецептор, по меньшей мере один компонент многоцепочечного химерного антигенного рецептора, pT-альфа или ее функциональный вариант, экзогенную нуклеиновую кислоту, один дополнительный каталитический домен.
Модифицированные T-клетки
Настоящее изобретение также относится к выделенным клеткам или клеточным линиям, допускающим получение посредством указанного способа получения клеток способами генной инженерии. В частности, указанная выделенная клетка содержит по меньшей мере один многоцепочечный CAR, как описано выше. В другом варианте осуществления указанная выделенная клетка содержит популяцию многоцепочечных CAR, причем все они содержат различные внеклеточные лигандсвязывающие домены. В частности, указанная выделенная клетка содержит экзогенные полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, составляющие по меньшей мере один многоцепочечный CAR. Упомянутые клетки могут также дополнительно содержать по меньшей мере один инактивированный ген, выбранный из группы, состоящей из CD52, GR, TCR-альфа, TCR-бета, гена HLA, генов иммунных контрольных точек, таких как PD1 и CTLA-4, или может экспрессировать трансген pT-альфа.
Объем настоящего изобретения также включает выделенную иммунную клетку, предпочтительно, T-клетку, полученную в соответствии с любым из способов, описанных выше. Указанная иммунная клетка обозначает клетку гемопоэтического происхождения, функционально участвующую в инициировании и/или осуществлении врожденного и/или адаптивного иммунного ответа. Указанная иммунная клетка в соответствии с настоящим изобретением может происходить от стволовой клетки. Стволовые клетки могут представлять собой взрослые стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, более конкретно нечеловеческие стволовые клетки, стволовые клетки пуповинной крови, клетки-предшественники, стволовые клетки костного мозга, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, тотипотентные стволовые клетки или гемопоэтические стволовые клетки. Типичными клетками человека являются CD34+ клетки. Указанная выделенная клетка может также представлять собой дендритную клетку, дендритную клетку-киллер, тучную клетку, NK-клетку, B-клетку или T-клетку, выбранную из группы, состоящей из воспалительных T-лимфоцитов, цитотоксических T-лимфоцитов, регуляторных T-лимфоцитов или хелперных T-лимфоцитов. В другом варианте осуществления указанная клетка может происходить из группы, состоящей из CD4+ T-лимфоцитов и CD8+ T-лимфоцитов. Перед размножением и генетической модификацией клеток настоящего изобретения источник клеток может быть получен от индивида посредством множества неограничивающих способов. Клетки могут быть получены из ряда неограничивающих источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань вилочковой железы, ткань из участка инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения можно использовать любой ряд T-клеточных линий, доступных и известных специалистам в данной области. В другом варианте осуществления указанная клетка может быть получена от здорового донора, от пациента с диагнозом рака или от пациента с диагнозом инфекции. В другом варианте осуществления указанная клетка является частью смешанной популяции клеток, которые представляют различные фенотипические характеристики. Объем настоящего изобретения также охватывает клеточную линию, получаемую из трансформированной T-клетки в соответствии со способом, описанным выше. Модифицированные клетки, резистентные к иммуносупрессивной обработке и допускающие получение указанным выше способом, включены в объем настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления указанная выделенная клетка в соответствии с настоящим изобретением содержит один инактивированный ген, выбранный из группы, состоящей из CD52, GR, PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCR-альфа и TCR-бета, и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и/или трансген pT-альфа. В другом конкретном варианте осуществления указанная выделенная клетка содержит полинуклеотиды, кодирующие указанные полипептиды, составляющие многоцепочечный CAR.
В другом варианте осуществления указанная выделенная клетка в соответствии с настоящим изобретением содержит два инактивированных гена, выбранных из группы, состоящей из CD52 и GR, CD52 и TCR-альфа, CDR52 и TCR-бета, GR и TCR-альфа, GR и TCR-бета, TCR-альфа и TCR-бета, PD1 и TCR-альфа, PD1 и TCR-бета, CTLA-4 и TCR-альфа, CTLA-4 и TCR-бета, LAG3 и TCR-альфа, LAG3 и TCR-бета, Tim3 и TCR-альфа, Tim3 и TCR-бета, BTLA и TCR-альфа, BTLA и TCR-бета, BY55 и TCR-альфа, BY55 и TCR-бета, TIGIT и TCR-альфа, TIGIT и TCR-бета, B7H5 и TCR-альфа, B7H5 и TCR-бета, LAIR1 и TCR-альфа, LAIR1 и TCR-бета, SIGLEC10 и TCR-альфа, SIGLEC10 и TCR-бета, 2B4 и TCR-альфа, 2B4 и TCR-бета, и/или экспрессирует CAR, многоцепочечный CAR и/или трансген pT-альфа.
В другом варианте осуществления TCR делают не функциональным в клетках в соответствии с настоящим изобретением посредством инактивации гена TCR-альфа и/или гена(ов) TCR-бета. Вышеуказанные стратегии используют, в частности, для избежания GvHD. В конкретном аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения модифицированных клеток, происходящих от индивидуума, причем указанные клетки могут пролиферировать независимо от сигнального пути главного комплекса гистосовместимости. Указанный способ включает следующие стадии:
(a) Получение клеток от указанного индивидуума;
(b) Генетическую модификацию указанных клеток ex vivo посредством инактивации генов TCR-альфа или TCR-бета;
(c) Культивирование генетически модифицированных T-клеток in vitro в соответствующих условиях для амплификации указанных клеток.
Модифицированные клетки, которые могут пролиферировать независимо от сигнального пути главного комплекса гистосовместимости, допускающие получение посредством данного способа, включены в объем настоящего изобретения. Упомянутые модифицированные клетки можно использовать в конкретном аспекте настоящего изобретения для лечения пациентов от отторжения хозяин против трансплантата (HvG) и заболевания трансплантат против хозяина (GvHD); следовательно, в объем настоящего изобретения попадает способ лечения пациентов от отторжения хозяин против трансплантата (HvG) и заболевания трансплантат против хозяина (GvHD), включающий лечение указанного пациента посредством введения указанному пациенту эффективного количества модифицированных клеток, содержащих инактивированные гены TCR-альфа и/или TCR-бета.
Активация и размножение T-клеток
Или до, или после генетической модификации T-клеток T-клетки могут быть активированы и размножены, как правило, с помощью способов, описанных, например, в патентах США 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; и публикации патентной заявки США № 20060121005. T-клетки могут быть размножены in vitro или in vivo.
Обычно T-клетки настоящего изобретения размножают посредством контакта со средством, которое имитирует комплекс CD3 TCR, и костимулирующей молекулой на поверхности T-клеток для создания сигнала активации для T-клетки.
Например, для создания сигнала активации для T-клетки можно использовать химические вещества, такие как ионофор кальция A23187, форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) или митогенные лектины вроде фитогемагглютинина (PHA).
В качестве неограничивающих примеров, популяции Т-клеток могут быть стимулированы in vitro, как, например, посредством контакта с анти-CD3 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или анти-CD2 антителом, иммобилизованным на поверхности, или посредством контакта с активатором протеинкиназы C (например, бриостатином) в сочетании с ионофором кальция. Для костимуляции вспомогательной молекулы на поверхности T-клеток используют лиганд, который связывает вспомогательную молекулу. Например, популяция T-клеток может быть приведена в контакт с анти-CD3 антителом и анти-CD28 антителом в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации T-клеток. Для стимуляции пролиферации или CD4+ T-клеток, или CD8+ T-клеток анти-CD3 антитело и анти-CD28 антитело. Например, средства, обеспечивающие каждый сигнал, могут находиться в растворе или быть связаны с поверхностью. Как легко могут понять средние специалисты в данной области, отношение частиц к клеткам может зависеть от размера частиц по отношению к клетке-мишени. В других вариантах осуществления настоящего изобретения клетки, такие как T-клетки, объединяют с покрытыми средством гранулами, после этого гранулы и клетки разделяют, и затем клетки культивируют. В альтернативном варианте осуществления перед культивированием покрытые средством гранулы и клетки не разделяют, но культивируют вместе. Условия, подходящие для культивирования T-клеток, включают подходящие среды (например, минимальные питательные среды, или среды RPMI-1640, или X-vivo 5 (Lonza)), который могут содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, фетальную бычью или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp и TNF- или любые другие добавки для роста клеток, известные специалисту. Другие добавки для роста клеток включают, но без ограничения, поверхностно-активное вещество, плазманат и восстанавливающие средства, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 и X-Vivo 20, Optimizer, с добавленными аминокислотами, пируватом натрия и витаминами, или свободные от сыворотки, или дополненные соответствующим количеством сыворотки (или плазмы), или определенным набором гормонов, и/или количеством цитокина(ов), достаточным для роста и размножения T-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, не в культуры клеток, которые предназначены для введения индивиду. Клетки-мишени выдерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например, подходящих температуре (например, 37°C) и атмосфере (например, воздух плюс 5% CO2). T-клетки, которые подвергались стимуляции в течение различного времени, могут проявлять различные характеристики.
В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки могут быть размножены посредством совместного культивирования с тканью или клетками. Упомянутые клетки могут также быть размножены in vivo, например, в крови индивида после введения указанной клетки индивиду.
Терапевтические применения
В другом варианте осуществления выделенная клетка, полученная посредством различных способов, или клеточная линия, происходящая от указанной выделенной клетки, как описано выше, может быть использована в качестве лекарственного средства. В другом варианте осуществления упомянутое лекарственное средство может быть использовано для лечения злокачественных опухолей или инфекции у пациента. В другом варианте осуществления указанная выделенная клетка в соответствии с настоящим изобретением или клеточная линия, происходящая от указанной выделенной клетки, могут быть использованы в изготовлении лекарственного средства для лечения рака, вирусной инфекции или аутоиммунного заболевания у пациента.
В другом аспекте настоящее изобретение основано на способах лечения пациентов, причем указанный способ включает по меньшей мере одну из следующих стадий:
(a) наличие иммунной-клетки, получаемой посредством любого из способов, описанных выше;
(b) введение указанных трансформированных иммунных клеток указанному пациенту.
В одном из вариантов осуществления указанные T-клетки по настоящему изобретению могут подвергаться устойчивому размножению T-клеток in vivo и могут существовать в течение длительного периода времени.
Упомянутое лечение может быть улучшающим, радикальным или профилактическим. Оно может быть или частью аутологичной иммунотерапии, или частью аллогенного иммунотерапевтического лечения. Под аутологичным понимается, что клетки, клеточная линия или популяция клеток, используемые для лечения пациентов, происходят от указанного пациента или от совместимого по лейкоцитарному антигену человека (HLA) донора. Под аллогенным понимается, что клетки или популяция клеток, используемые для лечения пациентов, происходят не от указанного пациента, но от донора.
Настоящее изобретение особенно подходит для аллогенной иммунотерапии, поскольку она дает возможность трансформации T-клеток, как правило полученных от доноров, в неаллореактивные клетки. Это может быть сделано в рамках стандартных протоколов и воспроизведено столько раз, сколько необходимо. Итоговые модифицированные T-клетки могут быть объединены и введены одному или нескольким пациентам, будучи доступны в виде "готового" терапевтического продукта.
Клетки, которые могут быть использованы с раскрытыми способами, описаны в предыдущем разделе. Упомянутое лечение может быть использовано для лечения пациентов с диагнозом рака, вирусной инфекции, аутоиммунных нарушений или заболевания трансплантат против хозяина (GvHD). Злокачественные опухоли, которые можно лечить, включают опухоли, которые не васкуляризированы или еще по существу не васкуляризированы, а также васкуляризированные опухоли. Злокачественные опухоли могут включать несолидные опухоли (такие как гематологические опухоли, например, лейкемии и лимфомы) или могут включать солидные опухоли. Виды рака, подлежащие лечению с помощью многоцепочечных CAR по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, карциному, бластому и саркому и определенную лейкемию или лимфоидные злокачественные опухоли, доброкачественные и злокачественные опухоли и злокачественные опухоли, например, саркомы, карциномы и меланомы. Также включены опухоли/раки взрослых и опухоли/раки детей.
Может иметь место лечение в комбинации с одной или несколькими терапиями против рака, выбранными из группы из терапии антителами, химиотерапии, терапии цитокинами, терапии дендритными клетками, генной терапии, гормональной терапии, терапии лазерным светом и лучевой терапии.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения упомянутое лечение может вводиться пациентам, проходящим иммуносупрессивное лечение. Действительно, настоящее изобретение, предпочтительно, основано на клетках или популяции клеток, которые были сделаны резистентными к по меньшей мере одному иммуносупрессивному средству вследствие инактивации гена, кодирующего рецептор для такого иммуносупрессивного средства. В данном аспекте иммуносупрессивное лечение должно способствовать селекции и размножению T-клеток в соответствии с настоящим изобретением в пациенте.
Введение клеток или популяции клеток в соответствии с настоящим изобретением может быть осуществлено любым удобным способом, в том числе посредством аэрозольной ингаляции, инъекции, приема внутрь, переливания, имплантации или трансплантации. Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть введены пациенту подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, интранодально, интрамедуллярно, внутримышечно, посредством внутривенной или внутрилимфатической инъекции или внутрибрюшинно. В одном из вариантов осуществления клеточные композиции настоящего изобретения, предпочтительно, вводят посредством внутривенной инъекции.
Введение клеток или популяции клеток может состоять из введения 104-109 клеток на кг веса тела, предпочтительно, от 105 до 106 клеток/кг веса тела, включая все целые значения числа клеток в пределах данных диапазонов. Клетки или популяция клеток могут быть введены в одной или нескольких дозах. В другом варианте осуществления упомянутое эффективное количество клеток вводят в виде однократной дозы. В другом варианте осуществления упомянутое эффективное количество клеток вводят в виде больше чем одной дозы в течение периода времени. График введения остается на усмотрение управляющего врача и зависит от клинического состояния пациента. Клетки или популяция клеток могут быть получены из любого источника, такого как банк крови или донор. При том, что индивидуальные потребности различаются, определение оптимальных интервалов эффективных количеств данного типа клеток для конкретного заболевания или условий лежит в пределах компетентности специалиста в данной области. Эффективное количество означает количество, которое обеспечивает терапевтический или профилактический эффект. Применяемая дозировка будет зависеть от возраста, состояния здоровья и веса реципиента, вида сопутствующего лечения, если таковое имеется, частоты лечения и природы желаемого эффекта.
В другом варианте осуществления упомянутое эффективное количество клеток или композицию, содержащую данные клетки, вводят парентерально. Упомянутое введение может представлять собой внутривенное введение. Упомянутое введение может быть осуществлено непосредственно путем инъекции в опухоль.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения клетки вводят пациенту в сочетании (например, до, одновременно или после) с любым количеством соответствующих модальностей лечения, включая, но без ограничения, лечение с помощью средств, таких как противовирусная терапия, цидофовир и интерлейкин-2, цитарабин (также известный как ARA-C), или лечение с помощью натализумаба для пациентов с MS, или лечение с помощью эфализумаба для пациентов с псориазом, или другие методы лечения для пациентов с PML. В других вариантах осуществления T-клетки настоящего изобретения могут использоваться в комбинации с химиотерапией, излучением, иммуносупрессивными средствами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммунодеструктивными средствами, такими как CAM PATH, анти-CD3 антитела или другие терапии антителами, цитоксином, флударибином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофеноловой кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и облучением. Данные препараты или ингибируют кальций-зависимую фосфатазу кальциневрин (циклоспорин и FK506), или ингибируют киназу p70S6, что важно для индуцируемой факторами роста сигнализации (рапамицин) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). В другом варианте осуществления клеточные композиции настоящего изобретения вводят пациенту в сочетании (например, до, одновременно или после) с трансплантацией костного мозга, T-клеточной аблативной терапией, используя или химиотерапевтические средства, такие как флударабин, наружная дистанционная лучевая терапия (XRT), циклофосфамид, или антитела, такие как OKT3 или CAMPATH. В другом варианте осуществления клеточные композиции настоящего изобретения вводят после B-клеточной аблативной терапии, такой как средства, которые реагируют с CD20, например, ритуксан. Например, в одном из вариантов осуществления индивиды могут проходить стандартное лечение с помощью высоких доз химиотерапии с последующей трансплантации стволовых клеток периферической крови. В определенных вариантах осуществления после трансплантата индивиды получали введение размноженных иммунных клеток настоящего изобретения. В дополнительном варианте осуществления размноженные клетки вводят до или после хирургии. Упомянутые модифицированные клетки, полученные посредством любого из способов, описанных в настоящем документе, могут использоваться в конкретном аспекте настоящего изобретения для лечения пациентов от отторжения хозяин против трансплантата (HvG) и заболевания трансплантат против хозяина (GvHD); следовательно, в объем настоящего изобретения попадает способ лечения пациентов от отторжения хозяин против трансплантата (HvG) и заболевания трансплантат против хозяина (GvHD), включающий лечение указанного пациента посредством введения указанному пациенту эффективного количества модифицированных клеток, содержащих инактивированные гены TCR-альфа и/или TCR-бета.
Пример способа получения аллогенных клеток человека способами генной инженерии для иммунотерапии
Для лучшего понимания настоящего изобретения один пример способа получения аллогенных клеток человека для иммунотерапии проиллюстрирован на фигуре 5. Данный способ включает комбинацию одной или нескольких из следующих стадий:
1. Наличие T-клеток из клеточной культуры или из образца крови от одного отдельного пациента или из банка крови и активация указанных T-клеток с помощью гранул активатора анти-CD3/C28. Гранулы обеспечивают как первичный, так и костимулирующий сигналы, которые требуются для активации и размножения T-клеток.
2. a) Трансдукция указанных клеток трансгеном pT-альфа или ее функционального варианта для поддержания поверхностной экспрессии CD3 и предоставления клетке возможности размножения посредством стимуляции комплекса CD3. Ожидается, что разрушение TCR элиминирует комплекс TCR и удалит аллореактивность (GvHD), но оно может изменить размножение аллогенных клеток из-за потери сигнального компонента CD3. Ожидается, что трансдуцированные клетки будут экспрессировать цепь pT-альфа или ее функциональный вариант. Данная цепь pT-альфа образует пару с цепью TCR-бета и сигнальными компонентами CD3 для образования комплекса пре-TCR и, посредством этого, восстановления функционального комплекса CD3 и поддержания активации или стимуляции инактивированных по TCR-альфа клеток. Трансдукция T-клеток с помощью лентивирусного вектора pT-альфа может быть осуществлена до или после инактивации TCR-альфа.
b) Трансдукция указанных клеток многоцепочечными CAR позволяет перенаправлять T-клетки против антигенов, экспрессированных на поверхности клеток-мишеней от различных злокачественных опухолей, включая лимфомы и солидные опухоли. Для улучшения функции костимулирующего домена изобретатели разработали многоцепочечный CAR, происходящий от FcεRI, как описано выше. Трансдукция может быть осуществлена до или после инактивации TCR-альфа и других генов, таких как гены CD52.
3. Инженерия не аллореактивных и иммуносупрессивно резистентных T-клеток:
a) Существует возможность инактивировать TCR-альфа в указанных клетках, для того чтобы элиминировать TCR с поверхности клетки и предотвратить распознавание посредством TCR аллогенных клеток ткани хозяина как чужой и, таким образом, избежать GvHD.
b) Также существует возможность инактивировать один ген, кодирующий мишень для иммуносупрессивного средства, для того чтобы сделать указанные клетки резистентными к иммуносупрессивному лечению для предотвращения отторжения трансплантата без воздействия на трансплантированные T-клетки. В данном примере мишенью иммуносупрессивных средств является CD52, и иммуносупрессивное средство представляет собой гуманизированное моноклональное анти-CD52 антитело.
Изобретателями было показано, что использование TALE-нуклеазы, делающее возможным более высокий уровень событий DSB в T-клетках, оказалось особенно выгодным для достижения вышеуказанной двойной инактивации в T-клетках. Предпочтительно, гены TCR-альфа и CD52 инактивируют посредством электропорирования T-клеток мРНК, кодирующей TALE-нуклеазу, нацеленную на указанные гены. Изобретателями было обнаружено, что использование мРНК, приводившее к высоким степеням трансформации, оказалось менее вредным для T-клеток и, таким образом, оказалось существенным в процессе инженерии T-клеток. Затем инактивированные T-клетки сортируют с помощью магнитных гранул. Например, T-клетки, экспрессирующие CD52, удаляли посредством фиксации на твердой поверхности, и инактивированные клетки не подвергали стрессу прохождения через колонку. Такой мягкий способ повышает концентрацию правильно сконструированных T-клеток.
4. Размножение in vitro сконструированных T-клеток перед введением пациенту или in vivo после введения пациенту посредством стимуляции комплекса CD3. Перед стадией введения пациенты могут подвергаться иммуносупрессивному лечению, как например, CAMPATH1-H, гуманизированным моноклональным анти-CD52 антителом.
5. Необязательно, указанные клетки подвергали воздействию биспецифических антител ex vivo до введения пациенту или in vivo после введения пациенту для приведения сконструированных клеток в непосредственную близость к антигену мишени.
Другие определения
- Если не указано иное, "по меньшей мере один" используется взаимозаменяемо и обозначает один или больше, чем один. - Аминокислотные остатки в полипептидной последовательности обозначены в настоящем документе в соответствии с однобуквенным кодом, в котором, например, Q обозначает Gln или остаток глутамина, R обозначает Arg или остаток аргинина, и D обозначает Asp или остаток аспарагиновой кислоты.
- Аминокислотная замена означает замещение одного аминокислотного остатка другим, например, замещение остатка аргинина остатком глутамина в пептидной последовательности представляет собой аминокислотную замену.
- Нуклеотиды обозначаются следующим образом: однобуквенный код используется для обозначения основания нуклеозида: a представляет собой аденин, t представляет собой тимин, c представляет собой цитозин, и g представляет собой гуанин. Для вырожденных нуклеотидов r обозначает g или a (пуриновые нуклеотиды), k обозначает g или t, s обозначает g или c, w обозначает a или t, m обозначает a или c, y обозначает t или c (пиримидиновые нуклеотиды), d обозначает g, a или t, v обозначает g, a или c, b обозначает g, t или c, h обозначает a, t или c, и n обозначает g, a, t или c.
- Как используется в настоящем документе, "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотиды" обозначает нуклеотиды и/или полинуклеотиды, такие как дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК), олигонуклеотиды, фрагменты, создаваемые полимеразной цепной реакцией (ПЦР), и фрагменты, создаваемые любым из лигирования, расщепления, действия эндонуклеазы и действия экзонуклеазы. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть составлены из мономеров, которые представляют собой природные нуклеотиды (как, например, ДНК и РНК), или аналоги природных нуклеотидов (например, энантиомерные формы природных нуклеотидов), или комбинацию тех и других. Модифицированные нуклеотиды могут иметь изменения во фрагментах сахаров и/или во фрагментах пиримидиновых или пуриновых оснований. Модификации сахаров включают, например, замену одной или нескольких гидроксильных групп галогенами, алкильными группами, аминами и азидогруппами, или сахара могут быть функционализированы как простые эфиры или сложные эфиры. Кроме того, весь фрагмент сахара может быть заменен стерически и электронно аналогичными структурами, такими как азасахара и карбоциклические аналоги сахаров. Примеры модификаций во фрагменте основания включают алкилированные пурины и пиримидины, ацилированные пурины или пиримидины или другие хорошо известные гетероциклические заместители. Мономеры нуклеиновой кислоты могут быть связаны фосфодиэфирными связями или аналогами таких связей. Нуклеиновые кислоты могут быть или одноцепочечными или двухцепочечными.
- Под "полинуклеотидом, последовательно содержащим первый участок гомологии с последовательностями в обратном направлении от указанного двухнитевого разрыва, последовательность, подлежащую вставке в геном указанной клетки, и второй участок гомологии с последовательностями в прямом направлении от от указанного двухнитевого разрыва" понимается конструкт или матрица ДНК, содержащие первую и вторую часть, которые гомологичны участкам 5' и 3' ДНК-мишени in situ. Конструкт ДНК также содержит третью часть, расположенную между первой и второй частью, которая имеет некоторую гомологию с соответствующей последовательностью ДНК in situ или, альтернативно, не имеет гомологии с участками 5' и 3' ДНК-мишени in situ. После расщепления ДНК-мишени возникает событие гомологичной рекомбинации между геномом, содержащим целевой ген, содержащийся в представляющем интерес локусе, и матрицей, причем геномная последовательность, содержащая ДНК-мишень, замещается третьей частью матрицы и вариабельной частью первой и второй частей указанной матрицы.
- Под "ДНК-мишенью", "последовательностью ДНК-мишени", "целевой последовательностью ДНК", "целевой последовательностью нуклеиновой кислоты", "последовательностью-мишенью" или "сайтом процессинга" понимается полинуклеотидная последовательность, на которую может быть направлена редкощепящая эндонуклеаза в соответствии с настоящим изобретением, и которая может быть ей обработана. Эти термины относятся к определенному местоположению ДНК, предпочтительно, местоположению генома в клетке, но также к части генетического материала, которая может существовать независимо от основной части генетического материала, как например, плазмиды, эписомы, вирус, транспозоны, или в органеллах, таких как митохондрии в качестве неограничивающего примера. В качестве неограничивающих примеров мишеней TALE-нуклеаз, целевые геномные последовательности обычно состоят из двух последовательностей длиной 17 п.о. (называемых полумишенями), разделенных спейсером 15 п.о. Каждая полумишень распознается повторами TALE-нуклеаз, перечисленных в таблицах 1, 5, 6 и 10 в качестве неограничивающих примеров, кодируемых в плазмидах, под контролем промотора EF1-альфа или промотора T7. Целевая последовательность нуклеиновой кислоты определяется последовательностью от 5' до 3' одной нити указанной мишени, как показано в таблицах 1, 5, 6 и 10.
- Под химерным антигенным рецептором (CAR) понимаются молекулы, которые объединяют связывающий домен против компонента, присутствующего на клетке-мишени, например, основанную на антителах специфичность к желаемому антигену (например, опухолевому антигену), с активирующим T-клеточный рецептор внутриклеточным доменом для создания химерного белка, который проявляет специфическую клеточную иммунную активность против мишени. Как правило, CAR состоит из внеклеточного одноцепочечного антитела (scFvFc), слитого с внутриклеточным сигнальным доменом дзета-цепи комплекса T-клеточного антигенного рецептора (scFvFc:ζ), и обладает способностью при экспрессии в T-клетках перенаправлять распознавание антигена на основании специфичности моноклонального антитела. Одним примером CAR, используемого в настоящем изобретении, является CAR, направленный против антигена CD19, и он может содержать в качестве неограничивающего примера аминокислотную последовательность: SEQ ID NO:73.
- Под "вектором доставки" или "векторами доставки" понимается любой вектор доставки, который можно использовать в настоящем изобретении для того, чтобы ввести в контакт с клеткой (т.е. "контактирование") или доставить внутрь клеток или внутриклеточных компартментов (т.е. "введение") средства/химические вещества и молекулы (белки или нуклеиновые кислоты), нужные в настоящем изобретении. Он включает, но без ограничения, липосомные векторы доставки, вирусные векторы доставки, лекарственные векторы доставки, химические носители, полимерные носители, липоплексы, полиплексы, дендримеры, микропузырьки (ультразвуковые контрастные средства), наночастицы, эмульсии или другие соответствующие векторы переноса. Данные векторы доставки делают возможной доставку молекул, химических веществ, макромолекул (генов, белков) или других векторов, таких как плазмиды, пептиды, разработанные Diatos. В этих случаях векторы доставки представляют собой молекулярные носители. Под "вектором доставки" или "векторами доставки" также понимаются способы доставки для осуществления трансфекции.
- Термины "вектор" или "векторы" относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. "Вектор" в настоящем изобретении включает, но без ограничения, вирусный вектор, плазмиду, РНК-вектор или линейную или кольцевую молекулу ДНК или РНК, которая может состоять из хромосомных, не хромосомных, полусинтетических или синтетических нуклеиновых кислот. Предпочтительными векторами являются способные к автономной репликации (эписомальный вектор) и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны (векторы экспрессии). Большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной области и коммерчески доступно.
Вирусные векторы включают ретровирус, аденовирус, парвовирус (например, аденоассоциированные вирусы), коронавирус, РНК-вирусы с отрицательной нитью, такие как ортомиксовирус (например, вирус гриппа), рабдовирус (например, вирус бешенства и везикулярного стоматита), парамиксовирус (например, кори и Сендай), РНК-вирусы с положительной нитью, такие как пикорнавирус и альфавирус, и вирусы с двухнитевой ДНК, включая аденовирус, вирус герпеса (например, вирус простого герпеса типов 1 и 2, вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус) и поксвирус (например, осповакцины, оспы кур и канарипокс). Другие вирусы включают, например, вирус Норфолк, тогавирус, флавивирус, реовирусы, паповавирус, гепаднавирус и вирус гепатита. Примеры ретровирусов включают: лейкоза-саркомы птиц, типа C млекопитающих, вирусы типа B, вирусы типа D, группы HTLV-BLV, лентивирус, спумавирус (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
- Под "лентивирусным вектором" понимаются основанные на ВИЧ лентивирусные векторы, которые являются очень перспективными для доставки генов из-за их относительно большой емкости упаковки, уменьшенной иммуногенности и их способности к стабильной трансдукции с высокой эффективностью большого диапазона различных типов клеток. Лентивирусные векторы обычно создают после временной трансфекции трех (упаковывающей, оболочки и переноса) или более плазмид в клетки-продуценты. Как и ВИЧ, лентивирусные векторы входят в клетку-мишень посредством взаимодействия вирусных поверхностных гликопротеинов с рецепторами на клеточной поверхности. При входе вирусная РНК подвергается обратной транскрипции, которая опосредуется комплексом вирусной обратной транскриптазы. Продуктом обратной транскрипции является двухцепочечная линейная вирусная ДНК, которая является субстратом для вирусной интеграции в ДНК инфицированных клеток. Под "интегративными лентивирусными векторами (или LV)" понимаются такие векторы, в качестве неограничивающего примера, которые способны интегрироваться в геном клетки-мишени. Напротив, под "неинтегративными лентивирусными векторами (или NILV)" понимаются эффективные векторы доставки генов, которые не интегрируются в геном клетки-мишени посредством действия интегразы вируса.
- Векторы доставки и векторы могут быть связаны или объединены с любыми методами клеточной пермеабилизации, такими как сонопорация, или электропорация, или производные данных методов.
- Под клеткой или клетками понимаются любые эукариотические живые клетки, первичные клетки и клеточные линии, происходящие от этих организмов, для культур in vitro.
- Под "первичной клеткой" или "первичными клетками" понимаются клетки, взятые непосредственно из живой ткани (т.е. биопсийного материала) и адаптированные для роста in vitro, которые подвергались очень небольшому количеству удвоений популяции и, следовательно, лучше представляют главные функциональный компоненты и характеристики тканей, из которых они происходят, по сравнению с непрерывными опухолеродными или искусственно иммортализованными клеточными линиями.
В качестве неограничивающих примеров, клеточные линии могут быть выбраны из группы, состоящей из клеток CHO-K1; клеток HEK293; клеток Caco2; клеток U2-OS; клеток NIH 3T3; клеток NSO; клеток SP2; клеток CHO-S; клеток DG44; клеток K-562, клеток U-937; клеток MRC5; клеток IMR90; клеток Jurkat; клеток HepG2; клеток HeLa; клеток HT-1080; клеток HCT-116; клеток Hu-h7; клеток Huvec; клеток Molt 4.
Все эти клеточные линии могут быть модифицированы с помощью способа настоящего изобретения для получения моделей клеточных линий для производства, экспрессии, количественного анализа, детектирования, исследования представляющего интерес гена или белка; данные модели могут быть также использованы для скрининга представляющих интерес биологически активных молекул при исследовании и производстве и в различных областях, таких как химические продукты, биотопливо, терапевтические средства и агрономия в качестве неограничивающих примеров.
- под "мутацией" понимается замена, удаление, вставка вплоть до одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати, пятнадцати, двадцати, двадцати пяти, тридцати, сорока, пятидесяти или более нуклеотидов/аминокислот в полинуклеотидной (кДНК, ген) или полипептидной последовательности. Мутация может воздействовать на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Она может также воздействовать на структуру геномной последовательности или структуру/стабильность кодируемой мРНК.
- под "вариантом(ами)" понимается вариант повтора, вариант, вариант связывания ДНК, вариант TALE-нуклеазы, вариант полипептида, полученный посредством мутации или замены по меньшей мере одного остатка в аминокислотной последовательности родительской молекулы.
- под "функциональным вариантом" понимается каталитически активный мутант белка или белкового домена; такой мутант может иметь такую же активность как и его родительский белок или белковый домен или дополнительные свойства или более высокую или более низкую активность.
- Под "геном" понимается основная единица наследственности, состоящая из сегмента ДНК, расположенного линейным образом вдоль хромосомы, который кодирует специфический белок или сегмент белка. Ген обычно включает промотор, 5'-нетранслируемую область, одну или несколько кодирующих последовательностей (экзоны), необязательно, интроны, 3'-нетранслируемую область. Ген может дополнительно содержать терминатор, энхансеры и/или сайленсеры.
- Как используется в настоящем документе, термин "локус" обозначает определенное физическое местоположение последовательности ДНК (например, гена) на хромосоме. Термин "локус" может относиться к определенному физическому местоположению последовательности-мишени редкощепящей эндонуклеазы на хромосоме. Такой локус может содержать последовательность-мишень, которая распознается и/или расщепляется редкощепящей эндонуклеазой в соответствии с настоящим изобретением. Следует понимать, что представляющий интерес локус настоящего изобретения может не только определять последовательность нуклеиновой кислоты, которая существует в основной части генетического материала (т.е. в хромосоме) клетки, но также часть генетического материала, которая может существовать независимо от указанной основной части генетического материала, такую как плазмиды, эписомы, вирус, транспозоны, или в органеллах, таких как митохондрии в качестве неограничивающих примеров.
- Термин "эндонуклеаза" относится к любому ферменту дикого типа или его варианту, способному катализировать гидролиз (расщепление) связей между нуклеиновыми кислотами в молекуле ДНК или РНК, предпочтительно молекуле ДНК. Эндонуклеазы не расщепляют молекулу ДНК или РНК независимо от ее последовательности, но распознают и расщепляют молекулу ДНК или РНК у определенных полинуклеотидных последовательностей, далее называемых "последовательности-мишени" или "сайты-мишени". Эндонуклеазы могут быть классифицированы как редкощепящие эндонуклеазы, когда они имеют, как правило, полинуклеотидный сайт распознавания, больший, чем 12 пар оснований (п.о.) в длину, более предпочтительно, равный 14-55 п.о. Редкощепящие эндонуклеазы значительно увеличивают HR посредством индуцирования двухнитевых разрывов ДНК (DSB) в определенном локусе (Rouet, Smih et al., 1994; Choulika, Perrin et al., 1995; Pingoud and Silva, 2007). Редкощепящие эндонуклеазы могут, например, представлять собой хоминг-эндонуклеазу (Paques and Duchateau, 2007), химерную цинковопальцевую нуклеазу (ZFN), получающуюся от слияния сконструированных цинковопальцевых доменов с каталитическим доменом рестрикционного фермента, такого как FokI (Porteus and Carroll, 2005), или химическую эндонуклеазу (Eisenschmidt, Lanio et al., 2005; Arimondo, Thomas et al., 2006). В химических эндонуклеазах химический или пептидный расщепитель конъюгирован или с полимером нуклеиновых кислот, или с другой ДНК, распознающей определенную последовательность-мишень, посредством этого направляя расщепляющую активность на определенную последовательность. Химические эндонуклеазы также включают синтетические нуклеазы, такие как конъюгаты ортофенантролина, ДНК-расщепляющую молекулу, и триплексформирующие олигонуклеотиды (TFO), которые, как известно, связывают определенные последовательности ДНК (Kalish and Glazer, 2005). Такие химические эндонуклеазы заключены в термине "эндонуклеаза" в соответствии с настоящим изобретением.
Редкощепящие эндонуклеазы могут также представлять собой, например, TALE-нуклеазы, новый класс химерных нуклеаз, использующий каталитический домен FokI и ДНК-связывающий домен, происходящий от подобного активатору транскрипции эффектора (TALE), семейства белков, используемых в инфекционном процессе патогенами растений рода Xanthomonas (Boch, Scholze et al., 2009; Moscou and Bogdanove, 2009; Christian, Cermak et al., 2010; Li, Huang et al.). Функциональная компоновка основанной на FokI TALE-нуклеазы (TALE-нуклеазы) по существу такая же, как у ZFN, но цинковопальцевый ДНК-связывающий домен заменен на домен TALE. Как таковое, расщепление ДНК TALE-нуклеазой требует двух распознающих ДНК участков, фланкирующих неспецифический центральный участок. Редкощепящие эндонуклеазы, охватываемые настоящим изобретением, могут также происходить от TALE- нуклеаз.
Редкощепящая эндонуклеаза может представлять собой хоминг-эндонуклеазу, также известную под названием мегануклеазы. Такие хоминг-эндонуклеазы хорошо известны в данной области (Stoddard, 2005). Хоминг-эндонуклеазы распознают целевую последовательность ДНК и создают одно- или двухнитевой разрыв. Хоминг-эндонуклеазы высоко специфичны, распознавая сайты-мишени ДНК в диапазоне от 12 до 45 пар оснований (п.о.) в длину, обычно в диапазоне от 14 до 40 п.о. в длину. Хоминг-эндонуклеаза в соответствии с настоящим изобретением может, например, соответствовать эндонуклеазе LAGLIDADG ("LAGLIDADF" раскрыто как SEQ ID NO:127), эндонуклеазе HNH или эндонуклеазе GIY-YIG. Предпочтительная хоминг-эндонуклеаза в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой вариант I-Crel.
- Под "TALE-нуклеазой" (TALEN) понимается слитый белок, состоящий из связывающего нуклеиновую кислоту домена, обычно происходящего от подобного активатору транскрипции эффектора (TALE), и одного нуклеазного каталитического домена для расщепления целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Каталитический домен, предпочтительно, представляет собой нуклеазный домен и, более предпочтительно, домен, обладающий эндонуклеазной активностью, такой как, например, I-Tevl, ColE7, NucA и Fok-I. В конкретном варианте осуществления домен TALE может быть слит с мегануклеазой, такой как, например, I-Crel и I-Onul, или ее функциональным вариантом. В более предпочтительном варианте осуществления указанная нуклеаза представляет собой мономерную TALE-нуклеазу. Мономерная TALE-нуклеаза представляет собой TALE-нуклеазу, которая не требует димеризации для специфического распознавания и расщепления, такого как слияния сконструированных TAL-повторов с каталитическим доменом I-Tevl, описанные в WO2012138927. Подобный активатору транскрипции эффектор (TALE) представляет собой белки из вида бактерий Xanthomonas, которые содержат множество повторяющихся последовательностей, причем каждый повтор содержит два остатка в положении 12 и 13 (RVD), которые специфичны для каждого нуклеотидного основания целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Связывающие домены со схожими свойствами модульного связывания нуклеиновых кислот основание за основанием (MBBBD) могут также происходить от новых модульных белков, недавно обнаруженных заявителем в другом виде бактерий. Новые модульные белки имеют преимущество в том, что демонстрируют большую изменчивость последовательности, чем TAL-повторы. Предпочтительно, RVD, связанные с распознаванием различных нуклеотидов, представляют собой HD для распознавания C, NG для распознавания T, NI для распознавания A, NN для распознавания G или A, NS для распознавания A, C, G или T, HG для распознавания T, IG для распознавания T, NK для распознавания G, HA для распознавания C, ND для распознавания C, HI для распознавания C, HN для распознавания G, NA для распознавания G, SN для распознавания G или A и YG для распознавания T, TL для распознавания A, VT для распознавания A или G и SW для распознавания A. В другом варианте осуществления существенные аминокислоты 12 и 13 могут мутировать в направлении других аминокислотных остатков, для того чтобы модулировать их специфичность в направлении нуклеотидов A, T, C и G и, в частности, усиливать эту специфичность. TALE-нуклеаза уже была описана и использована для стимулирования нацеливания на гены и модификаций генов (Boch, Scholze et al., 2009; Moscou and Bogdanove, 2009; Christian, Cermak et al., 2010; Li, Huang et al.). Сконструированные TAL-нуклеазы коммерчески доступны под торговым наименованием TALEN™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, Франция).
- Термин "расщепление" относится к разрыву ковалентного остова полинуклеотида. Расщепление может быть инициировано множеством способов, включая, но без ограничения, ферментативный или химический гидролиз фосфодиэфирной связи. Возможны как однонитевое расщепление, так и двухнитевое расщепление, и двухнитевое расщепление может происходить в результате двух различных событий однонитевого расщепления. Двухнитевое расщепление ДНК, РНК или гибрида ДНК/РНК может приводить к получению или тупых концов, или ступенчатых концов.
- Под "слитым белком" понимается результат хорошо известного в данной области процесса, состоящего в соединении двух или более генов, которые исходно кодируют отдельные белки или их часть, причем трансляция указанного "слитого гена" приводит к одному полипептиду с функциональными свойствами, происходящими от каждого из исходных белков.
- "Идентичность" относится к идентичности последовательностей между двумя молекулами нуклеиновой кислоты или полипептидами. Идентичность можно определять посредством сравнения положения в каждой последовательности, которое с целью сравнения может быть выровнено. Когда положение в сравниваемой последовательности занято тем же основанием, то молекулы идентичны в этом положении. Степень сходства или идентичности между нуклеиновокислотными или аминокислотными последовательностями является функцией количества идентичных или совпадающих нуклеотидов в положениях, общих для данных последовательностей нуклеиновой кислоты. Можно использовать различные алгоритмы и/или программы выравнивания для вычисления идентичности между двумя последовательностями, включая FASTA или BLAST, который доступен как часть пакета для анализа последовательностей GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.) и может быть использован, например, с установками по умолчанию. Например, рассматриваются полипептиды, имеющие идентичность по меньшей мере 70%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% с определенными полипептидами, описанными в настоящем документе, и, предпочтительно, проявляющие по существу те же функции, а также полинуклеотид, кодирующий такие полипептиды.
- "сходство" описывает отношение между аминокислотными последовательностями двух или более полипептидов. Можно также использовать BLASTP для идентификации аминокислотной последовательности, имеющей сходство последовательности по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% с эталонной аминокислотной последовательностью, с помощью матрицы сходства, такой как BLOSUM45, BLOSUM62 или BLOSUM80. Если не указано иное, оценка сходства будет основываться на использовании BLOSUM62. Когда используется BLASTP, процентное сходство основывается на оценке положительных результатов BLASTP, и процентная идентичность последовательности основывается на оценке идентичности BLASTP. "Идентичность" в BLASTP показывает количество и долю всех остатков в парах последовательностей с высокой оценкой, которые идентичны; и "число положительных результатов" BLASTP показывает количество и долю остатков, для которых оценки выравнивания имеют положительные значения, и которые схожи друг с другом. Аминокислотные последовательности, имеющие такие степени идентичности или сходства или любую промежуточную степень идентичности или сходства с аминокислотными последовательностями, раскрытыми в настоящем документе, рассматриваются и охвачены настоящим раскрытием. Полинуклеотидные последовательности схожих полипептидов определяют с использованием генетического кода, и они могут быть получены обычными средствами. Например, функциональный вариант pT-альфа может иметь сходство последовательности 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:107. Полинуклеотид, кодирующий такой функциональный вариант, может быть получен посредством обратной трансляции его аминокислотной последовательности с помощью генетического кода.
- "передающий сигнал домен" или "костимулирующий лиганд" обозначает молекулу на антиген-презентирующей клетке, которая специфически связывает распознанную костимулирующую молекулу на T-клетке, посредством этого обеспечивая сигнал, который, в дополнение к первичному сигналу, обеспечиваемому, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с молекулой MHC, нагруженной пептидом, опосредует T-клеточный ответ, включая, но без ограничения, активацию пролиферации, дифференцировку и тому подобное. Костимулирующий лиганд может включать, но без ограничения, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, рецептор лимфотоксина-бета, 3/TR6, ILT3, ILT4, агонист или антитело, которое связывает рецептор толл-лиганда, и лиганд, который специфически связывается с B7-H3. Костимулирующий лиганд также охватывает, в числе прочего, антитело, которое специфически связывается с костимулирующей молекулой, присутствующей на T-клетке, такой как, но без ограничения, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, функционально-связанный антиген-1 лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, лиганд, который специфически связывается с CD83.
"Костимулирующая молекула" обозначает распознанного партнера по связыванию на T-клетке, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, тем самым опосредуя костимулирующий ответ клетки, такой как, но без ограничения, пролиферация. Костимулирующие молекулы включают, но без ограничения, молекулу MHC класса I, BTLA и рецептор толл-лиганда.
"Костимулирующий сигнал", как используется в настоящем документе, обозначает сигнал, который в комбинации с первичным сигналом, таким как лигирование TCR/CD3, приводит к пролиферации и/или повышающей регуляции T-клеток или понижающей регуляции основных молекул.
- "биспецифическое антитело" обозначает антитело, которое имеет связывающие сайты для двух различных антигенов в одной молекуле антитела. Специалистам в данной области понятно, что в дополнение к канонической структуре антитела могут быть сконструированы другие молекулы с двумя специфичностями связывания. Кроме того, следует понимать, что связывание антигена биспецифическими антителами может быть одновременным или последовательным. Биспецифические антитела могут быть получены с помощью химических методов (см., например, Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807), методами "polydoma" (см. патент США № 4474893) или методами рекомбинантной ДНК, все из которых известны per se. В качестве неограничивающего примера, каждый связывающий домен содержит по меньшей мере один вариабельный участок от тяжелой цепи антитела ("участок VH или H"), причем участок VH первого связывающего домена специфически связывается с маркером лимфоцитов, таким как CD3, и участок VH второго связывающего домена специфически связывается с опухолевым антигеном.
- Термин "внеклеточный лигандсвязывающий домен", как используется в настоящем документе, определяют как олиго- или полипептид, который способен к связыванию лиганда. Предпочтительно, данный домен будет способен к взаимодействию с молекулой клеточной поверхности. Например, внеклеточный лигандсвязывающий домен может быть выбран для распознавания лиганда, который действует в качестве маркера клеточной поверхности на клетках-мишенях, связанных с конкретным состоянием заболевания. Таким образом, примеры маркеров клеточной поверхности, которые могут действовать как лиганды, включают связанные с вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, аутоиммунным заболеванием и раковыми клетками.
Термин "индивид" или "пациент", как используется в настоящем документе, включает всех членов царства животных, включая отличных от человека приматов и людей.
Приведенное выше описание настоящего изобретения предлагает способ и процесс его осуществления и применения, так что любой специалист в данной области может его осуществлять и применять, причем данная возможность обеспечена, в частности, для содержания прилагаемой формулы изобретения, которое составляет часть исходного описания.
Там, где в настоящем документе установлен числовой предел или диапазон, включены концевые точки. Кроме того, все значения и поддиапазоны в границах числового предела или диапазона прямо включены, как если бы они были явно указаны.
Приведенное выше описание представлено, чтобы дать возможность специалисту в данной области осуществлять и применять настоящее изобретение, и приведено в контексте конкретного применения и его требований. Различные модификации предпочтительных вариантов осуществления будут очевидны специалистам в данной области, и общие принципы, определенные в настоящем документе, могут быть применены к другим вариантам осуществления и применениям без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, не предполагается, что настоящее изобретение ограничено показанными вариантами осуществления, но должно соответствовать самому широкому объему, совместимому с принципами и признаками, раскрытыми в настоящем документе.
После общего описания настоящего изобретения дополнительное понимание может быть получено посредством ссылки на определенные конкретные примеры, которые приведены в настоящем документе только с целью иллюстрации, и не предназначены для ограничения, если не указано иное.
Примеры
Пример 1: TALE-нуклеазы, расщепляющие ген GR человека
Было разработано и получено 6 гетеродимерных TALE-нуклеаз, нацеленных на экзоны гена GR человека. Таблица 1 ниже указывает последовательности-мишени, расщепляемые каждой TALE-нуклеазой. TALE-нуклеаза GR состоит из двух независимых единиц (называемых половинами TALE-нуклеазы), причем каждая содержит повторную последовательность, сконструированную для связи и расщепления последовательности-мишени GR, состоящей из двух последовательностей длиной 17 п.о. (называемых полумишенями), разделенных спейсером 15 п.о.
Аминокислотные последовательности N-концевого, C-концевого доменов и повтора основаны на TALE AvrBs3 (ref: GenBank: X16130.1). C-концевой и N-концевой домены разделены двумя сайтами рестрикции BsmBI. Наборы повторов (SEQ ID NO:7-18), нацеленных на желаемые последовательности (SEQ ID NO:1-6), синтезировали с помощью способа твердой подложки, состоящего из последовательных стадий рестрикции/лигирования/промывания (международная заявка PCT WO2013/017950). Кратко говоря, первый блок (кодирующий двойной повтор) иммобилизовывали на твердой подложке посредством взаимодействия биотин/стрептавидин, затем второй блок (тройной повтор) лигировали к первому и после расщепления SfaNI присоединяли третий блок (тройной повтор). Данный процесс повторяли, используя блоки тройных или двойных повторов до получения желаемого набора повторов. Затем продукт клонировали в классической плазмиде для клонирования pAPG10 для амплификации в E. coli и секвенировали. Последовательности наборов повторов, полученные таким образом, субклонировали в дрожжевом TALE-векторе экспрессии, используя ферменты рестрикции BsmBI типа IIS для получения плазмиды и BbvI и SfaNI для вставляемой последовательности повтора. ДНК, кодирующую половину TALE-нуклеазы, содержащую происходящий от TALE ДНК-связывающий домен, слитый с каталитическим доменом фермента рестрикции FokI, амплифицировали в E. Coli, выделяли с помощью стандартных минипрепаративных методов и секвенировали для определения целостности вставки.
Активность TALE-нуклеазы GR в дрожжах:
Нуклеазную активность шести GR-TALE-нуклеаз проверяли при 37°C и 30°C в нашем SSA-анализе в дрожжах, описанном ранее (международные заявки PCT WO 2004/067736 и в Epinat, Arnould et al., 2003; Chames, Epinat et al., 2005; Arnould, Chames et al., 2006; Smith, Grizot et al., 2006), на мишенях, содержащих две последовательности-мишени TALE, обращенные друг к другу на нити ДНК, разделенные спейсером в 15 п.о., что давало SEQ ID NO:1-6. Все дрожжевые целевые репортерные плазмиды, содержащие целевые последовательности ДНК TALE-нуклеазы, конструировали, как описано выше (международные заявки PCT WO 2004/067736 и в Epinat, Arnould et al., 2003; Chames, Epinat et al., 2005; Arnould, Chames et al., 2006; Smith, Grizot et al., 2006). Уровень TALE-нуклеазной расщепляющей активности в дрожжах отдельных клонов на мишенях представлен в таблице 2.
Значения содержатся между 0 и 1. Максимальное значение составляет 1.
Активность TALE-нуклеаз GR в клетках HEK293:
Каждый TALE-нуклеазный конструкт субклонировали, используя расщепление ферментом рестрикции в векторе экспрессии млекопитающих под контролем длинного промотора pEF1-альфа.
Один миллион клеток HEK293 высевали за один день до трансфекции. Клетки котрансфицировали 2,5 мкг каждой из двух плазмид, кодирующих левую и правую половину TALE-нуклеаз GRex2, GRex3T2, GRex3T4, GRex5T1, GRex5T2 или GRex5T3, распознающих представляющие интерес геномные последовательности двух полумишеней в гене GR под контролем промотора EF1-альфа, используя 25 мкл липофектамина (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. В качестве контроля клетки котрансфицировали 2,5 мкг каждой из двух плазмид, кодирующих левую и правую половины TALE-нуклеаз, нацеленных на сайт-мишень ((TALE-нуклеаза TRAC_T01-L и -R (SEQ ID NO:41 и SEQ ID NO:42), сайт-мишень TRAC_T01 (SEQ ID NO:37)) участка константной альфа-цепи (TRAC_T01) T-клеточного рецептора под контролем промотора EF1-альфа. Двухнитевой разрыв, создаваемый TALE-нуклеазами в последовательности, кодирующей GR, индуцировал негомологичное соединение концов (NHEJ), которое представляет собой механизм, подверженный ошибкам. Активность TALE-нуклеаз измеряли по частоте вставок или делеций в целевом геномном локусе.
Через 2 или 7 дней после трансфекции клетки собирали, и осуществляли локус-специфические ПЦР на геномной ДНК, экстрагированной с использованием следующих составных праймеров: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3' (прямая адапторная последовательность, SEQ ID NO:126) -10N (TAG)- локус-специфическая прямая последовательность для экзона 2 GR: 5'-GGTTCATTTAACAAGCTGCC-3' (SEQ ID NO:127; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:31), для экзона 3 GR: 5'-GCATTCTGACTATGAAGTGA-3' (SEQ ID NO:128; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:32) и для экзона 5 GR: 5'-TCAGCAGGCCACTACAGGAGTCTCACAAG-3' (SEQ ID NO:129; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:33) и обратный составной праймер 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3' (обратная адапторная последовательность, SEQ ID NO:130))- локус-специфическая обратная последовательность для экзона 2 GR: 5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3' (SEQ ID NO:131; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:34), для экзона 3 GR: 5'-GGGCTTTGCATATAATGGAA-3' (SEQ ID NO:132; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:35) и для экзона 5 GR: 5'-CTGACTCTCCCCTTCATAGTCCCCAGAAC-3' (SEQ ID NO:133; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:36).
Продукты ПЦР секвенировали с помощью системы секвенирования 454 (454 Life Sciences). Получали приблизительно 10000 последовательностей на продукт ПЦР, и затем их анализировали на присутствие событий сайт-специфических вставок или делеций. Таблица 3 указывает процентную долю последовательностей, демонстрирующих вставки или делеции в сайте-мишени TALE-нуклеазы, от общего числа последовательностей в образце. В таблице 3 приведены для GRex2, GRex3T2 и GRex3T4 результаты типичного эксперимента.
Во всех исследованных случаях % мутагенеза был на день 7 близок при сравнении с образцом на день 2 после трансфекции. Природу событий мутагенеза также проанализировали, обнаружив во всех случаях преимущество делеций по сравнению со вставками.
Таблица 3 Процентная доля направленного мутагенеза в сайтах-мишенях эндогенных TALE-нуклеаз клеток HEK293 |
|||
Мишень | % вставок-делеций на день 2 при трансфекции TALE-нуклеазой GR | % вставок-делеций на день 7 при трансфекции TALE-нуклеазой GR | % вставок-делеций на день 2 при контрольной трансфекции TALE-нуклеазой TRAC_T01 |
GRex2 | 20,3 | 24,9 | 0,5 |
GRex3T2 | 9,3 | 9,8 | 0 |
GRex3T4 | 19 | 18,3 | 0,0 |
GRex5T1 | 11,2 | NA | 0,7 |
GRex5T2 | 3,4 | NA | 0 |
GRex5T3 | 8,3 | NA | 0 |
Активность TALE-нуклеаз GR в первичных T-лимфоцитах:
Каждый TALE-нуклеазный конструкт субклонировали, используя расщепление ферментом рестрикции в векторе экспрессии под контролем промотора T7.
мРНК, кодирующую TALE-нуклеазы, расщепляющие геномные последовательности GR, синтезировали из каждой плазмиды, несущей кодирующие последовательности в прямом направлении от промотора T7. T-лимфоциты, выделенные из периферической крови, активировали в течение 5 дней с использованием гранул активатора анти-CD3/CD28 (Life technologies), и 5 миллионов клеток трансфицировали посредством электропорации 10 мкг каждой из 2 мРНК, кодирующих обе половины TALE-нуклеазы, используя прибор CytoLVT-P (BTX-Harvard apparatus). T-клетки, трансфицированные 10 мкг каждой из 2 мРНК, кодирующих обе половины TALE-нуклеазы, нацеленные на ген CD52 (CD52_T02-L и -R TALEN (SEQ ID NO:55 и 56), последовательность-мишень CD52_T02 SEQ ID NO:40) использовали в качестве контроля.
Через 3 и 7 дней после трансфекции геномную ДНК выделели из трансфицированных клеток и осуществляли локус-специфические ПЦР, используя праймеры, описанные ранее. Продукты ПЦР секвенировали с помощью системы секвенирования 454 (454 Life Sciences). Получали приблизительно 10000 последовательностей на продукт ПЦР, и затем их анализировали на присутствие событий сайт-специфических вставок или делеций; результаты приведены в таблице 4.
Таблица 4 Процентная доля направленного мутагенеза в сайтах-мишенях эндогенных TALE-нуклеаз в первичных T-лимфоцитах |
|||
Мишень | % вставок-делеций на день 3 при трансфекции TALE-нуклеазой GR | % вставок-делеций на день 7 при трансфекции TALE-нуклеазой GR | % вставок-делеций на день 3 при контрольной трансфекции TALE-нуклеазой CD52 |
GRex2 | 26,2 | 30,7 | 0,7 |
GRex3T2 | 1,09 | 0,86 | 0,02 |
GRex3T4 | 6,3 | 6,93 | 0 |
GRex5T1 | 0,04 | 0,035 | 0,05 |
GRex5T2 | 1,3 | 1,0 | 0,22 |
GRex5T3 | 17,4 | NA | 0,41 |
Пример 2: TALE-нуклеазы, расщепляющие ген CD52 человека, константной цепи альфа T-клеточного рецептора человека (TRAC) и константных цепей бета 1 и 2 T-клеточного рецептора человека (TRBC)
Как описано в примере 1, были разработаны и получены гетеродимерные TALE-нуклеазы, нацеленные на гены CD52, TRAC и TRBC, соответственно. Целевые геномные последовательности состоят из двух последовательностей длиной 17 п.о. (называемых полумишенями), разделенных спейсером в 11 или 15 п.о. Каждая полумишень распознается повторами половин TALE-нуклеаз, приведенных в таблице 5. Геном человека содержит две функциональные бета-цепи T-клеточного рецептора (TRBC1 и TRBC2). Во время развития альфа/бета T-лимфоцитов одна из этих двух константных цепей выбирается в каждой клетке для сплайсига в вариабельный участок TCR-бета и образует функциональную полноразмерную бета-цепь. 2 мишени TRBC были выбраны в последовательностях, консервативных между TRBC1 и TRBC2, так что соответствующая TALE-нуклеаза будет расщеплять как TRBC1, так в то же время и TRBC2.
Были разработаны и другие последовательности-мишени в генах TRAC и CD52, которые приведены в таблице 6.
Активность CD52-TALE-нуклеазы, TRAC-TALE-нуклеазы и TRBC-TALE-нуклеазы в клетках HEK293
Каждый TALE-нуклеазный конструкт субклонировали, используя расщепление ферментом рестрикции в векторе экспрессии млекопитающих под контролем длинного промотора pEF1-альфа. Один миллион клеток HEK293 высевали за один день до трансфекции. Клетки котрансфицировали 2,5 мкг каждой из двух плазмид, кодирующих TALE-нуклеазы, распознающие две полумишени в представляющей интерес геномной последовательности в гене CD52, участка константной цепи альфа T-клеточного рецептора (TRAC) или участка константной цепи бета T-клеточного рецептора (TRBC) под контролем промотора EF1-альфа, или 5 мкг контрольного вектора pUC (pCLS0003), используя 25 мкл липофектамина (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Двухнитевое расщепление, создаваемое TALE-нуклеазами в последовательности, кодирующей CD52 или TRAC, восстанавливалось в живых клетках посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), которое представляет собой механизм, подверженный ошибкам. Активность TALE-нуклеаз в живых клетках измеряли по частоте вставок или делеций в целевом геномном локусе. Через 48 часов после трансфекции геномную ДНК выделели из трансфицированных клеток, и осуществляли локус-специфические ПЦР с использованием следующих составных праймеров: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (прямая адапторная последовательность, SEQ ID NO:126)- 10N (TAG)- локус-специфическая прямая последовательность для CD52: 5'-CAGATCTGCAGAAAGGAAGC-3' (SEQ ID NO:134; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:66), для TRAC: 5'-ATCACTGGCATCTGGACTCCA-3' (SEQ ID NO:135; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:67), для TRBC1: 5'-AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3' (SEQ ID NO:136; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:68) или для TRBC2: 5'-GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3' (SEQ ID NO:137; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:69) и обратный составной праймер 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (обратная адапторная последовательность, SEQ ID NO:130)-эндогенная локус-специфическая обратная последовательность для CD52: 5'-CCTGTTGGAGTCCATCTGCTG-3' (SEQ ID NO:138; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:70), для TRAC: 5'-CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3' (SEQ ID NO:139; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:71), для TRBC1 и TRBC2: 5'-ACCAGCTCAGCTCCACGTGGT-3' (SEQ ID NO:140; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:72). Продукты ПЦР секвенировали с помощью системы секвенирования ПЦР 454 (454 Life Sciences). Получали приблизительно 10000 последовательностей на продукт ПЦР, и затем их анализировали на присутствие событий сайт-специфических вставок или делеций; результаты приведены в таблице 7.
Таблица 7 Процентные доли вставок-делеций для TALE-нуклеазы, нацеленной на мишени CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 и TRBC_T02 |
||
Мишень | % вставок-делеций при трансфекции TALE-нуклеазой | % вставок-делеций контрольной трансфекции pUC |
CD52_T02 | 28,0 | 0,9 |
TRAC_T01 | 41,9 | 0,3 |
TRBC_T01 в константной цепи 1 | 3,81 | 0 |
TRBC_T01 в константной цепи 2 | 2,59 | 0 |
TRBC_T02 в константной цепи 1 | 14,7 | 0 |
TRBC_T02 в константной цепи 1 | 5,99 | 0 |
Активность CD52-TALE-нуклеазы, TRBC-TALE-нуклеазы и TRAC-TALE-нуклеазы в первичных T-лимфоцитах
Каждый TALE-нуклеазный конструкт субклонировали, используя расщепление ферментом рестрикции в векторе экспрессии млекопитающих под контролем промотора T7.
мРНК, кодирующую TALE-нуклеазу, расщепляющую геномные последовательности CD52 TRAC и TRBC, синтезировали из плазмиды, несущей кодирующие последовательности в прямом направлении от промотора T7. T-лимфоциты, выделенные из периферической крови, активировали в течение 5 дней с использованием гранул активатора анти-CD3/CD28 (Life technologies), и затем 5 миллионов клеток трансфицировали посредством электропорации 10 мкг каждой из 2 мРНК, кодирующих обе половины TALE-нуклеазы (или некодирующей РНК в качестве контроля), используя прибор CytoLVT-P. В результате вставок и делеций, индуцированных NHEJ, кодирующая последовательность для CD52 и/или TRAC оказывается в части клеток вне пределов рамки, что ведет к нефункциональным генам. Через 5 дней после электропорации клетки помечали конъюгированным с флуорохромом анти-CD52 или анти-TCR антителом посредством проточной цитометрии на присутствие CD52 или TCR на их клеточной поверхности. Поскольку все T-лимфоциты, размноженные из периферической крови, обычно экспрессируют CD52 и TCR, соотношение CD52-отрицательных или TCR-отрицательных клеток является прямой мерой TALE-нуклеазной активности. В таблице 8 приведены результаты типичного эксперимента. Таблица 9 показывает результаты типичного эксперимента для определения эффективности TALE-нуклеазы TRBC.
Таблица 8 Процентные доли CD52-отрицательных, TCR-отрицательных и CD52/TCR-двойных отрицательных T-лимфоцитов после трансфекции соответствующих экспрессирующих TALE-нуклеазу полинуклеотидов. |
|||
Трансфицированная РНК | % CD52-отрицательных клеток | % TCR-отрицательных клеток | % CD52/TCR двойных отрицательных клеток |
Некодирующая РНК | 1,21 | 1,531 | 0,111 |
TALEN CD52_T02 | 49,2 | 1,6 | 0,78 |
TALEN TRAC_T01 | 2,16 | 44,8 | 0,97 |
TALEN CD52_T02+TALEN TRAC_T01 | 29,3 | 39,6 | 15,5 |
Таблица 9 Процентные доли TCR-отрицательных T-лимфоцитов после трансфекции экспрессирующих TALE-нуклеазу TRBC полинуклеотидов |
|
Трансфицированная РНК | % TCR-отрицательных клеток |
Нет РНК | 1,22 |
TALEN TRBC_T01 | 6,52 |
TALEN TRBC_T02 | 23,5 |
Функциональный анализ T-клеток с целевым геном CD52
Целью инактивации гена CD52 является получение T-лимфоцитов, резистентных к опосредованной анти-CD52 антителом иммуносупрессии. Как описано в предыдущем абзаце, T-лимфоциты трансфицировали мРНК, кодирующей TALE-нуклеазу, расщепляющую CD52. Через 7 дней после трансфекции клетки обрабатывали 50 мкг/мл моноклонального анти-CD52 антитела (или крысиным IgG в качестве контроля) с или без 30% кроличьего комплемента (Cedarlane). После 2 часов инкубации при 37°C клетки помечали конъюгированным с флуорохромом анти-CD52 антителом вместе с флуоресцентным красителем для определения жизнеспособности (eBioscience) и анализировали посредством проточной цитометрии для измерения частоты CD52-положительных и CD52-отрицательных клеток среди живых клеток. Фигура 6 показывает результат типичного эксперимента, демонстрирующего, что CD52- отрицательные клетки полностью резистентны к комплемент-опосредованной токсичности анти-CD52 антител.
Функциональный анализ T-клеток с целевым геном TRAC
Целью инактивации гена TRAC является получение T-лимфоцитов, нечувствительных к стимуляции T-клеточного рецептора. Как описано в предыдущем абзаце, T-лимфоциты трансфицировали мРНК, кодирующей TALE-нуклеазу, расщепляющую TRAC или CD52. Через 16 дней после трансфекции клетки обрабатывали вплоть до 5 г/мл фитогемагглютинина (PHA, Sigma-Aldrich), Т-клеточного митогена, действующего через T-клеточный рецептор. Клетки с функциональным T-клеточным рецептором должны увеличиваться в размерах после обработки PHA. После трех дней инкубации клетки помечали конъюгированным с флуорохромом анти-CD52 или анти-TCR антителом и анализировали посредством проточной цитометрии для сравнения распределения размера клеток между TCR-положительными и TCR-отрицательными клетками или между CD52-положительными и CD52-отрицательными клетками. На фигуре 7 показано, что TCR-положительные клетки значительно увеличиваются в размерах после обработки PHA, тогда как TCR-отрицательные клетки имеют тот же размер, что и необработанные клетки, что указывает на то, что инактивация TRAC делает их нечувствительными к TCR-сигнализации. Напротив, CD52-положительные и CD52-отрицательные увеличиваются в размерах в одинаковой степени.
Функциональный анализ T-клеток с целевыми генами CD52 и TRAC
Для того, чтобы убедиться, что генная инженерия не влияет на способность Т-клеток демонстрировать противоопухолевую активность при снабжении химерным антигенным рецептором (CAR), авторы трансфицировали T-клетки, которые были целевыми для CD52-TALE-нуклеазы и TRAC-TALE-нуклеазы, 10 мкг РНК, кодирующей анти-CD19 CAR (SEQ ID NO:73). Через 24 часа T-клетки инкубировали в течение 4 часов с клетками Дауди, экспрессирующими CD19. Повышающую регуляцию CD107a, маркера цитотоксической гранулосекреции T-лимфоцитов (называемой дегрануляцией), на клеточной поверхности измеряли посредством анализа с помощью проточной цитометрии (Betts, Brenchley et al., 2003). Результаты представлены на фигуре 8 и показывают, что CD52-отрицательные/TCRαβ-отрицательные клетки и CD52-положительные/TCRαβ-положительные обладают одинаковой способностью к дегрануляции в ответ на PMA/иономицин (положительный контроль) или CD19+ клетки Дауди. Повышающая регуляция CD107 зависит от присутствия CD19+. Эти данные свидетельствуют о том, что генная инженерия не оказывает отрицательного воздействия на способность T-клеток к осуществлению контролируемого противоопухолевого ответа.
Безопасность CD52-TALE-нуклеазы и TRAC-TALE-нуклеазы для генома в первичных T-лимфоцитах
Поскольку наши конструкты включают нуклеазные субъединицы, важным вопросом является, может ли множественная TALE-нуклеазная трансфекция приводить к генотоксичности и расщеплению вне мишени при "близком соответствии" последовательностей-мишеней или посредством ошибочного спаривания половин TALE-нуклеазы. Для определения воздействия TRAC-TALE-нуклеазы и CD52-TALE-нуклеазы на целостность клеточных геномов авторы составили список последовательностей в геноме человека, которые дают возможность для расщепления вне сайта. Для создания данного списка авторы идентифицировали все последовательности в геноме с вплоть до 4 замен по сравнению с оригинальными полумишенями и затем идентифицировали пары потенциальных полумишеней в ориентации голова к голове со спейсером от 9 до 30 п.о. друг между другом. Данный анализ включал сайты, потенциально целевые для гомодимеров одной молекулы половины TALE-нуклеазы или гетеродимеров, образованных одной половиной TALE-нуклеазы CD52 и одной половиной TALE-нуклеазы TRAC. Авторы оценивали потенциальные мишени вне сайта на основании данных о специфичности, принимая во внимание стоимость отдельных замен и положение замен (причем несовпадения лучше переносятся основаниями с 3'-конца полумишени). Авторы получили 173 уникальные последовательности с оценкой, отражающей определение вероятности расщепления. Авторы выбрали 15 лучших оценок и проанализировали посредством глубокого секвенирования частоты мутаций, обнаруженных в данных локусах в T-клетках, одновременно трансфицированных TALE-нуклеазой CD52 и TRAC и очищенных посредством магнитного разделения на CD52-отрицательные, TCRαβ-отрицательные. Результаты приведены на фигуре 9. Самая высокая частота вставок/делеций составила 7×10-4. Данные результаты делают мутацию в гипотетической мишени вне сайта по меньшей мере в 600 раз менее вероятной, чем в предполагаемой мишени. Следовательно, TALE-нуклеазные реагенты, используемые в данном исследовании, оказываются чрезвычайно специфическими.
Пример 3: TALE-нуклеазы, расщепляющие ген CTLA4 человека и ген PDCD1 человека.
Как описано в примере 1, были разработаны и получены гетеродимерные TALE-нуклеазы, нацеленные соответственно на гены PDCD1 и CTLA4. Целевые геномные последовательности состоят из двух последовательностей длиной 17 п.о. (называемых полумишенями), разделенных спейсером в 11 или 15 п.о. Каждая полумишень распознается повторами половин TALE-нуклеаз, перечисленных в таблице 10.
Активность CTLA4-TALE-нуклеазы и PDCD1-TALE-нуклеазы в клетках HEK293
Каждый TALE-нуклеазный конструкт субклонировали, используя расщепление ферментом рестрикции в векторе экспрессии млекопитающих под контролем длинного промотора pEF1-альфа. Один миллион клеток HEK293 высевали за один день до трансфекции. Клетки котрансфицировали 2,5 мкг каждой из двух плазмид, кодирующих TALE-нуклеазы, распознающие две полумишени в представляющей интерес геномной последовательности в гене PDCD1 и CTLA-4 под контролем промотора EF1-альфа, или 5 мкг контрольного вектора pUC (pCLS0003), используя 25 мкл липофектамина (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Двухнитевое расщепление, создаваемое TALE-нуклеазами в последовательностях, кодирующих PDCD1 или CTLA-4, восстанавливалось в живых клетках посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), которое представляет собой механизм, подверженный ошибкам. Активность TALE-нуклеаз в живых клетках измеряли по частоте вставок или делеций в целевом геномном локусе. Через 48 часов после трансфекции геномную ДНК выделели из трансфицированных клеток, и осуществляли локус-специфические ПЦР с использованием следующих составных праймеров: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (прямая адапторная последовательность, SEQ ID NO:126)- 10N (TAG)- локус-специфическая прямая последовательность для CTLA4_T01: 5'-CTCTACTTCCTGAAGACCTG-3' (SEQ ID NO:141; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:99), для CTLA4_T03/T04: 5'-ACAGTTGAGAGATGGAGGGG-3' (SEQ ID NO:142; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:100), для PDCD1_T01: 5'-CCACAGAGGTAGGTGCCGC-3' (SEQ ID NO:143; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:101) или для PDCD1_T03: 5'-GACAGAGATGCCGGTCACCA-3' (SEQ ID NO:144; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:102) и обратный составной праймер 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (обратная адапторная последовательность, SEQ ID NO:130)- эндогенная локус-специфическая обратная последовательность для CTLA4_T01: 5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3' (SEQ ID NO:145; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:103), для CTLA4_T03/T04: 5'-GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3' (SEQ ID NO:146; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:104), для PDCD1_T01: 5'-GGCTCTGCAGTGGAGGCCAG-3' (SEQ ID NO:147; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:105) или для PDCD1_T03: 5'-GGACAACGCCACCTTCACCT-3' (SEQ ID NO:148; составной праймер, раскрытый как SEQ ID NO:106).
Продукты ПЦР анализировали посредством T7-эндонуклеазного анализа: кратко говоря, после денатурации и повторного отжига продукта ПЦР эндонуклеаза T7 специфически расщепляет ошибочную ДНК, состоящую из дикого типа и мутировавшей нитей. Продукт расщепления затем получают посредством электрофореза в полиакриламидном геле. Присутствие расщепленного продукта указывает на мутировавшие последовательности, индуцированные TALE-нуклеазной активностью. Результаты изображены на фигуре 10, где стрелки указывают на расщепленные продукты ПЦР. Они демонстрируют, что все TALE-нуклеазы PDCD1_T1, PDCD1_T3, CTLA4_T1, CTLA4_T3 и CTLA4_T4 проявляют мутагенную нуклеазную активность на своих сайтах-мишенях.
Пример 4: pT-альфа делает возможной поверхностную экспрессию CD3 в TCR-альфа-инактивированных T-лимфоцитах:
Описание различных вариантов preT-альфа:
Ген pT-альфа человека кодирует трансмембранный гликопротеин, содержащий внеклеточный Ig-подобный домен, гидрофобный трансмембранный домен и большой C-концевой внутрицитоплазматический хвост. Различные варианты, происходящие от pT-альфа гликопротеина человека, были разработаны и описаны в таблице 11 и представлены на фигуре 11.
Таблица 11 Описание выборки конструктов pT-альфа |
||
Варианты pT-альфа | Описание | SEQ ID |
pT-альфа-FL | Полноразмерный гликопротеин pT-альфа человека | 107 |
pT-альфа-Δ18 | Усеченный гликопротеин pT-альфа человека без 18 остатков с C-конца | 108 |
pT-альфа-Δ48 | Усеченный гликопротеин pT-альфа человека без 48 остатков с C-конца | 109 |
pT-альфа-Δ62 | Усеченный гликопротеин pT-альфа человека без 62 остатков с C-конца | 110 |
pT-альфа-Δ78 | Усеченный гликопротеин pT-альфа человека без 78 остатков с C-конца | 111 |
pT-альфа-Δ92 | Усеченный гликопротеин pT-альфа человека без 92 остатков с C-конца | 112 |
pT-альфа-Δ110 | Усеченный гликопротеин pT-альфа человека без 110 остатков с C-конца | 113 |
pT-альфа-Δ114 | Усеченный гликопротеин pT-альфа человека без 114 остатков с C-конца | 114 |
pT-альфа-FL-CD28 | Полноразмерный гликопротеин pT-альфа человека, слитый с C-конца с доменом активации CD28 | 115 |
pT-альфа-FL-CD8 | Полноразмерный гликопротеин pT-альфа человека, слитый с C-конца с доменом активации CD8 | 116 |
PT-альфа-FL-4-1BB | Полноразмерный гликопротеин pT-альфа человека, слитый с C-конца с доменом активации 4-1BB | 117 |
pT-альфа-Δ48-CD28 | Гликопротеин pT-альфа-Δ48, слитый с C-конца с доменом активации CD28 | 118 |
pT-альфа-Δ48-CD8 | Гликопротеин pT-альфа-Δ48, слитый с C-конца с доменом активации CD8 | 119 |
pT-альфа-Δ48-41BB | Гликопротеин pT-альфа-Δ48, слитый с C-конца с доменом активации 4-1BB | 120 |
pT-альфа-Δ114/TCRα.IC | Гликопротеин pT-альфа-Δ114, слитый с C-конца с внутриклеточным доменом TCR-альфа | 121 |
pT-альфа-EC/TCRα.TM.IC | Внеклеточный домен pT-альфа, слитый с C-конца с трансмембранным и внутриклеточным доменом TCR-альфа | 122 |
pT-альфа-Δ48-1×MUT | Гликопротеин pT-альфа-Δ48 с мутировавшим остатком W46R | 123 |
preT-альфа-Δ48-4×MUT | Гликопротеин pT-альфа-Δ48 с мутировавшими остатками D22A, K24A, R102A, R117A | 124 |
Различные исследованные конструкты preT-альфа включают:
1) Делеционные мутанты pT-альфа: Различные делеции были созданы во внутриклеточном цитоплазматическом хвосте белка pT-альфа человека (который содержит 114 аминокислот) (SEQ ID NO:107). Исследованные конструкты включают полноразмерный вариант белка (FL) и мутанты, в которых было удалено 18, 48, 62, 78, 92, 110 и 114 аминокислот с C-конца белка (от SEQ ID NO:108 до SEQ ID NO:114).
2) Мутанты pT-альфа, содержащие внутриклеточные активационные домены: Варианты FL и Δ48, слитые с внутриклеточными доменами активации CD8, CD28 или 41BB со своих C-концов (от SEQ ID NO:115 до SEQ ID NO:120).
3) Химерные мутанты pT-альфа/TCRα: В одном из конструктов внутриклеточный домен TCRα (IC) был слит с лишенным хвоста вариантом (Δ114) pT-альфа (SEQ ID NO:121). Также был создан второй конструкт, в котором внеклеточный домен pT-альфа был слит с трансмембранным (TM) и IC доменами от TCRα (SEQ ID NO:122).
4) Мутанты димеризации pT-альфа: Некоторые мутации были описаны в литературе как способные изменять способность к олигомеризации/димеризации комплекса пре-TCR. Предполагается, что данные мутанты делают возможной экспрессию пре-TCR на клеточной поверхности, не индуцируя конститутивную сигнализацию (как предполагается, индуцируемую при олигомеризации пре-TCR). Данные мутации были введены в вариант pT-альфа-Δ48 и представляют собой:
- 1×MUT: W46R (SEQ ID NO:123)
- 4×MUT: D22A, K24A, R102A, R117A (SEQ ID NO:124).
Активность различных конструктов preT-альфа в TRAC-инактивированных клетках Jurkat:
Для скрининга различных вариантов pT-альфа на их способность восстанавливать поверхностную экспрессию CD3 в TCR-альфа-инактивированных клетках была создана клеточная линия, в которой ген TCR-альфа был разрушен с помощью TALEN, нацеленной на TRAC. Клетки Jurkat (T-клеточная клеточная линия лейкемии) трансфицировали плазмидами, кодирующими для TALEN, расщепляющую TRAC, с помощью электропорации CytoPulse, и затем были очищены клетки KO (TCRα/β NEG; CD3NEG) посредством отрицательной селекции с помощью магнитных гранул CD3. Популяцию KO (JKT_KOx3 клетки) амплифицировали и использовали для скрининга различных вариантов pT-альфа. Скрининг проводили посредством трансфекции одного миллиона клеток JKT_KOx3 15 мкг плазмиды, кодирующей различные варианты pT-альфа, под контролем промотора EF1α, с последующим анализом посредством проточной цитометрии клеточной поверхностной экспрессии CD3 через 48 часов после трансфекции. Фигура 12 представляет собой типичный пример эффективности трансфекции (% BFP+ клеток) и активности конструктов pT-альфа FL, Δ18 и Δ48 в клетках JKT_KOx3 на основании % CD3+ клеток, определенного посредством проточной цитометрии. Результаты от различных конструктов сгруппированы в таблице 12.
Активность pT-альфа-FL и pT-альфа-Δ48 в TCR-альфа-инактивированных первичных T-лимфоцитах:
Для того, чтобы проверить способность вариантов pT-альфа-FL и pT-альфа-Δ48 индуцировать поверхностную экспрессию CD3 в TCR-альфа-инактивированных T-лимфоцитах, последовательности, кодирующие pT-альфа-FL и pT-альфа-Δ48 клонировали в самоинактивирующийся лентивирусный вектор pLV-SFFV-BFP-2A-PCTRA, который кодирует синий флуоресцентный белок (BFP) под контролем промотора SFFV, за которым следует саморасщепляющийся пептид T2A (фигура 13).
T-лимфоциты, выделенные из периферической крови, активировали в течение 72 часов с использованием гранул активатора анти-CD3/CD28 (Life technologies), и 4,5 миллиона клеток трансфицировали посредством электропорации 10 мкг мРНК, кодирующей TALE-нуклеазу, нацеленную на участок константной цепи TCR-альфа (TRAC), используя прибор CytoLVT-S (BTX-Harvard Harbour). Через два дня после электропорации T-клетки трансдуцировали лентивирусными векторами или LV-SFFV-BFP-2A-pT-альфа-Δ48, или LV-SFFV-BFP-2A-control. CD3-отрицательные и с низким содержанием CD3 T-клетки затем очищали с помощью магнитных гранул анти-CD3 (Miltenyi Biotech). Этот экспериментальный протокол представлен на фигуре 14A.
Фигура 14B изображает анализ с помощью проточной цитометрии клеточной поверхностной экспрессии TCR-альфа/бета, CD3 и экспрессии BFP на TCR-альфа-инактивированных T-клетках (KO), трансдуцированных лентивирусным вектором или BFP-2A-pT-альфа-Δ48 (KO/Δ48), или контрольным BFP (KO/BFP), до и после очистки с помощью гранул CD3. TCR-альфа-инактивированные клетки, трансдуцированные вектором BFP-T2A-pT-альфа-Δ48 (BFP+ клетки), демонстрируют более высокий уровень CD3 по сравнению с нетрансдуцированными клетками (BFP- клетки). Никаких различий не наблюдается среди клеток, трансдуцированных контрольным вектором BFP. Эти результаты показывают, что pT-альфа опосредует восстановление экспрессии CD3 на клеточной поверхности TCR-альфа-инактивированных клеток. Напротив, окрашивание TCR-альфа/бета остается, как и ожидалось, без изменений в клетках, трансдуцированных или нет вектором экспрессии pT-альфа-Δ48.
pT-альфа-опосредованная экспрессия CD3 поддерживает активацию TCR-дефицитных T-клеток:
Для определения способности pT-альфа передавать сигналы активации клеток, анализировали экспрессию маркеров ранней и поздней активации на TCR-альфа-инактивированных T-клетках, трансдуцированных pT-альфа-Δ48 и pT-альфа-Δ48.41BB. TCR-альфа-инактивированные T-клетки, трансдуцированные pT-альфа-Δ48 и pT-альфа-Δ48.41BB, создавали из первичных T-клеток человека, как описано в предыдущем разделе и на фигуре 14A.
Для детектирования сигнализации посредством CD3 клетки реактивировали с помощью покрытых анти-CD3/CD28 гранул через 3 дня после очистки TCR-альфа-инактивированных T-клеток с помощью гранул CD3 (фигура 14A). Клетки окрашивали конъюгированными с флуорохромом анти-CD69 (маркер ранней активации) и анти-CD25 (маркер поздней активации), соответственно, через 24 и 48 часов после реактивации и анализировали посредством проточной цитометрии (фигура 15A-B). Как показано на фигуре 15A-B, TCR-альфа-инактивированные клетки, экспрессирующие pT-альфа-Δ48 (KO/pΤα-Δ48) или pT-альфа-Δ48.41BB (KO/pΤα-Δ48.ΒΒ), демонстрируют повышающую регуляцию маркеров активации до уровней, аналогичных наблюдаемым в экспрессирующих TCR-альфа/бета клетках (NEP: не электропорированные клетки).
Другим индикатором активации T-клеток является увеличение размера клеток, которые иногда называют "взрывом". Способность комплексов пре-TCR индуцировать "взрыв" измеряли посредством анализа с помощью проточной цитометрии размера клеток через 72 часа после реактивации с помощью гранул анти-CD3/CD28 (фигура 15C). Стимуляция с помощью гранул анти-CD3/CD28 индуцировала сопоставимое увеличение размера клеток в клетках, экспрессирующих комплексы TCR-альфа/бета, по сравнению с клетками, экспрессирующими pT-альфа-Δ48 или pT-альфа-Δ48.41BB. Взятые вместе, эти результаты показывают, что комплексы пре-TCR могут передавать сигналы, которые эффективно связываются с механизмами, опосредующими повышающую регуляцию маркеров активации.
Экспрессия CD3, опосредованная pT-альфа, поддерживает размножение TCR-дефицитных первичных T-клеток с помощью стимулирующих анти-CD3/CD28 антител
Для определения способности комплексов пре-TCR поддерживать долгосрочную клеточную пролиферацию измеряли пролиферацию клеток, созданных, как описано выше. Десять дней после начальной активации клетки выдерживали в IL2 (нет реактивации) или в IL2 с гранулами анти-CD3/CD28 (реактивация). Для всех условий клетки подсчитывали и анализировали с помощью проточной цитометрии в различных временных точках для определения количества BFP+ клеток. Сравнивали рост TCR-альфа-инактивированных клеток (KO), трансдуцированных векторами BFP или BFP-T2A-пре-TCRα-Δ48, и определяли, во сколько раз изменится индукция данных клеток по отношению к значению, полученному на день 2 после реактивации. Фигура 16 показывает результаты, полученные с двумя независимыми донорами. В обоих случаях TCR-альфа-инактивированные клетки, экспрессирующие pT-альфа-Δ48, демонстрировали большее размножение, чем TCR-альфа-инактивированные клетки, экспрессирующие только контрольный вектор BFP. Для второго донора также рассмотрели TCR-альфа-инактивированные клетки, экспрессирующие pT-альфа-Δ48.41BB или полноразмерный pT-альфа, продемонстрировавшие также большее размножение, чем TCR-альфа-инактивированные клетки, экспрессирующие только контрольный вектор BFP.
Пример 5: оптимизация трансфекции мРНК в T-клетках с помощью метода CytoPulse.
Определение оптимизированной программы CytoPulse
Первую серию экспериментов проводили на не активированных PBMC, для того чтобы определить диапазон напряжения, в котором клетки могут быть трансфицированы. Было протестировано пять различных программ, как описано в таблице 13.
Таблица 13 Различные программы CytoPulse, использованные для определения минимального напряжения, требуемого для электропорации в происходящих от PBMC T-клетках |
||||||||||||
Группа 1 | Группа 2 | Группа 3 | ||||||||||
программа CytoPulse | Импульсы | V | Продолжительность (мс) | Интервал (мс) | Импульсы | V | Продолжительность (мс) | Интервал (мс) | Импульсы | V | Продолжительность (мс) | Интервал (мс) |
1 | 1 | 600 | 0,1 | 0,2 | 1 | 600 | 0,1 | 100 | 4 | 130 | 0,2 | 2 |
2 | 1 | 900 | 0,1 | 0,2 | 1 | 900 | 0,1 | 100 | 4 | 130 | 0,2 | 2 |
3 | 1 | 1200 | 0,1 | 0,2 | 1 | 1200 | 0,1 | 100 | 4 | 130 | 0,2 | 2 |
4 | 1 | 1200 | 0,1 | 10 | 1 | 900 | 0,1 | 100 | 4 | 130 | 0,2 | 2 |
5 | 1 | 900 | 0,1 | 20 | 1 | 600 | 0,1 | 100 | 4 | 130 | 0,2 | 2 |
3 или 6 миллионов клеток электропорировали в кювете с зазором 0,4 см (30 или 15×106 клеток/мл) с 20 мкг плазмид, кодирующих GFP, и контрольных плазмид pUC, используя различные программы CytoPulse. Чрез 24 часа после электропорации анализировали экспрессию GFP в электропорированных клетках с помощью проточной цитометрии для определения эффективности трансфекции. Данные, показанные на фигуре 17, указывают минимальное напряжение, требуемое для электропорации плазмид в происходящих от PBMC T-клетках. Эти результаты демонстрируют, что программы CytoPulse 3 и 4 делают возможной эффективную трансформацию T-клеток (EP#3 и #4).
Электропорация мРНК в очищенных активированных T-клетках
После определения лучшей программы CytoPulse, которая делает возможной эффективную электропорацию ДНК в T-клетах, авторы проверили, применим ли данный способ к электропорации мРНК.
5×106 очищенных T-клеток, предварительно активированных в течение 6 дней с помощью PHA/IL2, ресуспендировали в буфере cytoporation T (BTX-Harvard apparatus) и электропорировали в кюветах 0,4 см 10 мкг мРНК, кодирующей GFP, или 20 мкг плазмид, кодирующих GFP или pUC, используя предпочтительную программу CytoPulse, как определено в предыдущем разделе (таблица 14).
Таблица 14 Программа CytoPulse, использованная для электропорации очищенных T-клеток |
||||||||||||
Группа 1 | Группа 2 | Группа 3 | ||||||||||
программа CytoPulse | Импульсы | V | Продолжительность (мс) | Интервал (мс) | Импульсы | V | Продолжительность (мс) | Интервал (мс) | Импульсы | V | Продолжительность (мс) | Интервал (мс) |
3 | 1 | 1200 | 0,1 | 0,2 | 1 | 1200 | 0,1 | 100 | 4 | 130 | 0,2 | 2 |
Через 48 часов после трансфекции клетки окрашивали красителем для определения жизнеспособности (eFluor-450) и определяли клеточную жизнеспособность и % жизнеспособных GFP+ клеток посредством анализа с помощью проточной цитометрии (фигура 18).
Данные, представленные на фигуре 18, указывают что электропорация РНК при определенных здесь оптимальных условиях является не токсичной и делает возможной трансфекцию больше чем 95% жизнеспособных клеток.
В итоге, весь набор данных показывает, что Т-клетки могут быть эффективно трансфицированы или ДНК, или РНК. В частности, трансфекция РНК не оказывает влияния на клеточную жизнеспособность и делает возможным однородный уровень экспрессии представляющего интерес трансфицированного гена в клеточной популяции.
Эффективная трансфекция может быть достигнута вскоре после клеточной активации, независимо от используемого способа активации (PHA/IL-2 или покрытые CD3/CD28 гранулы). Изобретатели добились успеха в трансфекции клеток от 72 часов после активации с эффективностью >95%. Кроме того, также может быть получена эффективная трансфекция T-клеток после оттаивания и активации с помощью того же протокола электропорации.
Электропорация мРНК в первичных T-клетках человека для функциональной экспрессии TALE-нуклеазы
После демонстрации того, что электропорация мРНК делает возможной эффективную экспрессию GFP в первичных T-клетках человека, авторы проверили, применим ли данный способ к экспрессии других представляющих интерес белков. Нуклеазы на основе подобных активатору транскрипции эффекторов (TALE-нуклеазы) представляют собой сайт-специфические нуклеазы, создаваемые посредством слияния ДНК-связывающего домена TAL с ДНК-расщепляющим доменом. Они являются мощными инструментами редактирования генома, поскольку они индуцируют двухнитевые разрывы практически в любой желаемой последовательности ДНК. Эти двухнитевые разрывы активируют негомологичное соединение концов (NHEJ), подверженный ошибкам механизм репарации ДНК, потенциально ведущий к инактивации любого желаемого представляющего интерес гена. Альтернативно, если в то же время в клетки ввести адекватный шаблон репарации, индуцируемые TALE-нуклеазой разрывы ДНК могут быть восстановлены посредством гомологичной рекомбинации, что предлагает возможность модификации последовательности генов по желанию.
Авторы использовали электропорацию мРНК для экспрессии TALE-нуклеазы, разработанной так, чтобы специфически расщеплять последовательность в гене человека, кодирующем альфа-цепь T-клеточного антигенного рецептора (TRAC). Ожидается, что мутации, индуцируемые в данной последовательности, приведут к инактивации гена и исчезновению комплекса TCRαβ с клеточной поверхности. РНК TALE-нуклеазы TRAC или не кодирующую РНК в качестве контроля трансфицировали в активированные первичные T-лимфоциты человека с помощью метода CytoPulse. Электропорационная последовательность состояла из 2 импульсов по 1200 В с последующими четырьмя импульсами по 130 В, как описано в таблице 14.
Посредством анализа с помощью проточной цитометрии поверхностной экспрессии TCR через 7 дней после электропорации (фигура 19, верхняя панель) авторы обнаружили, что 44% T-клеток лишились экспрессии TCRαβ. Авторы проанализировали геномную ДНК трансфицированных клеток с помощью ПЦР-амплификации локуса TRAC с последующим высокопроизводительным секвенированием 454. 33% секвенированных аллелей (727 из 2153) содержали вставку или делецию в сайте расщепления TALE-нуклеазы. Фигура 19 (нижняя панель) показывает примеры мутировавших аллелей.
Эти данные показывают, что электропорация мРНК с помощью метода CytoPulse приводит к функциональной экспрессии TALE-нуклеазы TRAC.
Электропорация T-клеток моноцистронной мРНК, кодирующей одноцепочечный химерный антигенный анти-CD19 рецептор (CAR):
5×106 T-клеток, предварительно активированных в течение нескольких дней (3-5) с помощью покрытых анти-CD3/CD28 гранул и IL2, ресуспендировали в буфере cytoporation T и электропорировали в кюветах 0,4 см без мРНК или с 10 мкг мРНК, кодирующей одноцепочечный CAR (SEQ ID NO:73), используя программу, описанную в таблице 14.
Через 24 часа после электропорации клетки окрашивали с помощью фиксируемого красителя для определения жизнеспособности eFluor-780 и PE-конъюгированного фрагмента F(ab')2 козьего антимышиного IgG, специфического для определения клеточной поверхностной экспрессии данного CAR на живых клетках. Данные показаны на фигуре 20. Они демонстрируют, что подавляющее большинство живых Т-клеток, электропорированных моноцистронной мРНК, описанной выше, экспрессируют CAR на своей поверхности.
Через 24 часа после электропорации T-клетки совместно культивировали с клетками Дауди (CD19+) в течение 6 часов и анализировали с помощью проточной цитометрии для детектирования экспрессии маркера дегрануляции CD107a на своей поверхности (Betts, Brenchley et al., 2003).
Данные, показанные на фигуре 20, демонстрируют, что большинство клеток, электропорированных моноцистронной мРНК, описанной выше, подвергаются дегрануляции в присутствии клеток-мишеней, экспрессирующих CD19. Эти результаты ясно демонстрируют, что CAR, экспрессированный на поверхности электропорированных T-клеток, активен.
Электропорация T-клеток полицистронной мРНК, кодирующей мультисубъединичный химерный антигенный анти-CD19 рецептор (CAR):
5×106 T-клеток, предварительно активированных в течение нескольких дней (3-5) с помощью покрытых анти-CD3/CD28 гранул и IL2, электропорировали в буфере cytoporation T и электропорировали в кюветах 0,4 см без мРНК или с 45 мкг мРНК, кодирующей многоцепочечный CAR (SEQ ID NO:226) (фигура 21A и фигура 4B (csm4)), используя программу, описанную в таблице 14.
Через 24 часа после электропорации клетки окрашивали с помощью фиксируемого красителя для определения жизнеспособности eFluor-780 и PE-конъюгированного фрагмента F(ab')2 козьего антимышиного IgG, специфического для определения клеточной поверхностной экспрессии данного CAR на живых клетках. Данные, показанные на фигуре 21, демонстрируют, что подавляющее большинство живых Т-клеток, электропорированных полицистронной мРНК, описанной выше, экспрессируют CAR на своей поверхности.
Через 24 часа после электропорации T-клетки совместно культивировали с клетками Дауди (CD19+) в течение 6 часов и анализировали с помощью проточной цитометрии для детектирования экспрессии маркера дегрануляции CD107a на своей поверхности. Данные, показанные на фигуре 21 демонстрируют, что большинство клеток, электропорированных полицистронной мРНК, описанной выше, подвергаются дегрануляции в присутствии клеток-мишеней, экспрессирующих CD19. Эти результаты ясно демонстрируют, что CAR, экспрессированный на поверхности электропорированных T-клеток, активен.
Пример 6: Многоцепочечные CAR
A. Конструирование многоцепочечных CAR
Девять многоцепочечных CAR, нацеленных на антиген CD19, были разработаны на основании высокоаффинного рецептора для IgE (FcεRI). FcεRI, экспрессированный на тучных клетках и базофилах, вызывает аллергические реакции. Он представляет собой тетрамерный комплекс, состоящий из одной α-субъединицы (SEQ ID NO:202), одной β-субъединицы (SEQ ID NO:203) и двух дисульфидно-сшитых γ-субъединиц (SEQ ID NO:204). α-субъединица содержит IgE-связывающий домен. β и γ-субъединицы содержат ITAM (SEQ ID NO:198 и SEQ ID NO:199), которые опосредуют передачу сигнала (фигура 4A). Многоцепочечные CAR были разработаны, как описано на фигурах 4B, C и в таблице 15. В каждом многоцепочечном CAR внеклеточный домен цепи FcRα удаляли и заменяли на 4G7scFv и шарнир CD8α (SEQ ID NO:206). В многоцепочечных CAR csm2, csm4, csm5, csm8 и csm10 удаляли ITAM цепи FcRβ и/или цепи FcRγ. В многоцепочечных CAR csm2, csm4, csm5, csm6, csm8, csm9 и csm10 добавляли 3 ITAM CD3ζ (SEQ ID NO:197) к цепи FcRβ или цепи FcRγ. В многоцепочечных CAR csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 и csm10 добавляли внутриклеточный домен 4-1BB (SEQ ID NO:200) к цепи FcRα, цепи FcRβ или цепи FcRγ. В многоцепочечном CAR csm10 добавляли внутриклеточный домен CD28 к цепи FcRα (SEQ ID NO:201).
Таблица 15 Описание составов цепей вариантов многоцепочечных CAR |
|||
Варианты многоцепочечных CAR | альфа-цепь | бета-цепь | гамма-цепь |
Csm1 | FcRα-4G7scFV-CD8 (SEQ ID NO:206) |
FcRβ (SEQ ID NO:203) |
FcRγ (SEQ ID NO:204) |
Csm2 | FcRα-4G7scFv-CD8 (SEQ ID NO:206) |
FcRβ (SEQ ID NO:203) |
FcRγ-ΔITAM-41BB-CD3ζ (SEQ ID NO:212) |
Csm4 | FcRα-4G7scFv-CD8 (SEQ ID NO:206) |
FcRβ-ΔITAM-41BB (SEQ ID NO:208) |
FcRγ-ΔITAM-CD3ζ (SEQ ID NO:213) |
Csm5 | FcRα-4G7scFv-CD8 (SEQ ID NO:206) |
FcRβ-ΔITAM-41BB-CD3ζ (SEQ ID NO:209) |
FcRγ (SEQ ID NO:204) |
Csm6 | FcRα-4G7scFv-CD8 (SEQ ID NO:206) |
FcRβ-41BB (SEQ ID NO:210) |
FcRγ-CD3ζ (SEQ ID NO:214) |
Csm7 | FcRα-4G7scFv-CD8-4-1BB (SEQ ID NO:207) |
FcRβ (SEQ ID NO:203) |
FcRγ (SEQ ID NO:204) |
Csm8 | FcRα-4G7scFv-CD8-4-1BB (SEQ ID NO:207) |
FcRβ-ΔITAM-CD3ζ (SEQ ID NO:211) |
FcRγ (SEQ ID NO:204) |
Csm9 | FcRα-4G7scFv-CD8-4-1BB (SEQ ID NO:207) |
FcRβ (SEQ ID NO:203) |
FcRγ-CD3ζ (SEQ ID NO:214) |
Csm10 | FcRα-4G7scFv-CD8-CD28 (SEQ ID NO:206) |
FcRβ-ΔITAM-41BB (SEQ ID NO:208) |
FcRγ-ΔITAM-CD3ζ (SEQ ID NO:213) |
B. Временно экспрессированные многоцепочечные CAR могут вызывать активацию T-клеток
Многоцепочечные CAR могут быть экспрессированы в T-клетках человека после электропорации полицистронной мРНК.
T-клетки электропорировали кэпированной и полиаденилированой полицистронной мРНК (фигура 21A), которую получали с помощью набора mMESSAGE mMACHINE и линеаризованных плазмид в качестве шаблона. Плазмиды, используемые в качестве шаблона, содержали РНК-полимеразный промотор T7, за которым следовала полицистронная последовательность ДНК, кодирующая csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 или csm10 (SEQ ID NO:224-232).
Электропорацию полицистронных мРНК в T-клетки человека осуществляли с помощью устройства CytoLVT-S (Cellectis) в соответствии со следующим протоколом: 5×106 T-клеток, предварительно активированных в течение нескольких дней (3-5) с помощью покрытых анти-CD3/CD28 гранул и IL2, ресуспендировали в буфере cytoporation T и электропорировали в кюветах 0,4 см 45 мкг мРНК, используя программу PBMC3 (таблица 14).
Через 24 часа после электропорации T-клетки человека, сконструированные с помощью полицистронных мРНК, кодирующих многоцепочечные CAR, помечали с помощью фиксируемого красителя для определения жизнеспособности eFluor-780 и специфического PE-конъюгированного фрагмента F(ab')2 козьего антимышиного IgG и анализировали с помощью проточной цитометрии. Данные, показанные на фигуре 22, демонстрируют, что живые T-клетки, сконструированные с помощью полицистронных мРНК, экспрессируют многоцепочечные CAR csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 и csm10.
Как описано в литературе для FcεRI, экспрессия мультисубъединичных CAR обуславливается экспрессией 3 цепей. Одна только цепь α экспрессируется меньше, чем комплекс цепей α+γ, и комплекс цепей α+γ экспрессируется меньше, чем комплекс цепей α+β+γ (фигура 23).
T-клетки человека, временно экспрессирующие многоцепочечные CAR, подвергаются дегрануляции после совместного культивирования с клетками-мишенями
Через 24 часа после электропорации T-клетки человека, сконструированные с помощью полицистронных мРНК, кодирующих многоцепочечные CAR, культивировали совместно с целевыми (Дауди) или контрольными (K562) клетками в течение 6 часов. Затем CD8+ T-клетки анализировали с помощью проточной цитометрии для детектирования экспрессии маркера дегрануляции CD107a на своей поверхности. Данные, показанные на фигуре 24, демонстрируют, что CD8+ T-клетки человека, экспрессирующие многоцепочечные CAR csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 и csm10, подвергаются дегрануляции при совместном культивировании с экспрессирующими CD19 клетками-мишенями, но не при совместном культивировании с контрольными клетками.
T-клетки человека, временно экспрессирующие многоцепочечные CAR, секретируют цитокины после совместного культивирования с клетками-мишенями
Через 24 часа после электропорации T-клетки человека, сконструированные с помощью полицистронных мРНК, кодирующих многоцепочечные CAR, культивировали совместно с целевыми (Дауди) или контрольными (K562) клетками в течение 24 часов. Затем супернатанты собирали и анализировали с помощью цитометрического набора с множеством гранул для цитокинов TH1/TH2, для того чтобы определить количество цитокинов, производимых T-клетками. Данные, показанные на фигуре 25A-C, демонстрируют, что T-клетки человека, экспрессирующие многоцепочечные CAR csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 и csm10, производят IFNγ, IL8 и IL5 при совместном культивировании с экспрессирующими CD19 клетками-мишенями, но не при совместном культивировании с контрольными клетками.
T-клетки человека, временно экспрессирующие многоцепочечные CAR, лизируют клетки-мишени
Через 24 часа после электропорации T-клетки человека, сконструированные с помощью полицистронных мРНК, кодирующих многоцепочечные CAR, культивировали совместно с целевыми (Дауди) или контрольными (K562) клетками в течение 4 часов. Затем клетки-мишени анализировали с помощью проточной цитометрии для анализа их жизнеспособности. Данные, показанные на фигуре 26, демонстрируют, что клетки, экспрессирующие многоцепочечные CAR csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 и csm10, лизируют экспрессирующие CD19 клетки-мишени, но не контрольные клетки.
Список ссылок, цитированных в настоящем описании
Arimondo, P. B., C. J. Thomas, et al. (2006). "Exploring the cellular activity of camptothecin-triple-helix-forming oligonucleotide conjugates." Mol Cell Biol 26(1): 324-33.
Arnould, S., P. Chames, et al. (2006). "Engineering of large numbers of highly specific homing endonucleases that induce recombination on novel DNA targets." J Mol Biol 355(3): 443-58.
Ashwell, J. D. and R. D. Klusner (1990). "Genetic and mutational analysis of the T-cell antigen receptor." Annu Rev Immunol 8: 139-67.
Betts, M. R., J. M. Brenchley, et al. (2003). "Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation." J Immunol Methods 281(1-2): 65-78.
Boch, J., H. Scholze, et al. (2009). "Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors." Science 326(5959): 1509-12.
Boni, A., P. Muranski, et al. (2008). "Adoptive transfer of allogeneic tumor-specific T cells mediates effective regression of large tumors across major histocompatibility barriers." Blood 112(12): 4746-54.
Brahmer, J. R., C. G. Drake, et al. (2010). "Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates." J Clin Oncol 28(19): 3167-75.
Cambier, J. C. (1995). "Antigen and Fc receptor signaling. The awesome power of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)." J Immunol 155(7): 3281-5.
Carrasco, Y. R., A. R. Ramiro, et al. (2001). "An endoplasmic reticulum retention function for the cytoplasmic tail of the human pre-T cell receptor (TCR) alpha chain: potential role in the regulation of cell surface pre-TCR expression levels." J Exp Med 193(9): 1045- 58.
Cermak, T., E. L. Doyle, et al. (2011). "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting." Nucleic Acids Res 39(12): e82.
Chames, P., J. C. Epinat, et al. (2005). "In vivo selection of engineered homing endonucleases using double-strand break induced homologous recombination." Nucleic Acids Res 33(20): e178.
Choulika, A., A. Perrin, et al. (1995). "Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the l-Scel system of Saccharomyces cerevisiae." Mol Cell Biol 15(4): 1968-73.
Christian, M., T. Cermak, et al. (2010). "Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases." Genetics 186(2): 757-61.
Coutinho, A. E. and K. E. Chapman (2011). "The anti-inflammatory and immunosuppressive effects of glucocorticoids, recent developments and mechanistic insights." Mol Cell Endocrinol 335(1): 2-13.
Critchlow, S. E. and S. P. Jackson (1998). "DNA end-joining: from yeast to man." Trends Biochem Sci 23(10): 394-8.
Deng, D., C. Yan, et al. (2012). "Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors." Science 335(6069): 720-3.
Eisenschmidt, K., T. Lanio, et al. (2005). "Developing a programmed restriction endonuclease for highly specific DNA cleavage." Nucleic Acids Res 33(22): 7039-47.
Epinat, J. C, S. Arnould, et al. (2003). "A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells." Nucleic Acids Res 31(11):2952-62.
Geissler, R., H. Scholze, et al. (2011). "Transcriptional activators of human genes with programmable DNA-specificity." PLoS One 6(5): e19509.
Howard, F. D., H. R. Rodewald, et al. (1990). "CD3 zeta subunit can substitute for the gamma subunit of Fc epsilon receptor type I in assembly and functional expression of the high-affinity IgE receptor: evidence for interreceptor complementation." Proc Natl Acad Sci USA 87(18): 7015-9.
Huang, P., A. Xiao, et al. (2011). "Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs." Nat Biotechnol 29(8): 699-700.
Jena, B., G. Dotti, et al. (2010). "Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor." Blood 116(7): 1035-44.
Kalish, J. M. and P. M. Glazer (2005). "Targeted genome modification via triple helix formation." Ann N Y Acad Sci 1058: 151-61.
Li, L., M. J. Piatek, et al. (2012). "Rapid and highly efficient construction of TALE-based transcriptional regulators and nucleases for genome modification." Plant Mol Biol 78(4-5): 407-16.
Li, T., S. Huang, et al. (2011). "TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and Fokl DNA-cleavage domain." Nucleic Acids Res 39(1): 359-72.
Li, T., S. Huang, et al. (2011). "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes." Nucleic Acids Res 39(14): 6315-25.
Ma, J. L., E. M. Kim, et al. (2003). "Yeast Mre11 and Rad1 proteins define a Ku-independent mechanism to repair double-strand breaks lacking overlapping end sequences." Mol Cell Biol 23(23): 8820-8.
Mahfouz, M. M., L. Li, et al. (2012). "Targeted transcriptional repression using a chimeric TALE-SRDX repressor protein." Plant Mol Biol 78(3): 311-21.
Mahfouz, M. M., L. Li, et al. (2011). "De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks." Proc Natl Acad Sci USA 108(6): 2623-8.
Mak, A. N., P. Bradley, et al. (2012). "The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target." Science 335(6069): 716-9.
Metzger, H., G. Alcaraz, et al. (1986). "The receptor with high affinity for immunoglobulin E." Annu Rev Immunol 4: 419-70.
Miller, J. C., S. Tan, et al. (2011). "A TALE nuclease architecture for efficient genome editing." Nat Biotechnol 29(2): 143-8.
Morbitzer, R., P. Romer, et al. (2011). "Regulation of selected genome loci using de novo- engineered transcription activator-like effector (TALE)-type transcription factors." Proc Natl Acad Sci USA 107(50): 21617-22.
Moscou, M. J. and A. J. Bogdanove (2009). "A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors." Science 326(5959): 1501.
Mussolino, C, R. Morbitzer, et al. (2011). "A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity." Nucleic Acids Res 39(21):9283-93.
Pang, S. S., R. Berry, et al. (2010). "The structural basis for autonomous dimerization of the pre-T-cell antigen receptor." Nature 467(7317): 844-8.
Paques, F. and P. Duchateau (2007). "Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy." Curr Gene Ther 7(1): 49-66.
Pardoll, D. and C. Drake (2012). "Immunotherapy earns its spot in the ranks of cancer therapy." J Exp Med 209(2): 201-9.
Pardoll, D. M. (2012). "The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy." Nat Rev Cancer 12(4): 252-64.
Park, T. S., S. A. Rosenberg, et al. (2011). "Treating cancer with genetically engineered T cells." Trends Biotechnol 29(11): 550-7.
Pingoud, A. and G. H. Silva (2007). "Precision genome surgery." Nat Biotechnol 25(7): 743-4.
Porteus, M. H. and D. Carroll (2005). "Gene targeting using zinc finger nucleases." Nat Biotechnol 23(8): 967-73.
Robert, C. and C. Mateus (2011). "[Anti-CTLA-4 monoclonal antibody: a major step in the treatment of metastatic melanoma]." Med Sci (Paris) 27(10): 850-8.
Rouet, P., F. Smih, et al. (1994). "Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease." Mol Cell Biol 14(12):8096-106.
Saint-Ruf, C, O. Lechner, et al. (1998). "Genomic structure of the human pre-T cell receptor alpha chain and expression of two mRNA isoforms." Eur J Immunol 28(11): 3824-31.
Sander, J. D., L. Cade, et al. (2011). "Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs." Nat Biotechnol 29(8): 697-8.
Smith, J., S. Grizot, et al. (2006). "A combinatorial approach to create artificial homing endonucleases cleaving chosen sequences." Nucleic Acids Res 34(22): e149.
Stoddard, B. L. (2005). "Homing endonuclease structure and function." Q Rev Biophys 38(1):49-95.
Tesson, L, C. Usal, et al. (2011). "Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs." Nat Biotechnol 29(8): 695-6.
von Boehmer, H. (2005). "Unique features of the pre-T-cell receptor alpha-chain: not just a surrogate." Nat Rev Immunol 5(7): 571-7.
Waldmann, H. and G. Hale (2005). "CAMPATH: from concept to clinic." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360(1461): 1707-11.
Weber, E., R. Gruetzner, et al. (2011). "Assembly of designer TAL effectors by Golden Gate cloning." PLoS One 6(5): e19722.
Yamasaki, S., E. Ishikawa, et al. (2006). "Mechanistic basis of pre-T cell receptor-mediated autonomous signaling critical for thymocyte development." Nat Immunol 7(1): 67-75.
Zhang, F., L. Cong, et al. (2011). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription." Nat Biotechnol 29(2): 149-53.
Claims (29)
1. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор (CAR), направленный против маркера клеточной поверхности, представленного на целевой клетке, где многоцепочечный CAR содержит:
первый трансмембранный полипептид, содержащий трансмембранный домен и по меньшей мере один одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), причем данный по меньшей мере один одноцепочечный фрагмент антитела (scFv) способен связываться с маркером клеточной поверхности, представленным на целевой клетке, и
по меньшей мере один другой трансмембранный полипептид, содержащий трансмембранный домен и по меньшей мере один передающий сигнал домен,
причем указанный первый трансмембранный полипептид и указанный по меньшей мере один другой трансмембранный полипептид являются нековалентно связанными.
2. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 1, в котором по меньшей мере один трансмембранный полипептид содержит часть Fc-рецептора, субъединицы Т-клеточного рецептора, рецептора IL-2, p55 (α-цепи) или CD-белка.
3. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 1, где по меньшей мере один трансмембранный полипептид содержит часть рецептора Fc.
4. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 2, в котором указанную часть Fc-рецептора выбирают из группы, состоящей из: (a) альфа-цепи FcεRI, (b) бета-цепи FcεRI и (c) гамма-цепи FcεRI.
5. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 4, содержащий часть альфа-цепи FcεRI и часть гамма-цепи FcεRI, так что указанные цепи FcεRI димеризуются вместе с образованием димерного химерного антигенного рецептора.
6. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 4, содержащий часть альфа-цепи FcεRI, часть бета-цепи FcεRI и часть гамма-цепи FcεRI, так что указанные цепи FcεRI тетрамеризуются вместе с образованием тетрамерного химерного антигенного рецептора.
7. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 1, где целевая клетка представляет собой клетку злокачественной опухоли.
8. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 1, в котором указанный первый трансмембранный полипептид дополнительно содержит шарнир между указанным одноцепочечным фрагментом антитела (scFv) и указанным трансмембранным доменом.
9. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 1, в котором указанный передающий сигнал домен выбирают из группы, состоящей из дзета-цепи TCR, цепи FcεRIβ, цепи FcεRIγ, иммунорецепторного тирозинового активирующего мотива (ITAM).
10. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 1, в котором указанный CAR содержит костимулирующий домен.
11. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 1, дополнительно содержащий костимулирующую молекулу, выбранную из группы, состоящей из CD28, OX40, ICOS, CD137 и CD8.
12. Многоцепочечный химерный антигенный рецептор по п. 1, содержащий полипептиды, выбранные из группы, состоящей из от SEQ ID NO: 202 до SEQ ID NO: 204 и от SEQ ID NO: 206 до SEQ ID NO: 213.
13. Полинуклеотид, кодирующий многоцепочечный CAR по любому из пп. 1-12, причем указанный полинуклеотид содержит две или более последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие трансмембранные полипептиды, составляющие многоцепочечный CAR.
14. Вектор для экспрессии многоцепочечного CAR по любому из пп. 1-12 в клетке, причем указанный вектор содержит полинуклеотид по п. 13.
15. Способ получения генетически измененной иммунной клетки, направленной на маркер клеточной поверхности, представленный на целевой клетке, причем указанный способ включает:
(a) наличие иммунной клетки;
(b) введение в указанную иммунную клетку по меньшей мере одного полинуклеотида по п. 13 и
(c) экспрессию на поверхности иммунной клетки по меньшей мере одного многоцепочечного CAR по любому из пп. 1-12,
где указанная иммунная клетка представляет собой Т-клетку, дендритную клетку, дендритную клетку-киллер, тучную клетку, клетку естественного киллера (NK-клетку) или B-клетку.
16. Способ получения генетически измененной иммунной клетки по п. 15, дополнительно включающий стадию (d) инактивации в указанной иммунной клетке по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из TCR-альфа, TCR-бета, CD52, GR и генов иммунных контрольных точек.
17. Способ по п. 15 или 16, где указанная иммунная клетка представляет собой Т-клетку, дендритную клетку-киллер или клетку естественного киллера (NK-клетку).
18. Выделенная генетически измененная иммунная клетка, направленная против маркера клеточной поверхности, представленного на целевой клетке, полученная согласно способу по п. 15, причем указанная иммунная клетка экспрессирует на своей поверхности по меньшей мере один многоцепочечный CAR по любому из пп. 1-12, и где указанная иммунная клетка представляет собой Т-клетку, дендритную клетку, дендритную клетку-киллер, тучную клетку, клетку естественного киллера (NK-клетку) или B-клетку.
19. Выделенная генетически измененная иммунная клетка по п. 18, где указанная иммунная клетка представляет собой Т-клетку, дендритную клетку-киллер или клетку естественного киллера (NK-клетку).
20. Выделенная генетически измененная иммунная клетка по п. 18, где по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из TCR альфа, TCR бета, CD52, GR и генов иммунных контрольных точек, инактивирован.
21. Выделенная генетически измененная иммунная клетка по п. 18 или 19, где Т-клетка выбрана из воспалительных T-лимфоцитов, цитотоксических T-лимфоцитов, регуляторных T-лимфоцитов или хелперных T-лимфоцитов.
22. Применение выделенной генетически измененной иммунной клетки по любому из пп. 18-21 в качестве лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли, при этом указанный по меньшей мере один CAR, экспрессируемый на поверхности указанной иммунной клетки, направлен против маркера клеточной поверхности, представленного на клетке указанной злокачественной опухоли.
Applications Claiming Priority (13)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261696612P | 2012-09-04 | 2012-09-04 | |
US61/696,612 | 2012-09-04 | ||
US13/892,805 | 2013-05-13 | ||
USPCT/US2013/040766 | 2013-05-13 | ||
USPCT/US2013/40755 | 2013-05-13 | ||
USPCT/US2013/40766 | 2013-05-13 | ||
USPCT/US2013/040755 | 2013-05-13 | ||
US13/892,805 US11603539B2 (en) | 2012-05-25 | 2013-05-13 | Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant T cell for immunotherapy |
PCT/US2013/040766 WO2013176916A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-05-13 | Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells |
PCT/US2013/040755 WO2013176915A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-05-13 | Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant t cell for immunotherapy |
US13/942,191 | 2013-07-15 | ||
US13/942,191 US20150017136A1 (en) | 2013-07-15 | 2013-07-15 | Methods for engineering allogeneic and highly active t cell for immunotherapy |
PCT/US2013/058005 WO2014039523A1 (en) | 2012-09-04 | 2013-09-04 | Multi-chain chimeric antigen receptor and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015112125A RU2015112125A (ru) | 2016-10-27 |
RU2663725C2 true RU2663725C2 (ru) | 2018-08-08 |
Family
ID=50237572
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015112125A RU2663725C2 (ru) | 2012-09-04 | 2013-09-04 | Многоцепочечный химерный антигенный рецептор и его применения |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2893004B1 (ru) |
JP (1) | JP6352920B2 (ru) |
KR (1) | KR102141259B1 (ru) |
CN (1) | CN104769103B (ru) |
AU (1) | AU2013312838B2 (ru) |
BR (1) | BR112015004522A2 (ru) |
CA (1) | CA2883502C (ru) |
DK (1) | DK2893004T3 (ru) |
ES (1) | ES2714523T3 (ru) |
HK (1) | HK1212728A1 (ru) |
IL (1) | IL237576B (ru) |
MX (1) | MX367730B (ru) |
PT (1) | PT2893004T (ru) |
RU (1) | RU2663725C2 (ru) |
SG (1) | SG11201501471VA (ru) |
WO (1) | WO2014039523A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2800920C2 (ru) * | 2018-09-10 | 2023-08-01 | Атара Байотерапьютикс, Инк. | Способы экспандирования антигенспецифических car-t-клеток, композиции и применения, связанные с ними |
Families Citing this family (151)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2795906C (en) | 2009-04-13 | 2019-02-26 | Inserm, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Hpv particles and uses thereof |
EP2734621B1 (en) | 2011-07-22 | 2019-09-04 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US9700639B2 (en) | 2012-02-07 | 2017-07-11 | Aura Biosciences, Inc. | Virion-derived nanospheres for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents to cancer cells |
US20150017136A1 (en) * | 2013-07-15 | 2015-01-15 | Cellectis | Methods for engineering allogeneic and highly active t cell for immunotherapy |
ES2962571T3 (es) | 2012-05-25 | 2024-03-19 | Cellectis | Métodos para modificar células T alogénicas y resistentes a la inmunosupresión para inmunoterapia |
CN105142677B (zh) | 2013-02-15 | 2019-08-30 | 加利福尼亚大学董事会 | 嵌合抗原受体及其使用方法 |
US11077144B2 (en) | 2013-05-13 | 2021-08-03 | Cellectis | CD19 specific chimeric antigen receptor and uses thereof |
US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
US9340799B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | MRNA-sensing switchable gRNAs |
US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
EP4059521A1 (en) | 2013-09-18 | 2022-09-21 | Aura Biosciences, Inc. | Virus-like particle conjugates for diagnosis and treatment of tumors |
DK3066201T3 (en) | 2013-11-07 | 2018-06-06 | Editas Medicine Inc | CRISPR-RELATED PROCEDURES AND COMPOSITIONS WITH LEADING GRADES |
CA2930587A1 (en) | 2013-11-25 | 2015-05-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric antigen receptors to control hiv infection |
US11053481B2 (en) | 2013-12-12 | 2021-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains |
EP3808410A1 (en) * | 2013-12-20 | 2021-04-21 | Cellectis | Method of engineering multi-input signal sensitive t cell for immunotherapy |
AU2015216875B2 (en) | 2014-02-14 | 2021-02-25 | Cellectis | Cells for immunotherapy engineered for targeting antigen present both on immune cells and pathological cells |
WO2015155341A1 (en) | 2014-04-11 | 2015-10-15 | Cellectis | Method for generating immune cells resistant to arginine and/or tryptophan depleted microenvironment |
HUE049514T2 (hu) * | 2014-04-25 | 2020-09-28 | Bluebird Bio Inc | Javított eljárások adoptív sejtterápiák kialakítására |
CN110938655A (zh) | 2014-04-25 | 2020-03-31 | 蓝鸟生物公司 | Mnd启动子嵌合抗原受体 |
WO2015167766A1 (en) * | 2014-04-29 | 2015-11-05 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Ccr5 disruption of cells expressing anti-hiv chimeric antigen receptor (car) derived from broadly neutralizing antibodies |
WO2015166056A1 (en) * | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Cellectis | Cs1 specific multi-chain chimeric antigen receptor |
US11041021B2 (en) | 2014-05-23 | 2021-06-22 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Car based immunotherapy |
ES2846811T3 (es) | 2014-06-06 | 2021-07-29 | Bluebird Bio Inc | Composiciones de células T mejoradas |
JP2017519502A (ja) * | 2014-06-17 | 2017-07-20 | セレクティスCellectis | Cd123特異的多重鎖キメラ抗原受容体 |
BR112017001818A2 (pt) * | 2014-07-29 | 2017-11-21 | Pfizer | receptores antigênicos quiméricos específicos para egfrviii para imunoterapia de câncer |
AU2015295349B2 (en) * | 2014-07-29 | 2020-09-24 | Cellectis | ROR1(NTRKR1)specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
EP3194432B1 (en) * | 2014-07-31 | 2019-04-10 | Cellectis | Ror1 specific multi-chain chimeric antigen receptor |
EP4074735A1 (en) | 2014-08-28 | 2022-10-19 | BioAtla, Inc. | Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells |
AU2015310897B2 (en) | 2014-09-04 | 2020-03-19 | Cellectis | Trophoblast glycoprotein (5T4, tpbg) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy |
AU2015339744B2 (en) | 2014-10-31 | 2021-03-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Altering gene expression in CART cells and uses thereof |
CN107207597A (zh) * | 2014-11-06 | 2017-09-26 | 儿研所儿童医学中心 | 用于癌症和自身免疫疾病的免疫疗法 |
EP3230321B1 (en) | 2014-12-12 | 2019-08-28 | Bluebird Bio, Inc. | Bcma chimeric antigen receptors |
AU2015367317A1 (en) * | 2014-12-17 | 2017-06-01 | Cellectis | Inhibitory chimeric antigen receptor (iCAR or N-CAR) expressing non-T cell transduction domain |
AU2016212162A1 (en) | 2015-01-26 | 2017-07-13 | Cellectis | T cell receptor knock out engineered immune cells, endowed with chimeric antigen receptors binding to CD123 for the treatment of relapsed/refractory acute myeloid lymphoma or blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm |
CN105985444B (zh) * | 2015-02-05 | 2024-02-13 | 博生吉安科细胞技术有限公司 | 一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用 |
AU2016214301B2 (en) * | 2015-02-06 | 2022-05-19 | Cellectis | Primary hematopoietic cells genetically engineered by slow release of nucleic acids using nanoparticles |
WO2016130598A1 (en) * | 2015-02-09 | 2016-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Bi-specific chimeric antigen receptor and uses thereof |
WO2016134284A1 (en) | 2015-02-19 | 2016-08-25 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Chimeric antigen receptors and uses thereof |
MX2017010721A (es) | 2015-02-24 | 2018-08-28 | Univ California | Interruptores transcripcionales activados mediante unión y métodos para su uso. |
WO2016142532A1 (en) | 2015-03-11 | 2016-09-15 | Cellectis | Methods for engineering allogeneic t cell to increase their persistence and/or engraftment into patients |
GB201504840D0 (en) * | 2015-03-23 | 2015-05-06 | Ucl Business Plc | Chimeric antigen receptor |
CN107980046B (zh) | 2015-04-13 | 2021-12-24 | 辉瑞公司 | 靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体 |
WO2016187068A1 (en) | 2015-05-15 | 2016-11-24 | The General Hospital Corporation | Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily antibodies |
WO2016185035A1 (en) | 2015-05-20 | 2016-11-24 | Cellectis | Anti-gd3 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy |
AU2016275030B2 (en) | 2015-06-10 | 2021-12-09 | Nantkwest, Inc. | Modified NK-92 cells for treating cancer |
CA2986604A1 (en) | 2015-06-26 | 2016-12-29 | University Of Southern California | Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation |
EP4043556B1 (en) | 2015-06-30 | 2024-02-07 | Cellectis | Methods for improving functionality in nk cell by gene inactivation using specific endonuclease |
GB201513540D0 (en) | 2015-07-31 | 2015-09-16 | King S College London | Therapeutic agents |
CN108495641A (zh) | 2015-08-11 | 2018-09-04 | 塞勒克提斯公司 | 用于靶向cd38抗原和用于cd38基因失活的工程化的用于免疫疗法的细胞 |
CN106467906B (zh) * | 2015-08-20 | 2019-09-27 | 北京马力喏生物科技有限公司 | 构建体、转基因淋巴细胞及其制备方法和用途 |
IL293963A (en) | 2015-09-01 | 2022-08-01 | Univ California | Modular polypeptide libraries and methods for their preparation and use |
MA44907A (fr) * | 2015-09-11 | 2018-07-18 | Agenus Inc | Cellules hôtes génétiquement modifiées et leurs procédés d'utilisation |
KR20180053744A (ko) * | 2015-09-23 | 2018-05-23 | 사이토이뮨 테라퓨틱스 엘엘씨 | 면역 요법을 위한 flt3 유도된 car 세포 |
MX2018003534A (es) * | 2015-09-25 | 2019-04-25 | Abvitro Llc | Proceso de alto rendimiento para identificacion de blanco de receptor de celula t de secuencias de receptor de celula t apareadas de manera natural. |
WO2017059900A1 (en) * | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | Antigen receptors and uses thereof |
DK3365364T3 (da) | 2015-10-23 | 2024-05-06 | Eureka Therapeutics Inc | Kimære antistof/T-celle-receptorkonstruktioner og anvendelser deraf |
IL310721A (en) | 2015-10-23 | 2024-04-01 | Harvard College | Nucleobase editors and their uses |
WO2017075399A1 (en) * | 2015-10-30 | 2017-05-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Targeted cancer therapy |
WO2017075440A1 (en) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Targeted cancer therapy |
US11479755B2 (en) | 2015-12-07 | 2022-10-25 | 2Seventy Bio, Inc. | T cell compositions |
WO2017120546A1 (en) | 2016-01-08 | 2017-07-13 | The Regents Of The University Of California | Conditionally active heterodimeric polypeptides and methods of use thereof |
EP3405490B1 (en) | 2016-01-21 | 2021-10-20 | Pfizer Inc. | Mono and bispecific antibodies for epidermal growth factor receptor variant iii and cd3 and their uses |
EA201891641A1 (ru) | 2016-01-21 | 2019-01-31 | Пфайзер Инк. | Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на вариант iii рецептора эпидермального фактора роста |
SG11201807820PA (en) * | 2016-03-11 | 2018-10-30 | Bluebird Bio Inc | Genome edited immune effector cells |
EP3429634A1 (en) | 2016-04-15 | 2019-01-23 | Cellectis | A method of engineering prodrug-specific hypersensitive t-cells for immunotherapy by gene expression |
EP3429633B1 (en) | 2016-04-15 | 2021-02-24 | Cellectis | A method of engineering drug-specific hypersensitive t-cells for immunotherapy by gene inactivation |
WO2017190096A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | University Of Florida Research Foundation Incorporated | Chimeric antigen receptors and uses thereof |
JP7051715B2 (ja) | 2016-05-13 | 2022-04-11 | バイオアトラ、エルエルシー | 抗Ror2抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用 |
WO2018007263A1 (en) | 2016-07-06 | 2018-01-11 | Cellectis | Sequential gene editing in primary immune cells |
CN107586341A (zh) * | 2016-07-08 | 2018-01-16 | 生命序有限公司 | 重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用 |
CN107586342A (zh) * | 2016-07-08 | 2018-01-16 | 生命序有限公司 | 重组免疫检查点受体及其应用 |
US11384156B2 (en) | 2016-07-25 | 2022-07-12 | The Nemours Foundation | Adoptive T-cell therapy using EMPD-specific chimeric antigen receptors for treating IgE-mediated allergic diseases |
CA3032699A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
CN107793481A (zh) * | 2016-08-31 | 2018-03-13 | 南京传奇生物科技有限公司 | 一种靶向人cd123的嵌合受体配体及其应用 |
CN109715199A (zh) | 2016-09-14 | 2019-05-03 | 詹森生物科技公司 | 包含bcma特异性iii型纤连蛋白结构域的嵌合抗原受体及其用途 |
KR20190049887A (ko) | 2016-09-29 | 2019-05-09 | 난트케이웨스트, 인크. | 감소된 면역원성을 갖는 hla 클래스 i-결핍 nk-92 세포 |
CN110214180A (zh) | 2016-10-14 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器的aav递送 |
WO2018073393A2 (en) | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Cellectis | Tal-effector nuclease (talen) -modified allogenic cells suitable for therapy |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
KR102528384B1 (ko) | 2017-01-06 | 2023-05-02 | 이뮤너티바이오, 인크. | 감소된 cd96/tigit 발현을 갖는 유전자 변형된 nk-92 세포 |
TW201839136A (zh) | 2017-02-06 | 2018-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 治療血色素異常症之組合物及方法 |
JP7178355B2 (ja) | 2017-02-28 | 2022-11-25 | エンドサイト・インコーポレイテッド | Car t細胞療法のための組成物および方法 |
EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
CN110914426A (zh) | 2017-03-23 | 2020-03-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器 |
AU2018246377A1 (en) | 2017-03-31 | 2019-10-17 | Cellectis Sa | Universal anti-CD22 chimeric antigen receptor engineered immune cells |
SG11201909541WA (en) * | 2017-04-26 | 2019-11-28 | Eureka Therapeutics Inc | Chimeric antibody/t-cell receptor constructs and uses thereof |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
WO2018206791A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Cellectis | Protease based switch chimeric antigen receptors for safer cell immunotherapy |
US10780119B2 (en) | 2017-05-24 | 2020-09-22 | Effector Therapeutics Inc. | Methods and compositions for cellular immunotherapy |
PE20191847A1 (es) | 2017-06-02 | 2019-12-31 | Pfizer | Receptores de antigenos quimericos que se dirigen a flt3 |
CN110799640A (zh) * | 2017-06-07 | 2020-02-14 | 综合医院公司 | 表达嵌合抗原受体的t细胞 |
GB201709203D0 (en) * | 2017-06-09 | 2017-07-26 | Autolus Ltd | Antigen-binding domain |
AU2018292181A1 (en) | 2017-06-30 | 2020-01-23 | Cellectis | Cellular immunotherapy for repetitive administration |
AU2018304173A1 (en) | 2017-07-17 | 2020-01-30 | Janssen Biotech, Inc. | Antigen binding regions against fibronectin type III domains and methods of using the same |
WO2019016360A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Cellectis | MODIFIED IMMUNE CELLS RESISTANT TO TUMOR MICRO-ENVIRONMENT |
WO2019020733A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Cellectis | METHODS OF IMMUNE CELL SELECTION OF THE ANTIGEN-DEPENDENT CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTOR (CAR) |
CN111801345A (zh) | 2017-07-28 | 2020-10-20 | 哈佛大学的校长及成员们 | 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物 |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
JP7333495B2 (ja) | 2017-10-10 | 2023-08-25 | 国立大学法人広島大学 | エフェクターT細胞(Teff)抗原受容体を用いた抗原特異的制御性T細胞(Treg)の作出技術 |
CN111479830A (zh) | 2017-10-10 | 2020-07-31 | 国立大学法人广岛大学 | 使用铂talen的t细胞受体的完全取代技术 |
AU2018352592A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-06-04 | Beam Therapeutics, Inc. | Uses of adenosine base editors |
WO2019084284A1 (en) | 2017-10-27 | 2019-05-02 | Coneksis, Inc. | NK CELLS FOR USE IN THE TREATMENT OF CANCER IN DOGS |
CN111295189B (zh) | 2017-11-01 | 2023-09-15 | 艾洛基治疗公司 | 修饰的胱天蛋白酶-9多肽及其使用方法 |
WO2019106163A1 (en) | 2017-12-01 | 2019-06-06 | Cellectis | Reprogramming of genetically engineered primary immune cells |
WO2019129850A1 (en) | 2017-12-29 | 2019-07-04 | Cellectis | Off-the-shelf engineered cells for therapy |
EP3684399A1 (en) | 2017-12-29 | 2020-07-29 | Cellectis | Method for improving production of car t cells |
CA3089051A1 (en) | 2018-01-22 | 2019-07-25 | Endocyte, Inc. | Methods of use for car t cells |
US20210040451A1 (en) | 2018-01-31 | 2021-02-11 | Nantkwest, Inc. | Use of 5% human albumin in wash and harvest media |
AU2019215075A1 (en) | 2018-02-01 | 2020-08-20 | Pfizer Inc. | Antibodies specific for CD70 and their uses |
TW201936633A (zh) | 2018-02-01 | 2019-09-16 | 美商輝瑞大藥廠 | 標靶至cd70的嵌合抗原受體 |
EP3759129A1 (en) | 2018-02-28 | 2021-01-06 | Pfizer Inc | Il-15 variants and uses thereof |
WO2019177986A1 (en) | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Nantkwest, Inc. | Use of cd33car modified high affinity nk cells (t-hank) to reduce myeloid-derived suppressor cells suppressor activity (or reduce negative impact on nk cell activity) |
WO2019226521A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Nantkwest, Inc. | Basal media for growing nk-92 cells |
WO2019226649A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | Nantkwest, Inc. | Optimization of nk-92 cell growth using poloxamer |
AU2019272608B2 (en) | 2018-05-22 | 2023-04-20 | Immunitybio, Inc. | Fc-epsilon CAR |
WO2020014245A1 (en) | 2018-07-10 | 2020-01-16 | Nantkwest, Inc. | Cryopreservation |
EP3820994A1 (en) | 2018-07-10 | 2021-05-19 | Nantkwest, Inc. | Generating cik nkt cells from cord blood |
WO2020028654A1 (en) | 2018-08-01 | 2020-02-06 | Nantkwest, Inc. | Combined invasion and cytotoxicity assay using chemokine secreting target cells |
CA3107101A1 (en) | 2018-08-01 | 2020-02-06 | Nantkwest, Inc. | Chemokine responsive activated natural killer cells with secondary homing activation for verified targets |
IL296050A (en) | 2018-08-01 | 2022-10-01 | Immunitybio Inc | A quadricistronic system containing a receptor or cytokine and a chimeric antigen receptor for genetic modification of immunotherapies |
JP7338894B2 (ja) * | 2018-09-11 | 2023-09-05 | ボード オブ リージェンツ,ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | 自己免疫有害事象および免疫チェックポイント遮断療法の遺伝的マウスモデル |
US11547727B2 (en) | 2018-11-06 | 2023-01-10 | Immunitybio, Inc. | Chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells |
AU2019388876A1 (en) | 2018-11-26 | 2021-05-20 | Immunitybio, Inc. | IL-2 Dependent NK-92 cells with stable Fc receptor expression |
EP3887507A1 (en) | 2018-11-30 | 2021-10-06 | Janssen Biotech, Inc. | Gamma delta t cells and uses thereof |
CN113260633A (zh) | 2018-12-05 | 2021-08-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于癌症免疫疗法的诊断方法和组合物 |
SG11202109061YA (en) * | 2019-02-21 | 2021-09-29 | Marengo Therapeutics Inc | Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof |
AU2020242032A1 (en) | 2019-03-19 | 2021-10-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
JP2022539248A (ja) | 2019-07-02 | 2022-09-07 | フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター | 組換えad35ベクター及び関連遺伝子治療改善 |
WO2021041486A1 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Janssen Biotech, Inc. | Chimeric antigen receptor system and uses thereof |
US20240139242A1 (en) | 2019-10-18 | 2024-05-02 | Trustees Of Boston University | Cal-t constructs and uses thereof |
EP4081537A1 (en) | 2019-12-23 | 2022-11-02 | Cellectis | New mesothelin specific chimeric antigen receptors (car) for solid tumors cancer immunotherapy |
US11230699B2 (en) | 2020-01-28 | 2022-01-25 | Immunitybio, Inc. | Chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells targeting EGFR super-family receptors |
AU2021232141A1 (en) | 2020-03-03 | 2022-09-22 | Janssen Biotech, Inc. | ꝩδ T cells and uses thereof |
US20230212613A1 (en) | 2020-05-06 | 2023-07-06 | Cellectis S.A. | Methods for targeted insertion of exogenous sequences in cellular genomes |
CA3177481A1 (en) | 2020-05-08 | 2021-11-11 | David R. Liu | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
IL299276A (en) * | 2020-06-22 | 2023-02-01 | Univ Ramot | Protein modules with cell subunits that express them and their uses |
EP4176261A1 (en) | 2020-07-03 | 2023-05-10 | Cellectis S.A. | Method for determining potency of chimeric antigen receptor expressing immune cells |
WO2022020456A2 (en) | 2020-07-21 | 2022-01-27 | Allogene Therapeutics, Inc. | Chimeric antigen receptors with enhanced signaling and activities and uses thereof |
EP4185616A1 (en) | 2020-07-24 | 2023-05-31 | Cellectis S.A. | T-cells expressing immune cell engagers in allogenic settings |
CN116390746A (zh) | 2020-07-31 | 2023-07-04 | 塞勒克提斯公司 | 双car-t细胞 |
EP4330288A1 (en) | 2021-04-30 | 2024-03-06 | Cellectis S.A. | New anti-muc1 cars and gene edited immune cells for solid tumors cancer immunotherapy |
JP2024519041A (ja) | 2021-05-21 | 2024-05-08 | セレクティス ソシエテ アノニム | 固形腫瘍における癌関連線維芽細胞を調節することによるt細胞媒介性免疫療法の効力の増強 |
WO2023222617A1 (en) | 2022-05-16 | 2023-11-23 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | Endogenous signaling molecule activating chimeric antigen receptors and methods of generation thereof |
WO2024003334A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Cellectis S.A. | Enhancing safety of t-cell-mediated immunotherapy |
WO2024094775A1 (en) | 2022-11-03 | 2024-05-10 | Cellectis S.A. | Enhancing efficacy and safety of t-cell-mediated immunotherapy |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5770396A (en) * | 1992-04-16 | 1998-06-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Isolation characterization, and use of the human beta subunit of the high affinity receptor for immunoglobulin E |
EA009956B1 (ru) * | 2001-09-04 | 2008-04-28 | Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко. Лтд. | Внутриклеточный полипептид (cari) и способы его применения |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR901228A (fr) | 1943-01-16 | 1945-07-20 | Deutsche Edelstahlwerke Ag | Système d'aimant à entrefer annulaire |
US4474893A (en) | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
GB8611832D0 (en) | 1986-05-15 | 1986-06-25 | Holland I B | Polypeptide |
US5037743A (en) | 1988-08-05 | 1991-08-06 | Zymogenetics, Inc. | BAR1 secretion signal |
US6534055B1 (en) | 1988-11-23 | 2003-03-18 | Genetics Institute, Inc. | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US6352694B1 (en) | 1994-06-03 | 2002-03-05 | Genetics Institute, Inc. | Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells |
US5858358A (en) | 1992-04-07 | 1999-01-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US6905680B2 (en) | 1988-11-23 | 2005-06-14 | Genetics Institute, Inc. | Methods of treating HIV infected subjects |
IL104570A0 (en) * | 1992-03-18 | 1993-05-13 | Yeda Res & Dev | Chimeric genes and cells transformed therewith |
WO1993019163A1 (en) * | 1992-03-18 | 1993-09-30 | Yeda Research And Development Co, Ltd. | Chimeric receptor genes and cells transformed therewith |
US7175843B2 (en) | 1994-06-03 | 2007-02-13 | Genetics Institute, Llc | Methods for selectively stimulating proliferation of T cells |
US6692964B1 (en) | 1995-05-04 | 2004-02-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for transfecting T cells |
US7067318B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-06-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for transfecting T cells |
US6010613A (en) | 1995-12-08 | 2000-01-04 | Cyto Pulse Sciences, Inc. | Method of treating materials with pulsed electrical fields |
JP2004500095A (ja) | 2000-02-24 | 2004-01-08 | エクサイト セラピーズ, インコーポレイテッド | 細胞の同時の刺激および濃縮 |
US6867041B2 (en) | 2000-02-24 | 2005-03-15 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
US7572631B2 (en) | 2000-02-24 | 2009-08-11 | Invitrogen Corporation | Activation and expansion of T cells |
US6797514B2 (en) | 2000-02-24 | 2004-09-28 | Xcyte Therapies, Inc. | Simultaneous stimulation and concentration of cells |
JP2006518372A (ja) | 2003-01-28 | 2006-08-10 | セレクティス | 脊椎動物の体組織においてエクスビボかつイントトで相同的組換えを誘発するためのメガヌクレアーゼの使用およびその応用 |
JP4753119B2 (ja) | 2003-03-14 | 2011-08-24 | セレクティス ソシエテ アノニム | 大量処理の生体外エレクトロポレーション法 |
CA2815512A1 (en) | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Philippe Duchateau | Method for increasing the efficiency of double-strand break-induced mutagenesis |
EP3305798A1 (en) * | 2010-12-09 | 2018-04-11 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer |
WO2012138939A1 (en) | 2011-04-05 | 2012-10-11 | Philippe Duchateau | New tale-protein scaffolds and uses thereof |
EP2737066B1 (en) | 2011-07-29 | 2017-11-08 | Cellectis | High throughput method for assembly and cloning polynucleotides comprising highly similar polynucleotidic modules |
-
2013
- 2013-09-04 KR KR1020157008739A patent/KR102141259B1/ko active IP Right Grant
- 2013-09-04 AU AU2013312838A patent/AU2013312838B2/en active Active
- 2013-09-04 CN CN201380057661.1A patent/CN104769103B/zh active Active
- 2013-09-04 RU RU2015112125A patent/RU2663725C2/ru active
- 2013-09-04 BR BR112015004522A patent/BR112015004522A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2013-09-04 PT PT13776597T patent/PT2893004T/pt unknown
- 2013-09-04 SG SG11201501471VA patent/SG11201501471VA/en unknown
- 2013-09-04 MX MX2015002760A patent/MX367730B/es active IP Right Grant
- 2013-09-04 JP JP2015530148A patent/JP6352920B2/ja active Active
- 2013-09-04 EP EP13776597.0A patent/EP2893004B1/en active Active
- 2013-09-04 CA CA2883502A patent/CA2883502C/en active Active
- 2013-09-04 WO PCT/US2013/058005 patent/WO2014039523A1/en active Application Filing
- 2013-09-04 ES ES13776597T patent/ES2714523T3/es active Active
- 2013-09-04 DK DK13776597.0T patent/DK2893004T3/en active
-
2015
- 2015-03-04 IL IL237576A patent/IL237576B/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-01-15 HK HK16100443.5A patent/HK1212728A1/zh unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5770396A (en) * | 1992-04-16 | 1998-06-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Isolation characterization, and use of the human beta subunit of the high affinity receptor for immunoglobulin E |
EA009956B1 (ru) * | 2001-09-04 | 2008-04-28 | Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко. Лтд. | Внутриклеточный полипептид (cari) и способы его применения |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BIPULENDU JENA ET AL., Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor, BLOOD, 2010, v.116, p.1035-1044. * |
RA C. ET AL., Complete Structure of the Mouse Mast Cell Receptor for IgE (FcRI) and Surface Expression of Chimeric Receptors (Rat-Mouse-Human) on Transfected Cells, THE JOURNAL OF BIOLOCICAL CHEMISTRY, 1989, v.264, n.26, p.15323-15327. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2800920C2 (ru) * | 2018-09-10 | 2023-08-01 | Атара Байотерапьютикс, Инк. | Способы экспандирования антигенспецифических car-t-клеток, композиции и применения, связанные с ними |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20150083991A (ko) | 2015-07-21 |
SG11201501471VA (en) | 2015-03-30 |
AU2013312838B2 (en) | 2018-11-29 |
MX367730B (es) | 2019-09-04 |
PT2893004T (pt) | 2019-01-21 |
HK1212728A1 (zh) | 2016-06-17 |
RU2015112125A (ru) | 2016-10-27 |
DK2893004T3 (en) | 2019-02-04 |
EP2893004B1 (en) | 2018-10-24 |
EP2893004A1 (en) | 2015-07-15 |
ES2714523T3 (es) | 2019-05-28 |
CA2883502C (en) | 2021-05-04 |
CN104769103A (zh) | 2015-07-08 |
JP2015528298A (ja) | 2015-09-28 |
CA2883502A1 (en) | 2014-03-13 |
BR112015004522A2 (pt) | 2017-11-21 |
MX2015002760A (es) | 2015-10-29 |
AU2013312838A1 (en) | 2015-03-12 |
KR102141259B1 (ko) | 2020-08-05 |
WO2014039523A1 (en) | 2014-03-13 |
IL237576B (en) | 2019-08-29 |
JP6352920B2 (ja) | 2018-07-04 |
IL237576A0 (en) | 2015-04-30 |
CN104769103B (zh) | 2018-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11274316B2 (en) | Use of pre T alpha or functional variant thereof for expanding TCR alpha deficient T cells | |
RU2663725C2 (ru) | Многоцепочечный химерный антигенный рецептор и его применения | |
KR102329704B1 (ko) | 면역 요법을 위한 동종이계 및 고활성 t 세포의 조작 방법들 | |
US20230050345A1 (en) | Methods for engineering allogeneic and highly active t cell for immunotheraphy |