ES2714523T3 - Receptor quimérico de antígenos multicatenario y usos del mismo - Google Patents

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Abstract

Receptor quimérico de antígenos (CAR) multicatenario que comprende al menos: - un polipéptido transmembrana que comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular, en donde el al menos un dominio de unión a ligando extracelular interacciona con una molécula de superficie celular; y - un polipéptido transmembrana que comprende al menos un dominio de transducción de señal; en donde el dominio o los dominios de transducción de señal del receptor quimérico de antígenos multicatenario está presente en un polipéptido distinto del que porta el dominio o los dominios de unión a ligando extracelular.

Description

DESCRIPCION
Receptor quimerico de antigenos multicatenario y usos del mismo
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a receptores quimericos de antigenos (CAR). Los CAR son capaces de redirigir la especificidad y reactividad de celulas inmunitarias hacia una diana seleccionada que aprovecha las propiedades de dominio de union a ligando. En particular, la presente invencion se refiere a un receptor quimerico de antigenos multicatenario en el que los dominios de union a ligando y senalizacion estan separados en diferentes polipeptidos transmembrana para mejorar sus funciones. Los diferentes polipeptidos transmembrana que componen el CAR multicatenario de la presente invencion, una vez ensamblados juntos pueden unirse espedficamente con uno o varios ligandos en una diana e inducen la activacion de celulas inmunitarias en las que se expresan y la respuesta inmunitaria. La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos, vectores que codifican dichos polinucleotidos transmembrana y celulas aisladas que expresan dicho CAR multicatenario en su superficie para inmunoterapia. La presente invencion tambien se refiere a metodos para genomodificar celulas inmunitarias que expresan CAR multicatenarias en su superficie. La invencion abre la posibilidad de estrategias inmunoterapeuticas adoptivas eficaces para tratar cancer e infecciones vmcas.
Antecedentes de la invencion
La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de linfocitos T espedficos de antigeno autologos generados ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones vmcas y cancer. Los linfocitos T usados para inmunoterapia adoptiva pueden generarse mediante expansion de linfocitos T espedficos de antfgeno o redireccion de linfocitos T mediante ingeniena genetica (Park, Rosenberg et al. 2011). La transferencia de linfocitos T espedficos de antfgeno vmco es un procedimiento bien establecido usado para el tratamiento de infecciones vmcas asociadas con trasplante y tumores malignos relacionados con virus poco habituales. De forma similar, se ha mostrado que el aislamiento y transferencia de linfocitos T espedficos de tumor tienen exito en el tratamiento del melanoma.
Se han generado con exito especificidades novedosas en linfocitos T mediante la transferencia genetica de receptores de linfocitos T transgenicos o receptores quimericos de antfgenos (CAR) (Jena, Dotti et al. 2010). Los CAR son receptores sinteticos que consisten en un resto de direccion que esta asociado con uno o mas dominios de senalizacion en una unica molecula de fusion. En general, el resto de union de un CAR consiste en un dominio de union a antfgeno de un anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fragmentos ligeros y variables de un anticuerpo monoclonal unidos por un enlazador flexible. Tambien se han usado con exito restos de union basados en dominios de receptores o ligandos. Los dominios de senalizacion para CAR de primera generacion proceden de la region citoplasmica del CD3zeta o las cadenas gamma de receptores de Fc. Se ha mostrado que los CAR de primera generacion redirigen con exito la citotoxicidad de linfocitos T, sin embargo, no consiguieron proporcionar expansion prolongada y actividad antitumoral in vivo. Se han anadido dominios de senalizacion de moleculas coestimulantes incluyendo CD28, OX- 40 (CD134) y 4-1BB (CD137) solos (segunda generacion) o en combinacion (tercera generacion) para potenciar la supervivencia y aumentar la proliferacion de linfocitos T con CAR modificados. Los CAR han permitido con exito que los linfocitos T se redirijan hacia antfgenos expresados en la superficie de celulas tumorales de diversos tumores malignos incluyendo linfomas y tumores solidos (Jena, Dotti et al. 2010).
Las presentes arquitecturas de CAR se basan en un diseno en el que todos los dominios relevantes estan contenidos en un unico polipeptido (documento US 7.741.465 o WO 2012/079000). Este diseno necesita la adicion en serie de dominios de senalizacion, por lo tanto es necesario mover algunos dominios de sus posiciones yuxtamembrana naturales, distantes de la membrana plasmatica. No obstante, senan mas deseables arquitecturas en las que los ligandos y dominios de senalizacion estan separados en sus posiciones yuxtamembrana normales (es decir, adyacentes a la membrana celular en su lado interno) y se considerana que permiten mejora de la funcion de dominios coestimulantes. El receptor de alta afinidad para IgE (FceRI), podna proporcionar dicha arquitectura. De hecho, FceRI, que esta presente en mastocitos y basofilos, es un complejo tetramerico que consiste en una subunidad alfa de union a ligando, una subunidad beta y un homodfmero de dos subunidades gamma de transduccion de senal (Metzger, Alcaraz et al. 1986). El dominio alfa de FceRI consiste en un dominio extracelular que contiene dos dominios de tipo Ig que se unen con IgE, un dominio transmembrana y una cola citoplasmica corta. La subunidad beta contiene cuatro segmentos transmembrana que separan colas citoplasmicas amino y carboxilo terminales. La cadena gamma consiste esencialmente en una region transmembrana y cola citoplasmica que contiene un motivo de activacion basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM) (Cambier 1995).
El protocolo actual para tratamiento de pacientes usando inmunoterapia adoptiva se basa en la transferencia de celulas autologas. En este enfoque, se recuperan linfocitos T de pacientes, se modifican geneticamente o se seleccionan ex vivo, se cultivan in vitro para amplificar el numero de celulas si es necesario y finalmente se infunden en el paciente. Ademas de la infusion de linfocitos, el hospedador puede manipularse de otras maneras que apoyan el injerto de los linfocitos T o su participacion en una respuesta inmunitaria, por ejemplo preacondicionamiento (con radiacion o quimioterapia) y administracion de factores de crecimiento de linfocitos (tales como IL-2). Cada paciente recibe un tratamiento fabricado individualmente, usando los propios linfocitos del paciente (es decir una terapia autologa).
Las terapias autologas se enfrentan a obstaculos tecnicos y logfsticos sustanciales para la aplicacion practica, su generacion requiere instalaciones dedicaras caras y personal experto, deben generarse en un tiempo corto despues del diagnostico de un paciente y, en muchos casos, el pretratamiento del paciente ha dado como resultado funcion inmunitaria degradada, de modo que los linfocitos del paciente pueden ser poco funcionales y estar presentes en numeros muy bajos. Debido a estos obstaculos, la preparacion de celulas autologas de cada paciente es en efecto un producto nuevo, dando como resultado variaciones sustanciales en la eficacia y seguridad. Idealmente, se querna usar una terapia normalizada en la que las celulas terapeuticas alogenicas podnan prefabricarse, caracterizarse en detalle y estar disponibles para administracion inmediata a pacientes. Por alogenico se entiende que las celulas se obtienen de individuos que pertenecen a la misma especie pero son geneticamente diferentes. Sin embargo, el uso de celulas alogenicas tiene en la actualidad muchas desventajas. En hospedadores inmunocompetentes las celulas alogenicas son rechazadas rapidamente, un proceso denominado rechazo de hospedador frente a injerto (HvG) y esto limita sustancialmente la eficacia de las celulas transferidas. En hospedadores inmunocompetentes, las celulas alogenicas son capaces de injertarse, pero sus especificidades de TCR endogeno reconocen el tejido hospedador como ajeno, lo que da como resultado enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD), lo que puede conducir a dano tisular grave y muerte. Para usar eficazmente celulas alogenicas, deben superarse ambos de estos problemas.
En hospedadores inmunocompetentes, las celulas alogenicas son rechazadas rapidamente por el sistema inmunitario hospedador. Se ha demostrado que, los leucocitos alogenicos presentes en productos sangumeos no irradiados no persistiran mas de 5 a 6 dfas. (Boni, Muranski et al. 2008). Por tanto, para prevenir el rechazo de celulas alogenicas, el sistema inmunitario del hospedador debe suprimirse eficazmente. Se usan ampliamente glucocorticosteroides terapeuticamente para inmunosupresion (Coutinho y Chapman 2011). Esta clase de hormonas esteroides se une con el receptor de glucocorticoides (Gr ) presente en el citosol de linfocitos T en la translocacion al nucleo y la union de motivos de ADN espedficos que regulan la expresion de varios genes implicados en el proceso inmunologico. El tratamiento de linfocitos T con esteroides glucocorticoides da como resultado niveles reducidos de produccion de citocinas que conducen a anergia de linfocitos T e interferencia en la activacion de linfocitos T. Alemtuzumab, tambien conocida como CAMPATH1-H, es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige a CD52, una glucoprotema ligada a glucosilfosfatidil-inositol (GPI) de 12 aminoacidos (Waldmann y Hale 2005). CD52 se expresa a altos niveles en linfocitos T y B y menores niveles en monocitos estando ausente al mismo tiempo en granulocitos y precursores de medula osea. Se ha mostrado que el tratamiento con Alemtuzumab, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra CD52, induce un agotamiento rapido de linfocitos y monocitos en circulacion. Se usa frecuentemente en el tratamiento de linfomas de linfocitos T y en determinados casos como parte de un regimen de acondicionamiento para trasplante. Sin embargo, en el caso de inmunoterapia adoptiva el uso de farmacos inmunosupresores tendra tambien un efecto perjudicial en los linfocitos T terapeuticos introducidos. Por lo tanto, para usar eficazmente un enfoque de inmunoterapia adoptiva en estas condiciones, sena necesario que las celulas introducidas sean resistentes al tratamiento inmunosupresor.
Por otro lado, los receptores de linfocitos T (TCR) son receptores de superficie celular que participan en la activacion de linfocitos T en respuesta a la presentacion de antfgeno. El TCR esta compuesto en general por dos cadenas, alfa y beta, que se ensamblan para formar un heterodfmero y se asocia con las subunidades transductoras de CD3 para formar el complejo de receptores de linfocitos T presente en la superficie celular. Cada cadena alfa y beta del TCR consiste en una region variable (V) y constante (C) N-terminal de tipo inmunoglobulina, un dominio hidrofobo transmembrana y una region citoplasmica corta. Con respecto a moleculas de inmunoglobulina, la region variable de las cadenas alfa y beta se genera por la recombinacion V(D)J, creando una gran diversidad de especificidades de antfgeno en la poblacion de linfocitos T. Sin embargo, a diferencia de inmunoglobulinas que reconocen antfgeno intacto, los linfocitos T son activados por fragmentos peptfdicos procesados en asociacion con una molecula de MHC, introduciendo una dimension extra al reconocimiento de antfgenos por linfocitos T, conocido como restriccion de MHC. El reconocimiento de diferencias de MHC entre el donante y el receptor mediante el receptor de linfocitos T conduce a proliferacion de linfocitos T y el desarrollo potencial de GVHd . Se ha mostrado que la expresion en superficie normal del TCR depende de la smtesis y el ensamblaje coordinados de los siete componentes del complejo (Ashwell y Klusner 1990). La inactivacion de TCRalfa o TCRbeta puede dar como resultado la eliminacion del Tc R de la superficie de linfocitos T que previene el reconocimiento de aloantfgeno y por lo tanto GVHD. Sin embargo, la alteracion de TCR da como resultado la eliminacion del componente de senalizacion de CD3 y altera el significado de la expansion de linfocitos T adicional.
La inmunidad mediada por linfocitos T incluye multiples etapas secuenciales reguladas por un equilibrio entre senales coestimulantes e inhibidoras que ajustan la respuesta inmunitaria. Las senales inhibidoras denominadas puntos de control inmunitarios son cruciales para el mantenimiento de autotolerancia y tambien limitan el dano tisular colateral mediado por inmunidad. La expresion de puntos de control inmunitarios puede desregularse por tumores. La capacidad de los tumores para incorporar estas rutas inhibidoras representa un mecanismo importante en la resistencia inmunitaria y limita el exito de la inmunoterapia. Uno de los enfoques prometedores para activar la respuesta inmunitaria de linfocitos T es el bloqueo de estos puntos de control inmunitarios (Pardoll 2012). Los puntos de control inmunitarios representan barreras significativas a la activacion de inmunidad celular funcional en cancer y anticuerpos antagonistas espedficos para ligandos inhibidores en linfocitos T incluyendo CTLA4 y muerte programada-1 (PD-1) son ejemplos de agentes dirigidos que se evaluan en la clmica.
El antfgeno 4 asociado a linfocitos T citotoxicos (CTLA-4; tambien conocido como CD152) regula negativamente la amplitud de activacion de linfocitos T y el tratamiento con anticuerpos antagonistas de CTLA4 (ipilimumab) ha mostrado un beneficio de supervivencia en pacientes con melanoma (Robert y Mateus 2011). La protema de muerte celular programada 1 (PD1 o PDCD1 tambien conocida como CD279) representa otra diana muy prometedora para inmunoterapia (Pardoll y Drake 2012; Pardoll 2012). A diferencia de CTLA-4, PD1 limita funciones efectoras de linfocitos T en tejido periferico en el momento de una respuesta inflamatoria a la infeccion y para limitar la autoinmunidad. El primer ensayo clmico con anticuerpo PD1 muestra algunos casos de regresion tumoral (Brahmer, Drake et al. 2010). Multiples protemas de punto de control inmunitarios adicionales representan dianas prometedoras para bloqueo terapeutico basandose en estudios recientes.
En linfocitos T normales, los receptores de linfocitos T surgen de los receptores prelinfocitos T (pTCR) que son expresados por timocitos inmaduros y son cruciales para el desarrollo de linfocitos T de los estadios dobles negativos (CD4- CD8-) a los dobles positivos (CD4+ CD8+). Los prelinfocitos T que tienen exito en reordenaciones productivas del locus TCRbeta expresan una cadena de TCRbeta funcional que se empareja con una cadena preTalfa invariante y componentes de senalizacion de CD3 para formar el complejo pre-TCR. La expresion del preTCR en la superficie celular es necesaria para desencadenar seleccion beta, un proceso que induce la expansion de linfocitos T en desarrollo, aplica la exclusion alelica del locus TCRbeta y resulta da como resultado la induccion de reordenaciones en el locus TCRalfa (von Boehmer 2005). Despues de reordenaciones de TCRalfa productivas y sustitucion de pTalfa por TCRalfa para formar un TCR maduro, los timocitos experimentan una segunda etapa de seleccion, denominada positiva o seleccion de TCRalfa/beta tras la union de complejos MHC de peptidos propios expresados en celulas epiteliales timicas. Por tanto, los linfocitos T maduros reconocen y responden al complejo de antigeno/MHC mediante su TCR. La consecuencia mas inmediata de la activacion de t Cr es el inicio de rutas de senalizacion mediante la subunidades de CD3 asociadas que da como resultado multiples acontecimientos incluyendo la expansion clonal de linfocitos T, la regulacion positiva de marcadores de activacion en la superficie celular y la induccion de citotoxicidad o secrecion de citocinas.
Debido a la naturaleza de la seleccion de cadenas de TCRbeta mediante emparejamiento con preTalfa durante el desarrollo timico, en linfocitos T en los que se ha inactivado TCRalfa, la introduccion heterologa del transgen de pTalfa puede dar como resultado la formacion de un preTCR. Este pTCR puede actuar como un medio de activacion o estimulacion de linfocitos T de una manera que no depende de MHC, permitiendo por tanto, por ejemplo, la expansion continuada de linfocitos T alfa/beta despues de inactivacion de TCRalfa. De manera importante, el complejo de pTCR presenta una composicion bioquímica similar al TCR con respecto a subunidades de CD3 asociadas (Carrasco, Ramiro et al. 2001). Ademas, a diferencia de los TCR, puede producirse senalizacion de pre-TCR en parte por un acontecimiento independiente de ligando. La estructura cristalina del dominio extracelular de pTCR ha proporcionado una base estructural para la independencia de ligando posible de senalizacion de pTCR. Se ha mostrado que el pTCR forma un dfmero de cabeza a cola donde dos heterodfmeros de pTalfa-TCRbeta se asocian (Pang, Berry et al. 2010).
En el contexto del desarrollo de celulas inmunitarias genomodificadas de uso terapeutico que pueden dirigirse a celulas malignas o infectadas, los inventores han buscado arquitecturas de CAR mejoradas, lo que sena mas cercano a las naturales y probablemente se comportanan en consecuencia usando cualquier dominio de union a ligando mono o multiespedfico extracelular.
Como resultado, han disenado una nueva generacion de CAR que implican subunidades polipeptfdicas separadas segun la presente invencion, denominados "CAR multicatenarios".
Sumario de la invencion
Los receptores quimericos de antfgenos (CAR) en la tecnica anterior se presentan como moleculas de fusion individuales que necesitan la adicion en serie de dominios de senalizacion. Sin embargo, la eliminacion de los dominios de senalizacion de su posicion yuxtamembrana natural interfiere con su funcion. Por tanto, para superar esta desventaja, los inventores han tenido exito en el diseno de CAR denominados multicatenarios que permiten la posicion yuxtamembrana de todos los dominios de senalizacion relevantes. En los CAR multicatenarios los dominios de senalizacion se colocan en diferentes cadenas polipeptfdicas, de modo que se asientan en posiciones yuxtamembrana. Por ejemplo, los CAR multicatenarios pueden proceder de FceRI, reemplazando el dominio de union a IgE de alta afinidad de cadena alfa de FceRI mediante un dominio de union a ligando extracelular tal como scFv, mientras que las colas N y/o C-terminales de cadena beta y/o gamma de FceRI se usan para colocar el dominio de transduccion de senales en posiciones yuxtamembrana normales. El dominio de union a ligando extracelular tiene el papel de redirigir especificidad de linfocitos T hacia dianas celulares, mientras que los dominios de transduccion de senales, dejados en posiciones yuxtamembrana, activan la respuesta celular inmunitaria.
El hecho de que los dominios de senalizacion en posicion yuxtamembrana estan presentes en un polipeptido o polipeptidos distintos de los que portan el dominio de union a ligando extracelular, proporciona una arquitectura mas flexible para CAR. En consecuencia, pueden anadirse o retirarse dominios de senalizacion o dominios coestimulantes adicionales del CAR dependiendo de la intensidad de interaccion buscada entre el dominio de union a ligando del CAR y su receptor. Esta flexibilidad en la arquitectura del CAR tambien permite introducir un dominio o dominios de union a ligando extracelulares adicionales. Esto puede realizarse por fusion de un segundo dominio de union a ligando con el polipeptido que porta el primer dominio de union a ligando, o introduciendo dominios de union a ligando extracelular adicionales. Si este segundo dominio de union a ligando tiene una especificidad diferente, este forma un CAR multicatenario biespedfico y, si hay adicionales, CAR multicatenario multiespedfico. Estos son particularmente ventajosos a la vista de la direccion a una celula o un virus dado que porta dos o mas receptores diferentes presentes en su superficie. Esto aumenta la especificidad de dicho CAR multicatenario hacia dicha celula o virus. Por otro lado, el numero de dominios de senalizacion puede permitir la modulacion de la senal respectivamente a los diferentes dominios de union. Ademas, cada polipeptido recombinante que forma el CAR puede expresarse de forma independiente a diferentes niveles de expresion para modular adicionalmente la actividad del CAR.
La presente invencion se refiere a esta nueva arquitectura de CAR, a los polinucleotidos recombinantes que la codifican, asf como a los metodos para genomodificar celulas inmunitarias para reconocimiento de celulas espedficas, sea cual sea el fin y la naturaleza de las celulas inmunitarias.
La invencion proporciona adicionalmente metodos para hacer a dichas celulas inmunitarias mas adecuadas para fines de inmunoterapia.
Por ejemplo, las celulas inmunitarias pueden genomodificarse adicionalmente para que sean no alorreactivas y/o resistentes a agentes inmunosupresores, en particular, inactivando genes de TCR alfa o beta en celulas primarias y/o acoplando la inactivacion de genes que codifican dianas para diferentes agentes inmunosupresores, en particular CD52 y RG (receptores de glucocorticoides) y seleccionando adicionalmente las celulas resistentes a dichos agentes inmunosupresores.
Ademas de la concepcion anterior de celulas inmunitarias modificadas geneticamente, la presente invencion tambien se refiere a realizaciones en las que se genomodifican celulas inmunitarias para permitir la proliferacion cuando se inactiva TCRalfa, por ejemplo expresando transitoriamente preTalfa en la celula restaurando de este modo un complejo de CD3 funcional en ausencia de un TCR alfa/beta funcional.
Para genomodificar celulas inmunitarias modificadas altamente activas, la invencion tambien proporciona metodos en los que los puntos de control inmunitarios estan bloqueados por la falta de expresion de genes tales como PD1 y CTLA-4.
La presente solicitud desvela ademas celulas inmunitarias genomodificadas, en particular linfocitos T para usar como medicamente, mas particularmente, para tratar o prevenir el cancer administrando dichas celulas inmunitarias a un organismo vivo.
Breve descripcion de las figuras y tablas
Ademas de las caractensticas precedentes, la invencion comprende ademas otras caractensticas que surgiran de la descripcion a continuacion, asf como los dibujos adjuntos. Una apreciacion mas completa de la invencion y muchas de las ventajas consiguientes de la misma se obtendra mas facilmente ya que esto se entiende mejor por referencia a las siguientes Figuras junto con la descripcion detallada posterior.
Figura 1: Representacion esquematica de la relacion normal entre linfocitos T y celulas presentadoras de antfgenos.
Figura 2: Representacion esquematica de los linfocitos T terapeuticos modificados geneticamente segun la invencion y las celulas tumorales del paciente.
Figura 3: Representacion esquematica de CAR multicatenarios.
Figura 4: Esquema de diferentes versiones de CAR multicatenarios. A. Esquema del receptor FceRI. B-C Diferentes versiones de CAR multicatenarios (csml a csm10) que comprenden un scFv y una region de tallo de CD8 fusionada con el dominio transmembrana de cadena alfa de FceRI. Al menos un dominio 41BB, CD28 y/o CD3 zeta puede fusionarse con una cadena alfa, beta y/o gamma de FceRI.
Figura 5: Representacion esquematica de un ejemplo del metodo de genomodificacion de celulas alogenicas humanas para inmunoterapia
Figura 6: Concentracion en celulas por mililitro de celulas CD52 positivas o CD52 negativas despues de tratamiento con anticuerpo anti-CD52 (CAMPATH1-H) con complemento o controles.
Figura 7: Comparacion de la distribucion de dispersion frontal lateral (FSC), un indicador del tamano celular, entre celulas TCR positivas y TCR negativas o entre celulas CD52 positivas y CD52 negativas y celulas no activadas como control.
Figura 8: Analisis de citometna de flujo de expresion de CD107a (marcador de desgranulacion) en linfocitos T con CD52 y TCRalfa inactivados diana. La expresion de CD107 se analiza en celulas CD52+TCRap+ (primera columna), celulas CD52-TCRap- (segunda columna), celulas CD52-TCRap+ (tercera columna) y celulas CD52+TCRap- (cuarta columna) antes (A) y despues de incubacion con celulas Daudi (B); C) representa analisis de citometna de flujo de linfocitos T transfectados adicionalmente con un CAR e incubados con celulas Daudi; D) representa analisis de citometna de flujo de linfocitos T transfectados con un CAR pero no incubados con celulas Daudi y E) representa analisis de citometna de flujo de linfocitos T transfectados con un CAR y tratados con PMA/ionomicina (control positivo).
Figura 9: Analisis de secuenciacion profunda de dianas fuera de sitio potenciales de nucleasas TALE de CD52 y TRAC. La Figura 9 desvela secuencias de "mitad izquierda de la diana" como SEQ ID NO: 149-165 y secuencias de "mitad derecha de la diana" como SEQ ID NO 166-182, todas respectivamente, en orden de aparicion.
Figura 10: Analisis de locus genomico de PDCD1 y CTLA-4 mediante ensayo de endonucleasa T7. Las flechas apuntan a productos de PCR digeridos.
Figura 11: Representacion esquematica de algunos ejemplos de construcciones preTalfa.
Figura 12: Analisis de citometna de flujo de eficacia de transduccion (% de celulas BFP+) y actividad de las construcciones FL, A18, A48 pTalfa (% de expresion de CD3 en superficie) en celulas Jurkat con TCR alfa inactivado.
Figura 13: Representacion esquematica de una construccion lentivmca que codifica protema pTalfa (preTCRa).
Figura 14: A. Representacion del protocolo experimental. B. Analisis de citometna de flujo de TCR alfa/beta, expresion de CD3 y expresion de BFP en linfocitos T con TCRalfa inactivado (KO) transducidos con BFP-2A-pTalfaA48 (KO/A48) o vector lentivmco de BFP de control (KO/BFP) antes y despues de la purificacion. C. Analisis de citometna de flujo de expresion de TCR alfa/beta y CD3 en celulas con TCR alfa inactivado purificadas transducidas (BFPpos) o no (BFPneg) con vector lentivmco BFP-2A-pTalfaA48. NEP representa celulas no electroporadas con nucleasas TALE de TRAC.
Figura 15: A-B. Analisis de citometna de flujo de marcador de activacion temprano CD69 (A), marcador de activacion tardfo CD25 (B) expresion 24 y 48 horas despues de reactivacion con perlas anti-CD3/CD28 respectivamente en celulas no electroporadas (NEP) y celulas con TCRalfa inactivado (KO) transducidas con vector lentivmco BFP-2A-pTa-A48 (pTa-A48), vector lentivmco BFP-2A-pTa-A48.41BB (pTa-A48.BB) o vector BFP de control (BFP). Los histogramas de pTa-A48 corresponden a la senal de celulas con TCR inactivado que expresan pTa-A48 (celulas BFP+) mientras que los histogramas de KO corresponden a celulas con TCRalfa inactivado que no expresan pTa-A48 (celulas BFP-) Los histogramas de pTa-A48.BB corresponden a la senal detectada en celulas con TCR inactivado que expresan pTa-A48.41BB (celulas b Fp ) mientras que los histogramas de KO corresponden a celulas con TCRalfa inactivado que no expresan pTa-A48.41BB (celulas BFP-). Los histogramas de NEP (no electroporado) corresponden a senal detectada en celulas no genomodificadas. C. Analisis de citometna de flujo del tamano de celulas 72 horas despues de reactivacion con perlas anti-CD3/CD28 en celulas no electroporadas (NEP) y celulas con TCRalfa inactivado (KO) transducidas con vector lentivmco BFP-2A-pTa-A48 (pTa-A48), vector lentivmco BFP-2A-pTa-A48.41BB (pTa-A48.BB) o vector BFP de control (BFP). Los valores indicados en la parte superior de cada grafico corresponden a la media geometrica de la fluorescencia de cada poblacion.
Figura 16: Analisis de crecimiento celular de celulas con TCR alfa inactivado (KO) transducidas con vector pTalfa-A48 (pTaA48) o BFP de control (BFP) mantenidas en IL2 o en IL2 con perlas anti-CD3/CD28 en diferentes puntos temporales (eje x). El numero de celulas BFP+ se estima en diferentes puntos temporales para cada condicion y el factor de induccion de estas celulas (eje y) se estimo con respecto al valor obtenido el dfa 2 despues de la reactivacion. Los resultados se obtienen de dos donantes independientes. Para el segundo donante, el crecimiento celular tambien se determino para celulas transducidas con pTalfa-A48.41BB (pTa-A48.BB) y pTalfa de longitud completa (pTa-FL).
Figura 17: Analisis de citometna de flujo de celulas GFP positivas en PBMC electroporadas con los cinco programas de Cytopulse diferentes. A. NEP, EP n.° 1 (GFP) y EP n.° 2 (GFP); B. EP n.° 3 (pUC), EP n.° 4 (GFP) y EP n.° 5 (GFP). La lmea superior corresponde a la transfeccion de 6x106 celulas por cubeta, mientras que la lmea inferior corresponde a la transfeccion de 3x106 celulas por cubeta.
Figura 18: Analisis de citometna de flujo de mortalidad de linfocitos T purificados usando colorante de viabilidad (eFluor-450) y de celulas GFP positivas entre la poblacion viable despues de electroporacion con ARNm de GFP, ADN de GFP y ADN de pUC de control. A. NT y NEP; B. EP (sin ADN) y ADN de GFP; C. ADN de pUC y ARNm de GFP. NEP corresponde a celulas que se mantuvieron en tampon de electroporacion pero no se electroporaron y NT corresponde a celulas no electroporadas mantenidas en medio de cultivo.
Figura 19: Analisis de citometna de flujo de TCR alfa/beta y expresion de CD3 en linfocitos T primarios humanos despues de electroporacion de ARNm de nucleasa TALE de TRAC (parte superior). Analisis de secuenciacion profunda de ADN genomico extrafdo de linfocitos T primarios humanos despues de electroporacion de ARNm de nucleasa TALE de TRAC (parte inferior) (SEQ ID NO 183-192, respectivamente, en orden de aparicion).
Figura 20: A. Analisis de citometna de flujo de expresion de CAR (anti F(ab')2) despues de electroporacion de linfocitos T con o sin ARNm que codifica un CAR monocatenario. B. Analisis de citometna de flujo de expresion de CD107a (marcador de desgranulacion) en linfocitos T electroporados cocultivados con celulas daudi.
Figura 21: A. Representacion de ARNm que codifica un CAR multicatenario. B. Analisis de citometna de flujo de expresion de CAR (anti F(ab')2) en linfocitos T viables electroporados con o sin un ARNm policistronico que codifica un CAR multicatenario. C. Analisis de citometna de flujo de expresion de CD107a (marcador de desgranulacion) en linfocitos T electroporados cocultivados con celulas daudi.
Figura 22: Expresion de CAR multicatenarios en linfocitos T humanos despues de electroporacion de ARNm policistronicos.
Figura 23: La expresion de los CAR multisubunitarios esta condicionada por la expresion de las tres cadenas: a, p y Y.
Figura 24: Los linfocitos T humanos que expresan transitoriamente los CAR multicatenarios se desgranulan despues del cocultivo con celulas diana.
Figura 25: Los linfocitos T humanos que expresan transitoriamente los CAR multicatenarios secretan citocinas despues del cocultivo con celulas diana.
Figura 26: Los linfocitos T humanos que expresan transitoriamente los CAR multicatenarios lisan celulas diana. Tabla 1: Descripcion de las nucleasas TALE de GR y secuencias de los sitios diana de nucleasas TALE en el gen de GR humano.
Tabla 2: Actividad de escision de las nucleasas TALE de GR en levadura. Los valores estan comprendidos entre 0 y 1. El valor maximo es 1.
Tabla 3: Porcentaje de mutagenesis dirigida en sitios diana de nucleasa TALE endogenos en celulas 293.
Tabla 4: Porcentaje de mutagenesis dirigida en sitios diana de nucleasa TALE endogenos en linfocitos T primarios.
Tabla 5: Descripcion de las nucleasas TALE de CD52, TRAC y TRBC y secuencias de los sitios diana de nucleasas TALE en los genes correspondientes humanos.
Tabla 6: Secuencias diana adicionales para nucleasas TALE de TRAC y CD52.
Tabla 7: Porcentaje de indel para nucleasa TALE que se dirige a dianas de CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 y TRBC_T02.
Tabla 8: Porcentajes de linfocitos T CD52 negativos, TCR negativos y CD52/TCR dobles negativos despues de transfeccion de polinucleotidos que expresan nucleasa TALE correspondientes.
Tabla 9: Porcentajes de linfocitos T TCR negativos despues de transfeccion de polinucleotidos que expresan nucleasa TALE de TRBC.
Tabla 10: Descripcion de las nucleasas TALE de CTLA4 y PDCD1 y secuencias de los sitios diana de nucleasas TALE en los genes correspondientes humanos.
Tabla 11: Descripcion de un subconjunto de construcciones de pTalfa.
Tabla 12: Actividad de las diferentes construcciones de pTalfa en celulas Jurkat con TCR alfa inactivado. Se midio la actividad por analisis de citometna de flujo de expresion de CD3 en celulas jurkat con TCR alfa inactivado transfectadas con las construcciones de preTalfa diferentes.
Tabla 13: Programas de cytopulse diferentes usados para determinar la tension minima necesaria para electroporacion en linfocitos T procedentes de PBMC.
Tabla 14: Programa de cytopulse usado para electroporar linfocitos T purificados.
Tabla 15: Descripcion de las composiciones de cadenas de FcR de las versiones de CAR multicatenarios.
Descripcion detallada de la invencion
Salvo que se defina espedficamente en el presente documento, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia en los campos de la terapia genica, bioquímica, genetica y biologfa molecular.
Todos los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la practica o el ensayo de la presente invencion, con metodos y materiales adecuados que se describen en el presente documento. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecera. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique otra cosa.
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologfa celular, cultivo celular, biologfa molecular, biologfa transgenica, microbiologfa, ADN recombinante e inmunologfa, que estan dentro de las habilidades en la tecnica. Tales tecnicas se explican por completo en la bibliogratia. Vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, Estados Unidos); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de los Estados Unidos N.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries y S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson y M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., Nueva York), espedficamente, vol. 154 y 155 (Wu et al. eds.) y vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Receptor quimerico de antigenos (CAR) multicatenario
La presente invencion se refiere a un receptor quimerico de antigenos (CAR) multicatenario particularmente adaptado a celulas inmunitarias usadas en inmunoterapia.
El CAR multicatenario segun la invencion comprende en general al menos:
- un polipeptido transmembrana que comprende al menos un dominio de union a ligando extracelular, en donde el al menos un dominio de union a ligando extracelular interacciona con una molecula de superficie celular; y
- un polipeptido transmembrana que comprende al menos un dominio de transduccion de senal;
en donde el dominio o los dominios de transduccion de senal del receptor quimerico de antigenos multicatenario esta presente en un polipeptido distinto del que porta el dominio o los dominios de union a ligando extracelular.
La expresion "dominio de union a ligando extracelular" como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipeptido que es capaz de unirse con un ligando. Preferentemente, el dominio sera capaz de interaccionar con una molecula de superficie celular. Por ejemplo, el dominio de union a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actua como un marcador de superficie celular en celulas diana con una patologfa particular. Por lo tanto los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con infecciones vtiicas, bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y celulas cancerosas. En particular, el de union a ligando extracelular puede comprender un dominio de union a antigeno procedente de un anticuerpo contra un antigeno de la diana. Como ejemplos no limitantes, el antigeno de la diana puede ser un antigeno de superficie asociado a tumor, tal como ErbB2 (HER2/neu), antigeno carcinoembrionario (CEA), molecula de adhesion a celulas epiteliales (EpCAM), receptor de factor de crecimiento epidermico (EGFR), variante III de EGFR (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, disialogangliosido GD2, mucina ductal-epitelial, gp36, TAG-72, glucoesfingotipidos, antigeno asociado a glioma, gonadotropina corionica humana p, alfafetoprotema (AFP), AFP sensible a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilo esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostasa, antigeno espedfico de prostasa (PSA), PAP, NY-EsO-1, LAGA-la, p53, prostema, PSMA, supervivencia y telomerasa, antigeno 1 de tumor de carcinoma prostatico (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastasa de neutrofilos, efrina B2, CD22, factor de crecimiento de insulina (IGFI)-I, IGF-II, receptor del IGFI, mesotelina, una molecula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que presenta un eptiopo peptidico espedfico de tumor, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, antigenos tumorales del estroma, el dominio extra A (e Da ) dominio extra B (EDB) de fibronectina y el dominio A1 de tenascina C (TnC Al) y protema asociada a fibroblasto (fap); un antigeno espedfico de linaje o espedfico de tejido tal como CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), b7-2 (CD86), endoglina, una molecula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), BCMA (CD269, TNFRSF 17) o un antigeno de superficie espedfico de virus tal como un antigeno espedfico del VIH (tal como gpl20 del VIH); un antigeno espedfico del VEB, un antigeno espedfico del CMV, un antigeno espedfico del VPH, un antigeno espedfico del virus Lasse, un antigeno espedfico del virus de la gripe asf como cualquier derivado o variante de estos marcadores de superficie.
El dominio de union a ligando extracelular tambien puede comprender un peptido que se une con un antigeno de la diana, un peptido o una protema que se une con un anticuerpo que se une con un antigeno de la diana, un peptido o un ligando proteico tal como un factor de crecimiento, una citocina o una hormona como ejemplos no limitantes que se unen con un receptor en la diana o un dominio procedente de un receptor tal como un receptor del factor de crecimiento, un receptor de citocinas o un receptor de hormonas como ejemplos no limitantes, que se unen con un ligando o un ligando proteico en la diana. Preferentemente la diana es una celula o un virus.
En una realizacion preferida, dicho dominio de union a ligando extracelular es un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable ligero (Vl) y el pesado (Vh) de un anticuerpo monoclonal espedfico de antfgeno diana unido por un enlazador flexible. En una realizacion preferida, dicho scFv es un scFv anti-C D ^ , preferentemente scFV-4G7 (Peipp et al., J Immunol Methods. 15 de febrero de 2004;285(2):265-80) (VH: SEQ ID NO: 193 y VL: SEQ ID NO: 194, scFV: SEQ ID NO: 195).
Un dominio de union distinto de scFv tambien puede usarse para direccion predefinida de linfocitos, tales como fragmentos de anticuerpos de un unico dominio de camelidos o ligandos de receptores como un polipeptido de factor de crecimiento endotelial vascular, un peptido de union a integrina, heregulina o una mutema de iL-13, dominio de union a anticuerpos, bucles hipervariables de anticuerpos o CDR como ejemplos no limitantes.
En una realizacion preferida dicho polipeptido transmembrana comprende ademas una region de tallo entre dicho dominio de union a ligando extracelular y dicho dominio transmembrana. La expresion "region de tallo" usada en el presente documento significa en general cualquier oligo o polipeptido que actue para unir el dominio transmembrana con el dominio de union a ligando extracelular. En particular, las regiones de tallo se usan para proporcionar mas flexibilidad y accesibilidad para el dominio de union a ligando extracelular. Una region de tallo puede comprender hasta 300 aminoacidos, preferentemente de 10 a 100 aminoacidos y lo mas preferentemente de 25 to 50 aminoacidos. La region de tallo puede proceder de todas o parte de las moleculas de origen natural, tal como de toda o parte de la region extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de toda o parte de una region constante de anticuerpo. Como alternativa la region de tallo puede ser una secuencia sintetica que corresponde a una secuencia de tallo de origen natural o puede ser una secuencia de tallo completamente sintetica. En una realizacion preferida dicha region de tallo es una parte de la cadena alfa de CD8 humana (por ejemplo NP_001139345.1) (SEQ ID NO: 196).
Por tanto, la expresion de CAR multicatenario en celulas inmunitarias da como resultado celulas modificadas que seleccionan y eliminan dianas definidas, incluyendo, pero sin limitacion, celulas malignas que portan un antfgeno de superficie asociado a tumor respectivo o celulas infectadas por virus que portan un antfgeno de superficie espedfico de virus, o celulas diana que portan un antfgeno de superficie espedfico de linaje o espedfico de tejido.
En celulas cancerosas se observa habitualmente regulacion negativa o mutacion de antfgenos diana, creando variantes de escape de perdida de antfgeno. Por tanto, para compensar escape tumoral y hacer a las celulas inmunitarias mas espedficas de diana, el CAR multicatenario puede comprender varios dominios de union a ligando extracelulares, para unir simultaneamente diferentes elementos en diana aumentando de este modo la activacion y funcion de celulas inmunitarias. En una realizacion, los dominios de union a ligando extracelular pueden colocarse en tandem en el mismo polipeptido transmembrana y opcionalmente pueden separarse por un enlazador. En otra realizacion, dichos dominios de union a ligando extracelulares diferentes pueden colocarse en diferentes polipeptidos transmembrana que componen el CAR multicatenario. En otra realizacion, la presente invencion se refiere a una poblacion de CAR multicatenarios que comprenden cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelular. En particular, la presente invencion se refiere a un metodo de genomodificacion de celulas inmunitarias que comprenden proporcionar una celula inmunitaria y que expresan en la superficie de dicha celula una poblacion de CAR multicatenario que comprenden cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelular. En otra realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo de genomodificacion de una celula inmunitaria que comprende proporcionar una celula inmunitaria e introducir en dicha celula polinucleotidos que codifican polipeptidos que componen una poblacion de CAR multicatenarios que comprenden cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelular. En una realizacion particular el metodo de genomodificacion de una celula inmunitaria comprende expresar en la superficie de la celula al menos una parte de cadena beta y/o gamma de FceRI fusionada con un dominio transductor de senal y varias partes de cadenas alfa de FceRI fusionados con diferentes dominios de union a ligando extracelular. En una realizacion mas particular, dicho metodo comprende introducir en dicha celula al menos un polinucleotido que codifica una parte de cadena beta y/o gamma de FceRI fusionada con un dominio transductor de senal y varias cadenas alfa de FceRI fusionadas con diferentes dominios de union a ligando extracelular. Por poblacion de CAR multicatenarios, se entiende al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas CAR multicatenarios que comprenden cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelular. Los diferentes dominios de union a ligando extracelular segun la presente invencion pueden unir simultaneamente de forma preferente diferentes elementos en la diana aumentando de este modo la activacion y funcion de celulas inmunitarias.
La presente invencion tambien se refiere a una celula inmunitaria aislada que comprende una poblacion de CAR multicatenarios que comprenden cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelular.
El dominio de transduccion de senal o dominio de senalizacion intracelular del CAR multicatenario de la invencion es responsable de la senalizacion intracelular despues de la union del dominio de union a ligando extracelular con la diana dando como resultado la activacion de la celula inmunitaria y respuesta inmunitaria. En otras palabras, el dominio de transduccion de senal es responsable de la activacion de al menos una de las funciones efectoras normales de la celula inmunitaria en la que se expresa el CAR multicatenario. Por ejemplo, la funcion efectora de un linfocito T puede ser una actividad citolttica o actividad auxiliar que incluye la secrecion de citocinas. Por tanto, la expresion "dominio de transduccion de senal" se refiere a la parte de una protema que transduce la senal efectora a senal funcional y dirige la celula para realizar una funcion especializada.
Los ejemplos preferidos de dominio de transduccion de senal para su uso en CAR multicatenario pueden ser las secuencias citoplasmicas del receptor de Fc o receptor y correceptores de linfocitos T que actuan en concierto para iniciar la transduccion de senal despues de interaccion con el receptor de antigeno, asf como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintetica que tenga la misma capacidad funcional. El dominio de transduccion de senal comprende dos clases distintas de secuencia de senalizacion citoplasmica, la que inician activacion primaria dependiente de antigeno y las que actuan de una manera dependiente de antigeno para proporcionar una senal secundaria o coestimulante. La secuencia de senalizacion citoplasmica primaria puede comprender motivos de senalizacion que se conocen como motivos de activacion basados en tirosina inmunorreceptores de ITAM. Los ITAM son motivos de senalizacion bien definidos hallados en la cola intracitoplasmica de una diversidad de receptores que actuan como sitios de union para tirosina quinasas de clase syk/zap70. Los ejemplos de ITAM usados en la invencion pueden incluir como ejemplos no limitantes los procedentes de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRepsilon, CD3 gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En una realizacion preferida, el dominio de transduccion de senalizacion del CAR multicatenario puede comprender el dominio de senalizacion CD3zeta o el dominio intracitoplasmico de las cadenas beta o gamma de FceRI.
En una realizacion particular el dominio de transduccion de senal del CAR multicatenario de la presente invencion comprende una molecula senal coestimulante. Una molecula coestimulantes es una molecula de superficie celular distinta de un receptor de antfgeno o sus ligandos que es necesaria para una respuesta inmunitaria eficaz. "Ligando coestimulante" se refiere a una molecula en una celula presentadora de antigenos que se une espedficamente con una molecula coestimulante afm en un linfocito T, proporcionando de este modo una senal que, ademas de la senal primaria proporcionada mediante, por ejemplo, la union de un complejo de TCR/CD3 con una molecula del MHC cargada con peptido, media en una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitacion, activacion de proliferacion, diferenciacion y similares. Un ligando coestimulante puede incluir pero sin limitacion CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulante inducible (ICOS-L), molecula de adhesion intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une con el receptor de ligando Toll y un ligando que se une espedficamente con B7-H3. Un ligando coestimulante tambien abarca, entre otros, un anticuerpo que se une espedficamente con una molecula coestimulante presente en un linfocito T, tal como, pero sin limitacion, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antfgeno 1 asociado a la funcion de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une espedficamente con CD83.
Una "molecula coestimulante" se refiere al companero de union afm en un linfocito T que se une espedficamente con un ligando coestimulante, mediando de este modo en una respuesta coestimulante por la celula, tal como, pero sin limitacion, proliferacion. Las moleculas coestimulantes incluyen, pero sin limitacion, una molecula del MHC de clase I, BTLA y receptor de ligando Toll. Los ejemplos de moleculas coestimulantes incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antfgeno 1 asociado a la funcion de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une espedficamente con CD83 y similares.
En otra realizacion particular, dicho dominio de transduccion de senal es un motivo de union a Factor 2 asociado a TNFR (TRAF2), cola citoplasmica de la familia del miembro de TNFR coestimulante. La cola citoplasmica del miembro de la familia de TNFR coestimulante contiene motivos de union a TRAF2 que consisten en el motivo conservado mayor (P/S/A)X(Q/E)E) o el motivo conservado menor (PXQ.XXD), en donde X es cualquier aminoacido. Se reclutan protemas TRAF a las colas intracelulares de muchos TNFR en respuesta a trimerizacion del receptor.
En una realizacion preferida, el dominio de transduccion de senal del CAR multicatenario de la presente invencion comprende una parte de molecula senal coestimulante seleccionada del grupo que consiste en 4-1BB (GenBank: AAA53133.) y c D28 (NP_006130.1). En particular el dominio de transduccion de senal del CAR multicatenario de la presente invencion comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de SEQ ID NO: 200 y SEQ ID NO: 201.
Las caractensticas distintivas de polipeptidos transmembrana apropiados comprenden la capacidad para expresarse en la superficie de una celula inmunitaria, en particular celulas linfodticas o linfocitos citoltticos naturales (NK), y para interaccionar entre sf para dirigir la respuesta celular de celulas inmunitarias contra una celula diana predefinida. Los diferentes polipeptidos transmembrana del CAR multicatenario de la presente invencion que comprenden un dominio de union a ligando extracelular y/o un dominio de transduccion de senal interaccionan entre sf para tomar parte en la transduccion de senal despues de la union con un ligando diana e inducir una respuesta inmunitaria. El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o de una sintetica. El dominio transmembrana puede proceder de cualquier protema unida a membrana o transmembrana. Como ejemplos no limitantes, el polipeptido transmembrana puede ser una subunidad del receptor de linfocitos T tal como a, p, y o 8, polipeptido que constituye el complejo de CD3, receptor de IL2 p55 (cadena a), p75 (cadena p) o cadena y, cadena subunitaria de receptores de Fc, en particular receptor Fcy III o protemas CD. Como alternativa el dominio transmembrana puede ser sintetico y puede comprender restos predominantemente hidrofobos tales como leucina y valina. En una realizacion preferida, el polipeptido transmembrana procedente de las cadenas del receptor Fc£ o variante de las mismas, en particular comprende una parte de las cadenas a (SEQ ID NO: 202), p (Se Q ID NO: 203) y/o y (SEQ ID NO: 204) de FceRI o variante de las mismas.
La expresion "procedente de" significa un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que es equivalente a la de un receptor Fc£ que incluye una o mas modificaciones de aminoacidos de la secuencia del receptor Fc£. Dicha modificacion o modificaciones de aminoacidos pueden incluir sustitucion o sustituciones, supresion o supresiones, adicion o adiciones de aminoacidos o una combinacion de cualquiera de esas modificaciones y pueden alterar la actividad biologica de la region de union a Fc en relacion con la de un receptor de Fc. Por otro lado, las regiones de union a Fc procedentes de un receptor de Fc particular pueden incluir una o mas modificaciones de aminoacidos que no alteran sustancialmente la actividad biologica de la region de union a Fc en relacion con la de un receptor de Fc. La modificacion o modificaciones de aminoacidos de este tipo comprenderan habitualmente sustitucion o sustituciones de aminoacidos conservativas.
En una realizacion particular, el CAR multicatenario comprende un polipeptido transmembrana procedente de una cadena de Fc£RI. En realizaciones mas particulares la cadena de Fc£RI es una cadena a de Fc£RI, en la que el dominio extracelular se reemplaza por un dominio de union a ligando extracelular, preferentemente por un scFV, mas preferentemente scFv-4G7 (SEQ ID NO: 195).
En realizaciones mas particulares, dicho CAR multicatenario puede comprender una parte de cadena alfa de Fc£RI y una parte de cadena beta de Fc£RI o variante de las mismas de modo que dichas cadenas de Fc£RI se dimerizan espontaneamente entre sf para formar un receptor quimerico de antfgenos dimerico. En otra realizacion, el antigeno quimerico multicatenario puede comprender una parte de cadena alfa de Fc£RI y una parte de una cadena gamma de Fc£RI o variante de las mismas de modo que dichas cadenas de Fc£RI se trimericen espontaneamente entre sf para formar un receptor quimerico de antfgenos trimerico y, en otra realizacion, el receptor quimerico de antfgenos multicatenario puede comprender una parte de cadena alfa de Fc£RI, una parte de cadena beta de Fc£RI y una parte de cadena gamma de Fc£RI o variantes de las mismas de modo que dichas cadenas de Fc£RI se tetramericen espontaneamente entre sf para formar un receptor quimerico de antfgenos tetramerico.
En otras palabras, el CAR multicatenario que comprende al menos dos de los siguientes componentes:
a) un polipeptido que comprende una parte de cadena alfa de Fc£RI y un dominio de union a ligando extracelular,
b) un polipeptido que comprende una parte de cadena beta de Fc£RI y/o
c) un polipeptido que comprende una parte de cadena gamma de Fc£RI, por lo que diferentes polipeptidos multimerizan entre sf de forma espontanea para formar CAR dimerico, trimerico o tetramerico.
En una realizacion preferida, el CAR multicatenario de la presente invencion comprende una parte de un polipeptido con secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 202 a SEQ ID NO: 204.
La expresion "una parte de" usada en el presente documento se refiere a cualquier subconjunto de la molecula, es decir, un peptido mas corto. Como alternativa, las variantes funcionales de secuencias de aminoacidos del polipeptido pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN que codifica el polipeptido. Dichas variantes o variantes funcionales incluyen, por ejemplo, supresiones de, o inserciones o sustituciones de, restos dentro de la secuencia de aminoacidos. Cualquier combinacion de supresion, insercion y sustitucion tambien puede realizarse para llegar a la construccion final, siempre que la construccion final posea la actividad deseada, especialmente para mostrar una actividad inmunitaria celular antidiana espedfica. La funcionalidad del CAR multicatenario de la invencion en una celula hospedadora es detectable en un ensayo adecuado para demostrar el potencial de senalizacion de dicho CAR multicatenario tras la union de una diana particular. Dichos ensayos estan disponibles para los expertos en la materia. Por ejemplo, este ensayo permite la deteccion de una ruta de senalizacion, desencadenada tras la union de la diana, tal como un ensayo que implica la medicion del aumento de liberacion de ion de calcio, fosforilacion de tirosina intracelular, renovacion de fosfato de inositol o produccion de interleucina (IL) 2, interferon y, GM-CSF, IL-3, IL-4 efectuada de este modo.
Como ejemplo no limitante, se ilustran diferentes versiones de CAR multicatenario en la Figura 4. En una realizacion mas preferida, el CAR multicatenario de la presente invencion comprende un polipeptido con secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 206 a SEQ ID NO: 213. En una realizacion preferida el CAR multicatenario comprende un polipeptido con secuencia de aminoacidos que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 %, 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 206 a SEQ ID NO: 213.
Polinucleotidos, vectores:
La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos, vectores que codifican el CAR multicatenario anteriormente descrito segun la invencion. La presente invencion proporciona polinucleotidos, incluyendo moleculas de ADN y ARN que codifican los polipeptidos transmembrana desvelados en el presente documento que pueden incluirse en el CAR multicatenario. En particular, la invencion se refiere a un polinucleotido que comprende dos o mas secuencias de acido nucleico que codifican los polipeptidos transmembrana que comprenden el c A r multicatenario como se ha descrito anteriormente. En una realizacion preferida, la presente invencion se refiere a un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 214 a SEQ ID NO: 223. En una realizacion preferida, el polinucleotido tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 %, 95 % 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 214 a SEQ ID NO: 223.
El polinucleotido puede consistir en un casete de expresion o vector de expresion (por ejemplo un plasmido para introduccion en una celula hospedadora bacteriana o un vector vmco tal como un vector de baculovirus para transfeccion de una celula hospedadora de insecto o un vector plasmfdico o vmco tal como un lentivirus para transfeccion de una celula hospedadora de mamffero).
En una realizacion particular, las diferentes secuencias de acido nucleico pueden incluirse en un polinucleotido o vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de salto ribosomico tal como una secuencia que codifica un peptido 2A. Los peptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo de Aphtovirus de pircornavirus, provocan un "salto" ribosomico de un codon al siguiente sin la formacion de un enlace peptfdico entre los dos aminoacidos codificados por los codones (vease Donnelly et al., J. of General Virology 82:1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)). Por "codon" se entiende tres nucleotidos en un ARNm (o en la cadena con sentido de una molecula de ADN) que se traducen mediante un ribosoma en un resto de aminoacido. Por tanto, pueden sintetizarse dos polipeptidos a partir de una unica fase abierta de lectura contigua en un ARNm cuando los polipeptidos se separan por una secuencia oligopeptidica de 2A que esta en fase. Dichos mecanismos de salto ribosomico son bien conocidos en la tecnica y se sabe que son usados por varios vectores para la expresion de varias protemas codificadas por un unico ARN mensajero. Como ejemplo no limitante, en la presente invencion, se han usado peptidos 2A para expresar en la celula los diferentes polipeptidos del CAR multicatenario. En una realizacion mas preferida, la presente invencion se refiere a polinucleotidos seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 224 a SEQ ID NO: 232.
Para dirigir un polipeptido transmembrana tal como FceR a la ruta secretora de una celula hospedadora, se proporciona una secuencia senal secretora (tambien conocida como una secuencia lfder, secuencia prepro o secuencia pre) en secuencia polinucleotidica o secuencia de vector. La secuencia senal secretora puede ser la de FceR, o puede proceder de otra protema secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizarse de novo. La secuencia senal secretora esta unida operativamente a la secuencia de acido nucleico transmembrana, es decir, las dos secuencias estan unidas en la fase de lectura correcta y se situan para dirigir el polipeptido de nueva smtesis a la ruta secretora de la celula hospedadora. Las secuencias senal secretoras se situan habitualmente 5' de la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de interes, aunque pueden situarse determinadas secuencias senal secretoras en otra parte de la secuencia de acido nucleico de interes (vease, por ejemplo, Welch et al., patente de los Estados Unidos n.° 5.037.743; Hollands et al., patente de los Estados Unidos n.° 5.143.830). En una realizacion preferida el peptido senal comprende los restos 1 a 25 de la cadena alfa de FceRI (NP_001992.1) y tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 205.
Los expertos en la materia reconoceran que, a la vista de la degeneracion del codigo genetico, es posible variacion de secuencia considerable entre estas moleculas polinucleotidicas. Preferentemente, las secuencias de acido nucleico de la presente invencion tienen codones optimizados para expresion en celulas de mairnfero, preferentemente para expresion en celulas humanas. La optimizacion de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interes de codones que son en general poco habituales en genes altamente expresados de una especie dada por codones que son en general frecuentes en genes altamente expresados de dicha especie, codificando dichos codones los aminoacidos como los codones que se intercambian.
En una realizacion preferida, el polinucleotido segun la presente invencion comprende la secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las: SEQ ID NO: 214 a SEQ ID NO: 223. La presente invencion se refiere a polinucleotidos que comprenden una secuencia de acido nucleico que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 214 a SEQ ID NO: 222.
Metodos para genomodificacion de una celula inmunitaria:
En una realizacion particular incluida, la invencion se refiere a un metodo para preparar celulas inmunitarias para inmunoterapia que comprende introducir en dichas celulas inmunitarias los polipeptidos que componen dicho CAR multicatenario y expandir dichas celulas. En una realizacion particular, la invencion se refiere a un metodo de genomodificacion de una celula inmunitaria que comprenden proporcionar una celula y expresar en la superficie de dicha celula al menos un CAR multicatenario como se ha descrito anteriormente. En una realizacion particular, el metodo comprende transformer la celula con al menos un polinucleotido que codifica polipeptidos que componen al menos un CAR multicatenario como se ha descrito anteriormente y expresar dichos polinucleotidos en dicha celula.
En otra realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo para preparar celulas para inmunoterapia que comprende introducir en dichas celulas los diferentes polipeptidos que componen dicho CAR multicatenario y expandir dichas celulas. En una realizacion preferida, dichos polinucleotidos se incluyen en vectores lentivfticos a la vista de su expresion estable en las celulas.
En otra realizacion, dicho metodo comprende ademas una etapa de modificar geneticamente dicha celula inactivando al menos un gen que expresa un componente del TCR, una diana para un agente inmunosupresor, gen de HLA y/o un gen de punto de control inmunitario tal como PDCD1 o CTLA-4. En una realizacion preferida, dicho gen se selecciona del grupo que consiste en TCRalfa, TCRbeta, CD52, GR, PD1 y CTLA-4. En una realizacion preferida dicho metodo comprende ademas introducir en dichos linfocitos T una endonucleasa de corte poco habitual capaz de inactivar selectivamente mediante escision de ADN de dichos genes. En una realizacion mas preferida dicha endonucleasa de corte poco habitual es nucleasa TALE. Son nucleasas TALE preferidas segun la invencion las que reconocen y escinden la secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1 a 6 (GR), SEQ ID NO: 37, 57 a 60 (TCRalfa), SEQ ID NO: 38 o 39 (TCRbeta), y SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 61 a SEQ ID NO: 65 (CD52), SEQ ID NO: 74 a SEQ ID NO: 78 (PD1 y CTLA-4).
Inactivando un gen se pretende que el gen de interes no se exprese en una forma proteica funcional. En una realizacion particular, la modificacion genetica del metodo se basa en la expresion, en celulas proporcionadas para genomodificar, de una endonucleasa de corte poco habitual de modo que dicha endonucleasa de corte poco habitual cataliza espedficamente la escision en un gen diana inactivando de este modo dicho gen diana. Las roturas de cadena de acido nucleico provocadas por la endonucleasa de corte poco habitual se reparan habitualmente a traves de mecanismos distintos de recombinacion homologa o union de extremos no homologos (NHEJ). Sin embargo, la NHEJ es un proceso de reparacion imperfecto que a menudo da como resultado cambios en la secuencia de ADN en el sitio de la escision. Los mecanismos implican la reunion de lo que queda de los dos extremos de ADN a traves de religamiento directo (Critchlow y Jackson 1998) o mediante la denominada union de extremos mediada por microhomologfa (Ma, Kim et al., 2003). La reparacion mediante union de extremos no homologos (NHEJ) a menudo da como resultado pequenas inserciones o supresiones y se puede utilizar para la creacion de desactivaciones genicas espedficas. Dicha modificacion puede ser una sustitucion, supresion o adicion de al menos un nucleotido. Las celulas en las que se ha producido un acontecimiento de mutagenesis inducida por escision, es decir un acontecimiento de mutagenesis consecutivo a un acontecimiento de NHEJ, pueden identificarse y/o seleccionarse mediante un metodo bien conocido en la tecnica.
En otra realizacion, el dominio catalftico adicional puede introducirse ademas en la celula con dicha endonucleasa de corte poco habitual para aumentar la mutagenesis para potenciar su capacidad para inactivar genes diana descritos en la presente divulgacion. En particular, dicho dominio catalftico adicional es una enzima de procesamiento de extremos de ADN. Los ejemplos no limitantes de enzimas de procesamiento de extremos de ADN incluyen exonucleasas 5-3', exonucleasas 3-5', exonucleasas alcalinas 5-3', endonucleasas flap 5', helicasas, hosfatasa, hidrolasas y ADN polimerasas independientes de molde. Los ejemplos no limitantes de dicho dominio catalftico comprenden un dominio proteico o derivado catalfticamente activo del dominio proteico seleccionado del grupo que consiste en hExol (EXO1_HUMAN), Exol de levadura (EXO1_YEAST), Exol de E. coli, TREX2 humana, TREX1 de raton, TREX1 humana, TREX1 bovina, TREX1 de rata, DNA2 humana de TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal), DNA2 de levadura (DNA2_YEAST). En una realizacion preferida, dicho dominio catalftico adicional tiene una actividad exonucleasa 3'-5' y, en una realizacion mas preferida, dicho dominio catalftico adicional es TREX, mas preferentemente dominio catalftico TREX2 (documento WO2012/058458). En otra realizacion preferida, dicho dominio catalftico es codificado por un polipeptido de TREX monocatenario. Dicho dominio catalftico adicional puede fusionarse con una protema de fusion de nucleasa o protema quimerica segun la invencion opcionalmente por un enlazador peptfdico.
Se sabe que las roturas endonucleolfticas estimulan la tasa de recombinacion homologa. Por tanto, en otra realizacion, la etapa de modificacion genetica del metodo comprende ademas una etapa de introduccion en celulas un acido nucleico exogeno que comprende al menos una secuencia homologa de una parte de la secuencia de acido nucleico diana, de modo que se produce recombinacion homologa entre la secuencia de acido nucleico diana y el acido nucleico exogeno. En realizaciones particulares, dicho acido nucleico exogeno comprende primera y segunda partes que son homologas de la region 5' y 3' de la secuencia de acido nucleico diana, respectivamente. Dicho acido nucleico exogeno en estas realizaciones tambien comprende una tercera parte situada entre la primera y la segunda parte que no comprende homologfa con las regiones 5' y 3' de la secuencia de acido nucleico diana. Despues de la escision de la secuencia de acido nucleico diana, se estimula una recombinacion homologa entre la secuencia de acido nucleico diana y el acido nucleico exogeno. Preferentemente, se usan secuencias homologas de al menos 50 pb, preferentemente mas de 100 pb y mas preferentemente mas de 200 pb dentro de dicha matriz donante. Por lo tanto, el acido nucleico exogeno es preferentemente de 200 pb a 6000 pb, mas preferentemente de 1000 pb a 2000 pb. De hecho, se localizan homologfas de acido nucleico compartidas en regiones que flanquean cadena arriba y cadena abajo el sitio de la rotura y la secuencia de acido nucleico para introducir debena localizarse entre las dos ramas.
En particular, dicho acido nucleico exogeno comprende sucesivamente una primera region de homolog^a con secuencias cadena arriba de dicha escision, una secuencia para inactivar un gen diana seleccionado del grupo que consiste en TCR alfa, TCR beta, CD52, GR, genes de punto de control inmunitario y una segunda region de homologfa con secuencias cadena abajo de la escision. Dicha etapa de introduccion de polinucleotidos puede ser simultanea, antes o despues de la introduccion o expresion de dicha endonucleasa de corte poco habitual. Dependiendo de la localizacion de la secuencia de acido nucleico diana en donde se ha producido acontecimiento de rotura, dicho acido nucleico exogeno puede usarse para desactivar un gen, por ejemplo cuando se localiza acido nucleico exogeno en la fase abierta de lectura de dicho gen, o para introducir nuevas secuencias o genes de interes. Pueden usarse inserciones de secuencias usando dicho acido nucleico exogeno para modificar un gen diana existente, mediante correccion o reemplazo de dicho gen (intercambio de alelo como ejemplo no limitante) o para regular positiva o negativamente la expresion del gen diana (intercambio de promotor como ejemplo no limitante), dicha correccion o reemplazo de gen diana. En una realizacion preferida, la inactivacion de genes del grupo que consiste en TCR alfa, TCR beta, CD52, GR, genes de punto de control inmunitario puede realizarse en una localizacion genomica precisa diana de una nucleasa TALE espedfica, en donde dicha nucleasa TALE espedfica cataliza una escision y en donde dicho acido nucleico exogeno que comprende sucesivamente al menos una region de homologfa y una secuencia para inactivar un gen diana seleccionado del grupo que consiste en TCR alfa, TCR beta, CD52, GR, genes de punto de control inmunitario que se integra por recombinacion homologa. En otra realizacion, varios genes pueden inactivarse, sucesivamente o al mismo tiempo, usando varias nucleasas TALE respectivamente y dirigiendose espedficamente a un gen definido y varios polinucleotidos espedficos para inactivacion de genes espedficos.
Por etapa de modificacion genomica adicional, puede entenderse tambien la inactivacion de otro gen seleccionado del grupo que consiste en TCR alfa, TCR beta, CD52, GR, genes de punto de control inmunitario. Como se ha mencionado anteriormente, dicha etapa de modificacion genomica adicional puede ser una etapa de inactivacion que comprende:
(a) introducir en dichas celulas al menos una endonucleasa de corte poco habitual de modo que dicha endonucleasa de corte poco habitual catalice espedficamente la escision en una secuencia diana del genoma de dicha celula.
(b) Opcionalmente introducir en dichas celulas un acido nucleico exogeno que comprende sucesivamente una primera region de homologfa con secuencias cadena arriba de dicha escision, una secuencia para insertar en el genoma de dicha celula y una segunda region de homologfa con secuencias cadena abajo de dicha escision,
en donde dicho acido nucleico exogeno introducido inactiva un gen e integra al menos una secuencia polinucleotfdica exogena que codifica al menos una protema recombinante de interes. En otra realizacion, dicha secuencia polinucleotfdica exogena se integra en un gen seleccionado del grupo que consiste en TCR alfa, TCR beta, CD52, GR, genes de punto de control inmunitario.
- Linfocitos T resistentes a inmunosupresion:
En un aspecto particular, una de las etapas de modificacion genetica de celulas puede ser un metodo que comprende:
(a) modificar linfocitos T inactivando al menos un gen que expresa una diana para un agente inmunosupresor, y
(b) expandir dichas celulas, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.
Un agente inmunosupresor es un agente que suprime la funcion inmunitaria mediante uno de varios mecanismos de accion. En otras palabras, un agente inmunosupresor es un papel desempenado por un compuesto que es mostrado por una capacidad de reducir el alcance y/o la voracidad de una respuesta inmunitaria. Como ejemplo no limitante, un agente inmunosupresor puede ser un inhibidor de calcineurina, una diana de rapamicina, un bloqueador de cadena a de interleucina 2, un inhibidor de inosina monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de acido dihidrofolico reductasa, un corticosteroide o un antimetabolito inmunosupresor. Los inmunosupresores citotoxicos clasicos actuan inhibiendo la smtesis de ADN. Otros pueden actuar mediante activacion de linfocitos T o inhibiendo la activacion de celulas auxiliares. El metodo segun la invencion permite conferir resistencia inmunosupresora a linfocitos T para inmunoterapia inactivando la diana del agente inmunosupresor en linfocitos T. Como ejemplos no limitantes, las dianas para agente inmunosupresor pueden ser un receptor para un agente inmunosupresor tal como: CD52, receptor de glucocorticoides (GR), un miembro genico de la familia del FKBP y un miembro genico de la familia de la ciclofilina.
Inactivando un gen se pretende que el gen de interes no se exprese en una forma proteica funcional. En una realizacion particular, la modificacion genetica del metodo se basa en la expresion, en celulas proporcionadas para genomodificar, de una endonucleasa de corte poco habitual de modo que dicha endonucleasa de corte poco habitual cataliza espedficamente la escision en un gen diana inactivando de este modo dicho gen diana. En una realizacion particular, dicho metodo para genomodificar celulas comprende al menos una de las siguientes etapas:
(a) Proporcionar un linfocito T, preferentemente de un cultivo celular o de una muestra sangumea;
(b) Seleccionar un gen en dicho linfocito T que expresa una diana para un agente inmunosupresor;
(c) Introducir en dicho linfocito T una endonucleasa de corte poco habitual capaz de inactivar selectivamente mediante escision de ADN, preferentemente mediante rotura bicatenaria, dicho gen que codifica una diana para dicho agente inmunosupresor, y
(d) Expandir dichas celulas, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.
En una realizacion mas preferida, dicho metodo comprende:
(a) Proporcionar un linfocito T, preferentemente de un cultivo celular o de una muestra sangumea;
(b) Seleccionar un gen en dicho linfocito T que expresa una diana para un agente inmunosupresor;
(c) Transformar dicho linfocito T con acido nucleico que codifica una endonucleasa de corte poco habitual capaz de inactivar selectivamente mediante escision de ADN, preferentemente mediante rotura bicatenaria, dicho gen que codifica una diana para dicho agente inmunosupresor, y
(d) Expresar dichas endonucleasas de corte poco habitual en dichos linfocitos T;
(e) Expandir dichas celulas, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.
En una realizacion particular, dicha endonucleasa de corte poco habitual se dirige espedficamente a un gen seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR. En otra realizacion, dicho gen de la etapa (b), espedfico para un tratamiento inmunosupresor, es CD52 y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) o (e) comprende un anticuerpo humanizado que se dirige a antfgeno CD52.
En otra realizacion, dicho gen de la etapa (b), espedfico para un tratamiento inmunosupresor, es un receptor de glucocorticoides (GR) y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) o (e) comprende un corticosteroide tal como dexametasona.
En otra realizacion, dicho gen diana de la etapa (b), espedfico para un tratamiento inmunosupresor, es un miembro genico de la familia de FKBP o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) o (e) comprende FK506 tambien conocido como Tacrolimus o fujimicina. En otra realizacion, dicho miembro genico de la familia de FKBP es FKBP12 o una variante del mismo.
En otra realizacion, dicho gen de la etapa (b), espedfico para un tratamiento inmunosupresor, es un miembro genico de la familia de ciclofilina o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) o (e) comprende ciclosporina.
En otra realizacion, dicha endonucleasa de corte poco habitual puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de cinc o una nucleasa TALE. En una realizacion preferida, dicha endonucleasa de corte poco habitual es una nucleasa TALE. Son nucleasas TALE preferidas segun la invencion las que reconocen y escinden la secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 1 a 6 (GR), y
- SEQ ID NO: 40, 61 a 65 (CD52)
Dichas nucleasas TALE comprenden preferentemente una secuencia polinucleotidica seleccionada de SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 47 a SEQ ID NO: 48, para escindir las secuencias diana respectivas SEQ ID NO: 1 a 6 y SEQ ID NO: 40.
- Linfocitos T altamente activos para inmunoterapia
En un aspecto particular, una etapa particular de modificacion genetica de celulas puede ser un metodo que comprende:
(a) modificar linfocitos T inactivando al menos un gen de punto de control inmunitario; y
(b) expandir dichas celulas.
La inmunidad mediada por linfocitos T incluye multiples etapas secuenciales que implican la seleccion clonal de celulas espedficas de antfgeno, su activacion y proliferacion en tejido linfoide secundario, su transporte a sitios de antfgeno e inflamacion, la ejecucion de funcion efectora directa y la provision de ayuda (mediante citocinas y ligandos de membrana) para una multitud de celulas inmunitarias efectoras. Cada una de estas etapas es regulada contrarrestando la senal estimulante e inhibidora que ajusta la respuesta. Los expertos en la materia entenderan que la expresion "puntos de control inmunitarios" significa un grupo de moleculas expresadas por linfocitos T. Estas moleculas actuan en la practica como "frenos" para modular negativamente o inhibir una respuesta inmunitaria. Las moleculas de punto de control inmunitarias incluyen, pero sin limitacion, muerte programada 1 (PD-1, tambien conocida como PDCD1 y CD279, numero de registro: NM_005018), El antigeno 4 de linfocitos T citotoxicos (CTLA-4, tambien conocido como CD152, GenBank, numero de registro AF414120.1), LAG3 (tambien conocida como CD223, numero de registro: NM_002286.5), Tim3 (tambien conocida como HAVCR2, GenBank, numero de registro: JX049979.1), BTLA (tambien conocida como CD272, numero de registro: NM_181780.3), BY55 (tambien conocida como CD160, GenBank, numero de registro: CR541888.1), TIGIT (tambien conocida como VSTM3, numero de registro: NM_173799), B7H5 (tambien conocida como C10orf54, homologo de gen vista de raton, numero de registro: NM_022153.1), LAIR1 (tambien conocida como CD305, GenBank, numero de registro: CR542051.1), SIGLEC10 (GeneBank, numero de registro: AY358337.1), 2B4 (tambien conocida como CD244, numero de registro: NM_001166664.1), que inhiben directamente las celulas inmunitarias. Por ejemplo, CTLA-4 es una protema de superficie celular expresada en determinados linfocitos T CD4 y CD8 T; cuando interaccionan con sus ligandos (B7-1 y B7-2) en celulas presentadoras de antfgenos, se inhiben la activacion y funcion efectora de linfocitos T. Por tanto la presente invencion se refiere a un metodo de genomodificacion de linfocitos T, especialmente para inmunoterapia, que comprende la modificacion genetica de linfocitos T inactivando al menos una protema implicada en el punto de control inmunitario, en particular PD1 y/o CTLA-4.
En una realizacion particular, dicho metodo para genomodificar celulas comprende al menos una de las siguientes etapas:
(a) proporcionar un linfocito T, preferentemente de un cultivo celular o de una muestra sangumea;
(b) Introducir en dicho linfocito T una endonucleasa de corte poco habitual capaz de inactivar selectivamente mediante escision de ADN, preferentemente por rotura bicatenaria, un gen que codifica una protema de punto de control inmunitario,
(c) expandir dichas celulas.
En una realizacion mas preferida, dicho metodo comprende:
(a) proporcionar un linfocito T, preferentemente de un cultivo celular o de una muestra sangumea;
(b) transformar dicho linfocito T con acido nucleico que codifica una endonucleasa de corte poco habitual capaz de inactivar selectivamente mediante escision de ADN, preferentemente por rotura bicatenaria, un gen que codifica una protema de punto de control inmunitario;
(c) expresar dichas endonucleasas de corte poco habitual en dichos linfocitos T;
(d) expandir dichas celulas.
En una realizacion particular, dicha endonucleasa de corte poco habitual se dirige espedficamente a un gen seleccionado del grupo que consiste en: PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCR alfa y TCR beta. En otra realizacion, dicha endonucleasa de corte poco habitual puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de cinc o una nucleasa TALE. En una realizacion preferida, dicha endonucleasa de corte poco habitual es una nucleasa TALE. Por nucleasa TALE se entiende una protema de fusion que consiste en un dominio de union a ADN procedente de un efector de tipo activador de la transcripcion (TALE) y un dominio catalftico de nucleasa para escindir una secuencia diana de acido nucleico. (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al. 2011; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011; Sander, Cade et al. 2011; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011; Zhang, Cong et al. 2011; Deng, Yan et al. 2012; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012).
En la presente invencion se han disenado nuevas nucleasas TALE para dirigirse con precision a genes relevantes para estrategias de inmunoterapia adoptiva. Son nucleasas TALE preferidas segun la invencion las que reconocen y escinden la secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78 (PD1), SEQ ID NO: 74 a SEQ ID NO: 76 (CTLA-4). La presente divulgacion tambien se refiere a polipeptidos de nucleasa TALE que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 79 a SEQ ID NO: 88.
La presente divulgacion tambien se refiere a polipeptidos que comprenden una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 79 a SEQ ID NO: 88. Tambien estan comprendidos en el alcance de la presente divulgacion, polinucleotidos, vectores que codifican las endonucleasas de corte poco habitual anteriormente descritas segun la invencion. Este metodo puede asociarse con uno cualquiera de los diferentes metodos descritos en la presente divulgacion.
- Linfocitos T no alorreactivos:
En otra realizacion, la presente invencion puede ser particularmente adecuada para inmunoterapia alogenica. En este caso, una de las etapas de modificacion genetica de celulas puede ser un metodo que comprende:
(a) modificar linfocitos T inactivando al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR) (b) Expandir dichas celulas.
En una realizacion particular, la modificacion genetica del metodo se basa en la expresion, en celulas proporcionadas para genomodificar, de una endonucleasa de corte poco habitual de modo que dicha endonucleasa de corte poco habitual cataliza espedficamente la escision en un gen diana inactivando de este modo dicho gen diana. En una realizacion particular, dicho metodo para genomodificar celulas comprende al menos una de las siguientes etapas: (a) Proporcionar un linfocito T, preferentemente de un cultivo celular o de una muestra sangumea;
Introducir en dicho linfocito T una endonucleasa de corte poco habitual capaz de inactivar selectivamente mediante escision de ADN, preferentemente mediante rotura bicatenaria, al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR).
(b) Expandir dichas celulas.
En una realizacion mas preferida, dicho metodo comprende:
(a) Proporcionar un linfocito T, preferentemente de un cultivo celular o de una muestra sangumea;
(b) Transformar dicho linfocito T con acido nucleico que codifica una endonucleasa de corte poco habitual capaz de inactivar selectivamente mediante escision de ADN, preferentemente mediante rotura bicatenaria, al menos un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR);
(c) Expresar dichas endonucleasas de corte poco habitual en dichos linfocitos T;
(d) Clasificar los linfocitos T transformados, que no expresan TCR en su superficie celular;
(e) Expandir dichas celulas.
En otra realizacion, dicha endonucleasa de corte poco habitual puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedo de cinc o una nucleasa TALE. En una realizacion preferida, dicha endonucleasa de corte poco habitual es una nucleasa TALE. Son nucleasas TALE preferidas segun la invencion las que reconocen y escinden la secuencia diana seleccionada del grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 37, 57 a 60 (TCRalfa),
- SEQ ID NO: 38 o 39 (TCRbeta),
Dichas nucleasas TALE comprenden preferentemente una secuencia polinucleotfdica seleccionada de SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 48, para escindir las secuencias diana respectivas s Eq ID NO: 37 a 39.
- PreTalfa
En otro aspecto, otra etapa de modificacion genetica de celulas puede ser un metodo para expandir linfocitos T deficientes en TCR alfa que comprende introducir en dicho pTalfa de linfocitos T (tambien denominado preTCRa) o una variante funcional del mismo y expandir dichas celulas, opcionalmente mediante la estimulacion del complejo de CD3. En una realizacion preferida, el metodo comprende:
a) Transformar dichas celulas con acido nucleico que codifica al menos un fragmento de pTalfa para apoyar la expresion en superficie de CD3
b) Expresar dicho pTalfa en dichas celulas
c) Expandir dichas celulas, opcionalmente mediante la estimulacion del complejo de CD3.
La invencion tambien se refiere a un metodo para preparar linfocitos T para inmunoterapia que comprende etapas del metodo para expansion para linfocitos T.
En una realizacion particular, la secuencia polinucleotidica de pTalfa puede introducirse aleatoriamente o bien mediante recombinacion homologa, en particular la insercion podna asociarse con la inactivacion del gen de TCRalfa.
Segun la invencion, se usan diferentes variantes funcionales de pTalfa. Una "variante funcional" del peptido se refiere a una molecula sustancialmente similar al peptido completo o un fragmento del mismo. Un "fragmento" del pTalfa o variante funcional del mismo de la presente invencion, se refiere a cualquier subconjunto de la molecula, es decir, un peptido mas corto. Los pTalfa variantes funcionales preferidos pueden ser pTalfa de longitud completa o una version de pTalfa truncada en el extremo C terminal. pTalfa truncado en el extremo C terminal carece en el extremo C terminal de uno o mas restos. Como ejemplos no limitantes, la version de pTalfa truncada en el extremo C terminal carece de 18, 48, 62, 78, 92, 110 o 114 restos del extremo C de la proterna (SEQ ID NO: 107 a SEQ ID NO: 114). Por otra parte, las variantes de secuencias de aminoacidos del polipeptido pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN que codifica el peptido. Dichas variantes funcionales incluyen, por ejemplo, supresiones de, o inserciones o sustituciones de, restos dentro de la secuencia de aminoacidos. Cualquier combinacion de supresion, insercion y sustitucion tambien puede realizarse para llegar a la construccion final, siempre que la construccion final posea la actividad deseada, en particular la restauracion de un complejo de CD3 funcional. En una realizacion preferida, se introduce al menos una mutacion en las diferentes versiones de pTalfa como se ha descrito anteriormente para afectar a la dimerizacion. Como ejemplo no limitante, el resto mutado puede ser al menos W46R, D22A, K24A, R102A o R117A de la proterna pTalfa humana o posiciones alineadas usando el metodo de CLUSTALW en la familia de pTalfa o miembro homologo. Preferentemente pTalfa o variante del mismo como se ha descrito anteriormente comprenden el resto mutado W46R (SEQ ID NO: 123) o los restos mutados D22A, K24A, R102A y R117A (SEQ ID NO: 124). En una realizacion particular, dicho pTalfa o variantes tambien se fusionan con un dominio de transduccion de senales tal como CD28, OX40, ICOS, CD27, CD137 (4-1BB) y CD8 como ejemplos no limitantes (SEQ ID NO: 115 a SEQ ID NO: 120). El dominio extracelular de pTalfa o variantes como se ha descrito anteriormente puede fusionarse con un fragmento de la proterna TCRalfa, particularmente el dominio transmembrana e intracelular de TCRalfa (SEQ ID NO: 122). Las variantes de pTalfa tambien pueden fusionarse con el dominio intracelular de TCRalfa (SEQ ID NO: 121).
En otra realizacion, dichas versiones de pTalfa se fusionan con un dominio de union a ligando extracelular y mas preferentemente pTalfa o variante funcional del mismo se fusiona con un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFV) que comprende el fragmento variable ligero (Vl) y el pesado (Vh) de un anticuerpo monoclonal espedfico de antfgeno diana unido por un enlazador flexible. Como un ejemplo no limitante, la secuencia de aminoacidos de pTalfa o variante funcional del mismo se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 107 a SEQ ID NO: 124.
Debido a que puede surgir algo de variabilidad de los datos genomicos de los que proceden estos polipeptidos y tambien para tener en cuenta la posibilidad de sustituir algunos de los aminoacidos presentes en estos polipeptidos sin perdida significativa de actividad (variantes funcionales), la invencion abarca variantes polipeptfdicas de los polipeptidos anteriores que comparte al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 % y aun mas preferentemente al menos 95 % de identidad con las secuencias proporcionadas en esta solicitud de patente.
La presente invencion se refiere por tanto a polipeptidos que comprenden una secuencia polipeptfdica que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, mas preferentemente al menos 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 107 a SEQ ID NO: 124.
Por linfocito T deficiente en TCR alfa se entiende un linfocito T aislado que carece de expresion de una cadena de TCR alfa funcional. Esto puede conseguirse mediante diferentes medios, como ejemplos no limitantes, genomodificando un linfocito T de modo que no exprese ningun TCR funcional en su superficie celular o genomodificando un linfocito T de modo que produzca muy poca cadena alfa de TCR funcional en su superficie o genomodificando un linfocito T para expresar una forma mutada o truncada de cadena alfa de TCR.
Las celulas deficientes en TCR alfa ya no pueden expandirse mediante complejo de CD3. Por tanto, para solucionar este problema y permitir la proliferacion de celulas deficientes en TCR alfa, se introduce pTalfa o variante funcional del mismo en dichas celulas, restaurando de este modo un complejo de CD3 funcional. En una realizacion preferida, el metodo comprende ademas introducir en dichos linfocitos T endonucleasas de corte poco habitual capaces de inactivar selectivamente mediante escision de ADN un gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR). En una realizacion particular, dicha endonucleasa de corte poco habitual es una nucleasa TALE. Como ejemplos no limitantes, se dirige nucleasa TALE contra una de las secuencias diana genicas de TCRalfa seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 57 a 60. Preferentemente, se seleccionan nucleasas TALE entre el grupo que consiste en las SEQ ID No : 41 y SEQ ID NO: 42.
Tambien estan abarcadas en la presente invencion polipeptidos que codifican pTalfa, particularmente variantes funcionales descritas anteriormente. En una realizacion preferida la invencion se refiere a un pTalfa o variante funcional del mismo fusionado con un dominio de transduccion de senal tal como CD28, OX40, ICOS, CD137 y CD8. Mas particularmente, la invencion se refiere a una variante funcional de pTalfa que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 107 a SEQ ID NO: 124. Tambien estan abarcadas en la presente invencion polinucleotidos, vectores que codifican pTalfa o variantes funcionales de los mismos descritos anteriormente.
En el alcance de la presente invencion tambien estan abarcadas celulas aisladas o lmeas celulares susceptibles de poder obtenerse por dicho metodo. En particular, dichas celulas aisladas o lmeas celulares se obtienen introduciendo en dichas celulas un pTalfa o una variante funcional del mismo para apoyar la expresion en superficie de CD3. En una realizacion preferida, dicha celula aislada o lmea celular se modifica geneticamente de forma adicional inactivando el gen de TCRalfa. Este gen es inactivado preferentemente por al menos una endonucleasa de corte poco habitual. En una realizacion preferida dicha endonucleasa de corte poco habitual es nucleasa TALE.
En el alcance de la presente invencion tambien estan abarcadas celulas aisladas o lmeas celulares susceptibles de poder obtenerse por dicho metodo para genomodificar celulas, en particular linfocitos T, en el que al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en TCR alfa, TCR beta, CD52, GR, se han inactivado genes de punto de control inmunitario.
- Anticuerpos biespedficos
Segun una realizacion adicional, los linfocitos T genomodificados obtenidos por los diferentes metodos como se ha descrito previamente pueden exponerse adicionalmente a anticuerpos biespedficos. Dichos linfocitos T podnan exponerse a anticuerpos biespedficos ex vivo antes de la administracion a un paciente. Dichos anticuerpos biespedficos comprenden dos regiones variables con propiedades antigenicas definidas que permiten aproximar las celulas genomodificadas a un antfgeno diana. Como un ejemplo no limitante, dicho anticuerpo biespedfico se dirige contra un marcador tumoral y antfgeno de linfocitos tal como CD3 y tiene el potencial de redirigir y activar cualquier linfocito T en circulacion contra tumores.
Metodos de suministro
Los diferentes metodos descritos anteriormente implican introducir CAR multicatenario, pTalfa o variantes funcionales del mismo, endonucleasa de corte poco habitual, nucleasa TALE, CAR opcionalmente con enzima de procesamiento de extremos de ADN o acido nucleico exogeno en una celula.
Como ejemplo no limitante, dicho CAR multicatenario, pTalfa o variante funcional del mismo, endonucleasas de corte poco habitual, nucleasas TALE o CAR opcionalmente con enzima de procesamiento de extremos de ADN o acido nucleico exogeno pueden introducirse como transgenes codificados por uno o como vectores plasirndicos diferentes. Diferentes transgenes pueden incluirse en un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de salto ribosomico tal como una secuencia que codifica un peptido 2A. Los peptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo de Aphtovirus de pircornavirus, provocan un "salto" ribosomico de un codon al siguiente sin la formacion de un enlace peptfdico entre los dos aminoacidos codificados por los codones (vease Donnelly et al., J. of General Virology 82:1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)). Por "codon" se entiende tres nucleotidos en un ARNm (o en la cadena con sentido de una molecula de ADN) que se traducen mediante un ribosoma en un resto de aminoacido. Por tanto, pueden sintetizarse dos polipeptidos a partir de una unica fase abierta de lectura contigua en un ARNm cuando los polipeptidos se separan por una secuencia oligopeptidica de 2A que esta en fase. Dichos mecanismos de salto ribosomico son bien conocidos en la tecnica y se sabe que son usados por varios vectores para la expresion de varias protemas codificadas por un unico ARN mensajero. Como ejemplo no limitante, en la presente invencion, se han usado peptidos 2A para expresar en la celula la endonucleasa de corte poco habitual y una enzima de procesamiento de extremos de ADN o los diferentes polipeptidos del CAR multicatenario.
Dicho vector plasmfdico tambien puede contener un marcador de seleccion que posibilita la identificacion y/o seleccion de celulas que recibieron dicho vector.
Los polipeptidos pueden sintetizarse in situ en la celula como resultado de la introduccion de polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos en la celula. Como alternativa, dichos polipeptidos podnan producirse fuera de la celula y despues introducirse en la misma. Se conocen en la tecnica metodos para introducir una construccion polinucleotfdica en celulas animales y que incluyen como ejemplos no limitantes metodos de transformacion estables en los que la construccion polinucleotidica se integra en el genoma de la celula, metodos de transformacion transitoria en los que la construccion polinucleotfdica no se integra en el genoma de la celula y metodos mediados por virus. Dichos polinucleotidos pueden introducirse en una celula mediante, por ejemplo, vectores vmcos recombinantes (por ejemplo retrovirus, adenovirus), liposoma y similares. Por ejemplo, los metodos de transformacion transitoria incluyen por ejemplo microinyeccion, electroporacion o bombardeo de partmulas. Dichos polinucleotidos pueden incluirse en vectores, mas particularmente plasmidos o virus, con la intencion de que se expresen en celulas.
- Electroporacion
En realizaciones particulares de la invencion, los polinucleotidos que codifican polipeptidos segun la presente invencion pueden ser ARNm que se introduce directamente en las celulas, por ejemplo, mediante electroporacion. Los inventores determinaron la condicion optima para electroporacion de ARNm en linfocitos T.
El inventor uso la tecnologfa de cytoPulse que permite, mediante el uso de campos electricos por pulsos, permeabilizar de forma transitoria celulas vivas para suministro de material a las celulas. La tecnolog^a, basada en el uso de formas de onda de electroporacion PulseAgile (propiedad de Cellectis) proporciona el control preciso de la duracion de los pulsos, la intensidad asf como el intervalo entre pulsos (patente de los Estados Unidos n.° 6.010.613 y solicitud de PCT internacional W02004083379). Todos estos parametros pueden modificarse para conseguir las mejores condiciones para alta eficacia de transfeccion con mortalidad mmima. Basicamente, los primeros pulsos de campo electrico altos permiten la formacion de poros, mientras que pulsos de campo electrico inferiores posteriores permiten mover el polinucleotido a la celula. En un aspecto de la presente invencion, el inventor describe las etapas que condujeron a la consecucion de >95 % de eficacia de transfeccion de ARNm en linfocitos T y el uso del protocolo de electroporacion para expresar de forma transitoria diferentes tipos de protemas en linfocitos T. En particular la divulgacion se refiere a un metodo para transformar linfocitos T que comprende poner en contacto dichos linfocitos T con ARN y aplicar a linfocitos T una secuencia de pulsos agiles que consiste en:
(a) un pulso electrico con un intervalo de tension de 2250 a 3000 V por centimetro, una amplitud de pulso de 0,1 ms y un intervalo de pulso de 0,2 a 10 ms entre los pulsos electricos de la etapa (a) y (b);
(b) un pulso electrico con un intervalo de tension de 2250 a 3000 V con una amplitud de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso electrico de la etapa (b) y el primer pulso electrico de la etapa (c); y
(c) 4 pulsos electricos con una tension de 325 V con una amplitud de pulso de 0,2 ms y un intervalo de pulso de 2 ms entre cada uno de 4 pulsos electricos.
El metodo para transformar linfocitos T que comprende poner en contacto dichos linfocitos T con ARN y aplicar a linfocitos T una secuencia de pulsos agiles que consiste en:
(a) un pulso electrico con una tension de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000V por centimetro, una amplitud de pulso de 0,1 ms y un intervalo de pulso de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 ms entre los pulsos electricos de la etapa (a) y (b);
(b) un pulso electrico con un intervalo de tension de 2250, de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 V con una amplitud de pulso de 100 ms y un intervalo de pulso de 100 ms entre el pulso electrico de la etapa (b) y el primer pulso electrico de la etapa (c); y
(c) 4 pulsos electricos con una tension de 325 V con una amplitud de pulso de 0,2 ms y un intervalo de pulso de 2 ms entre cada uno de 4 pulsos electricos.
Cualquier valor indicado en el intervalo de valores descrito anteriormente se desvela en la presente solicitud. El medio de electroporacion puede ser cualquier medio adecuado conocido en la tecnica. Preferentemente, el medio de electroporacion tiene conductividad en un intervalo que abarca de 0,01 a 1,0 miliSiemens.
Como ejemplos no limitantes, dicho ARN puede codificar una endonucleasa de corte poco habitual, un monomero de la endonucleasa de corte poco habitual tal como media nucleasa TALE, un receptor quimerico de antfgenos, al menos un componente del receptor quimerico de antfgenos multicatenario, un pTalfa o variante funcional del mismo, un acido nucleico exogeno, un dominio catalftico adicional.
Linfocitos T modificados
La presente invencion tambien se refiere a celulas aisladas o lmeas celulares susceptibles de poder obtenerse por dicho metodo para genomodificar celulas. En particular dicha celula aislada comprende al menos un CAR multicatenario como se ha descrito anteriormente. En otra realizacion, dicha celula aislada comprende una poblacion de CAR multicatenarios que comprenden cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelular. En particular, dicha celula aislada comprende secuencias polinucleotidicas exogenas que codifican polipeptidos que componen al menos un CAR multicatenario. Dichas celulas pueden comprender ademas al menos un gen inactivado seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa, TCR beta, gen de HLA, genes de puntos de control inmunitarios tales como PD1 y CTLA-4, o pueden expresar un transgen de pTalfa.
En el alcance de la presente invencion tambien esta abarcada una celula inmunitaria aislada, preferentemente un linfocito T obtenido segun uno cualquiera de los metodos descritos previamente. Dicha celula inmunitaria se refiere a una celula de origen hematopoyetico implicada funcionalmente en el inicio y/o la ejecucion de respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa. Dicha celula inmunitaria segun la presente invencion puede proceder de una celula madre. Las celulas madre pueden ser celulas madre del adulto, celulas madre embrionarias, mas particularmente celulas madre no humanas, celulas madre de sangre del cordon umbilical, celulas progenitoras, celulas madre de la medula osea, celulas madre pluripotentes inducidas, celulas madre totipotentes o celulas madre hematopoyeticas. Son celulas humanas representativas celulas CD34+. Dicha celula aislada tambien puede ser una celula dendntica, celula dendntica citolftica, un mastocito, un linfocito NK, un linfocito B o un linfocito T del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotoxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares. En otra realizacion, dicha celula puede proceder del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansion y modificacion genetica de las celulas de la invencion, puede obtenerse una fuente de celulas de un sujeto mediante una diversidad de metodos no limitantes. Pueden obtenerse celulas de varias fuentes no limitantes, incluyendo celulas mononucleares de sangre periferica, medula osea, tejido de ganglio linfatico, sangre de la medula osea, tejido del timo, tejido de un sitio de infeccion, ascitis, efusion pleural, tejido del bazo y tumores. En determinadas realizaciones de la presente invencion, se puede usar cualquiera de varias lmeas de linfocitos T disponibles y conocidas por los expertos en la materia. En otra realizacion, dicha celula puede proceder de un donante sano, de un paciente al que se ha diagnosticado cancer o de un paciente al que se ha diagnosticado una infeccion. En otra realizacion, dicha celula es parte de una poblacion mixta de celulas que presentan diferentes caractensticas fenotfpicas. En el alcance de la presente invencion tambien esta abarcada una lmea celular obtenida de un linfocito T transformado segun el metodo previamente descrito. El alcance de la presente invencion abarca celulas modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de poder obtenerse mediante el metodo previo.
En otra realizacion, dicha celula aislada segun la presente invencion comprende un gen inactivado seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIG IT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCR alfa y TCR beta y/o expresa un CAR, un CAR multicatenario y/o un transgen de pTalfa. En otra realizacion particular, dicha celula aislada comprende polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos que componen el CAR multicatenario.
En otra realizacion, dicha celula aislada segun la presente invencion comprende dos genes inactivados seleccionados del grupo que consiste en CD52 y GR, CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR beta, TCR alfa y TCR beta, PD1 y TCR alfa, PD1 y TCR beta, CTLA-4 y TCR alfa, CTLA-4 y TCR beta, LAG3 y TCR alfa, LAG3 y TCR beta, Tim3 y TCR alfa, Tim3 y TCR beta, BTLA y TCR alfa, BTLA y TCR beta, BY55 y TCR alfa, BY55 y TCR beta, TIGIT y TCR alfa, TIG IT y TCR beta, B7H5 y TCR alfa, B7H5 y TCR beta, LAIR1 y TCR alfa, LAIR1 y TCR beta, SIGLEC10 y TCR alfa, SIGLEC10 y TCR beta, 2B4 y TCR alfa, 2B4 y TCR beta y/o expresa un CAR, un CAR multicatenario y/o un transgen de pTalfa.
En otra realizacion, TCR se hace no funcional en las celulas segun la invencion inactivando el gen de TCR alfa y/o gen o genes de TCR beta. Las estrategias anteriores se usan mas particularmente para evitar GvHD. En un aspecto particular de la presente divulgacion hay un metodo para obtener celulas modificadas procedentes de un individuo, en el que dichas celulas pueden proliferar independientemente de la ruta de senalizacion del complejo mayor de histocompatibilidad. Dicho metodo comprende las siguientes etapas:
(a) Recuperar celulas de dicho individuo;
(b) Modificar geneticamente dichas celulas ex vivo inactivando genes de TCR alfa o TCR beta;
(c) Cultivar linfocitos T modificados geneticamente in vitro en condiciones apropiadas para amplificar dichas celulas.
Las celulas modificadas, que pueden proliferar independientemente de la ruta de senalizacion del complejo mayor de histocompatibilidad, susceptibles de poder obtenerse mediante este metodo estan abarcadas en el alcance de la presente invencion. Dichas celulas modificadas para su uso en el tratamiento de pacientes que lo necesitan contra rechazo de hospedador contra injerto (HvG) y enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD) es un aspecto particular de la invencion; por lo tanto en el alcance de la presente invencion estan dichas celulas modificadas para su uso en un metodo de tratamiento de pacientes que lo necesiten contra rechazo de hospedador contra injerto (HvG) y enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD) que comprende tratar a dicho paciente administrando a dicho paciente una cantidad eficaz de dichas celulas modificadas que comprenden genes de TCR alfa y/o TCR beta inactivados.
Activacion y expansion de linfocitos T
Bien antes o bien despues de la modificacion genetica de los linfocitos T, los linfocitos T pueden activarse y expandirse en general usando metodos como se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la publicacion de solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 20060121005. Los linfocitos T pueden expandirse in vitro o in vivo.
En general, los linfocitos T de la invencion se expanden por contacto con un agente que estimula un complejo de CD3 TCR y una molecula coestimulante en la superficie de los linfocitos T para crear una senal de activacion para el linfocito T.
Por ejemplo, pueden usarse productos qmmicos tales como ionoforo de calcio A23187, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) o lectinas mitogenas como fitohemaglutinina (PHA) para crear una senal de activacion para el linfocito T.
Como ejemplos no limitantes, pueden estimularse poblaciones de linfocitos T in vitro tal como mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de union a antfgeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o mediante contacto con un activador de protema quinasa C (por ejemplo, bryostatina) junto con un ionoforo de calcio. Para coestimulacion de una molecula adyuvante en la superficie de los linfocitos T, se usa un ligando que se une con la molecula adyuvante. Por ejemplo, una poblacion de linfocitos T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferacion de los linfocitos T. Para estimular la proliferacion de linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada senal pueden estar en solucion o acoplados a una superficie. Como apreciaran facilmente los expertos habituales en la materia, la relacion de partmulas con respecto a celulas puede depender del tamano de partmula en relacion con la celula diana. En realizaciones adicionales de la presente invencion, las celulas, tales como linfocitos T, se combinan con perlas recubiertas con agente, las perlas y las celulas se separan posteriormente y despues se cultivan las celulas. En una realizacion alternativa, antes del cultivo, las perlas recubiertas con antigeno y celulas no se separan sino que se cultivan juntas. Las condiciones apropiadas para cultivo de linfocitos T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, medio esencial mmimo o medio RPMI 1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para proliferacion y viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, lFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L- 15, TGFp y TNF- o cualquier otro aditivo para el crecimiento de celulas conocidos por el experto en la materia. Otros aditivos para el crecimiento de celulas incluyen, pero sin limitacion, tensioactivo, plasmanato y agentes reductores tales como N-acetil-cistema y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoacidos anadidos, piruvato sodico y vitaminas, sin suero o complementados con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina o citocinas suficiente para el crecimiento y la expansion de linfocitos T. Antibioticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solamente en cultivos experimentales, no en cultivos de celulas que van a infundirse en un sujeto. Las celulas diana se mantienen en condiciones necesarias para apoyar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37 °C) y atmosfera apropiadas (por ejemplo, aire mas CO25 %). Los linfocitos T que se han expuesto a diversos tiempos de estimulacion pueden mostrar diferentes caractensticas.
En otra realizacion particular, dichas celulas pueden expandirse cocultivando con tejido o celulas. Dichas celulas tambien pueden ser para su uso en expansion in vivo, por ejemplo en la sangre del sujeto despues de administrar dicha celula al sujeto.
Aplicaciones terapeuticas
En otra realizacion, la celula aislada obtenida por los diferentes metodos o la lmea celular procedente de dicha celula aislada como se ha descrito previamente para su uso como un medicamento. En otra realizacion, dicho medicamente puede ser para su uso en el tratamiento de cancer o infecciones en un paciente que lo necesite. En otra realizacion, dicha celula aislada segun la invencion o lmea celular procedente de dicha celula aislada puede usarse en la fabricacion de un medicamente para el tratamiento de un cancer, infeccion vmca o enfermedad autoinmunitaria en un paciente que lo necesite.
Dicho tratamiento puede ser de alivio, curativo o profilactico. Puede ser parte de una inmunoterapia autologa o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogenica. Por autologa, se entiende que las celulas, la lmea celular o la poblacion de celulas usadas para tratar pacientes se originan de dicho paciente o de un donante compatible con antfgeno de leucocitos humano (HLA). Por alogenica se entiende que las celulas o la poblacion de celulas usadas para tratar pacientes no se originan de dicho paciente sino de un donante.
La invencion es particularmente adecuada para inmunoterapia alogenica, en la medida en que permite la transformacion de linfocitos T, tfpicamente obtenidos de donantes, en celulas no alorreactivas. Esto puede realizarse con protocolos convencionales y reproducirse tantas veces como sea necesario. Los linfocitos T modificados resultantes pueden agruparse y administrarse a uno o varios pacientes, que se ponen a disposicion como un producto terapeutico "generico".
En la seccion previa se han descrito celulas que pueden usarse en los metodos desvelados. Dicho tratamiento puede ser para tratar pacientes a los que se ha diagnosticado cancer, infeccion vmca, trastornos autoinmunitarios o enfermedad de injerto contra huesped (GvHD). Los canceres que pueden tratarse incluyen tumores que no estan vascularizados o que aun no estan vascularizados sustancialmente, asf como tumores vascularizados. Los canceres pueden comprender tumores no solidos (tales como tumores hematologicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores solidos. Los tipos de canceres para tratar con los CAR multicatenarios de la invencion incluyen, pero sin limitacion, carcinoma, blastoma y sarcoma, y determinadas leucemias o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos y neoplasias, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. Tambien se incluyen tumores/canceres adultos y tumores/canceres pediatricos.
Puede ser un tratamiento en combinacion con una o mas terapias contra cancer seleccionadas del grupo de terapia de anticuerpos, quimioterapia, terapia de citocinas, terapia de celulas dendnticas, terapia genica, terapia hormonal, terapia lummica por laser y radioterapia.
Dicho tratamiento puede administrarse a pacientes que se someten a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la presente invencion se basa preferentemente en celulas o una poblacion de celulas, que se han hecho resistentes a al menos un agente inmunosupresor debido a la inactivacion de un gen que codifica un receptor para dicho agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debena ayudar a la seleccion y expansion de los linfocitos T segun la invencion en el paciente.
La administracion de las celulas o la poblacion de celulas segun la presente invencion puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalacion de aerosol, inyeccion, ingesta, transfusion, implantacion o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrate a un paciente por via subcutanea, por v^a intradermica, por via intratumoral, por via intranodal, por via intramedular, por via intramuscular, mediante inyeccion intravenosa o intralinfatica o por via intraperitoneal. En una realizacion, las composiciones celulares de la presente invencion se administran preferentemente mediante inyeccion intravenosa.
La administracion de las celulas o la poblacion de celulas puede consistir en la administracion de 104- 109 celulas por kg de peso corporal, preferentemente de 105 a 106 celulas/kg de peso corporal incluyendo todos los valores de numeros enteros de numeros de celulas dentro de esos intervalos. Las celulas o la poblacion de celulas pueden administrarse en una o mas dosis. Dicha cantidad eficaz de celulas puede administrarse como una unica dosis. Dicha cantidad eficaz de celulas puede administrarse como mas de una dosis a lo largo de un periodo de tiempo. El momento de administracion esta dentro del criterio del medico a cargo y depende de la condicion clmica del paciente. Las celulas o la poblacion de celulas pueden obtenerse de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Aunque las necesidades individuales vanan, la determinacion de intervalos optimos de cantidades eficaces de un tipo celular dado para una enfermedad o afecciones particulares dentro de la experiencia de la tecnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapeutico o profilactico. La dosificacion administrada dependera de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento simultaneo, si lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.
Dicha cantidad eficaz de celulas o composicion que comprende esas celulas puede administrarse por via parenteral. Dicha administracion puede ser una administracion intravenosa. Dicha administracion puede realizarse directamente mediante inyeccion en un tumor.
Las celulas pueden administrarse a un paciente junto con (por ejemplo, antes de, simultaneamente o despues de) cualquiera de una variedad de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitacion, tratamiento con agentes tales como terapia antivmca, cidofovir e interleucina-2, Tratamiento con citarabina (tambien conocida como ARA-C) o nataliziimab para pacientes con MS o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con PML. los linfocitos T de la invencion se pueden usar en combinacion con quimioterapia, radiacion, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citotoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, acido micofenolico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiacion. Estos farmacos inhiben la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la senalizacion inducida por factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 11; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). Las composiciones celulares para administracion a un paciente junto con (por ejemplo, antes de, simultaneamente o despues de) trasplante de medula osea, terapia ablativa de linfocitos T usando agentes de quimioterapia tales como, fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH, son realizaciones adicionales de la presente invencion. Las composiciones celulares para administracion despues de terapia ablativa de linfocitos B tal como terapia ablativa de linfocitos B con agentes que reaccionan con c D20, por ejemplo, Rituxan es otra realizacion de la presente invencion. Por ejemplo, los sujetos pueden someterse a tratamiento convencional con dosis alta de quimioterapia seguido de trasplante de celulas madre de sangre periferica. Otra realizacion es una infusion de las celulas inmunitarias expandidas de la presente invencion para su uso despues del trasplante. Otras realizaciones de la presente invencion son celulas expandidas para administracion antes o despues de cirugfa. Dichas celulas modificadas obtenidas por uno cualquiera de los metodos descritos aqrn pueden ser para su uso en un aspecto particular de la invencion para tratar pacientes que lo necesiten contra rechazo de hospedador contra injerto (HvG) y enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD); por lo tanto en el alcance de la presente invencion estan celulas modificadas obtenidas por uno cualquiera de los metodos descritos aqrn para su uso en un metodo de tratamiento de pacientes que lo necesiten contra rechazo de hospedador contra injerto (HvG) y enfermedad de injerto contra hospedador (GvHD) que comprende tratar a dicho paciente administrando a dicho paciente una cantidad eficaz de dichas celulas modificadas que comprenden genes de TCR alfa y/o TCR beta inactivados.
Ejemplo de metodo para genomodificar celulas alogenicas humanas para inmunoterapia
Para una mejor comprension de la invencion, se ilustra un ejemplo de metodo para genomodificar celulas alogenicas humanas para inmunoterapia en la Figura 5. El metodo que comprende una combinacion de una o varias de las siguientes etapas:
1. Proporcionar linfocitos T de un cultivo celular o de una muestra sangumea de un paciente individual o de banco de sangre y activar dichos linfocitos T usando perlas anti-CD3/C28. Las perlas proporcionan las senales tanto primarias como coestimulante que son necesarias para la activacion y expansion de linfocitos T.
2. a) Transducir dichas celulas con transgen de pTalfa o variante funcional del mismo para apoyar la expresion en superficie de CD3 y permitir la expansion celular mediante estimulacion del complejo de CD3. Se espera la alteracion de TCR para la eliminacion del complejo de TCR y elimina la alorreactividad (GvHD) pero puede alterar la expansion de celulas alogenicas debido a la perdida de componente de senalizacion de c D3. Se espera que celulas transducidas expresen cadena de pTalfa o variante funcional de la misma. Esta cadena de pTalfa se empareja con la cadena de TCRbeta y componentes de senalizacion de CD3 para formar el complejo de preTCR y, de este modo, restaurar un complejo de CD3 funcional y apoyar la activacion o estimulacion de celulas de TCRalfa inactivadas. Puede realizarse transduccion de linfocitos T con vector lentivmco de pTalfa antes o despues de inactivacion de TCRalfa.
b) Transducir dichas celulas con CAR multicatenarios permite redirigir linfocitos T contra antigenos expresados en la superficie de celulas diana de diversos tumores malignos incluyendo linfomas y tumores solidos. Para mejorar la funcion de dominio coestimulante, los inventores han disenado un CAR multicatenario procedente de FceRI como se ha descrito previamente. Puede realizarse transduccion antes o despues de la inactivacion de TCRalfa y los otros genes, tales como genes de CD52.
3. Genomodificar linfocitos T no alorreactivos y resistentes a inmunosupresion:
a) Es posible inactivar TCR alfa en dichas celulas para eliminar el TCR de la superficie de la celula y evitar el reconocimiento de tejido hospedador como ajeno mediante TCR de alogenico y por tanto evitar GvHD.
b) Tambien es posible inactivar un gen que codifica diana para agente inmunosupresor para hacer a dichas celulas resistentes al tratamiento inmunosupresor para evitar el rechazo de injertos sin afectar a linfocitos T trasplantados. En este ejemplo, la diana de agentes inmunosupresores es CD52 y el agente inmunosupresor es un anticuerpo anti-CD52 monoclonal humanizado.
Los inventores han mostrado que el uso de nucleasa TALE permitiendo mayores tasas de acontecimientos de DSB en linfocitos T fue particularmente ventajoso para conseguir la inactivacion doble anterior en linfocitos T. Preferentemente, los genes de TCRalfa y CD52 se inactivan electroporando linfocitos T con ARNm que codifica nucleasa TALE que se dirige a dichos genes. Los inventores han descubierto que el uso de ARNm dio como resultado alta tasa de transformacion que era menos perjudicial para los linfocitos T y, por lo tanto, fue cntico en el proceso de genomodificacion de linfocitos T. Despues, los linfocitos T inactivados se clasificaron usando perlas magneticas. Por ejemplo, se retiran linfocitos T que expresan CD52 mediante fijacion en una superficie solida y las celulas inactivadas no se exponen a la tension de pasar a traves de una columna. Este metodo suave aumenta la concentracion de linfocitos T genomodificadas de forma apropiada.
4. Expansion in vitro de linfocitos T genomodificados antes de la administracion a un paciente mediante estimulacion del complejo de CD3. Antes de la etapa de administracion, los pacientes pueden someterse a un tratamiento inmunosupresor tal como CAMPATH1-H, un anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD52.
5. Opcionalmente exponer dichas celulas a anticuerpos biespedficos ex vivo antes de la administracion a un paciente para aproximar las celulas genomodificadas a un antfgeno diana.
Otras definiciones
- A menos que se especifique de otro modo, "un", "uno", "una", "el", "la", y "al menos uno" se usan indistintamente y significan uno o mas de uno.- Los restos de aminoacidos en una secuencia polipeptfdica se designan en el presente documento segun el codigo de una letra, en el que, por ejemplo, O significa resto de Gln o glutamina, R significa resto de Arg o arginina y D significa resto de Asp o acido aspartico.
- Sustitucion de aminoacidos significa el reemplazo de un resto de aminoacido con otro, por ejemplo el reemplazo de un resto de arginina con un resto de glutamina en una secuencia peptfdica es una sustitucion de aminoacidos.
- Los nucleotidos se disenan de la siguiente manera: se usa el codigo de una letra para designar la base de un nucleosido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleotidos degradados, r representa g o a (nucleotidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleotidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.
- Como se usa en el presente documento, "acido nucleico" o "polinucleotidos" se refiere a nucleotidos y/o polinucleotidos, tales como acido desoxirribonucleico (ADN) o acido ribonucleico (ARN), oligonucleotidos, fragmentos generados por la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligamiento, escision, accion de endonucleasa y accion de exonucleasa. Las moleculas de acido nucleico pueden estar compuestas de monomeros que son nucleotidos de origen natural (tales como ARN y ARN) o analogos de nucleotidos de origen natural (por ejemplo, formas enantiomericas de nucleotidos de origen natural), o una combinacion de ambos. Los nucleotidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azucar y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de azucar incluyen, por ejemplo, reemplazo de uno o mas grupos hidroxilo con halogenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azucares pueden funcionalizarse como eteres o esteres. Por otra parte, el resto de azucar completo puede reemplazarse con estructuras esterica y electronicamente similares, tales como azucares aza y analogos carbodclicos de azucar. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterodclicos bien conocidos. Los monomeros de acido nucleico pueden unirse por enlaces fosfodiester o analogos de dichas uniones. Los acidos nucleicos puede ser monocatenarios o bicatenarios.
- por "polinucleotido que comprende sucesivamente una primera region de homologfa con secuencias cadena arriba de dicha rotura bicatenaria, una secuencia para insertar en el genoma de dicha celula y una segunda region de homologfa con secuencias cadena abajo de dicha rotura bicatenaria" se pretende indicar una construccion de ADN o una matriz que comprende una primera y segunda parte que son homologas de las regiones 5' y 3' de una diana de ADN in situ. La construccion de ADN tambien comprende una tercera parte situada entre la primera y segunda parte que comprende algo de homologfa con la secuencia de ADN correspondiente in situ o como alternativa no comprende homologfa con las regiones 5' y 3' de la diana de ADN in situ. Despues de la escision de la diana de ADN, se estimula un acontecimiento de recombinacion homologa entre el genoma que contiene el gen diana comprendido en el locus de interes y esta matriz, en donde la secuencia genomica que contiene la diana de ADN se reemplaza por la tercera parte de la matriz y una parte variable de las primera y segunda partes de dicha matriz.
- por "diana de ADN", "secuencia diana de ADN", "secuencia de ADN diana", "secuencia diana de acido nucleico", "secuencia diana" o "sitio de procesamiento" se entiende una secuencia polinucleotidica que puede ser diana y procesarse mediante una endonucleasas de corte poco habitual segun la presente invencion. Estas expresiones se refieren a una localizacion de ADN espedfica, preferentemente una localizacion genomica en una celula, pero tambien una parte de material genetico que puede existir de forma independiente del cuerpo principal de material genetico tal como plasmidos, episomas, virus, transposones o en organulos tales como mitocondrias como ejemplo no limitante. Como ejemplos no limitantes de dianas de nucleasa TALE, las secuencias genomicas diana consisten en general en dos secuencias de 17 pb de longitud (denominadas medias dianas) separadas por un espaciador de 15 pb. Cada media diana es reconocida por repeticiones de nucleasas TALE enumeradas en las tablas 1, 5, 6 y 10 como ejemplos no limitantes, codificadas en plasmidos, bajo el control de promotor de EF1-alfa o promotor de T7. La secuencia diana de acido nucleico esta definida por la secuencia 5' a 3' de una cadena de dicha diana, como se indica en las tablas 1, 5, 6 y 10.
- Por receptor quimerico de antfgenos (CAR) se entiende moleculas que combinan un dominio de union contra un componente presente en la celula diana, por ejemplo una especificidad basada en anticuerpos por un antfgeno deseado (por ejemplo, antfgeno tumoral) con un dominio intracelular activador de receptor de linfocitos T para generar una protema quimerica que muestra una actividad inmunitaria celular antidiana. En general, CAR consiste en un anticuerpo monocatenario extracelular (scFvFc) fusionado con el dominio de senalizacion intracelular de la cadena zeta del complejo de receptor de antfgeno de linfocitos T (scFvFc:Z) y tiene la capacidad, cuando se expresa en linfocitos T, de redirigir el reconocimiento de antfgenos basado en la especificidad del anticuerpo monoclonal. Un ejemplo de CAR usado en la presente invencion es un CAR dirigido contra antfgeno CD19 y puede comprender como ejemplo no limitante la secuencia de aminoacidos: SEQ ID NO: 73
- Por "vector de suministro" o "vectores de suministro" se entiende cualquier vector de suministro que puede usarse en la presente invencion para poner en contacto celular (es decir "entrar en contacto") o suministrar dentro de celulas o compartimentos subcelulares (es decir "introducir") agentes/productos qmmicos y moleculas (protemas o acidos nucleicos) necesarios en la presente invencion. Incluye, pero sin limitacion, vectores de suministro liposomicos, vectores de suministro vmcos, vectores de suministro farmacologicos, vehmulos qmmicos, vehmulos polimericos, lipoplejos, poliplejos, dendnmeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonidos), nanopartmulas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de suministro permiten el suministro de moleculas, productos qmmicos, macromoleculas (genes, protemas) u otros vectores tales como plasmidos, peptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de suministro son vehmulos moleculares. Por "vector de suministro" o "vectores de suministro" tambien se entienden metodos de suministro para realizar transfeccion.
- Los terminos "vector" o "vectores" se refieren a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un "vector" en la presente invencion incluye, pero sin limitacion, un vector vmco, un plasmido, un vector de ARN o una molecula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en un acido nucleico cromosomico, no cromosomico, semisintetico o sintetico. Son vectores preferidos aquellos capaces de replicacion autonoma (vector episomico) y/o expresion de acidos nucleicos a los que estan unidos (vectores de expresion). Los expertos en la materia conocen grandes cantidades de vectores adecuados y estos estan disponibles en el mercado.
Los vectores vmcos incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rhabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampion y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN bicatenario incluyendo adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple de tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela de los canarios). Otros virus incluyen virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus, y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, tipo C de mairnferos, virus de tipo B, virus de tipo D, grupo de HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, Tercera Edicion, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).
- Por "vector lentivmco" se entiende vectores lentivmcos basados en VIH que son muy prometedores para el suministro de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de forma estable con alta eficacia una gran variedad de tipos celulares diferentes. Habitualmente se generan vectores lentivmcos despues de la transfeccion transitoria de tres (empaquetamiento, envoltura y transferencia) o mas plasmidos en celulas productoras. Como el VIH, los vectores lentivmcos entran en la celula diana a traves de la interaccion de glucoprotemas de superficie vmca con receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN vmco experimenta transcripcion inversa, que esta mediado por el complejo de transcriptasa inversa vmca. El producto de transcripcion inversa es un ADN vmco lineal bicatenario, que es el sustrato para integracion vmca en el ADN de celulas infectadas. Por "vectores lentivmcos (o LV) integradores", se entiende dichos vectores como ejemplo no limitante, que son capaces de integrarse en el genoma de una celula diana. Por el contrario por "vectores lentivmcos no integradores (o NILV)" se entienden vectores de suministro genico que no se integran en el genoma de una celula diana mediante la accion de la integrasa vmca.
- Los vectores de suministro y vectores pueden asociarse y combinarse con cualquier tecnica de permeabilizacion celular tal como sonoporacion o electroporacion o derivados de estas tecnicas.
- Por celula o celulas se entiende cualquier celula viva eucariota, celulas primarias y lmeas celulares procedentes de estos organismos para cultivos in vitro.
- Por "celula primaria" o "celulas primarias" se entienden celulas tomadas directamente de tejido vivo (es decir material de biopsia) y estabilizadas para crecimiento in vitro, que han experimentado muy pocas duplicaciones de poblacion y son por lo tanto mas representativas de los principales componentes y caractensticas funcionales de tejidos de los que proceden, en comparacion con lmeas celulares tumorigenicas continuas o inmortalizadas artificialmente.
Como ejemplos no limitantes pueden seleccionarse lmeas celulares del grupo que consiste en celulas CHO-K1; celulas HEK293; celulas Caco2; celulas U2-OS; celulas NIH 3T3; celulas NSO; celulas SP2; celulas CHO-S; celulas DG44; celulas K-562, celulas U-937; celulas MRC5; celulas IMR90; celulas Jurkat; celulas HepG2; celulas HeLa; celulas HT-1080; celulas HCT-116; celulas Hu-h7; celulas Huvec; celulas Molt 4.
Todas estas lmeas celulares pueden modificarse mediante el metodo de la presente invencion para proporcionar modelos de lmeas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una protema de interes; estos modelos tambien pueden usarse para explorar moleculas de interes biologicamente activas en investigacion y produccion y diversos campos tales como química, biocombustibles, productos terapeuticos y agronomffa como ejemplos no limitantes.
- por "mutacion" se entiende la sustitucion, supresion, insercion de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o mas nucleotidos/aminoacidos en un polinucleotido (ADNc, gen) o una secuencia polipepffdica. La mutacion puede afectar a la secuencia codificante de un gen o su secuencia reguladora. Tambien puede afectar a la estructura de la secuencia genomica o la estructura/estabilidad del ARNm codificado.
- por "variante o variantes", se entiende una variante repetida, una variante, una variante de union a ADN, una variante de nucleasa TALE, una variante polipepffdica obtenida por mutacion o reemplazo de al menos un resto en la secuencia de aminoacidos de la molecula parental.
- por "variante funcional" se entiende un mutante cataffticamente activo de una protema o un dominio proteico; dicho mutante puede tener la misma actividad en comparacion con su protema parental o dominio proteico o propiedades adicionales, o actividad mayor o menor.
- Por "gen" se entiende la unidad basica de herencia, que consiste en un segmento de ADN dispuesto de una manera lineal a lo largo de un cromosoma, que codifica una protema o un segmento de protema espedfico. Un gen incluye habitualmente un promotor, una region 5' no traducida, una o mas secuencias codificantes (exones), opcionalmente intrones, una region 3' no traducida. El gen puede comprender ademas un terminador, potenciadores y/o silenciadores.
- Como se usa en el presente documento, el termino "locus" es la localizacion ffsica espedfica de una secuencia de ADN (por ejemplo de un gen) en un cromosoma. El termino "locus" puede hacer referencia a la localizacion ffsica espedfica de una secuencia diana de endonucleasa de corte poco habitual en un cromosoma. Dicho locus puede comprender una secuencia diana que es reconocida y/o escindida por una endonucleasa de corte poco habitual segun la invencion. Se entiende que el locus de interes de la presente invencion puede no solamente clasificar una secuencia de acido nucleico que existe en el cuerpo principal del material genetico (es decir, en un cromosoma) de una celula sino tambien una parte del material genetico que puede existir independientemente de dicho cuerpo principal de material genetico tal como plasmidos, episomas, virus, transposones o en organulos tales como mitocondrias como ejemplos no limitantes.
- El termino "endonucleasa" se refiere a cualquier enzima de tipo silvestre o variante capaz de catalizar la hidrolisis (escision) de enlaces entre acidos nucleicos en una molecula de ADN o ARN, preferentemente una molecula de ADN. Las endonucleasas no escinden la molecula de ADN o ARN independientemente de su secuencia, pero reconocen y escinden la molecula de ADN o ARN en secuencias polinucleotidicas espedficas, denominadas ademas "secuencias diana" o "sitios diana". Las endonucleasas pueden clasificarse como endonucleasas de corte poco habitual cuando tienen habitualmente un sitio de reconocimiento de polinucleotidos mayor de 12 pares de bases (pb) de longitud, mas preferentemente de 14-55 pb. Las endonucleasas de corte poco habitual aumentan significativamente HR induciendo roturas bicatenarias (DSB) de ADN en un locus definido (Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud y Silva 2007). Las endonucleasas de corte poco habitual pueden ser, por ejemplo, una endonucleasa de asentamiento (Paques y Duchateau 2007), una nucleasa quimerica de dedos de cinc (ZFN) que resultan de la fusion de dominios de dedos de cinc genomodificados con el dominio catalftico de una enzima de restriccion tal como Fokl (Porteus y Carroll 2005) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006). En endonucleasas qrnmicas, un agente de escision qmmico o peptfdico se conjuga con un poftmero de acidos nucleicos o con otro ADN que reconoce una secuencia diana espedfica, dirigiendo de este modo la actividad de escision a una secuencia espedfica. Las endonucleasas qrnmicas tambien abarcan nucleasas sinteticas como conjugados de ortofenantrolina, una molecula de escision de ADN y oligonucleotidos formadores de triples cadenas (t Fo ), que se sabe que se unen a secuencias de ADN espedficas (Kalish y Glazer 2005). Dichas endonucleasas qrnmicas estan comprendidas en el termino "endonucleasa" segun la presente invencion.
Las endonucleasas de corte poco habitual tambien pueden ser, por ejemplo, nucleasas TALE, una nueva clase de nucleasas quimericas que usan un dominio catalftico de FokI y un dominio de union a ADN procedente de efector de tipo activador de la transcripcion (TALE), una familia de protemas usadas en el proceso de infeccion por patogenos vegetales del genero Xanthomonas (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al.
2010; Li, Huang et al.). La distribucion funcional de una nucleasa TALE basada en Fokl (nucleasa TALE) es esencialmente la de un ZFN, reemplazando el dominio de union a ADN del dedo de cinc por el dominio TALE. Como tal, la escision de ADN por una nucleasa TALE requiere dos regiones de reconocimiento de ADN que flanquean una region central inespedfica. Las endonucleasas de corte poco habitual abarcadas en la presente invencion tambien pueden proceder de nucleasas TALE.
La endonucleasa de corte poco habitual puede ser una endonucleasa de asentamiento, tambien conocida con el nombre de meganucleasa. Dichas endonucleasas de asentamiento son bien conocidas en la materia (Stoddard 2005). Las endonucleasas de asentamiento reconocen una secuencia diana de ADN y generan una rotura mono o bicatenaria. Las endonucleasas de asentamiento son altamente espedficas, reconociendo sitios diana de ADN que vanan de 12 a 45 pares de bases (pb) de longitud, que vanan habitualmente de 14 a 40 pb de longitud. La endonucleasa de asentamiento segun la invencion puede corresponder por ejemplo a una endonucleasa LAGLIDADG ("LAGLIDADF" desvelada como SEQ ID NO: 127), a una endonucleasa h Nh o a una endonucleasa GIY-YIG. La endonucleasa de asentamiento preferida segun la presente invencion puede ser una variante I-Crel.
- Por una "nucleasa TALE" (TALEN) se entiende una protema de fusion que consiste en un dominio de union a acido nucleico habitualmente procedente de un efector de tipo activador de la transcripcion (TALE) y un dominio catalftico de nucleasa para escindir una secuencia diana de acido nucleico. El dominio catalftico es preferentemente un dominio de nucleasa y mas preferentemente un dominio que tiene actividad endonucleasa, como por ejemplo I-Tevl, ColE7, NucA y Fok-I. En una realizacion particular, el dominio TALE puede fusionarse con una meganucleasa como por ejemplo I-CreI e I-OnuI o variante funcional de los mismos. En una realizacion mas preferida, dicha nucleasa es una nucleasa TALE monomerica. Una nucleasa TALE monomerica es una nucleasa TALE que no requiere dimerizacion para reconocimiento espedfico y escision, tal como las fusiones de repeticiones de TAL genomodificadas con el dominio catalftico de I-TevI descrito en el documento WO2012138927. El efector de tipo activador de la transcripcion (TALE) son protemas de la especie bacteriana Xanthomonas que comprenden una pluralidad de secuencias repetidas, comprendiendo cada repeticion restos dobles en la posicion 12 y 13 (RVD) que son espedficos de cada base nucleotidica de la secuencia diana de acido nucleico. Los dominios de union con propiedades de union a acidos nucleicos base a base modulares similares (MBBBD) tambien pueden proceder de nuevas protemas modulares recientemente descubiertas por el solicitante en una especie bacteriana diferente. Las nuevas protemas modulares tienen la ventaja de presentar mas variabilidad de secuencia que repeticiones de TAL. Preferentemente, los RVD asociados con el reconocimiento de los diferentes nucleotidos son HD para reconocer C, NG para reconocer T, Nl para reconocer A, NN para reconocer G o A, NS para reconocer A, C, G o T, HG para reconocer T, IG para reconocer T, NK para reconocer G, HA para reconocer C, ND para reconocer C, HI para reconocer C, HN para reconocer G, NA para reconocer G, SN para reconocer G o A e YG para reconocer T, TL para reconocer A, VT para reconocer A o G y SW para reconocer A. En otra realizacion, los aminoacidos crfticos 12 y 13 pueden mutarse hacia otros restos de aminoacidos para modular su especificidad hacia nucleotidos A, T, C y G y en particular para potenciar su especificidad. La nucleasa TALE ya se ha descrito y usado para estimular la direccion genica y modificaciones genicas (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al.). Estan disponibles en el mercado TAL-nucleasas genomodificadas con el nombre comercial TALEN™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, Francia).
- El termino "escision" se refiere a la rotura de la cadena principal covalente de un polinucleotido. La escision puede iniciarse mediante diversos metodos, incluyendo, pero sin limitacion, hidrolisis enzimatica o química de un enlace fosfodiester. Son posibles tanto escision monocatenaria como bicatenaria, y puede producirse escision bicatenaria como resultado de dos acontecimientos de escision monocatenarios distintos. La escision de ADN, ARN o Idbrido de ADN/ARN bicatenario puede dar como resultado la produccion de extremos romos o extremos escalonados.
- Por "protema de fusion" se entiende el resultado de un proceso bien conocido en la tecnica que consiste en la union de dos o mas genes que codifican originalmente protemas separadas o parte de ellas, dando como resultado la traduccion de dicho "gen de fusion" un unico polipeptido con propiedades funcionales procedentes de cada una de las protemas originales.
- La "identidad" se refiere a la identidad de secuencia entre dos moleculas de acido nucleico o polipeptidos. La identidad puede determinarse comparando una posicion en cada secuencia que puede alinearse para fines de comparacion. Cuando una posicion en la secuencia comparada esta ocupada por la misma base, entonces las moleculas son identicas en esa posicion. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de acido nucleico o aminoacidos es una funcion del numero de nucleotidos identicos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de acido nucleico. Pueden usarse diversos algoritmos y/o programas de alineamiento para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA, o BLAST que estan disponibles como parte del paquete de analisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden usarse con, por ejemplo, ajustes por defecto. Por ejemplo, se contemplan polipeptidos que tienen al menos 70 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con polipeptidos espedficos descritos en el presente documento y que muestran preferentemente sustancialmente las mismas funciones, asf como polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos.
- "similitud" describe la relacion entre las secuencias de aminoacidos de dos o mas polipeptidos. BLASTP tambien puede usarse para identificar una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoacidos de referencia usando una matriz de similitud tal como BLOSUM45, BLOSUM62 o BLOSUM80. A menos que se indique otra cosa una puntuacion de similitud se basara en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuacion de positivos de BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuacion de identidades de BLASTP. Las "identidades" de Bl a St P muestran el numero y fraccion de restos totales en los pares de secuencias de alta puntuacion que son identicos; y los "positivos" de BLASTP muestran el numero y fraccion de restos para los que las puntuaciones de alineamiento tienen valores positivos y que son similares entre sf. La presente divulgacion contempla y abarca secuencias de aminoacidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad de similitud con las secuencias de aminoacidos desveladas en el presente documento. Las secuencias polinucleotidicas de polipeptidos similares se deducen usando el codigo genetico y pueden obtenerse por medios convencionales. Por ejemplo, una variante funcional de pTalfa puede tener 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87,5 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 % de similitud de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 107. Un polinucleotido que codifica dicha variante funcional se producina por traduccion inversa de su secuencia de aminoacidos usando el codigo genetico.
- "Dominio de transduccion de senales" o "ligando coestimulante" se refiere a una molecula en una celula presentadora de antfgenos que se une espedficamente con una molecula coestimulante afm en un linfocito T, proporcionando de este modo una senal que, ademas de la senal primaria proporcionada mediante, por ejemplo, la union de un complejo de TCR/CD3 con una molecula del MHC cargada con peptido, media en una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitacion, activacion de proliferacion, diferenciacion y similares. Un ligando coestimulante puede incluir pero sin limitacion CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulante inducible (ICOS-L), molecula de adhesion intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une con el receptor de ligando Toll y un ligando que se une espedficamente con B7-H3. Un ligando coestimulante tambien abarca, entre otros, un anticuerpo que se une espedficamente con una molecula coestimulante presente en un linfocito T, tal como, pero sin limitacion, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antfgeno 1 asociado a la funcion de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une espedficamente con CD83.
Una "molecula coestimulante" se refiere al companero de union afm en un linfocito T que se une espedficamente con un ligando coestimulante, mediando de este modo en una respuesta coestimulante por la celula, tal como, pero sin limitacion, proliferacion. Las moleculas coestimulantes incluyen, pero sin limitacion, una molecula del MHC de clase I, BTLA y receptor de ligando Toll.
Una "senal coestimulante" como se usa en el presente documento se refiere a una senal, que en combinacion con senal primaria, tal como ligamiento de TCR/CD3, conduce a proliferacion de linfocitos T y/o regulacion positiva o regulacion negativa de moleculas clave.
- "Anticuerpo biespedfico" se refiere a un anticuerpo que tiene sitios de union para dos antfgenos diferentes en una unica molecula de anticuerpo. Los expertos en la materia apreciaran que pueden construirse otras moleculas ademas de la estructura de anticuerpo canonica con dos especificidades de union. Se apreciara ademas que la union a antfgeno mediante anticuerpos biespedficos puede ser simultanea o secuencial. Pueden producirse anticuerpos biespedficos mediante tecnicas qdmicas (vease por ejemplo, Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807), mediante tecnicas de "polidoma" (vease Patente de los Estados Unidos N.° 4.474.893) o mediante tecnicas de ADN recombinante, que son todas conocidas por sf solas. Como un ejemplo no limitante, cada dominio de union comprende al menos una region variable de una cadena pesada de anticuerpo ("region VH o H"), en donde la region VH del primer dominio de union se une espedficamente con el marcador de linfocitos tal como CD3 y la region VH del segundo dominio de union se une espedficamente con antfgeno tumoral.
- La expresion "dominio de union a ligando extracelular" como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipeptido que es capaz de unirse con un ligando. Preferentemente, el dominio sera capaz de interaccionar con una molecula de superficie celular. Por ejemplo, el dominio de union a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actua como un marcador de superficie celular en celulas diana con una patologfa particular. Por lo tanto los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con infecciones vmcas, bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y celulas cancerosas.
El termino "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, incluye todos los miembros del reino animal incluyendo primates no humanos y seres humanos.
La descripcion de la invencion anteriormente escrita proporciona una manera y proceso para prepararla y usarla de modo que cualquier experto en esta materia este capacitado para prepararla y usarla, proporcionandose esta capacitacion en particular para la materia objeto de las reivindicaciones adjuntas, que componen una parte de la descripcion original.
Cuando se indique un lfmite o intervalo numerico en el presente documento, se incluyen los puntos finales. Ademas, todos los valores y subintervalos en un lfmite o intervalo numerico se incluyen espedficamente como si se escribieran de forma explfcita.
Habiendo descrito de forma general la presente invencion, puede obtenerse un entendimiento adicional por referencia a determinados ejemplos espedficos, que se proporcionan en el presente documento para fines de ilustracion y no se pretende que sean limitantes a no ser que se especifique otra cosa.
Ejemplos
Ejemplo 1: Nucleasas TALE que escinden el gen de GR humano
Se disenaron y produjeron 6 exones que se dirigen a nucleasas TALE heterodimericos del gen de GR humano. La Tabla 1 posterior indica las secuencias diana escindidas por cada nucleasa TALE. La nucleasa TALE de GR estaba compuesta de dos entidades independientes (denominadas medias nucleasas TALE) conteniendo cada una una secuencia repetida genomodificada para unirse con y escindir secuencias diana de GR que consisten en dos secuencias de 17 pb de longitud (denominadas medias dianas) separadas por un espaciador de 15 pb.
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Tabla 1: Descripcion de las nucleasas TALE de GR y secuencias de los sitios diana de nucleasas TALE en el gen de GR humano.
Las secuencias de aminoacidos de los dominios N terminales, C terminales y repeticion se basan en el AvrBs3 TALE (ref: GenBank: X16130.1). Los dominios C terminales y N terminales estan separados por dos sitios de restriccion de BsmBI. Las matrices de repeticion (SEQ ID NO: 7 a 18), que se dirigen a las secuencias deseadas (SEQ ID NO: 1 a 6) se sintetizaron usando un metodo de soporte solido compuesto de etapas de restriccion/ligamiento/lavado consecutivas (Solicitud de PCT internacional W02013/017950). En resumen, el primer bloque (que codifica una dirrepeticion) se inmovilizo en un soporte solido mediante interaccion de biotina/estreptavidina, el segundo bloque (trirrepeticion) se ligo despues con el primero y despues de digestion con SfaNI se acoplo un tercer bloque (trirrepeticion). El proceso se repitio usando bloques de tri o dirrepeticion tras obtener la matriz de repeticiones deseada. El producto se clono despues en un plasmido de clonacion pAPG10 clasico para amplificacion en E. coli y se secuencio. Las secuencias de matrices repetidas obtenidas de este modo se subclonaron en un vector de TALE de expresion en levadura usando enzimas de restriccion de tipo IIS BsmBI para el plasmido receptor y Bbvl y SfaNI para la secuencia repetida insertada. El ADN que codificaba la media nucleasa TALE, que contema un dominio de union a ADN procedente de TALE fusionado con el dominio catalftico de la enzima de restriccion FokI, se amplifico en E. coli, se recupero por tecnicas de miniprep convencionales y se secuencio para evaluar la integridad del inserto.
Actividad de nucleasas TALE de GR en levadura:
Se ensayo la actividad nucleasa de las seis nucleasas TALE de GR a 37 °C y 30 °C en el ensayo de SSA de levadura de los inventores descrito previamente (Solicitudes de PCT internacionales W o 2004/067736 y en (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) en dianas que contienen las dos secuencias diana de TALE una enfrente de la otra en la cadena de ADN separadas por un espaciador de 15 pb que dan como resultado SEQ ID NO: 1 a 6. Todos los plasmidos indicadores de diana de levadura que contienen las secuencias diana de ADN de nucleasa TALE se construyeron como se ha descrito previamente (Solicitudes de PCT internacionales WO 2004/067736 y en (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006). Los niveles de actividad de escision de nucleasa TALE, en levadura, de clones individuales en las dianas se muestran en la tabla 2.
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Tabla 2: Actividad de escision de las nucleasas TALE de GR en levadura. Los valores estan comprendidos entre 0 y 1. El valor maximo es 1.
Actividad de nucleasas TALE de GR en celulas HEK293:
Cada construccion de nucleasa TALE se subclono usando digestion con enzimas de restriccion en un vector de expresion de mairnferos bajo el control de un promotor largo de pEF1alfa.
Se sembro un millon de celulas HEK293 un d^a antes de la transfeccion. Las celulas se cotransfectaron con 2,5 |jg de cada uno de dos plasmidos que codifican la mitad izquierda y derecha de nucleasa TALE de GRex2, GRex3T2, GRex3T4, GRex5Tl, GRex5T2 o GRex5T3 que reconoce las dos medias secuencias genomicas diana de interes en el gen de GR bajo el control del promotor de EFIalfa usando 25 j l de lipofectamine (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. Como control, las celulas se cotransfectaron con 2,5 jg de cada uno de los dos plasmidos que codifican la mitad izquierda y la derecha de nucleasas TALE que se dirigen al sitio diana de la region de cadena constante alfa del receptor de linfocitos T (TRAC_T01) ((nucleasa TALE de TRAC_T01-L y -R (SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42, sitio diana de TRAC_T01 (SEQ ID NO: 37)) bajo el control del promotor de EFIalfa. La rotura bicatenaria generada por nucleasas TALE en secuencia codificante de GR induce union de extremos no homologos (NHEJ), que es un mecanismo propenso a errores. La actividad de nucleasas TALE se mide por la frecuencia de inserciones o supresiones en el locus genomico diana.
2 o 7 dfas despues de la transfeccion se recogieron celulas y se realizaron PCR espedficas de locus en ADN genomico extrafdo usando los siguientes cebadores compuestos: 5'- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3' (secuencia adaptadora directa, SEQ ID NO: 126)- 10N (TAG)- secuencia directa espedfica de locus para exon 2 de GR: 5'-GGTTCATTTAACAAGCTGCC-3' (SEQ ID NO: 127; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 31), para exon 3 de GR: 5'- GCATTCTGACTATGAAGTGA-3' (SEQ ID NO: 128; cebador compuesto desvelado como Se Q ID NO: 32) y para exon 5 de GR: 5'-TCAGCAGGCCACTACAGGAGTCTCACAAG-3' (SEQ ID NO: 129; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO:33) y el cebador compuesto inverso 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3' (secuencia adaptadora inversa, SEQ ID NO: 130))- secuencia inversa espedfica de locus para exon 2 de GR: 5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3' (SEQ ID NO: 131; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 34), para exon 3 de GR: 5'- GGGCTTTGCATATAATGGAA-3' (SEQ ID NO: 132; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 35) y para exon 5 de GR: 5'-CTGACTCTCCCCTTCATAGTCCCCAGAAC-3' (SEQ ID NO: 133; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 36).
Se secuenciaron productos de PCR por un sistema de secuenciacion 454 (454 Life Sciences). Se obtuvieron aproximadamente 10.000 secuencias por cada producto de PCR y despues se analizaron con respecto a la presencia de acontecimientos de insercion o supresion espedficos de sitio. La Tabla 3 indica el porcentaje de las secuencias que muestran inserciones o supresiones en el sitio diana de nucleasa TALE entre el numero total de secuencias en la muestra. En la tabla 3 se enumeran para GRex2, GRex3T2 y GRex3T4 los resultados de un experimento representativo.
En todos los casos ensayados, el % de mutagenesis fue similar el dfa 7 en comparacion con el de la muestra el dfa 2 despues de la transfeccion. Tambien se analizo la naturaleza de los acontecimientos mutagenicos, que revelan una ma oria de su resiones en todos los casos en com aracion con inserciones
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Tabla 3: Porcentaje de mutagenesis dirigida en sitios diana de nucleasa TALE endogenos en celulas HEK293.
Actividad de nucleasas TALE de GR en linfocitos T primarios:
Cada construccion de nucleasa TALE se subclono usando digestion con enzimas de restriccion en un vector de expresion bajo el control de un promotor T7.
Se sintetizaron ARNm que codificaban nucleasas TALE que escinden secuencias genomicas de GR a partir de cada plasmido que portaba las secuencias codificantes cadena abajo del promotor T7. Se activaron linfocitos T aislados de sangre periferica durante 5 dfas usando perlas activadoras anti-CD3/CD28 (Life technologies) y se transfectaron 5 millones de celulas mediante electroporacion con 10 jg de cada uno de 2 ARNm que codifican ambas medias nucleasas TALE usando un instrumento CytoLVT-P (aparato BTX- Harvard). Se usan como control linfocitos T con 10 jg de cada uno de los 2 ARNm que codifican ambas medias nucleasas TALE que se dirigen al gen de CD52 (CD52_T02-L y -R TALEN (SEQ ID NO: 55 y 56), secuencia diana CD52_T02 SEQ ID NO: 40).
3 y 7 dfas despues de la transfeccion, Se aislo ADN genomico de celulas transfectadas y se realizaron PCR espedficas de locus usando los cebadores descritos previamente. Se secuenciaron productos de PCR por un sistema de secuenciacion 454 (454 Life Sciences). Se obtuvieron aproximadamente 10.000 secuencias por cada producto de PCR y despues se analizaron con respecto a la presencia de acontecimientos de insercion o supresion espedficos de sitio; los resultados estan en la Tabla 4.
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Tabla 4: Porcentaje de mutagenesis dirigida en sitios diana de nucleasa TALE endogenos en linfocitos T primarios.
Ejemplo 2: Nucleasas TALE que escinden el gen de CD52 humano, la cadena constante alfa del receptor de linfocitos T humano (TRAC) y las cadenas constantes beta 1 y 2 del receptor de linfocitos T humano (TRBC)
Como se ha descrito en el ejemplo 1, se disenaron y produjeron nucleasas TALE heterodimericas que se dirigfan a genes de CD52, TRAC y TRBC. Las secuencias genomicas diana consisten en dos secuencias de 17 pb de longitud (denominadas medias dianas) separadas por un espaciador de 11 o 15 pb. Cada media diana es reconocida por repeticiones de medias nucleasas TALE enumeradas en la tabla 5. El genoma humano contiene dos cadenas beta receptoras de linfocitos T funcionales (TRBC1 y TRBC2). Durante el desarrollo de linfocitos T alfa/beta, una de estas dos cadenas constantes se selecciona en cada celula para cortar y empalmar en la region variable de TCR-beta y forma una cadena beta de longitud completa funcional. Las 2 dianas de TRBC se eligieron en secuencias conservadas entre TRBC1 y TRBC2 de modo que la nucleasa TALE correspondiente escindina tanto TRBC1 como TRBC2 al mismo tiempo.
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Tabla 5: Descripcion de las nucleasas TALE de CD52, TRAC y TRBC y secuencias de los sitios diana de nucleasas TALE en los genes correspondientes humanos.
Se han disenado otras secuencias diana en genes de TRAC y CD52, que se presentan en la Tabla 6.
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Tabla 6: Secuencias diana adicionales para nucleasas TALE de TRAC y CD52.
Actividad de nucleasa TALE de CD52, nucleasa TALE de TRAC y nucleasa TALE de TRBC en celulas HEK293
Cada construccion de nucleasa TALE se subclono usando digestion con enzimas de restriccion en un vector de expresion de mairnferos bajo el control de un promotor largo de pEFIalfa. Se sembro un millon de celulas HEK293 un dfa antes de la transfeccion. Las celulas se cotransfectaron con 2,5 pg de cada uno de los dos plasmidos que codifican las nucleasas TALE que reconocen las dos medias dianas en la secuencia genomica de interes en el gen de CD52, La region de cadena constante alfa del receptor de linfocitos T (TRAC) o region de cadena constante beta del receptor de linfocitos T (TRBC) bajo el control del promotor de EF1-alfa o 5 pg de un vector pUC de control (pCLS0003) usando 25 pl de lipofectamine (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. La escision bicatenaria generada por nucleasas TALE en secuencias codificantes de CD52 o TRAC se repara en celulas vivas mediante union de extremos no homologos (NHEJ), que es un mecanismo propenso a errores. La actividad de nucleasas TALE en celulas vivas se mide por la frecuencia de inserciones o supresiones en el locus genomico diana. 48 horas despues de la transfeccion, se aislo ADN genomico de celulas transfectadas y se realizaron PCR espedficas de locus usando los siguientes cebadores compuestos: 5'- CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (secuencia adaptadora directa, SEQ ID NO: 126)- 10N (TAG)- secuencia directa espedfica de locus para CD52: 5-CAGATCTGCAGAAAGGAAGC-3' (SEQ ID NO: 134; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 66), para TRAC: 5'- ATCACTGGCATCTGGACTCCA-3' (SEQ ID NO: 135; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 67), para TRBC1: 5'-AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3' (SEQ ID NO: 136; cebador compuesto desvelado como Se Q ID NO: 68), o para TRBC2: 5'- GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3' (SEQ ID NO: 137; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 69) y el cebador compuesto inverso 5'- CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (secuencia adaptadora inversa, Se Q ID NO: 130)-secuencia inversa espedfica de locus endogeno para CD52: 5'-CCTGTTGGAGTc Ca TCTGCTG-3' (SEQ ID NO: 138; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 70), para TRAC: 5'-CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3' (SEQ ID NO: 139; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 71), para TRBC1 y TRBC2: 5'-ACCAGCTc Ag CTCCACGTGGT-3' (SEQ ID n O: 140; cebador compuesto desvelado como Se Q ID NO: 72). Se secuenciaron productos de PCR por un sistema de secuenciacion 454 (454 Life Sciences). Se obtuvieron aproximadamente 10.000 secuencias por cada producto de PCR y despues se analizaron con respecto a la presencia de acontecimientos de insercion o supresion espedficos de sitio; los resultados estan en la Tabla 7.
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Tabla 7: Porcentajes de indel para nucleasa TALE que se dirige a dianas de CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 y TRBC_T02.
Actividad de nucleasa TALE de CD52, nucleasa TALE de TRBC y nucleasa TALE de TRAC en linfocitos T primarios
Cada construccion de nucleasa TALE se subclono usando digestion con enzimas de restriccion en un vector de expresion de mairnferos bajo el control del promotor T7.
Se sintetizaron ARNm que codificaban nucleasa TALE que escindfa secuencia genomica de CD52 TRAC y TRBC a partir del plasmido que portaba las secuencias codificantes cadena abajo del promotor T7. Se activaron linfocitos T aislados de sangre periferica durante 5 dfas usando perlas activadoras anti-CD3/CD28 (Life technologies) y se transfectaron despues 5 millones de celulas mediante electroporacion con 10 pg de cada uno de 2 ARNm que codifican ambas medias nucleasas TALE (o ARN no codificante como controles) usando un instrumento CytoLVT-P. Como consecuencia de las inserciones y supresiones inducidas por NHEJ, la secuencia codificante para CD52 y/o TRAC estara fuera de fase en una fraccion de las celulas dando como resultado genes no funcionales. 5 dfas despues de la electroporacion, las celulas se marcaron con anticuerpo anti-CD52 o anti-TCR conjugado con fluorocromo mediante citometna de flujo para determinar la presencia de CD52 o TCR en su superficie celular. Ya que todos los linfocitos T expandidos a partir de sangre periferica expresan normalmente CD52 y t Cr , la proporcion de celulas CD52 negativas o TCR negativas es una medida directa de la actividad nucleasa TALE. En la tabla 8 se enumeran los resultados de un experimento representativo. La tabla 9 muestra los resultados de un experimento representativo que ensaya la eficacia de nucleasas TALE de TRBC.
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Tabla 8: Porcentajes de linfocitos T CD52 negativos, TCR negativos y CD52/TCR dobles negativos despues de transfeccion de polinucleotidos que expresan nucleasa TALE correspondientes.
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Tabla 9: Porcentajes de linfocitos T TCR negativos despues de transfeccion de polinucleotidos que expresan nucleasa TALE de TRBC.
Analisis funcional de linfocitos T con gen de CD52 diana
El objetivo de la inactivacion del gen de CD52 es hacer a los linfocitos T resistentes a inmunosupresion mediada por anticuerpos anti-CD52. Como se ha descrito en el parrafo anterior, los linfocitos T se transfectaron con ARNm que codifica nucleasa TALE que escinde CD52. 7 dfas despues de la transfeccion, las celulas se trataron con anticuerpo monoclonal anti-CD52 50 pg/ml (o IgG de rata como control) con o sin complemento de conejo al 30 % (Cedarlane). Despues de 2 horas de incubacion a 37 °C, las celulas se marcaron con un anticuerpo anti-CD52 conjugado con fluorocromo junto con un colorante de viabilidad fluorescente (eBioscience) y se analizaron mediante citometna de flujo para medir la frecuencia de celulas CD52 positivas y CD52 negativas entre celulas vivas. La Figura 6 muestra el resultado de un experimento representativo, que demuestra que las celulas CD52 negativas son completamente resistentes a toxicidad de anticuerpo anti-CD52 mediada por complemento.
Analisis funcional de linfocitos T con gen de TRAC diana
El objetivo de la inactivacion del gen de TRAC es hacer a los linfocitos T insensibles a estimulacion de receptores de linfocitos T. Como se ha descrito en el parrafo anterior, los linfocitos T se transfectaron con ARNm que codifica nucleasa TALE que escinde TRAC o CD52. 16 dfas despues de la transfeccion, las celulas se trataron con hasta 5 |jg/ml de fitohemaglutinina (PHA, Sigma-Aldrich), un mitogeno de linfocitos T que actua mediante el receptor de linfocitos T. Las celulas con un receptor de linfocitos T funcional debenan aumentar en tamano despues de tratamiento de PHA. Despues de tres dfas de incubacion, las celulas se marcaron con un anticuerpo anti-CD52 o anti-TCR conjugado con fluorocromo y se analizaron por citometna de flujo para comparar la distribucion de tamanos celulares entre celulas TCR positivas y TCR negativas, o entre celulas CD52 positivas y CD52 negativas. La Figura 7 muestra que las celulas TCR positivas aumentan significativamente en tamano despues del tratamiento con PHA mientras que las celulas TCR negativas tienen el mismo tamano que celulas no tratadas que indican que la inactivacion de TRAc las hizo insensibles a senalizacion de TCR. Por el contrario, las CD52 positivas y CD52 negativas aumentan en tamano en la misma medida.
Analisis funcional de linfocitos T con genes de CD52 y TRAC diana
Para verificar que la ingeniena genomica no afecto a la capacidad de los linfocitos T para presentar actividad antitumoral cuando se les proporciono un receptor quimerico de antfgenos (CAR), los inventores transfectaron linfocitos T que se habfan dirigido con nucleasa TALE de CD52 y nucleasa TALE de TRAC con 10 jg de ARN que codifica un CAR anti-CD19 (SEQ ID NO: 73). 24 horas despues, se incubaron linfocitos T durante 4 horas con celulas Daudi que expresaban CD19. La regulacion positiva de superficie celular de CD107a, se midio un marcador de liberacion de granulos citotoxicos por linfocitos T (denominado desgranulacion) mediante analisis de citometna de flujo (Betts, Brenchley et al. 2003). Los resultados se incluyen en la Figura 8 y muestran que las celula CD52 negativa/TCRap negativas y CD52 positivas/TCRap positivas tienen la misma capacidad de desgranular en respuesta a PMA/ionomicina (control positivo) o celulas Daudi CD19+. La regulacion positiva de CD107 depende de la presencia de un CD19+. Estos datos sugieren que la ingeniena genomica no tiene influencia negativa en la capacidad de linfocitos T para montar una respuesta antitumoral controlada.
Seguridad genomica de nucleasa TALE de CD52 y nucleasa TALE de TRAC en linfocitos T primarios
Como las construcciones de los inventores incluyen subunidades de nucleasa, una pregunta importante es si la transfeccion de nucleasa TALE multiple puede conducir a genotoxicidad y escision fuera de diana en secuencias diana de 'coincidencia cercana' o mediante desapareamiento de medias nucleasas TALE. Para estimar la influencia de nucleasa TALE de TRAC y nucleasa TALE de CD52 en la integridad de los genomas celulares, los inventores enumeraron secuencias en el genoma humano que presentaban potencial para escision fuera de sitio. Para generar esta lista, los inventores identificaron todas las secuencias en el genoma con hasta 4 sustituciones en comparacion con las medias dianas originales y despues identificaron los pares de medias dianas potenciales en una orientacion de cabeza a cabeza con un espaciador de 9 a 30 pb entre sf. Este analisis incluyo sitios que son dianas potenciales de homodfmeros de una molecula de media nucleasa TALE o heterodfmeros formados por una media nucleasa TALE de CD52 y una media nucleasa TALE de TRAC. Los inventores puntuaron las dianas fuera de sitio potenciales basandose en los datos de especificidad teniendo en cuenta el coste de sustituciones individuales y la posicion de las sustituciones (donde los desapareamientos se toleran mejor para bases en el extremo 3' de la media diana). Los inventores obtuvieron 173 secuencias unicas con una puntuacion que refleja una estimacion de la probabilidad de escision. Los inventores seleccionaron las 15 mejores puntuaciones y analizaron por secuenciacion profunda la frecuencia de mutaciones halladas en estos loci en linfocitos T transfectados simultaneamente con nucleasa TALE de CD52 y TRAC y purificados mediante separacion magnetica como CD52 negativos, TCRap negativos. Los resultados estan en la Figura 9. La mayor frecuencia de insercion/supresion es 7x10-4. Estos resultados hacen al menos 600 veces menos probable que se mute la diana fuera de sitio potencial que las dianas pretendidas. Los reactivos de nucleasa TALE usados en este estudio parecen por lo tanto extremadamente espedficos.
Ejemplo 3: Nucleasas TALE que escinden el gen de CTLA4 humano y el gen de PDCD1 humano.
Como se ha descrito en el ejemplo 1, se disenaron y produjeron nucleasas TALE heterodimericas que se dirigfan respectivamente a genes de PDCD1 y CTLA4. Las secuencias genomicas diana consisten en dos secuencias de 17 pb de longitud (denominadas medias dianas) separadas por un espaciador de 11 o 15 pb. Cada media diana es reconocida por repeticiones de medias nucleasas TALE enumeradas en la tabla 10.
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Tabla 10: Descripcion de las nucleasas TALE de CTLA4 y PDCD1 y secuencias de los sitios diana de nucleasas TALE en los genes correspondientes humanos.
Actividad de nucleasa TALE de CTLA4 y nucleasa TALE de PDCD1 en celulas HEK293
Cada construccion de TALE-nucleasa se subclono usando digestion con enzimas de restriccion en un vector de expresion de mairnferos bajo el control del promotor largo de pEFIalfa. Se sembro un millon de celulas HEK293 un dfa antes de la transfeccion. Las celulas se cotransfectaron con 2,5 |jg de cada uno de dos plasmidos que codifican las nucleasas TALE que reconocen las dos medias dianas en la secuencia genomica de interes en el gen de PDCD1 y CTLA-4 bajo el control del promotor de EF1-alfa o 5 jg de un vector pUC de control (pCLS0003) usando 25 j l de lipofectamine (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. La escision bicatenaria generada por nucleasas TALE en secuencias codificantes de PDCD1 o CTLA-4 se repara en celulas vivas mediante union de extremos no homologos (NHEJ), que es un mecanismo propenso a errores. La actividad de nucleasas TALE en celulas vivas se mide por la frecuencia de inserciones o supresiones en el locus genomico diana. 48 horas despues de la transfeccion, se aislo ADN genomico de celulas transfectadas y se realizaron PCR espedficas de locus usando los siguientes cebadores compuestos: 5'- CCATCTCATCCCTGCg Tg TCTCCGACTCAG (secuencia adaptadora directa, SEQ ID NO: 126)- 10N (Ta G)- secuencia directa espedfica de locus para CTLA4_T01: 5'-CTCTACTTCCTGAAGACCTG-3' (SEQ ID NO: 141; cebador compuesto desvelado como SEQ iD NO: 99), para CTLA4_T03/T04: 5'- ACAGTTGAGAGATGGAGGGG-3' (SEQ ID No : 142; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 100), para PDCD1_T01: 5'-CCACAGAGGTAGGTGCCGC-3' (Se Q ID NO: 143; cebador compuesto desvelado como Se Q ID NO: 101) o para PDCD1_T03: 5'- GACAGAGATGCCGGTCACCA-3' (SEQ ID NO: 144; cebador compuesto desvelado como SeQ ID NO: 102) y el cebador compuesto inverso 5'- CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (secuencia adaptadora inversa, SEQ ID NO: 130)-secuencia inversa espedfica de locus endogeno para CTLA4_t 01: 5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3' (SEQ ID NO: 145; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 103), para CTLA4_T03/T04: 5'- GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3' (SEQ ID n O: 146; cebador compuesto desvelado como Se Q ID NO: 104), para PDCD1_T01: 5'- GGCTCTGCAGTGGAGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 147; cebador compuesto desvelado como SEQ ID NO: 105) o para PDCD1_T03: 5'- GGACAACGCCACCTTCACCT-3' (SEQ ID NO: 148; cebador compuesto desvelado como s Eq ID NO: 106).
Los productos de PCR se analizaron mediante ensayo de endonucleasa T7: en resumen, despues de desnaturalizacion y rehibridacion del producto de PCR, la endonucleasa T7 digerira espedficamente ADN desapareado compuesto de cadenas de tipo silvestre y mutadas. El producto de digestion se resuelve despues mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La presencia de un producto digerido es indicativa de secuencias mutadas inducidas por actividad de nucleasa TALE. Los resultados se presentan en la Figura 10 donde las flechas apuntan a los productos de PCR digeridos. Demuestran que todas las nucleasas TALE de PDCD1_T1, PDCD1_T3, CTLA4_T1, c TlA4_T3 y CTLA4_T4 muestran actividad nucleasa mutagenica en sus sitios diana.
Ejemplo 4: pTalfa permite la expresion en superficie de CD3 en linfocitos T de TCR alfa inactivado:
Descripcion de las diferentes versiones de preTalfa:
El gen de pTalfa humano codifica una glucoprotema transmembrana que comprende un dominio de tipo Ig extracelular, un dominio transmembrana hidrofobo y una cola intracitoplasmatica C terminal grande. Se han disenado diferentes versiones procedentes de glucoprotema pTalfa humana y se describen en la Tabla 11 y se representan en la figura 11.
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Tabla 11: Descripcion de un subconjunto de construcciones de pTalfa
Las diferentes construcciones de preTalfa ensayadas incluyen:
1) Mutantes de supresion de pTalfa: Se generaron diferentes supresiones en la cola citoplasmatica intracelular de la protema pTalfa humana (que comprende 114 aminoacidos) (SEQ ID NO: 107). Las construcciones ensayadas incluyen la version de longitud completa de la protema (FL) y mutantes en los que se suprimieron 18, 48, 62, 78, 92, 110 y 114 aminoacidos del extremo C de la protema (SEQ ID NO: 108 a SEQ ID NO: 114).
2) Mutantes de pTalfa que contienen dominios de activacion intracelulares: Las variantes de FL y A48 se fusionaron con los dominios de activacion intracelular CD8, CD28 o 41BB en su extremo C (SEQ ID NO: 115 a SEQ ID NO: 120).
3) Mutantes quimericos de pTalfa/TCRa: En una de las construcciones, el dominio intracelular (IC) TCRa se fusiono con una version sin cola (A114) de pTalfa (SEQ ID NO: 121). Tambien se genero una segunda construccion en la que el dominio extracelular de pTalfa se fusiono con los dominios transmembrana (TM) y los IC de TCRa (SEQ ID NO: 122).
4) Mutantes de dimerizacion de pTalfa: Se han descrito algunas mutaciones en la bibliograffa como capaces de alterar la capacidad de oligomerizacion/dimerizacion del complejo preTCR. Se ha propuesto que estos mutantes permiten la expresion de preTCR en la superficie celular, sin inducir la senalizacion constitutiva (que se supone que se induce tras oligomerizacion preTCR). Las mutaciones se han introducido en la variante de pTalfaA48 y son: - 1xMUT: W46R (SEQ ID NO: 123)
- 4x MUT: D22A, K24A, R102A, R117A (SEQ ID NO: 124)
Actividad de diferentes construcciones preTalfa en celulas Jurkat con TRAC inactivado:
Para explorar diferentes variantes de pTalfa para determinar su capacidad para restaurar la expresion en superficie de CD3 en celulas con TCRalfa inactivado, se genero una lmea celular en la que el gen de TCRalfa se altero usando TALEN que se dirige a TRAC. Se transfectaron celulas Jurkat (una lmea celular de leucemia de linfocitos T) con plasmidos que codifican la TALEN que escinde TRAC usando electroporacion de CytoPulse, y las celulas KO (TCRa/pNEG; CD3NEG) donde se purificaron despues mediante seleccion negativa usando perlas magneticas de CD3. La poblacion KO (celulas JKT_KOx3) se amplifico y se uso para exploracion de las diferentes variantes de pTalfa. Se realizo exploracion mediante transfeccion de un millon de celulas JKT_KOx3 con 15 pg de plasmido que codifica las diferentes variantes de pTalfa bajo el control del promotor EF1a, seguido de analisis por citometna de flujo de expresion en superficie celular de CD3 48 h despues de la transfeccion. La Figura 12 es un ejemplo representativo de las eficacias de transfeccion (% de celulas BFP+) y actividad de las construcciones de pTalfa FL, A l8 y A48 en celulas JKT_KOx3, basandose en el % de celulas CD3+, determinado por citometna de flujo. Los resultados de las diferentes construcciones se agrupan en la Tabla 12.
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Tabla 12: Actividad de las diferentes construcciones de pTalfa en celulas Jurkat con TCR alfa inactivado. Se midio la actividad por analisis de citometna de flujo de expresion de CD3 en celulas jurkat con TCR alfa inactivado transfectadas con las construcciones de preTalfa diferentes.
Actividad de pTalfa-FL y pTalfa-A48 en linfocitos T con TCR alfa inactivado:
Para ensayar la capacidad de versiones de pTalfa-FL y pTalfa-A48 para inducir la expresion en superficie de CD3 en linfocitos T con TCR alfa inactivado, se clonaron secuencias codificantes de pTalfa-FL y pTalfa-A48 en un vector lentivmico pLV-SFFV-BFP-2A-PCTRA autoinactivante que codifica protema azul fluorescente (BFP) bajo el promotor de SFFV seguido del peptido T2A de autoescision (figura 13).
Se activaron linfocitos T aislados de sangre periferica durante 72 horas usando perlas activadoras anti-CD3/CD28 (Life technologies) y se transfectaron 4,5 millones de celulas mediante electroporacion con 10 pg de ARNm que codifica la nucleasa TALE que se dirige a region de cadena constante de TCR alfa (TRAC) usando un instrumento CytoLVT-S (BTX- Harvard Harbour). Dos dfas despues de la electroporacion, los linfocitos T se transdujeron con los vectores lentivmcos LV-SFFV-b Fp -2A- pTalfa-A48 o LV-SFFV-BFP-2A-control. Despues se purificaron linfocitos T CD3 negativos y CD3bajo usando perlas magneticas anti-CD3 (Miltenyi Biotech). Este protocolo experimental esta representado en la Figura 14A.
La Figura 14B representa analisis de citometna de flujo de TCRalfa/beta, expresion en superficie celular de CD3 y expresion de BFP en linfocitos T con TCRalfa inactivado (KO) transducidos con BFP-2A-pTalfaA48 (KO/A48) o vector lentivirico de BFP de control (KO/BFP) antes y despues de la purificacion con perlas de CD3. Las celulas con TCRalfa inactivado transducidas con el vector BFP-T2A-pTalfa-A48 (celulas BFP+) muestran mayores niveles de CD3 en comparacion con celulas no transducidas (celulas BFP-). No se observan diferencias entre celulas transducidas con el vector de BFP de control. Estos resultados indican que pTalfa media en la restauracion de la expresion de CD3 en la superficie celular de celulas con TCRalfa inactivado. Por el contrario, la tincion de TCRalfa/beta permanece, como se esperaba, sin cambios en celulas transducidas o no con el vector de expresion pTalfa-A48.
La expresion de CD3 mediada por pTalfa apoya la activacion de linfocitos T deficientes en TCR:
Para determinar la capacidad de pTalfa para transducir senales de activacion de celulas, se analizo la expresion de marcadores de activacion tempranos y tardfos en linfocitos T con TCR alfa inactivado transducidos con pTalfa-A48 y pTalfa-A48.41BB. Se generaron linfocitos T con TCR alfa inactivado transducidos con pTalfa-A48 y pTalfa-A48.41BB a partir de linfocitos T humanos primarios como se ha descrito en la seccion previa y en la Figura 14A.
Para detectar la senalizacion mediante CD3, las celulas se reactivaron usando perlas recubiertas con anti-CD3/CD28 3 dfas despues de la purificacion de linfocitos T con TCR alfa inactivado con perlas de CD3 (figura 14A). Las celulas se tineron con anti-CD69 (marcador de activacion temprana) y anti-CD25 (marcador de activacion tardfa) conjugados con fluorocromo, 24 y 48 horas despues de reactivacion respectivamente y se analizaron mediante citometna de flujo (Figura 15A-B). Como se representa en la figura 15A-B, las celulas con t Cr alfa inactivado que expresan pTalfa-A48 (KO/pTa-A48) o pTalfa-A48.41BB (KO/pTa-A48.BB) muestran regulacion positiva de los marcadores de activacion, hasta niveles similares a los observados en celulas que expresan TCRalfa/beta (NEP: celulas no electroporadas).
Otro indicador de la activacion de linfocitos T es un aumento del tamano celular que se denomina en ocasiones "expansion". La capacidad de los complejos preTCR para inducir "expansion" se midio mediante analisis de citometna de flujo del tamano celular 72 horas despues de la reactivacion usando perlas anti-CD3/CD28 (Figura 15C). La estimulacion con perlas anti-CD3/CD28 indujo aumentos comparables del tamano celular en celulas que expresan complejos de TCRalfa/beta frente a celulas que expresan pTalfa-A48 o pTalfa-A48.41BB. En conjunto, estos resultados sugieren que los complejos preTCR son competentes para transducir senales que se acoplan eficazmente con los mecanismos que median en la regulacion positiva del marcador de activacion.
La expresion de CD3 mediada por pTalfa apoya la expansion de linfocitos T primarios deficientes en TCR usando anticuerpos anti-CD3/ CD28 estimulantes
Para evaluar la capacidad de los complejos preTCR para apoyar la proliferacion celular a largo plazo, se midio la proliferacion de celulas generadas como se ha descrito previamente. Diez dfas despues de la activacion inicial, las celulas se mantuvieron en IL2 (sin reaccion) o en IL2 con perlas anti-CD3/CD28 (reaccion). Para cada condicion, las celulas se contaron y se analizaron mediante citometna de flujo en los diferentes puntos temporales para estimar el numero de celulas BFP+. El crecimiento de celulas con TCRalfa inactivado (KO) transducidas con vectores de BFP o BFP-T2A-preTCRa-A48 y el factor de induccion de estas celulas se estimo con respecto al valor obtenido el dfa 2 despues de la reactivacion. La Figura 16 muestra los resultados obtenidos con dos donantes independientes. En ambos casos, las celulas con TRCalfa inactivado que expresaban pTalfa-A48 presentaron mayor expansion que celulas con TCR alfa inactivado que expresaban solamente el vector de control de BFP. Para el segundo donante, tambien se incluyeron celulas con TCRalfa inactivado que expresan pTalfa-A48.41BB o pTalfa de longitud completa, que presentaban mayor expansion que celulas con TCRalfa inactivado que expresan solamente el vector de control de BFP.
Ejemplo 5: Optimizacion de transfeccion de ARNm en linfocitos T usando tecnologia Cytopulse.
Determinacion del programa de cytopulse optimizado
Se realizo un primer conjunto de experimentos en PBMC no activadas para determinar un intervalo de tension en el que podnan transfectarse celulas. Se ensayaron cinco programas diferentes como se describe en la Tabla 13.
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Tabla 13: Programas de cytopulse diferentes usados para determinar la tension minima necesaria para electroporacion en linfocitos T procedentes de PBMC.
Se electroporaron 3 o 6 millones de celulas en una cubeta con hueco de 0,4 cm (30 o 15x106 celulas/ml) con 20 |jg de plasmidos que codifican GFP y plasmidos de control pUC usando los diferentes programas de Cytopulse. 24 horas despues de la electroporacion, se analizo la expresion de GFP en celulas electroporadas mediante citometna de flujo para determinar la eficacia de transfeccion. Los datos mostrados en la Figura 17 indican la tension minima necesaria para electroporacion de plasmidos en linfocitos T procedentes de PBMC. Estos resultados demuestran que el programa de cytopulse 3 y 4 permite una transformacion eficaz de linfocitos T (EP n.° 3 y n.° 4).
Electroporacion de ARNm de linfocitos T purificados activados
Despues de determinar el mejor programa de cytopulse que permite una electroporacion de ADN eficaz de linfocitos T, los inventores ensayaron si este metodo era aplicable a la electroporacion de ARNm.
Se resuspendieron 5x106 linfocitos T purificados preactivados 6 dfas con PHA/IL2 en tampon de citoporacion T (aparato BTX-Harvard) y se electroporaron en cubetas de 0,4 cm con 10 jg de ARNm que codifica GFP o 20 jg de plasmidos que codifican GFP o pUC usando el programa de cytopulse preferido como se determino en la seccion previa (tabla 14).
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Tabla 14: Programa de cytopulse usado para electroporar linfocitos T purificados.
48 h despues de la transfeccion las celulas se tineron con colorante de viabilidad (eFluor-450) y la viabilidad celular y el % de celulas GFP+ viables se determinaron mediante analisis de citometna de flujo (Figura 18).
Los datos mostrados en la Figura 18 indican que la electroporacion de ARN con la condicion optima determinada aqu no es toxica y permite la transfeccion de mas del 95 % de las celulas viables.
En smtesis, el conjunto de datos completo muestra que los linfocitos T pueden transfectarse eficazmente con ADN o ARN. En particular, la transfeccion de ARN no tiene ninguna influencia en la viabilidad celular y permite niveles de expresion uniformes del gen transfectado de interes en la poblacion celular.
Puede conseguirse transfeccion eficaz poco despues de la activacion celular, independientemente del metodo de activacion usado (perlas recubiertas con PHA/IL-2 o CD3/CD28). Los inventores han conseguido transfectar celulas desde 72 h despues de la activacion con eficacias de >95 %. Ademas, tambien puede obtenerse transfeccion eficaz de linfocitos T despues de descongelacion y activacion usando el mismo protocolo de electroporacion.
Electroporacion de ARNm en linfocitos T humanos primarios para expresion funcional de nucleasa TALE
Despues de demostrar que la electroporacion de ARNm permite la expresion eficaz de GFP en linfocitos T humanos primarios, los inventores ensayaron si este metodo era aplicable a la expresion de otras protemas de interes. Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripcion (nucleasa TALE) son nucleasas espedficas de sitio generadas por la fusion de un dominio de union a ADN de TAL con un dominio de escision de ADN. Son herramientas de edicion del genoma potentes ya que inducen roturas bicatenarias practicamente en cualquier secuencia de ADN deseada. Estas roturas bicatenarias activan union de extremos no homologos (NHEJ), un mecanismo de reparacion de ADN propenso a errores, que conduce potencialmente a inactivacion de cualquier gen deseado de interes. Como alternativa, si se introduce un molde de reparacion adecuado en las celulas al mismo tiempo, las roturas de ADN inducidas por nucleasa TALE pueden repararse mediante recombinacion homologa, ofreciendo por lo tanto la posibilidad de modificar a voluntad la secuencia genica.
Los inventores han usado electroporacion de ARNm para expresar una nucleasa TALE disenada para escindir espedficamente una secuencia en el gen humano que codifica la cadena alfa del receptor de antfgeno de linfocitos T (TRAC). Se espera que las mutaciones inducidas en esta secuencia den como resultado inactivacion genica y perdida de complejo TCRap de la superficie celular. Se transfectan ARN de nucleasa TALE de TRAC o ARN no codificante como control en linfocitos T humanos primarios activados usando tecnologfa Cytopulse. La secuencia de electroporacion consistio en 2 pulsos de 1200 V seguido de cuatro pulsos de 130 V como se describe en la Tabla 14.
Mediante analisis de citometna de flujo de expresion en superficie de TCR 7 dfas despues de la electroporacion (Figura 19, panel superior), los inventores observaron que 44% de los linfocitos T perdieron la expresion de TCRap. Los inventores analizaron el ADN genomico de las celulas transfectadas mediante amplificacion por PCR del locus de TRAC seguido de secuenciacion de alto rendimiento de 454. 33 % de los alelos secuenciados (727 de 2153) conteman insercion o supresion en el sitio de escision de nucleasa TALE. La Figura 19 (panel inferior) muestra ejemplos de los alelos mutados.
Estos datos indican que la electroporacion de ARNm usando tecnolog^a cytopulse da como resultado expresion funcional de nucleasa TALE de TRAC.
Electroporacion de linfocitos T con un ARNm monocistronico que codifica un receptor quimerico de antigenos (CAR) monocatenario anti-CD19:
Se resuspendieron 5X106 linfocitos T preactivados varios dfas (3-5) con perlas recubiertas anti-CD3/CD28 e IL2 en tampon de citoporacion T y se electroporaron en cubetas de 0,4 cm sin ARNm o con 10 pg de ARNm que codifica un CAR monocatenario (SEQ ID NO: 73) usando el programa descrito en la Tabla 14.
24 horas despues de la electroporacion, las celulas se tineron con un colorante de viabilidad fijable eFluor-780 y un fragmento F(ab')2 de cabra anti IgG de raton conjugado con PE espedfico para evaluar la expresion en superficie celular del CAR en las celulas vivas. Los datos se muestran en la Figura 20. Indica que la amplia mayona de los linfocitos T vivos electroporados con el ARNm monocitronico descrito previamente expresan el c A r en su superficie.
24 horas despues de la electroporacion, se cocultivaron linfocitos T con celulas Daudi (CD19+) durante 6 horas y se analizaron por citometna de flujo para detectar la expresion del marcador de desgranulacion CD107a en su superficie (Betts, Brenchley et al. 2003).
Los datos mostrados en la figura 20 indican que la mayona de las celulas electroporadas con el ARNm monocistronico descrito previamente desgranulan en presencia de celulas diana que expresan CD19. Estos resultados demuestran claramente que el CAR expresado en la superficie de linfocitos T electroporados esta activo.
Electroporacion de linfocitos T con un ARNm policistronico que codifica un receptor quimerico de antigenos (CAR) multisubunitario anti-CD19:
Se electroporaron 5X106 linfocitos T preactivados varios dfas (3-5) con perlas recubiertas anti-CD3/CD28 e IL2 en tampon de citoporacion T y se electroporaron en cubetas de 0,4 cm sin ARNm o con 45 pg de ARNm que codifica un CAR multicatenario (SEQ ID NO: 226), Figura 21A y figura 4B (csm4)) usando el programa descrito en la Tabla 14.
24 horas despues de la electroporacion, las celulas se tineron con un colorante de viabilidad fijable eFluor-780 y un fragmento F(ab')2 de cabra anti IgG de raton conjugado con PE espedfico para evaluar la expresion en superficie celular del CAR en las celulas vivas. Los datos mostrados en la Figura 21 indican que la amplia mayona de los linfocitos T vivos electroporados con el ARNm policistronico descrito previamente expresan el CAR en su superficie.
24 horas despues de la electroporacion, se cocultivaron linfocitos T con Daudi (CD19+) durante 6 horas y se analizaron por citometna de flujo para detectar la expresion del marcador de desgranulacion CD107a en su superficie. Los datos mostrados en la Figura 21 indican que la mayona de las celulas electroporadas con el ARNm policistronico descrito previamente desgranulan en presencia de celulas diana que expresan CD19. Estos resultados demuestran claramente que el CAR expresado en la superficie de linfocitos T electroporados esta activo.
Ejemplo 6: CAR multicatenarios
A. Diseno de CAR multicatenarios
Se disenaron nueve CAR multicatenarios que se dirigen al antigeno CD19 basandose en el receptor de alta afinidad para IgE (FceRI). El FceRI expresado en mastocitos y basofilos desencadena reacciones alergicas. Es un complejo tetramerico compuesto de una unica subunidad a (SEQ ID NO: 202), una unica subunidad p (SEQ ID NO: 203) y dos subunidad y unidas por disulfuro (SEQ ID NO: 204). La subunidad a contiene el dominio de union a IgE. Las subunidades p y y contienen ITAM (SEQ ID NO: 198 y SEQ ID NO: 199) que median en la transduccion de senal Figura 4A. Los CAR multicatenarios se disenaron como se ha descrito en las Figuras 4B, C y Tabla 15. En cada CAR multicatenario, el dominio extracelular de la cadena FcRa se suprimio y se reemplazo por el 4G7scFv y la bisagra CD8a (SEQ ID NO: 206). En los CAR multicatenarios csm2, csm4, csm5, csm8 y csm10, el ITAM de la cadena FcRp y/o la cadena FcRy se suprimio. En los CAR multicatenarios csm2, csm4, csm5, csm6, csm8, csm9 y csm10, los 3 ITAM de CD3Z (SEQ ID n O: 197) se anadieron a la cadena FcRp o la cadena FcRy. En los CAR multicatenarios csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 y csm10, el dominio intracelular 4-1BB (SEQ ID NO: 200) se anadio a la cadena FcRa, la cadena FcRp o la cadena FcRy. En los CAR multicatenarios csm10, el dominio intracelular CD28 se anadio a la cadena FcRa (s Eq ID NO: 201).
Figure imgf000041_0001
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Tabla 15: Descripcion de las composiciones de cadenas de las versiones de CAR multicatenarios.
B. Los CAR multicatenarios expresados de forma transitoria pueden desencadenar activacion de linfocitos T
Los CAR multicatenarios pueden expresarse en linfocitos T humanos despues de electroporacion de ARNm policistronico.
Se electroporaron linfocitos T con ARNm policistronico con recubrimiento terminal y poliadenilado (Figura 21A), que se produjeron usando el kit mMESSAGE mMACHINE y plasmidos linealizados como molde. Los plasmidos usados como molde conteman el promotor de ARN polimerasa T7 seguido de una secuencia de ADN policistronico que codifica csm l, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 o csm10 (SEQ ID NO: 224 a 232).
La electroporacion de los ARNm policistronicos en los linfocitos T humanos se realizo usando el dispositivo CytoLVT-S (Cellectis), segun el siguiente protocolo: Se resuspendieron 5X106 linfocitos T preactivados varios dfas (3-5) con perlas recubiertas anti-CD3/CD28 e IL2 en tampon de citoporacion T y se electroporaron en cubetas de 0,4 cm con 45 |jg de ARNm que usa el programa PBMC3 Tabla 14.
24 horas despues de la electroporacion, se marcaron linfocitos T humanos genomodificados usando ARNm policistronicos que codifican CAR multicatenarios con un colorante de viabilidad flexible eFluor-780 y un fragmento F(ab')2 de cabra anti IgG de raton conjugado con PE espedfico, y se analizaron por citometna de flujo. Los datos mostrados en la Figura 22 indican que los linfocitos T vivos genomodificados usando ARNm policistronicos expresan los CAR multicatenarios csm l, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 y csm10.
Como se ha descrito en la bibliograffa para el FceRI, la expresion de los CAR multisubunitarios esta condicionada por la expresion de las 3 cadenas. La cadena a sola se expresa menos que el complejo de cadenas a y y el complejo de cadenas a y se expresa menos que el complejo de cadenas a p y Figura 23.
Los linfocitos T humanos que expresan transitoriamente los CAR multicatenarios se desgranulan despues del cocultivo con celulas diana
24 horas despues de la electroporacion, se cocultivaron linfocitos T humanos genomodificados usando ARNm policistronicos que codifican los CAR multicatenarios con celulas diana (Daudi) o de control (K562) durante 6 horas. Los linfocitos T CD8+ se analizaron despues por citometna de flujo para detectar la expresion del marcador de desgranulacion CD107a en su superficie. Los datos mostrados en la Figura 24 indican que los linfocitos T CD8+ humanos que expresan los CAR multicatenarios csml, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 y csm10 se desgranulan en cocultivo con celulas diana que expresan CD19 pero no en cocultivo con celulas de control.
Los linfocitos T humanos que expresan transitoriamente los CAR multicatenarios secretan citocinas despues del cocultivo con celulas diana
24 horas despues de la electroporacion, se cocultivaron linfocitos T humanos genomodificados usando ARNm policistronicos que codifican los CAR multicatenarios con celulas diana (Daudi) o de control (K562) durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogieron y analizaron despues usando el kit de matriz de perlas citometricas de citocinas TH1/TH2 para cuantificar las citocinas producidas por los linfocitos T. Los datos mostrados en la Figura 25A-C indican que los linfocitos T humanos que expresan los CAR multicatenarios csm l, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 y csm10 producen IFNy, IL8 e IL5 en cocultivo con celulas diana que expresan CD19 pero no en cocultivo con celulas de control.
Los linfocitos T humanos que expresan transitoriamente los CAR multicatenarios lisan celulas diana
24 horas despues de la electroporacion, se cocultivaron linfocitos T humanos genomodificados usando ARNm policistronicos que codifican los CAR multicatenarios con celulas diana (Daudi) o de control (K562) durante 4 horas. Las celulas diana se analizaron despues mediante citometna de flujo para analizar su viabilidad. Los datos mostrados en la Figura 26 indican que las celulas que expresan los CAR multicatenarios csm l, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 y csm10 lisan las celulas diana que expresan CD19 pero no las celulas de control.
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Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Receptor quimerico de antfgenos (CAR) multicatenario que comprende al menos:
- un polipeptido transmembrana que comprende al menos un dominio de union a ligando extracelular, en donde el al menos un dominio de union a ligando extracelular interacciona con una molecula de superficie celular; y - un polipeptido transmembrana que comprende al menos un dominio de transduccion de senal;
en donde el dominio o los dominios de transduccion de senal del receptor quimerico de antfgenos multicatenario esta presente en un polipeptido distinto del que porta el dominio o los dominios de union a ligando extracelular.
2. El receptor quimerico de antigenos multicatenario de la reivindicacion 1 en donde al menos un polipeptido transmembrana comprende una parte del receptor de Fc.
3. El receptor quimerico de antfgenos multicatenario de la reivindicacion 2 en donde dicha parte del receptor de Fc se selecciona del grupo que consiste en: (a) cadena alfa de FceRI, (b) cadena beta de FceRl y (c) cadena gamma de FceRI.
4. El receptor quimerico de antfgenos multicatenario de la reivindicacion 3 en donde dicha parte del receptor de Fc es una parte de la cadena alfa de FceRI.
5. El receptor quimerico de antigenos multicatenario segun la reivindicacion 3 o 4 que comprende una parte de la cadena alfa de FceRI y una parte de la cadena beta de FceRI de modo que dichas cadenas de FceRI dimerizan entre sf para formar un receptor quimerico de antigenos dimerico.
6. El receptor quimerico de antigenos multicatenario segun la reivindicacion 3 o 4 que comprende una parte de la cadena alfa de FceRI y una parte de la cadena gamma de FceRI de modo que dichas cadenas de FceRI trimerizan entre sf para formar un receptor quimerico de antigenos trimerico.
7. El receptor quimerico de antigenos multicatenario de la reivindicacion 3 o 4 que comprende una parte de la cadena alfa de FceRI, una parte de la cadena beta de FceRI y una parte de la cadena gamma de FceRI de modo que dichas cadenas de FceRI se tetramericen entre sf para formar un receptor quimerico de antfgenos tetramerico.
8. El receptor quimerico de antfgenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el dominio de union a ligando extracelular reconoce un ligando que actua como un marcador de superficie celular en celulas diana asociadas con una patologfa particular.
9. El receptor quimerico de antfgenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde dicho dominio de union a ligando extracelular es un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv).
10. El receptor quimerico de antfgenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde dicho polipeptido transmembrana comprende ademas una region de tallo.
11. El receptor quimerico de antfgenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde dicho dominio transductor de senal se selecciona del grupo que consiste en: cadena zeta del TCR, cadena FCeRp, cadena FceRIy, motivo de activacion basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM).
12. El receptor quimerico de antfgenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde dicho CAR comprende un dominio coestimulante.
13. El receptor quimerico de antfgenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que comprende ademas una molecula coestimulante seleccionada del grupo que consiste en: CD28, OX40, ICOS, CD137 y CD8.
14. El receptor quimerico de antfgenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que comprende polipeptidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 202 a SEQ ID NO: 204 y SEQ ID NO:206 a SEQ ID NO: 213.
15. Un polinucleotido que comprende dos o mas secuencias de acido nucleico que codifican los polipeptidos transmembrana que componen el CAR multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Un vector que comprende un polinucleotido de la reivindicacion 15.
17. Un metodo para genomodificacion de una celula inmunitaria que comprende:
(a) Proporcionar una celula inmunitaria;
(b) Expresar en la superficie de dichas celulas al menos un receptor quimerico de antfgenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
18. El metodo para genomodificacion de una celula inmunitaria de la reivindicacion 17 que comprende:
(a) Proporcionar una celula inmunitaria;
(b) Introducir en dicha celula al menos un polinucleotido que codifica polipeptidos que componen al menos un receptor quimerico de antigenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14;
(c) Expresar dichos polinucleotidos en dicha celula.
19. El metodo para genomodificacion de una celula inmunitaria de la reivindicacion 17 que comprende:
(a) Proporcionar una celula inmunitaria;
(b) Expresar en la superficie de dicha celula una poblacion de receptores quimericos de antfgenos multicatenarios segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 comprendiendo cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelular.
20. El metodo para genomodificacion de una celula inmunitaria de la reivindicacion 18 que comprende:
(a) Proporcionar una celula inmunitaria;
(b) Introducir en dicha celula al menos un polinucleotido que codifica polipeptidos que componen una poblacion de receptores quimericos de antigenos multicatenarios segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 comprendiendo cada uno diferentes dominios de union a ligando extracelular.
(c) Expresar dichos polinucleotidos en dicha celula.
21. El metodo para genomodificacion de una celula inmunitaria de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 que comprende ademas la etapa de d) inactivar en dicha celula inmunitaria al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en TCR alfa, TCR beta, CD52, GR y puntos de control inmunitarios.
22. Una celula inmunitaria aislada que puede obtenerse del metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21.
23. Una celula inmunitaria aislada que comprende al menos un receptor quimerico de antfgenos multicatenario segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
24. Una celula aislada segun la reivindicacion 22 o 23 procedente de linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotoxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares.
25. Una celula inmunitaria aislada segun una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 para su uso como medicamento.
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