RU2632118C1 - Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины - Google Patents

Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины Download PDF

Info

Publication number
RU2632118C1
RU2632118C1 RU2016129987A RU2016129987A RU2632118C1 RU 2632118 C1 RU2632118 C1 RU 2632118C1 RU 2016129987 A RU2016129987 A RU 2016129987A RU 2016129987 A RU2016129987 A RU 2016129987A RU 2632118 C1 RU2632118 C1 RU 2632118C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
immune complexes
mmldl
atherogenicity
mmlnp
cholesterol
Prior art date
Application number
RU2016129987A
Other languages
English (en)
Inventor
Оксана Михайловна Драпкина
Батожаб Батожаргалович Шойбонов
Софья Олеговна Елиашевич
Original Assignee
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) filed Critical федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России)
Priority to RU2016129987A priority Critical patent/RU2632118C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2632118C1 publication Critical patent/RU2632118C1/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/539—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и предназначено для выделения и исследования иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП), из сыворотки крови человека. Агрегируют из сыворотки крови человека множественно модифицированные ЛНП в условиях 9,1% ПВП-35000 при комнатной температуре, осаждают центрифугированием, тщательно декантируют. Полученный супернатант инкубируют при 4°С в течение 30 мин. Образовавшиеся агрегаты ИК-ммЛНП осаждают повторным центрифугированием, декантируют, растворяют преципитат в буфере без ПВП и определяют содержание холестерина, триацилглицеринов. Определяют содержание IgG в составе преципитата. Исследуют комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих ммЛНП. Способ может применяться для ранней диагностики субклинического атеросклероза. 1 ил., 5 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к клинической биохимии, иммунологии, кардиологии, неврологии и может быть использовано для выделения из сыворотки крови человека и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП).
Известны способы выделения иммунных комплексов, содержащих окисленные липопротеины низкой плотности, из сыворотки крови человека преципитацией их 2,5%, 3,5% и 4% растворами полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 (ПЭГ-6000) в течение 24 часов. Агрегированные иммунные комплексы, содержащие множественно модифицированные ЛНП, осаждают центрифугированием, промывают преципитат 3 раза буфером, содержащим соответствующую концентрацию ПЭГ-6000 и определяют в преципитате холестерин после экстракции [1-4, 7-10].
Недостатком приведенных способов являются: длительность процедуры выделения, неполная преципитация ИК-ммЛНП, копреципитация иммунных комплексов, содержащих другие антигены (нелипопротеиновые) и как следствие - отсутствие единых, унифицированных стандартных способов избирательного выделения иммунных комплексов, содержащих ммЛНП.
В качестве прототипа использован экспресс-способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП) с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350) и поливинилпирролидона с молекулярной массой 12600 (ПВП-12600) [5]. Использование буфера, содержащего 8,3% ПЭГ-3350 и 3,3% ПВП-12600, при соотношении сыворотка:буфер (1:1,2) позволило авторам преимущественно преципитировать из сыворотки циркулирующие иммунные комплексы, содержащие ммЛНП. Агрегаты ИК-ммЛПНП осаждают центрифугированием и преципитат растворяют в буфере без ПЭГ и ПВП, определяют содержание холестерина с использованием коммерческих наборов «Холестерин» и при уровне свыше 8,3 мг/дл констатируют повышенный уровень. В преципитете также определяют степень связывания комплемента морской свинки. Атерогенность ИК-ммЛПНП выражают как отношение степени связывания комплемента к холестерину в иммунных комплексах
Данная методика также не лишена недостатков. Способ не позволяет отделить иммунные комплексы, содержащие ммЛНП, от свободных ммЛНП, а в условиях 4,5% ПЭГ-3350 и 1,8% ПВП-12600 наблюдается неспецифическая копреципитация высокомолекулярных белков из сыворотки крови.
Техническим результатом предлагаемого способа является устранение вышеуказанных недостатков, эффективное разделение иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, и свободных ммЛНП, устранение неспецифической копреципитации высокомолекулярных белков сыворотки крови, что дает возможность использовать данный способ для ранней диагностики субклинического атеросклероза за счет подтверждения гомогенности препаратов, оценки их патогенности в тесте связывания комплемента и расчета атерогенности как отношение степени связывания комплемента к холестерину в этих препаратах. Заявленный способ позволяет разделить ммЛНП и ИК-ммЛНП, полностью преципитировать патогенные ЛНП и точно вычислить атерогенность, поскольку атерогенность по способу-прототипу является суммарной реакцией степени связывания комплемента пулом ммЛНП и ИК-ммЛНП и отражает только общую тенденцию в тесте связывания комплемента.
Этот результат достигается тем, что специфическую преципитацию иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП), из сыворотки крови человека проводят путем инкубации супернатанта, полученного после предварительного осаждения ммЛНП в среде поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), в течение 30 минут при 4°С, затем образовавшиеся агрегаты ИК-ммЛНП осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 3100g, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000 и определяют содержание холестерина, триацилглицеринов и IgG в иммунных комплексах с использованием коммерческих ферментативных наборов. Определяют степень связывания комплемента (ССК) морской свинки препаратом ИК-ммЛНП и рассчитывают атерогенность как отношение ССК к содержанию холестерина в ИК-ммЛНП.
Способ осуществляют следующим образом.
Проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, отделяют сыворотку и определяют уровень содержания ммЛНП. К 15 мкл исследуемой сыворотки добавляют 150 мкл буфера, содержащего 10% ПВП-35000, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин в 96-ти луночных иммунологических планшетах с плоским дном.
Способ выделения иммунных комплексов, содержащих ммЛНП включает:
- Буфер-1 для преципитации множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности, который включает 20% ПВП-35000 в 0,01 М трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;
- Буфер-2 для растворения преципитата иммунных комплексов, который представляет собой 0,01М Трис-HCl-буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.
Степень помутнения определяют турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка используют пробы сыворотки с соответствующим количеством Буфера-2. Рассчитывают уровень содержания ммЛНП по формуле
[ммЛНП], ЕД = [ЕО-ЕК]×100,
где [ммЛПН] - множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в единицах (ЕД);
ЕО - оптическая плотность опытной пробы, сыворотки с соответствующим количеством буфера, содержащего 10% ПВП-35000, при длине волны 450 нм, ед. опт. пл.;
ЕК - оптическая плотность контрольной пробы при длине волны 450 нм, сыворотки с соответствующим количеством буфера-К, ед. опт. пл.;
100 - коэффициент перерасчета в единицы (ЕД).
Выделение множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности. К 100 мкл сыворотки крови человека добавляют 84 мкл 20% ПВП-35000, тщательно перемешивают и после 10-ти минутной инкубации при комнатной температуре, агрегированные ммЛНП осаждают путем центрифугирования при 3100g в течение 10 мин при 23°С. ПВП-преципитат тщательно декантируют (супернатант в дальнейшем используют для выделения иммунных комплексов, содержащих ммЛНП) и осадок ресуспендируют в 100 мкл буфера-2. После растворения осадка в полученных ПВП-преципитатах определяют содержание холестерина с использованием коммерческих ферментных наборов [6].
Определение степени связывания комплемента препаратами ммЛНП и расчет их атерогенности. К 10 мкл растворов преципитатов ммЛНП, разбавленных в соотношении 1:99 вероналовым солевым буфером (VBS2+), добавляют 15 мкл раствора, разбавленного 1:9, комплемента морской свинки. Общий объем пробы доводят до 0,3 мл буфером VBS2+ и инкубируют в течение 20 мин при 37°С. После инкубации в пробы добавляют 200 мкл ЕА, тщательно перемешивают и продолжают инкубацию в течение 30 мин при 37°С. Реакцию комплемент-опосредованного лизиса останавливают добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15М NaCl, центрифугируют при комнатной температуре в течение 10 мин при 1800 оборотах в минуту и определяют величину гемолиза по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержит преципитата ммЛНП. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствует о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяют по формуле
У(%)=[(X-R)/(H-R)×100],
где Н, R и X - величины оптической плотности А405 в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяют по формуле:
ССК(%)=100-У.
Атерогенность иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, рассчитывают как отношение степени связывания комплемента к количеству холестерина в преципитированных иммунных комплексов в индивидуальных сыворотках.
Выделение иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеинов низкой плотности. Супернатант, приготовленный как описано выше, инкубируют при 4°С в течение 30 минут. Агрегированные иммунные комплексы осаждают путем центрифугирования при 3100g в течение 10 мин при 4°С. Преципитат ИК-ммЛНП тщательно декантируют и полученный осадок ресуспендируют в исходном объеме, в 100 мкл буфера-2. После растворения осадка в полученных преципитатах определяют содержание холестерина с использованием коммерческих ферментных наборов.
Определение IgG в препарате ИК-ммЛНП в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Предварительно титруют преципитаты иммунных комплексов, разведенных 1:99, на 12 лунок в 96-ти луночных кругло донных иммунологических планшетах. В качестве стандарта титруют препарат IgG с исходной концентрацией 1 мг/мл. После титрования преципитатов и стандартного препарата IgG добавляют равный объем разбавленного раствора антител против IgG человека, содержащего 4 гемагглютинирующие единицы. Тщательно перемешивают и добавляют равный объем 1% суспензии иммунных комплексов, эритроцитов барана, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека (ЕАЧ), повторно перемешивают и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации определяют для каждой пробы лунку, где наблюдается торможение гемагглютинации. Расчеты проводят с использованием данных по торможению гемагглютинации стандартного раствора IgG человека.
Электрофорез ммЛНП, ИК-ЛНП и исходной сыворотки. Электрофорез фракций ммЛНП, ИК-ммЛНП и исходной сыворотки проводят на ацетат-целлюлозной пленке с использованием наборов реагентов производства фирмы Sebia (Франция). Результаты представлены на рис. 1.
Как видно на рис. 1 (дорожки №1, 6 и 11), образцы исходной сыворотки на электрофореграмме разгоняются на три фракции (β-липопротеин (ЛНП), α-липопротеин (ЛВП) и альбумин). Препараты ммЛНП при электрофорезе (дорожки №2, 7 и 12) также разгоняются на три полосы (на старте остаются низкозаряженные липопротеины, липопротеины с подвижностью α-липопротеина и фракции альбумина). Препараты ИК-ммЛНП (дорожки №3, 8 и 13) характеризуются содержанием преимущественно липопротеинов с подвижностью β-липопротеинов, за исключением пробы на дорожке №8, который дал две фракции. Наиболее чистыми по данным электрофореза оказались препараты нЛНП (дорожки №4, 9 и 14). Для интерпретации полученных данных были проведены биохимические исследования приготовленных препаратов на анализаторе «Olympus AU400» (Япония).
Биохимический анализ пулированной сыворотки крови и приготовленных из нее фракций ммЛНП и ИК-ммЛНП. Пулированную сыворотку готовили смешиванием сывороток крови от 10 больных с атеросклерозом каротидных артерий. Фракции ммЛНП, ИК-ммЛНП, нЛНП и ЛВП готовили как описано выше. Концентрацию общего ХС, ХС-ЛНП, липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛВП), триацилглицеринов (ТАГ), аполипопротеинов А и В (апоА и В), определяли на биохимическом анализаторе «Olympus AU400» (Япония). Полученные данные представлены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, в пулированной сыворотке определяется повышенный уровень общего холестерина за счет холестерина ЛНП. Остальные показатели находятся в пределах референсных значений. Анализ фракций показал:
1. В препарате ммЛНП содержится до 11% ЛВП по холестерину и не определяется Аро А.
2. В препарате ИК-ммЛНП 0,15 мМ/л холестерина приходится на ХС-ЛОНП. На долю ХС-ЛНП приходится 87% из общего холестерина препарата ИК-ммЛНП. По Аро-протеину всего 1% приходится на Аро А. 6% приходится на ХС-ЛВП.
3. В препарате нЛНП содержится до 7% ЛВП по холестерину; из пула аропротеина 6,7% приходится на Аро А.
4. Содержание данных показателей в составе ЛВП свидетельствуют о том, что 0,4% в ЛВП содержится Х-ЛНП, 0,8% Аро В.
Разработанный способ выделения иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, анализ их патогенности в тесте связывания комплемента и расчет атерогенности был использован при обследовании крови у больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий и у здоровых лиц.
Пример 1. Выделение и характеристика ммЛНП и иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеинов низкой плотности, из сыворотки крови у больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий.
Проведены исследования у 16 больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий (АКА). Определение уровня ммЛНП, фракционирование ммЛНП и ИК-ммЛНП, степень связывания комплемента и расчет атерогенности проводили как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Пример 2. Выделение и характеристика ммЛНП и иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеинов низкой плотности, из сыворотки крови относительно здоровых лиц. Проведены исследования у 14 здоровых лиц с отсутствием изменений в интима-медиальном комплексе каротидных артерий. Определение уровня ммЛНП, фракционирование ммЛНП и ИК-ммЛНП, степень связывания комплемента и расчет атерогенности проводили как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, определение уровня содержания ммЛНП методом турбидиметрии выявляет только у 3 человек (21%) повышенный уровень, в то время как у больных с АКА данный показатель составил 37,5% (табл. 2). Информативным оказался показатель холестерина в ммЛНП. У здоровых лиц у 43% наблюдается повышенный уровень холестерина в ммЛНП (у больных - 68,8%). Средние показатели степени связывания комплемента практически не отличаются в группах и составили 58% и 59%, соответственно.
Наиболее информативным оказался показатель атерогенности ммЛНП. В группе здоровых лиц данный показатель колебался от 0,32 ЕД до 1,17 ЕД, в то время как у больных с АКА данный показатель колебался от 15 до 1067 ЕД. Расчет удельной активности (атерогенности) ммЛНП в тесте связывания комплемента характеризует высокий воспалительный потенциал ммЛНП, особенно при «нормальном» уровне содержания ммЛНП у больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий.
Данные содержания и патогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, в группах больных с АКА и здоровых лиц показали значимые различия. Так содержание холестерина в ИК-ммЛНП у больных с АКА в 2,8 раз было выше, чем в контрольной группе, причем эти комплексы у больных обладали очень низкой степенью связывания комплемента (только в 4 пробах наблюдается связывание комплемента из 16, а в остальных пробах наблюдается стабилизация комплемента в разной степени при предварительной инкубации). Расчет атерогенности ИК-ммЛНП выявил более существенные различия в комплемент-связывающей способности этих комплексов. В случае стабилизации комплемента (от + 12% до + 27%) для расчета атерогенности использовали величину 1% ССК. В таблице 4 представлены сводные данные со средними значениями исследованных показателей по двум группам.
Как видно из сравнительных данных, представленных в таблице 4, наиболее информативными показателями оказались данные, полученные при исследовании функциональной активности в тесте связывания комплемента. Представлены сравнительные данные по атерогенности ммЛНП и ИК-ммЛНП в тесте связывания комплемента. Отмечено превышение уровня холестерина в ммЛНП в 2 раза у пациентов с подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий, что свидетельствует о наличии системной воспалительной реакции, причем атерогенность этих ммЛНП почти в 200 раз превышает данный показатель в контрольной группе. Колебания данного показателя от 15 ЕД до 1067 ЕД у больных с АКА свидетельствует о степени воспалительной реакции. Определение данного показателя при противовоспалительной терапии позволит контролировать эффективность лечения.
Пример 3. Выделение и характеристика иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, из сыворотки крови относительно здоровых лиц и больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами исследования предлагаемым способом и прототипом.
2.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при условиях 1,8% ПВП-12600 и 4,5% ПЭГ-3350 (по прототипу). К 50 мкл сыворотки крови больных с атеросклерозом каротидных артерий и относительно здоровых доноров добавляли 60 мкл буфера, содержащего 8,3% ПЭГ-3350 и 3,3% ПВП-12600 и инкубировали 10 мин при 23°С. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждали центрифугированием при 23°С в течение 5 мин при 3100g. Супернатант декантировали и осадок растворяли в 50 мкл буфера без ПЭГа и ПВП. В преципитате определяли содержание холестерина с использованием коммерческого набора «Холестерин», степень связывания комплемента морской свинки и рассчитывали атерогенность ИК-ммЛНП. Полученные результаты с использованием предлагаемого способа и прототипа представлены в таблице 5.
Как видно из сравнительных данных, представленных в таблице 5, предлагаемый способ выделения иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, показывает: 1. Содержание холестерина как в ммЛНП, так и в ИК-ммЛНП; 2. В контрольной группе содержание холестерина в ммЛНП и ИК-ммЛНП незначительно отличается, в то время как у больных с АКА содержание холестерина в ИК-ммЛНП в среднем почти в два раза больше, чем в ммЛНП; 3. Показатели атерогенности ммЛНП и ИК-ммЛНП в контрольной группе различаются незначительно, в то время как у больных с АКА атерогенность ммЛНП колебалась 15 до 1067 ЕД, а атерогенность ИК-ммЛНП - от 0,0007 до 0,032 ЕД.
Данные, полученные с использованием прототипа, не позволяют разделить ммЛНП и ИК-ммЛНП, а также полностью преципитировать патогенные ЛНП. Атерогенность в данном способе является суммарной реакцией степени связывания комплемента пулом ммЛНП и ИК-ммЛНП и отражает только общую тенденцию в тесте связывания комплемента.
Полученные данные о низкой атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, у больных с атеросклерозом каротидных артерий свидетельствует, с одной стороны, об антиатерогенном эффекте аутоиммунной реакции за счет связывания и нейтрализации патогенных ммЛНП. С другой стороны, низкая эффекторная (комплемент-активирующая) функция аутоантител к ммЛНП приводит к нарушению солюбилизации и элиминации иммунных комплексов, содержащих ммЛНП. Известно, что нарушение опсонизации иммунных комплексов компонентом C3b комплемента сопровождается незавершенным фагоцитозом. Возможно в этом и есть причина образования «пенистых» клеток - макрофагов, «фаршированных» липидными каплями.
Таким образом, заявленный способ специфического выделения иммунных комплексов позволяет проводить фундаментальные исследования процессов атерогенеза персонифицированно и контролировать эффективность терапии. Полученные экспериментальные данные об эффекторной функции аутоантител к ммЛНП в иммунных комплексах свидетельствуют о двойственной природе «антиатерогенной» аутоиммунной реакции организма человека на ммЛНП. Сравнительные исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, в тесте связывания комплемента у здоровых доноров и больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий позволяют использовать данный способ как для ранней диагностики субклинического атеросклероза, так и для оценки характера аутоиммунной реакции у конкретных индивидуумов. Таким образом, определение атерогенности ИК-ммЛНП данным способом позволил выявить существенное его повышение у больных с атеросклерозом по сравнению со здоровыми лицами.
Литература
1. Гуревич B.C., Уразгильдеева С.А., Бутхашвили М.И., Васина Л.В. Эволюция представлений о про- и антиатерогенных свойствах липопротеинов // Атеросклероз и дислипидемия. - 2012. - №4. - С. 54-63.
2. Собенин И.А., Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Холестерин иммунных комплексов как индикатор атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С. 99-103.
3. Тертов В.В., Качарава А.Г., Саядян Х.С. и др. Холестеринсодержащие циркулирующие иммунные комплексы - компонент сыворотки крови больных с ишемической болезнью сердца, обуславливающий ее атерогенность // Кардиология. - 1989. - Т. 29, №8. - С. 35-38.
4. Шойбонов Б.Б., Борголов В.М., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Тест-система определения циркулирующих иммунных комплексов // Патент РФ №2452962 от 10.06.2012 г., Бюл. №16.
5. Шойбонов Б.Б., Кравченко М.А., Баронец В.Ю., Толпыго С.М., Костырева М.В., Шабалина А.А., Замолодчикова Т.С., Котов А.В., Панченко Л.Ф. Определение атерогенности иммунных комплексов, содержащих модифицированные липопротеины, в тесте связывания комплемента // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2014. - №4. - С. 133-138.
6. Шойбонов Б.Б., Шойбонова Б.В. Способ определения атерогенности крови // Патент РФ №2497116 от 10.08.2012.
7. Burut D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V. 61, №7. - P. 679-689.
8. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V. 190. - P. 359-369.
9. Szondy E., Mezey Z., Fust G. et al. Serial measurement of circulating immune complexes in myocardial infarction // Br Heart J. - 1981. - V. 46. - P. 93-98.
10. Virella G., Carter R.E., Saad A., et al. Distribution of IgM and IgG antibodies to oxidiesed LDL in immune complexes isolated from patients with type l diabetes and its relationship with nephropathy // Clin. Immunol. - 2008. - V. 127, №3. - P. 394-400.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
АКА - больные с атеросклерозом каротидных артерий
Контр. - группа здоровых лиц без изменений в ИМК каротидных артерий
Figure 00000005
АКА - больные с атеросклерозом каротидных артерий
Контр. - группа здоровых лиц без изменений в ИМК каротидных артерий
Figure 00000006

Claims (1)

  1. Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП), включающий приготовление преципитата из сыворотки крови человека в растворе 9,1% поливинилпирролидона (ПВП), его центрифугирование, отделение супернатанта декантацией, определение содержания холестерина в иммунных комплексах, степени связывания комплемента (ССК) и атерогенности как отношение ССК к холестерину в ИК-ммЛНП, отличающийся тем, что специфическую преципитацию ИК-ммЛНП проводят путем инкубации супернатанта в течение 30 минут при 4°С, затем образовавшиеся агрегаты ИК-ммЛНП осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 3100g, декантируют и преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000.
RU2016129987A 2016-07-21 2016-07-21 Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины RU2632118C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016129987A RU2632118C1 (ru) 2016-07-21 2016-07-21 Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016129987A RU2632118C1 (ru) 2016-07-21 2016-07-21 Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2632118C1 true RU2632118C1 (ru) 2017-10-02

Family

ID=60040574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016129987A RU2632118C1 (ru) 2016-07-21 2016-07-21 Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2632118C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2680848C1 (ru) * 2017-10-17 2019-02-28 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) Способ оценки характера аутоиммунной реакции организма человека на множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в литическом тесте

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013036926A2 (en) * 2011-09-09 2013-03-14 Texas Heart Institute Identification of specific apolipoprotein epitopes on circulating atherogenic low-density lipoprotein
RU2497116C1 (ru) * 2012-08-10 2013-10-27 Батожаб Батожаргалович Шойбонов Способ определения атерогенности крови человека
RU2501013C1 (ru) * 2012-07-26 2013-12-10 Батожаб Батожаргалович Шойбонов Способ определения минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности в сыворотке или плазме крови человека
RU2530627C2 (ru) * 2012-12-20 2014-10-10 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Нии Общей Патологии И Патофизиологии" Рамн Экспресс-способ определения холестерина в иммунных комплексах
RU2549467C1 (ru) * 2013-12-19 2015-04-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИНФ им. П.К. Анохина" РАМН) Способ определения атерогенности иммунных комплексов
RU2592238C1 (ru) * 2015-01-15 2016-07-20 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина" (ФГБНУ "НИИНФ им. П.К. Анохина") Метод выделения и количественного определения множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013036926A2 (en) * 2011-09-09 2013-03-14 Texas Heart Institute Identification of specific apolipoprotein epitopes on circulating atherogenic low-density lipoprotein
RU2501013C1 (ru) * 2012-07-26 2013-12-10 Батожаб Батожаргалович Шойбонов Способ определения минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности в сыворотке или плазме крови человека
RU2497116C1 (ru) * 2012-08-10 2013-10-27 Батожаб Батожаргалович Шойбонов Способ определения атерогенности крови человека
RU2530627C2 (ru) * 2012-12-20 2014-10-10 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Нии Общей Патологии И Патофизиологии" Рамн Экспресс-способ определения холестерина в иммунных комплексах
RU2549467C1 (ru) * 2013-12-19 2015-04-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИНФ им. П.К. Анохина" РАМН) Способ определения атерогенности иммунных комплексов
RU2592238C1 (ru) * 2015-01-15 2016-07-20 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина" (ФГБНУ "НИИНФ им. П.К. Анохина") Метод выделения и количественного определения множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VIRELLA G. et al. Distribution of IgM and IgG antibodies to oxidiesed LDL in immune complexes isolated from patients with type 1 diabetes and its relationship with nephropathy. Clin. Immunol. 2008. V.127, 3. P.394-400, abstract. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2680848C1 (ru) * 2017-10-17 2019-02-28 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) Способ оценки характера аутоиммунной реакции организма человека на множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в литическом тесте

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cammarata et al. Serum anti-γ-globulin and antinuclear factors in the aged
Galvao-Castro et al. Polyclonal B cell activation, circulating immune complexes and autoimmunity in human american visceral leishmaniasis.
Ruddy et al. Hereditary deficiency of the second component of complement (C2) in man: correlation of C2 haemolytic activity with immunochemical measurements of C2 protein
Morgan et al. The occurrence of A, B and O blood group substances in pseudo-mucinous ovarian cyst fluids
Grotz et al. Hypocomplementemic urticarial vasculitis syndrome: an interdisciplinary challenge
Vaughan Serum responses in rheumatoid arthritis
Füst et al. Studies on the occurrence of circulating immune complexes in vascular diseases
RU2635516C2 (ru) Способы и устройство для обнаружения глютеновой чувствительности и ее дифференцирования с целиакией
Kobayashi et al. A 75-kD autoantigen recognized by sera from patients with X-linked autoimmune enteropathy associated with nephropathy
Wakaki et al. Tubulointerstitial nephritis and uveitis syndrome with autoantibody directed to renal tubular cells
Molnár et al. Decreased mucosal expression of intestinal alkaline phosphatase in children with coeliac disease
Dörner et al. Significantly increased maternal and fetal IgG autoantibody levels to 52 kD Ro (SS-A) and La (SS-B) in complete congenital heart block
Naranjo et al. Circulating immune-complexes of IgG/IgM bound to B2-glycoprotein-I associated with complement consumption and thrombocytopenia in antiphospholipid syndrome
Monier et al. Clinical and laboratory features of canine lupus syndromes
RU2444014C1 (ru) Среда и способ определения множественно модифицированных липопротеинов сыворотки крови человека
RU2632118C1 (ru) Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины
Vojdani et al. Differentiation between celiac disease, nonceliac gluten sensitivity, and their overlapping with Crohn’s disease: a case series
Fong et al. Ulcerative colitis with anti‐erythrocyte antibodies
Ho et al. A pilot study evaluating novel urinary biomarkers for Crohn’s disease
Kohno et al. Anti-thyroid peroxidase antibody activity in sera of patients with systemic lupus erythematosus.
Sakamaki et al. Autoantibodies against the specific epitope of human tropomyosin (s) detected by a peptide based enzyme immunoassay in sera of patients with ulcerative colitis show antibody dependent cell mediated cytotoxicity against HLA-DPw9 transfected L cells
Merra et al. Propionyl-L-carnitine hydrochloride for treatment of mild to moderate colonic inflammatory bowel diseases
Kaplan et al. The role of oxidative stress in the etiopathogenesis of gluten-sensitive enteropathy disease
Contreras et al. Physiological aspects of circulating immune complexes in the normal population.
RU2530627C2 (ru) Экспресс-способ определения холестерина в иммунных комплексах

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner