RU2680848C1 - Способ оценки характера аутоиммунной реакции организма человека на множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в литическом тесте - Google Patents
Способ оценки характера аутоиммунной реакции организма человека на множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в литическом тесте Download PDFInfo
- Publication number
- RU2680848C1 RU2680848C1 RU2017136546A RU2017136546A RU2680848C1 RU 2680848 C1 RU2680848 C1 RU 2680848C1 RU 2017136546 A RU2017136546 A RU 2017136546A RU 2017136546 A RU2017136546 A RU 2017136546A RU 2680848 C1 RU2680848 C1 RU 2680848C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mmlnp
- mmldl
- lytic activity
- ula
- immune complexes
- Prior art date
Links
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 title abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 7
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 24
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 108010071584 oxidized low density lipoprotein Proteins 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 102000016752 1-Alkyl-2-acetylglycerophosphocholine Esterase Human genes 0.000 description 1
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical class CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000036523 atherogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для оценки литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности. Способ включает приготовление преципитата из сыворотки крови человека путем инкубации супернатанта, полученного после предварительного осаждения множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) буфером, содержащим 20% поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), в течение 30 мин при 4°С. Затем образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов, содержащих ммЛНП (ИК-ммЛНП) осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 31000 g, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000 и пределяют содержание холестерина в иммунных комплексах. К пробам ммЛНП и ИК-ммЛНП добавляют стандартизованные эритроциты барана, инкубируют в течение 24 ч при 37°С, рассчитывают коэффициент удельной литической активности (К) ммЛНП и ИК-ммЛНП как отношение степени лизиса к холестерину в этих комплексах, сопоставляют величину КммЛНП и ИК-ммЛНП у обследуемого человека. В случае снижения данного коэффициента ИК-ммЛНП по сравнению с КммЛНП оценивается как нейтрализация литической активности. При противоположном эффекте, при тенденции к увеличению данного коэффициента ИК-ммЛНП, оценивается как возрастание литической активности. Равные величины К(ммЛНП) и К(ИК-ммЛНП) свидетельствуют о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах, не влияют на литическую активность. Использование данного изобретения позволяет оценить характер аутоиммунной реакции организма на ммЛНП для раннего прогноза течения и контроля эффективности патогенетической терапии атеросклероза.1 пр., 7 табл., 1 ил.
Description
Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для оценки литической активности иммунных комплексов, содержащих множественно-модифицированные липопротеины низкой плотности (ИК-ммЛНП), для прогноза течения заболеваний, связанных с повышенным уровнем ммЛНП (атеросклероз, гестоз, сахарный диабет, и.т.д.), так и для разработки препаратов, уменьшающих патогенность ммЛНП и иммунных комплексов, содержащих ммЛНП.
Атеросклероз является сложным, периодически обостряющимся хроническим воспалительным процессом повреждения сосудов, развивающимся на фоне нарушений холестеринового обмена, который приводит к структурной модификации сосудистого эндотелия и разрастанию соединительной ткани, обуславливая формирование атеросклеротической бляшки. Атеросклероз и его осложнения - ишемическая болезнь сердца, инсульт, поражение сосудов нижних конечностей продолжают оставаться наиболее частой причиной инвалидизации и смертности населения в экономически развитых странах Европы, США и особенно России [European Guidelines on Cardiovascular Disease // Eur. Heart J. - 2003. - V. 24 №17. - P. 1601-1610; NCEP. Adult Treatment Panel III Guidelines // Circulation. - 2004. - V. 110. - P. 227-239; ВНОК Российские рекомендации. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. М. - 2004. - 36 с.].
Заболевание начинается с накопления липопротеинов, в первую очередь, липопротеинов низкой плотности (ЛНП), во внеклеточном матриксе сосудов. Данные частицы ЛНП агрегируют и подвергаются модификации в результате окисления. Модифицированные окислением ЛНП (моЛНП) являются токсичными и повреждают сосуды, вызывая воспаление и фиброз [Steinberg D. The LDL modification hypothesis of atherogenesis: an update // J. Lipid Res. - 2009. - V. 50. - P. S376-S381]. Параллельно с окислением ЛНП обретают иммуногенные свойства и в организме синтезируются аутоантитела к моЛНП и образуются иммунные комплексы, содержащие моЛНП. Аутоантитела, образующиеся против неоэпитопов моЛНП, определяются в крови и титр этих антител коррелирует с тяжестью атеросклероза, и рассматривается в качестве маркера заболевания [Itabe Н., Mori М., Higashi Y., and Takano Т. Minimally modified LDL is an oxidized LDL enriched with oxidized phosphatidylcholines //J Biochem. - 2003. - V. 134. - P. 459-465; Tsimikas S. Oxidative biomarkers in the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease //Am J Cardiol. - 2006. - V. 98. - P. 9Р-17Р].
В качестве прототипа использован способ определения литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) [Патент РФ №2577719 от 20.03.2016 г. ]. Суть способа заключается в том, что предварительно из сыворотки крови человека выделяют ммЛНП путем обработки раствором 20% поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), инкубируют, образовавшиеся агрегаты ммЛНП осаждают центрифугированием, декантируют, осадок ммЛНП растворяют в буфере без ПВП-35000, добавляют отмытые стандартизованные эритроциты барана, инкубируют в течение 48 часов при комнатной температуре, измеряют фотометрически оптическую плотность проб при длине волны 620 нм, по калибровочному графику определяют степень лизиса и при лизисе более 10% констатируют повышенную литическую активность ммЛНП.
Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала лабораторных тестов для оценки литической активности ИК-ммЛНП путем сравнения величин коэффициентов удельной литической активности ммЛНП и иммунных комплексов, содержащих ммЛНП (ИК-ммЛНП) для раннего прогноза течения и контроля эффективности патогенетической терапии атеросклероза в условиях клинико-диагностических лабораторий.
Этот результат достигается тем, что специфическую преципитацию ИК-ммЛНП, из сыворотки крови человека проводят путем инкубации супернатанта, полученного после предварительного осаждения множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) буфером, содержащим 20% поливинилпирролидона (ПВП) с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), в течение 30 минут при 4°С, затем образовавшиеся агрегаты (ИК-ммЛНП) осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 3100g, тщательно декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000 и определяют содержание холестерина, с использованием коммерческих ферментативных наборов. К пробам ммЛНП и ИК-ммЛНП добавляют стандартизованные эритроциты барана, инкубируют в течение 24 часов при 37°С, рассчитывают коэффициент удельной литической активности (КУЛА) ммЛНП и ИК-ммЛНП как отношение степени лизиса к холестерину в этих комплексах, сопоставляют величину КУЛА ммЛНП и ИК-ммЛНП у обследуемого человека, в случае снижения данного коэффициента ИК-ммЛНП по сравнению с КУЛА ммЛНП - оценивается как нейтрализация литической активности, при противоположном эффекте, при тенденции к увеличению данного коэффициента ИК-ммЛНП - оценивается как возрастание литической активности, равные величины КУЛА (ммЛНП) и КУЛА (ИК-ммЛНП) свидетельствуют о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах не влияют на литическую активность.
Способ осуществляют следующим образом: проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, готовят сыворотку крови. Приготовление ммЛНП и ИК-ммЛНП, описано в работе [Патент №2632118 от 02.10.2017 г]. Кратко: к 100 мкл сыворотки крови добавляют 84 мкл буфера, содержащего 20% ПВП-35000 (конечная концентрация ПВП-35000 в пробе составляет 9,1%), тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Агрегированные ммЛНП осаждают центрифугированием, тщательно отбирают супернатант и инкубируют его в течение 30 мин при 4°С. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов, содержащих ИК-ммЛНП, осаждают центрифугированием при 4°С при 3100g в течение 10 мин, тщательно декантируют и преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000. К 10 мкл препаратов ммЛНП и ИК-ммЛНП, приготовленных из сыворотки крови индивидуумов, добавляют 50 мкл стандартизованные эритроциты барана (1,5×108 кл/мл), общий объем доводят до 100 мкл буфером VBS2+, инкубируют в течение 24 часов при 37°С, измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 620 нм и по калибровочному графику определяют степень лизиса. Рассчитывают коэффициент удельной литической активности (КУЛА) ммЛНП и ИК-ммЛНП как отношение степени лизиса к холестерину в этих комплексах, сопоставляют величину КУЛА ммЛНП и ИК-ммЛНП у обследуемого человека, в случае снижения данного коэффициента ИК-ммЛНП по сравнению с КУЛА ммЛНП - оценивается как нейтрализация литической активности, при противоположном эффекте, при тенденции к увеличению данного коэффициента ИК-ммЛНП - оценивается как возрастание литической активности, равные величины КУЛА (ммЛНП) и КУЛА (ИК-ммЛНП) свидетельствуют о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах не влияют на литическую активность.
Для выделения иммунных комплексов, содержащих ммЛНП используют:
- Буфер-1 для преципитации множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности, который содержит 20% ПВП-35000 в 0,01 М трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;
- Буфер-2 для растворения преципитата иммунных комплексов, который представляет собой 0,01М Трис-HCl-буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 M NaCl.
Изобретение поясняется фигурой 1 на которой представлен калибровочный график для определения степени лизиса эритроцитов барана по оптической плотности при длине волны 620 нм.
Определение оптимальной концентрации эритроцитов барана для теста определения литической активности ИК-ммЛНП. Эритроциты барана (Е) 3 раза отмывают в вероналовом солевом буфере (VBS2+) центрифугированием в течение 10 мин при 2500 об/мин. Строят график зависимости оптической плотности суспензии эритроцитов (при длине волны 620 нм) от концентрации эритроцитов. Для этого 1% суспензию эритроцитов прогрессивно разводят в плоскодонной 96-ти луночной иммунологической планшете в объеме 100 мкл 0,15М NaCl. Тщательно перемешивают и измеряют на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 620 нм. Результаты представлены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, наблюдается линейная зависимость оптической плотности суспензии эритроцитов от концентрации в растворе до А620 равной 0,56 ЕД. Свыше 0,56 ЕД при А620 данная зависимость - нелинейная. Поэтому для теста определения литической активности ИК-ммЛНП нами выбрана концентрация суспензии Е, которая в объеме 100 мкл в лунке 96-луночного планшета дает оптическую плотность, равную 0,40-0,56 ЕД (1,5×108 кл/мл). Для определения степени лизиса эритроцитов нами предложен калибровочный график, в котором степень лизиса эритроцитов оценивают по снижению оптической плотности при длине волны 620 нм. За 0% лизиса принимают оптическую плотность контроля эритроцитов на спонтанный лизис (50 мкл Е + 50 мкл VBS2+), соответственно за 100% лизис принимают оптическую плотность контроля на полный лизис (50 мкл Е + 50 мкл H2O). Степень лизиса эритроцитов оценивают после 24-ти часовой инкубации при 37°С по калибровочному графику, представленному на фиг. 1.
Как видно из фиг. 1, калибровочный график позволяет определять степень лизиса эритроцитов в процентах по оптической плотности пробы без стадии центрифугирования и измерения гемоглобина в супернатанте и последующего расчета степени лизиса эритроцитов, что существенно упрощает регистрацию результатов анализа литической активности ИК-ммЛНП в рутинных исследованиях.
Выделение иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеинов низкой плотности. ИК-ммЛНП выделяли, как описано в работе [Патент №2632118 от 02.10.2017 г, бюлл. №28]. На первом этапе из индивидуальных сывороток крови выделяют ммЛНП путем добавления к 100 мкл сыворотки 84 мкл буфера, содержащего 20% ПВП (конечная концентрация ПВП-35000 составляет 9,1%), и инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре. Агрегированные в этих условиях ммЛНП осаждают центрифугированием при 3100g в течение 10 мин при 23°С, тщательно отбирают супернатант, преципитат ммЛНП растворяют в 100 мкл Буфера-2. Далее супернатант, приготовленный как описано выше, инкубируют при 4°С в течение 30 минут. Агрегированные иммунные комплексы осаждают путем центрифугирования при 3100g в течение 10 мин при 4°С. реципитат ИК-ммЛНП тщательно декантируют и полученный осадок ресуспендируют в исходном объеме, в 100 мкл буфера-2. После растворения осадков в полученных фракциях ммЛНП и ИК-ммЛНП определяют содержание холестерина с использованием коммерческих ферментных наборов. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, содержание холестерина в ммЛНП в среднем составил 53,4 мг/дл (колебания от 13,5 мг/дл до 116,4 мг/дл). Содержание холестерина в ИК-ммЛНП в среднем составил 22,6 мг/дл (колебания от 1,8 мг/дл до 68,8 мг/дл). Причем в 15 пробах ИК-ммЛНП уровень холестерина был менее 10 мг/дл.
Таким образом, во всех пробах содержание холестерина в ммЛНП было повышенным, в то время как холестерин в ИК-ммЛНП в 29% тестированных проб был менее 10 мг/дл.
Пример 1. Определение литической активности ммЛНП и ИК-ммЛНП, приготовленных из сыворотки крови беременных женщин.
Литическую активность ИК-ммЛНП определяли аналогично определению литической активности ммЛНП как описано в патенте РФ №2577719 от 20.03.2016 г. Литический тест проводят в 96-луночных плоскодонных иммунологических планшетах. Вначале вносят в лунки по 10 мкл ммЛНП или ИК-ммЛНП, затем добавляют 40 мкл буфера VBS2+ и 50 мкл суспензии стандартизованных (1,5×108 кл/мл) эритроцитов барана. Параллельно ставят контроли: на полный лизис (50 мкл суспензии эритроцитов барана +50 мкл H2O); на спонтанный лизис (50 мкл эритроцитов барана +50 мкл буфера VBS2+). Планшету заклеивают пленкой и оставляют на 24 часа при 37°С. После инкубации планшету тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность проб на фотометре для иммуноферментного анализа при длине волны 620 нм и по калибровочному графику определяют степень лизиса. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, по литической активности исследованные пробы мм ЛНП распределяются на три группы:
1 группа с низкой литической активностью (% лизиса менее 11%), всего 5 проб;
2 группа - со средней литической активностью (% лизиса от 12% до 50%), всего 20 проб;
3 группа - с высокой литической активностью (% лизиса более 51%), всего 26 проб.
Таким же образом по величине литической активности пробы ИК-ммЛНП также распределяются на три группы:
1 группа с низкой литической активностью (менее 11%). Всего 15 проб;
2 группа - со средней литической активностью (%>лизиса от 12% до 50%). Всего 30 проб;
3 группа - с высокой литической активностью (лизис более 51%). Всего 6 проб.
Таким образом, данное условное распределение по группам было бы корректным при равном количестве холестерина в ммЛНП и ИК-ммЛНП. С другой стороны, тест определения литической активности данных физиологических макромолекулярных комплексов является функциональным и поэтому требуется стандартизация литической активности с учетом содержания холестерина в данных комплексах через расчетный коэффициент, коэфициент удельной литической активности (КУЛА).
Расчет коэффициента удельной литической активности (КУЛА) ммЛНП и ИК-ммЛНП, Для комплексной оценки литической активности ммЛНП и ИК-ммЛНП предложен коэффициент удельной литической активности, который представляет собой отношение степени лизиса эритроцитов к холестерину в индивидуальных пробах ммЛНП и ИК-ммЛНП, приготовленных из сыворотки крови одного и того же человека. Полученные значения КУЛА представлены в таблице 4.
Как видно из данных, представленных в таблице 4, по величине коэффициентов удельной литической активности (КУЛА) пробы ммЛНП условно делятся на три группы:
1 группа - 24 пробы с низким КУЛА (менее 1,0 ЕД);
2 группа - 23 пробы со средним значением КУЛА (от 1,0 ЕД до 2,0 ЕД);
3 группа - 4 пробы с высоким КУЛА (более 2 ЕД).
Аналогично, пробы ИК-ммЛНП по величине КУЛА также делятся на три группы:
1 группа - 19 пробы с низким КУЛА (менее 1 ЕД);
2 группа - 22 пробы со средним значением КУЛА (от 1,0 ЕД до 2,0 ЕД);
3 группа - 10 проб с КУЛА (более 2,0 ЕД).
Анализ величины коэффициентов в парах ммЛНП и ИК-ммЛНП свидетельствует о разнонаправленных сдвигах, т.е. в одних пробах наблюдается возрастание КУЛА, в других, наоборот, снижение данного коэффициента. В третьей группе КУЛА остается постоянным.
Таким образом, для оценки литической активности иммунных комплексов, содержащих ммЛНП, в предлагаемом тесте проводится анализ в парных пробах величины КУЛА (ммЛНП и ИК-ммЛНП). Результаты парного анализа свидетельствуют:
1. В случае снижения величины КУЛА ИК-ммЛНП по сравнению с КУЛА ммЛНП в парных пробах характер аутоиммунной реакции организма на ммЛНП оценивается как протективный (благоприятный). Эффект нейтрализации литической активности при взаимодействии аутоантител с ммЛНП, возможно, связан либо с нейтрализацией липопротеин-ассоциированной фосфолипаза А2, либо нейтрализацией лизофосфатидилхолина в молекуле ммЛНП в иммунных комплексах, либо связывание аутоантител с ммЛНП вызывает конформационные изменения в молекуле липопротеина, приводя к снижению патогенности в литическом тесте (см. таблицу 5);
2. В случае возрастания величины КУЛА в парных пробах ммЛНП и ИК-ммЛНП характер аутоиммунной реакции организма на ммЛНП оценивается как про-воспалительный (патогенный) ответ на ммЛНП. Возможно, возрастание патогенности (литической активности) ммЛНП в составе иммунных комплексов связано с конформационными изменениями в молекуле липопротеина. Данный факт является абсолютно новым эффектом для иммунных реакций, (см. таблицу 6);
3. В случае равных значений величины КУЛА в парах ммЛНП и ИК-ммЛНП, с одной стороны, имеет значение величина данного коэффициента для оценки патогенности, с другой стороны, данный факт свидетельствует о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах не влияют на литическую активность данных комплексов. При данной ситуации патогенный эффект ммЛНП и ИК-ммЛНП зависит только от концентрации их в крови обследуемого индивидуума (таблица 7).
Таким образом, способ оценки литической активности ИК-ммЛНП в организме человека позволяет проводить диагностику течения атеросклеротического процесса, расширяет возможности для коррекции проводимой терапии под контролем коэффициента удельной литической активности ммЛНП и ИК-ммЛНП, открывает новый подход к оценке атерогенности ммЛНП и ИК-ммЛНП «от количественных» показателей к «качественным» (функциональным) показателям. То есть, при нормальном уровне ммЛНП и ИК-ммЛНП патологический процесс, обусловленный данными комплексами может протекать с разной скоростью, в зависимости от коэффициента удельной литической активности, т.е. от патогенности данных комплексов.
Предлагаемый способ прост в выполнении, не требует дорогостоящих реактивов и оборудования. Для регистрации лизиса эритроцитов не требуется стадия центрифугирования Использование простого и информативного способа оценки характера аутоиммунной реакции организма на естественный метаболит, ИК-ммЛНП, позволяет проводить скрининг и выявлять людей с острым течением патологического, в частности, атеросклеротического процесса, как на доклинических стадиях заболевания, так и при клиническом атеросклерозе.
Claims (1)
- Способ оценки литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности, включающий приготовление преципитата из сыворотки крови человека путем инкубации супернатанта, полученного после предварительного осаждения множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛНП) буфером, содержащим 20% поливинилпирролидона с молекулярной массой 35000 (ПВП-35000), в течение 30 мин при 4°С, затем образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов, содержащих ммЛНП (ИК-ммЛНП), осаждают центрифугированием при 4°С в течение 10 мин при 31000 g, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПВП-35000, определяют содержание холестерина в иммунных комплексах, отличающийся тем, что к пробам ммЛНП и ИК-ммЛНП добавляют стандартизованные эритроциты барана, инкубируют в течение 24 ч при 37°С, рассчитывают коэффициент удельной литической активности (КУЛА) ммЛНП и ИК-ммЛНП как отношение степени лизиса к холестерину в этих комплексах, сопоставляют величину КУЛА ммЛНП и ИК-ммЛНП у обследуемого человека, в случае снижения данного коэффициента ИК-ммЛНП по сравнению с КУЛА ммЛНП оценивается как нейтрализация литической активности, при противоположном эффекте, при тенденции к увеличению данного коэффициента ИК-ммЛНП, оценивается как возрастание литической активности, равные величины КУЛА (ммЛНП) и КУЛА (ИК-ммЛНП) свидетельствуют о том, что аутоантитела, связываясь с ммЛНП в иммунных комплексах, не влияют на литическую активность.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136546A RU2680848C1 (ru) | 2017-10-17 | 2017-10-17 | Способ оценки характера аутоиммунной реакции организма человека на множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в литическом тесте |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136546A RU2680848C1 (ru) | 2017-10-17 | 2017-10-17 | Способ оценки характера аутоиммунной реакции организма человека на множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в литическом тесте |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2680848C1 true RU2680848C1 (ru) | 2019-02-28 |
Family
ID=65632564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017136546A RU2680848C1 (ru) | 2017-10-17 | 2017-10-17 | Способ оценки характера аутоиммунной реакции организма человека на множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в литическом тесте |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2680848C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113804593A (zh) * | 2020-06-11 | 2021-12-17 | 北京科兴生物制品有限公司 | 一种裂解疫苗裂解效果的检测方法及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2444014C1 (ru) * | 2010-08-24 | 2012-02-27 | Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Нии Общей Патологии И Патофизиологии Рамн | Среда и способ определения множественно модифицированных липопротеинов сыворотки крови человека |
| WO2013036926A2 (en) * | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Texas Heart Institute | Identification of specific apolipoprotein epitopes on circulating atherogenic low-density lipoprotein |
| RU2577719C1 (ru) * | 2015-01-15 | 2016-03-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина" (ФГБНУ "НИИНФ им. П.К. Анохина") | Способ определения литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности |
| RU2632118C1 (ru) * | 2016-07-21 | 2017-10-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины |
-
2017
- 2017-10-17 RU RU2017136546A patent/RU2680848C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2444014C1 (ru) * | 2010-08-24 | 2012-02-27 | Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Нии Общей Патологии И Патофизиологии Рамн | Среда и способ определения множественно модифицированных липопротеинов сыворотки крови человека |
| WO2013036926A2 (en) * | 2011-09-09 | 2013-03-14 | Texas Heart Institute | Identification of specific apolipoprotein epitopes on circulating atherogenic low-density lipoprotein |
| RU2577719C1 (ru) * | 2015-01-15 | 2016-03-20 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина" (ФГБНУ "НИИНФ им. П.К. Анохина") | Способ определения литической активности множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности |
| RU2632118C1 (ru) * | 2016-07-21 | 2017-10-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Способ выделения и исследования атерогенности иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113804593A (zh) * | 2020-06-11 | 2021-12-17 | 北京科兴生物制品有限公司 | 一种裂解疫苗裂解效果的检测方法及应用 |
| CN113804593B (zh) * | 2020-06-11 | 2024-05-24 | 北京科兴生物制品有限公司 | 一种裂解疫苗裂解效果的检测方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bertini et al. | The metabonomic signature of celiac disease | |
| Rodríguez de Sotillo et al. | Evidence of oxidative stress in temporomandibular disorders: a pilot study | |
| van de Logt et al. | S 100 A 12: A noninvasive marker of inflammation in inflammatory bowel disease | |
| Uysal et al. | The levels of serum pentraxin3, CRP, fetuin-A, and insulin in patients with psoriasis. | |
| Laan et al. | Markers for early sensitization and inflammation in relation to clinical manifestations of atopic disease up to 2 years of age in 133 high‐risk children | |
| Hummel et al. | Postpartum outcomes in women with gestational diabetes and their offspring: POGO study design and first-year results | |
| Magro et al. | C-reactive protein in Crohn’s disease: how informative is it? | |
| JP2019518225A (ja) | 早産を予測する方法及び組成物 | |
| Mete et al. | Association between S100b levels and COVID-19 pneumonia: a case control study | |
| RU2680848C1 (ru) | Способ оценки характера аутоиммунной реакции организма человека на множественно модифицированные липопротеины низкой плотности в литическом тесте | |
| US11181523B2 (en) | Method for the early detection of acute kidney injury in critical patients, using fibroblast growth factor 23, klotho and erythropoietin as biomarkers | |
| Xu et al. | The clinical significance of the SIRT2 expression level in the early stage of sepsis patients | |
| Mentese et al. | Carbonic anhydrase I and II autoantibodies in Behçet's disease. | |
| Cooper et al. | Family history of hypertension and red cell cation transport in high school students | |
| Seven et al. | Comprehensive evaluation of irisin levels in fetomaternal circulation of pregnant women with obesity or gestational diabetes mellitus | |
| RU2618447C2 (ru) | Способ оценки степени тяжести интоксикации | |
| Tada et al. | Renal glucosuria is not associated with atherosclerotic cardiovascular disease outcome in a general Japanese community | |
| Wang et al. | The Value of Urine NAG, NGAL Combined with Serum Cys-C in Early Diagnosis of Neonatal Hyperbilirubinemia-related Acute Kidney Injury. | |
| RU2549467C1 (ru) | Способ определения атерогенности иммунных комплексов | |
| RU2523413C1 (ru) | СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕВМАТОИДНОГО АРТИРИТА ПО НАЛИЧИЮ АНТИТЕЛ К МОДИФИЦИРОВАННОМУ ЦИНТРУЛЛИНИРОВАННОМУ ВИМЕНТИНУ (Anti-MCV) В РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ | |
| Dzudzor et al. | Serum 25‐hydroxyvitamin D and hyaluronic acid levels as markers of fibrosis in patients with chronic liver disease at the main tertiary referral hospital in Ghana: A case‐control study design | |
| Hassaan et al. | Fatty Acid Binding Protein (1 & 2) as Markers of Diabetic Nephropathy in Elderly Patients with Type 2 Diabetes Mellitus | |
| RU2388412C1 (ru) | Способ оценки степени тяжести трофологической недостаточности у больных хронической обструктивной болезнью легких | |
| JPWO2014034168A1 (ja) | 早期腎障害の評価マーカーとその測定方法 | |
| RU2633749C1 (ru) | Способ диагностики пищевой аллергии |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |