RU2627177C2 - Способ определения биологической активности дефибротида, основанный на применении эуглобулина - Google Patents

Способ определения биологической активности дефибротида, основанный на применении эуглобулина Download PDF

Info

Publication number
RU2627177C2
RU2627177C2 RU2014149089A RU2014149089A RU2627177C2 RU 2627177 C2 RU2627177 C2 RU 2627177C2 RU 2014149089 A RU2014149089 A RU 2014149089A RU 2014149089 A RU2014149089 A RU 2014149089A RU 2627177 C2 RU2627177 C2 RU 2627177C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
defibrotide
plasmin
euglobulin
substrate
biological activity
Prior art date
Application number
RU2014149089A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2014149089A (ru
Inventor
Теренцио ИНЬОНИ
Виджей КУМАР
Кхалид ИСЛАМ
Original Assignee
Джентиум С.Р.Л.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46829846&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2627177(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Джентиум С.Р.Л. filed Critical Джентиум С.Р.Л.
Publication of RU2014149089A publication Critical patent/RU2014149089A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2627177C2 publication Critical patent/RU2627177C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/127—DNAzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения биологической активности дефибротида. Приводят в контакт дефибротид, эуглобулин млекопитающего и субстрат, специфичный для плазмина, который в результате реакции с плазмином дает измеряемый продукт. Субстрат, специфичный для плазмина, представляет собой соединение формулы А1-А2-А3-Х, где A1 и А2 являются неполярными аминокислотами, А3 является лизином или аргинином и X является измеряемым продуктом. Измеряемый продукт выбирают из группы, состоящей из пара-нитроанилина и 2-нафтиламина. Измеряют количества образовавшегося продукта в последовательных временных точках для определения биологической активности дефибротида. Изобретение обеспечивает точные и правильные измерения активности дефибротида даже в присутствии примесей, таких как, например, РНК, гепарин, деградированный дефибротид. Способ является чувствительным для обнаружения концентраций дефибротида, равных или меньших чем 2,5 мкг/мл, и дает хорошую корреляцию до максимальных величин концентраций, равных или более высоких чем 1000 мкг/мл. 13 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл.

Description

Изобретение относится к способу определения биологической активности дефибротида и, в частности, к непрямому ферментативному способу определения биологической активности дефибротида.
Область техники, к которой относится изобретение
Дефибротид (Merck Index, 1996, no. 2915) является веществом природного происхождения, которое получают экстракцией из органов животных и которое состоит из натриевой соли полидезоксирибонуклеотидов с низкой молекулярной массой. Дефибротид является предметом многочисленных фармакологических исследований, которые позволили предположить, что он может применяться в терапии в качестве антитромботического агента (патент США US 3829567).
Кроме того, дефибротид также успешно использовался в лечении периферических артериопатий, при острой почечной недостаточности (патент США US 4694134) или при острой ишемии миокарда (патент США US 4693995).
В настоящее время дефибротид проходит клинические испытания на предмет применения в лечении и профилактике веноокклюзионной болезни (ВОБ).
Подобно другим биологическим веществам, которые получают экстракцией, дефибротид является также предметом ограниченной вариабельности состава, что типично для природных биополимеров. Классическим примером данного явления является гепарин, вариабельность которого от партии к партии в отношении длины цепи, молекулярной массы, состава, степени сульфатирования и т.д. хорошо известна. Следствием этого является то, что одни и те же количества по массе дефибротида могут быть фактически неэквивалентными с точки зрения специфической биологической активности.
Процесс экстракции, выделения и очистки не может per se гарантировать абсолютную воспроизводимость этого продукта именно вследствие присущей ему биополимерной структуры.
Однако, при надлежащем контроле, можно уменьшить эту вариабельность: для этой цели проводились исследования стандартизованных промышленных процессов для выделения дефибротида экстракцией из органов, такие как, например, исследования, описанные в патенте США US 4985552.
Продукт, полученный в соответствии с вышеупомянутым процессом, характеризуется путем определения некоторых специфических физико-химических параметров, таких как, например, электрофоретическая подвижность, коэффициент экстинкции, способность к оптическому вращению и средняя относительная молекулярная масса. Однако эти параметры зависят, в основном, от структуры дефибротида и не могут обеспечить информацию о его биологической активности.
Насколько известно авторам заявленного изобретения, единственными способами, которые, как сообщалось до настоящего времени, использовались для оценки биологической активности дефибротида, являются чашечный тест определения лизиса фибрина и тромбоэластографическая регистрация времени лизиса эуглобулина [Prino G., Mantovani М., Niada R., Coccheri S., Butti A., Indagini preliminari sull'attività fibrinolitica, nell'animale e nell'uomo, di una nuova sostanza presente in diversi organi animali, Simposio Internazionale: La ricerca scientifica nell'industria farmaceutica in Italia, Rome, 2-4 Oct. 1975 - II Farmaco, Ed. Prat.) (1969), 24, 552-561] и основанный на применении плазмина способ, раскрытый в патенте США US 7338777, упомянутый в данном описании в ссылочном порядке.
Однако вышеупомянутый способ тромбоэластографической регистрации времени лизиса эуглобулина отличается значительной экспериментальной сложностью, неудовлетворительными воспроизводимостью и точностью и в конкретном случае тромбоэластографической регистрации линейностью ответа, ограниченной очень узкими диапазонами концентраций.
Ферментативную активность плазмина обычно определяют различными стандартными тестами in vitro. Одним из наиболее часто используемых способов является определение при помощи спектрофотометрии или флуориметрии хромогенных или флуорогенных соединений, которые высвобождаются посредством действия плазмина на различные субстраты (Haemostasis, (1978), 7, 138-145). Обычно используют пептидные субстраты, имеющие формулу A1-A2-A3-X, где A1 и A2 являются аминокислотами, которые являются преимущественно неполярными, A3 является лизином или аргинином и X представляет измеряемое высвобождающееся соединение, например пара-нитроанилин (pNa) или 2-нафтиламин (NA) (Haemostasis, (1978), 7, 146-149). Кроме вышеупомянутых пептидных субстратов, успех был достигнут с использованием других, более простых, соединений, таких как, например, п-нитробензил-п-толуолсульфонил-L-аргинин (Haemostasis, (1978), 7, 105-108).
В этих тестах скорость, с которой соединение X высвобождается в инкубационную среду, пропорциональна активности (в Международных Единицах/мг) плазмина, присутствующего в пробе.
Данный способ проводят в ТРИС-буфере без какого-либо другого плазменного/сывороточного активатора/ингибитора. Тем не менее, процедура не отражает физиологического состояния и не моделирует с какой-либо точностью механизм действия дефибротида in vivo.
Таким образом, до настоящего времени не были описаны и испытаны достоверные, точные и воспроизводимые способы определения биологической активности дефибротида, отражающие точным образом механизм действия продукта в комплексной биологической системе (in vivo).
Авторы заявленного изобретения разработали простой и надежный способ определения биологической активности дефибротида, который позволяет контролировать образцы, получаемые экстракцией и, следовательно, позволяет стандартизировать медицинские препараты на основе дефибротида.
Способ, к которому относится данное изобретение, позволяет определять специфическую биологическую активность дефибротида в сравнении со стандартным эталоном с высокой точностью и надежностью.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет кинетику высвобождения pNA из субстрата S-2251 под действием фракции эуглобулина млекопитающего, который активирован и не активирован дефибротидом (концентрация 0-50 мкг/мл, 0-100 минут).
Фиг. 2 представляет сигмоидальную кривую, получаемую в зависимости от стандарта и анализируемого образца дефибротида.
Фиг. 3 представляет «плотность в сравнении со временем» стандартных композиций (например: S1_Ca, S1_Cb, S1_Cc) с приемлемым диапазоном линейности (например: от 30 до 35 мин).
Описание изобретения
Данное изобретение относится к способу определения специфической биологической активности образцов дефибротида, включающему этапы:
а) приведения в контакт дефибротида, эуглобулина и субстрата, специфичного для плазмина, который посредством реакции с плазмином обеспечивает измеряемый продукт, и
б) измерения количества образованного продукта в последовательных временных точках.
Способ по заявленному изобретению является непрямым in vitro способом для определения активности дефибротида, который основан на функциональном взаимодействии между дефибротидом и эуглобулином.
Эуглобулин является фракцией сывороточного глобулина, которая нерастворима в дистиллированной воде, но растворима в солевых растворах.
Эуглобулин содержит фибриноген, ингибитор-1 активатора плазминогена, тканевой активатор плазминогена (ТАП, tPA), плазминоген и, в меньшем количестве, альфа2-антиплазмин, а также фактор VIII.
Авторы заявленного изобретения неожиданно обнаружили, что дефибротид катализирует гидролиз плазминогена в плазмин. Таким образом, при инкубации дефибротида эуглобулином и субстратом, специфичным для плазмина, например пептидом с формулой A1-A2-A3-X, как описано в Haemostasis, (1978), 7, 138-149, упомянутом в данном описании в ссылочном порядке, скорость, с которой соединение X высвобождается в инкубационную среду, возрастает пропорционально концентрации самого дефибротида.
Иными словами, дефибротид катализирует гидролиз плазминогена, содержащегося в эуглобулине, в плазмин; затем упомянутый плазмин ферментативно реагирует с субстратом, специфичным для плазмина, предпочтительно с хромогенным субстратом, для получения измеряемого продукта.
Следовательно, способ согласно заявленному изобретению дополнительно включает этапы: в) определения скорости высвобождения измеряемого продукта в ходе ферментативной реакции на стандартном и тестовом образцах дефибротида; г) корреляции, математически и/или графически, скорости высвобождения и соответствующей концентрации дефибротида для определения биологической активности тестового образца дефибротида.
Образец дефибротида, используемый для определения в соответствии с заявленным изобретением, обычно получают экстракцией из органов согласно известным процедурам, таким как, например, процедуры, описанные в патенте США US 4985552, который уже упоминался в ссылочном порядке.
Партию обычного, изготовляемого промышленным путем дефибротида выбирали в качестве эталонного образца (стандарта) и использовали для построения калибровочных кривых в соответствии со способом согласно заявленному изобретению.
В общем и целом, данный способ обеспечивает точные и правильные измерения дефибротида даже в присутствии примесей, таких как, например, РНК, гепарин, деградированный дефибротид (дефибротид, из которого был удален пурин или пиримидин) или этанол, при условии, что они находятся в концентрациях, обычно меньших чем 10% по массе, и при этом не нарушающих баланс системы.
Кроме возможности определения дефибротида, данный способ позволяет также определять другие биологически эквивалентные вещества, получаемые из дефибротида, такие как, например, деаминированный дефибротид или, более просто, дефибротид, денатурированный воздействием физико-химических параметров.
Данный способ является достаточно чувствительным для обнаружения концентраций дефибротида, равных или меньших чем 2,5 мкг/мл (конечная концентрация в этой системе определения), и обычно дает хорошую корреляцию до максимальных величин концентраций, равных или более высоких чем 1000 мкг/мл.
Используемый эуглобулин является обычно фракцией эуглобулина любого млекопитающего, таким как, например, бычий, свиной, кроличий или человеческий эуглобулин, причем предпочтительным является человеческий и бычий эуглобулин.
Хотя фракция эуглобулина является предпочтительной ферментативной системой, использование других эквивалентных ферментативних систем, таких как, например, разбавленная плазма и сыворотка (до 1:10 с буферами), искусственные или изолированные сочетания плазминогена, ТПА, урокиназного активатора плазминогена УАП, ингибиторов-1 и -2 активатора плазминогена, альфа2-антиплазмина и подобных ферментативних систем, которые являются химически и биологически родственными и имеют сходную функциональность, находится также в рамках данного изобретения.
В способе по данному изобретению под субстратом для плазмина может пониматься любой субстрат, специфичный для плазмина, который, в условиях заявленного способа, высвобождает детектируемый продукт гидролиза X.
В зависимости от природы детектируемой группы X могут использоваться равным образом успешно альтернативные системы детектирования, обычно известные специалисту в данной области. Спектрофотометрические или флуорометрические системы детектирования являются особенно предпочтительными, в особенности спектрофотометрические системы.
Обычно используемыми субстратами являются субстраты, которые являются специфичными для плазминоген-плазминной пробы. Предпочтительно использовать пептиды формулы A1-A2-A3-X, в которой A1 и A2 являются преимущественно неполярными аминокислотами, A3 является лизином или аргинином и X является детектируемой группой. Примерами таких субстратов являются Val-Leu-Lys-pNa, Val-Phe-Lys-pNa или пиро-Glu-Phe-Lys-pNa, в которых группа X, детектируемая при помощи спектрофотометрии, является пара-нитроанилином (pNa). Другие подходящие субстраты, например, Val-Gly-Arg-2NA, содержат 2-нафтиламин, который измеряют флуорометрией. Особенно предпочтительным субстратом является соединение H-D-валил-L-лейцил-L-лизин-п-нитроанилин (H-D-Val-Leu-Lys-pNa).
Плазмины и специфичные субстраты, используемые для определения активности дефибротида во фракции эуглобулина, являются обычно коммерчески доступными.
Способ определения согласно заявленному изобретению проводят помещением образца дефибротида в раствор эуглобулина при специфических pH и молярности.
В частности, фракции эуглобулина, полученные из плазмы млекопитающего, восстанавливают растворением и разбавлением эуглобулина до первоначального объема в солевом буфере (например, объем фракции эуглобулина, полученный из 10 мл плазмы, растворяют и восстанавливают до 10 мл с солевым буфером при pH от 7 до 8).
Что касается субстрата, концентрации от 0,3 до 4 мМ, предпочтительно от 2,5 до 3,5 мМ и наиболее предпочтительно 3 мМ, используют обычно в случае хромогенного субстрата, тогда как концентрации от 0,05 до 0,15 мМ используют в случае флуорогенного субстрата.
Способ определения согласно заявленному изобретению, подобно другим ферментативним способам, является чувствительным к pH среды.
Фактически он не может применяться при экстремальных значениях pH, при которых ферментативная система была бы инактивирована.
Предпочтительно также, чтобы pH среды не подвергался изменению в любой временной точке во время периода проведения измерений, и, следовательно, фракции эуглобулина обычно забуферивают с использованием буферных систем, выбранных из систем, обычно используемых в биологических тестах. Например, подходящими буферными системами могут быть фосфатный буфер, цитратный буфер или трис(гидроксиметил)аминометан-гидрохлоридный и натрий-хлоридный (ТРИС-NaCl) буфер. Восстановление фракции эуглобулина проводят предпочтительно в присутствии ТРИС-NaCl.
В данном способе обычно предпочтительно поддерживать pH среды в диапазоне приблизительно от 7 до 8, более предпочтительно при приблизительно 7,4.
Кроме того, предпочтительно поддерживать концентрацию буферной системы в диапазоне от 10 до 200 мМ, предпочтительно при приблизительно 50 мМ. Помимо этого, предпочтительно поддерживать концентрацию буферной системы в диапазоне от 10 до 200 мМ, предпочтительно на уровне примерно 50 мМ. Более предпочтительно, концентрацию ТРИС-NaCl поддерживать на уровне 50 мМ для ТРИС и 150 мМ для хлорида натрия.
В частности, для обеспечения возможности замеров предпочтительно предварительно разбавить/растворить дефибротид в ТРИС-NaCl буфере для получения исходного стокового раствора образца и стандарта. Из стоковых растворов, пробу и стандарт разбавляют серийным разбавлением до определенного объема фракции эуглобулина до момента достижения при анализе диапазона концентрации примерно от 1 до 1000 мкг/мл дефибротида. Способ данного изобретения для определения биологической активности дефибротида предусматривает прямое разбавление испытуемых растворов во фракции эуглобулина, с последующим добавлением хромогенного или флуорогенного субстрата. В частности, для обеспечения правильного проведения измерений, предусмотренных данным способом, предпочтительно добавлять плазмин или специфичный субстрат или оба к буферному раствору, содержащему образец дефибротида, перед началом стадии измерения. Субстрат для плазмина предпочтительно добавляют в последнюю очередь.
Важным параметром данного способа определения является температура. Предпочтительно поддерживать одну и ту же температуру на протяжении всей продолжительности измерений и для всех измеряемых образцов как при построении калибровочных кривых, так и во время стадии измерений. Для этой цели предпочтительно использовать прибор с возможностью контроля температуры, а также при необходимости следует проводить несколько серий измерений, изменяя положение образцов таким образом, чтобы гарантировать, что данная система имеет максимальную температурную гомогенность.
Обычно этот способ определения используют в диапазоне температур, например, от 25 до 40°C, предпочтительно от 35 до 39°C и еще более предпочтительно при 37°C.
Согласно заявленному изобретению, измерение концентрации соединения X, высвобождающегося в среду под действием дефибротида, начинают тогда, когда все реагенты были добавлены, и продолжают в течение заранее заданного времени и при заранее заданной частоте в зависимости от химической природы X и системы детектирования.
Подобно другим способам биологического определения, способ по заявленному изобретению также предусматривает этапы калибровки и измерения, которые предпочтительно проводят параллельно для уменьшения, насколько это возможно, экспериментальной погрешности.
Этап калибровки включает в себя получение данных оптической плотности, относящихся к пробам с известными увеличивающимися концентрациями дефибротида (стандарта), статистическую обработку этих данных и экстраполяцию калибровочных кривых, которые выражают корреляцию между увеличением скорости ферментативной реакции данного изобретения и концентрацией дефибротида, присутствующего во фракции эуглобулина. На этапе измерения, благодаря корреляции, полученной на этапе калибровки, возможно определить неизвестные биологические активности образцов дефибротида на основе величин оптической плотности, измеренных и обработанных при тех же самых условиях.
Более подробно, экспериментальный протокол обычно предусматривает подготовку нескольких образцов, как стандартных, так и неизвестных, при различных известных концентрациях дефибротида. Образцы дефибротида готовят последовательным разведением исходных растворов в соответствии с заданным заранее фактором разведения.
В заявленном способе предпочтительно подготовить по меньшей мере 5 концентраций стандарта и 5 концентраций тестируемого образца с получением как минимум 4 повторов по каждой концентрации стандарта и, аналогично, по каждой концентрации тестируемого образца, обычно при последовательном разведении 1:2 исходных растворов.
Концентрации как стандарта, так и анализируемого образца дефибротида обычно равны от 0,1 до 1000 мкг/мл.
Концентрации анализируемого образца имеют предпочтительно тот же самый порядок величин, что и концентрации стандарта.
Согласно приведенной выше иллюстрации, измерения для каждой концентрации предпочтительно проводят на одном микропланшете, где размещение каждого образца, стандарта и анализируемого образца, соответственно, при соответствующей концентрации является предпочтительно измененным. Согласно этой схеме для расположения образцов, которая объясняется более подробно в экспериментальной части, для каждой концентрации как стандарта дефибротида, так и анализируемого образца дефибротида измеряют по меньшей мере 4 значения оптической плотности для каждой временной точки.
Серию измерений, описанных выше, проводят в заданных заранее временных точках, то есть прежде всего во время t0, то есть когда все компоненты были добавлены, перед началом ферментативной реакции согласно заявленному изобретению и затем через точные интервалы и в течение времени, достаточного для получения необходимых данных.
Предпочтительно измерения оптической плотности продолжаются максимально до 90 минут со снятиями показаний, производимыми каждые 1-10 минут. Более предпочтительно снятия показаний производят каждую минуту. Фотометрические снятия показаний оптической плотности проводят при длине волны, которая зависит от характера детектируемой группы X, высвобождаемой в ходе ферментативной гидролитической реакции. В конкретном случае, когда X является pNA, оптическую плотность измеряют при 405 нм.
Показания оптической плотности стандартных и неизвестных образцов дефибротида, известные как исходные данные, обычно напрямую происходят из одного и того же прибора, который обеспечивает операцию снятия показаний; их сводят в таблицу таким образом, чтобы значение оптической плотности присутствовало для каждой временной точки и для каждой лунки.
Затем эти исходные данные подвергают обработке с использованием, например, электронной таблицы Microsoft Excel®. Эта первая операция обработки данных приводит к расчету средней оптической плотности и связанного с ней стандартного отклонения в каждой временной точке и для каждой серии показаний, причем каждая серия показаний содержит по меньшей мере 4 повтора для каждой концентрации как стандарта, так и анализируемого образца дефибротида.
Дальнейшая статистическая обработка данных проводится при помощи коммерчески доступного программного обеспечения для проведения биологических испытаний, как описано Finney D J, Statistical Method in Biological Assay, 2nd ed. Ch. Griffin, London and relevant Pharmacopoeias.
В частности, согласно заявленному изобретению, проведение теста на определение биологической активности дефибротида можно осуществлять с использованием моделей параллельных линий, скошенного коэффициента и логистической кривой четырех параметров, как описано, например, в соответствующих параграфах European Pharmacopoeia General text 5.3, Statistical Analysis.
Как показано на фиг. 1, посредством откладывания времени по абсциссе, а оптической плотности по ординате получают прямые линии, наклон b которых будет пропорционален скорости ферментативной реакции: при увеличении концентрации дефибротида будет увеличиваться скорость гидролиза и пропорционально будет увеличиваться величина b. Наконец, величины наклона, рассчитанные, как описано выше, для каждой серии повторов стандарта дефибротида и анализируемого образца дефибротида, коррелируют с концентрацией дефибротида, к которой они относятся. Вместо реального значения, могут использовать приемлемые математические превращения данных по абсциссе (десятичный логарифм концентрации дефибротида).
Графически эта корреляция дает сигмоидальную кривую для стандарта и сигмоидальную кривую для анализируемого образца (фиг. 2); центральные части этих сигмоидальных кривых дают две прямые линии, которые обычно являются параллельными и расстояние между которыми является функцией разности между биологическими активностями анализируемого образца и стандарта. В этом интервале линейности определяют активность в соответствии с методологией биологического определения с использованием параллельных линий, описанной Finney D J, Statistical Method in Biological Assay, 2nd ed. Ch. Griffin, London.
Для более точного определения используют модели логистических кривых с четырьмя параметрами и в данном случае полную сигмоидальную кривую стандарта и анализируемого образца используют для расчета относительной биологической активности образца.
В предпочтительном воплощении данного изобретения стандартные растворы и растворы образцов дефибротида, которые подлежат определению, вводят в соответствующие лунки микропланшетов. Фракцию эуглобулина готовят в момент использования, и она представляет собой разжижающую среду для исходного раствора дефибротида. Наконец, добавляют раствор, содержащий хромогенный субстрат. Затем этот микропланшет помещают в термостатированный планшет-ридер и после быстрого перемешивания снимают показания оптической плотности этой системы через заданные предварительно интервалы и в течение предварительно заданного периода времени. Затем полученные исходные данные обрабатывают, определяя, таким образом, неизвестные активности образцов дефибротида.
Как показано на нижеследующих примерах, способ согласно заявленному изобретению позволяет получить жидкие композиции дефибротида, предпочтительно водные растворы, с определенной биологической активностью и, в частности, с активностью от 25 до 35 МЕ/мг дефибротида, предпочтительно от 27.5 до 32.5 МЕ/мг и, более предпочтительно, от 28 до 32 МЕ/мг.
Жидкие композиции дефибротида предпочтительно поставляют в продажу в виде наборов, более предпочтительно флаконов, содержащих 200 мг дефибротида в 2.5 мл забуференного водного раствора (предпочтительно при pH от 6.5 до 8.5, более предпочтительно от 7 до 8), для разбавления перед использованием; соответственно, при определении биологической активности при помощи способа согласно заявленному изобретению каждый набор содержит дефибротид активностью от 5000 до 7000 ME, предпочтительно от 5500 до 6500 ME, более предпочтительно от 5600 до 6400.
Эти и другие аспекты данного изобретения будут проиллюстрированы более подробно в следующих примерах, которые, однако, не должны рассматриваться как ограничивающие заявленное изобретение.
Примеры
В приведенных здесь примерах использовали следующие материалы:
Figure 00000001
Программы и программное обеспечение
- Microsoft Excel® (Microsoft Corporation, Redmond, Wash., USA)
Вещества
- Дефибротид (Gentium)
- Хромогенный субстрат S-2251 (Chromogenix Instrumentation Laboratory S.p.A., Milan, Italy)
- Трис(гидроксиметил)аминометан (TPHC)-NaCl, (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
- 1н HCl (Carlo Erba reagenti, Milan, Italy)
- 1 н NaOH (Carlo Erba reagenti, Milan, Italy)
- Бычья плазма (Tebu Bio Italia, Magenta (MI), Italy)
- Уксусная кислота ледяная (Carlo Erba reagenti, Milan, Italy)
Растворы
- ТРИС-NaCl (раствор 1 л): в стакане 1 л L количественно переносят 6.06 г ТРИС-HCl и 2.2 г NaCl. Растворяют в 500 мл очищенной воды и корректируют pH до 7.4 с примерно 40 мл HCl 1N. Количественно переносят раствор в мерную колбу объемом 1 л и разбавляют раствор до объема с очищенной водой. Хранят раствор в холодильнике при (2-8°C).
- Хромогенный субстрат S2251 (CAS 63589-93-5) 3 мМ (раствор 15.2 мл): примерно 25 мг хромогенного субстрата растворяют в 15,2 мл дистиллированной воды и хранят в холодильнике при (2-8°C).
- Бычьи эуглобулины (раствор 10 мл). В контейнер с минимальным объемом 300 мл вводят 240 мл охлажденной на льду очищенной воды и при помешивании добавляют 10 мл бычьей плазмы. Корректируют pH до 5.3±0.1 с уксусной кислотой 1%. Оставляют отстояться при 2-8°C в течение 1-16 часов. Отделяют прозрачный раствор супернатанта путем откачки сифоном и собирают преципитат центрифугированием при 2.800 оборотах в минуту в течение 5 минут и при 4°C. Суспендируют преципитат путем механического диспергирования (например: при помощи лабораторной стеклянной указки) в 5 мл охлажденной на льду очищенной воды, встряхивают в течение примерно 5 мин и собирают преципитат центрифугированием при 2.800 оборотах в минуту в течение 5 минут и при 4°C. Диспергируют преципитат механически в примерно 10 мл ТРИС-NaCl; для облегчения растворения преципитата дробят преципитат в крошки при помощи приемлемого инструмента (например: лабораторной стеклянной указки). Хранят полученную суспензию при 2-8°C в течение не менее 1 часа и не более 6 часов до использования.
Стандартные и анализируемые растворы дефибротида
Стандартный стоковый раствор
В мерную колбу 20 мл количественно переносят 100 мг аккуратно взвешенного стандартного образца дефибротида. Растворяют порошок с примерно 10 мл ТРИС-NaCl и восстанавливают объем с этим же самым растворителем. Разбавляют 1:4 полученный раствор с ТРИС-NaCl для получения стандартного раствора дефибротида примерно 1.25 мг/мл.
Анализируемый стоковый раствор
В мерную колбу 20 мл количественно переносят 100 мг аккуратно взвешенной пробы дефибротида. Растворяют порошок с примерно 10 мл ТРИС-NaCl и восстанавливают объем с этим же самым растворителем. Разбавляют 1:4 полученный раствор с ТРИС-NaCl для получения анализируемого раствора дефибротида примерно 1.25 мг/мл.
Приготовление стандартного и анализируемого растворов
a) Дефибротид 125 мкг/мл: разбавляют 1:10 стоковый раствор дефибротида (стандартный и анализируемый) с ТРИС-NaCl (эквивалентно 50 мкг/мл в планшетную лунку). В пробирку Эппендорфа количественно переносят 500 мкл приготовленного раствора и смешивают с 500 мкл эуглобулина. Закрывают пробирку и хранят в охлаждаемой льдом воде.
b) Дефибротид 62.5 мкг/мл: разбавляют 1:2 раствор (а) с ТРИС-NaCl (эквивалентно 25 мкг/мл в планшетную лунку). В пробирку Эппендорфа количественно переносят 500 мкл приготовленного раствора и смешивают с 500 мкл эуглобулина. Закрывают пробирку и хранят в охлаждаемой льдом воде.
c) Дефибротид 31.25 мкг/мл: разбавляют 1:2 раствор (b) с ТРИС-NaCl (эквивалентно 12.5 мкг/мл в планшетную лунку). В пробирку Эппендорфа количественно переносят 500 мкл приготовленного раствора и смешивают с 500 мкл эуглобулина. Закрывают пробирку и хранят в охлаждаемой льдом воде.
d) Дефибротид 12.5 мкг/мл: разбавляют 1:2.5 раствор (d) с ТРИС-NaCl (эквивалентно 5 мкг/мл в планшетную лунку). В пробирку Эппендорфа количественно переносят 500 мкл приготовленного раствора и смешивают с 500 мкл эуглобулина. Закрывают пробирку и хранят в охлаждаемой льдом воде.
Бланковый раствор
Смешать 1 объем эуглобулинов с 1 объемом раствора ТРИС NaCl (например: 500 мкл + 500 мкл)
Размещение в лунках планшета
Согласно предлагаемой схеме размещения (см. Табл. 1 далее по тексту) добавляют в каждую лунку планшета 200 мкл стандартного или анализируемого или бланкового раствора. Необходимо отметить, что различные схемы размещения можно применять в соответствии с наличием и конфигурацией автоматических пипеток. Однако для теста нужно осуществить не менее 4 размещений для каждого стандартного и анализируемого раствора.
Непосредственно перед инкубированием планшета в ридере добавляют в каждую лунку 50 мкл хромогенного субстрата.
Figure 00000002
S1, S2, S3, S4: размещение 1 стандартного раствора, размещение 2, размещение 3, размещение 4,
U1, U2, U2, U5: размещение 1 анализируемого раствора, размещение 2, размещение 3, размещение 4,
Ca, Cb, Cc etc.: Концентрация дефибротида в стандартном и анализируемом растворе а, b, c и т.д.
BLK Бланковый раствор
Расчет и результаты
Из кинетической схемы «плотность и время» стандартных растворов (например: S1_Ca, S1_Cb, S1_Cc) определить приемлемый линейный диапазон (например: от 30 до 35 мин, см. фиг. 3).
Определение линейного кинетического диапазона (А@405 нм и время).
Рассчитать для каждого раствора стандарта и пробы ответ анализа (наклонная) в предопределенном диапазоне времени в следующем порядке.
Figure 00000003
где:
Aa - величины плотности при временных значениях Time Та (30 мин из схемы выше по тексту),
Ab - величина плотности при временном значении Time Tb (35 мин из схемы выше по тексту).
Включить полученные значения в табличном виде, как показано в табл. 2.
Figure 00000004
Отложить ответы на анализируемое вещество и стандарт на логарифмы концентрации и рассчитать активность исследуемого вещества, используя модель параллельных линий, как определено соответствующим параграфом 5.3.2 Ph. Eur Current edition.
Необходимо использовать не менее 3 последовательных серийных разбавлений стандарта и образца (например, концентрация дефибротида 5 мкг/мл, 12.5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл, или 5 мкг/мл, 12.5 мкг/мл, 25 мкг/мл или 12.5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл).
Дисперсионный анализ
Дисперсионный анализ проводят в соответствии с параграфом 5.3.2.3 Ph. Eur. current edition and Finney DJ (1964) Statistical Method in Biological Assay 2nd ed.
Тест на приемлемость
1) Данные линейной регрессии не критичны, т.е. расчетная вероятность менее 0.05. Если данный критерий не достигнут, невозможно рассчитать 95% C.I.
2) Данные непараллелизма не критичны, т.е. расчетная вероятность менее 0.05.
3) Данные нелинейности не критичны, т.е. расчетная вероятность менее 0.05.
Критерии приемлемости
4) Оцениваемая активность не ниже 90% и не выше 111% от заданной активности.
5) Границы доверительного интервала (P=0.95) оцениваемой активности не менее 80% и не более 125% от заданной активности.
Расчет
Figure 00000005
где:
- R: результат образца, полученный анализом модели параллельных линий,
- Std Potency: заданная активность стандарта (МЕ/мг сухого вещества),
- Cone. Std: концентрация стандарта (мг/мл сухого вещества),
- Cone. Sample: Концентрация образца (мг/мл сухого вещества).
Тест, проводимый на композициях дефибротида
Вышеописанный тест использовали для определения биологической активности жидких композиций, содержащих 200 мг дефибротида в 2.5 мл (80 мг на мл) и с количественно-качественным составом, указанным в табл. 3.
Figure 00000006
Результаты приведены в табл. 4.
Figure 00000007

Claims (16)

1. Способ определения биологической активности дефибротида, включающий этапы:
а) приведения в контакт дефибротида, эуглобулина млекопитающего и субстрата, специфичного для плазмина, который в результате реакции с плазмином дает измеряемый продукт; и
б) измерения количества образовавшегося продукта в последовательных временных точках для определения биологической активности дефибротида.
2. Способ по п. 1, в котором эуглобулин представляет собой эуглобулин млекопитающего.
3. Способ по п. 2, в котором эуглобулин представляет собой эуглобулин человека, кролика или животного подсемейства бычьих.
4. Способ по п. 1, в котором плазмин, реагирующий с субстратом, специфичным для плазмина, высвобождается плазминогеном, содержащимся в эуглобулине.
5. Способ по п. 1, в котором субстрат, специфичный для плазмина, представляет собой хромогенный субстрат.
6. Способ по п. 1, в котором субстрат, специфичный для плазмина, представляет собой соединение формулы А1-А2-А3-Х, где A1 и А2 являются неполярными аминокислотами, А3 является лизином или аргинином и X является измеряемым продуктом.
7. Способ по п. 6, в котором измеряемый продукт X выбирают из группы, состоящей из пара-нитроанилина и 2-нафтиламина.
8. Способ по п. 4, в котором субстратом, специфичным для плазмина, является H-D-валил-L-лейцил-L-лизин-п-нитроанилин.
9. Способ по п. 6, в котором измеряемый продукт X измеряют при помощи спектрофотометрии или спектрофлюорометрии.
10. Способ по п. 2, в котором эуглобулин млекопитающего ресуспендируют до объема первоначальной плазмы или разбавляют до соотношения 1:10 с приемлемым буфером, а хромогенный/флуорогенный субстрат имеет концентрацию от 2.5 до 3.5 мМ, предпочтительно 3 мМ.
11. Способ по п. 1, в котором реакционной средой является водный раствор, забуференный до рН в пределах от 7 до 8, предпочтительно до рН 7.4.
12. Способ по п. 1, в котором температуру этой системы поддерживают при 35-39°С, предпочтительно при 37°С.
13. Способ по п. 1, в котором концентрация субстрата, специфичного для плазмина, составляет от 0.3 до 4 мМ, предпочтительно от 2.5 до 3.5 мМ, более предпочтительно 3 мМ.
14. Способ по п. 1, включающий также этапы: в) определения скорости высвобождения измеряемого продукта в ходе ферментативной реакции на стандартном и анализируемом образцах дефибротида; г) математической и/или графической корреляции скорости высвобождения и соответствующей концентрации дефибротида для определения биологической активности анализируемого образца дефибротида.
RU2014149089A 2012-06-22 2012-06-22 Способ определения биологической активности дефибротида, основанный на применении эуглобулина RU2627177C2 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IT2012/000193 WO2013190582A1 (en) 2012-06-22 2012-06-22 Euglobulin-based method for determining the biological activity of defibrotide

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017126880A Division RU2766143C2 (ru) 2017-07-26 2017-07-26 Жидкая композиция дефибротида для лечения и профилактики веноокклюзионной болезни

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2014149089A RU2014149089A (ru) 2016-08-10
RU2627177C2 true RU2627177C2 (ru) 2017-08-03

Family

ID=46829846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014149089A RU2627177C2 (ru) 2012-06-22 2012-06-22 Способ определения биологической активности дефибротида, основанный на применении эуглобулина

Country Status (17)

Country Link
US (6) US9902952B2 (ru)
EP (1) EP2864496B2 (ru)
JP (1) JP6198821B2 (ru)
KR (4) KR101948243B1 (ru)
CN (2) CN110079580B (ru)
AU (1) AU2012383169B2 (ru)
BR (1) BR112014031934B1 (ru)
CA (1) CA2874960C (ru)
DK (1) DK2864496T4 (ru)
ES (1) ES2660969T5 (ru)
HK (1) HK1208503A1 (ru)
IL (1) IL236132B (ru)
IN (1) IN2014DN10584A (ru)
MX (1) MX352085B (ru)
RU (1) RU2627177C2 (ru)
SG (1) SG11201408481UA (ru)
WO (1) WO2013190582A1 (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107007617A (zh) 2010-11-12 2017-08-04 真蒂奥姆责任有限公司 去纤维蛋白多核苷酸用于预防和/或治疗移植物抗宿主病(gvhd)
AU2012383169B2 (en) 2012-06-22 2017-12-21 Gentium S.R.L. Euglobulin-based method for determining the biological activity of defibrotide
EP3026122A1 (en) 2014-11-27 2016-06-01 Gentium S.p.A. Cellular-based method for determining the potency of defibrotide
CN110249399B (zh) * 2017-01-25 2022-05-03 凯米特电子公司 自衰减mlcc阵列
JP2020530004A (ja) * 2017-08-03 2020-10-15 ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド 核酸を高濃度で含む製剤
US11571440B2 (en) 2018-04-12 2023-02-07 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited Defibrotide for the prevention and treatment of cytokine release syndrome and neurotoxicity associated with immunodepletion
WO2020118165A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited Subcutaneous delivery of high concentration formulations
EP4110287A1 (en) 2020-02-28 2023-01-04 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited Delivery of low viscosity formulations
TW202308659A (zh) 2021-05-06 2023-03-01 愛爾蘭商爵士製藥愛爾蘭有限責任公司 用於急性呼吸窘迫症候群之治療及預防的去纖維蛋白多核苷酸

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4693995A (en) * 1984-02-16 1987-09-15 Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A. Pharmaceutical composition for the treatment of acute myocardial ischemia
US4985552A (en) * 1986-04-17 1991-01-15 Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A. Process for obtaining chemically defined and reproducible polydeoxyribonucleotides
RU2323979C2 (ru) * 2001-12-17 2008-05-10 Джентиум Спа Способ определения биологической активности дефибротида

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3899481A (en) 1970-11-03 1975-08-12 Crinos Industria Farmaco Process for the controlled partial degradation of deoxyribonucleic acid extracted from animal organs
DE2154279A1 (de) 1970-11-03 1972-05-25 Crinos Industria Farmaco Medikamente für das fibrinolytische System
IT1043823B (it) 1970-11-03 1980-02-29 Prephar Procedimento per l estrazione di acidi nucleici da organi animali
DE2812943C3 (de) 1978-03-23 1981-05-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagens zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin im Plasma
US4853221A (en) 1980-11-13 1989-08-01 Warner-Lambert Company Method for treating non-small cell lung cancer, head and neck cancers and breast cancer
IT1170215B (it) 1983-09-12 1987-06-03 Crinos Industria Farmaco Composizione farmaceutica per il trattamento di stati di insufficienza renale acuta
IT1170214B (it) 1983-09-12 1987-06-03 Crinos Industria Farmaco Composizione farmaceutica per la cura delle arteriopatie periferiche
US4694134A (en) 1985-05-28 1987-09-15 Ajax Magnethermic Corporation Apparatus for overheating edges of skelp for the production of compression welded pipe
US5223609A (en) 1986-04-17 1993-06-29 Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A. Process for obtaining chemically defined and reproducible polydeoxyribonucleotides
US5231006A (en) 1986-10-16 1993-07-27 Behringwerke Aktiengesellschaft Method for the determination of plasminogen
US4753221A (en) 1986-10-22 1988-06-28 Intravascular Surgical Instruments, Inc. Blood pumping catheter and method of use
JP2907447B2 (ja) 1988-08-24 1999-06-21 中外製薬株式会社 抗血栓剤
IT1231509B (it) 1989-09-07 1991-12-07 Crinos Industria Farmaco Composizione farmceutica ad uso topico per la terapia della fragilita' capillare.
JPH0539280A (ja) * 1990-07-20 1993-02-19 Takeda Chem Ind Ltd サツカロアスコルビン酸誘導体および血栓症予防治療剤
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US5624912A (en) 1991-08-21 1997-04-29 Burcoglu; Arsinur Method of treating HIV infection and related secondary infections with defibrotide
US5977083A (en) 1991-08-21 1999-11-02 Burcoglu; Arsinur Method for using polynucleotides, oligonucleotides and derivatives thereof to treat various disease states
US6699985B2 (en) 1991-08-21 2004-03-02 Arsinur Burcoglu Method of treating HIV infection and related secondary infections thereof
IT1252174B (it) 1991-12-09 1995-06-05 Crinos Industria Farmaco Oligodesossimibonucleotidi ad attivita' antiischemica e procedimenti per il loro ottenimento
US5578716A (en) 1993-12-01 1996-11-26 Mcgill University DNA methyltransferase antisense oligonucleotides
JPH08127539A (ja) 1994-10-31 1996-05-21 Ajinomoto Co Inc ヒトｉｌ−１１を含有する末梢血幹細胞増加剤
US5856444A (en) 1994-11-30 1999-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Thrombocytopoiesis stimulating factor
US6383480B1 (en) 1996-07-10 2002-05-07 Meiji Milk Products, Co., Ltd. Composition comprising midkine or pleiotrophin protein and method of increasing hematopoietic cells
CA2259041A1 (en) 1997-04-28 1998-11-05 Arsinur Burcoglu Method of treating hiv infection and related secondary infections thereof
JP2002512508A (ja) 1997-05-30 2002-04-23 マクギル・ユニヴァーシティ Ｄｎａメチルトランスフェラーゼゲノミック配列およびアンチセンスオリゴヌクレオチド
US6177545B1 (en) 1997-09-02 2001-01-23 Insight Strategy & Marketing Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications
DE19740384A1 (de) 1997-09-08 1999-03-11 Max Delbrueck Centrum Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN) gegen Proteinkinase C (PKC)-Isoformen, ihre Verwendung und pharmazeutische Zubereitungen dieser ODN
GB9719161D0 (en) * 1997-09-09 1997-11-12 Glaxo Group Ltd New therapeutic method
US6573372B2 (en) 1999-01-07 2003-06-03 Heska Corporation Feline immunoglobulin E molecules and compositions there of
AU780454B2 (en) 1999-06-03 2005-03-24 Jessie L.S. Au Methods and compositions for modulating cell proliferation and cell death
ATE311907T1 (de) 1999-06-08 2005-12-15 Gentium Spa Anwendung von komplexen von kationischen liposomen und polydeoxyribonukleotiden wie arzneimitteln
EP1147777A1 (en) 2000-04-18 2001-10-24 Crinos Industria Farmacobiologica S.p.A. Combination of defibrotide and G-CSF and its use to activate haematopoietic progenitors
US8771663B2 (en) 2000-04-18 2014-07-08 Gentium Spa Formulation having mobilising activity
US20070037144A1 (en) 2000-10-20 2007-02-15 Jay Wohlgemuth Leukocyte expression profiling
US6846670B2 (en) 2000-11-28 2005-01-25 The University Of Chicago Genetically engineered herpes virus for the treatment of cardiovascular disease
CA2433225A1 (en) 2000-12-29 2002-07-11 Bio-Technology General, Inc. Isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US6770753B2 (en) 2001-07-05 2004-08-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Phosphorothioate antisense heparanase oligonucleotides
WO2003027313A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services SUPPRESSORS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND METHODS OF USE
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CA2487171A1 (en) 2002-05-31 2003-12-11 Klinikum Der Universitat Regensburg Method for the protection of endothelial and epithelial cells during chemotherapy
US20050215498A1 (en) 2002-05-31 2005-09-29 Guenther Eissner Method for the protection of endothelial and epithclial cells during chemotherapy
EP1534332A4 (en) 2002-07-01 2006-11-22 Savient Pharmaceuticals Inc ANTIBODIES AND ITS USES
US20060293256A1 (en) 2002-08-06 2006-12-28 Masateru Yamada Remedy or preventive for kidney disease and method of diagnosing kidney disease
US20050196382A1 (en) 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
DE10244453A1 (de) 2002-09-24 2004-04-01 Phenomiques Gmbh Hemmung der Proteinkinase C-alpha zur Behandlung von Krankheiten
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
ITMI20031714A1 (it) 2003-09-05 2005-03-06 Gentium Spa Formazioni ad azione antitumorale.
WO2005089503A2 (en) 2004-03-19 2005-09-29 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Cd4-igg2 formulations
AU2005289774B2 (en) * 2004-09-22 2012-03-08 The Regents Of The University Of Colorado Methods for a global assay of coagulation and fibrinolysis
US7723127B2 (en) 2005-03-03 2010-05-25 Novx Systems Inc. Immunoassay with extended dynamic range
US20080194507A1 (en) 2005-03-03 2008-08-14 Massimo Iacobelli Defibrotide An/Or Oligodeoxyribonucleotides For Treating Angiogenesis-Dependent Tumors
WO2006119619A1 (en) 2005-05-06 2006-11-16 Replicor Inc. Oligonucleotides inhibiting cell proliferation
EP1872787A1 (en) 2006-06-27 2008-01-02 Gentium S.p.A. Use of defibrotide for the inhibition of heparanase
EP1982722A1 (en) 2007-04-16 2008-10-22 Gentium S.p.A. Use of oligotide for the treatment of renal diseases
FR2917172B1 (fr) * 2007-06-07 2014-01-03 Inst Nat Sante Rech Med Methode de mesure de l'activite plasmine des microparticules presentes dans un echantillon de fluide biologique et utilisation
US20090023158A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 Elan Pharmaceuticals, Inc. Compositions and Methods for Identifying Substrate Specificity of Inhibitors of Gamma Secretase
EP2103689A1 (en) 2008-03-19 2009-09-23 Gentium S.p.A. Synthetic phosphodiester oligonucleotides and therapeutical uses thereof
CA2723648A1 (en) 2008-04-10 2009-10-15 Piyush Gupta Methods for identification and use of agents targeting cancer stem cells
EP3791880A1 (en) * 2009-04-29 2021-03-17 Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited Pharmaceutical compositions comprising epa
US20130065260A1 (en) * 2009-11-06 2013-03-14 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, Methods and Uses for Simultaneous Assay of Thrombin and Plasmin Generation
CN107007617A (zh) 2010-11-12 2017-08-04 真蒂奥姆责任有限公司 去纤维蛋白多核苷酸用于预防和/或治疗移植物抗宿主病(gvhd)
AU2012383169B2 (en) 2012-06-22 2017-12-21 Gentium S.R.L. Euglobulin-based method for determining the biological activity of defibrotide
EP3026122A1 (en) 2014-11-27 2016-06-01 Gentium S.p.A. Cellular-based method for determining the potency of defibrotide
JP2020530004A (ja) 2017-08-03 2020-10-15 ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド 核酸を高濃度で含む製剤

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4693995A (en) * 1984-02-16 1987-09-15 Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A. Pharmaceutical composition for the treatment of acute myocardial ischemia
US4985552A (en) * 1986-04-17 1991-01-15 Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A. Process for obtaining chemically defined and reproducible polydeoxyribonucleotides
RU2323979C2 (ru) * 2001-12-17 2008-05-10 Джентиум Спа Способ определения биологической активности дефибротида

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COCCHERI S. et al. "Defibrotide", Cardiovascular drug reviews, v.9, no.2, 01.06.1991, p.172-196. *
ESPOSITO E et al. "Effect of Long-Term Stabilization of Cationic Liposomes as Defibrotide Delivery System for Antithrombotic Activity", Drug development research, 2002, v.55, p.127-138. *
RANIERI G. ET AL: "Defibrotide in the treatment of Raynaud's phenomenon in patients with progressive systemic sclerosis or essential mixed cryoglobulinemia", Current therapeutic research, v.53, no.1, 01.01.1993, p.48-58. *
RICHARDSON P. G. et al. "Multi-institutional use of defibrotide in 88 patients after stem cell transplantation with severe veno-occlusive disease and multisystem organ failure: response without significant toxicity in a high-risk population and factors predictive of outcome", Blood, 15.12.2002, v.100, no.13, p.4337-4343. *
RICHARDSON P. G. et al. "Multi-institutional use of defibrotide in 88 patients after stem cell transplantation with severe veno-occlusive disease and multisystem organ failure: response without significant toxicity in a high-risk population and factors predictive of outcome", Blood, 15.12.2002, v.100, no.13, p.4337-4343. COCCHERI S. et al. "Defibrotide", Cardiovascular drug reviews, v.9, no.2, 01.06.1991, p.172-196. RANIERI G. ET AL: "Defibrotide in the treatment of Raynaud's phenomenon in patients with progressive systemic sclerosis or essential mixed cryoglobulinemia", Current therapeutic research, v.53, no.1, 01.01.1993, p.48-58. *

Also Published As

Publication number Publication date
US11236328B2 (en) 2022-02-01
US11746348B2 (en) 2023-09-05
MX2014016114A (es) 2015-09-23
US20180334672A1 (en) 2018-11-22
MX352085B (es) 2017-11-08
IN2014DN10584A (ru) 2015-08-28
EP2864496B2 (en) 2020-11-25
KR20180098420A (ko) 2018-09-03
US11085043B2 (en) 2021-08-10
US20210363519A1 (en) 2021-11-25
IL236132A0 (en) 2015-01-29
BR112014031934A8 (pt) 2018-01-02
AU2012383169B2 (en) 2017-12-21
US20150176003A1 (en) 2015-06-25
US20200208148A1 (en) 2020-07-02
KR20190112197A (ko) 2019-10-02
BR112014031934A2 (pt) 2017-06-27
CA2874960C (en) 2021-05-18
CA2874960A1 (en) 2013-12-27
US20230357762A1 (en) 2023-11-09
DK2864496T4 (da) 2021-01-04
KR101948243B1 (ko) 2019-05-21
EP2864496A1 (en) 2015-04-29
EP2864496B1 (en) 2017-11-29
BR112014031934B1 (pt) 2021-05-04
ES2660969T5 (es) 2021-09-03
SG11201408481UA (en) 2015-01-29
ES2660969T3 (es) 2018-03-26
CN104619857A (zh) 2015-05-13
KR20190016148A (ko) 2019-02-15
HK1208503A1 (en) 2016-03-04
JP2015521477A (ja) 2015-07-30
KR102038357B1 (ko) 2019-10-31
US9902952B2 (en) 2018-02-27
WO2013190582A1 (en) 2013-12-27
IL236132B (en) 2018-07-31
RU2014149089A (ru) 2016-08-10
CN110079580A (zh) 2019-08-02
JP6198821B2 (ja) 2017-09-20
KR20150044877A (ko) 2015-04-27
AU2012383169A1 (en) 2015-01-15
DK2864496T3 (en) 2018-01-15
CN110079580B (zh) 2022-12-06
US20210388350A1 (en) 2021-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2627177C2 (ru) Способ определения биологической активности дефибротида, основанный на применении эуглобулина
AU2002360945B2 (en) A method for determining the biological activity of defibrotide
AU2002360945A2 (en) A method for determining the biological activity of defibrotide
RU2766143C2 (ru) Жидкая композиция дефибротида для лечения и профилактики веноокклюзионной болезни
TWI615473B (zh) 用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性之基於優球蛋白的方法
SA113350049B1 (ar) طريقة تعتمد على جلوبولين حقيقي لتحديد النشاط الحيوي لديفيبروتيد

Legal Events

Date Code Title Description
HZ9A Changing address for correspondence with an applicant