SA113350049B1 - طريقة تعتمد على جلوبولين حقيقي لتحديد النشاط الحيوي لديفيبروتيد - Google Patents

Abstract

يتعلق الاختراع الحالي بطريقة لتقدير النشاط الحيوي biological activity النوعي لعينات ديفيبروتيد defibrotide، حيث تشتمل على الخطوات: أ) ملامسة ديفيبروتيد، وجلويولين حقيقي euglobulin، وركيزة خاصة بالبلازمين plasmin، حيث أنه بالتفاعل مع البلازمين، يتم توفير منتج قابل للقياس؛ وب) قياس كمية المنتج المتكون في أوقات متتالية، وبالتالي تحديد النشاط الحيوي للديفيبروتيد. كما يتم الكشف عن صيغ ديفيبروتيد سائلة Liquid defibrotide formulations ، وبخاصة ذات نشاط يتراوح من 25 إلى 35 وحدة دولية/ مجم من ديفيبروتيد، ويفضل من 27.5 إلى 32.5 دولية/ مجم، والأفضل من 28 إلى 32 دولية/ مجم. شكل 1

Description

— \ —

Euglobulin-based method for determining the biological activity of defibrotide ‏الوصف الكامل‎ خلفية الاختراع يتعلق الاختراع الحالي بطريقة لتحديد النشاط الحيوي لديفيبروتيد ‎(defibrotide)‏ وبصفة خاصة يتعلق بطريقة إنزيمية ‎enzymatic method‏ غير مباشرة لتحديد النشاط الحيوي لديفيبروتيد. يعتبر الديفيبروتيد رقم 49156؟- 19955 ‎Merck Index,‏ مادة طبيعية يتم الحصول عليها باستخلاصها من أعضاء حيوانية وتتكون من ملح صوديوم ‎sodium salt‏ لبولي ديوكسي ريبو © نيوكليوتيدات ‎polydeoxyribonucleotides‏ منخفض الوزن الجزيئي. وقد خضع ديفيبروتيد للعديد من الأبحاث الصيدلانية التي دلت على إمكانية استخدامه في العلاج كعامل مضاد للتخثر .)787 4831 ‏(براءة الاختراع الأمريكية رقم‎ anti-thrombotic agent بالإضافة إلى ذلك؛ فقد تم استخدام ديفيبروتيد بنجاح في علاجاعتلالات الشرايين المحيطية acute renal ‏أو في حالة القصور الكلوي الحاد‎ «peripheral arteriopathies ‏أو في إقفار عضلة القلب الحاد‎ )42154٠74 ‏(براءة الاختراع الأمريكية رقم‎ insufficiency ٠ (£14740 ‏(براءة الاختراع الأمريكية رقم‎ acute myocardial ischaemia ويخضع ديفيبروتيد حالياً للتجارب السريرية لاستخدامه في علاج والوقاية من مرض انسداد الأوردة .(VOD) venous occlusive disease ‎LS,‏ هي الحال مع باقي المواد الحيوية التي يتم الحصول عليها بالاستخلاص؛ فإن ديفيبروتيد ‎١‏ أيضاً يتميز بقلة قابلية تغاير التركيب وهي أمر عادي بالنسبة للبوليمرات الحيوية ‎natural‏ ‎(biopolymers‏ الأمثلة التقليدية على ذلك الهيبارين ‎heparin‏ المعروف بتباينه من تشغيلة ‏إلى أخرى من حيث طول السلسلة؛ والوزن الجزيئي؛ والتركيبة؛ ودرجة الكبرتة ‎sulphatation‏

د ‎٠‏ الخ. ومن نتائج ذلك أن نفس الكميات بالوزن من ديفيبروتيد قد لا تكون متكافئة من حيث النشاط الحيوي ‎.biological activity‏ ولا يمكن أن تضمن عملية الاستخلاص ‎extraction‏ والعزل 15018100 والتنقية ‎«purification‏ ‏بحد ذاتها؛ إمكانية الإنتاج المطلقة للمنتج؛ ويرجع ذلك تحديداً إلى طبيعة البوليمرية الحيوية.

مع ذلك؛ ففي حالة التحكم الجيد؛ من الممكن خفض هذا التباين: ولذلك؛ تم إجراء الدراسات عن العمليات الصناعية القياسية لعزل ديفيبروتيد بإستخلاصه من الأعضاء»؛ كما ما ورد في براءة الاختراع الأمريكية رقم 49850507. يتميز المنتج الذي تم الحصول عليه طبقاً للعملية سالفة الذكر بتحديد بعض المتغيرات الفيزيائية والكيميائية ‎physico-chemical parameters‏ مثل ؛ الرحلان ‎electrophoretic mobility‏ «

optical rotatory ‏وطاقة الدوران الضوئية‎ coefficient of extinction ‏ومعامل الانقراض‎ ٠

‎power‏ والكتلة الجزيئية النسبية ‎relative molecular mass‏ لمتوسط الكتلة. مع هذاء فإن هذه

‏المتغيرات تعتمد بشكل أساسي على بنية الديفيبروتيد وغير قادرة على توفير معلومات عن نشاطه الحيوي.

‏وحسب ما لدينا من معلومات؛ فإن الطرق الوحيدة التي ورد استخدامها حتى الآن في تقييم النشاط

‎yo‏ والتسجيل التخطيطي لمرونة ‎gaalifibrin plate test‏ لديفيبروتيد هي الاختبار بطبق فيبرين

‎lysis time [Prino G., Mantovani M.,‏ 9100© التخثر لزمن تحلل جلويولين حقيقي

‎Niada R., Coccheri S., Butti A., Indagini preliminari sull'attivita fibrinolitica,

‎nell'animale e nellluomo, di una nuova sostanza presente in diversi organi

‎animali, Simposio Internazionale: La ricerca scientifica nell'industria

‎farmaceutica in Italia, Rome, Yave ‏اكتوبر‎ ¢——Il Farmaco, Ed.

Prat.) 9٠

‏التي تم الكشف عنها في ‎(Y474) ©71-5007 (Yéplasmin‏ والطريقة المعتمدة على البلازمين

‏براءة الاختراع الأمريكية رقم 777797997؛ والمدرجة في الوثيقة الحالية كمرجع.

‏مع ذلك؛ فإن الطريقة السابقة لتسجيل مخطط مرونة التخثر ‎thromboelastographic‏ لزمن

‏تحلل جلويولين حقيقي تتميز بالكثير من التعقيد التجريبي؛ وبدرجة غير مرضية من إمكانية إعادة

سا الانتاج والدقة؛ و في حالة التسجيل لمخطط مرونة التخثر؛ باقتصار خطية الاستجابة على قيم تركيزات ضيقة للغاية. أما ‎daly‏ للطريقة المعتمدة على البلازمين» فإن النشاط الإنزيمي ‎enzymatic activity‏ للبلازمين عادة ما يتم قياسه باختبارات معملية بمقياس مختلف. ومن أكثر الطرق المستخدمة © شيوعياً القياس الطيفي ‎spectrophotometry‏ أو قياس التألق ‎fluorimetry‏ للمركبات الصبغية ‎chromogenic‏ أو التألقية ‎fluorogenic‏ التي يطلقها مفعول البلازمين على الركائز المناسبة ‎.[Haemostasis, ١٠-١8 YaYAY‏ وعادة ما يتم استخدام ركائز البتيد ‎Peptide‏ ‏9005065 ذات الصيغة ‎AT-AY-A)Y‏ - )ل ‎all‏ فيها ‎١/8‏ و ؟ عبارة عن أحماض أمينية ‎amino acids‏ غير قطبية بشكل سائد» ‎A‏ ¥ عبارة عن ليسين ‎Jlysine‏ أرجينين ©8091017 و ‎XV‏ تمثل المركب المحرر القابل للقياس» ‎Jie‏ بارا - نيترو ألينين ‎s(pNa) para-nitroaniline‏ "- نافثيل امين ‎(NA) [ 2-naphthylamine‏ ااكبصاحت نحخ ‎Haemostasis, ١‏ بالإضافة إلى ركائز الببتيد سالفة ‎SA‏ فقد تحقق نجاح في استخدام مركبات أخرى أبسط على سبيل ‎JB‏ م - نيترو بنزيل- م - تولوين سلفونيل-ا -أرجنين-م- الإ01005802-م ‎٠/6 toluenesulphonyl-L-arginine‏ نام نح١ ‎[Haemostasis, ١٠‏ ‎٠‏ ويتناسب معدل إطلاق المركب ‎AX‏ وسط الاحتضان ‎incubation medium‏ مع نشاط (وحدة/ مجم) البلازمين الموجود في العينة. لذلك فإن الطريقة التي تم الكشف عنها في براءة الاختراع الأمريكية رقم 77779797 تعتمد على نتيجة وهي أنه في اختبارات تقييم البلازمين السابق وصفهاء يعمل ديفيبروتيد على زيادة معدل إطلاق المركب )ل بشكل نسبي مع ‎HSH‏ ‏مع ذلك؛ يتم ‎chal‏ هذه الطريقة في محلول منظم ‎TRIS buffer‏ دون أي منشط/ مثبط للبلازما/ © المصل. ‎ld‏ فإن الإجراء لا يعكس الحالة الفسيولوجية ولا يحاكي بشكل دقيق آلية مفعول ديفيبروتيد في جسم الكائن الحي. لذلك؛ حتى الآن؛ لم يتم وصف طرق دقيقة وصحيحة يمكن إعادة إنتاجها والتأكد منها لتقدير النشاط الحيوي لديفيبروتيد تعكس بدقة آلية مفعول المنتج في جهاز حيوي معقد ‎complex‏ ‎biological system‏ (داخل جسم الكاثن الحي).

الوصف العام للاختراع لقد قمنا بتطوير طريقة بسيطة وموثوقة لتقدير النشاط الحيوي لديفيبروتيد؛ تتيح مقارنة العينات التي يتم الحصول عليها بالاستخلاص ومن ثم تتيح عمل مقاييس للمستحضرات الطبيعية المعتمدة على ديفيبروتيد. © وتتيح الطريقة التي يقدمها الاختراع الحالي تقدير النشاط الحيوي لديفيبروتيد مقارنة بمقياس مرجعي يتميز بدرجة عالية من الدقة. شرح مختصر للرسومات الشكل رقم ‎١‏ عبارة عن مخطط يوضح حركيات إطلاق ‎PNA‏ من الركيزة ‎YYOIS—‏ ؛ عن طريق جزء جلويولين حقيقي ثديي ‎mammalian euglobulin fraction‏ منشط وغير منشط بديفيبروتيد ‎٠‏ (تركيز صفر- ‎٠٠0‏ ميكروجم/ مثل؛ صفر- ١٠٠دقيقة)‏ حيث أن: المحور العمودي يمثل الامتصاص عند £00 نانومتر؛ المحور الأفقي يمثل الزمن بالدقائق؛ ‎AW‏ جلوبولين حقيقي بشري؛ ‎V0‏ * هي جلوبولين حقيقي بشري+اديفيبروتيد © ميكروجم/مل؛ ا هي جلوبولين حقيقي بشري+اديفيبروتيد ‎٠١‏ ميكروجم/مل؛ و > هي جلوبولين حقيقي بشري+ديفيبروتيد ‎٠‏ * ميكروجم/مل. الشكل رقم ‎١‏ عبارة عن مخطط يوضح السيني الذي يزداد بالنسبة إلى عينة قياسية وعينة اختبار من ديفيبروتيد. ‎Yo‏ حيث أن: ‎gov.‏

-؟- المحور العمودي يمثل استجابة التجربة؛ المحور الأفقي يمثل تركيز الديفيبروتيد (ميكروجرام/مل) (مقياس لوخ) ا هي الخط المقارب السفلي؛ ‎M‏ هي الخط المقارب العلوي؛ ل هي عامل الميل الخطي؛

؛١ ‏هي المتوالية‎ A ‏هي المتوالية ؟؛‎ 8 ‏هي المتوالية ؟؛ و‎ C .4 ‏هي المتوالية‎ D

‎Vo‏ عند ‎5٠5‏ نانومتر مقابل الزمن" لمستحضرات الشكل رقم ؟ عبارة عن مخطط يوضح "الامتصاصض ) يحدد قيم خطية مناسبة ‎Sie)‏ من ‎٠‏ إلى ‎SY_Cb, 5١_06 Yo‏ ,8)_لأقياسية (مثل دقيقة). حيث أن: © هي القياسية المنخفضة؛

‎Yo‏ + هي القياسية المتوسطة؛ و هي القياسية المرتفعة ‎١ Chua ol)‏ لتفصيلي: لذلك فإن الاختراع الحالي يتعلق بطريقة لتقدير النشاط الحيوي النوعي لعينات ديفيبروتيد؛» حيث تشتمل الطريقة على الخطوات:

0 ملامسة ديفيبروتيد ‎cdefibrotide‏ وجلويولين حقيقي ‎ceuglobuling‏ وركيزة خاصة بالبلازمين؛ حيث أنه بالتفاعل مع البلازمين؛ يتم توفير منتج يمكن قياسه و ب) قياس كمية المنتج المتكون على أزمنة متتالية. إنْ طريقة الاختراع طريقة معملية غير مباشرة لقياس نشاط ديفيبروتيد» حيث تعتمد على التفاعلات © الوظيفية بين ديفيبروتيد وجلويولين حقيقي. ويعتبر جلويولين حقيقي هو ذلك الجزء من جلوبيولين المصل ‎serum globulin‏ غير القابل للذوبان في الماء المقطر ‎distilled water‏ ولكنه قابل للذوبان في المحاليل الملحية ‎saline‏ ‎.solutions‏ ‏يحتوي جلويولين حقيقي على فيبرينوجين ‎fibrinogen‏ و ‎PAI-Y‏ ومنشط بلازمينوجين نسيجي ‎«(tPA) tissue plasminogen activator ٠‏ وبلازمينوجين ‎plasminogen‏ وبدرجة أقل ألفا 7- مضاد للبلازمين ‎alpha 2—antiplasmin‏ وكذلك العامل ‎Mi‏ ‏ومن المدهش أن المخترعين الحاليين قد اكتشفوا أن ديفيبروتيد يحفز التحلل المائي للبلازمينوجين إلى لازمين. وبالتالي؛ فعند احتضان ديفيبروتيد مع جلويولين حقيقي وركيزة خاصة بالبلازمين» مثل ببتيد ‎peptide‏ له الصيغة ‎=X A Y-AY-1A‏ كما تم الكشف عنه في ‎Haemostasis,‏ ‎Yo‏ 8/ا١-ل7ا-/3١-؟١ء‏ المدرجة في الوثيقة الحالية كمرجع؛ فإن معدل إطلاق المركب ‎GX‏ ‏وسط الاحتضان يزيد بشكل يتناسب مع تركيز ديفيبروتيد ذاته. من ‎Al Lali‏ فإن ديفيبروتيد يحفز التحلل المائي ‎hydrolysis‏ للبلازمينوجين الموجود في جلويولين حقيقي إلى بلازمين؛ حيث يتفاعل البلازمين إنزيمياً مع الركيزة الخاصة بالبلازمين؛ ويفضل ركيزة صبغية ‎ccromogenic substrate‏ لتوفير منتج قابل للقياس. ‎Ye‏ كما تشتمل طريقة الاختراع الحالي على الخطوات: (ج) قياس معدل إطلاق المنتج القابل للقياس أثناء التفاعل الإنزيمي ‎enzymatic reaction‏ لكل من عينة قياسية وعينة اختبار من ديفيبروتيد؛ د) الربط» الرياضي و/ أو الرسومي؛ بين معدل الإطلاق وتركيز ديفيبروتيد المناظر للحصول على النشاط الحيوي لعينة الاختبار من ديفيبروتيد.

— A —

يتم تحضير عينة ديفيبروتيد المستخدمة في القياس طبقاً للاختراع الحلي بصفة عامة باستخلاصه من الأعضاء طبقاً للإجراءات المعروفة؛ كتلك الواردة» على سبيل المثال» في براءة الاختراع الأمريكية رقم £20000 التي سبق ذكرها ‎ally‏ تندرج في الوثيقة الحالية كمرجع.

لقد تم اختيار تشغيلة من ديفيبروتيد العادي المصنع كعينة مرجعية (قياسية) وتم أستخدامها في

هه تحضير منحنيات معايرة ‎calibration curves‏ طبقاً لطريقة الاختراع الحالي.

بصفة عامة؛ توفر الطريقة الحالية قياسات دقيقة لديفيبروتيد حتى في وجود ملوثات؛ متل ‎RNA‏ ؛ والهيبارين؛ وديفيبروتيد المتحلل ‎degraded defibrotide‏ (ديفيبروتيد تمت إزالة البيورين 1010م والبيريميدين ‎pyrimidine‏ منه) أو إثانول» بشرط أن تكون تركيزاتها بصفة عامة أقل من ‎96٠0‏ ‏بالوزن؛ لكيلا تتلف الجهاز.

‎٠‏ بالإضافة إلى السماح بقياس ديفيبروتيد؛ فإن الطريقة تسمح كذلك بقياس المواد الأخرى المكافئة حيوياً المستمدة من ديفيبروتيد؛ مثل ديفيبروتيد منزوع الأمين ‎«deaminated defibrotide‏ أو ببساطة؛ ديفيبروتيد مزالة خواصه الطبيعية/ متحلل مع توليفة من الظروف الفسيوكيميائية ‎.physicochemical conditions‏ تتميز الطريقة الحالية بحساسية كبيرة لرصد تركيزات ديفيبروتيد الأقل من أو تساوي 7.5ميكرو

‎VO‏ جم/ مل (تركيز نهائي في جهاز القياس ‎(determination system‏ وبصفة ‎dale‏ تعبر عن ارتباط جيد يصل إلى أقصى قيم تركيز أعلى من أو تساوي ‎٠٠٠١‏ ميكروجم/ مل. يكون الجلويولين الحقيقي المستخدم بصفة عامة هو أي جزء الجلويولين الحقيقي ‎Jie fl‏ جلويولين حقيقي بقري ‎bovine‏ أو من الخنزير ‎(porcine‏ أو من الأرنب ‎rabbit‏ أو بشري؛ مع تفضيل الجلويولين الحقيقي البشري والبقري.

‎Yo‏ مع ذلك؛ على الرغم من أن جزء ديفيبروتيد هو النظام الإنزيمي ‎enzymatic system‏ المختار» إلا أن استخدام أنظمة أنزيمية ‎enzymatic systems‏ أخرى مكافئة؛ ‎Jie‏ البلازما ‎plasma‏ ‏والمصل ‎serum‏ المخففين (حتى نسبة ‎٠١ :١‏ مع محاليل منظمة ‎(buffers‏ والتوليفات المعزولة أو المصطنعة من البلازمينوجين 3 ‎PA 3 tPA‏ نا + و ‎٠١ PAI‏ ألفا ¥ مضاد للبلازمين

‎q —‏ — ‎antiplasmin‏ وما شابه ذلك من أنظمة إنزيمية ذات صلة من الناحية الكيميائية والحيوية ولها نفس الوظائف؛ يقع أيضاً في نطاق الاختراع الحالي. في طريقة الاختراع ‎(lal)‏ يمكن اعتبار ركيزة البلازمين أية ركيزة خاصة للبلازمين تقوم تحت ظروف معينة؛ بتحرير منتج تحلل ‎hydrolysis product jl‏ يمكن رصده ‎X‏ ‏© حسب طبيعة المجموعة ‎X‏ الممكن رصدهاء يمكن نفس الدرجة تبني الأنظمة البديلة للرصد

‏والشائعة ومعروفة للشخص صاحب المهارة في المجال. وتعد أنظمة الرصد بالقياس الطيفي وقياس التألق مميزة وبخاصة أنظمة القياس الطيفي ‎.spectrophotometric systems‏ عادة .ما تكون الركائز المستخدمة ‏ هي تلك الخاصة بتجربة البلازمينوج- البلازمين ‎plasminoge—plasmin assay‏ ويفضل استخدام ببتيدات ‎peptides‏ لها الصيغة /١-تم/-‏

‏-؟ هه كا ء؛ حيث التي فيها ‎١/8‏ و ؟ عبارة عن أحماض أمينية غير قطبية بشكل سائدء ‎YA‏ ‏عبارة عن ليسين أو أرجينين و تمثل المجموعة الممكن رصدها. ومن أمثلة تلك الركائز ‎Val-‏ ‎—-Phe-Lys—pNa J » Leu-Lys—pNa‏ أرى ‎pyroGlu—Phe-Lys-pNa‏ حيث تكون المجموعة التي يمكن رصدها ‎X‏ باستخدام القياس الطيفي هي بارا- نيترو ألينين ‎para—‏ ‎.(PNa) nitroaniline‏ وتحتوي الركائز الأخرى المناسبة مثل ‎Val-Gly-Arg-2NA‏ على ‎-١‏

‎Vo‏ تافثيل امين ‎cnaphthylamine‏ حيث يمكن قياسه بقياس التألق. ومن الركائز المفضلة بشكل خاص ‎H‏ - 0 - فاليل-ا = لوسيل-ا = ليسين-م - نيترو أنيلين ‎H-D-Valyl-L-‏ ‎.(H-D-Val-Leu-Lys-pNA) Leucyl-L-Lysine-p-nitroaniline‏ وتعتبر الركائز الخاصة المستخدمة في قياس نشاط ديفيبروتيد في جزء جلويولين حقيقي ‎euglobulin fraction‏ بصفة عامة متوفرة تجارياً.

‎٠‏ ويتم إجراء طريقة القياس الخاصة بالاختراع الحالي بوضع عينة ديفيبروتيد في محلول جلوبولين حقيقي ‎ceuglobulin solution‏ عند رقم هيدروجيني ومولارية معينة. بصفة خاصة؛ يتم ‎sale)‏ تكوين ‎shal‏ جلويولين حقيقي ‎euglobulin fractions‏ التي يتم الحصول عليها من البلازما الثديية ‎mammalian plasma‏ بإذابة وتخفيف جلويولين حقيقي إلى الحجم الطبيعي للبلازما المتولدة مع محلول ملحي ‎saline bufferalaic‏ (مثل كمية جزء جلويولين

— \ «=

حقيقي التي يتم الحصول عليها من ١٠مل‏ بلازما مذابة ومعاد تشكيلها إلى ١٠مل‏ مع محلول

ملحي منظم عند رقم هيدروجيني يتراوح من ‎١‏ إلى ‎(A‏

مع ذلك؛ بالنسبة لتركيزات الركائز التي تتراوح من ‎١.‏ إلى ؛ ملي مولار؛ ويفضل من ‎Yo‏

8 ملي مولار وعلى نحو مميز ‎١‏ ملي مولارء؛ يتم استخدامها بصفة عامة في حالة الركيزة

0 الصبغية؛ بينما يتم استخدام التركيزلاات التي تتراوح من 0.05 إلى 0.15 في ‎Ala‏ ركيزة تألقية fluorogenic substrate

وتتميز طريقة القياس الخاصة بالاختراع الحالي؛ ‎Jie‏ الطرق الإنزيمية ‎enzymatic methods‏

الأخرى؛ بحساسيتها للرقم الهيدروجيني للوسط.

في الواقع؛ لا يمكن بصفة عامة تطبيقها عند قيم الرقم الهيدروجيني القصوى حيث قد يكون الجهاز ‎٠‏ الإنزيمي ‎enzymatic system‏ غير فعال.

كما يفضل ألا يمر الرقم الهيدروجيني للوسط بتباين في أي وقت أثناء 558 أخذ القياسات؛ وبالتالي؛

يتم إعادة تشكيل جزء جلويولين حقيقي مع أنظمة محاليل منظمة ‎buffer systems‏ يتم اختيارها

من تلك التي يتم استخدامها عادة في الاختبارات الحيوية. وقد تكون أنظمة المحاليل المنظمة

المناسبة؛ على سبيل المثال؛ محلول منظم فوسفاتي ‎«phosphate buffer‏ أو محلول سيترات ‎VO‏ منظم ‎«citrate buffer‏ أو محلول منظم (تريس ‎TRIS‏ - 8001ل). ويفضل ‎sale)‏ تشكيل جزء

جلويولين حقيقي باستخدام تريس - ‎.NaCl‏

في الطريقة الحالية يفضل عادة الحفاظ على الرقم الهيدروجيني للوسط حوالي بين ‎١‏ إلى ‎A‏

والأفضل حوالي ‎NAVE‏

بالإضافة إلى ذلك؛ يفضل؛ الحفاظ على تركيز نظام المحلول المنظم ‎٠١ (buffer system‏ ‎Ys‏ إلى ‎Yoo‏ ملي مولار؛ ويفضل عند حوالي ‎٠‏ © ملي مولار. وبشكل أكثر تحديداً لتركيزات تريس -

‎NaCl‏ يجب أن تكون التركيزات ‎٠ ٠‏ ملي مولار بالنسبة لتريس و١٠5١‏ ملي مولار لكلوريدالصوديوم

‎.sodium chloride

-١١-

في طريقة الاختراع الخاصة بتقدير النشاط الحيوي لديفيبروتيد؛ يتم تخفيف محاليل عينات ديفيبروتيد مباشرة إلى جزء جلويولين حقيقي؛ ثم تتم إضافة الركيزة الصبغية أو التألقية. بصفة خاصة؛ لإتاحة القياسات يفضل أن يتم أولاً تخفيف/ إذابة ديفيبروتيد في محلول منظم تريس - ‎NaCl‏ للحصول على محلول ‎of‏ لكل منهماء وعينة ومقياس. ومن المحاليل الأم يتم تخفيف العينة 0 والمقياس بتخفيف متسلسل؛ إلى حجم محدد من جزء جلويولين حقيقي حتى تتراوح ‎af‏ التركيز

التحليليلة من حوالي ‎١‏ إلى ‎٠٠٠١‏ ميكروجم/ مل من ديفيبروتيد. من المتغيرات الهامة في طريقة القياس الحالية درجة الحرارة. فمن المفضل الحفاظ على نفس درجة الحرارة طوال 358 االقياسات ولجميع العينات المقاسة؛ سواء ‎Lad‏ يتعلق بإنشاء المنحنيات المرجعية أو أثناء مرحلة القياس. ولذلك؛ يفضل استخدام جهاز محكوم درجة الحرارة ‎lads‏ إذا اقتضى

‎٠‏ الأمرء من الممكن البدء بعدة مجموعات من القياس؛ وتغيير موضع العينات بشكل مناسب للتأكد من أن الجهاز به أقصى درجة من التجانس الحراري ‎thermal homogeneity‏ بصفة عامة؛ يتم تطبيق طريقة القياس هذه في مدى حراري؛ يتراوح مثلاً من ‎YO‏ 460 م؛ ويفضل من ‎Fo‏ إلى م والأفضل عند لم طبقاً للاختراع الحالي؛ يبدأ قياس تركيز المركب ‎X‏ الذي يتم إطلاقه في الوسط بفعل ديفيبروتيد

‎Vo‏ عندما تتم إضافة كل الكواشف ويستمر لفترة زمنية محددة سلفاً وبتكرار محدد سلفاً كوظيفة للصفة الكيميائية ‎XI‏ وجهاز الرصد ‎detection system‏ وكما هو الحال في الطرق الأخرى للقياس الحيوي» فإن طريقة الاختراع الحالي توفر مرحلة معايرة ‎calibration stage‏ ومرحلة قياس ‎measuring stage‏ يفضل إجراءهما في نفس الأطباق المجهرية ‎microplateplate‏ من أجل تقليل حدوث التفاوت التجريبي لأقصى حد ممكن.

‎٠‏ تشتمل مرحلة المعايرة على اكتساب بيانات الامتصاص ‎absorbance data‏ المتعلقة بالعينات عند تركيزات ديفيبروتيد متزايدة ومعلومة (قياسية)؛ وإعادة المعالجة الإحصائية لتلك البيانات واستكمال منحنيات المعايرة؛ والتي تعبر عن الارتباط بين الزيادة في معدل التفاعل الإنزيمي للاختراع وتركيز ديفيبروتيد الموجود في ‎ein‏ جلويولين حقيقي. وفي مرحلة القياس؛ نظراً للارتباط الذي تم الحصول عليه في مرحلة ‎pled)‏ من الممككن قياس الأنشطة الحيوية ‎biological‏

_ \ \ —_

المجهولة لعينات ديفيبروتيد بناءاً على قيم الامتصاص المقاسة والمعالجة تحت نفس

بشيء من التفصيل؛ يوفر البروتوكول التجريبي بصفة عامة تحضير العديد من ‎show (lial‏

قياسة ومجهولة؛ بتركيزات معلومة من ديفيبروتيد. ويتم تحضير عينات ديفيبروتيد بتخفيف تدريجي

5 للمحاليل الأم ‎mother solutions‏ طبقاً لعام تخفيف محدد سلفاً.

في الطريقة الحالية؛ يفضل تحضير © تركيزات على الأقل من القياسية و5 تركيزات من العينة

المراد اختبارهاء وتحضير ؛ مضاعفات على الأقل لكل تركيز من العينة القياسية؛ وبالمتل لكل

تركيز من عينة الاختبار؛ بصفلة عامة لتخفيفات متتالية ‎:١‏ 7 من المحاليل الأم.

وتتراوح تركيزات كل من العينة القياسية وعينة الاختبار من ديفيبروتيد بصفة عامة من ‎١0٠‏ إلى ‎٠ ٠‏ ميكرو جم/ مل.

ويفضل أن تكون تركيزات عينة الاختبار من نفس درجة مقدار تركيزات العينة القياسية.

طبقاً للتوضيح السابق؛ يفضل إجراء قياسات كل تركيز على أطباق مجهرية واحدة حيث يفضل

أن تبادل موضع كل ‎die‏ القياسية وعينة ‎LEA)‏ على الترتيب؛ عند التركيز المناظر. طبقاً لهذا

المخطط لترتيب العينات؛ المبين بالتفصيل في الجزء التجريبي؛ لكل تركيز من العينة القياسية ‎١٠‏ وعينة الاختبار من ديفيبروتيد؛ يتم قياس ؛ قيم امتصاص على الأقل كل مرة.

يتم أخذ مجموعة القياسات السابق وصفها عند أزمنة محددة سلفاً؛ بعبارة أخرى؛ أولاً عند الزمن ‎cot‏

أي عند إضافة جميع المكونات؛ قبل بدء التفاعل الإنزيمي الخاص بالاختراع؛ ثم عند فووصل

زمنية دقيقة ولمدة زمنية كافية لاكتساب البيانات اللازمة.

من المفضل؛ استمرار قياسات الامتصاص حتى ‎9٠0‏ دقيقة؛ مع أخذ القراءات كل ‎٠١ -١‏ دقائق. ‎٠‏ والأفضل» أخذ القراءات كل دقيقة. ويتم إجراء قراءات الامتصاص الضوئي ‎photometric‏

086 عند طول موجي ‎wavelength‏ يعتمد على طبيعة المجموعة ‎X‏ القابلة للقياس

والمحررة في أثنا ء تفاعل التحلل المائي الإنزيمي ‎hydrolytic reaction‏ 60721/01816. وفي حالة

معينة تكون ‎X led‏ هي /لا-0 ؛ يتم قياس الامتصاص عند £00 نانو متر.

‎Ad —_‏ \ _ ‎Las‏ قراءات الامتصاص للعينة القياسية وعينات ديفيبروتيد المجهولة؛ المعروفة بالبيانات الخام؛ بصفة عامة من نفس الجهاز الذي يوفر عملية القراءة؛ ويتم الترتيب في جدول بحيث يتم التعبير عن قيم الامتصاص لكل مرة وبطريقة جيدة.

‏ثم تتم معالجة البيانات الخام؛ باستخدام؛ على سبيل ‎JE‏ جداول البيانات - ميكروسوفت إكسل ‎Microsoft Excel® ©‏ ويؤدي تشغيل هذه المعالجة الأولى إلى حساب متوسط الامتصاص ‎absorbance‏ 81/6806 والاتحراف المعياري ‎standard deviation‏ المصاحب» عند كل مرة ولكل مجموعة من القراءات؛» حيث تشمل كل مجموعة على ؛ مضاعفات على الأقل لكل تركيز

‏لكلاً من العينة القياسية وعينة الاختبار من ديفيبروتيد. يتم إجراء معالجة إحصائية أخرى للبيانات ببرمجيات متوفرة تجارياً للقياس التجريبي الحيوي كما تم ‎٠٠‏ وصفه في ‎Finney D J, Statistical Method in Biological Assay, Ynd ed.

Ch.‏ ‎Griffin, London.‏ ودساتير الأدوية ذات الصلة ولتحري ‎daa)‏ فإنه طبقاً للاختراع الحالي؛ يمكن إجراء قياس الاختبارات الحيوية لديفيبروتيد ‎Jil‏ ونماذج منحنيات منطقية ‎del)‏ 81100"باستخدام نموذج متوازي الخطوط؛ ونموذج كما تم وصفهاء؛ على سبيل المثال في ‎logistic curve models‏ 0813811216 -الا0]المتغيرات ‎European Pharmacopoeia General text o.Y, Statistical Analysis. yo‏ الصادي يمكن الحصول على الخطوط المستقيمة يكون ميلها ”0”يتناسب مع معدل التفاعل الإنزيمي: بزيادة تركيز ديفيبروتيد؛ ومعدل التحلل المائي؛ و بشكل ‎clita‏ قيمةٌ ”0 سوف تزداد . وأخيراً؛ ترتبط قيم ‎(Jud‏ المحسوب كما سبق وصفه لكل مجموعة مضاعفات من ديفيبروتيد ‎Yo‏ القياسية وعينة الاختبار من ديفيبروتيد؛ مع تركيز ديفيبروتيد التي ترتبط بها. ويمكن استخدام التحويل الرياضي المناسب للمحور السيني (اي لوغاريتم تركيز ديفيبروتيد) نيابة عن القيمة الحقيقية. رسومياً؛ يثير هذا الارتباط السيني للعينة القياسية والسيني لعينة الاختبار (الشكل رقم ؟)؛ للجزء المركزي من السيني خطين مستقيمين متوازيين بصفة عامة والمسافة بينهما هي ‎Al‏ الفرق في ‎alia‏ الحيوي بين عينة الاختبار والعينة القياسية. ويتم استخدام هذا الفاصل في قياس القوة

— ¢ \ — ‎D J, Statistical Method in‏ لا1008 اباستخدام نموذج الخط الموازي كما تم وصفه في ‎Biological Assay, Ynd ed.

Ch.

Griffin, London.‏ لقياس أكثر تحديداً؛ يتم استخدام نموذج المنحنى النسبي رباعي المتغيرات وفي هذه الحالة يتم استخدام منحنى السيني ‎sigmoid curve‏ الكامل لكل من العينة والعينة القياسية؛ في حساب القوة © الحيوية ‎biological potency‏ للعينة.

في أحد تجسيدات الاختراع الحالي المفضلة؛ يتم إدخال المحاليل القياسية ومحاليل عينات

ديفيبروتيد المراد قياسها في الأعين المناظرة في الطبق المجهري ‎microplate‏ ويتم تحضير ‎sia‏

جلويولين حقيقي في لحظة الاستخدام ويكون هو وسط تخفيف ‎dilution media‏ محلول

ديفيبروتيد الأم ‎defibrotide stock solution‏ وأخيراً؛ تتم إضافة المحلول المحتوي على ركيزة ‎Vo‏ صبغية. ثم يتم وضع الطبق المجهري في ‎AE‏ مزودة بترموستات ‎«thermostated reader‏

وبعد التقليب السريع؛ يتم أخذ قراءات امتصاص الجهاز عند فواصل زمنية محددة ‎ha‏ ولمدة زمنية

محددة سلفاً. ثم تتم معالجة البيانات الخام التي تم الحصول ‎cede‏ ومن ثم قياس الأنشطة

المجهولة لعينات ديفيبروتيد.

وكما سيتضح من الأمثلة التالية؛ فإن طريقة الاختراع تسمح بالحصول على صيغ ديفيبروتيد ‎dil Vo‏ ويفضل محاليل مائية ‎water solutions‏ ذات نشاط حيوي محدد؛ وبصفة خاصة؛ ذات

نشاط يتراوح من ‎Yo‏ إلى ‎yo‏ وحدة دولية/ مجم من ديفيبروتيد 3 ويفضل من ما إلى .77

وحدة دولية/ ‎cane‏ والأفضل من 748 إلى ‎TY‏ وحدة دولية/ مجم.

يفضل تسويق صيغ ديفيبروتيد الساثلة ‎Liquid defibrotide‏ في شكل حاويت؛ والأفضل ‎Cd‏

تحتوي على ‎Yeo‏ مجم من ديفيبروتيد في ‎Y.0‏ مل من محاليل مائية منظمة (يفضل عند رقم ‎Yo‏ هيدروجيني 1.0 إلى م والأفضل من ‎VY‏ إلى ‎A‏ ( ¢ بحيث يتم تخفيفها قبل الاستخدام؛ بالتالي؛

عند تقدير النشاط الحيوي بطريقة الاختراع الحالي فإن كل ‎gla‏ تعطس نشاط لديفيبروتيد يتراوح

من ‎Oven‏ إلى ‎bag Your‏ دولية/ مجم ‘ ويفضل 550.6 إلى 10 وحدة دولية/ مجم ‘

والأفضل من 5106068 إلى ‎TE‏ وحدة دولية/ مجم.

اج \ _ سوف تتضح هذه السمات وغيرها من سمات الاختراع من خلال الأمثلة التالية التي يجب ألا تعتبر مقيدة لمجال الاختراع. الأمثلة لقد تم استخدام المواد التالية في الأمثلة الواردة هنا: ‎o‏ الجهاز الخواص ‎is] il‏ أطباق مجهرية لقياس امتصاص 1/5-/الا مزودة بغرفة ترموستات ‎ies thermostatic chamber |‏ امتصاص ‎absorbance fer‏ ‎mares‏ ‏قياس الامتصاص الحركي ‎Kinetic Absorbance‏ عند £40 ‎sili‏ متر ‎FY‏ 70م ‎ON]‏ جيل | ‎٠١-45‏ دقيقة ‎aa | Chamber‏ ‎Temperature!‏ | . ‎JS‏ تجيل ‎#١ Jal‏ دقيقة ‎ela‏ ) البرامج والبرمجيات ‎Microsoft Excel® (Microsoft Corporation, Redmond, Wash., USA)‏ المواد ديفيبروتيد ‎(Gentium)‏

Chromogenix Instrumentation Laboratory S.p.A., Milan, ‏؟ ؟(‎ 0١ 5- ‏ركيزة صبغية‎ ٠ (Italy

تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينو ميثان ‎Tris(hydroxymethyl)Jaminomethane‏ (تريس)- ‎(Sigma-Aldrich, Milan, Italy) « NaCl‏ ‎١‏ ع ‎HCl(Carlo Erba reagenti, Milan, Italy)‏ ‎١‏ ع ‎NaOH(Carlo Erba reagenti, Milan, Italy)‏ © بلازما بقري ‎(Tebu Bio Italia, Magenta (Ml), Italy) Bovine Plasma‏ حمض أسيتيك تلجي ‎(Carlo Erba reagenti, Milan, Italy) Glacial Acetic Acid‏ المحاليل (تريس)- ‎NaCl‏ (مستحضر ‎١‏ لتر): في كأس سعة ‎١‏ لتر تم ‎Ja‏ 0.00 جم من تريس - ‎HCl‏ ‎YY, NV‏ جم ‎NaCl‏ تم الإذابة في ‎5٠٠0‏ مل من الماء المنقى ‎purified water‏ وتعديل ‎A‏ ‏الهيدروجيني إلى 7.4 بحوالي ‎٠‏ مل من ‎HOI‏ ١ع.‏ تم النقل الكمي للمحلول إلى دورق حجمي سعة ‎١‏ لتر وتخفيف المحلول إلى الحجم بالماء المتقى. تم تخزين المحلول في الثلاجة ( ا م). الركيزة الصبغية ( 50-43-7754 | ‎YY) (CAS‏ 5 ؟ ملي مولار (مسحضر ‎(Je) 0.Y‏ تمت إذابة حوالي ‎YO‏ مجم من الركيزة الصبغية باستخدام ‎١5.7‏ مل من الماء المنقى. تم تخزين ‎١5‏ _المحلول في الثلاجة (7- 8 م). جلويولين حقيقي بقري 60910501105 ‎Bovine‏ (مستحضر ‎٠١‏ مل). في حاوية بسعة دنيا ‎Yoo‏ ‏مل تم إدخال ‎YE‏ مل من الماء المنقى المبرد بالثلج ومع التقليب تمت إضافلة ١٠مل‏ من البلازما البقري. وتم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 5.7 + ‎١٠‏ بحمض أسيتيك ‎acetic acid‏ 961. تم السماح بالاستقرار عند ‎١ sad aA SY‏ إلى ‎١6‏ ساعة. تمت إزالة محلول المادة الطافية ‎solution ٠٠‏ 50066008801 ._الرائق بالسحب بالماصة وجمع الراسب بالطرد المركزي ‎centrifugation‏ عند ‎YA.‏ لفة في الدقيقة لمدة © دقائق ‎fs‏ م. تم تعليق الراسب المشتت ميكانيكياص ‎Sie)‏ عن طريق قضيب زجاجي معملي ‎(laboratory glass rod‏ في #مل من الماء المنقى المبرد ‎Fant‏ ثم الرج ‎AW‏ حوالي ‎fo}‏ دقائق وجمع الراسب بالطرد المركزي ‎6٠ die‏

لفة في الدقيقة لمدة © دقائق و4 م. تم تشتيت الراسب ميكانيكياً إلى حوالي ‎٠١‏ مل من تريس - ‎NaCl‏ ؛ ولتسهيل ذوبان الراسب يتم تكسير جسيمات الراسب بأداة مناسبة ‎Jig)‏ قضيب زجاجي معملي). يتم تخزين المعلق الناتج عند 7- ‎A‏ م لمدة لا تقل عن ساعة ولا تزيد عن ‎١‏ ساعات قبل استخدامه. المحاليل القياسية ومحاليل عينة ديفيبروتيد المحلول الأم المرجعي في دورق حجمي ‎volumetric flask‏ سعة ١٠مل‏ تم النقل الكمي ‎٠٠١ Mad‏ مجم من عينة مرجعية قياسية من ديفيبروتيد التي تم قياسها بدقة. تمت إذابة مسحوق بحوالي ‎٠٠١‏ مل من تريس- ‎NaCl‏ والوصول إلى الحجم بنفس المذيب. تم التخفيف بنسبة ‎:١‏ ؛ للحصول على ‎٠‏ المحلول مع تريس- ‎NaCl‏ للحصول على محلول مرجعي من ديفيبروتيد حوالي ‎٠١76‏ مجم/ مل. المحلول الأم للعينة في دورق حجمي سعة ‎٠‏ “مل ثم النقل الكمي لحوالي ‎Ye‏ مجم من ‎ae‏ ديفيبروتيد التي ثم قياسها بدقة. تمت إذابة مسحوق بحوالي ‎٠١‏ مل من تريس - ‎NaCl‏ والوصول إلى الحجم بنفس المذيب. تم التخفيف بنسبة ‎:١‏ ؛ للحصول على المحلول مع تريس- ‎NaCl‏ للحصول على محلول ‎V0‏ عينة من ديفيبروتيد حوالي ‎٠١5‏ مجم/ مل. تحضير المحاليل المرجعية ومحاليل العينة أ) ديفيبروتيد ‎fang See) YO‏ مل: تمت تخفيف محلول أم لديفيبروتيد ‎٠١ :١‏ (مرجعي وللعينة) باستخدام تريس- ‎00d ll NaCl‏ ميكرو جم/ مل في عين الطبق). وفي أنبوب اختبار إبندروف تم النقل الكمي ‎000d‏ ميكرو لتر من المحلول المحضر والخلط مع 550 ميكرو لتر من ‎٠‏ ديفيبروتيد. تم غلق الأنبوب والتخزية في ماء مبرد بالثلج. ب) ديفيبروتيد 17.25 ميكرو ‎fan‏ مل: يتم تخفيف محلولل() ‎:١‏ ؟ باستخدام تريس- ‎NaCl‏ ‏(مناظر ‎YoU‏ ميكرو جم/ مل في عين الطبق). وفي أنبوب اختبار إبندروف ‎eppendorf tube‏

تم النقل الكمي ‎0d‏ 0 ميكرو لتر من المحلول المحضر والخلط مع ‎50٠0‏ ميكرو لتر من جلويولين حقيقي. تم غلق الأنبوب والتخزية في ماء مبرد بالثلج ‎.ice—cooled water‏ ‎(z‏ ديفيبروتيد ‎7١.‏ ميكرو ‎[ox‏ مل: يتم تخفيف محلول(ب) ‎AEA‏ باستخدام تريس - ‎NaCl‏ ‎hale)‏ ل7.5١‏ ميكرو جم/ مل في عين الطبق). وفي أنبوب اختبار إبندروف تم النقل الكمي ‎٠١01‏ ميكرو لتر من المحلول المحضر والخلط مع ‎©٠0٠١‏ ميكرو لتر من جلويولين حقيقي. تم غلق الأنبوب والتخزية في ماء مبرد بالثلج. 2( ديفيبروتيد ‎[ox Se YY.0‏ مل: يتم تخفيف محلول(ب) ‎١ :١‏ باستخدام تريس - ‎NaCl‏ ‏(مناظر 00 ميكرو جم/ مل في عين الطبق). وفي أنبوب اختبار إبندروف تم النقل الكمي ‎ov vd‏ ميكرو لتر من المحلول المحضر والخلط مع 500 ميكرو لتر من جلويولين حقيقي. تم غلق ‎٠‏ الأنبوب والتخزية في ماء مبرد بالثلج. المحلول الغفل ‎Blank solution‏ يتم خلط ‎١‏ حجم من ديفيبروتيد مع ‎١‏ حجم من محلول تريس - ‎Ou Jie) NaCl‏ ميكرو لتر + ميكرو لتر). ترسيب الطبق ‎Vo‏ طبقاً لمخطط الترسيب المقترح (راجع جدول ‎)١‏ التالي تتم في كل عين بالطبق إضافة ‎٠٠١0‏ ميكرو لتر من المحلول القياسي؛ أو العينة؛ أوالمحلول الغفل. ولا يمكن استخدام مخطط ترسيب مختلف طبقا لتوفر وشكل الماصات الآلية ‎pipettes‏ 8010071810. مع ذلك؛ لا يجب استخدام أقل من ؛ ترسيبات لكل محلول مرجعي أو للعينة للتجربة. قبل احتضان الطبق مباشرة في قارئ الأطباق المجهرية ‎microplate reader‏ تتم إضافة ‎٠*٠‏ ‎Ye‏ ميكرو لتر لكل عين من ركيزة صبغية. جدول ‎١‏ ya - | - | - | - | - | - | 5١ Cd | 5١ Cc | 5١ Cb | S\ Ca | BLK | - | i

BEEEEEEEIEC EI oT rc Fro Feros ET

Foy ‏اتن توا توا أ‎ ‏ل‎ ET EE

J pf FY TON IY FTCA FT

EEE EEE EAA ACTS

EEEEER rT ‏أن‎ 7 - 3 0 5010077 ‏المحلول — ل‎ 0 : = 15 58 ٍ 5 ‏الترسيب 4؛‎ oF ‏الترسيب‎ CY ‏الترسيب‎ ‏الترسيب 4؛‎ oF ‏لاه: ترسيب محلول العينة ١؛ الترسيب ؟؛ الترسيب‎ (YU YU VU ‏وج الخ.‎ es J ‏المرجعي وللعينة‎ Defibrotide ‏الخ.: تركيز ديفيبروتيد‎ «Cc «Cb (Ca ‎:BLK 5‏ المحلول الغفل الحسابات والنتائج ‎٠+‏ _١3من‏ الرسم البياني الحركي يحدد "الامتصاص مقابل الزمن" المستحضرات القياسية (مثلاً ‏©©_59 « 59-06 ) مدى خطي مناسب (مثلاً من ‎١0‏ إلى ‎Yo‏ دقيقة؛ راجع الشكل رقم 3). ‏تحديد المدى الحركي ‎A) ball‏ عند £00 نانو ‎jie‏ مقابل الزمن). ‎٠‏ حساب لكل مستحضر من المرجعية و العينة استجابة (منحدر) التجربة في المدى الزمني المحدد سلفا كما يلي. استجابة العينة 8 المرجعية- ‎٠٠٠١ x 18 - Tb/Ab-Aa‏

=« \ _ ‎Aa‏ هو قيم الامتصاص عند الزمن 18 )0 دقيقة من الرسم البياني من أعلى) ‎Ab‏ هو قيم الامتصاص عند الزمن ‎Th‏ )¥0 دقيقة من الرسم البياني من أعلى) تم تسجيل القيمة التي تم الحصول عليها في تنسيق جدول كما هو مبين في جدول ؟ ‎Yds ©‏ مستوى التركيز [ميكرو جم/ مل] ‎vU YU YU 5 5 5 VS‏ نا ‎CC‏ ‏تم التسجيل البياني للاستجابات للامتصاص المراد دراسته للمستحضر القياسي مقابل لورغاريتمات التركيز وحساب نشاط الامتصاص المراد دراسته باستخدام النموذج الخطي المتوازي كما حدده الفصل ‎Y=Y=0‏ من الطبعة الحالي ‎Ph.

Eur)‏ . يجب عدم استخدام مالا يقل ‎Toe‏ تخفيفات متسلسلة متتالية من المرجعية والعينة ‎Oe)‏ تركيز ‎٠‏ ديفيبروتيد © ميكروجم/ مل؛ أو ‎١١©‏ ميكروجم/ مل؛ أو ‎YO‏ ميكروجم/ مل؛ أو ‎٠٠‏ ميكروجم/ مل؛ أو © ميكروجم/ مل؛ أو ‎١١١‏ ميكروجم/ ‎cde‏ أو ‎YO‏ ميكروجم/ ‎cde‏ أو ‎٠‏ 5 ميكروجم/ مل). تحليل التباين yy . ‏والطبعة الثانية من‎ Ph. Eur. ‏من الطبعة الحالية ل‎ 7-7-٠ ‏يتم إجراء تحليل التباين طبقاً للجزء‎

Finney DJ (Y41¢) Statistical Method in Biological Assay. ‏اختبار التأكد‎ ‏ذات دلالة أي كانت الاحتمالية‎ linear regression terms ‏كانت حدود الارتداد الخطي‎ .9645 Cul ‏فإذا لم يتحقق هذا المعيار؛ فلن يمكن حساب‎ vivo ‏المحسوبة أقل من‎ © .٠..6 ‏لم يكن حد عدم التوازي ذا دلالة؛ أي الاحتمالية المحسوبة أقل من‎ cer 0 ‏حد عدم الخطية لم يكن ذا دلالة؛ أي الاحتمالية المحسوبة أقل من‎ ‏معايير القبول‎ ‏من الفعالية المذكورة.‎ 9611١ ‏ولا تزيد عن‎ % ٠ ‏لم تكن الفعالية المقدرة أقل من‎ ‏تزد عن 96175 من الفعالية‎ aly 96860 ‏حدود الثقة 020.95 للفعالية المقدرة لم تكن أقل من‎ ٠ ‏المذكورة.‎ ‏الحساب‎ ‎Sample Potency (U/mg) = R x Std ah Ra (mg/mL) ‏حيث:‎ ‎parallel line ‏+ا: هي نتيجة العينة التي تم الحصول عليها بتحليل النموذج الخطي المتواني‎ Vo model dry ‏الفعالية المذكورة للمرجعية (وحدة دولية/ مجم على المادة الجافة‎ Std Potency (substance ‏تركيز المرجعية (وحدة دولية/ مجم على المادة الجافة)‎ :Conc. Std ‏تركيز العينة (وحدة دولية/ مجم على المادة الجافة)‎ :Conc. Sample Y. gov.

— \ \ — التجربة المستخدمة في صيغ ديفيبروتيد تم استخدام التجربة التي سبق الكشف عنها في تحديد النشاط الحيوي للصيغ السائلة المحتوية على ‎Yeo‏ مجم من ديفيبروتيد في ‎Y.0‏ مل ) ‎A‏ مجم/ مل) والمحتوية على التركيب الكمي النوعي الوارد في الجدول ؟ © جدول ؟ المكون نوعية الوظيفة حقن ١٠٠مجم‏ | التركيز المرجعية إلى لكل مل القياسية سيترات الصوديوم ‎USP - EP | Sodium‏ | محلول منظم ‎YO‏ مجم ‎٠‏ مجم ‎gla (Citrate‏ هيدرات ‎Dihydrate‏ ‏ماء للحقن ‎USP - EP‏ | مذيب/ ناقل كمية كافية إلى | ١مل‏ .مل هيدروكسيد الصوديوم | مع - ‎١ NF‏ تعديل الرقم اكمية كافية إلى ‎١ Sodium hydroxide‏ الهيدروجيني ‎V.A=TLY‏ ‏مولار أو حمض الهيدروكلوريك ‎١ hydrochloric acid‏ مولار النيتروجين ‎Nitrogen‏ مح - ‎١ NF‏ غاز خامل | كمية كافية لازاحة الهواء النتائج مبينة في جدول ؛

اس جدول ؛ التشغيلة الفعالية الفعالية وحدة دولية/ مجم | وحدة دولية/ حاوي من ‎٠٠090‏ مجم ‎gov.‏

"١

TA ‏نين‎ ٠١اصتنلنلخأإ‎

HHH

__ i sn

Reference Standard ‏المستخدمة كمقياس مرجعي‎ * gov.

Claims (1)

1. اج \ — عناصر الحماية ‎-١‏ طريقة لتقدير النشاط الحيوي ‎biological activity‏ النوعي لديفيبروتيد ‎defibrotide‏ حيث ‏تشتمل الطريقة على الخطوات: ‏0 ملامسة ديفيبروتيد ‎cdefibrotide‏ وجلويولين حقيقي ثديي ‎euglobulin‏ 11811710081181 وركيزة ‏خاصة بالبلازمين 01850010؛ حيث أنه بالتفاعل مع البلازمين ‎plasmin‏ يتم توفير منتج يمكن ‏© قياسه و ‏ب) قياس كمية المنتج المتكون على أزمنة متتالية؛ وبالتالي تحديد النشاط الحيوي ‎biological‏

   ‎.defibrotide ‏لديفيبروتيد‎ activity ‏"- الطريقة طبقاً لعنصر الحماية ‎٠‏ حيث أن الجلويولين الحقيقي 611910051110 هو جلويولين ‎٠‏ حقيقي 3% ‎.mammalian euglobulin‏ ‎dahl) -"‏ طبقاً لعنصر الحماية ‎٠‏ حيث أن الجلويولين الحقيقي 611910051110 هو جلويولين ‏حقيقي ‎euglobulin‏ بشري 0000180 أو من الأرنب ‎rabbit‏ أو بقري ‎bovine‏ ‎Vo‏ ؛- الطريقة طبقاً لعنصر الحماية ‎١‏ حيث أن البلازمين ‎plasmin‏ الذي يتفاعل مع الركيزة ‏الخاصة بالبلازمين ‎plasmin‏ يطلقه ‎alge‏ البلازمين ‎plasminogen‏ الموجود في الجلويولين

   ‎.euglobulin ‏الحقيقي‎ ‎—o0‏ الطريقة طبقاً لعنصر الحماية ‎١‏ حيث أن الركيزة الخاصة بالبلازمين 01850010 هي ركيزة ‎٠‏ صبغية ‎.cromogenic substrate‏ ‏- الطريقة ‎lads‏ لعنصر الحماية ‎٠‏ حيث أن الركيزة الخاصة بالبلازمين ‎plasmin‏ هي مركب له ‏الصيغة 8/١-/7-/3-ل‏ ؛ التي فيها ‎AGIA‏ ¥ عبارة عن أحماض أمينية غير قطبية -000 ‎polar amino acids‏ بشكل سائد» ‎vA‏ عبارة عن ليسين ‎lysine‏ أرجينين ‎arginine‏ ول ‎Yo‏ تمثل المنتج الممكن رصده.

   — أ \ — "- الطريقة طبقاً لعنصر الحماية 1 حيث يتم اختيار المنتج الممكن قياسه ‎X‏ من المجموعة المكونة من بارا - نيترو ألينين ‎para—nitroaniline‏ و ‎—Y‏ نافتيلامين ‎.naphthylamine‏ ‏0 +- الطريقة طبقاً لعنصر الحماية ‎of‏ حيث أن الركيزة الخاصة ‎plasmin pull‏ هي ‎D-H‏ ‏- فاليل-ا - لوسيل-ا - ليسين-م - تيترو أنيلين ‎H-D-Valyl-L-Leucyl-L—‏

   ‎.Lysine—p-—nitroaniline‏ ‏4- الطريقة طبقاً لعنصر الحماية 7؛ حيث يتم قياس المنتج القابل للقياس )ل عن طريق القياس ‎٠‏ الطيفي الضوئي ‎spectrophotometry‏ أو القياس الطيفي التألقي ‎.spectfofluorimetry‏ ‎-٠‏ الطريقة طبقاً لعنصر الحماية ‎oF‏ حيث .يتم إعادة تكوين جلويولين حقيقي الثديي ‎mammalian euglobulin‏ بنفس الحجم للبلازما 0185008 الناشئة أو يتم تخفيفه بنسبة ‎٠١ :١‏ مع محلول ملحي مناسب وركيزة صبغية/ تألقية ‎chromogenic/fluorogenic substrate‏ ‎Ve‏ بتركيز يتراوح من ©.؟ إلى ‎Veo‏ ملي مولار؛ ويفضل ؟ ملي مولار. ‎-١١‏ الطريقة طبقاً لعنصر الحماية ‎»١‏ حيث يتم إجراء الطريقة المذكورة في وسط تفاعل عبارة عن محلول ‎aqueous solution Ak‏ منظم إلى رقم هيدروجيني يتراوح من ‎١‏ إلى ‎A‏ ويفضل رقم ‎ARLES SPE‏

   ‎Y.‏ ‎-١‏ الطريقة طبقاً لعنصر الحماية ‎o)‏ حيث يتم الحفاظ على درجة الحرارة بين ‎TO‏ و79 م؛ ويفضل عند ‎VV‏ م. ‎-٠‏ الطريقة طبقاً لعنصر الحماية ‎Cus)‏ يتراوح تركيز الركيزة الخاصة بالبلازمين ‎plasmin‏ ‎Yo‏ من ‎٠.‏ إلى ¢ ملي مولارء ويفضل من ‎Y.0‏ إلى 5 ملي مولار» وا لأفضل ملي مولار.

   ا" 64- الطريقة طبقاً لعنصر الحماية ‎dua)‏ تشتمل الطريقة على الخطوات (ج) قياس معدل إطلاق المنتج القابل للقياس أثناء التفاعل الإنزيمي ‎enzymatic reaction‏ لكل من عينة قياسية وعينة اختبار من ديفيبروتيد ‎cdefibrotide‏ د) ‎all‏ الرياضي و/ أو الرسومي؛ بين معدل الإطلاق وتركيز ديفيبروتيد ‎defibrotide‏ المناظر للحصول على النشاط الحيوي ‎biological‏ ‎dual activity | ©‏ الاختبار من ديفيبروتيد ‎.defibrotide‏ ‎gov.‏

   سس سل لل لل ا 8 8 ~ }3 ‎ox‏ 3 ‎Hy i‏ 3 3 3 3 ‎Hy‏ ‎Hy 3‏ ‎Ny 3 ci‏ بي ا 1 3 ‎i i REE‏

   ‎b . a‏ 3 ‎RRR‏ 3 3 حي 3 3 ‎BRR‏ ¥ ‎J ss‏ ‎N H ETT‏ ‎H 3 RR Ta }‏ امم لجنيا امن ايها مان جح :> الات ااا ا »>< ‎ky‏ ‏: > > 1 1 0 ا 5 ‎ae‏ ل" ا ‎AR RRR‏ ا ‎Saad‏ 8 2 سس تبي 1 8 3 ‎i i (RRS‏ ل .م ‎ad‏ 3 ! ل نا 0000ل الم يي ان 8 3 1 ‎TN‏ ا ا ‎ua‏ 5 ¥ ؟ 34 ‎oa eo ee SERIE‏ 3 * ‎Ca ras‏ اين 4 }3 الجسس لاا سجن مهاج لات اج نظ % ‎N RIE a‏ 9 ‎I ETE J‏ 3 ك ال ا 8 ل : ‎i‏ 94 اتا اا ااا ‎an‏ 3 3 5 0 ا اش ات ممح ‎RN RSI EN CRD DA DIN BE oS RR ER RA RE A SRE RB RE DE‏ 8 3% = ‎rg Teper 3‏ ‎N 3 3‏ 3 8 3 3 5< ‎RRR RRR‏ الح لاا الال ااي ال ااا الل لاا الاج 4 ‎N‏ 3 ‎x‏ ¥ 8 ‎v Hy‏ 1 : : 3 . ‎Ax Xx‏ يخ ‎FS‏ و 7+ 3 ‎Hy‏ ‏السسسحت ‎N FE EE EE EE i SS‏ ‎HN N 3 3 RN‏ ‎X i‏ المي ‎WW‏ الل ؟ 8 + 5 1 ا >< 8 ا د ‎RN oF 3‏ بيخ 3 3 ¥ و الس امه ‎N‏ 5 ‎Hy N N‏ ‎Hy ]‏ الج ‎RR,‏ ‎wie om 4‏ ‎re Wt‏ بالدقاية : ‎Le‏ بالدثاثق. الشكل ركم + ‎Vas fof‏

   ‎RRR‏ م د مه د حي دحي دح سدس ده ييا # م اا ‎PEE pd 3‏ ل 3 ‎i‏

   ‎LI. Ee 3‏ 3 ؟* ؟: ‎i 3 Bina oN Ed‏ ‎H 3 SRR: 4‏ 3 اس ‎FI ER‏ ‎RE Ed‏ الاي 33 ‎Ey‏ اه ‎i 3 a Nin‏ ‎I * SE 4‏ 1 = الي ‎I‏ ‏: لا 5 ‎Ral 0‏ 0 ‎SR 8‏ ؟ ‎i‏ ‎SEE % Ed‏ 3 ‎HE aoe H‏ ان ‎id Si‏ 5

   ‎I. Et 5‏ ¥ ‎iy 3 Se by‏ ‎i Et °° H‏ : ‎SR = 3‏ 6خ ‎oa‏ ‎i! 2 3 REE ; 3‏ ‎Joo i RACERS : H‏ ‎i‏ مي 0 لل لكي ‎i‏ ب ‎SET 8‏ 25 ‎oF Se 2 a‏ 3 1 ‎oo Psy x‏ 3 & 5 رقي ا ا : ‎by‏ : ا > 3 ‎bs‏ ‎ld 3 5 RR a 3‏ ‎oo OR ra A‏ 3 < 3 ‎co a‏ : ما الأب ‎FOE‏ ‎A ane 0 8 ES‏ 3 ‎x‏ > اح ‎SE‏ 3 ‎by‏ ِ نا الا اليا 3 ‎AA > a‏ لي 3 ‎SAR Hy‏ 3 ‎HS‏ ب ا 3 ‎i RE " i‏ ‎by‏ ا اا لبي 3 ‎a‏ تي ‎i Se‏ 3 ال ‎hy PEE SS > AE Hy‏ ‎PRE 3‏ 3 » ‎ae i‏ 3 3 - متت ا : ‎RS i‏ ا ‎ee 3 x‏ ا ‎I EH‏ ‎BARAK x‏ 3 & 1 سيد ؟ 3 3 ‎py »‏ 3 3 ‎LE SLES‏ احا احا ‎ELE LLL LE a ELE LL‏ ع :< + + 1 & ‎H ¥ 3‏ <> ‎x ¥ ¥ ¥‏ ا ل 8 ا & ‎Ed Re‏ ل ‎PRINS PE PEC‏ 4 تزكيز الديقييرو تيد ميكر و جرام مل ا 8 ا ‎٠ AR‏ الس الج 3 1 الشكل كن 3 عا

   ©,

   i i i i i i i i i DE ‏جح كح‎ i i 1 i i i i . 3 0) 1 ‏ممسشسسسسسسسسستساال قار‎ A i 1 3 0) Sol / ‏ب‎ ‎i wok } ‏ا ل‎ 8 ‏ا‎ gat # 1 ‏قو لي‎ * N ‏ا‎ LA «* i ‏ا د ا ال اب أنهو سسأ سس سسا له #كورم‎ : ‏ا‎ or : ah ‏ل‎

   ا ‎N‏ حي

   ‎Lal :‏ جه الل

   ‎0 i ‏كود‎ ET 51 Re ia ‏الل حك‎ N PL oF

   ‎4 - ‏ال الس‎ we 3 NEE 0)

   ‎3 N Np SO og RR pe i i SR { N 1 1 5430 0 ‏أ‎ i N o i adi AS RE 3 N ‏ا .ا‎ GREY GAPS ‏مجم‎ sss ‏د لل ل ل‎ sss “ v 8 i i 3 0) i : N sib A AAA AA AAA AA A AAA AAA AAA A AAA AA AAA AAA fr A AA AA AAA AA AAA A AAA RA AAA A AAR 1 PEE $+ ® * 0 3 $ 1 ¥ 8 ¥ : 0 3 Rate i > 8 ‏مطح يا د‎ TE Ea Ta Fa ‏ل اله المج‎ i i i HE SE 4 i i \ i die 3

   ‎SHEL. et ‏الزمن بالدقاق‎ oa TL Tak g ‏لحي‎

   مدة سريان هذه البراءة عشرون سنة من تاريخ إيداع الطلب وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها أو سقوطها لمخالفتها لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية صادرة عن مدينة الملك عبدالعزيز للعلوم والتقنية ؛ مكتب البراءات السعودي ص ب ‎TAT‏ الرياض 57؟؟١١‏ ¢ المملكة العربية السعودية بريد الكتروني: ‎patents @kacst.edu.sa‏