RU2612150C2 - Penicillium vulpinum micromycetes strain f-1523 with antibacterial activity on anthrax agent bacillus anthracis - Google Patents
Penicillium vulpinum micromycetes strain f-1523 with antibacterial activity on anthrax agent bacillus anthracis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2612150C2 RU2612150C2 RU2015122210A RU2015122210A RU2612150C2 RU 2612150 C2 RU2612150 C2 RU 2612150C2 RU 2015122210 A RU2015122210 A RU 2015122210A RU 2015122210 A RU2015122210 A RU 2015122210A RU 2612150 C2 RU2612150 C2 RU 2612150C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- vulpinum
- bacillus anthracis
- anthrax
- micromycetes
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/80—Penicillium
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии.The invention relates to the field of medical microbiology and biotechnology.
Борьба с возбудителем сибирской язвы в природных очагах ее распространения является важнейшей задачей по профилактике заражения бактериальной инфекцией человека и животных. Одной из задач по обеспечению проведения противоэпидемических мероприятий в отношении возбудителя сибирской язвы является внедрение в практику новых дезинфектологических препаратов и технологий их применения [О мерах совершенствования мероприятий по профилактике сибирской язвы в Российской Федерации. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г.Г. Онищенко №41 от 27 июня 2008 г.].The fight against the causative agent of anthrax in the natural foci of its spread is the most important task in preventing infection with a bacterial infection of humans and animals. One of the tasks to ensure the implementation of anti-epidemic measures in relation to the causative agent of anthrax is the introduction into practice of new disinfectological drugs and technologies for their use [On measures to improve measures for the prevention of anthrax in the Russian Federation. Resolution of the Chief State Sanitary Doctor of the Russian Federation G.G. Onishchenko No. 41 dated June 27, 2008].
Известно, что до настоящего времени основными средствами деконтаминации зараженной сибиреязвенным микробом почвы продолжают оставаться химические дезинфицирующие средства [Соколова Η.Ф. Современные средства и методы для дезинфекции при сибирской язве // Материалы VIII Всероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: Сб. статей. - М.: Росинэкс. - 2002. - С. 56-57].It is known that until now, chemical disinfectants continue to be the main means of decontamination of soils infected with anthrax microbe [Sokolova Ф.F. Modern means and methods for disinfection in anthrax // Materials of the VIII All-Russian Congress of Epidemiologists, Microbiologists and Parasitologists: Sat. articles. - M.: Rosinex. - 2002. - S. 56-57].
Известно также, что химические средства имеют ряд недостатков экологического и санитарно-гигиенического характера [Федорова Л.С. Дезинфицирующие свойства хлорактивных соединений и средств на их основе (обзор литературы) / Л.С. Федорова, И.М. Цвирова, А.С. Белова, Н.С. Левчук // Ж. Дезинфекционное дело. - 2011. - №4. - С. 11-19].It is also known that chemicals have a number of disadvantages of environmental and sanitary-hygienic nature [Fedorova LS The disinfecting properties of chloroactive compounds and agents based on them (literature review) / L.S. Fedorova, I.M. Tsvirova, A.S. Belova, N.S. Levchuk // J. Disinfection business. - 2011. - No. 4. - S. 11-19].
Известно что, в перечне дезинфицирующих средств, используемых для обеззараживания почвы, полностью отсутствуют биологические препараты [Дезинфицирующие средства: Справочник. М: Торговая компания «БИНГО ГРАНД». - 2007. - 336 с].It is known that, in the list of disinfectants used for disinfecting the soil, biological preparations are completely absent [Disinfectants: Handbook. M: Trading company "BINGO GRAND". - 2007. - 336 s].
Вместе с тем известно, что почва богата микробными антагонистами, выполняющими заметную роль в элиминации бактериальных патогенов [Черкасский Б.Л. Принципы и перспективы санации почвенных очагов сибирской язвы // Материалы Международ. симпоз. по дезинфекции и стерилизации. - М.: Медицина, 1972. - С. 54-56].However, it is known that the soil is rich in microbial antagonists that play a prominent role in the elimination of bacterial pathogens [B. Cherkassky Principles and prospects for the rehabilitation of soil foci of anthrax // Materials International. symposium for disinfection and sterilization. - M .: Medicine, 1972. - S. 54-56].
Известно, что в отношении бактерии Bacillus anthracis наибольшим потенциалом антагонистического воздействия обладают культуры Streptomyces roseus, Bacillus subtilis, Escherichia coli [Семенова C.A., Галиуллин А.К. Микробные антагонисты для биологической санации скотомогильников // Ученые записки КГАВМ. - Казань. - 2010. - Т. 204. - С. 246-251].It is known that in relation to the bacterium Bacillus anthracis, the cultures of Streptomyces roseus, Bacillus subtilis, Escherichia coli possess the greatest potential for antagonistic effects [Semenova C.A., Galiullin A.K. Microbial antagonists for the biological rehabilitation of cattle cemeteries // Uchenye zapiski KGAVM. - Kazan. - 2010. - T. 204. - S. 246-251].
Известно также, что среди микробов, подавляющих развитие возбудителя сибирской язвы, наиболее изучены актиномицеты [Калюжная Л.Д. Изучение антагонистического действия актиномицетов на бациллы сибирской язвы / Л.Д. Калюжная, А.М. Брянская, А.С. Коротич, В.П. Касавченко // Ж. Антибиотики. - 1975. - №7. - С. 617-623]. Микромицеты как антагонисты возбудителя сибирской язвы еще не известны.It is also known that among the microbes that suppress the development of the causative agent of anthrax, the most studied actinomycetes [Kalyuzhnaya L.D. Studying the antagonistic action of actinomycetes on anthrax bacilli / L.D. Kalyuzhnaya, A.M. Bryansk, A.S. Korotich, V.P. Kasavchenko // J. Antibiotics. - 1975. - No. 7. - S. 617-623]. Micromycetes as antagonists of the causative agent of anthrax are not yet known.
Задачей изобретения является получение нового штамма микромицета Penicillium vulpinum (Cooke et Massee) Seifert et Samson с выраженными антибактериальными свойствами в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.The objective of the invention is to obtain a new strain of micromycete Penicillium vulpinum (Cooke et Massee) Seifert et Samson with pronounced antibacterial properties against the causative agent of anthrax Bacillus anthracis.
Штамм гриба Penicillium vulpinum АА-74 выделен из почвы, собранной в Тверской области в мае 2011 года. Штамм депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск). Справка о депонировании №468 от 16.10.2012. Штамму присвоен регистрационный номер F-1523. Штамм характеризуется следующими признаками.The strain of the fungus Penicillium vulpinum AA-74 was isolated from soil collected in the Tver region in May 2011. The strain is deposited in the State collection of pathogenic microorganisms and cell cultures (GKPM-Obolensk). Certificate of deposit No. 468 dated 10/16/2012. The strain is assigned registration number F-1523. The strain is characterized by the following features.
Культурально-морфологические особенности штамма:Cultural and morphological features of the strain:
Колонии растут умеренно, через 7 дней при 25°С на среде Чапека достигают размера 12-20 мм, на ММС - 25-30 мм. Краевая зона колонии низкая, светлоокрашенная, в центральной части хорошо развиты коремии 2-3 мм высотой. Ножки коремий плотные, гладкостенные, от белого до телесного или розового цвета, простые или разветвленные; верхушки с булавовидной, лопаточко-видной или состоящей из обособленных асимметрических кисточек конидиеносной структурой. Кисточки иногда скучены в колонки серовато-зеленого цвета с желтоватым оттенком. Обратная сторона колонии от кремовой до красновато-коричневой, при старении темнеет. Пигмент в среду не диффундирует. Капли экссудата прозрачные. Вегетативный мицелий белый или светло-сероватый; гифы обычно несут разбросанные кисточки конидий. Конидиеносцы плохо выражены, гладкие, 3,5-4 мкм в диаметре. Рами цилиндрические, 10-25×3-4 мкм. Метулы цилиндрические 9-12×2-3 мкм. Фиалиды цилиндрические, 8-11×2,2-3 мкм. Конидии эллиптические, гладкостенные, 4-4,5×3-3,5 мкм, в массе зеленовато-серые, в цепочках, сжатых в короткую колонку, обычно сохраняются в цепочках в жидкой среде.The colonies grow moderately, after 7 days at 25 ° C on the Chapek medium they reach a size of 12-20 mm, on MMS - 25-30 mm. The marginal zone of the colony is low, light-colored, in the central part, coremia 2-3 mm high are well developed. The legs of Korea are dense, smooth-walled, from white to flesh or pink, simple or branched; apices with a club-shaped, scapular-shaped or conidiophobic structure consisting of separate asymmetric brushes. Brushes are sometimes clustered in columns of a grayish-green color with a yellowish tinge. The reverse side of the colony, from cream to reddish brown, darkens with aging. The pigment does not diffuse on Wednesday. The exudate drops are clear. Vegetative mycelium is white or light gray; GIFs usually carry scattered conidia brushes. Conidiophores are poorly expressed, smooth, 3.5-4 microns in diameter. Rami cylindrical, 10-25 × 3-4 microns. Metula cylindrical 9-12 × 2-3 microns. The phialides are cylindrical, 8-11 × 2.2-3 microns. Conidia are elliptic, smooth-walled, 4-4.5 × 3-3.5 μm, greenish-gray in mass, in chains compressed into a short column, they are usually stored in chains in a liquid medium.
Физиолого-биохимические особенности штамма:Physiological and biochemical features of the strain:
Аэроб. Температурный оптимум роста 25-30°С. Оптимальный рН в пределах от 5,0 до 8,0. Оптимальный рост гриба отмечен на средах, где в качестве источника углерода использовали сахарозу, крахмал, мелассу, в качестве источников азота - хлористый аммоний, азотнокислый висмут, азотнокислый аммоний, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, глютен. Тиомочевина и мочевина как источник азота грибом не используетсяAerobe. The temperature optimum of growth is 25-30 ° C. The optimum pH is between 5.0 and 8.0. Optimal fungal growth was observed in media where sucrose, starch, molasses were used as the carbon source, ammonium chloride, bismuth nitrate, ammonium nitrate, corn extract, yeast extract, and gluten were used as nitrogen sources. Thiourea and urea are not used as a source of nitrogen by the fungus
Антагонистические свойстваAntagonistic properties
Штамм гриба Penicillium vulpinum F-1523 обладает антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.The strain of the fungus Penicillium vulpinum F-1523 has antagonistic activity against gram-positive and gram-negative bacteria.
Способ, условия и состав сред для культивирования.The method, conditions and composition of the media for cultivation.
Плотные питательные среды: ММС, агар Чапека, агар Сабуро, сусло-агар.Dense nutrient media: MMS, Чapek agar, Saburo agar, wort agar.
Оптимальная температура для роста 22-25°С, длительность культивирования до массовой споруляции - 5-7 суток, в зависимости от состава среды и температуры культивирования.The optimum temperature for growth is 22-25 ° C, the duration of cultivation before mass sporulation is 5-7 days, depending on the composition of the medium and the temperature of cultivation.
Способ, условия и состав сред для длительного хранения:Method, conditions and composition of media for long-term storage:
1. В обезвоженном состоянии на ионообменной смоле, хранение при температуре (4-8)°С, перезакладка через 5 лет.1. In a dehydrated state on an ion-exchange resin, storage at a temperature of (4-8) ° C, re-laying after 5 years.
2. Под минеральным маслом на агаре Чапека, хранение при температуре (4-8)°С, перезакладка через 1 год.2. Under mineral oil on апapek agar, storage at a temperature of (4-8) ° C, re-laying after 1 year.
3. В жидком азоте, срок хранения не ограничен.3. In liquid nitrogen, the shelf life is unlimited.
4. В лиофилизированном виде, хранение при температуре (4-8)°С, не менее пяти лет.4. In a lyophilized form, storage at a temperature of (4-8) ° C, at least five years.
Характеристика представленных образцов (упаковка, состав защитной среды, концентрация микробных клеток, условия хранения, периодичность перезакладки и т.п.):The characteristics of the presented samples (packaging, composition of the protective environment, concentration of microbial cells, storage conditions, frequency of re-laying, etc.):
Стеклянные флаконы вместимостью 3,5 см3, содержащие обезвоженную контактно-сорбционным методом суспензию заспорованной культуры микромицета. Исходный объем суспензии - 0,1 см3, исходная концентрация клеток ~ 6,5×108 КОЕ/см3. Хранить при температуре (4-8)°С, перезакладка через 5 лет. Для регидратации культуры использовать охлажденный стерильный физиологический раствор в объеме 5 см3.Glass bottles with a capacity of 3.5 cm 3 containing a suspension of the spoiled micromycete culture dehydrated by the contact-sorption method. The initial suspension volume is 0.1 cm 3 , the initial cell concentration is ~ 6.5 × 10 8 CFU / cm 3 . Store at a temperature of (4-8) ° C, re-laying after 5 years. To rehydrate the culture, use a cooled sterile saline solution in a volume of 5 cm 3 .
Пример 1. Выращивание штамма Penicillium vulpinum F-1523 на твердой питательной среде и оценка его антимикробного спектра действияExample 1. Growing a strain of Penicillium vulpinum F-1523 on solid nutrient medium and evaluation of its antimicrobial spectrum of activity
Для определения антимикробного спектра действия грибной культуры Penicillium vulpinum F-1523 использовали метод блоков, основанный на способности веществ диффундировать в толщу агара и задерживать рост тест-объектов, находящихся в зоне диффузии. Гриб Penicillium vulpinum F1F-1523 выращивают на плотной питательной микологической модифицированной среде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; агар - 15,0; глюкоза - 10,0; мальтоза - 10, NaNO3 - 2,0; KCl - 0,5; FeSO4×7H2O - 0,01; MgSO4×7Η2O - 0,5; Κ2ΗΡΟ4 - 1,0; гентамицин - 0,04 мкг/мл.To determine the antimicrobial spectrum of action of the fungal culture of Penicillium vulpinum F-1523, the block method was used, based on the ability of substances to diffuse into the agar and inhibit the growth of test objects located in the diffusion zone. The fungus Penicillium vulpinum F1F-1523 is grown on a dense nutrient mycological modified medium of the following composition (g / l): peptone - 5.0; yeast extract - 5.0; agar - 15.0; glucose - 10.0; maltose - 10, NaNO 3 - 2.0; KCl - 0.5; FeSO 4 × 7H 2 O — 0.01; MgSO 4 × 7Η 2 O - 0.5; Κ 2 ΗΡΟ 4 - 1.0; gentamicin - 0.04 μg / ml.
Штамм выращивают в течение 5-13 дней в термостате при температуре (24±0,5)°С. Затем из агара с исследуемой культурой P. vulpinum F-1523 пробочным сверлом вырезают блоки диаметром 5 мм и помещают на засеянные и подсушенные газоны тест-культур.The strain is grown for 5-13 days in a thermostat at a temperature of (24 ± 0.5) ° C. Then blocks with a diameter of 5 mm are cut out from agar with the studied culture of P. vulpinum F-1523 with a cork drill and placed on the sown and dried lawns of test cultures.
Для приготовления газонов тест-объектов используют суточные культуры, полученные из музея ГНЦПМБ, которые выращивают на чашках Петри со средой ГРМ (гидролизат рыбной муки). Опытным путем подбирают концентрацию микроорганизмов для получения на чашках Петри сплошного, но не густого газона. Стандартизацию проводят по шкале McFarlanda, используют стандарты мутности. Суспензии суточных тест-культур плотностью 106 кл/мл высевали на чашки Петри диаметром 90 мм по 0,2 мл, растирали шпателем для получения однородного газона и оставляли на 30 мин для полного впитывания в агар. Параллельно используют метод глубинного посева. В чашки Петри предварительно разливают по 10 мл питательной среды ГРМ и оставляют на сутки в термостате (для проверки на контаминацию). На следующие сутки в расплавленный агар - 100 мл добавляют 2 мл суспензии суточной тест-культуры плотностью 10 кл/мл, тщательно перемешивают и разливали по 10 мл в чашки Петри. Диски с культурой гриба помещают на поверхность второго слоя агара после застывания.To prepare the lawns of the test objects, daily crops are used, obtained from the Museum of the State Scientific Center for Microbiology, which are grown on Petri dishes with timing medium (fish meal hydrolyzate). Experimentally select the concentration of microorganisms to obtain a solid but not thick lawn on Petri dishes. Standardization is carried out on a McFarlanda scale, using turbidity standards. Suspensions of daily test cultures with a density of 10 6 cells / ml were sown on 0.2 ml diameter Petri dishes 90 cm, ground with a spatula to obtain a uniform lawn and left for 30 minutes to completely absorb into the agar. In parallel, the method of deep sowing is used. 10 ml of the timing medium are previously poured into Petri dishes and left in the thermostat for a day (to check for contamination). The next day, 2 ml of daily test culture suspension with a density of 10 cells / ml was added to molten agar - 100 ml, mixed thoroughly and poured into 10 ml Petri dishes. Mushroom culture discs are placed on the surface of the second agar layer after solidification.
Каждый опыт проводили в трех повторностях. Активность штамма определяли по среднему значению диаметра зоны подавления роста тест-культур. Диаметры зон подавления роста тест-организмов вокруг блочков измеряли линейкой. При этом была принята следующая шкала активности: высокая активность - диаметр зоны подавления 21-30 мм и более; умеренная активность - диаметр зоны 10-20 мм; низкая активность - диаметр зоны 6-9 мм.Each experiment was carried out in triplicate. The strain activity was determined by the average diameter of the zone of inhibition of growth of test cultures. The diameters of the zones of inhibition of growth of test organisms around the blocks were measured with a ruler. The following activity scale was adopted: high activity — diameter of the suppression zone 21-30 mm or more; moderate activity - zone diameter 10-20 mm; low activity - the diameter of the zone is 6-9 mm.
Из приведенных данных следует, что штамм гриба Penicillium vulpinum F-1523 оказывает антимикробное воздействие на патогенные микроорганизмы различных таксономических групп. Исходя из шкалы активности, наибольшая антибактериальная активность штамма гриба отмечена в отношении бактерий Francisella tularensis и Bacillus cereusFrom the above data it follows that the strain of the fungus Penicillium vulpinum F-1523 has an antimicrobial effect on pathogenic microorganisms of various taxonomic groups. Based on the activity scale, the highest antibacterial activity of the fungal strain was observed against bacteria Francisella tularensis and Bacillus cereus
Пример 2. Выращивание штамма Penicillium vulpinum F-1523 на жидкой питательной среде, получение грибной субстанции и ее испытание на активность в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracisExample 2. Growing a strain of Penicillium vulpinum F-1523 in a liquid nutrient medium, obtaining a fungal substance and testing it for activity against the causative agent of anthrax Bacillus anthracis
Культуру гриба P. vulpinum F-1523 предварительно оживляют путем засева пробирок с плотной питательной средой (агар Чапека, агар Сабуро, сусло-агар). Засеянные косяки выращивают в термостате при температуре +22-25°С в течение 5÷7 суток до массовой споруляции в зависимости от состава среды и температуры культивирования.The fungus culture of P. vulpinum F-1523 is pre-revitalized by inoculation of tubes with a dense nutrient medium (Capeca agar, Saburo agar, wort agar). Inoculated jambs are grown in a thermostat at a temperature of + 22-25 ° C for 5-7 days before mass sporulation, depending on the composition of the medium and the temperature of cultivation.
Для культивирования штамма в колбах используют питательную среду следующего состава (г/л):For the cultivation of the strain in flasks using a nutrient medium of the following composition (g / l):
Для засева питательной среды готовят 3-суточный инокулят. Для получения инокулята в среду помещали агаровый блок с газоном гриба, выращенного на среде Чапека+.For inoculation of the nutrient medium, a 3-day inoculum is prepared. To obtain the inoculum, an agar block with the lawn of the fungus grown on Chapek + medium was placed in the medium.
Для засева питательной среды используют инокулюм в количестве 5 мл. Культивирование осуществляют в качалочных колбах V=750 мл, содержащих 100 мл среды при температуре 25°С на подвесной качалке со скоростью вращения 220 об/мин в течение 72 часов.For inoculation of a nutrient medium inoculum is used in an amount of 5 ml. Cultivation is carried out in rocking flasks V = 750 ml, containing 100 ml of medium at a temperature of 25 ° C on a hanging rocking chair with a rotation speed of 220 rpm for 72 hours.
Культуральную жидкость каждой пробы центрифугировали при скорости вращения ротора 6000 об/мин в течение 20 мин. В результате центрифугирования получали фугат культуральной жидкости (ФКЖ), который использовали для определения бактерицидной активности в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis (вакцинный штамм СТИ-1). Грибная субстанция в форме ФКЖ может служить источником получения грибных метаболитов посредством ее экстрагирования и фракционирования.The culture fluid of each sample was centrifuged at a rotor speed of 6000 rpm for 20 minutes. As a result of centrifugation, a culture fluid centrifuge (PCF) was obtained, which was used to determine the bactericidal activity against the causative agent of anthrax Bacillus anthracis (vaccine strain STI-1). Mushroom substance in the form of PCF can serve as a source of obtaining fungal metabolites through its extraction and fractionation.
Для определения активности ФКЖ использовали метод лунок, в которые закапывали по 0,01 мл (10 мкл) и 0,1 мл (100 мкл) ФКЖ. Повторность опытов 4-кратная. При этом применяли ту же шкалу активности, что и при определении спектра антимикробного действия штамма P. vulpinum F-1523. Полученные результаты представлены в таблице 2. Вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 выращивали на твердой агаризованной среде по специальной методике [Маринин Л.И., Дятлов И.А., Мокриевич А.Н. и др. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы // Учебно-методическое пособие. Оболенск, 2009. - 304 стр.].To determine the activity of PCF, the well method was used, in which 0.01 ml (10 μl) and 0.1 ml (100 μl) of PCF were instilled. The repetition of the experiments is 4-fold. In this case, the same activity scale was used as in determining the antimicrobial spectrum of the P. vulpinum F-1523 strain. The results are presented in table 2. The vaccine strain B. anthracis STI-1 was grown on solid agarized medium according to a special method [Marinin L.I., Dyatlov I.A., Mokrievich A.N. and other Methods of studying the biological properties of the causative agent of anthrax // Teaching aid. Obolensk, 2009. - 304 p.].
Установлено, что высокая активность ФКЖ штамма P. vulpinum F-1523 наиболее показательно проявляется при дозе 100 мкл. Причем высокая активность ФКЖ штамма отмечается уже по прошествии суток (35 мм) и достигает максимума на вторые сутки (45 мм). Высокая активность ФКЖ штамма P. vulpinum F-1523 при дозе 10 мкл наблюдается только по прошествии 2-х суток культивирования (25±3 мм).It was found that the high activity of PCF of the strain P. vulpinum F-1523 is most revealing at a dose of 100 μl. Moreover, the high activity of the PCF strain is observed already after a day (35 mm) and reaches a maximum on the second day (45 mm). High activity of PCF of P. vulpinum F-1523 strain at a dose of 10 μl is observed only after 2 days of cultivation (25 ± 3 mm).
Таким образом, штамм микромицета Penicillium vulpinum F-1523 обладает антибактериальной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis и может быть рекомендован в качестве продуцента биологического препарата.Thus, the Penicillium vulpinum F-1523 micromycete strain has antibacterial activity against the causative agent of anthrax Bacillus anthracis and can be recommended as a producer of a biological preparation.
Пример 3. Получение экспериментальных образцов препарата на основе штамма гриба Penicillium vulpinum F-1523 и их испытание на активность в отношении возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracisExample 3. Obtaining experimental samples of the drug based on the strain of the fungus Penicillium vulpinum F-1523 and their test for activity against the causative agent of anthrax Bacillus anthracis
Для получения экспериментальных образцов грибного препарата культуру Penicillium vulpinum F-1523 выращивали на плотной питательной среде Чапека+. Культуру гриба выращивали в чашках Петри при температуре 27°С и относительной влажности 85-90% в течение 7-10 дней до образования сплошного воздушного мицелия со зрелыми конидиями.To obtain experimental samples of the mushroom preparation, a culture of Penicillium vulpinum F-1523 was grown on a solid nutrient medium Chapek +. The fungus culture was grown in Petri dishes at a temperature of 27 ° C and a relative humidity of 85-90% for 7-10 days until the formation of a continuous aerial mycelium with mature conidia.
Наработку культуральной жидкости (КЖ) штамма гриба Penicillium vulpinum F-1523 проводили в качалочных колбах на среде следующего состава (г/л):The accumulation of the culture fluid (CL) of the strain of the fungus Penicillium vulpinum F-1523 was carried out in rocking flasks on a medium of the following composition (g / l):
Для засева питательной среды использовали 3-суточный инокулят. Инокулят готовили на жидкой питательной среде, куда помещали агаровый блок с газоном гриба. Культивирование проводили при 27°С, рН среды - 6.0-6.5 на микробиологической качалке - 180 об/мин в течение 72 часов. На основе проведенных опытов по оценке влияния различных консервантов, стабилизаторов и эмульгаторов на жизнеспособность культуры P. vulpinum F-1523 составлена рецептура товарной формы грибного препарата. Состав препарата: уксусная кислоты в качестве консерванта; олеиновая кислота в качестве стабилизатора; твин 80 в качестве эмульгатора. Для этой цели из экспериментальных образцов (КЖ, фугат КЖ, паста), полученных путем культивирования штамма Р. vulpinum F-1523, приготовили рецептурные формы препаратов следующего состава (по объему):A 3-day inoculum was used for inoculating the culture medium. The inoculum was prepared in a liquid nutrient medium where an agar block with a mushroom lawn was placed. The cultivation was carried out at 27 ° C, the pH of the medium was 6.0-6.5 on a microbiological shaker - 180 rpm for 72 hours. Based on the experiments to evaluate the effect of various preservatives, stabilizers and emulsifiers on the viability of the P. vulpinum F-1523 culture, a marketable formulation of the mushroom preparation was compiled. Composition of the preparation: acetic acid as a preservative; oleic acid as a stabilizer; tween 80 as an emulsifier. For this purpose, from experimental samples (QOL, QOL centrate, paste) obtained by cultivating a strain of P. vulpinum F-1523, prescription forms of preparations of the following composition were prepared (by volume):
- образец КЖ, пасты, фугата КЖ - 97,4%- a sample of QoL, paste, centrifuge QoL - 97.4%
- олеиновая кислота (стабилизатор) - 2,5%- oleic acid (stabilizer) - 2.5%
- твин 80 (эмульгатор) - 0,1%- tween 80 (emulsifier) - 0.1%
- уксусная кислота 20% (консервант) - доведение рН до 3-4 ед. рН- acetic acid 20% (preservative) - bringing the pH to 3-4 units. pH
Активность экспериментальных образцов определяли путем закапывания в лунки культурой В. anthracis СТИ-1 по 100 мкл исследуемого образца в 4-кратной повторности.The activity of the experimental samples was determined by instillation in wells of a culture of B. anthracis STI-1 in 100 μl of the test sample in 4-fold repetition.
Результаты представлены в таблице 3.The results are presented in table 3.
Анализ данных таблицы 3 показывает, что все экспериментальные образцы препарата, созданные на основе штамма P. vulpinum F-1523, показали высокую активность в отношении В. anthracis СТИ-1, сопоставимую с активностью экспериментальных образцов без ингредиентов. Полученные данные могут быть использованы для разработки товарных форм биопрепаратов с антибактериальными свойствами в отношении возбудителя сибирской язвы.Analysis of the data in table 3 shows that all experimental samples of the drug, created on the basis of the strain P. vulpinum F-1523, showed high activity against B. anthracis STI-1, comparable with the activity of experimental samples without ingredients. The data obtained can be used to develop commercial forms of biological products with antibacterial properties against the causative agent of anthrax.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015122210A RU2612150C2 (en) | 2015-06-09 | 2015-06-09 | Penicillium vulpinum micromycetes strain f-1523 with antibacterial activity on anthrax agent bacillus anthracis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015122210A RU2612150C2 (en) | 2015-06-09 | 2015-06-09 | Penicillium vulpinum micromycetes strain f-1523 with antibacterial activity on anthrax agent bacillus anthracis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015122210A RU2015122210A (en) | 2016-12-27 |
| RU2612150C2 true RU2612150C2 (en) | 2017-03-02 |
Family
ID=57759276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015122210A RU2612150C2 (en) | 2015-06-09 | 2015-06-09 | Penicillium vulpinum micromycetes strain f-1523 with antibacterial activity on anthrax agent bacillus anthracis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2612150C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112226370A (en) * | 2019-07-15 | 2021-01-15 | 浙江泛亚生物医药股份有限公司 | New strain of penicillium fox dung and application thereof |
-
2015
- 2015-06-09 RU RU2015122210A patent/RU2612150C2/en active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AMNA A. ET AL., Antibacterial activity of culture extracts of Penicillium species against soil-borne bacteria.//Mycopath, 2011, 9, с.17-20. * |
| ЛИХОВИДОВ В.Е. И ДР., Поиск штаммов микромицетов, обладающих бактерицидной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы, //Современная микология в России, 2012, т.3, Тезисы докладов Третьего Съезда микологов России, с.381. * |
| ЛИХОВИДОВ В.Е. И ДР., Поиск штаммов микромицетов, обладающих бактерицидной активностью в отношении возбудителя сибирской язвы, //Современная микология в России, 2012, т.3, Тезисы докладов Третьего Съезда микологов России, с.381. AMNA A. ET AL., Antibacterial activity of culture extracts of Penicillium species against soil-borne bacteria.//Mycopath, 2011, 9, с.17-20. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112226370A (en) * | 2019-07-15 | 2021-01-15 | 浙江泛亚生物医药股份有限公司 | New strain of penicillium fox dung and application thereof |
| CN112226370B (en) * | 2019-07-15 | 2021-11-19 | 浙江泛亚生物医药股份有限公司 | New strain of penicillium fox dung and application thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015122210A (en) | 2016-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ferraz et al. | Biocontrol ability and putative mode of action of yeasts against Geotrichum citri-aurantii in citrus fruit | |
| Tong et al. | Antimicrobial activities of endophytic fungal isolates from medicinal herb Orthosiphon stamineus Benth | |
| Swain et al. | Biocontrol efficacy of Bacillus subtilis strains isolated from cow dung against postharvest yam (Dioscorea rotundata L.) pathogens | |
| Suryanto et al. | A possibility of chitinolytic bacteria utilization to control basal stems disease caused by Ganoderma boninense in oil palm seedling | |
| Arunachalam et al. | Studies on bioprospecting of endophytic bacteria from the medicinal plant of Andrographis paniculata for their antimicrobial activity and antibiotic susceptibility pattern | |
| RU2313941C2 (en) | Preparation for protecting plants against pathogens of agricultural crops and grape diseases with growth-stimulating effect, method for preparing this preparation and strains for its realization | |
| KR102509861B1 (en) | Novel Bacillus amyloliquefaciens strain and composition for controlling Fusarium oxysporum or Phytophthora drechsleri of Astragalus membranaceus Bunge root comprising the same as an active ingredient | |
| CN106591203B (en) | A kind of Paenibacillus polymyxa KM2501-1 and its application | |
| KR20120030630A (en) | Bacillus amyloliquefaciens jbc36 and composition comprising the same for control of plant pathogens | |
| KR100735572B1 (en) | 32 A novel Streptomyces padanus VSP-32 KCTC BP active against plant fungal pathogens and preparation of microbial pesticide | |
| JPWO2006085567A1 (en) | Plant disease control agent and plant disease control method | |
| Rossi et al. | Aquatic plants as potential sources of antimicrobial compounds active against bovine mastitis pathogens | |
| Ajayi et al. | Antimicrobial screening of the essential oil of some herbal plants from Western Nigeria | |
| Benaissa et al. | Antagonistic effect of plant growth promoting rhizobacteria associated with Rhus tripartitus on gram positive and negative bacteria. | |
| RU2558293C1 (en) | STRAIN OF MICROMYCETE Trichoderma hamatum, HAVING ANTIBACTERIAL ACTIVITY AGAINST ANTHRAX CAUSATIVE AGENT Bacillus anthracis | |
| KR101005484B1 (en) | Streptomyces sporoclivatus CJS-49 KCTC 11109BP active against plant fungal pathogens | |
| RU2612150C2 (en) | Penicillium vulpinum micromycetes strain f-1523 with antibacterial activity on anthrax agent bacillus anthracis | |
| Goutam et al. | In vitro potential of endophytic fungus Aspergillus terreus (JAS-2) associated with Achyranthus aspera and study on its culture conditions | |
| Olofin et al. | Assessment of the antimicrobial properties of fractions obtained from bryophytes | |
| KR100726864B1 (en) | 10930 A novel Streptomyces griseofuscus VSG-16 KCTC 10930BP active against plant fungal pathogens and preparation of microbial pesticide | |
| CN109497050B (en) | Paenibacillus polymyxa fermentation product and preparation method and application thereof | |
| CN114369550A (en) | Bacillus amyloliquefaciens for promoting oat growth and application thereof | |
| RU2620971C1 (en) | Trichoderma asperellum strain - producer of hydrolytic enzymes and peptide metabolites and its application | |
| Hamudeng et al. | Effectiveness of antibacterial extract of coriander seeds (coriandrum sativum L.) against staphylococcus aureus | |
| Aribisala et al. | Identification, antagonistic potentials and plasmid profiling of microorganisms associated with termitarium from cocoa trees in Ibule-soro, Akure, Nigeria |