RU2532845C1 - ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД MS8 Flip-R ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА Histoplasma capsulatum - Google Patents
ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД MS8 Flip-R ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА Histoplasma capsulatum Download PDFInfo
- Publication number
- RU2532845C1 RU2532845C1 RU2013135302/10A RU2013135302A RU2532845C1 RU 2532845 C1 RU2532845 C1 RU 2532845C1 RU 2013135302/10 A RU2013135302/10 A RU 2013135302/10A RU 2013135302 A RU2013135302 A RU 2013135302A RU 2532845 C1 RU2532845 C1 RU 2532845C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- histoplasmosis
- flip
- capsulatum
- causative agent
- dna
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен олигонуклеотидный зонд MS8 Flip-R для флуоресцентной детекции возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами HcMs8s, HcMs8as3, имеющий следующую структуру: MS8 Flip-R 5'(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2) 3', где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции "Black Hole 2". Изобретение может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя гистоплазмоза - H. capsulatum в пробах, для диагностики в здравоохранении и для научных исследований, поскольку позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК H.
capsulatum в пробах чистых культур и биологическом материале. 1 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.
Гистоплазмоз - инфекционное заболевание, вызываемое диморфными грибами, относящимися к роду Н. capsulatum. В эндемичных областях условия окружающей среды представлены умеренным климатом с постоянной влажностью. Ареалами существования Н. capsulatum в естественных условиях служат многие азиатские страны, такие как Индонезия, Тайланд, Индия. Высокоэндемичные очаги Histoplasma capsulatum var. capsulatum - возбудителя классического (американского) гистоплазмоза, расположены вдоль реки Миссисипи (США), в Латинской Америке (Венесуэла, Эквадор, Бразилия, Парагвай, Уругвай, Аргентина). Histoplasma capsulatum var. duboisii - вариант африканского гистоплазмоза, эндемичен для тропических районов Африки. Еще один представитель рода Histoplasma, Histoplasma capsulatum var. farciminosum, вызывает эпизоотический лимфангоит у лошадей, ослов, мулов и в патологии людей какого-либо существенного значения не имеет. Ареал распространения включает средиземноморские страны, Северную Африку и государства Азии (Индия, Пакистан, Япония).
Возбудителя гистоплазмоза относят к агентам II группы патогенности, все работы с ними строго регламентированы СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». Манипуляции с данными грибами могут проводиться только в специализированных учреждениях, квалифицированными специалистами, имеющими опыт работы с возбудителями особо опасных инфекций.
Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных микромицетов и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя гистоплазмоза.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.
При детекции продуктов амплификации использование специальных флуоресцентных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что не только сокращает время проведения анализа, но и снижает риск перекрестной контаминации продуктами ПЦР и, соответственно, уменьшает число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе реакции амплификации, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории силами одного сотрудника. Этот подход позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм. Существует несколько флуоресцентных технологий, различающихся по способам генерации репортерной флуоресценции. В данной заявке используются зонды с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярных маяков» (molecular beacons).
Наиболее близким аналогом являются олигонуклеотидные зонды, разработанные для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени J. Martagon-Villamil с соавторами в 2003 году. Авторы используют 2 зонда с резонансным переносом энергии (LightCycler assay). Принцип метода основан на переносе энергии с одного флуорофора, находящегося на 3′-конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5′- конце второго зонда. Излучение детектируется при одновременном связывании обоих зондов с ДНК-матрицей. В качестве ДНК-мишеней для выявления возбудителя гистоплазмоза были выбраны спейсерные области рибосомальных генов [Identification of Histoplasma capsulatum from culture extracts by real-time PCR / Martagon-Villamil J., Shrestha N., Sholtis M., et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol.41, №3, - p.1295-1298].
S.J. Buitrago с соавторами в 2009 году предложили использование двух гибридизационных зондов для одновременного обнаружения ДНК Н. capsulatum и Paracoccidioides brasiïiensis методом ПЦР в режиме реального времени (патент №ЕР 2339026). В качестве ДНК-мишеней авторы выбрали спейсерные области рибосомальных генов. Однако, данные фрагменты генома, как правило, являются высококонсервативными у близкородственных микромицетов, что может приводить к ложноположительным результатам при проведении анализа.
Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидного зонда для флуоресцентной детекции результатов анализа методом полимеразной цепной реакции при идентификации H. capsulatum в режиме реального времени.
Цель достигается конструированием специфичного олигонуклеотида, имеющего структуру «шпильки» с флуорофором и гасителем флуоресценции на концах и обладающего комплементарностью к продукту реакции амплификации с праймерами HcMs8s/HcMs8as3 (патент №2464318):
MS8 Flip-R5/(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2)3/
Где ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.
Характеристика олигонуклеотидного зонда и ДНК-мишени для его гибридизации.
Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), был подобран олигонуклеотид, обладающий активностью гибридизационного зонда по типу «молекулярного маяка» к фрагменту генома возбудителя гистоплазмоза, фланкированному праймерами HcMs8s-HcMs8as3. Данный зонд обеспечивает флуоресцентную детекцию продуктов амплификации фрагмента гена MS8 (mold-specific MS8 protein) (GenBank NCBI, AY049031), кодирующего белок H. capsulatum, экспрессия которого происходит в мицелиальной фазе. Протеин ms8 участвует в образовании клеточной стенки гиф, придавая ей гидрофильность и гибкость.
В качестве положительного контроля эксперименты проводили на штаммах H.capsulatum var. capsulatum 6650, 6651, 6652, H. capsulatum var. duboisii 630, 638, H. capsulatum var. farciminosum 12-89, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×106 клеток/мл до 1×101 клеток/мл. Подсчет клеток дрожжевой фазы проводили в камере Горяева. Апробация флуоресцентного зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя гистоплазмоза коллекционного центра МЖК ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.
Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентно-меченым зондом MS8 Flip-R оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя гистоплазмоза, и составила- 1×102-1×104 клеток/мл.
Для обнаружения возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР в режиме реального времени оценена возможность использования сконструированного олигонуклеотидного зонда для анализа биологического материала (кровь, суспензия органов, искусственно контаминированные клетками Н. capsulation). Показано, что использование разработанного зонда при постановке реакции амплификации позволяет выявлять ДНК возбудителей гистоплазмоза с чувствительностью 1×104 кл/мл.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Методика конструирования флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда MS8 Flip-R для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.
На основе анализа in silico нуклеотидной последовательности фрагмента гена MS8 возбудителя гистоплазмоза, фланкированной праймерами HcMs8s/HcMs8as3 и имеющей длину 361 п.н., сконструирован гибридизационный зонд размером 24 п.н. (таблица 1).
Полученный олигонуклеотид был проанализирован с помощью компьютерной программы Vector NTI Express v.1.1.2 (Life Technologies, США) на предмет образования вторичных структур с праймерами HcMs8s/HcMs8as3, а также с использованием ресурса BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ним и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа, гомологии выявлено не было.
Пример 2. Детекция специфических фрагментов ДНК с помощью разработанного зонда MS8 Flip-R для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР в режиме реального времени.
В состав реакционных смесей, помимо анализируемой ДНК, входили комплементарные специфическому фрагменту ДНК Н. capsulatum олигонуклеотидные зонды, меченые флуорофором ROX и гасителем флуоресценции (BHQ2), а также праймеры HcMs8s/HcMs8as3, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-F-ДНК-полимераза. Праймеры и зонд для внутреннего контроля использовали при проверке тест-систем на специфичность и при анализе способов выделения ДНК. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды.
Амплификацию продолжительностью 45 циклов проводили в объеме 25 мкл с использованием «горячего старта».
Анализ продуктов ПЦР осуществляли в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Регистрацию результатов проводили в табличной и графической форме с помощью компьютерных программ. Результаты оценивали по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что определяется значением порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов (рис.1).
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации в режиме реального времени с помощью разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза.
Чувствительность реакции амплификации с разработанным гибридизационным зондом MS8 Flip-R оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений клеток чистых культур возбудителя гистоплазмоза.
Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1%, прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С и инкубированием при комнатной температуре 24 ч. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляли с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляли как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур Н. capsulatum ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора с использованием разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда MS8 Flip-R продукт амплификации детектировался с ДНК всех штаммов возбудителя гистоплазмоза с чувствительностью 1×102-1×104 клеток/мл (рис.1). С другими видами близкородственных грибов и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.
Таким образом, разработанный гибридизационный зонд может быть использован для идентификации возбудителя гистоплазмоза и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК возбудителя гистоплазмоза в чистой культуре и биологическом материале.
Таблица 1 | |||
Характеристика сконструированного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для идентификации возбудителя гистоплазмоза H. capsulatum | |||
Наименование зонда | Последовательность праймеров | Локализация | флуоресцентный краситель/гаситель флуоресценции |
MS8 Flip-R | GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC | ген MS8 (mold-specific MS8 protein) | ROX/BHQ2 |
Claims (1)
- Олигонуклеотидный зонд MS8 Flip-R для флуоресцентной детекции возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами HcMs8s, HcMs8as3, имеющий следующую структуру: MS8 Flip-R 5'(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2) 3',
где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции "Black Hole 2".
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013135302/10A RU2532845C1 (ru) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД MS8 Flip-R ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА Histoplasma capsulatum |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013135302/10A RU2532845C1 (ru) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД MS8 Flip-R ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА Histoplasma capsulatum |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2532845C1 true RU2532845C1 (ru) | 2014-11-10 |
Family
ID=53382507
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013135302/10A RU2532845C1 (ru) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД MS8 Flip-R ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА Histoplasma capsulatum |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2532845C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110760606A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-02-07 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | 荚膜组织胞浆菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5693501A (en) * | 1995-03-08 | 1997-12-02 | Indiana University Advanced Research & Technology Institute | Compounds and methods to determine presence of Histoplasma capsulatum |
US20050065330A1 (en) * | 2002-04-24 | 2005-03-24 | The Cleveland Clinic Foundation | Identification of Histoplasma capsulatum using a PCR assay |
RU2464318C1 (ru) * | 2011-07-05 | 2012-10-20 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | Олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза histoplasma capsulatum |
-
2013
- 2013-07-26 RU RU2013135302/10A patent/RU2532845C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5693501A (en) * | 1995-03-08 | 1997-12-02 | Indiana University Advanced Research & Technology Institute | Compounds and methods to determine presence of Histoplasma capsulatum |
US20050065330A1 (en) * | 2002-04-24 | 2005-03-24 | The Cleveland Clinic Foundation | Identification of Histoplasma capsulatum using a PCR assay |
RU2464318C1 (ru) * | 2011-07-05 | 2012-10-20 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора | Олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза histoplasma capsulatum |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110760606A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-02-07 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | 荚膜组织胞浆菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9523131B2 (en) | PCR diagnostics of dermatophytes and other pathogenic fungi | |
Lin et al. | Identification of novel Bartonella spp. in bats and evidence of Asian gray shrew as a new potential reservoir of Bartonella | |
Mayerhofer et al. | A species-specific multiplexed PCR amplicon assay for distinguishing between Metarhizium anisopliae, M. brunneum, M. pingshaense and M. robertsii | |
Malele et al. | Comparative diagnostic and analytical performance of PCR and LAMP-based trypanosome detection methods estimated using pooled whole tsetse flies and midguts | |
JP5522820B2 (ja) | イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー | |
RU2612137C1 (ru) | Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica | |
CN102409102B (zh) | 一种鉴别牛分枝杆菌的pcr引物及方法 | |
RU2435860C1 (ru) | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА B.pseudomallei И B.mallei | |
Tian et al. | Visual detection of Didymella bryoniae in cucurbit seeds using a loop-mediated isothermal amplification assay | |
US11549153B2 (en) | Methods of detecting and typing pathogenic strains of Francisella tularensis | |
Zhou et al. | Development of a Loop‐Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Trichosporon asahii in Experimental and Clinical Samples | |
CN102329864A (zh) | 一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光pcr试剂盒 | |
Müştak et al. | Detection and differentiation of Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium by multiplex quantitative PCR from different poultry matrices | |
RU2532845C1 (ru) | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД MS8 Flip-R ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ГИСТОПЛАЗМОЗА Histoplasma capsulatum | |
Pornprasert et al. | Development of TaqMan real‐time polymerase chain reaction for the detection and identification of Penicillium marneffei | |
Zhang et al. | Detection of Haemophilus parasuis isolates from South China by loop-mediated isothermal amplification and isolate characterisation | |
RU2539108C1 (ru) | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii | |
Modise et al. | A novel multiplex qPCR‑HRM assay for the simultaneous detection of four abortive zoonotic agents in cattle, sheep, and goats | |
RU2486252C1 (ru) | СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Yersinia pseudotuberculosis ОТ Yersinia pestis И Yersinia enterocolitica | |
RU2346045C1 (ru) | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii | |
CN104561339A (zh) | 一种检测来源于结核分枝杆菌的待测dna分子中snp位点的试剂盒 | |
RU2639498C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации возбудителя бластомикоза blastomyces dermatitidis | |
RU2464318C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза histoplasma capsulatum | |
RU2583001C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк возбудителей кокцидиоидомикоза coccidioides immitis и coccidioides posadasii | |
Alcoba-Flórez et al. | Yeast molecular identification and typing |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150727 |