RU2346045C1 - ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii - Google Patents
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii Download PDFInfo
- Publication number
- RU2346045C1 RU2346045C1 RU2007121817/13A RU2007121817A RU2346045C1 RU 2346045 C1 RU2346045 C1 RU 2346045C1 RU 2007121817/13 A RU2007121817/13 A RU 2007121817/13A RU 2007121817 A RU2007121817 A RU 2007121817A RU 2346045 C1 RU2346045 C1 RU 2346045C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- posadasii
- coccidioidomycosis
- primers
- identifying
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии. Сконструирована пара специфичных олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК C.posadasii, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру: 5'-CACTTCTTAAGTCTTATTTCC-3'-CpSOW82s 5'-GGCATTGATCGTCACCTCCAT-3'-CpSOW82as. Использование праймеров позволяет идентифицировать C.posadasii, дифференцировать его от филогенетически близкородственного микромицета C.immitis и детектировать в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью ДИК этого возбудителя кокцидиоидомикоза в биологическом материале и объектах окружающей среды. Изобретение может быть использовано в медицине для выявления генетического материала одного из возбудителей кокцидиоидомикоза - Coccidioides posadasii в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований. 3 ил. 1 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала одного из возбудителей кокцидиоидомикоза - Coccidioides posadasii - в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.
C.posadasii - диморфный гриб, является одним из возбудителей особо опасного микоза и имеет значительное географическое распространение, включая юго-западную часть США, Центральную и Южную Америку (Fisher М.С.et al., 2001; Fisher M.C., Taylor J.W., 2003), в отличие от C.immitis, который эдемичен только для Калифорнии (США). Фенотипических признаков, с помощью которых можно было бы дифференцировать эти 2 близкородственных вида, пока не установлено. Выделение некалифорнийского генотипа возбудителя кокцидиоидомикоза в самостоятельный вид - C.posadasii стало возможным только на основании результатов генетических исследований в 2002 г. (Fisher M.C. et al., 2002).
Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данного микромицета и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК-комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретного микроорганизма, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя кокцидиоидомикоза.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителя. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемого микромицета.
Наиболее близким аналогом являются специфические олигонуклеотиды, фланкирующие фрагмент гена Ag2/PRA (antigen 2/proline-rich antigen), экспрессия которого происходит в паразитической стадии развития гриба (Bialek R. et al. PCR assays for identification of Coccidioides posadasii based on the nucleotide sequence of the antigen 2/proline-rich antigen. J. Clin. Microbiol. 2004. Vol.42, №2. P.778-783). Сконструированные праймеры авторы использовали в гнездной ПЦР для идентификации возбудителя C.posadasii. Однако в работе тестировали образцы тканей, пораженных только С.posadasii, а сведения о тестировании штаммов C.immitis отсутствуют. Применение гнездной ПЦР имеет определенный недостаток - это высокий риск контаминации проб на втором этапе постановки реакции.
В 2006 году в публикации Т. Umeyama et al. (Novel approach to designing primers for identification and distinction of the human pathogenic fungi Coccidioides immitis and Coccidioides posadasii by PCR amplification. J. Clin. Microbiol. 2006. Vol.44, №5. P.1859-1862) предложены праймеры для дифференцирования двух видов Coccidioides на основе нуклеотидной последовательности C.immitis contig 2.2 (accession number AAEC02000002), обозначенные Coi9-1F и Coi9-1R. Отличие этих двух видов микромицетов заключается в длине синтезируемых ампликонов - у C.posadasii фрагмент ДНК короче на 86 п.н. Однако в этом случае возникает сложность интерпретации результатов ПЦР при электрофоретическом разделении фрагментов ДНК и необходимости использования дополнительных стандартов молекулярных размеров. Кроме того, сами же авторы в работе отмечают, что эти олигонуклеотидные затравки не испытывались на клиническом материале.
Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для идентификации C.posadasii методом полимеразной цепной реакции.
Цель достигается конструированием специфичных праймеров для идентификации ДНК одного из возбудителей кокцидиоидомикоза C.posadasii, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:
5'-CACTTCTTAAGTCTTATTTCC-3'- CpSOW82s
5'-GGCATTGATCGTCACCTCCAT-3' - CpSOW82as
Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.
Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), были подобраны праймеры, обозначенные CpSOW82s - CpSOWS2as, комплементарные фрагменту гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) для идентификации C.posadasii. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 300 п.н.
В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме C.posadasii 36 Silveira, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×106 артроспор/мл до 1×101 артроспор/мл. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.
Чувствительность реакции амплификации с праймерами CpSOW82s-CpSOW82as оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведении чистых культур возбудителей кокцидиоидомикоза, и составила - 1×102-1×103 артроспор/мл. С помощью предлагаемых олигонуклеотидных праймеров были проанализированы биоптаты и кровь от лабораторных животных, экспериментально зараженных возбудителем кокцидиоидомикоза. Для обнаружения возбудителей кокцидиоидомикоза методом ПЦР оценена возможность использования сконструированных праймеров для анализа биологического материала (печень, селезенка, легкие) при экспериментальной инфекции. Показано, что в реакции амплификации возбудитель детектировался в суспензиях органов от всех белых мышей, зараженных культурой данных микромицетов, на всех сроках наблюдения.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза C.posadasii методом ПЦР.
На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей кокцидиоидомикоза, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ) для конструирования праймеров, была выбрана последовательность гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) C.posadasii, размер которой составляет 3635 п.н. (GenBank NCBI, AF308873). С помощью компьютерного анализа были выбраны специфические участки ДНК, имеющие нуклеотидные отличия от филогенетически близкогородственного микромицета С.immitis и других микроорганизмов. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами - 300 п.н. (табл.1).
Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLASTN на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.
Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза C.posadasii с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров.
Для исключения возможности неспецифического отжига праймеров до достижения заданных температурных параметров используют режим «горячего старта». «Горячий старт» обеспечивается приготовлением реакционной смеси, состоящей из двух слоев (верхнего и нижнего), разделенных прослойкой воска. Нижний слой содержит предлагаемые праймеры для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза C.posadasii и дезоксирибонуклеозид-трифосфаты; верхний - реакционный буфер, фермент Taq-полимеразу и ДНК-матрицу. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит на этапе предварительной денатурации ДНК при 95°С.
Общий объем реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу.
Приготовление «нижней» реакционной смеси:
Раствор dNTP (2,5 мМ) - 2 мкл
Праймер CpSOW82s (12 пМ/ мкл) - 1 мкл
Праймер CpSOW82as (12 пМ/ мкл) - 1 мкл
вода деиоинизированная - 0,6 мкл
Сверху наслаивается расплавленный воск 11 мкл.
(Приготовленные таким образом смеси можно хранить при t+8°С до 6 мес)
Состав «верхней» реакционной смеси:
(×10) реакционный буфер ((NH4)2SO4 - 170 мМ, BSA - 2 мг/мл,
DTT - 10 мМ, Трис - 670 мМ, рН 8,8) - 2,5 мкл
MgCl2 0,25 M - 0,2 мкл
фермент Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл
вода деиоинизированная - 7,1 мкл
исследуемая проба ДНК - 10 мкл.
Сверху наслаивают по 30 мкл минерального масла
Условия проведения реакции для амплификатора «Терцик» (Москва): этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 42 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 55°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.
После этого продукты реакции разделяют путем электрофореза в 3% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса. При использовании разработанных олигонуклеотидных праймеров в реакции амплификации с ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза синтезируемые ампликоны по электрофоретической подвижности соответствуют расчетным данным (фиг.1.)
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза C.posadasii.
Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведении артроспор чистых культур возбудителей кокцидиоидомикоза.
Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляют с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляют, как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур C.posadasii и C.immitis Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался только с ДНК штаммов C.posadasii с чувствительностью 1×102-1×103 артроспор/мл. С другими видами близкородственных грибов, в том числе C.immitis, и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.
В качестве примера на фиг.2 показана электрофореграмма результатов реакции амплификации при определении чувствительности ПЦР с помощью сконструированных праймеров с ДНК типового штамма C.posadasii 36 Silveira, а на фиг.3 - электрофореграмма результатов реакции амплификации при определении специфичности сконструированных праймеров.
Таким образом, разработанные праймеры могут быть использованы для идентификации C.posadasii, позволяют дифференцировать его от филогенетически близкородственного микромицета С.immitis и детектировать в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью ДНК этого возбудителя кокцидиоидомикоза в биологическом материале и объектах окружающей среды.
Claims (1)
- Олигонуклеотидные праймеры для идентификации Coccidioides posadasii методом полимеразной цепной реакции, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющие следующую структуру:
5'-CACTTCTTAAGTCTTATTTCC-3'-CpSOW82s
5'-GGCATTGATCGTCACCTCCAT-3'-CpSOW82as,
комплементарные фрагменту гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) С.posadasii.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007121817/13A RU2346045C1 (ru) | 2007-06-09 | 2007-06-09 | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007121817/13A RU2346045C1 (ru) | 2007-06-09 | 2007-06-09 | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2346045C1 true RU2346045C1 (ru) | 2009-02-10 |
Family
ID=40546716
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007121817/13A RU2346045C1 (ru) | 2007-06-09 | 2007-06-09 | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2346045C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2539108C1 (ru) * | 2013-07-26 | 2015-01-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii |
| RU2631935C1 (ru) * | 2016-08-04 | 2017-09-28 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования днк |
-
2007
- 2007-06-09 RU RU2007121817/13A patent/RU2346045C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIALLEK R. et al. PCR assays for identification of Coccidioides posadasii based on the nucleotide sequence of the antigen 2/proline-rich antigen. J. Clin Microbiol. 2004 Feb; 42(2): 778-83. UMEYAMA Т. et al. Novel approach to designing primers for identification and distinction of the human pathogenic fungi Coccidioides immitis and Coccidioides posadasii by PCR amplification. J. Clin Microbiol. 2006 May; 44(5): 1859-62. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2539108C1 (ru) * | 2013-07-26 | 2015-01-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЙ ЗОНД PR-SOW ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА Coccidioides posadasii |
| RU2631935C1 (ru) * | 2016-08-04 | 2017-09-28 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации медицински значимых микромицетов методом секвенирования днк |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Buszewski et al. | Identification of microorganisms by modern analytical techniques | |
| Vrålstad et al. | A quantitative TaqMan® MGB real-time polymerase chain reaction based assay for detection of the causative agent of crayfish plague Aphanomyces astaci | |
| EP1891232B1 (en) | Pcr diagnostics of dermatophytes and other pathogenic fungi | |
| Weiss et al. | An extended multilocus sequence typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples | |
| Vuran et al. | Identification of Malassezia species from pityriasis versicolor lesions with a new multiplex PCR method | |
| Ilahi et al. | Real-time PCR identification of six Malassezia species | |
| Derzelle et al. | Use of high-resolution melting and melting temperature-shift assays for specific detection and identification of Bacillus anthracis based on single nucleotide discrimination | |
| Dhib et al. | Evaluation of Chitine synthase (CHS1) polymerase chain reaction assay in diagnosis of dermatophyte onychomycosis | |
| CN111757945A (zh) | 鉴定皮肤癣菌的方法 | |
| JP2010046038A (ja) | イチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマー | |
| KR20090100950A (ko) | 실시간 ｐｃｒ을 이용한 브루셀라 속 균주의 검출 방법 | |
| RU2346045C1 (ru) | ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii | |
| RU2621864C1 (ru) | Способ определения видовой принадлежности возбудителя бруцеллеза методом пцр с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени | |
| EP2529034B1 (en) | Methods for the detection of fungus | |
| US5910409A (en) | Methods and reagents for detecting fungal pathogens in a biological sample | |
| JP3194943B2 (ja) | クリプトコックス・ネオホルマンスの検出に用いる核酸プローブおよび方法 | |
| KR101765677B1 (ko) | 결핵 및 비결핵 항산균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| KR20110060156A (ko) | 핵산 추출용 조성물과 이를 이용한 핵산 추출방법 및 핵산의 증폭방법 | |
| TW201408779A (zh) | 檢測結核菌的方法及套組 | |
| CN102888412B (zh) | 一种新孢子虫特异pcr检测试剂盒及制备方法 | |
| Neji et al. | Molecular identification of dermatophytes isolated in Sfax-Tunisia | |
| JP7023465B2 (ja) | 検体中の細菌数の定量方法 | |
| RU2464318C1 (ru) | Олигонуклеотидные праймеры для идентификации возбудителя гистоплазмоза histoplasma capsulatum | |
| RU2486252C1 (ru) | СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Yersinia pseudotuberculosis ОТ Yersinia pestis И Yersinia enterocolitica | |
| WO2019163672A1 (ja) | 白癬菌の遺伝子をｌａｍｐ法により検出するためのプライマーセット及びそれを含むキット並びにそれらを用いて白癬菌を検出する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090610 |