RU2521506C1 - Method of generating antigen-specific cytotoxic cells with antitumour activity in breast cancer - Google Patents
Method of generating antigen-specific cytotoxic cells with antitumour activity in breast cancer Download PDFInfo
- Publication number
- RU2521506C1 RU2521506C1 RU2013114856/10A RU2013114856A RU2521506C1 RU 2521506 C1 RU2521506 C1 RU 2521506C1 RU 2013114856/10 A RU2013114856/10 A RU 2013114856/10A RU 2013114856 A RU2013114856 A RU 2013114856A RU 2521506 C1 RU2521506 C1 RU 2521506C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- mnc
- lysate
- dose
- adherent
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы.The invention relates to immunology and biotechnology, and in particular to methods for generating antigen-specific cells with cytotoxic activity against breast cancer cells.
Несмотря на успехи диагностики и лечения в последние два десятилетия рак молочной железы (РМЖ) до сих пор является наиболее распространенным онкологическим заболеванием среди женщин. По сравнению с 1999 годом, в 2009 в России наблюдался рост заболеваемости раком молочной железы на 15,91% [Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность). Под ред. В.И. Чиссова, 2011]. Общая выживаемость больных раком молочной железы в 5- и 10-летний срок составляет 68% и 50%, соответственно [La Vecchia, С., et al.//Ann. Oncol. - 2009. - №19].Despite the success of diagnosis and treatment in the last two decades, breast cancer (BC) is still the most common cancer among women. Compared with 1999, in 2009 in Russia there was an increase in the incidence of breast cancer by 15.91% [Malignant neoplasms in Russia in 2009 (incidence and mortality). Ed. IN AND. Chissova, 2011]. The overall survival of patients with breast cancer in the 5- and 10-year period is 68% and 50%, respectively [La Vecchia, C., et al.//Ann. Oncol. - 2009. - No. 19].
На данный момент, перспективным направлением в лечении онкологических заболеваний являются различные методы иммунотерапии, направленные на непосредственное воздействие на опухоль и гибель раковых клеток в первичном очаге, или способствующие снижению риска раннего метастазирования и рецидивов опухолевого роста, за счет индукции апоптоза диссеминированных опухолевых клеток. Иммунотерапия непосредственно стимулирует внутренние системы организма на борьбу с патологическим процессом, а также способствует профилактике токсического действия как самой опухоли, так и химио- и лучевой терапии на организм в целом [Попович A.M. Иммунотерапия в онкологии. // Справочник по иммунотерапии для практического врача. СПб: изд-во "Диалог", 2002. С.335-352].At the moment, a promising direction in the treatment of cancer is various immunotherapy methods aimed at directly affecting the tumor and the death of cancer cells in the primary focus, or helping to reduce the risk of early metastasis and relapse of tumor growth, by inducing apoptosis of disseminated tumor cells. Immunotherapy directly stimulates the body’s internal systems to combat the pathological process, and also helps prevent the toxic effects of the tumor itself, as well as chemo- and radiation therapy on the body as a whole [Popovich A.M. Immunotherapy in oncology. // Handbook of immunotherapy for a practitioner. St. Petersburg: Publishing House "Dialogue", 2002. S.335-352].
При любом онкологическом процессе, и при РМЖ, в частности, начиная с ранних предраковых состояний, начинается подавление нормального функционирования иммунной системы, приводящее к развитию иммунодепрессии, которая на сегодняшний день рассматривается как один из основных факторов агрессивного роста опухоли. [А. Mantovani et al. Tumour immunity: effector response to tumor and role of the microenvironment. // Lancet. - 2008. - N371. - p.771-83]. Это может быть связано с преобладанием CD4+ Т хелперов над CD8+ цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) [Kohrt HE, et al. Profile of immune cells in axillary lymph nodes predicts disease-free survival in breast cancer. // PLoS Med. - 2005. - N2(e284). - p.904-919; D.G. DeNardo and L. M. Coussens. Balancing immune response: crosstalk between adaptive and innate immune cells during breast cancer progression. - Breast Cancer Research. - 2007. - №9(212)]. Основной задачей иммунотерапии является активация процесса, способствующего разрушению опухоли с помощью усиления функциональных свойств антиген-презентирующих клеток (дендритных клеток), цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллерных клеток.In any oncological process, and in breast cancer, in particular, starting from early precancerous conditions, the suppression of the normal functioning of the immune system begins, leading to the development of immunosuppression, which today is considered as one of the main factors of aggressive tumor growth. [BUT. Mantovani et al. Tumour immunity: effector response to tumor and role of the microenvironment. // Lancet. - 2008 .-- N371. - p.771-83]. This may be due to the predominance of CD4 + T helpers over CD8 + cytotoxic lymphocytes (CTLs) [Kohrt HE, et al. Profile of immune cells in axillary lymph nodes predicts disease-free survival in breast cancer. // PLoS Med. - 2005. - N2 (e284). p.904-919; D.G. DeNardo and L. M. Coussens. Balancing immune response: crosstalk between adaptive and innate immune cells during breast cancer progression. - Breast Cancer Research. - 2007. - No. 9 (212)]. The main objective of immunotherapy is to activate the process that contributes to the destruction of the tumor by enhancing the functional properties of antigen-presenting cells (dendritic cells), cytotoxic T-lymphocytes and natural killer cells.
Дендритные клетки являются профессиональными антиген-презентирующими клетками, способными захватывать АГ и представлять его на своей поверхности в комплексе, как с классическими МНС I и II классов [R.M. Steinman The dendritic cells system and its role in immunogenicity. // Annu. Rev. bnmunol. - 1991. - №9. - p.271-279], так и с неклассическими молекулами (семейство CD1). [А.К. Palucka et al. Dendritic cells: a critical player in cancer therapy? // J Immunother. - 2008. - N31(9). - p.793-805]. Активация дендритных клеток(ДК) происходит в периферических тканях, где клетки узнают антигены и захватывают их с помощью различных механизмов (макропиноцитоза, рецептор-опосредованного эндоцитоза, фагоцитоза и др.). После захвата антигена ДК изменяют свою морфологию и фенотип, теряют способность к эндоцитозу, и мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где происходит межклеточное взаимодействие зрелых ДК и наивных или покоящихся Т-клеток. За счет взаимодействия рецепторов этих клеток, а также различных цитокинов происходит передача активационного сигнала Т-клеткам и запуск иммунного ответа [Н. Saito et al. Dendritic Cell-Based Vaccination Against Cancer. // Hematol Oncol Clin. - 2006. - N20. - p.689-710]. Активация Т-лимфоцитов зависит как от наличия костимуляторных молекул на поверхности клеток (CD40L, CD80/CD86, CD83 и др.), так и от микроокружения взаимодействующих клеток (ФНО-alpha, ИФН-gamma, ИЛ-12 и т.д.) [Н. Ueno et al. Dendritic cell subsets in health and disease. // Immunological Reviews. - 2007. - №219. - p.118-142].Dendritic cells are professional antigen-presenting cells capable of capturing AH and presenting it on its surface in a complex, as with classical MHC classes I and II [R.M. Steinman The dendritic cells system and its role in immunogenicity. // Annu. Rev. bnmunol. - 1991. - No. 9. - p.271-279], and with non-classical molecules (family CD1). [A.K. Palucka et al. Dendritic cells: a critical player in cancer therapy? // J Immunother. - 2008 .-- N31 (9). - p.793-805]. The activation of dendritic cells (DC) occurs in peripheral tissues, where cells recognize antigens and capture them using various mechanisms (macropinocytosis, receptor-mediated endocytosis, phagocytosis, etc.). After antigen capture, DCs change their morphology and phenotype, lose their ability to endocytosis, and migrate to the secondary lymphoid organs, where the intercellular interaction of mature DCs and naive or resting T cells takes place. Due to the interaction of the receptors of these cells, as well as various cytokines, the activation signal is transmitted to T cells and the immune response is triggered [N. Saito et al. Dendritic Cell-Based Vaccination Against Cancer. // Hematol Oncol Clin. - 2006. - N20. - p.689-710]. Activation of T-lymphocytes depends both on the presence of costimulatory molecules on the cell surface (CD40L, CD80 / CD86, CD83, etc.), and on the microenvironment of interacting cells (TNF-alpha, IFN-gamma, IL-12, etc.) [N. Ueno et al. Dendritic cell subsets in health and disease. // Immunological Reviews. - 2007. - No. 219. - p.118-142].
Цитокины, продукция которых осуществляется активированными ДК, оказывают влияние на развитие иммунного ответа. Так, считается, что IL-18 воздействует на другие цитокины (например, ИФHg) и формирует цитотоксический тип иммунного ответа, за счет дифференцировки Т клеток в Th1 лимфоциты [De Jong Е.С., Smits Н.Н., Kapsenberg M.L. Dendritic cell-mediated Т cell polarization. // Springer Semin Immun. - 2004. - №26. - P.289-307]. Аналогичным действием обладает ИЛ-12. При этом ИЛ-18 сильнее, чем ИЛ-12 усиливает продукцию IFNγ Т- и цитотоксическими НК-клетками, а также пролиферацию Т-клеток [Barbulescu К, Becker С, Schlaak JF, et al. IL-12 and IL-18 differentially regulate the transcriptional activity of the human IFN-gamma promoter in primary CD4+T lymphocytes. // J Immunol. - 1998. - №160. - P.3642-3647].Cytokines, the production of which is carried out by activated DCs, affect the development of the immune response. So, it is believed that IL-18 acts on other cytokines (for example, IFHg) and forms a cytotoxic type of immune response, due to the differentiation of T cells into Th1 lymphocytes [De Jong E.S., Smits N.N., Kapsenberg M.L. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin Immun. - 2004. - No. 26. - P.289-307]. A similar effect has IL-12. Moreover, IL-18 is stronger than IL-12 enhances the production of IFNγ by T and cytotoxic NK cells, as well as the proliferation of T cells [Barbulescu K, Becker C, Schlaak JF, et al. IL-12 and IL-18 differentially regulate the transcriptional activity of the human IFN-gamma promoter in primary CD4 + T lymphocytes. // J Immunol. - 1998. - No. 160. - P.3642-3647].
На сегодняшний день наибольшее распространение получили ДК вакцины на основе миелоидных клеток. Незрелые ДК получают из прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), при добавлении в среду рчГМ-КСФ и рчИЛ-4. Для созревания ДК применяют определенный набор цитокинов, таких как ФНО-alpha, ИФН-alpha, ИЛ-15, ИФН-gamma, ПГЕ2, и т.д. Для нагрузки ДК опухолевыми АГ могут использоваться РНК, ДНК, рекомбинантные белки, лизат опухолевых клеток [K.Palucka et al. Recent developments in cancer vaccines. // J Immunol. - 2011. - №186(3). - p.1325-1331].To date, the most common are DC myeloid cell vaccines. Immature DCs are obtained from the adherent fraction of mononuclear cells (MNCs) when rhGM-CSF and rhIL-4 are added to the medium. For the maturation of DC, a specific set of cytokines is used, such as TNF-alpha, IFN-alpha, IL-15, IFN-gamma, PGE 2 , etc. RNA, DNA, recombinant proteins, tumor cell lysate can be used to load DC with tumor AGs [K. Palucka et al. Recent developments in cancer vaccines. // J Immunol. - 2011. - No. 186 (3). - p.1325-1331].
Использование лизата аутологичных опухолевых клеток позволяет презентировать весь возможный набор иммунных молекул, тем самым вызывая поликлональную реакцию Т-лимфоцитов против опухолевых клеток. Кроме того, так как материал забирается непосредственно от больного, отсутствует ограничение по HLA типу.The use of a lysate of autologous tumor cells makes it possible to present the entire possible set of immune molecules, thereby causing a polyclonal reaction of T-lymphocytes against tumor cells. In addition, since the material is taken directly from the patient, there is no restriction on the HLA type.
Наиболее близким к предполагаемому является способ получения ДК и нагрузки их аутологичными апоптотическими опухолевыми клетками [N. Delirezh et al. Autologous dendritic cells loaded with apoptotic tumor cells induce Т cell-mediated immune responses against breast cancer in vitro. // Cellular Immunology - 2009 - №257 - p.23-31]. ДК получали из прилипшей фракции мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных с использованием lymphoprep (1.077 g/ml). Для получения незрелых ДК, прилипшая фракция МНК культивировалась в культуральной среде в присутствии гранулоцитарно -макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина 4 (ИЛ-4) в финальной концентрации 1000 ME/ml и 800 ME/ml соответственно. Среда менялась через день при повторном добавлении цитокинов. На 4 день в культуру незрелых ДК добавляли апоптотические опухолевые клетки в соотношении 1:1 и инкубировались в течение ночи. Апоптотические опухолевые клетки (ОК) получали из операционного материала опухоли, путем механического разделения на кусочки и ферментативного выделения клеток в течение ночи (37°С и 5% СO2) с последующим гамма-облучением суспензии клеток. Облученные ОК инкубировались в течение 48 часов в полной среде с добавлением 10% человеческой сыворотки и замораживались до дальнейшего использования. Для получения зрелых ДК, на 5 день в культуру незрелых ДК и апоптотических ОК добавляли 25% (по объему) кондиционной среды моноцитов и 10 нг/мл ФНО-alhpa. Антиген-активированные зрелые ДК получались на 7 день культивирования. Далее, для оценки способности антиген-активированных ДК стимулировать цитотоксический Т-клеточный ответ in vitro, проводилось сокультивирование аутологичных Т-клеток, выделенных с помощью магнитной сепарации, и антиген-нагруженных ДК в течение 19 дней. Повторная стимуляция Т-клеток осуществлялась каждые 2 недели. Среда заменялась каждые 3 дня с добавлением ИЛ-2 (20 IU/ml). Первая оценка цитотоксичности проводилась как минимум на 19 день после стимуляции Т-клеток антиген-активированными ДК. Уровень цитотоксичности против аутологичных опухолевых клеток варьировал от 21% до 65% (медиана 28±9.5%). Также, наблюдался лизис клеток опухолевой линии К562 от 5,2 до18% (медиана 7.1±2.6%). Однако он был значительно ниже, чем лизис аутологичных опухолевых клеток (р<0,05). Через 24 часа после последней (третьей) стимуляции собиралась кондиционная среда совместной культуры активированных ДК и Т-клеток для измерения уровня продукции ИЛ-4 и ИФН-gamma с помощью коммерческого набора ELISA. У всех 5 пациентов наблюдался разный уровень продукции данных цитокинов: двое из исследуемых пациентов секретировали высокий уровень ИФН-gamma по сравнению с ИЛ-4 (335±38 pg/ml против 29±8 pg/ml), а у троих был выше уровень ИЛ-4, чем ИФН-gamma (1393±1218 pg/ml против 90±81 pg/ml).Closest to the proposed is a method of obtaining DC and load their autologous apoptotic tumor cells [N. Delirezh et al. Autologous dendritic cells loaded with apoptotic tumor cells induce T cell-mediated immune responses against breast cancer in vitro. // Cellular Immunology - 2009 - No. 257 - p.23-31]. DK was obtained from the adherent fraction of peripheral blood mononuclear cells isolated using lymphoprep (1.077 g / ml). To obtain immature DCs, the adherent MNC fraction was cultured in a culture medium in the presence of granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4) at a final concentration of 1000 ME / ml and 800 ME / ml, respectively. The medium changed every other day with the repeated addition of cytokines. On day 4, apoptotic tumor cells were added to the immature DC culture in a 1: 1 ratio and incubated overnight. Apoptotic tumor cells (OK) were obtained from the surgical material of the tumor, by mechanical separation into pieces and enzymatic isolation of cells overnight (37 ° C and 5% CO 2 ), followed by gamma irradiation of the cell suspension. Irradiated OKs were incubated for 48 hours in complete medium supplemented with 10% human serum and frozen until further use. To obtain mature DCs, on day 5, 25% (by volume) of monocyte conditioned medium and 10 ng / ml TNF-alhpa were added to the culture of immature DCs and apoptotic OCs. Antigen-activated mature DCs were obtained on day 7 of cultivation. Further, to assess the ability of antigen-activated DCs to stimulate a cytotoxic T-cell response in vitro, autologous T cells isolated by magnetic separation and antigen-loaded DCs were co-cultured for 19 days. Re-stimulation of T cells was carried out every 2 weeks. The medium was replaced every 3 days with the addition of IL-2 (20 IU / ml). The first cytotoxicity assessment was performed at least 19 days after stimulation of T cells with antigen-activated DCs. The level of cytotoxicity against autologous tumor cells ranged from 21% to 65% (median 28 ± 9.5%). Also, lysis of K562 tumor line cells was observed from 5.2 to 18% (median 7.1 ± 2.6%). However, it was significantly lower than the lysis of autologous tumor cells (p <0.05). 24 hours after the last (third) stimulation, a conditioned medium of a joint culture of activated DCs and T cells was collected to measure the level of production of IL-4 and IFN-gamma using a commercial ELISA kit. All 5 patients had different levels of production of these cytokines: two of the studied patients secreted a high level of IFN-gamma compared with IL-4 (335 ± 38 pg / ml versus 29 ± 8 pg / ml), and three had a higher level of IL -4 than IFN-gamma (1393 ± 1218 pg / ml versus 90 ± 81 pg / ml).
Описанный способ получения антиген-активированных дендритных клеток достаточно длителен (7 суток), требует использования большого количества рекомбинантных цитокинов (рчГМ-КСФ, рчИЛ-4, рчФНО-alpha, и рчИЛ-2), что ведет к значительному удорожанию технологии, так и обладает недостаточной цитотоксической и интерферон-продуцирующей активностью.The described method for producing antigen-activated dendritic cells is quite long (7 days), requires the use of a large number of recombinant cytokines (rhGM-CSF, rhIL-4, rhFNO-alpha, and rhIL-2), which leads to a significant increase in the cost of the technology, and it has insufficient cytotoxic and interferon-producing activity.
Новая техническая задача - повышение цитотоксической и интерферон продуцирующей активности антиген-активированных дендритных клеток, обладающих более высоким потенциалом цитотоксической активности для формирования эффективного противоопухолевого ответа против опухолевых клеток молочной железы при сокращении сроков культивирования.A new technical task is to increase the cytotoxic and interferon-producing activity of antigen-activated dendritic cells with a higher potential of cytotoxic activity for the formation of an effective antitumor response against breast tumor cells while shortening the cultivation time.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем:The essence of the invention is as follows:
Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови больных раком молочной железы культивируют с антиген-активированными дендритными клетками, полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК. Антигенную активацию ДК проводят с помощью лизата аутологичных опухолевых клеток, а для созревания ДК используют рекомбинантный человеческий провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли (рчФНО-α). Для эффективной модуляции противоопухолевой защиты совместное культивировании зрелых антиген-активированных ДК и неприлипающей фракции МНК проводят в присутствии рекомбинантных человеческих интерлейкинов (рчИЛ-12 и рчИЛ-18), что позволяет повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток.Mononuclear cells of a non-adherent fraction of the peripheral blood of patients with breast cancer are cultured with antigen-activated dendritic cells obtained from monocytes of the adherent fraction of MNCs. Antigenic activation of DCs is carried out using a lysate of autologous tumor cells, and a recombinant human pro-inflammatory cytokine - tumor necrosis factor (rhFNO-α) is used to mature DCs. For effective modulation of antitumor defense, the joint cultivation of mature antigen-activated DCs and a non-adherent fraction of MNCs is carried out in the presence of recombinant human interleukins (rhIL-12 and rhIL-18), which increases the cytotoxic potential of mononuclear antigen-specific cells.
Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является:The fundamental difference between the developed method and the prototype is:
- использование рчИЛ-12 и рчИЛ-18 при сокультивировании ДК и МНК, что повышает эффективность стимуляции и направленную дифференцировку наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа,- the use of rchIL-12 and rchIL-18 in the co-cultivation of DCs and MNCs, which increases the efficiency of stimulation and directed differentiation of naive T cells into type 1 T-helpers,
- применение протоколов активации и созревания ДК, включающих использование аутологичных опухолевых антигенов, что активирует ДК против собственных опухолевых антигенов, тем самым увеличивая цитотоксический ответ, а также сокращает стадию получения зрелых антиген-активированных ДК до 5 суток.- the use of activation and maturation protocols for DCs, including the use of autologous tumor antigens, which activates DCs against their own tumor antigens, thereby increasing the cytotoxic response, and also reduces the stage of obtaining mature antigen-activated DCs up to 5 days.
Изобретение осуществляют следующим образом.The invention is as follows.
Выделенные из периферической крови больных раком молочной железы клетки прилипающей фракции мононуклеарных клеток культивируют в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×105 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СО2 при 37°С с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 48 часов культивирования к полученным незрелым ДК добавляют опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток) в дозе 100 мкг/мл, а еще через 48 часов для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносят рчФНО-α в дозе 25 нг/мл. Полученные дендритные клетки культивируют с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл.The adherent fraction of mononuclear cells isolated from the peripheral blood of breast cancer patients is cultured at a concentration of 1 million / ml in complete medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 5 × 10 5 mM 2-mercaptoethanol, 80 μg / ml gentamicin, 100 μg / ml ampicillin in an atmosphere of 5% CO 2 at 37 ° C with the addition of rhGM-CSF (50 ng / ml) and rhIL-4 (100 ng / ml). After 48 hours of cultivation, a tumor antigen (lysate of autologous tumor cells) at a dose of 100 μg / ml is added to the resulting immature DCs, and after 48 hours, rcfNO-α is added at a dose of 25 ng / ml for the maturation of immature dendritic cells. The obtained dendritic cells were cultured with a non-adherent fraction of mononuclear cells in a ratio of 1:10 with the addition of rhIL-12 at a dose of 10 ng / ml and rhIL-18 at a dose of 100 ng / ml.
Способность полученных антиген-активированных ДК стимулировать прямую цитотоксичность МНК оценивали по уровню гибели аутологичных опухолевых клеток, а также гибели клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы MCF-7. Для этого, полученные ДК совместно культивировали с неприлипшей фракцией МНК для праймирования опухолевых антигенов. Во все группы вносили аутологичные опухолевые клетки или клетки аденокарциномы молочной железы MCF-7 и оценивали их гибель по высвобождению внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы. Показано достоверное повышение значения цитотоксичности, что служит показателем активации противоопухолевых цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения опухолевых клеток (табл.1 и 2).The ability of the obtained antigen-activated DCs to stimulate direct cytotoxicity of MNCs was assessed by the level of death of autologous tumor cells, as well as the death of MCF-7 mammary adenocarcinoma tumor cell lines. For this, the obtained DCs were jointly cultivated with a non-adherent MNC fraction for priming tumor antigens. Autologous tumor cells or MCF-7 mammary adenocarcinoma cells were introduced into all groups and their death was assessed by the release of the intracellular enzyme lactate dehydrogenase. A significant increase in cytotoxicity was shown, which serves as an indicator of the activation of antitumor cytotoxic cells necessary for the destruction of tumor cells (Tables 1 and 2).
В Табл.1 приведены данные по цитотоксичности совместной культуры МНК больных раком молочной железы и аутологичных ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток, по отношению к аутологичным опухолевым клеткам (n=22). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.Table 1 shows the cytotoxicity of the co-culture of MNCs in patients with breast cancer and autologous DCs loaded with tumor cell lysate in relation to autologous tumor cells (n = 22). Data are presented as mean and mean error.
* Примечание:* Note:
МНК - контрольная культура МНК;MNC - control culture of MNCs;
МНК+ДК 0 - совместная культура МНК и зрелых ДК, созревание которых происходило в отсутствие опухолевого антигенаMNC + DC 0 - a joint culture of MNCs and mature DCs, the maturation of which occurred in the absence of tumor antigen
МНК + ДК Lys - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клетокMNC + DC Lys - a co-culture of MNC and DC loaded with a lysate of autologous tumor cells
+рчИЛ-12+рчИЛ18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18+ rchIL-12 + rchIL18 - co-cell culture with the addition of rchIL-12 and rchIL-18
* - статистически достоверные различия с группой МНК в соответствующей стимуляции* - statistically significant differences with the MNC group in the corresponding stimulation
# - статистически достоверные различия с группой МНК+ДК 0 в соответствующей стимуляции# - statistically significant differences with the group of MNC + DC 0 in the corresponding stimulation
В Табл.2 приведены данные по цитотоксичности совместной культуры МНК больных раком молочной железы и аутологичных ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток, по отношению к опухолевой линии рака молочной железы MCF-7 (n=22). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.Table 2 shows the cytotoxicity data of the co-culture of MNCs in patients with breast cancer and autologous DCs loaded with tumor cell lysate in relation to the MCF-7 breast cancer tumor line (n = 22). Data are presented as mean and mean error.
* Примечание:* Note:
МНК - контрольная культура МНК;MNC - control culture of MNCs;
МНК+ДК 0 - совместная культура МНК и зрелых ДК, созревание которых происходило в отсутствие опухолевого антигенаMNC + DC 0 - a joint culture of MNCs and mature DCs, the maturation of which occurred in the absence of tumor antigen
МНК + ДК Lys - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клетокMNC + DC Lys - a co-culture of MNC and DC loaded with a lysate of autologous tumor cells
+рчИЛ-12+рчИЛ18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18+ rchIL-12 + rchIL18 - co-cell culture with the addition of rchIL-12 and rchIL-18
* - статистически достоверные различия с группой МНК в соответствующей стимуляции* - statistically significant differences with the MNC group in the corresponding stimulation
# - статистически достоверные различия с группой МНК+ДК 0 в соответствующей стимуляции# - statistically significant differences with the group of MNC + DC 0 in the corresponding stimulation
& - статистически достоверные различия с группой МНК+ДК Lys& - statistically significant differences with the group MNC + DC Lys
При оценке цитотоксической активности совместной культуры МНК и антиген - активированных зрелых ДК были получены результаты, подтверждающие эффективность применения данного протокола для получения зрелых дендритных клеток, способных стимулировать цитотоксический потенциал МНК. Добавление в совместную культуру МНК и ДК стимулирующих цитокинов рчИЛ-12 и рчИЛ-18 является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их цитотоксического противоопухолевого ответа. Аналогичные результаты были получены при исследовании цитотоксического потенциала против клеточной линии рака молочной железы MCF-7, а именно добавление рекомбинантных цитокинов в совместную культуру антиген-нагруженных ДК и МНК статистически достоверно увеличивают цитотоксический ответ.When assessing the cytotoxic activity of a co-culture of MNCs and antigen-activated mature DCs, results were obtained confirming the effectiveness of using this protocol to obtain mature dendritic cells capable of stimulating the cytotoxic potential of MNCs. Adding rhIL-12 and rhIL-18 stimulating cytokines to the co-culture of MNCs and DCs is an effective way to generate specific cytotoxic cells of mononuclear origin, which is manifested in the enhancement of their cytotoxic antitumor response. Similar results were obtained in the study of the cytotoxic potential against the MCF-7 breast cancer cell line, namely the addition of recombinant cytokines to the joint culture of antigen-loaded DCs and MNCs statistically significantly increase the cytotoxic response.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что использование рекомбинантных человеческих цитокинов (ИЛ-12 и ИЛ-18) статистически повышает цитотоксическую активность мононуклеарных клеток, как против аутологичных опухолевых клеток, так и против специфической клеточной линии аденокарциномы молочной железы, что свидетельствует об усилении индукции ответа Т хелперов 1 типа. При сравнении цитотоксического ответа против аутологичных ОК и клеток линии MCF-7 получены статистически достоверные различия в способности антиген-активированных ДК стимулироваться МНК как в спонтанных культурах (33,21±3,55% против 24,93±3,95%, соответственно, р<0,05), так и при стимуляции культуры клеток цитокинами (44,56±5,24% против 30,92±4,55, соответственно, р<0,05).Based on the results obtained, it can be concluded that the use of recombinant human cytokines (IL-12 and IL-18) statistically increases the cytotoxic activity of mononuclear cells, both against autologous tumor cells and against a specific cell line of mammary adenocarcinoma, which indicates increased induction T helper type 1 response. When comparing the cytotoxic response against autologous OCs and MCF-7 cells, statistically significant differences were obtained in the ability of antigen-activated DCs to be stimulated by MNCs as in spontaneous cultures (33.21 ± 3.55% versus 24.93 ± 3.95%, respectively, p <0.05), and when stimulating cell culture with cytokines (44.56 ± 5.24% versus 30.92 ± 4.55, respectively, p <0.05).
Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-12, и рчИЛ-18 in vitro.Thus, as a result of the studies, a method for generating antitumor cytotoxic cells using antigen-activated autologous dendritic cells and rhIL-12 and rhIL-18 in vitro was developed.
Для анализа антиген-специфической стимуляции иммунного ответа по Th1 типу, определяли содержание ИНФ-γ в кондиционной среде культуры МНК, сокультивированных с антиген - активированными дендритными клетками без добавления или с добавлением цитокинов, до и после дополнительной стимуляции опухолевыми антигенами. В табл.3 представлены результаты по продукции ИНФ-γ МНК пациентов с раком молочной железы, культивированных в разных условиях.To analyze the antigen-specific stimulation of the immune response according to the Th1 type, the content of INF-γ in the conditioned culture medium of MNCs co-cultivated with antigen-activated dendritic cells without or with cytokines was determined before and after additional stimulation with tumor antigens. Table 3 presents the results for the production of INF-γ MNCs in patients with breast cancer cultured under different conditions.
В Табл.3 приведены данные по продукции ИФН-гамма в совместной культуре МНК больных раком молочной железы и ДК, активированных лизатом аутологичных опухолевых клеток ДК (n=26). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.Table 3 shows the data on the production of IFN-gamma in a joint culture of MNCs in patients with breast cancer and DC activated by a lysate of autologous DC tumor cells (n = 26). Data are presented as mean and mean error.
* Примечание:* Note:
МНК - контрольная культура МНК;MNC - control culture of MNCs;
МНК+ДК(0) -совместная культура МНК и ДК без трансфекции;MNC + DC (0) - a joint culture of MNCs and DCs without transfection;
МНК+ДК(Lys) - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клетокMNC + DC (Lys) - a joint culture of MNCs and DCs loaded with a lysate of autologous tumor cells
+рчИЛ-12, +рчИЛ-18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18+ rchIL-12, + rchIL-18 - co-cell culture with the addition of rchIL-12 and rchIL-18
+лизат - повторное добавление лизата в культуру МНК и ДК на 2 стуки после сокультивирования+ lysate - repeated addition of lysate to the culture of MNCs and DCs for 2 knocks after co-cultivation
* - статистически значимые различия* - statistically significant differences
Под действием аутологичных антиген-активированных ДК больных раком молочной железы статистически достоверно повышается уровень продукции цитокина мононуклеарными клетками как в спонтанных культурах, так и при стимуляции ИЛ-12 и ИЛ-18 по сравнению с контрольными группами (МНК и МНК+ДК(0)). Добавление лизата в совместную культуру МНК и ДК не оказывает статистически значимого воздействия на продукцию ИФН-g.Under the influence of autologous antigen-activated DCs in patients with breast cancer, the level of cytokine production by mononuclear cells is statistically significantly increased both in spontaneous cultures and upon stimulation of IL-12 and IL-18 compared to control groups (MNC and MNC + DC (0)) . Adding a lysate to the co-culture of MNCs and DCs does not have a statistically significant effect on IFN-g production.
Полученные данные по продукции иммунорегуляторного цитокина ИФН-g подтверждают результаты цитотоксического теста о возможности модуляции иммунного ответа с помощью разработанного протокола в сторону Th1-го типа.The obtained data on the production of immunoregulatory cytokine IFN-g confirm the results of the cytotoxic test about the possibility of modulating the immune response using the developed protocol in the direction of Th1 type.
Помимо Т-хелперов 1 типа, в развитие специфического противоопухолевого иммунного ответа принимают участие CD8+ цитотоксические лимфоциты. Доминирующим механизмом запуска цитотоксического ответа против поврежденных или измененных клеток является гранзим-опосредованный путь запуска апоптоза, который осуществляется двумя основными белками: порообразующим белком - перфорином, и основным цитотоксическим белком - гранзимом В [Rousalova I., Krepela E. Granzyme B-induced apoptosis in cancer cells and its regulation (Review). // International journal of oncology. - 2010. - №37. - P.1361-1378]. В исследованиях на мышах было показано, что отсутствие белка перфорина делает невозможным проникновение гранзима В в клетку и, соответственно, удаление поврежденных или измененных клеток. [Cullen SP, Brunet M, Martin SJ Granzymes in cancer and immunity. // Cell Death and Differentiation. - 2010. - №17. - P.616-623].In addition to type 1 T-helpers, CD8 + cytotoxic lymphocytes participate in the development of a specific antitumor immune response. The dominant mechanism for triggering a cytotoxic response against damaged or altered cells is the granzyme-mediated apoptosis triggering pathway, which is accomplished by two main proteins: the pore-forming protein, perforin, and the main cytotoxic protein, granzyme B [Rousalova I., Krepela E. Granzyme B-induced apoptosis in cancer cells and its regulation (Review). // International journal of oncology. - 2010. - No. 37. - P.1361-1378]. In studies in mice, it was shown that the absence of perforin protein makes it impossible for granzyme B to enter the cell and, accordingly, remove damaged or altered cells. [Cullen SP, Brunet M, Martin SJ Granzymes in cancer and immunity. // Cell Death and Differentiation. - 2010. - No. 17. - P.616-623].
Для оценки потенциальной цитотоксической активности мононуклеарных клеток больных раком молочной железы, культивированных с антиген-стимулированными дендритными клетками определяли содержание внутриклеточного мономерного белка перфорина. (Табл.4).To assess the potential cytotoxic activity of mononuclear cells of patients with breast cancer cultured with antigen-stimulated dendritic cells, the content of intracellular monomeric protein perforin was determined. (Table 4).
На Фиг.4 приведены данные по содержанию перфорин-позитивных клеток в совместной культуре МНК и ДК, активированных лизатом аутологичных опухолевых клеток (n=26). Нагрузка осуществлялась на стадии незрелых ДК, совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.Figure 4 shows data on the content of perforin-positive cells in a joint culture of MNCs and DCs activated by a lysate of autologous tumor cells (n = 26). The load was carried out at the stage of immature DC, co-cultivation was carried out for 48 hours. Data are presented as mean and mean error.
Примечание:Note:
МНК - контрольная культура МНК;MNC - control culture of MNCs;
МНК+ДК(0) - совместная культура МНК и ДК без трансфекции;MNC + DC (0) - a joint culture of MNCs and DCs without transfection;
МНК+ДК(Lys) - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клетокMNC + DC (Lys) - a joint culture of MNCs and DCs loaded with a lysate of autologous tumor cells
+рчИЛ-12, +рчИЛ-18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18+ rchIL-12, + rchIL-18 - co-cell culture with the addition of rchIL-12 and rchIL-18
+лизат - повторное добавление лизата в культуру МНК и ДК на 2 стуки после сокультивирования+ lysate - repeated addition of lysate to the culture of MNCs and DCs for 2 knocks after co-cultivation
* - статистически значимые различия* - statistically significant differences
Было показано, что добавление в совместную культуру МНК и антиген - активированных ДК рчИЛ-12 и рчИЛ-18 статистически достоверно увеличивает уровень продукции порообразующего белка перфорина при сравнении со всеми группами контроля (интактная группа МНК и группа МНК, культивированная совместно с ДК, созревание которых происходило в отсутствие антигена). При сокультивировании неприлипшей фракции МНК и антиген-нагруженных ДК в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18, повторное добавление лизата приводит к статистически достоверному увеличению внутриклеточной продукции перфорина по сравнению как с другими группами контроля (МНК и МНК+ДК(0) в аналогичной стимуляции), так и по сравнению с другими видами стимуляции совместной культуры МНК и антиген - активированных ДК.It was shown that the addition of rhIL-12 and rhIL-18 to the co-culture of MNCs and antigen-activated DCs rhIL-12 and rhIL-18 statistically significantly increases the level of production of the perforin pore-forming protein when compared with all control groups (the intact MNC group and the MNC group, cultivated together with DC, maturing occurred in the absence of antigen). Upon co-cultivation of the non-adherent fraction of MNCs and antigen-loaded DCs in the presence of rchIL-12 and rchIL-18, repeated addition of the lysate leads to a statistically significant increase in the intracellular production of perforin compared to other control groups (MNC and MNC + DC (0) in similar stimulation ), and compared with other types of stimulation of the joint culture of MNCs and antigen-activated DCs.
Таким образом, совместное культивирование зрелых аутологичных антиген-активированных денритных клеток и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток совместно с рчИЛ-12 и рчИЛ-18, при повторном добавлении лизата или без него приводит к достоверному повышению содержания перфорин-позитивных клеток с более высокой потенциальной цитотоксической активностью.Thus, co-cultivation of mature autologous antigen-activated dendritic cells and a non-adherent fraction of mononuclear cells together with rchIL-12 and rchIL-18, with or without lysate re-addition, leads to a significant increase in the content of perforin-positive cells with higher potential cytotoxic activity.
В результате проведенных исследований была показана эффективность разработанного протокола генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных ДК и рчИЛ-12 и рчИЛ-18.As a result of the studies, the effectiveness of the developed protocol for the generation of antitumor cytotoxic cells using antigen-activated DCs and rhIL-12 and rhIL-18 was shown.
лизат, ИЛ12, ИЛ18MNC + DC (0) +
lysate, IL12, IL18
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013114856/10A RU2521506C1 (en) | 2013-04-01 | 2013-04-01 | Method of generating antigen-specific cytotoxic cells with antitumour activity in breast cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013114856/10A RU2521506C1 (en) | 2013-04-01 | 2013-04-01 | Method of generating antigen-specific cytotoxic cells with antitumour activity in breast cancer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2521506C1 true RU2521506C1 (en) | 2014-06-27 |
Family
ID=51218310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013114856/10A RU2521506C1 (en) | 2013-04-01 | 2013-04-01 | Method of generating antigen-specific cytotoxic cells with antitumour activity in breast cancer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2521506C1 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2631792C2 (en) * | 2016-01-11 | 2017-09-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) | Method for obtaining of mature antigen-activated dendritic cells with transfection of tumour cells rna of breast cancer |
| RU2645464C1 (en) * | 2016-09-15 | 2018-02-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) | Immunotherapy of breast cancer using antigen-activated dendritic cells |
| RU2655625C1 (en) * | 2017-02-14 | 2018-05-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова" | Method for treating breast cancer in cats |
| RU2793914C1 (en) * | 2022-06-06 | 2023-04-07 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр" Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Method for enhancing antitumor t-cell immunity in lung cancer patients |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2378373C2 (en) * | 2008-02-04 | 2010-01-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | Method for generation of antigen-specific antituberculous cells |
| WO2011110953A2 (en) * | 2010-03-09 | 2011-09-15 | Artemev, Timur | Polyepitope constructs and methods for their preparation and use |
| RU2458985C1 (en) * | 2011-03-18 | 2012-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Method of generating antigen-specific of cytotoxic cells with anticancer activity |
| RU2465324C1 (en) * | 2011-06-16 | 2012-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Method for generation of specific immune response on human immunodeficiency virus antigens |
-
2013
- 2013-04-01 RU RU2013114856/10A patent/RU2521506C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2378373C2 (en) * | 2008-02-04 | 2010-01-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | Method for generation of antigen-specific antituberculous cells |
| WO2011110953A2 (en) * | 2010-03-09 | 2011-09-15 | Artemev, Timur | Polyepitope constructs and methods for their preparation and use |
| RU2458985C1 (en) * | 2011-03-18 | 2012-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Method of generating antigen-specific of cytotoxic cells with anticancer activity |
| RU2465324C1 (en) * | 2011-06-16 | 2012-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт клинической иммунологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИКИ" СО РАМН) | Method for generation of specific immune response on human immunodeficiency virus antigens |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BAI L. et al., Dendritic Cells pulsed with viral oncolysates potently stimulate autologous T cells from cancer patients, Intern. Journ. Of Oncology, 2002, v.21, n.4, p. 685-694. * |
| SOBOL P.T. et al., Adaptive antiviral Immunity is a Determinant of the Therapeutic Success of Oncolytic Virotherapy Molecular Therapy, 2011, v.19, n.2, p.335-344 * |
| КУРИЛИН В.В. и др., Модуляция цитотоксического противоопухолевого ответа в культуре мононуклеарных клеток с помощью дендритных клеток, Сибирский Онкологический Журнал, 2010, приложение 1, с.64-65. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2631792C2 (en) * | 2016-01-11 | 2017-09-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) | Method for obtaining of mature antigen-activated dendritic cells with transfection of tumour cells rna of breast cancer |
| RU2645464C1 (en) * | 2016-09-15 | 2018-02-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" (НИИФКИ) | Immunotherapy of breast cancer using antigen-activated dendritic cells |
| RU2655625C1 (en) * | 2017-02-14 | 2018-05-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова" | Method for treating breast cancer in cats |
| RU2793914C1 (en) * | 2022-06-06 | 2023-04-07 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр" Российской академии наук ("Томский НИМЦ") | Method for enhancing antitumor t-cell immunity in lung cancer patients |
| RU2822876C2 (en) * | 2023-12-18 | 2024-07-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | METHOD OF PRODUCING CYTOTOXIC LYMPHOCYTES USING IFN-γ AND TNF-α FOR ADOPTIVE IMMUNOTHERAPY |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11027001B2 (en) | Therapeutic cancer vaccines derived from a novel dendritic cell line | |
| US9211321B2 (en) | Method for proliferation of antigen-specific T cells | |
| Anguille et al. | Dendritic cell vaccination in acute myeloid leukemia | |
| Jacobs et al. | The interaction of NK cells and dendritic cells in the tumor environment: how to enforce NK cell & DC action under immunosuppressive conditions? | |
| Itoh et al. | Streptococcal preparation OK432 promotes functional maturation of human monocyte-derived dendritic cells | |
| Oth et al. | Pathogen‐associated molecular patterns induced crosstalk between dendritic cells, T helper cells, and natural killer helper cells can improve dendritic cell vaccination | |
| JP2014520780A (en) | Means and methods for active cell carcinoma immunotherapy using tumor cells and dendritic cells killed by high hydrostatic pressure | |
| JP2017025066A (en) | Means and methods for active cellular immunotherapy of cancer by using tumor cells killed by high hydrostatic pressure and dendritic cells | |
| RU2521506C1 (en) | Method of generating antigen-specific cytotoxic cells with antitumour activity in breast cancer | |
| WO2014007669A1 (en) | Autologous cell vaccine for treating oncological diseases and method for producing same | |
| KR20130091061A (en) | Composition for maturation of dendritic cell comprising mycobacterium tuberculosis rv2005c | |
| TW202206591A (en) | Method for ex vivo expanding natural killer cells and natural killer t cells | |
| RU2392946C2 (en) | Autologous vaccine for oncotherapy and method for preparing thereof | |
| Kass et al. | Restoration of tumor-specific HLA class I restricted cytotoxicity in tumor infiltrating lymphocytes of advanced breast cancer patients by in vitro stimulation with tumor antigen-pulsed autologous dendritic cells | |
| Tanaka et al. | Efficient induction of specific cytotoxic T lymphocytes to tumor rejection peptide using functional matured 2 day-cultured dendritic cells derived from human monocytes | |
| Cheng et al. | Biological activity of cytotoxic dendritic cells cocultured with cytokine-induced killer cells and their effect on acute leukemia cells | |
| KR101117186B1 (en) | Method for improvement of dendritic cell migration and of ctl cytotoxicity generated with dendritic cells | |
| Wojas-Turek et al. | Treatment with cyclophosphamide supported by various dendritic cell-based vaccines induces diversification in CD4+ T cell response against MC38 colon carcinoma | |
| RU2508298C2 (en) | Generation method of antigen-specific cytotoxic cells with activity against ovarian carcinoma cells | |
| Yano et al. | A new strategy using autologous dendritic cells and lymphokine-activated killer cells for cancer immunotherapy: efficient maturation of DCs by co-culture with LAK cells in vitro | |
| Rashid et al. | Decreased T-cell proliferation and skewed immune responses in LLC-bearing mice | |
| Khamisabadi et al. | Listeria monocytogenes activated dendritic cell based vaccine for prevention of experimental tumor in mice | |
| Hu et al. | HPV16 CTL epitope peptide-activated dendritic cell and natural killer co-culture for therapy of cervical cancer in an animal model | |
| DK2847321T3 (en) | PROCEDURE FOR IN-VITRO MATURING DENDRIT CELLS | |
| US10716810B2 (en) | Canine autologous immunotherapy using dendritic cell induced cancer killing immunocytes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150402 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20180129 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20180313 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190402 |