RU2521506C1

RU2521506C1 - Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы

Info

Publication number: RU2521506C1
Application number: RU2013114856/10A
Authority: RU
Inventors: Сергей Витальевич Сенников; Юлия Александровна Шевченко; Юлия Николаевна Хантакова; Василий Васильевич Курилин; Юлия Анатольевна Лопатникова; Сергей Васильевич Сидоров; Сергей Анатольевич Волгушев; Владимир Петрович Оглоблин; Лина Викторовна Ефимова; Надежда Вениаминовна Теплова
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "БиоМедТех" (ООО "БиоМедТех")
Priority date: 2013-04-01
Filing date: 2013-04-01
Publication date: 2014-06-27

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы, и может быть использовано в медицине. Способ включает выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови пациента, разделение клеток на прилипающую и неприлипающую фракции, добавление к прилипающей фракции МНК ростовых факторов, нагрузку дендритных клеток антигенами опухолевого лизата in vitro, стимуляцию созревания дендритных клеток в течение последующих суток. При этом к полученным незрелым ДК добавляют лизат аутологичных опухолевых клеток в дозе 100 мкг/мл, а еще через 48 часов в течение последующих 24 часов вносят рчФНО-альфа в дозе 25 нг/мл. Затем проводят совместное культивирование зрелых активированных лизатом дендритных клеток и неприлипающей фракции МНК в соотношении 1:10 в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 в дозе 10 нг/мл и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 в дозе 100 нг/мл. Изобретение позволяет повысить уровень цитотоксической и интерферон-продуцирующей активности антиген-активированных дендритных клеток при сокращении сроков их культивирования. 4 табл.

Description

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы.

Несмотря на успехи диагностики и лечения в последние два десятилетия рак молочной железы (РМЖ) до сих пор является наиболее распространенным онкологическим заболеванием среди женщин. По сравнению с 1999 годом, в 2009 в России наблюдался рост заболеваемости раком молочной железы на 15,91% [Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность). Под ред. В.И. Чиссова, 2011]. Общая выживаемость больных раком молочной железы в 5- и 10-летний срок составляет 68% и 50%, соответственно [La Vecchia, С., et al.//Ann. Oncol. - 2009. - №19].

На данный момент, перспективным направлением в лечении онкологических заболеваний являются различные методы иммунотерапии, направленные на непосредственное воздействие на опухоль и гибель раковых клеток в первичном очаге, или способствующие снижению риска раннего метастазирования и рецидивов опухолевого роста, за счет индукции апоптоза диссеминированных опухолевых клеток. Иммунотерапия непосредственно стимулирует внутренние системы организма на борьбу с патологическим процессом, а также способствует профилактике токсического действия как самой опухоли, так и химио- и лучевой терапии на организм в целом [Попович A.M. Иммунотерапия в онкологии. // Справочник по иммунотерапии для практического врача. СПб: изд-во "Диалог", 2002. С.335-352].

При любом онкологическом процессе, и при РМЖ, в частности, начиная с ранних предраковых состояний, начинается подавление нормального функционирования иммунной системы, приводящее к развитию иммунодепрессии, которая на сегодняшний день рассматривается как один из основных факторов агрессивного роста опухоли. [А. Mantovani et al. Tumour immunity: effector response to tumor and role of the microenvironment. // Lancet. - 2008. - N371. - p.771-83]. Это может быть связано с преобладанием CD4+ Т хелперов над CD8+ цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) [Kohrt HE, et al. Profile of immune cells in axillary lymph nodes predicts disease-free survival in breast cancer. // PLoS Med. - 2005. - N2(e284). - p.904-919; D.G. DeNardo and L. M. Coussens. Balancing immune response: crosstalk between adaptive and innate immune cells during breast cancer progression. - Breast Cancer Research. - 2007. - №9(212)]. Основной задачей иммунотерапии является активация процесса, способствующего разрушению опухоли с помощью усиления функциональных свойств антиген-презентирующих клеток (дендритных клеток), цитотоксических Т-лимфоцитов и натуральных киллерных клеток.

Дендритные клетки являются профессиональными антиген-презентирующими клетками, способными захватывать АГ и представлять его на своей поверхности в комплексе, как с классическими МНС I и II классов [R.M. Steinman The dendritic cells system and its role in immunogenicity. // Annu. Rev. bnmunol. - 1991. - №9. - p.271-279], так и с неклассическими молекулами (семейство CD1). [А.К. Palucka et al. Dendritic cells: a critical player in cancer therapy? // J Immunother. - 2008. - N31(9). - p.793-805]. Активация дендритных клеток(ДК) происходит в периферических тканях, где клетки узнают антигены и захватывают их с помощью различных механизмов (макропиноцитоза, рецептор-опосредованного эндоцитоза, фагоцитоза и др.). После захвата антигена ДК изменяют свою морфологию и фенотип, теряют способность к эндоцитозу, и мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где происходит межклеточное взаимодействие зрелых ДК и наивных или покоящихся Т-клеток. За счет взаимодействия рецепторов этих клеток, а также различных цитокинов происходит передача активационного сигнала Т-клеткам и запуск иммунного ответа [Н. Saito et al. Dendritic Cell-Based Vaccination Against Cancer. // Hematol Oncol Clin. - 2006. - N20. - p.689-710]. Активация Т-лимфоцитов зависит как от наличия костимуляторных молекул на поверхности клеток (CD40L, CD80/CD86, CD83 и др.), так и от микроокружения взаимодействующих клеток (ФНО-alpha, ИФН-gamma, ИЛ-12 и т.д.) [Н. Ueno et al. Dendritic cell subsets in health and disease. // Immunological Reviews. - 2007. - №219. - p.118-142].

Цитокины, продукция которых осуществляется активированными ДК, оказывают влияние на развитие иммунного ответа. Так, считается, что IL-18 воздействует на другие цитокины (например, ИФHg) и формирует цитотоксический тип иммунного ответа, за счет дифференцировки Т клеток в Th1 лимфоциты [De Jong Е.С., Smits Н.Н., Kapsenberg M.L. Dendritic cell-mediated Т cell polarization. // Springer Semin Immun. - 2004. - №26. - P.289-307]. Аналогичным действием обладает ИЛ-12. При этом ИЛ-18 сильнее, чем ИЛ-12 усиливает продукцию IFNγ Т- и цитотоксическими НК-клетками, а также пролиферацию Т-клеток [Barbulescu К, Becker С, Schlaak JF, et al. IL-12 and IL-18 differentially regulate the transcriptional activity of the human IFN-gamma promoter in primary CD4+T lymphocytes. // J Immunol. - 1998. - №160. - P.3642-3647].

На сегодняшний день наибольшее распространение получили ДК вакцины на основе миелоидных клеток. Незрелые ДК получают из прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), при добавлении в среду рчГМ-КСФ и рчИЛ-4. Для созревания ДК применяют определенный набор цитокинов, таких как ФНО-alpha, ИФН-alpha, ИЛ-15, ИФН-gamma, ПГЕ₂, и т.д. Для нагрузки ДК опухолевыми АГ могут использоваться РНК, ДНК, рекомбинантные белки, лизат опухолевых клеток [K.Palucka et al. Recent developments in cancer vaccines. // J Immunol. - 2011. - №186(3). - p.1325-1331].

Использование лизата аутологичных опухолевых клеток позволяет презентировать весь возможный набор иммунных молекул, тем самым вызывая поликлональную реакцию Т-лимфоцитов против опухолевых клеток. Кроме того, так как материал забирается непосредственно от больного, отсутствует ограничение по HLA типу.

Наиболее близким к предполагаемому является способ получения ДК и нагрузки их аутологичными апоптотическими опухолевыми клетками [N. Delirezh et al. Autologous dendritic cells loaded with apoptotic tumor cells induce Т cell-mediated immune responses against breast cancer in vitro. // Cellular Immunology - 2009 - №257 - p.23-31]. ДК получали из прилипшей фракции мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных с использованием lymphoprep (1.077 g/ml). Для получения незрелых ДК, прилипшая фракция МНК культивировалась в культуральной среде в присутствии гранулоцитарно -макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина 4 (ИЛ-4) в финальной концентрации 1000 ME/ml и 800 ME/ml соответственно. Среда менялась через день при повторном добавлении цитокинов. На 4 день в культуру незрелых ДК добавляли апоптотические опухолевые клетки в соотношении 1:1 и инкубировались в течение ночи. Апоптотические опухолевые клетки (ОК) получали из операционного материала опухоли, путем механического разделения на кусочки и ферментативного выделения клеток в течение ночи (37°С и 5% СO₂) с последующим гамма-облучением суспензии клеток. Облученные ОК инкубировались в течение 48 часов в полной среде с добавлением 10% человеческой сыворотки и замораживались до дальнейшего использования. Для получения зрелых ДК, на 5 день в культуру незрелых ДК и апоптотических ОК добавляли 25% (по объему) кондиционной среды моноцитов и 10 нг/мл ФНО-alhpa. Антиген-активированные зрелые ДК получались на 7 день культивирования. Далее, для оценки способности антиген-активированных ДК стимулировать цитотоксический Т-клеточный ответ in vitro, проводилось сокультивирование аутологичных Т-клеток, выделенных с помощью магнитной сепарации, и антиген-нагруженных ДК в течение 19 дней. Повторная стимуляция Т-клеток осуществлялась каждые 2 недели. Среда заменялась каждые 3 дня с добавлением ИЛ-2 (20 IU/ml). Первая оценка цитотоксичности проводилась как минимум на 19 день после стимуляции Т-клеток антиген-активированными ДК. Уровень цитотоксичности против аутологичных опухолевых клеток варьировал от 21% до 65% (медиана 28±9.5%). Также, наблюдался лизис клеток опухолевой линии К562 от 5,2 до18% (медиана 7.1±2.6%). Однако он был значительно ниже, чем лизис аутологичных опухолевых клеток (р<0,05). Через 24 часа после последней (третьей) стимуляции собиралась кондиционная среда совместной культуры активированных ДК и Т-клеток для измерения уровня продукции ИЛ-4 и ИФН-gamma с помощью коммерческого набора ELISA. У всех 5 пациентов наблюдался разный уровень продукции данных цитокинов: двое из исследуемых пациентов секретировали высокий уровень ИФН-gamma по сравнению с ИЛ-4 (335±38 pg/ml против 29±8 pg/ml), а у троих был выше уровень ИЛ-4, чем ИФН-gamma (1393±1218 pg/ml против 90±81 pg/ml).

Описанный способ получения антиген-активированных дендритных клеток достаточно длителен (7 суток), требует использования большого количества рекомбинантных цитокинов (рчГМ-КСФ, рчИЛ-4, рчФНО-alpha, и рчИЛ-2), что ведет к значительному удорожанию технологии, так и обладает недостаточной цитотоксической и интерферон-продуцирующей активностью.

Новая техническая задача - повышение цитотоксической и интерферон продуцирующей активности антиген-активированных дендритных клеток, обладающих более высоким потенциалом цитотоксической активности для формирования эффективного противоопухолевого ответа против опухолевых клеток молочной железы при сокращении сроков культивирования.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем:

Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови больных раком молочной железы культивируют с антиген-активированными дендритными клетками, полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК. Антигенную активацию ДК проводят с помощью лизата аутологичных опухолевых клеток, а для созревания ДК используют рекомбинантный человеческий провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли (рчФНО-α). Для эффективной модуляции противоопухолевой защиты совместное культивировании зрелых антиген-активированных ДК и неприлипающей фракции МНК проводят в присутствии рекомбинантных человеческих интерлейкинов (рчИЛ-12 и рчИЛ-18), что позволяет повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток.

Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является:

- использование рчИЛ-12 и рчИЛ-18 при сокультивировании ДК и МНК, что повышает эффективность стимуляции и направленную дифференцировку наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа,

- применение протоколов активации и созревания ДК, включающих использование аутологичных опухолевых антигенов, что активирует ДК против собственных опухолевых антигенов, тем самым увеличивая цитотоксический ответ, а также сокращает стадию получения зрелых антиген-активированных ДК до 5 суток.

Изобретение осуществляют следующим образом.

Выделенные из периферической крови больных раком молочной железы клетки прилипающей фракции мононуклеарных клеток культивируют в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10⁵ мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СО₂ при 37°С с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 48 часов культивирования к полученным незрелым ДК добавляют опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток) в дозе 100 мкг/мл, а еще через 48 часов для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносят рчФНО-α в дозе 25 нг/мл. Полученные дендритные клетки культивируют с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл.

Способность полученных антиген-активированных ДК стимулировать прямую цитотоксичность МНК оценивали по уровню гибели аутологичных опухолевых клеток, а также гибели клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы MCF-7. Для этого, полученные ДК совместно культивировали с неприлипшей фракцией МНК для праймирования опухолевых антигенов. Во все группы вносили аутологичные опухолевые клетки или клетки аденокарциномы молочной железы MCF-7 и оценивали их гибель по высвобождению внутриклеточного фермента лактатдегидрогеназы. Показано достоверное повышение значения цитотоксичности, что служит показателем активации противоопухолевых цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения опухолевых клеток (табл.1 и 2).

В Табл.1 приведены данные по цитотоксичности совместной культуры МНК больных раком молочной железы и аутологичных ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток, по отношению к аутологичным опухолевым клеткам (n=22). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

* Примечание:

МНК - контрольная культура МНК;

МНК+ДК 0 - совместная культура МНК и зрелых ДК, созревание которых происходило в отсутствие опухолевого антигена

МНК + ДК Lys - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клеток

+рчИЛ-12+рчИЛ18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18

* - статистически достоверные различия с группой МНК в соответствующей стимуляции

# - статистически достоверные различия с группой МНК+ДК 0 в соответствующей стимуляции

В Табл.2 приведены данные по цитотоксичности совместной культуры МНК больных раком молочной железы и аутологичных ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток, по отношению к опухолевой линии рака молочной железы MCF-7 (n=22). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

* Примечание:

МНК - контрольная культура МНК;

& - статистически достоверные различия с группой МНК+ДК Lys

При оценке цитотоксической активности совместной культуры МНК и антиген - активированных зрелых ДК были получены результаты, подтверждающие эффективность применения данного протокола для получения зрелых дендритных клеток, способных стимулировать цитотоксический потенциал МНК. Добавление в совместную культуру МНК и ДК стимулирующих цитокинов рчИЛ-12 и рчИЛ-18 является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их цитотоксического противоопухолевого ответа. Аналогичные результаты были получены при исследовании цитотоксического потенциала против клеточной линии рака молочной железы MCF-7, а именно добавление рекомбинантных цитокинов в совместную культуру антиген-нагруженных ДК и МНК статистически достоверно увеличивают цитотоксический ответ.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что использование рекомбинантных человеческих цитокинов (ИЛ-12 и ИЛ-18) статистически повышает цитотоксическую активность мононуклеарных клеток, как против аутологичных опухолевых клеток, так и против специфической клеточной линии аденокарциномы молочной железы, что свидетельствует об усилении индукции ответа Т хелперов 1 типа. При сравнении цитотоксического ответа против аутологичных ОК и клеток линии MCF-7 получены статистически достоверные различия в способности антиген-активированных ДК стимулироваться МНК как в спонтанных культурах (33,21±3,55% против 24,93±3,95%, соответственно, р<0,05), так и при стимуляции культуры клеток цитокинами (44,56±5,24% против 30,92±4,55, соответственно, р<0,05).

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных аутологичных дендритных клеток и рчИЛ-12, и рчИЛ-18 in vitro.

Для анализа антиген-специфической стимуляции иммунного ответа по Th1 типу, определяли содержание ИНФ-γ в кондиционной среде культуры МНК, сокультивированных с антиген - активированными дендритными клетками без добавления или с добавлением цитокинов, до и после дополнительной стимуляции опухолевыми антигенами. В табл.3 представлены результаты по продукции ИНФ-γ МНК пациентов с раком молочной железы, культивированных в разных условиях.

В Табл.3 приведены данные по продукции ИФН-гамма в совместной культуре МНК больных раком молочной железы и ДК, активированных лизатом аутологичных опухолевых клеток ДК (n=26). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

* Примечание:

МНК - контрольная культура МНК;

МНК+ДК(0) -совместная культура МНК и ДК без трансфекции;

МНК+ДК(Lys) - совместная культура МНК и ДК, нагруженных лизатом аутологичных опухолевых клеток

+рчИЛ-12, +рчИЛ-18 - совместная культура клеток с добавлением рчИЛ-12 и рчИЛ-18

+лизат - повторное добавление лизата в культуру МНК и ДК на 2 стуки после сокультивирования

* - статистически значимые различия

Под действием аутологичных антиген-активированных ДК больных раком молочной железы статистически достоверно повышается уровень продукции цитокина мононуклеарными клетками как в спонтанных культурах, так и при стимуляции ИЛ-12 и ИЛ-18 по сравнению с контрольными группами (МНК и МНК+ДК(0)). Добавление лизата в совместную культуру МНК и ДК не оказывает статистически значимого воздействия на продукцию ИФН-g.

Полученные данные по продукции иммунорегуляторного цитокина ИФН-g подтверждают результаты цитотоксического теста о возможности модуляции иммунного ответа с помощью разработанного протокола в сторону Th1-го типа.

Помимо Т-хелперов 1 типа, в развитие специфического противоопухолевого иммунного ответа принимают участие CD8+ цитотоксические лимфоциты. Доминирующим механизмом запуска цитотоксического ответа против поврежденных или измененных клеток является гранзим-опосредованный путь запуска апоптоза, который осуществляется двумя основными белками: порообразующим белком - перфорином, и основным цитотоксическим белком - гранзимом В [Rousalova I., Krepela E. Granzyme B-induced apoptosis in cancer cells and its regulation (Review). // International journal of oncology. - 2010. - №37. - P.1361-1378]. В исследованиях на мышах было показано, что отсутствие белка перфорина делает невозможным проникновение гранзима В в клетку и, соответственно, удаление поврежденных или измененных клеток. [Cullen SP, Brunet M, Martin SJ Granzymes in cancer and immunity. // Cell Death and Differentiation. - 2010. - №17. - P.616-623].

Для оценки потенциальной цитотоксической активности мононуклеарных клеток больных раком молочной железы, культивированных с антиген-стимулированными дендритными клетками определяли содержание внутриклеточного мономерного белка перфорина. (Табл.4).

На Фиг.4 приведены данные по содержанию перфорин-позитивных клеток в совместной культуре МНК и ДК, активированных лизатом аутологичных опухолевых клеток (n=26). Нагрузка осуществлялась на стадии незрелых ДК, совместное культивирование проводилось в течение 48 часов. Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

Примечание:

МНК - контрольная культура МНК;

МНК+ДК(0) - совместная культура МНК и ДК без трансфекции;

* - статистически значимые различия

Было показано, что добавление в совместную культуру МНК и антиген - активированных ДК рчИЛ-12 и рчИЛ-18 статистически достоверно увеличивает уровень продукции порообразующего белка перфорина при сравнении со всеми группами контроля (интактная группа МНК и группа МНК, культивированная совместно с ДК, созревание которых происходило в отсутствие антигена). При сокультивировании неприлипшей фракции МНК и антиген-нагруженных ДК в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18, повторное добавление лизата приводит к статистически достоверному увеличению внутриклеточной продукции перфорина по сравнению как с другими группами контроля (МНК и МНК+ДК(0) в аналогичной стимуляции), так и по сравнению с другими видами стимуляции совместной культуры МНК и антиген - активированных ДК.

Таким образом, совместное культивирование зрелых аутологичных антиген-активированных денритных клеток и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток совместно с рчИЛ-12 и рчИЛ-18, при повторном добавлении лизата или без него приводит к достоверному повышению содержания перфорин-позитивных клеток с более высокой потенциальной цитотоксической активностью.

В результате проведенных исследований была показана эффективность разработанного протокола генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с помощью антиген-активированных ДК и рчИЛ-12 и рчИЛ-18.

Приложение
Таблица 1
Группы	Уровень цитотоксичности, %
МНК	23,08±3,75
МНК+рчИЛ-12+рчИЛ18	19,42±4,40
МНК+ДК0	27,75±3,41*
МНК+ДК 0+рчИЛ-12+рчИЛ 18	24,98±4,41
МНК+ДК Lys	33,21±3,55*
МНК + ДК Lys+рчИЛ-12+рчИЛ 18	44,56±5,24*#

Таблица 2
Группы	Уровень цитотоксичности, %
МНК	21,25±3,89
МНК+рчИЛ-12+рчИЛ 18	21,95±4,03
МНК+ДК0	16,70±3,11
МНК+ДК 0+рчИЛ-12+рчИЛ 18	17,55±2,62
MHK+AKLys	24,93±3,95#
МНК + ДК Lys+рчИЛ-12+рчИЛ18	30,92±±4,55*#&

Таблица 3

Содержание ИФН-гамма, пг/мл

МНК-

МНК+ИЛ12, ИЛ18

МНК+лизат

МНК+лизат, ИЛ12, ИЛ18

МНК+ДК(0)

МНК+ДК(0)+ИЛ12, ИЛ18

МНК+ДК(0)+лизат

МНК+ДК(0)-+лизат ИЛ12, ИЛ18

МНК+ДК(Lys)

МНК+ДК(Lys)-+ИЛ12, ИЛ18

МНК+ДК(Lys

МНК+ДК(Lys)+лизат, ИЛ12, ИЛ18

МНК

1,41±0,2 2

*

МНК+ ИЛ 12, ИЛ18

114,82±4 6,54

*

МНК+ лизат

2,47±0,3 1

*

МНК + лизат, ИЛ 12, ИЛ18

104,12±4 4,42

*

МНК+ДК(0)

10,23±5, 16

*

МНК+Д К(0)+ ИЛ 12, ИЛ18

175,39±6 0,48

*

МНК+ДК(0)+лизат

7,73±2,8 9

*

МНК+ДК(0) +
лизат, ИЛ12, ИЛ18

166,55±5 1,55

*

МНК+XK(Lys)

12,38±3, 96

*

МНК+ ДК(Lys)+И Л12,ИЛ18

262,89±7 6,25

МНК+ДК(Lys)+ лизат

16,35±5, 83

*

МНК+ДК(Lys)+л изат,ИЛ12, ИЛ18

252,49±6 8,93

Таблица 4

Количест во перфорин-позитивных клеток, %

МНК-

МНК+ИЛ12, ИЛ18

МНК+лизат

МНК+лизат, ИЛ12, ИЛ18

МНК+ДК(0)

МНК+ДК(0)+ИЛ12, ИЛ18

МНК+ДК(0)+лизат

МНК+ДК(0)-+лизат ИЛ12, ИЛ18

МНК+ДК(Lys)

МНК+ДК(Lys)-+ИЛ12, ИЛ18

МНК+ДК(Lys)+лизат

МНК+ДК(Lys)+лизат, ИЛ12, ИЛ18

МНК

2,53±0,70

МНК+ ИЛ12, ИЛ18

2,83±0,53

*

МНК+, лизат

2,71±0,92

*

МНК + лизат, ИЛ 12, ИЛ18

3,06±0,85

*

МНК+ДК(0)

2,08±0,56

*

МНК+ДК(0)+ ИЛ 12, ИЛ18

3,12±0,70

*

МНК+ДК(0)+ лизат

2,19±0,39

*

МНК+ ДК(0) + лизат, ИЛ 12, ИЛ18

3,82±1,02

*

МНК+ДК(Lys)

3,24±0,56

*

МНК+ДК(Lys)+ИЛ12, ИЛ18

4,76±1,21

*

МНК+ДК(Lys)+ лизат

3,52±0,61

*

МНК+ ДК(Lys)+ лизат ,И Л12, ИЛ18

5,46±0,86

Claims

Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы, включающий выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови пациента, разделение клеток на прилипающую и неприлипающую фракции, добавление к прилипающей фракции МНК ростовых факторов, нагрузку дендритных клеток антигенами опухолевого лизата in vitro, стимуляцию созревания дендритных клеток в течение последующих суток, отличающийся тем, что проводят совместное культивирование зрелых дендритных клеток, активированных с помощью лизата аутологичных опухолевых клеток рака молочной железы, и неприлипающей фракции МНК в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18, при этом к полученным незрелым ДК добавляют лизат аутологичных опухолевых клеток в дозе 100 мкг/мл, а еще через 48 часов в течение последующих 24 часов вносят рчФНО-α в дозе 25 нг/мл, после этого полученные дендритные клетки культивируют с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл.