RU2465324C1 - Method for generation of specific immune response on human immunodeficiency virus antigens - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: what is presented is a method for modulation of a specific immune response on human immunodeficiency virus antigens. Dendritic cells recovered from peripheral blood of nominally healthy donors and presenting specific antigens (polyepitope protein TBI) are cultured with a non-adherent fraction of mononuclear cells with the presence of anti-inflammatory cytokines rhIL-12 and rhIL-18.

EFFECT: method enables producing in vitro antigen-specific clones of T-cells with activity of type 1 T-helpers required to form an effective immune response on HIV antigens.

3 dwg

Description

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам модуляции антиген-специфической иммунной реакции против антигенов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).The invention relates to immunology and biotechnology, and in particular to methods of modulating an antigen-specific immune response against antigens of the human immunodeficiency virus (HIV-1).

В основе развития нарушений иммунной защиты при проникновении ВИЧ в организм человека лежит поражение CD4+ Т-хелперов, дендритных клеток, что приводит к гибели иммуннокомпетентных клеток, дисрегуляции иммунной защиты и развития синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).The basis of the development of immune defense disorders during the penetration of HIV into the human body is the defeat of CD4 + T-helpers, dendritic cells, which leads to the death of immunocompetent cells, dysregulation of immune defense and the development of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).

В настоящее время большое внимание уделяется широконейтрализующим антителам как перспективным препаратам, способным нейтрализовать циркулирующие в крови вирусы. Однако реплицирующие формы вируса, находящиеся внутри клеток организма человека, не подвергаются воздействию гуморальных факторов защиты. В то же время важным звеном иммунитета, участвующим в элиминации вируса, находящегося внутри клетки, является Т-клеточный иммунитет (в основном цитотоксические Т-лимфоциты).At present, much attention is paid to widely neutralizing antibodies as promising drugs that can neutralize the circulating viruses in the blood. However, the replicating forms of the virus inside the cells of the human body are not exposed to humoral defense factors. At the same time, T-cell immunity (mainly cytotoxic T-lymphocytes) is an important element of immunity involved in the elimination of the virus inside the cell.

В настоящее время развиваются новые подходы профилактики и лечения больных, инфицированных ВИЧ, создаваемых на основе надежных и безопасных вакцин против ВИЧ, включающих в свой состав специально отобранные В- и Т-клеточные эпитопы [Кузнецова А.В., Данилова Т.И., Гладских О.П. и др. Дендритные клетки и их использование в иммунотерапии. // Молекулярная медицина. - 2003. - №3. - С.3-17; Bashan S.I., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I., NekrasovaN.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Poryvaeva V.A., Abomeva I.V., Ilyichev A.A. Designing and engineering of DNA-vaccine construction encoding multiple CTL epitopes of major HIV-1 antigens // Vaccine. - 2004. - No 22. - P.1672-1682; Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat`ev G.M. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIV vaccine // Protein Eng. 1995. V.8. No2. P.167-173]. Такие вакцины содержат только те эпитопы, которые необходимы для формирования протективного специфического иммунитета. Данный подход был использован для создания искусственной полиэпитопной конструкции - белка TBI, созданного на базе ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора [Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Азаев М.Ш., Рябчикова Е.И., Гилева И.П., Ильичев A.A. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1 // Молекулярная биология. - 2000. - Т. 34, №3. - С.480-485.; Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat`ev G.M. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIV vaccine // Protein Eng. 1995. V.8. No2. P.167-173; Karpenko L.I., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Poryvaeva V.A., Pronyaeva T.R. et al. Construction of artificial virus-like particles exposing HIV epitopes, and the study of their immunogenic properties // Vaccine. - 2003. - No 21(5-6). - P.386-392].Currently, new approaches are being developed for the prevention and treatment of HIV-infected patients, created on the basis of reliable and safe HIV vaccines, which include specially selected B- and T-cell epitopes [Kuznetsova A.V., Danilova T.I., Gladskikh O.P. and others. Dendritic cells and their use in immunotherapy. // Molecular medicine. - 2003. - No. 3. - S.3-17; Bashan S.I., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I., NekrasovaN.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Poryvaeva V.A., Abomeva I.V., Ilyichev A.A. Designing and engineering of DNA-vaccine construction encoding multiple CTL epitopes of major HIV-1 antigens // Vaccine. - 2004 .-- No. 22 .-- P.1672-1682; Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat`ev G.M. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIV vaccine // Protein Eng. 1995. V.8. No2. P.167-173]. Such vaccines contain only those epitopes that are necessary for the formation of protective specific immunity. This approach was used to create an artificial polyepitope construct - TBI protein, created on the basis of the Federal State Institution Scientific Center of the WB “Vector” of Rospotrebnadzor [Lebedev LR, Karpenko LI, Poryvaeva VA, Azaev M.Sh., Ryabchikova E .I., Gileva I.P., Ilyichev AA Construction of virus-like particles exhibiting HIV-1 epitopes // Molecular Biology. - 2000. - T. 34, No. 3. - S. 480-485 .; Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat`ev G.M. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIV vaccine // Protein Eng. 1995. V.8. No2. P.167-173; Karpenko L.I., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Poryvaeva V.A., Pronyaeva T.R. et al. Construction of artificial virus-like particles exposing HIV epitopes, and the study of their immunogenic properties // Vaccine. - 2003 .-- No. 21 (5-6). - P.386-392].

Для достижения оптимальной активации Т-клеток против ВИЧ посредством ДК-иммунотерапии очень важно контролировать состояние созревания ДК, т.к. незрелые ДК слабо стимулируют Т-клетки и могут быть толерогены. Созревание ДК описывается как эффекторная функция, которая активирует антиген-специфические Т-клеточные иммунные реакции [Reis e Sousa С.Dendritic cells in a mature age. Nat. Rev. ImmunoL - 2006. - No.6. - P.476-483]. Это процесс включает экспрессию поверхностных молекул, таких как МНС.To achieve optimal T-cell activation against HIV through DC immunotherapy, it is very important to monitor the state of DC maturation, as immature DCs stimulate T cells weakly and can be tolerogenic. DC maturation is described as an effector function that activates antigen-specific T-cell immune responses [Reis e Sousa C. Dendritic cells in a mature age. Nat. Rev. ImmunoL - 2006 .-- No.6. - P.476-483]. This process involves the expression of surface molecules such as MHC.

В настоящее время активно исследуется возможность применения новых методов иммунокоррекции у больных ВИЧ, в частности использования дендритных клеток для модуляции специфического противовирусного иммунного ответа [Rinaldo C.R. Dendritic cell-based human immunodeficiency virus vaccine. // J.Intem Med. - 2009. - Vol.256. - No.1. - P.138-158]. Дендритные клетки (ДК) - гетерогенная по происхождению, морфологии и выполняемым функциям популяция иммунокомпетентных клеток, которые принимают участие практически во всех видах иммунных реакций. ДК являются основными антигенпрезентирующими клетками, что обусловливает их непосредственное и важнейшее участие в формировании эффективного специфического иммунного ответа. Кроме того, ДК обладают способностью продуцировать провоспалительные цитокины (ФНО-α, ИФН-γ, ИЛ-1, ИЛ-12 и др.), что приводит к активации функций других иммунокомпетентных клеток, участвующих в противовирусной защите.The possibility of using new methods of immunocorrection in HIV patients, in particular the use of dendritic cells to modulate a specific antiviral immune response, is currently being actively studied [Rinaldo C.R. Dendritic cell-based human immunodeficiency virus vaccine. // J.Intem Med. - 2009 .-- Vol.256. - No.1. - P.138-158]. Dendritic cells (DCs) are a population of immunocompetent cells that are heterogeneous in origin, morphology, and function, which are involved in almost all types of immune responses. DCs are the main antigen-presenting cells, which determines their direct and most important participation in the formation of an effective specific immune response. In addition, DCs have the ability to produce pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IFN-γ, IL-1, IL-12, etc.), which leads to activation of the functions of other immunocompetent cells involved in antiviral protection.

По мере дифференцировки (созревания) изменяется функциональное состояние дендритных клеток. Так на стадии незрелых дендритных клеток они эффективно захватывают антигены, в основном посредством эндоцитоза и микропиноцитоза, но при этом их способность стимулировать Т-клетки ограничена. На стадии терминальной дифференцировки (зрелости) дендритные клетки способны презентировать антиген Т-лимфоцитам и активировать их, продуцируя соответствующие гуморальные факторы. То есть дендритные клетки, обладая уникальными механизмами захвата/представления антигена наивным Т-клеткам и активируя их, определяют направленность и эффективность иммунных реакций в организме.In process of differentiation (maturation), the functional state of dendritic cells changes. So at the stage of immature dendritic cells, they effectively capture antigens, mainly through endocytosis and micropinocytosis, but their ability to stimulate T cells is limited. At the stage of terminal differentiation (maturity), dendritic cells are able to present an antigen to T-lymphocytes and activate them, producing the corresponding humoral factors. That is, dendritic cells, possessing unique mechanisms of antigen capture / presentation to naive T cells and activating them, determine the direction and effectiveness of immune responses in the body.

Эффективность использования ДК объясняется, во-первых, тем, что на сегодня достаточно хорошо изучены молекулярные механизмы участия ДК в формировании иммунного ответа и, во-вторых, протоколы получения ДК и модуляции с их помощью иммунного ответа выглядят наиболее изученными и «прозрачными» с точки зрения контроля всех этапов этого метода клеточной терапии.The effectiveness of using DCs is explained, firstly, by the fact that today the molecular mechanisms of DCs participation in the formation of the immune response are well studied and, secondly, the protocols for obtaining DCs and modulating the immune response with them look the most studied and “transparent” from the point of view of view control of all stages of this method of cell therapy.

Эффективность модуляции ДК специфического иммунного ответа зависит от дополнительной стимуляции ДК in vitro. Оптимальное приготовление ДК для иммунотерапии дает возможность увеличения CD4+ и CD8+ Т-клеток непосредственно после инфузии. В данной модели созревание in vitro может активировать ДК для продукции ИЛ-12 при последующем взаимодействии с Тх1 клетками in vivo. ИЛ-12 продуцирующие ДК, которые ввели в организм, должны в последствии поляризовать CD4+ Т×1 клетки, которые преимущественно продуцируют ИФН-γ, который активирует CD8+цитотоксические Т-лимфоциты. Таким образом, посредством активированных in vitro ДК стимулируются CD8+ и преобладание Т×1 над Т×2 реакций in vivo, что позволит устранить дефицит Т-клеточной реактивности, наблюдаемой при ВИЧ-инфекции.The effectiveness of DC modulation of a specific immune response depends on additional in vitro stimulation of DC. The optimal preparation of DCs for immunotherapy makes it possible to increase CD4 + and CD8 + T cells immediately after infusion. In this model, in vitro maturation can activate DCs for the production of IL-12 during subsequent interaction with Tx1 cells in vivo. IL-12 producing DCs, which were introduced into the body, should subsequently polarize CD4 + T × 1 cells, which mainly produce IFN-γ, which activates CD8 + cytotoxic T lymphocytes. Thus, through in vitro activated DCs, CD8 + and the predominance of T × 1 over T × 2 in vivo reactions are stimulated, which will eliminate the deficit of T-cell reactivity observed in HIV infection.

Было показано, что ВИЧ инфицирует как миелоидные, так и плазмацитоидные дендритные клетки, путем взаимодействия с CD4, DC-SIGN [Schimdt В., Fujimura S.H., Martin J.N., Levy J.A. Variations in plasmacytoid dendritic cell (PDC) and myeloid dendritic cell (MDC) levels in HIV-infected subjects on and off antiretroviral therapy. J. Clin. Immunol. 2006. - Vol.26. - P.55-64]. Репликация вируса в большей степени происходит в незрелых дендритных клетках по сравнению со зрелыми клетками. Миелоидные дендритные клетки у больных ВИЧ, не подвергавшиеся специфической терапии, имеют незрелый фенотип и индуцируют активность регуляторных Т-клеток, которые могут подавлять пролиферацию CD8+ Т-клеток и их функцию [Krathwohl M.D., Schacker T.W., Anderson J.L. Abnormal presence of semimature dendritic cells that induce regulatory Т cells in HIV-infected subjects. J. Infect Dis. - 2006. - Vol.193. - P.494-504].It has been shown that HIV infects both myeloid and plasmacytoid dendritic cells by interacting with CD4, DC-SIGN [Schimdt B., Fujimura S.H., Martin J.N., Levy J.A. Variations in plasmacytoid dendritic cell (PDC) and myeloid dendritic cell (MDC) levels in HIV-infected subjects on and off antiretroviral therapy. J. Clin. Immunol. 2006. - Vol. 26. - P.55-64]. Virus replication occurs to a greater extent in immature dendritic cells compared to mature cells. Myeloid dendritic cells in HIV patients who have not undergone specific therapy have an immature phenotype and induce the activity of regulatory T cells that can inhibit the proliferation of CD8 + T cells and their function [Krathwohl M.D., Schacker T.W., Anderson J.L. Abnormal presence of semimature dendritic cells that induce regulatory T cells in HIV-infected subjects. J. Infect Dis. - 2006 .-- Vol.193. - P.494-504].

Описан способ (прототип), при котором получали незрелые дендритные клетки из CD14+ мононуклеарных клеток периферической крови ВИЧ-позитивных (негативных) пациентов путем культивирования в полной среде с добавлением рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рчГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (рчИЛ-4) в течение 5-6 дней. Затем получали зрелые дендритные клетки путем добавления CD40L в культуральную среду и инкубации в течение 40 ч. В качестве ВИЧ-специфического антигена использовались эпитопы пептидов Nef и Gag. Антигены добавляли к незрелым или зрелым дендритным клеткам и инкубировали в течение 2 ч. Далее антиген-активированные клетки культивировали совместно с мононуклеарными клетками (МНК) в соотношении 1:10 в течение 16-18 ч («overnight»). Для оценки пролиферативной активности CD4- и CD8-позитивных клеток совместное культивирование продолжалось в течение 6 дней. Также оценивали внутриклеточную продукцию иммуннокомпетентными клетками IFN-γ, TNF-α методом проточной цитофлуорометрии. Наибольшее количество IFN-γ-положительных клеток было в группе МНК, сокультивированных со зрелыми ДК, к которым после созревания добавляли 15-мерный белок (эпитопы Nef и Gag), по сравнению с группой МНК, которые сокультивировали с ДК, к которым добавляли антигены на стадии незрелых клеток. В тоже время не было обнаружено стимуляции Т-клеточной реактивности в ответ на эпитопы белков Gag и Nef у трех ВИЧ-серонегативных пациентов. Эпитопы белка Nef стимулировали пролиферацию CD8-позитивных лимфоцитов в присутствии дендритных клеток, в культуре мононуклеарных клеток без сокультивирования с дендритными клетками белок Nef не стимулировал пролиферацию СD8-позитивных лимфоцитов. Белки Gag стимулировали пролиферацию CD4-и CD8-позитивных клеток. Наибольшее влияние белков на пролиферацию было при предварительной нагрузке ими дендритных клеток. Полученные результаты показали, что использование сочетания эпитопы белков Gag и Nef стимулирует продукцию множества иммунных медиаторов CD4- и СD8-позитивными клетками. При стимуляции МНК антиген-активированными дендритными клетками количество IFN-γ- и TNF-α-позитивных клеток достигало не более 2-3% от всей популяции лимфоцитов (Huang X.-L., Fan Z., Borowski L., Rinaldo C.R. Multiple T-cell responses to human immunodeficiency virus type 1 are enhanced by dendritic cell // Clinical and vaccine immunology. - 2009. - Vol.16. - N.10. - P.1504-1516).A method (prototype) is described in which immature dendritic cells from CD14 + peripheral blood mononuclear cells of HIV-positive (negative) patients were obtained by culturing in complete medium supplemented with recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF) and interleukin-4 (rhIL -4) within 5-6 days. Then mature dendritic cells were obtained by adding CD40L to the culture medium and incubation for 40 hours. Epitopes of the Nef and Gag peptides were used as HIV-specific antigen. Antigens were added to immature or mature dendritic cells and incubated for 2 hours. Next, antigen-activated cells were cultured together with mononuclear cells (MNC) in a ratio of 1:10 for 16-18 hours (“overnight”). To assess the proliferative activity of CD4 and CD8 positive cells, co-culture continued for 6 days. Intracellular production was also evaluated by immunocompetent cells IFN-γ, TNF-α by flow cytometry. The highest number of IFN-γ-positive cells was in the group of MNCs co-cultivated with mature DCs, to which, after maturation, a 15-dimensional protein (Nef and Gag epitopes) was added, compared to the group of MNCs, which were co-cultured with DCs, to which antigens were added on stages of immature cells. At the same time, no stimulation of T-cell reactivity was detected in response to the epitopes of the Gag and Nef proteins in three HIV-seronegative patients. Nef protein epitopes stimulated the proliferation of CD8-positive lymphocytes in the presence of dendritic cells; in a mononuclear cell culture without co-cultivation with dendritic cells, Nef did not stimulate the proliferation of CD8-positive lymphocytes. Gag proteins stimulated the proliferation of CD4 and CD8 positive cells. The greatest influence of proteins on proliferation was upon preload of dendritic cells. The results showed that the use of a combination of Gag and Nef protein epitopes stimulates the production of many immune mediators of CD4 and CD8 positive cells. Upon stimulation of MNCs with antigen-activated dendritic cells, the number of IFN-γ and TNF-α-positive cells reached no more than 2-3% of the entire lymphocyte population (Huang X.-L., Fan Z., Borowski L., Rinaldo CR Multiple T-cell responses to human immunodeficiency virus type 1 are enhanced by dendritic cell // Clinical and vaccine immunology. - 2009. - Vol.16. - N.10. - P.1504-1516).

Недостатком данного подхода является длительный срок культивирования дендритных клеток (5-6 дней). Создание полиэпитопного иммуногена, содержащего более 30 эпитопов ВИЧ, достаточно сложная в техническом плане процедура. Все это приводит к значительному удорожанию технологии. Кроме того, уровень стимуляции цитотоксических клеток, судя по количеству IFN-γ- и TNF-α-позитивных клеток, довольно низок и не превышает 2-3%.The disadvantage of this approach is the long term cultivation of dendritic cells (5-6 days). The creation of a polyepitope immunogen containing more than 30 epitopes of HIV is a rather complicated technical procedure. All this leads to a significant increase in the cost of technology. In addition, the level of stimulation of cytotoxic cells, judging by the number of IFN-γ and TNF-α-positive cells, is quite low and does not exceed 2-3%.

Направленность развития протективного ответа зависит от многих факторов, в том числе от баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Известно, что провоспалительный цитокин ИЛ-12 обладает широкой биологической активностью, стимулирует цитотоксические и НК-клетки, активирует дифференциацию CD4+ Т-лимфоцитов по 1 типу, индуцирует продукции NO макрофагами, тем самым потенцирует противовирусный иммунитет. Прововоспалительный цитокин ИЛ-18 является фактором, индуцирующим продукцию ИФН-γ Т- и НК-клетками, усиливая цитотоксический ответ. Показано, что при совместном применении ИЛ-12 и ИЛ-18 наблюдается наиболее выраженная стимуляция продукции ИНФ-γ и перфоринзависимой цитотоксичности НК-клеток, пролиферация Т-лимфоцитов, что позволяет максимально возможно стимулировать эффекторное звено иммунитета против ВИЧ [de Arquer G.R., Реnа R., Cabrere С., Coma G., Ruiz-Hernandez R., Guerola R., Clotet В., Ruiz L., Este J.A., Calle M.L., Bofill M. Skewed expression and up-regulation of the IL-12 and IL-18 receptors in resting and activated CD4 Т cells from HIV-1-infected patients // J. Leukoc. BioL - 2007. - Vol.82. - P.72-78].The direction of development of the protective response depends on many factors, including the balance of pro- and anti-inflammatory cytokines. It is known that the pro-inflammatory cytokine IL-12 has a wide biological activity, stimulates cytotoxic and NK cells, activates the differentiation of type 1 CD4 + T-lymphocytes, induces NO production by macrophages, thereby potentiating antiviral immunity. The pro-inflammatory cytokine IL-18 is a factor inducing the production of IFN-γ by T and NK cells, enhancing the cytotoxic response. The combined use of IL-12 and IL-18 showed the most pronounced stimulation of the production of INF-γ and perforin-dependent cytotoxicity of NK cells, proliferation of T-lymphocytes, which makes it possible to stimulate the effector immunity against HIV [de Arquer GR, Rena R ., Cabrere S., Coma G., Ruiz-Hernandez R., Guerola R., Clotet B., Ruiz L., Este JA, Calle ML, Bofill M. Skewed expression and up-regulation of the IL-12 and IL -18 receptors in resting and activated CD4 T cells from HIV-1-infected patients // J. Leukoc. BioL - 2007 .-- Vol. 82. - P.72-78].

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа генерации антиген-специфического иммунного ответа против антигенов вируса иммунодефицита человека.An object of the present invention is to provide an efficient and economical method for generating an antigen-specific immune response against human immunodeficiency virus antigens.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем:The essence of the invention is as follows:

Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови условно здоровых доноров культивируют с антиген-активированными дендритными клетками, полученными из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток. Антигенную активацию дендритных клеток проводят с помощью полиэпитопного вирусного белка TBI, а для созревания ДК используют рекомбинантный человеческий провоспалительный цитокин - фактор некроза опухоли (рчФНО-α). Для повышения модуляции потенциала цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых антиген-активированных ДК проводят в присутствии рчИЛ-12 и рчИЛ-18.Mononuclear cells of a non-adherent fraction of peripheral blood of conditionally healthy donors are cultured with antigen-activated dendritic cells obtained from monocytes of an adherent fraction of mononuclear cells. Antigenic activation of dendritic cells is carried out using the TBI polyepitope viral protein, and recombinant human pro-inflammatory cytokine - tumor necrosis factor (rcFNO-α) is used to mature DCs. To increase the modulation of the potential of the cytotoxic activity of mononuclear antigen-specific cells, the non-adherent fraction of MNCs and mature antigen-activated DCs are co-cultured in the presence of rhIL-12 and rhIL-18.

Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является использование рчИЛ-12 и рчИЛ-18 при сокультивировании ДК и МНК, что повышает эффективность необходимых для стимуляции и поддержания направленной дифференцировки наивных Т-клеток в Т-хелперы 1 типа, а также применение протоколов активации и созревания ДК, включающих использование антигенной вирусной конструкции - полиэпитопного белка TBI и рчФНО-α, что активирует мононуклеарные клетки против вирусных антигенов (увеличение содержания внутриклеточного перфорина в иммуннокомпетентных клетках), а также сокращает стадию получения зрелых антиген-активированных ДК до 3-х суток.The fundamental difference between the developed method and the prototype is the use of rchIL-12 and rchIL-18 when co-cultivating DCs and MNCs, which increases the efficiency of stimulating and maintaining directed differentiation of naive T cells into type 1 T-helpers, as well as the use of activation and maturation protocols for DC including the use of an antigenic viral construct - polyepitope protein TBI and rhFNO-α, which activates mononuclear cells against viral antigens (increase in the content of intracellular perforin in the immune competent cells), and also reduces the stage of obtaining mature antigen-activated DCs up to 3 days.

Предлагаемое изобретение повышает эффективность генерации цитотоксических клеток, а также позволяет сократить сроки сокультивирования ДК и МНК, что в итоге приводит к снижению стоимости процедуры.The present invention improves the efficiency of generation of cytotoxic cells, and also reduces the time of co-cultivation of DCs and MNCs, which ultimately leads to a decrease in the cost of the procedure.

Техническим результатом изобретения является генерация in vitro антиген-специфических клонов Т-клеток с активностью Т-хелперов 1 типа, необходимых для формирования эффективного противовирусного ответа.The technical result of the invention is the generation of in vitro antigen-specific T-cell clones with the activity of type 1 T-helpers necessary for the formation of an effective antiviral response.

Изобретение осуществляется следующим образом.The invention is as follows.

Выделенная из периферической крови условно здоровых доноров прилипающая фракция мононуклеарных клеток культивируется в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10^-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СO₂ при 37°С с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 48 часов культивирования к полученным незрелым ДК добавляется антигенная вирусная конструкция (полиэпитопный белок TBI) в дозе 130 нг/мл, а еще через 24 часа для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносится рчФ-НО-α в дозе 25 мкг/мл.The adherent fraction of mononuclear cells isolated from the peripheral blood of conditionally healthy donors is cultured at a concentration of 1 million / ml in complete medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 5 × 10 ^-5 mM 2-mercaptoethanol, 80 μg / ml gentamicin, 100 μg / ml ampicillin in an atmosphere of 5% CO ₂ at 37 ° C with the addition of rhGM-CSF (50 ng / ml) and rhIL-4 (100 ng / ml). After 48 hours of cultivation, an antigenic viral construct (TBI polyepitope protein) is added to the resulting immature DCs at a dose of 130 ng / ml, and after another 24 hours, rcF-HO-α is added at a dose of 25 μg / for maturation of immature dendritic cells ml

Полученные дендритные клетки культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл. Для оценки антиген-специфического ответа полученные группы культур клеток разделили на две подгруппы (спонтанная и TBI-стимулированная), к одной из них через 48 часов инкубации (5% СО₂ и 37°С) добавляли белок TBI в количестве 130 нг/мл.The obtained dendritic cells are cultured with a non-adherent fraction of mononuclear cells in a ratio of 1:10 with the addition of rhIL-12 at a dose of 10 ng / ml and rhIL-18 at a dose of 100 ng / ml. To evaluate the antigen-specific response, the obtained groups of cell cultures were divided into two subgroups (spontaneous and TBI-stimulated), and TBI protein in the amount of 130 ng / ml was added to one of them after 48 hours of incubation (5% CO ₂ and 37 ° C).

Для определения потенциальной цитотоксической активности Т-лимфоцитов через 48 часов оценивали количество перфоринсодержащих цитотоксических клеток и содержание ИЛ-4 и ИФН-γ в кондиционной среде культур клеток. Через 60 часов с момента добавления белка TBI в культуру мононуклеарных клеток оценивали внутриклеточную продукцию ИЛ-4 и ИНФ-γ иммуннокомпетентными клетками.To determine the potential cytotoxic activity of T-lymphocytes after 48 hours, the number of perforin-containing cytotoxic cells and the content of IL-4 and IFN-γ in the conditioned medium of cell cultures were evaluated. 60 hours after the addition of the TBI protein to the mononuclear cell culture, the intracellular production of IL-4 and INF-γ by immunocompetent cells was evaluated.

Исследованием количества цитотоксических Т-лимфоцитов было установлено, что при добавлении белка TBI в культуру МНК с дендритными клетками, нагруженными антигеном, происходит уменьшение количества цитотоксических Т-лимфоцитов, содержащих ИЛ-4 (фиг.1).A study of the number of cytotoxic T-lymphocytes found that when TBI protein is added to the MNC culture with dendritic cells loaded with antigen, the number of cytotoxic T-lymphocytes containing IL-4 decreases (Fig. 1).

Также было показано, что добавление ИЛ-12 и ИЛ-18 к дендритным клеткам, нагруженным антигеном, приводит к дальнейшему снижению количества цитотоксических Т-лимфоцитов, содержащих ИЛ-4 (фиг.1).It was also shown that the addition of IL-12 and IL-18 to dendritic cells loaded with antigen, leads to a further decrease in the number of cytotoxic T lymphocytes containing IL-4 (figure 1).

Количество IFN-γ-содержащих цитотоксических Т-лимфоцитов достоверно не меняется как при инкубации с дендритными клетками, нагруженными белком TBI, так и в присутствии IL-12 и IL-18.The number of IFN-γ-containing cytotoxic T-lymphocytes does not significantly change both during incubation with dendritic cells loaded with TBI protein, and in the presence of IL-12 and IL-18.

На следующем этапе оценивали уровень продукции ИЛ-4 и ИФН-γ мононуклеарными клетками при сокультивировании их с дендритными клетками, нагруженными белком TBI. Обнаружено, что сокультивирование МНК с дендритными клетками и цитокинами (ИЛ-12 и ИЛ-18) не влияет на продукцию ИЛ-4 В то же время дендритные клетки, нагруженные белком TBI, в сочетании с ИЛ-12 и ИЛ-18 достоверно увеличивают содержание ИФН-γ в культуре МНК, по сравнению с аналогичной культурой клеток, но без добавления ИЛ-12 и ИЛ-18 (фиг.2). Следует отметить, что внесение белка TBI в культуру МНК с дендритными клетками, нагруженными антигеном, вызывает увеличение содержания ИФН-γ в кондиционной среде. Этот эффект белка был наиболее выражен в культуре клеток, к которым добавляли ИЛ-12 и ИЛ-18.At the next stage, the level of production of IL-4 and IFN-γ by mononuclear cells was evaluated upon co-cultivation with dendritic cells loaded with TBI protein. It was found that co-cultivation of MNCs with dendritic cells and cytokines (IL-12 and IL-18) does not affect the production of IL-4. At the same time, dendritic cells loaded with TBI protein, in combination with IL-12 and IL-18, significantly increase the content IFN-γ in the culture of MNCs, compared with a similar cell culture, but without the addition of IL-12 and IL-18 (figure 2). It should be noted that the introduction of TBI protein into the culture of MNCs with dendritic cells loaded with antigen causes an increase in the content of IFN-γ in the conditioned medium. This protein effect was most pronounced in cell culture, to which IL-12 and IL-18 were added.

Для оценки влияния дендритных клеток, нагруженных белком TBI, на потенциальную цитотоксическую активность мононуклеарных клеток определяли содержание CD8-позитивных клеток, секретирующих внутриклеточный мономерный белок перфорин - фактор цитотоксичности, вызывающий образование пор в цитоплазматической мембране, приводящих к лизису инфицированных клеток. Установлено, что использование дендритных клеток, нагруженных белком TBI, достоверно увеличивает количество CD8-позитивных клеток, содержащих перфорин, в культуре МНК в отличие от дендритных клеток без нагрузки белком TBI, что свидетельствует о способности полиэпитопного белка (TBI) стимулировать цитотоксическую активность CD8-позитивных клеток (фиг.3).To assess the effect of dendritic cells loaded with TBI protein on the potential cytotoxic activity of mononuclear cells, the content of CD8-positive cells secreting the intracellular monomeric protein perforin, a cytotoxicity factor causing pore formation in the cytoplasmic membrane, leading to the lysis of infected cells, was determined. It has been established that the use of dendritic cells loaded with TBI protein significantly increases the number of CD8-positive cells containing perforin in MNC culture, in contrast to dendritic cells without loading with TBI protein, which indicates the ability of the polyepitope protein (TBI) to stimulate the cytotoxic activity of CD8-positive cells (figure 3).

Claims (1)

Способ генерации специфического иммунного ответа против антигенов вируса иммунодефицита человека, заключающийся в совместном культивировании неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови с дендритными клетками (ДК), активированными антигенами ВИЧ и полученными из моноцитов прилипающей фракции МНК, отличающийся тем, что для совместного культивирования берут зрелые ДК, полученные добавлением к антиген-активированным с помощью полиэпитопного вирусного белка ТВ1 незрелым ДК провоспалительного цитокина ФНО-α, а совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых антиген-активированных ДК проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина - 12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина - 18. A method for generating a specific immune response against human immunodeficiency virus antigens, which consists in co-culturing a non-adherent fraction of mononuclear cells (MNCs) isolated from peripheral blood with dendritic cells (DCs) activated by HIV antigens and obtained from monocytes of an adherent fraction of MNCs, characterized in that for mature DCs obtained by adding to the immature DC proinflammatory DCs to antigen-activated TB1 polyepitopic viral protein tokin TNF-α, and co-culturing non-stick fraction MNC and mature antigen-activated DC is performed in the presence of recombinant human interleukin - 12 and recombinant human IL - 18.

Images