RU2502743C1 - Synthetic antigen having ability to fix autoantibodies to muscarine m2-receptor - Google Patents
Synthetic antigen having ability to fix autoantibodies to muscarine m2-receptor Download PDFInfo
- Publication number
- RU2502743C1 RU2502743C1 RU2012133212/10A RU2012133212A RU2502743C1 RU 2502743 C1 RU2502743 C1 RU 2502743C1 RU 2012133212/10 A RU2012133212/10 A RU 2012133212/10A RU 2012133212 A RU2012133212 A RU 2012133212A RU 2502743 C1 RU2502743 C1 RU 2502743C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- receptor
- muscarinic
- antigen
- peptide
- autoantibodies
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к иммунологии, и служит для определения аутоантител, специфичных к мускариновому М2-рецептору, которое может быть использовано для диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма.The invention relates to biochemistry and medicine, in particular to immunology, and is used to determine autoantibodies specific for the muscarinic M2 receptor, which can be used to diagnose idiopathic heart rhythm disorders.
Фатальные нарушения ритма и проводимости сердца являются одной из главных причин внезапной сердечной смерти в развитых странах ([1] - Zheng Z., Croft J., Giles W., MensahG. Sudden cardiac death in the United States, 1989 to 1998. Circulation 2001; 104: 2158-2163). Наиболее часто встречающейся формой нарушения ритма сердца является мерцательная аритмия (МА), которая обычно возникает как осложнение различных заболеваний сердечно-сосудистой системы. Однако в 10-30% случаев даже при тщательном клинико-инструментальном обследовании пациентов с аритмиями и блокадами сердца выявить причину подобных нарушений не удается, т.е. МА проявляется у пациентов без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы ([2] - Бекбосынова М.С. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. М: ФГУ РКНПК, 2007). В этих случаях аритмию принято квалифицировать как «идиопатическую». В ряде исследований показана вероятность развития у таких пациентов вторичной, аритмогенно обусловленной, кардиомиопатии с ухудшением сократительной функции миокарда, которая восстанавливается при хирургическом или медикаментозном устранении аритмии ([3] - Ардашев А.В., Склярова Т.Ф., Шаваров А.А. Особенности центральной гемодинамики у пациентов с идиопатическими нарушениями ритма сердца из области выходного тракта правого желудочка до радиочастотной катетерной аблации и в течение года после нее. Кардиология 2009; 3: 4-9, [4] - Chugh S.S., Shen W - K., Luria D.M. First evidence of premature ventricular complex-induced cardiomyopathy: a potentially reversible cause of heart failure. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 2000; 11: 328-329). Есть клинические описания развития аритмогенной дисплазии правого желудочка через 15 лет от момента выявления у пациентов «идиопатической» желудочковой экстрасистолии ([5] - Kuhn А., Kottkamp Н., Thiele Н. Idiopathic right ventricular tachycardia or arrythmogenic right ventricular tachycardia? Dtsch. Med. Woch. 2000; 25 (22): 692-697). Эти и другие данные позволяют предположить, что «идиопатические» нарушения ритма могут быть первым, наиболее ранним проявлением заболеваний сердца.Fatal arrhythmias and conduction of the heart are one of the main causes of sudden cardiac death in developed countries ([1] - Zheng Z., Croft J., Giles W., Mensah G. Sudden cardiac death in the United States, 1989 to 1998. Circulation 2001 ; 104: 2158-2163). The most common form of heart rhythm disturbance is atrial fibrillation (MA), which usually occurs as a complication of various diseases of the cardiovascular system. However, in 10-30% of cases, even with a thorough clinical and instrumental examination of patients with arrhythmias and heart block, it is not possible to identify the cause of such disorders, i.e. MA appears in patients without signs of an organic disease of the cardiovascular system ([2] - Bekbosynova MS. Abstract of dissertation for the degree of Doctor of Medical Sciences. M: FGU RKNPK, 2007). In these cases, it is customary to qualify arrhythmia as "idiopathic." A number of studies have shown the likelihood of developing in these patients secondary, arrhythmogenically caused, cardiomyopathy with worsening myocardial contractile function, which is restored during the surgical or medical elimination of arrhythmia ([3] - Ardashev AV, Sklyarova TF, Shavarov A.A. Features of central hemodynamics in patients with idiopathic cardiac arrhythmias from the right ventricular exit tract before radiofrequency catheter ablation and during the year after it Cardiology 2009; 3: 4-9, [4] - Chugh SS, Shen W - K., Luria D.M. First evidence of premature ventricular complex-induced cardiomyopathy: a potentially reversible cause of heart failure. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 2000; 11: 328-329). There are clinical descriptions of the development of arrhythmogenic dysplasia of the right ventricle after 15 years from the moment the patients revealed an “idiopathic” ventricular extrasystole ([5] - Kuhn A., Kottkamp N., Thiele N. Idiopathic right ventricular tachycardia or arrythmogenic right ventricular tachycardia? Dtsch. Med Woch. 2000; 25 (22): 692-697). These and other data suggest that "idiopathic" rhythm disturbances may be the first, earliest manifestation of heart disease.
В настоящее время установлено, что аутоантитела, обнаруженные в сыворотках крови больных с аритмиями и острой сердечной недостаточностью, являются антителами к собственным антигенам, целому ряду рецепторов, в частности к β1-адренорецептору, белку мускаринового М2-рецептора и др., что свидетельствует об аутоиммунном характере данного спектра заболеваний ([6] - Matoba Y. et al. Therapeutic Left Ventricular Assist Device and Apheresis on Dilated Cardiomyopathy.// Artificial Organs. - 2004.- V.28(2).-P.171-181). Большинство аутоантител является иммуноглобулинами класса G (IgG) с молекулярной массой около 150 кДа.It has now been established that autoantibodies found in the blood serum of patients with arrhythmias and acute heart failure are antibodies to their own antigens, a number of receptors, in particular to the β 1 -adrenergic receptor, the protein of the muscarinic M2 receptor, etc., which indicates the autoimmune nature of this spectrum of diseases ([6] - Matoba Y. et al. Therapeutic Left Ventricular Assist Device and Apheresis on Dilated Cardiomyopathy.// Artificial Organs. - 2004.- V.28 (2) .- P.171-181) . Most autoantibodies are class G immunoglobulins (IgG) with a molecular weight of about 150 kDa.
Опубликованые данные свидетельствуют о том, что у больных с постоянной формой «идиопатической» МА антитела к мускариновому М2-рецептору присутствуют в 3 раза чаще, чем у здоровых лиц ([7] - Chiale Р.А, et al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction. // Circulation. 2001;103(13):1765-71). Добавление сыворотки крови, содержащей антитела к мускариновому М2-рецептору к изолированным сердцам лабораторных животных и куриным эмбрионам, вызывало снижение частоты сердечных сокращений и индукцию суправентрикулярных аритмий ([8] - Baba A., Yoshikawa Т., Fukuda Y., Sugiyama Т. et al. Autoantibodies against M2-muscarinic acetylcholine receptors: new upstream targets in atrial fibrillation in patients with dilated cardiomyopathy.// Eur. Heart. J. 2004; 25: 1108-1115). Таким образом, есть основания полагать, что аутоиммунные механизмы, в частности, действие аутоантител к мускариновому М2-рецептору, могут способствовать возникновению и сохранению МА у пациентов без органического заболевания сердца.Published data indicate that in patients with a constant form of “idiopathic” MA, antibodies to the muscarinic M2 receptor are present 3 times more often than in healthy individuals ([7] - Chiale P. A., et al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction. // Circulation. 2001; 103 (13): 1765-71). The addition of blood serum containing antibodies to the muscarinic M2 receptor to isolated hearts of laboratory animals and chicken embryos caused a decrease in heart rate and induction of supraventricular arrhythmias ([8] - Baba A., Yoshikawa T., Fukuda Y., Sugiyama T. et al. Autoantibodies against M2-muscarinic acetylcholine receptors: new upstream targets in atrial fibrillation in patients with dilated cardiomyopathy.// Eur. Heart. J. 2004; 25: 1108-1115). Thus, there is reason to believe that autoimmune mechanisms, in particular, the action of autoantibodies to the muscarinic M2 receptor, can contribute to the emergence and maintenance of MA in patients without organic heart disease.
В связи с вышесказанным, определение уровня антител к мускариновому М2-рецептору чрезвычайно важно для диагностики нарушений ритма и проводимости сердца у больных без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы.In connection with the foregoing, determining the level of antibodies to the muscarinic M2 receptor is extremely important for the diagnosis of rhythm and cardiac conduction disorders in patients without signs of an organic disease of the cardiovascular system.
Из уровня техники известны синтезированные пептиды из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, соответствующие линейным участкам 171-182 и 168-192 данного белка, которые были использованы для изучения активности антител к мускариновому М2-рецептору ([9] - Elies R. et al. Immunochemical and functional characterization of an agonist-like monoclonal antibody against the M2 acetylcholine receptor. //Eur. J. Biochem. l998; 251:659-666). Также использовался для наработки антипептидных антител и скриннинга сывороток больных с различными сердечно-сосудистыми патологиями пептид, соответствующий последовательности 169-193 второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора ([8], [10] - Fu L.X. et al. Localization of a Functional Autoimmune Epitope on the Muscarinic Acetylcholine Receptor-2 in Patients with Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. // J. Clin.Invest. 1993; 91:1964-1968).Synthesized peptides from the second extracellular loop of the muscarinic M2 receptor corresponding to the linear sections 171-182 and 168-192 of this protein, which were used to study the activity of antibodies to the muscarinic M2 receptor ([9] - Elies R. et al Immunochemical and functional characterization of an agonist-like monoclonal antibody against the M2 acetylcholine receptor. // Eur. J. Biochem. L998; 251: 659-666). A peptide corresponding to the sequence 169-193 of the second extracellular loop of the muscarinic M2 receptor ([8], [10] Fu LX et al. Localization of a Functional Autoimmune Epitope was also used to generate antipeptide antibodies and screen sera of patients with various cardiovascular pathologies) on the Muscarinic Acetylcholine Receptor-2 in Patients with Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. // J. Clin. Invest. 1993; 91: 1964-1968).
Подробное исследование ИФА с использованием пептида, соответствующего последовательности 169-193 из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, дано в статье [8]. Показано, что в ИФА с использованием данного пептида антитела к мускариновому М2-рецептору были обнаружены у 40% пациентов с дилатационной кардиомиопатией и 23% пациентов с идиопатическими нарушениями ритма.A detailed study of ELISA using a peptide corresponding to sequence 169-193 from the second extracellular loop of the muscarinic M2 receptor is given in [8]. It was shown that in ELISA using this peptide antibodies to the muscarinic M2 receptor were found in 40% of patients with dilated cardiomyopathy and 23% of patients with idiopathic rhythm disturbances.
Таким образом, наиболее близким к заявляемому синтетическому антигену является индивидуальный пептид, соответствующий последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора [8, 10].Thus, the closest to the claimed synthetic antigen is an individual peptide corresponding to sequence 168-192 from the 2nd extracellular loop of the muscarinic M2 receptor [8, 10].
Недостатком используемого пептида является его ограниченная специфичность, так как с данным пептидом могут реагировать только аутоантитела, направленные к соответствующей этому пептиду антигенной детерминанте 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора. В то же время у больных с идиопатическими патологиями сердца аутоантитела могут быть направлены как к 1-й, так и ко 2-й петлям, а также к комплексу двух петель, сближенных в природной молекуле мускаринового М2-рецептора ([11]. - Johren К., Holtje H.-D. A model of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor.// J. Comp. - Aided Mol.Design. 2002; 16:795-801). Таким образом, ограниченная антигенная специфичность последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, в свою очередь, объясняет заниженную чувствительность (количество положительных ответов) ИФА крови больных с использованием данного пептида. Кроме того, данный пептид характеризуется плохой растворимостью в водных буферных системах, обусловленной присутствием кластера гидрофобных аминокислотных остатков, что также может отрицательно сказываться на чувствительности к данному пептиду.The disadvantage of the used peptide is its limited specificity, since only autoantibodies directed to the corresponding antigenic determinant of the 2nd extracellular loop of the muscarinic M2 receptor can react with this peptide. At the same time, in patients with idiopathic heart pathologies, autoantibodies can be directed both to the 1st and 2nd loops, as well as to the complex of two loops that are close in the natural molecule of the muscarinic M2 receptor ([11]. - Johren K., Holtje H.-D. A model of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor.// J. Comp. - Aided Mol.Design. 2002; 16: 795-801). Thus, the limited antigenic specificity of the 168-192 sequence from the 2nd extracellular loop of the muscarinic M2 receptor, in turn, explains the underestimated sensitivity (the number of positive responses) of the ELISA of the blood of patients using this peptide. In addition, this peptide is characterized by poor solubility in aqueous buffer systems due to the presence of a cluster of hydrophobic amino acid residues, which can also adversely affect the sensitivity to this peptide.
Задачей и техническим результатом изобретения является создание конформационного антигена, обладающего более высокой специфичностью к аутоантителам и лучшей растворимостью в водных буферных системах, а также способов диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма с использованием созданного антигена.The objective and technical result of the invention is the creation of a conformational antigen with higher specificity for autoantibodies and better solubility in aqueous buffer systems, as well as methods for diagnosing idiopathic heart rhythm disorders using the created antigen.
Изобретение поясняется диаграммой (фиг.1), на которой представлен уровень аутоантител у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы к антигенам мускаринового М2-рецептора.The invention is illustrated by a diagram (figure 1), which shows the level of autoantibodies in patients with impaired rhythm and conduction of the heart without signs of an organic disease of the cardiovascular system to antigens of the muscarinic M2 receptor.
Поставленная задача решается тем, что синтетический антиген, обладающий способностью связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору, включающий пептид, соответствующий аминокислотной последовательности из второй внеклеточной петли белка мускаринового М2-рецептора, согласно изобретению содержит пептид, соответствующий аминокислотной последовательности из первой внеклеточной петли белка мускаринового М2-рецептора, сшитый с пептидом второй внеклеточной петли дисульфидной связью. При этом линейная аминокислотная последовательность из первой петли белка содержит Cys96, а линейная аминокислотная последовательность из второй петли белка содержит Cys176. Наилучший результат достигается при использовании линейной аминокислотной последовательности из первой внеклеточной петли белка, содержащей фрагмент (83-98), и линейной аминокислотной последовательности из второй внеклеточной петли белка, содержащей фрагмент (171-182).The problem is solved in that a synthetic antigen with the ability to bind autoantibodies to the muscarinic M2 receptor, comprising a peptide corresponding to the amino acid sequence from the second extracellular loop of the muscarinic M2 receptor protein, according to the invention contains a peptide corresponding to the amino acid sequence from the first extracellular loop of the muscarinic M2 protein receptor crosslinked to the peptide of the second extracellular loop by a disulfide bond. In this case, the linear amino acid sequence from the first loop of the protein contains Cys 96 , and the linear amino acid sequence from the second loop of the protein contains Cys 176 . The best result is achieved by using a linear amino acid sequence from the first extracellular loop of the protein containing the fragment (83-98) and a linear amino acid sequence from the second extracellular loop of the protein containing the fragment (171-182).
Поставленная задача решается также созданием способа получения синтетического антигена, обладающего способностью связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору, включающего синтез пептидов из первой и второй внеклеточных петель белка мускаринового М2-рецептора, и сшивку синтезированных пептидов посредством реакции тиол-дисульфидного обмена. При этом реакцию тиол-дисульфидного обмена осуществляют взаимодействием тиола пептида последовательности 83-98 и S-пиридинсульфенильного производного пептида последовательности 171-182 в водно-органической среде при рН 8-8.5.The problem is also solved by creating a method for producing a synthetic antigen with the ability to bind autoantibodies to the muscarinic M2 receptor, including the synthesis of peptides from the first and second extracellular loops of the protein of the muscarinic M2 receptor, and the cross-linking of the synthesized peptides through a thiol disulfide exchange reaction. The thiol-disulfide exchange reaction is carried out by the interaction of the thiol of the peptide of sequence 83-98 and the S-pyridine sulfenyl derivative of the peptide of sequence 171-182 in an aqueous-organic medium at a pH of 8-8.5.
Поставленная задача решается также созданием набора для диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма, включающий указанный синтетический антиген и сорбент для нанесения антигена.The problem is also solved by creating a kit for the diagnosis of idiopathic heart rhythm disorders, including the specified synthetic antigen and sorbent for applying antigen.
Поставленная задача решается также разработкой способа диагностики идиопатических нарушений сердечного ритма, включающего исследование крови пациента с использованием указанного набора для диагностики методом ИФА.The problem is also solved by the development of a method for the diagnosis of idiopathic heart rhythm disturbances, including a study of the patient’s blood using the specified ELISA diagnostic kit.
Таким образом, поставленная задача решается за счет создания искусственного конформационного антигена, который включает в себя пептидные фрагменты из двух внеклеточных петель белка мускаринового М2-рецептора, сшитые дисульфидной связью, и который способен связывать аутоантитела к данному рецептору с чувствительностью, превышающей таковую для линейного прототипа или механической смеси данных линейных пептидных фрагментов. При этом синтетический антиген представляет собой индивидуальное химическое соединение, содержащее пептид, соответствующий последовательности 1-й внеклеточной петли и пептид из 2-й внеклеточной петли, соединенные дисульфидной связью между остатками Cys96 и Cys176.Thus, the problem is solved by creating an artificial conformational antigen, which includes peptide fragments from two extracellular loops of a protein of the muscarinic M2 receptor, crosslinked by a disulfide bond, and which is able to bind autoantibodies to this receptor with a sensitivity exceeding that for a linear prototype or a mechanical mixture of these linear peptide fragments. In this case, the synthetic antigen is an individual chemical compound containing a peptide corresponding to the sequence of the 1st extracellular loop and a peptide from the 2nd extracellular loop connected by a disulfide bond between residues Cys 96 and Cys 176 .
Заявляемый синтетический антиген может быть использован для создания диагностического набора для выявления антител к мускариновому М2-рецептору в крови пациентов с идиопатическими аритмиями методом ИФА, подробное описание которого представлено ниже. При этом в качестве сорбента может быть применен стандартный 96-луночный полистироловый планшет.The inventive synthetic antigen can be used to create a diagnostic kit for detecting antibodies to the muscarinic M2 receptor in the blood of patients with idiopathic arrhythmias by ELISA, a detailed description of which is presented below. Moreover, a standard 96-well polystyrene plate can be used as a sorbent.
Заявляемое техническое решение характеризуется неочевидностью, т.к. в ряду пептидов и их аналогов не существует четкой взаимосвязи между структурой и активностью, поэтому способность заявляемого синтетического антигена связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору не является очевидной. В случае линейных эпитопов, в частности прототипа, антигенность можно предсказать, используя компьютерные программы для анализа аминокислотной последовательности белка ([12] - Норр N., Woods К. Prediction of antigenic determinants from amino acid sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 72. 72. P.3824-3828). Для поиска конформационных антигенных эпитопов используют сложную и дорогостоящую технологическую методологию, сопряженную с синтезом, выделением и тестированием десятков полипептидов ([13] - Евстигнеева Р.П., Палькеева М.Е. Методы поиска антигенных детерминант для белков с известной первичной структурой// Биоорг. химия. 2000, 26(4):243-262). Заявляемый конформационный антиген получают методологически значительно более простым способом. Он представляет собой искусственную конструкцию, не являющуюся линейным эпитопом, включающую в себя 2 фрагмента мускаринового М2-рецептора (например, 83-98 и 171-182), далеко отстоящие друг от друга и соединенные в одну молекулу с помощью направленного замыкания дисульфидного мостика между фрагментами 83-98 и 171-182 мускаринового М2-рецептора. Дисульфидная связь в заявляемом антигене образована между остатками цистеина 96 и 176. По данным наших исследований, любые пептиды из данных петель, содержащие остатки Cys96 и Cys176, способны связывать антитела к мускариновому М2-рецептору, в той или иной степени воспроизводя свойства белка. Наиболее оптимальный результат был достигнут при выборе последовательности 83-98, соответствующей 1-й внеклеточной петле т.к., с одной стороны, данный фрагмент состоит из 16-ти аминокислотных остатков, и синтез его легко осуществим; а, с другой стороны, меньшая длина пептида сопряжена с его пониженной иммуногенностью. Выбор последовательности 171-182 из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, близкой к прототипу, обусловлен тем, что этот фрагмент лишен того кластера гидрофобных аминокислотных остатков, который есть в пептиде-прототипе, что повышает растворимость антигена в водных буферных системах, применяемых в тестах. В пользу такой оптимальной конструкции искусственного антигена говорит тот факт, что синтезированный конформационный антиген оказался значительно лучше растворим в водных буферных системах, чем пептид-прототип, практически нерастворимый в воде, и чем пептиды - составные части искусственного антигена.The claimed technical solution is characterized by non-obviousness, because in the series of peptides and their analogues there is no clear correlation between structure and activity, therefore, the ability of the claimed synthetic antigen to bind autoantibodies to the muscarinic M2 receptor is not obvious. In the case of linear epitopes, in particular the prototype, antigenicity can be predicted using computer programs for analysis of the amino acid sequence of the protein ([12] - Norr N., Woods K. Prediction of antigenic determinants from amino acid sequences // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1981. V. 72. 72. P.3824-3828). To search for conformational antigenic epitopes, a complex and expensive technological methodology is used, coupled with the synthesis, isolation and testing of dozens of polypeptides ([13] - Evstigneeva RP, Palkeeva ME, Methods for the search for antigenic determinants for proteins with a known primary structure // Bioorg Chemistry. 2000, 26 (4): 243-262). The inventive conformational antigen is obtained methodologically in a much simpler way. It is an artificial construct that is not a linear epitope, including 2 fragments of the muscarinic M2 receptor (for example, 83-98 and 171-182), far spaced from each other and connected into one molecule by the directional closure of the disulfide bridge between the fragments 83-98 and 171-182 muscarinic M2 receptor. A disulfide bond in the claimed antigen is formed between cysteine residues 96 and 176. According to our studies, any peptides from these loops containing Cys 96 and Cys 176 residues are capable of binding antibodies to the muscarinic M2 receptor, reproducing the properties of the protein to one degree or another. The most optimal result was achieved by choosing the sequence 83-98 corresponding to the 1st extracellular loop, because, on the one hand, this fragment consists of 16 amino acid residues, and its synthesis is easily feasible; and, on the other hand, the shorter length of the peptide is associated with its reduced immunogenicity. The choice of the sequence 171-182 from the second extracellular loop of the muscarinic M2 receptor, which is close to the prototype, is due to the fact that this fragment lacks the cluster of hydrophobic amino acid residues that is in the prototype peptide, which increases the solubility of the antigen in the aqueous buffer systems used in the tests . This optimal construction of an artificial antigen is supported by the fact that the synthesized conformational antigen was much better soluble in aqueous buffer systems than the prototype peptide, which is practically insoluble in water, and the peptides that are components of an artificial antigen.
Синтез пептидов последовательности 1-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (гексадекапептид) и последовательности 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (додекапептид), может быть осуществлен по стандартной технологии синтеза на твердой фазе ([14] - Barany G., Merrifild R.B. Solid phase synthesis.// The Peptide. Analysis, Synthesis, Biology. V 2. Special Methods in Peptide Synthesis. Part. A. // Ed. E. Gross, J. Meienhofer. - New York; Academic Press, 1980, P. 3-254) с использованием Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил) - методологии на полимере Ванга.The synthesis of peptides of the sequence of the 1st extracellular loop of the muscarinic M2 receptor (hexadecapeptide) and the sequence of the 2nd extracellular loop of the muscarinic M2 receptor (dodecapapeptide) can be carried out according to standard solid-phase synthesis technology ([14] - Barany G., Merrifild RB Solid phase synthesis. // The Peptide. Analysis, Synthesis, Biology.
Ниже представлено подробное описание синтеза пептидов последовательности 83-98 1-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора (гексадекапептид) и последовательности 171-182 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора. Для синтеза пептидов были использованы производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DIPEA (N-изопропил-N-этиламин), НОВТ (1-гидроксибензотриазол), TBTU (N, N, N', N'-тетраметил-O-(бензотриазол-1-ил) урония тетрафторборат), TIB S (триизобутилсилан) фирмы Fluka (Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, 4-метилпиперидин, метанол и трифторуксусную кислоту (Applied Biosystems, США). DMF (N,N-диметилформамид) очищали перегонкой над нингидрином и окисью бария. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутияъную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот, гидроксильных функций серина, треонина и тирозина; тритильную (Trt) группу для карбоксамидной функции глутамина и сульфгидрильной функции цистеина. Аминокислотную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная с С-конца, с использованием в качестве конденсирующего реагента TBTU с добавкой 1-гидроксибензотриазола в присутствии DIPEA.The following is a detailed description of the synthesis of peptides of the sequence 83-98 of the 1st extracellular loop of the muscarinic M2 receptor (hexadecapeptide) and the sequence 171-182 of the 2nd extracellular loop of the muscarinic M2 receptor. For the synthesis of peptides, L-amino acid derivatives of Bachem (Switzerland), DIPEA (N-isopropyl-N-ethylamine), HOBT (1-hydroxybenzotriazole), TBTU (N, N, N ', N'-tetramethyl-O- ( benzotriazol-1-yl) uronium tetrafluoroborate), TIB S (triisobutylsilane) from Fluka (Switzerland). For the synthesis, N-methylpyrrolidone, dichloromethane, 4-methylpiperidine, methanol and trifluoroacetic acid were used (Applied Biosystems, USA). DMF (N, N-dimethylformamide) was purified by distillation over ninhydrin and barium oxide. The following protections were used to block the functional groups of the amino acid side chains: tert-butyl for the carboxyl groups of aspartic and glutamic acids, the hydroxyl functions of serine, threonine, and tyrosine; trityl (Trt) group for the carboxamide function of glutamine and sulfhydryl function of cysteine. The amino acid chain was expanded by one amino acid, starting at the C-terminus, using TBTU with the addition of 1-hydroxybenzotriazole in the presence of DIPEA as a condensing reagent.
Синтез пептидов проводили с С-конца в соответствии с нижеприведенным протоколом твердофазного синтеза. Синтез проводили в ручном режиме, исходя из 0.6 ммоль Fmoc-аминоацилполимера (Bachem, Швейцария). Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой, с размером частиц 200-400 меш фирмы Bachem (Швейцария). В Таблице 1 представлен Протокол твердофазного синтеза пептидов с описанием последовательности реализуемых стадий.The synthesis of peptides was carried out from the C-end in accordance with the following solid-phase synthesis protocol. The synthesis was carried out in manual mode, starting from 0.6 mmol of the Fmoc aminoacylpolymer (Bachem, Switzerland). For solid-phase synthesis, a styrene copolymer with 1% divinylbenzene with a hydroxymethylphenoxymethyl anchor group, with a particle size of 200-400 mesh from Bachem (Switzerland) was used. Table 1 presents the Protocol of solid-phase synthesis of peptides with a description of the sequence of the implemented stages.
Отщепление и деблокирование пептидов осуществляли действием трифторуксусной кислоты со специальными добавками, предотвращающими побочные реакции. Линейные гексадекапептид и тридекапептид очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография) до 97-98% чистоты. Аналитическую ВЭЖХ проводили на проводили на хроматографах (Gilson, Франция) и Knauer (ФРГ). Препаративную ВЭЖХ проводили на приборе Applied Biosystems (Германия), пептиды детектировали при 226 нм. Пептиды элюировали градиентом концентрации ацетонитрила в 0.1% TFA (трифторуксусная кислота). Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил и изопропиловый спирт фирмы Раnrеас (Испания).The peptides were cleaved and released by trifluoroacetic acid with special additives that prevent side reactions. Linear hexadecapapeptide and tridecapeptide were purified using preparative HPLC (HPLC - high performance liquid chromatography) to 97-98% purity. Analytical HPLC was performed on chromatographs (Gilson, France) and Knauer (Germany). Preparative HPLC was performed on an Applied Biosystems instrument (Germany), peptides were detected at 226 nm. Peptides were eluted with a gradient of acetonitrile concentration in 0.1% TFA (trifluoroacetic acid). For HPLC, acetonitrile and isopropyl alcohol (Ranreas, Spain) were used.
Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонках Диасорб С16 (РФ) и Spherisorb ODS (США) (4,6×250 мм) с сорбентами С18 с размером пор порядка 100А - Nucleosil С18 и Kromasil 100-5 С18, на хроматографе фирмы Gilson (Франция). Для анализа синтетического антигена кроме этих сорбентов использовали Vydac С18 с размером пор 300А. В качестве элюентов использовали буфер А - 0,1% TFA, рН 2.0, буфер Б - 80% ацетонитрила или изопропанола в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А со скоростью потока 1 мл/мин.Analytical HPLC was performed on Diasorb C16 (RF) and Spherisorb ODS (USA) (4.6 × 250 mm) columns with C18 sorbents with pore sizes of the order of 100A — Nucleosil C18 and Kromasil 100-5 C18, on a Gilson chromatograph (France). For the analysis of synthetic antigen, in addition to these sorbents, Vydac C18 with a pore size of 300 A was used. Buffer A - 0.1% TFA, pH 2.0, buffer B - 80% acetonitrile or isopropanol in buffer A were used as eluents, elution with a concentration gradient of buffer B in buffer A at a flow rate of 1 ml / min.
Синтезированные пептиды характеризовали данными 1Н-ЯМР-спектроскопии (1Н-ЯМР- спектры снимали на спектрометре WH-500 Bruker 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d (d6 - дейтерированный диметилсульфоксид) при 300°К, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл, химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана) и масс-спектрометрии (масс-спектры регистрировали на приборе VISION 2000, Termobioanalysis corp., Finnigan, США).The synthesized peptides were characterized by 1 H-NMR spectroscopy ( 1 H-NMR spectra were recorded on a WH-500 Bruker 500 MHz spectrometer (Germany) in DMSO-d (d6 is deuterated dimethyl sulfoxide) at 300 ° K, the concentration of peptides was 2-3 mg / ml, chemical shifts were measured relative to tetramethylsilane) and mass spectrometry (mass spectra were recorded on a VISION 2000 instrument, Termobioanalysis corp., Finnigan, USA).
Синтез заявляемого синтетического антигена осуществляли с помощью реакции тиол-дисульфидного обмена между предшественниками - гексадекапептидом (83-98) и додекапептидом (171-182), взятыми в эквимолярном соотношении. При этом Cys176 додекапептида (171-182) защищали временной 2-пиридинсульфенильной (PyS) защитной группой ([15] - Andreu D., Albericio F., Sole N.A., Munson M.C., Ferrer M., Barany G. // Peptide Synthesis Protocol. Eds. M.W. Pennington, B.M. Dunn. New Jersey, Totowa: Humana Press Inc. 1994. P. 91-169; [16] - Сидорова M.В., Палькеева M.E., Молокоедов А.С, Азьмуко А.А., Секридова А.В., Овчинников М.В., Левашов П.А., Афанасьева О.И., Берестецкая Ю.В., Афанасьева М.И., Разова О.А., Беспалова Ж.Д., Покровский С.Н., Синтез и свойства нового конформационного антигена, моделирующего внеклеточную часть β1-адренорецептора // Биоорг. химия. 2009, 35 (3): 311-322), которая снимается при действии тиольной группы Cys96 гексадекапептида (83-98) с образованием дисульфида.The synthesis of the claimed synthetic antigen was carried out using the thiol disulfide exchange reaction between the precursors hexadecapeptide (83-98) and dodecapapeptide (171-182), taken in an equimolar ratio. Moreover, Cys 176 of the dodecapapeptide (171-182) was protected with a temporary 2-pyridine sulfenyl (PyS) protecting group ([15] - Andreu D., Albericio F., Sole NA, Munson MC, Ferrer M., Barany G. // Peptide Synthesis Protocol. Eds. MW Pennington, BM Dunn. New Jersey, Totowa: Humana Press Inc. 1994. P. 91-169; [16] - Sidorova M.V., Palkeeva ME, Molokoedov A.S., Azmuko A.A. , Sekridova A.V., Ovchinnikov M.V., Levashov P.A., Afanasyeva O.I., Berestetskaya Yu.V., Afanasyeva M.I., Razova O.A., Bespalova Zh.D., Pokrovsky S.N., Synthesis and properties of a new conformational antigen modeling the extracellular part of the β1-adrenergic receptor // Bioorg. Chemistry. 2009, 35 (3): 311-322), which is removed When the action of the thiol group of Cys 96 hexadecapeptides (83-98) to form a disulfide.
Реакция тиол-дисульфидного обмена, использованная для получения заявляемого синтетического антигена, ранее была предложена для замыкания внутримолекулярных дисульфидных связей в линейных пептидах в водных средах [15]. При синтезе заявляемого антигена данный способ был использован для сшивки разных пептидных фрагментов, удаленных друг от друга в белке, а также была проведена данная реакция в водно-органической среде при рН 8-8.5.The thiol-disulfide exchange reaction used to obtain the claimed synthetic antigen was previously proposed for the closure of intramolecular disulfide bonds in linear peptides in aqueous media [15]. In the synthesis of the claimed antigen, this method was used to cross-link different peptide fragments removed from each other in the protein, and this reaction was also carried out in an aqueous-organic medium at a pH of 8-8.5.
Сравнительный анализ биологической активности заявляемого синтетического антигена, пептида-прототипа последовательности 168-192 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора, а также пептидов - предшественников I и II, являющихся составными частями заявляемого синтетического антигена, проводили в одинаковых условиях унифицированным непрямым методом иммуноферментного анализа (ИФА) ([17] - Principles and practice of immunoassay, Sec. edition, ed. Price C.P., Newman D.J., London, Macmillan Reference Ltd, 1997), используя клинически охарактеризованную панель сывороток пациентов. Методика и условия постановки ИФА были аналогичны описанным в литературе [8-10]. Антиген-пептид сорбировали на твердую фазу - полистироловый планшет для ИФА. Аутоантитела, содержащиеся в исследуемой сыворотке крови, после взаимодействия с антигеном на твердой фазе определяли с помощью моноклональных антител к иммуноглобулинам человека, ковалентно меченых ферментом-пероксидазой из хрена. Ферментативная активность, определяемая в колориметрической реакции пероксидазы с хромогеном, была прямо пропорциональна концентрации определяемых антител. Ниже, в Примере 4, представлено подробное описание иммуноферментного анализа связывания заявляемых пептидных синтетических антигенов с аутоантителами к мускариновому-М2 рецептору и полученных результатов сравнительного анализа биологической активности заявляемого синтетического антигена и пептида-прототипа.A comparative analysis of the biological activity of the claimed synthetic antigen, the prototype peptide of sequence 168-192 from the 2nd extracellular loop of the muscarinic M2 receptor, as well as the precursors of the precursors I and II, which are components of the claimed synthetic antigen, was carried out under identical conditions using a unified indirect enzyme immunoassay Assay (ELISA) ([17] - Principles and practice of immunoassay, Sec. edition, ed. Price CP, Newman DJ, London, Macmillan Reference Ltd, 1997) using a clinically characterized panel of patient sera. The methodology and conditions for the production of ELISA were similar to those described in the literature [8-10]. The antigen-peptide was sorbed onto the solid phase, a polystyrene ELISA plate. The autoantibodies contained in the test blood serum after interaction with the antigen on the solid phase were determined using monoclonal antibodies to human immunoglobulins covalently labeled with horseradish peroxidase enzyme. The enzymatic activity, determined in the colorimetric reaction of peroxidase with a chromogen, was directly proportional to the concentration of the determined antibodies. Example 4 below provides a detailed description of an enzyme-linked immunosorbent assay for the binding of the claimed peptide synthetic antigens to autoantibodies to the muscarinic M2 receptor and the results of a comparative analysis of the biological activity of the claimed synthetic antigen and the prototype peptide.
Изобретение поясняется следующими примерами:The invention is illustrated by the following examples:
Пример 1. Синтез додекапептида последовательности 83-98 из 1-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (предшественник I).Example 1. Synthesis of the dodecapide sequence 83-98 from the 1st extracellular loop of the muscarinic M2 receptor H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp -Leu-OH (precursor I).
Твердофазный синтез H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (предшественник I) проводили, исходя из 1.0 г Fmoc-Leu-полимера, содержащего 0.75 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом.Solid-phase synthesis of H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (precursor I) was carried out starting from 1.0 g of Fmoc-Leu a polymer containing 0.75 mmol of the starting amino acid, in accordance with the above standard protocol.
Заключительное деблокирование и отщепление гексадекапептида (I) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего гексадекапептидилполимера смесью 20 мл TFA, 0.5 мл Н2O, 0.5 мл TIBS и 0.5 мл 2-меркаптоэтанола в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой холодный эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0.65 г сырого продукта (I), содержащего, по данным ВЭЖХ, 54% целевого пептида.The final release and cleavage of hexadecapeptide (I) from the polymer was carried out in one step by treating the corresponding hexadecapeptidyl polymer with a mixture of 20 ml of TFA, 0.5 ml of H 2 O, 0.5 ml of TIBS and 0.5 ml of 2-mercaptoethanol for 2 hours. Then the polymer was filtered off, washed with 2 × 2 ml of deblocking mixture, the filtrate was evaporated and dry cold ether was added to the residue. The precipitate was filtered off, washed with dichloromethane (3 × 3 ml), ether (3 × 5 ml), and dried in a vacuum desiccator. Received 0.65 g of crude product (I) containing, according to HPLC, 54% of the target peptide.
Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Applied Biosystems (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизировали. В итоге получено 0.25 г (21% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (I). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 98%. Аминокислотный состав по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии: Туг 2, Thr 1, Не 1, Val 3, Gly 2, Pro 2, Leu 2, Asp 1, Trp 1, Cys 1. Масс-спектр: m/z: 1794.5 [M+H]+, вычислено 1795.7, для C87H127N17O22S1.The peptide was purified using preparative HPLC on an Applied Biosystems instrument (USA) using a 130T Diasorb-C16 column (25 × 250 mm),
Пример 2. Синтез додекапептида последовательности 171-182 из 2-й внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора H-Val121-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys176(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser182-OH (предшественник IIPys).Example 2. Synthesis of dodecapide sequence 171-182 from the 2nd extracellular loop of the muscarinic M2 receptor H-Val 121 -Glu-Asp-Gly-Glu-Cys 176 (PyS) -Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser 182 -OH (precursor II Pys ).
Стадия 1. Твердофазный синтез H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник II) проводили, исходя из 1.0 г Fmос-Sеr(Вut)-полимера, содержащего 0.6 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом.
Заключительное деблокирование и отщепление додекапептида (II) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего гексадекапептидилполимера смесью 20 мл TFA, 0.5 мл Н2О, 0.5 мл TIBS в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой холодный эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0.63 г сырого продукта (II), содержащего, по данным ВЭЖХ, 82% целевого пептида.The final release and cleavage of dodecapapeptide (II) from the polymer was carried out in a single step by treating the corresponding hexadecapeptidyl polymer with a mixture of 20 ml of TFA, 0.5 ml of H2O, 0.5 ml of TIBS for 2 hours, then the polymer was filtered off, washed with 2 × 2 ml of the deblocking mixture, the filtrate was evaporated and dry cold ether was added to the residue. The precipitate was filtered off, washed with dichloromethane (3 × 3 ml), ether (3 × 5 ml), and dried in a vacuum desiccator. Received 0.63 g of crude product (II) containing, according to HPLC, 82% of the target peptide.
Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Applied Biosystems (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизировали. В итоге получено 0.22 г (24.9% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (II). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 95%. Аминокислотный состав по данным 1Н-ЯМР-спектроскопии: Val 1, Glu 2, Asp 1, Gly 1, Cys 1, Туr 1, He 1, Gin 1, Phe 2, Ser 1. Масс-спектр: m/z 1436.4, 1474.3 [M+K]+, вычислено 1436.6 для C65H89N13O22S.The peptide was purified using preparative HPLC on an Applied Biosystems instrument (USA) using a 130T Diasorb-C16 column (25 × 250 mm),
Стадия 2. Получение додекапептида H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник IIPyS).
К раствору 0.02 г (0.016 ммоль) додекапептида H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (II) в 8 мл смеси ацетонитрила и 0.1% водного раствора трифторуксусной кислоты (8:2) прибавляли раствор 10 мг (Pys)2 в 2 мл ацетонитрила и выдерживали 16 ч при 20°С. Исчезновение исходного пептида контролировали с помощью аналитической ВЭЖХ на колонке Kromasil 4.6×250 мм, размер зерна сорбента 5 мкм; подвижная фаза - буфер А: 0.1% TFA, буфер Б: 80% ацетонитрил в буфере А; пептиды элюировали градиентом Б в А от 30 до 90% за 30 мин со скоростью 1 мл/мин, детекция при 226 нм. Время удерживания (I) - 13.56 мин, время удерживания (IIPyS) - 14.21 мин). Реакционную смесь упаривали досуха, для удаления избытка (PyS)2 и пиридин-тиола (контроль ВЭЖХ), остаток несколько раз растирали с сухим эфиром, эфир декантировали. Полученный продукт хроматографировали на колонке с колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS, 10×250 мм, в условиях, описанных для стадии 1. Получено 0.015 г Н-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (предшественник IIPyS) с чистотой 98%.To a solution of 0.02 g (0.016 mmol) of the dodecapapeptide H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (II) in 8 ml of a mixture of acetonitrile and 0.1% aqueous trifluoroacetic solution acid (8: 2) was added a solution of 10 mg (Pys) 2 in 2 ml of acetonitrile and incubated for 16 hours at 20 ° C. The disappearance of the original peptide was monitored by analytical HPLC on a Kromasil column 4.6 × 250 mm, sorbent grain size 5 μm; mobile phase - buffer A: 0.1% TFA, buffer B: 80% acetonitrile in buffer A; peptides were eluted with a gradient of B in A from 30 to 90% for 30 min at a rate of 1 ml / min, detection at 226 nm. Retention time (I) - 13.56 min, retention time (II PyS ) - 14.21 min). The reaction mixture was evaporated to dryness to remove excess (PyS) 2 and pyridine-thiol (HPLC control), the residue was triturated several times with dry ether, the ether was decanted. The resulting product was chromatographed on a Spherisorb ODS reverse phase column column, 10 × 250 mm, under the conditions described for
Пример 3. Синтетический антиген, включающий в себя гексадекапептид (83-98) и додекапептид (171-182) из последовательности мускаринового М2-рецептора, соединенные дисульфидной связью.Example 3. A synthetic antigen comprising a hexadecapeptide (83-98) and a dodecapapeptide (171-182) from the sequence of a muscarinic M2 receptor connected by a disulfide bond.
К раствору 0.015 г додекапептида H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys(PyS)-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (IIPyS) 2.5 мл смеси 0.1 М ацетата аммония рН 6.8 и изопропилового спирта (4:1) прибавляли раствор 0.015 г гексадекапептида H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (I) в 4 мл смеси того же буфера и спирта (1:1), доводили рН до 8-8.5 раствором гидроокиси аммония и выдерживали при 20°С 5-8 ч. Для контроля происходящих превращений использовали тест на свободную SH-группу с реактивом Эллмана и аналитическую ВЭЖХ.To a solution of 0.015 g of dodecapapeptide H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys (PyS) -Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-OH (II PyS ) 2.5 ml of a mixture of 0.1 M ammonium acetate pH 6.8 and isopropyl alcohol (4: 1) was added a solution of 0.015 g of the hexadecapeptide H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH (I) in A 4 ml mixture of the same buffer and alcohol (1: 1) was adjusted to pH 8–8.5 with ammonium hydroxide solution and kept at 20 ° С for 5–8 h. To control the occurring transformations, we used the free SH group test with Ellman’s reagent and analytical HPLC
По окончании реакции рН реакционной смеси доводили до 4 уксусной кислотой, спирт упаривали, остаток хроматографировали на колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS, 10×250 мм, размер зерна сорбента - 10 мкм, подвижная фаза: буфер А - 0.1М NH4OAc, рН 6.8, буфер Б - 40% водный изопропиловый спирт. Целевой продукт элюировали градиентом буфера Б в буфере А от 0 до 30% за 10 мин, далее от 30 до 90% за 60 мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, собирали, спирт упаривали, остаток лиофилизировали. Получено 0.01 мг (37.3%) синтетического антигена. Масс-спектр, m/z: 3228.5 [М+Н+]. Вычислено 3228.8 для C152H216N30O44S2.At the end of the reaction, the pH of the reaction mixture was adjusted to 4 with acetic acid, the alcohol was evaporated, the residue was chromatographed on a Spherisorb ODS reverse phase column, 10 × 250 mm, sorbent grain size, 10 μm, mobile phase: buffer A, 0.1 M NH 4 OAc, pH 6.8, buffer B - 40% aqueous isopropyl alcohol. The target product was eluted with a gradient of buffer B in buffer A from 0 to 30% in 10 minutes, then from 30 to 90% in 60 minutes. The fractions corresponding to the target product were collected, the alcohol was evaporated, and the residue was lyophilized. Received 0.01 mg (37.3%) of the synthetic antigen. Mass spectrum, m / z: 3228.5 [M + H + ]. 3228.8 calculated for C 152 H 216 N 30 O 44 S 2 .
Пример 4. Описание методики проведения иммуноферментного анализа пептидных антигенов.Example 4. Description of the methodology for enzyme immunoassay of peptide antigens.
Перед проведением анализа выдерживали компоненты набора при комнатной температуре (18-25°С) не менее 30 мин.Before analysis, the components of the kit were kept at room temperature (18-25 ° C) for at least 30 minutes.
1. Для иммобилизации пептидных антигенов на планшетах для проведения ИФА пептид растворяли в концентрации 2 мМ в КББР (0,05 М Na-карбонат-бикарбонатный буфер с рН 9,6). Вносили в лунки планшетов по 100 мкл раствора пептида и инкубировали 16-20 часов при +20-25°С.1. To immobilize peptide antigens on ELISA plates, the peptide was dissolved at a concentration of 2 mM in CBD (0.05 M Na-carbonate-bicarbonate buffer with a pH of 9.6). 100 μl of the peptide solution was added to the wells of the plates and incubated for 16-20 hours at + 20-25 ° C.
Для удаления несвязанных антигенов и блокирования неспецифических реакций лунки планшета промывали ФСБ-Т (0,01М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl и 0,1% Твин-20) с БСА (бычьим сывороточным альбумином) в концентрации 5 г/л.To remove unbound antigens and block non-specific reactions, the plate wells were washed with FSB-T (0.01 M Na-phosphate buffer pH 7.2, containing 0.15 M NaCl and 0.1% Tween-20) with BSA (bovine serum albumin) in concentration of 5 g / l.
3. Вносили пипеткой во все лунки планшета по 80 мкл буферного раствора для разведения образцов.3.
4. Вносили пипеткой в соответствующие лунки по 20 мкл подготовленных образцов. Закрывали планшет крышкой и инкубировали его в термостате при температуре 37°С в течение 60±2 мин.4.
5. Промывали планшет раствором для отмывки с помощью устройства для отмывки планшета не менее 4-х раз.5. The tablet was washed with a washing solution with a device for washing the tablet at least 4 times.
6. Вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора коньюгата, индивидуально подобранного для каждого антигена.6. Add 100 μl of the conjugate working solution individually selected for each antigen to the wells.
7. Закрывали планшет крышкой и инкубировали его в термостате при температуре 37°С в течение 30±2 мин.7. Cover the plate with a lid and incubate it in an incubator at a temperature of 37 ° C for 30 ± 2 min.
8. Промывали планшет раствором для отмывки с помощью устройства для отмывки планшета не менее 4-х раз.8. The tablet was washed with a washing solution with a device for washing the tablet at least 4 times.
9. Вносили в лунки по 100 мкл свежеприготовленной субстратной смеси. Субстратная смесь готовилась непосредственно перед внесением в лунки. К 7 объемам субстратного буферного раствора добавляли 1 объем раствора ТМБ (тетраметилбензидина), тщательно перемешивали полученную смесь. Данный раствор хранили при комнатной температуре не более 5 мин.9. 100 μl of freshly prepared substrate mixture was added to the wells. The substrate mixture was prepared immediately before entering into the wells. To 7 volumes of substrate buffer solution was added 1 volume of TMB (tetramethylbenzidine) solution, the resulting mixture was thoroughly mixed. This solution was stored at room temperature for no more than 5 minutes.
10. Закрывали планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре без перемешивания в течение 20±1 мин.10. Cover the plate with a lid and incubate at room temperature without stirring for 20 ± 1 min.
11. Вносили в лунки по 100 мкл стоп-реагента в той же последовательности и тем же методом, каким вносили субстратную смесь.11. 100 μl of stop reagent were added to the wells in the same sequence and by the same method as the substrate mixture.
12. В течение 5 мин после добавления стоп-реагента просчитывали планшет на фотометре для ИФА при длине волны 450 нм.12. Within 5 minutes after adding the stop reagent, the plate was counted on an ELISA photometer at a wavelength of 450 nm.
Положительными образцами считались образцы, оптическая плотность (ОПкрит.) которых была равна или более суммы среднего значения оптической плотности плюс удвоенное значение стандартного отклонения по выборке с исключенными значениями, выходящими за рамки нормального распределения:Positive samples were samples whose optical density (OD crit ) was equal to or more than the sum of the average optical density plus doubled standard deviation for the sample with excluded values that go beyond the normal distribution:
ОПкрит=ОПcред+2×станд. отклOD crit = OD med + 2 × std. off
Уровень аутоантител представлен в результатах как отношение оптической плотности (ОП) А450 иммуноферментной реакции исследуемого образца к ОПкрит.The level of autoantibodies is presented in the results as the ratio of optical density (OD) A 450 of the enzyme immunoassay of the test sample to OD crit .
Далее представлено описание способа выявления аутоантител к мускариновому рецептору.The following is a description of a method for detecting muscarinic receptor autoantibodies.
Для доказательства способности синтетического антигена, не являющегося линейным эпитопом, как описанный прототип, связывать аутоантитела к мускариновому М2-рецептору было проведено определение уровня аутоантител IgG и IgM классов на большой панели больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Результаты чувствительности ИФА для определения аутоантител представлены в таблице 2.To prove the ability of a synthetic antigen that is not a linear epitope, such as the described prototype, to bind autoantibodies to the muscarinic M2 receptor, the level of IgG and IgM autoantibodies was determined on a large panel of patients with cardiovascular diseases. The sensitivity results of ELISA for determining autoantibodies are presented in table 2.
Представленные результаты показывают, что чувствительность ИФА с использованием в качестве антигена синтетического пептида, включающего в себя предшественники I и II, сшитые дисульфидной связью, достоверно выше (вероятность F-тест *р<0,05), чем в случае использования линейного пептида с последовательностью 168-192 (прототипа). Это различие показано как для аутоантител IgG класса, так и для аутоантител IgM класса.The presented results show that the sensitivity of ELISA using a synthetic peptide as antigen, including the precursors I and II, crosslinked by a disulfide bond, is significantly higher (probability of F-test * p <0.05) than in the case of using a linear peptide with the sequence 168-192 (prototype). This difference is shown for both IgG class autoantibodies and IgM class autoantibodies.
Литературные данные [8-10] свидетельствуют о возможности применения пептидов, соответствующих последовательностям 168-192 (прототип) и 169-193 из второй внеклеточной петли мускаринового М2-рецептора для диагностики повышения уровня аутоантител к мускариновому М2-рецептору у больных кардиомиопатией, патологией с выраженными органическими поражениями. Об этом же свидетельствуют результаты собственных исследований авторов, приведенные в таблице 2. Однако важно было сравнение специфичности заявляемого синтетического антигена с описанным в литературе пептидом последовательности 168-192 (прототипом) для определения уровня антител IgG-класса к мускариновому М2-рецептору у больных с аритмиями без признаков органического заболевания сердца. Сравнительный анализ биологической активности прототипа и заявляемого синтетического антигена проводили в унифицированных условиях. Результаты представлены в таблице 3.Literature data [8-10] indicate the possibility of using peptides corresponding to sequences 168-192 (prototype) and 169-193 from the second extracellular loop of the muscarinic M2 receptor for diagnosing an increase in the level of autoantibodies to the muscarinic M2 receptor in patients with cardiomyopathy, pathology with severe organic lesions. This is also evidenced by the results of our own studies of the authors, shown in table 2. However, it was important to compare the specificity of the claimed synthetic antigen with the sequence peptide 168-192 (prototype) described in the literature for determining the level of IgG class antibodies to muscarinic M2 receptor in patients with arrhythmias without signs of organic heart disease. A comparative analysis of the biological activity of the prototype and the claimed synthetic antigen was carried out under standardized conditions. The results are presented in table 3.
Как видно из приведенных результатов, заявляемый синтетический антиген, включающий в себя пептиды-предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью, позволяет обнаружить достоверно (вероятность F-тест *р<0,05) большее число пациентов с повышенным уровнем аутоантител по сравнению с пептидом последовательности 168-192 из 2-й петли мускаринового М2-рецептора (прототипом).As can be seen from the above results, the claimed synthetic antigen, which includes the precursor peptides I and II, connected by a disulfide bond, allows to detect significantly (probability of F-test * p <0.05) a greater number of patients with an increased level of autoantibodies compared to the peptide sequences 168-192 from the 2nd loop of the muscarinic M2 receptor (prototype).
При этом заявляемый антиген более специфичен при определении аутоантител к фрагментам мускаринового М2-рецептора у больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердца, чем у больных с установленными сердечно-сосудистыми заболеваниями, поскольку позволяет с большой долей достоверности (вероятность F-тест р<0,001) определять большее число пациентов с повышенным уровнем аутоантител - 25,4% против 9% (таблица 2).Moreover, the claimed antigen is more specific in determining autoantibodies to fragments of the muscarinic M2 receptor in patients with cardiac arrhythmias and cardiac conduction disorders without signs of organic heart disease than in patients with established cardiovascular diseases, since it allows a high degree of certainty (probability F-test p <0.001) to determine a larger number of patients with an increased level of autoantibodies - 25.4% versus 9% (table 2).
Прямым подтверждением влияния структурных особенностей заявляемого антигена на способность к связыванию аутоантител является следующий модельный эксперимент. В описанном ИФА методе на планшет сорбировали: 1) пептид-предшественник I, 2) пептид-предшественник II 3) механическую смесь пептидов-предшественников I и II, 4) заявляемый антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью. Для сорбции антигены брали в концентрации 2 мМ, в механической смеси пептидов I и II брали по 1 мМ каждого пептида. Уровень IgG аутоантител определяли у 16 больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы. Результаты эксперимента представлены на диаграмме (фиг.1). На диаграмме представлены следующие обозначения: 1 - предшественник I, 2 - предшественник II, 3 - механическая смесь предшественников I и II, 4 - заявляемый антиген, включающий в себя предшественники I и II, соединенные дисульфидной связью, р* - вероятность сходства с заявляемым пептидом по F-тесту.The following model experiment is a direct confirmation of the influence of the structural features of the claimed antigen on the ability to bind autoantibodies. In the described ELISA method, the following were adsorbed onto the plate: 1) the precursor peptide I, 2) the precursor peptide II 3) a mechanical mixture of the precursor peptides I and II, 4) the inventive antigen comprising the precursors I and II connected by a disulfide bond. For sorption, antigens were taken at a concentration of 2 mM; in the mechanical mixture of peptides I and II, 1 mM of each peptide was taken. The level of IgG autoantibodies was determined in 16 patients with impaired rhythm and conduction of the heart without signs of an organic disease of the cardiovascular system. The results of the experiment are presented in the diagram (figure 1). The following notation is presented on the diagram: 1 - precursor I, 2 - precursor II, 3 - mechanical mixture of precursors I and II, 4 - claimed antigen, including precursors I and II connected by a disulfide bond, p * - probability of similarity with the claimed peptide according to the F-test.
Таким образом, модельный эксперимент наглядно подтверждает, что заявляемый антиген обладает принципиально иными функциональными свойствами, нежели механическая смесь его составных структур, что подтверждает предположение о том, что антитела более специфичны к конформационным эпитопам, образованным линейными эпитопами, сближенными в молекуле белка благодаря дисульфидной связи. Кроме того, лучшая по сравнению с прототипом растворимость заявляемого синтетического антигена позволяет использовать его для создания более точных диагностических наборов для обнаружения аутоантител к мускариновому М2-рецептору в крови больных с нарушениями ритма и проводимости сердца без признаков органического заболевания сердечно-сосудистой системы. Заявляемый синтетический антиген может быть использован для ранней диагностики сердечно-сосудистых заболеваний.Thus, the model experiment clearly confirms that the claimed antigen has fundamentally different functional properties than the mechanical mixture of its composite structures, which confirms the assumption that antibodies are more specific for conformational epitopes formed by linear epitopes that are close in the protein molecule due to the disulfide bond. In addition, the better solubility of the claimed synthetic antigen in comparison with the prototype allows it to be used to create more accurate diagnostic kits for detecting muscarinic M2 receptor autoantibodies in the blood of patients with cardiac arrhythmias and cardiac conduction without signs of an organic disease of the cardiovascular system. The inventive synthetic antigen can be used for early diagnosis of cardiovascular disease.
Claims (5)
сшивку последнего с пептидом I, взятым в эквимолярном количестве, посредством реакции тиол-дисульфидного обмена.2. The method of producing the synthetic antigen according to claim 1, having the ability to bind autoantibodies to the muscarinic M2 receptor, including solid-phase synthesis of peptides: I - H-Tyr-Thr-Val-Ile-Gly-Tyr-Trp-Pro-Leu-Gly- Pro-Val-Val-Cys-Asp-Leu-OH) (83-98) from the first and II - H-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser- OH (171-182) from the second extracellular loops of the protein of the muscarinic M2 receptor, obtaining the S-pyridine sulfenyl derivative of the peptide
crosslinking the latter with peptide I, taken in an equimolar amount, through a thiol disulfide exchange reaction.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012133212/10A RU2502743C1 (en) | 2012-08-03 | 2012-08-03 | Synthetic antigen having ability to fix autoantibodies to muscarine m2-receptor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012133212/10A RU2502743C1 (en) | 2012-08-03 | 2012-08-03 | Synthetic antigen having ability to fix autoantibodies to muscarine m2-receptor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2502743C1 true RU2502743C1 (en) | 2013-12-27 |
Family
ID=49817695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012133212/10A RU2502743C1 (en) | 2012-08-03 | 2012-08-03 | Synthetic antigen having ability to fix autoantibodies to muscarine m2-receptor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2502743C1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2195275C1 (en) * | 2001-04-09 | 2002-12-27 | Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра СО РАН | Anti-arrhythmic agent |
| US20040120946A1 (en) * | 2000-04-07 | 2004-06-24 | Eiji Ogino | Adsorbents for dilated cardiomyopathy |
| JP2008133297A (en) * | 2000-04-28 | 2008-06-12 | Acadia Pharmaceuticals Inc | Muscarinic agonist |
| CN101215564A (en) * | 2003-11-07 | 2008-07-09 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | M2-vagusstoff receptor mutation gene of dilatant cardiomyopathy patient |
| US20120157491A1 (en) * | 2004-04-27 | 2012-06-21 | Glaxo Group Limited | Muscarinic acetylcholine receptor antagonists |
-
2012
- 2012-08-03 RU RU2012133212/10A patent/RU2502743C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040120946A1 (en) * | 2000-04-07 | 2004-06-24 | Eiji Ogino | Adsorbents for dilated cardiomyopathy |
| JP2008133297A (en) * | 2000-04-28 | 2008-06-12 | Acadia Pharmaceuticals Inc | Muscarinic agonist |
| RU2195275C1 (en) * | 2001-04-09 | 2002-12-27 | Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра СО РАН | Anti-arrhythmic agent |
| CN101215564A (en) * | 2003-11-07 | 2008-07-09 | 首都医科大学附属北京朝阳医院 | M2-vagusstoff receptor mutation gene of dilatant cardiomyopathy patient |
| US20120157491A1 (en) * | 2004-04-27 | 2012-06-21 | Glaxo Group Limited | Muscarinic acetylcholine receptor antagonists |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5372380B2 (en) | Binding compounds, immunogenic compounds and peptidomimetics | |
| KR102404285B1 (en) | Assays for igfbp7 having improved performance in biological samples | |
| JP2014506883A (en) | PSA scavenger, composition, method and production thereof | |
| CN104987366B (en) | A kind of rheumatoid arthritis autoantibody combination antigen and its application | |
| KR20080003325A (en) | Antibody directed against gastrin-releasing peptide precursor and use thereof | |
| CN106556592B (en) | The chemical luminescence reagent kit and preparation method thereof of quantitative detection people TK1 | |
| KR101589285B1 (en) | Paralemmin as a marker of cardiovascular disorders and cardiovascular disorders diagnostic kit using thereof | |
| RU2502743C1 (en) | Synthetic antigen having ability to fix autoantibodies to muscarine m2-receptor | |
| CN112457392A (en) | Soluble ST2 protein antigenic determinant polypeptide and application thereof | |
| JP6276992B2 (en) | Molecular markers for early detection of pleural mesothelioma patients and their expression analysis methods | |
| CN100402551C (en) | Antigen epitope of beta2-microglobulin and its application | |
| CN114957438B (en) | Human Abeta 1-42 epitope polypeptide for detecting Alzheimer disease and preparation method thereof | |
| KR20130132430A (en) | Moesin fragments associated with aplastic anemia | |
| CN114989313B (en) | P-tau181 epitope peptide and application thereof in Alzheimer disease detection | |
| CN108929374A (en) | People HBP epitope peptide, antigen, antibody, application and kit | |
| CN107446040B (en) | Human ST2 epitope peptide, antigen, antibody, kit and application | |
| JP5453667B2 (en) | Arteriosclerosis detection method and arteriosclerosis marker | |
| EP2859354B1 (en) | Nitrated cardiac troponin i as a biomarker of cardiac ischemia | |
| EP2187216B1 (en) | Novel liver cancer marker | |
| RU2356576C1 (en) | SYNTHETIC ANTIGEN ABILITY TO BIND β1-ADRENORECEPTOR AUTOANTIBODIES | |
| WO2014073708A1 (en) | Novel peptide and use thereof | |
| Palkeeva et al. | Synthetic conformational antigen which simulates the extracellular part of the M2-muscarinic receptor: Interaction with blood sera of patients suffering from idiopathic arrhythmias | |
| CN110412295B (en) | PTEN Nedd8 modified breast cancer novel marker and invention and application of specific antibody thereof | |
| WO2023108897A1 (en) | Polypeptide for preparing onecut3 antibody, and rabbit polyclonal antibody and application thereof | |
| CN114316042A (en) | cTnI protein antigenic determinant polypeptide and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20140411 |