KR101589285B1 - Paralemmin as a marker of cardiovascular disorders and cardiovascular disorders diagnostic kit using thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 심혈관 질환에 특이적인 진단 마커에 관한 것으로서, 심혈관 질환 환자의 조직 또는 혈청에서 특이적으로 발현이 증가하는 파랄레민(paralemmin) 및 이를 이용한 심혈관 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
The present invention relates to a diagnostic marker specific for cardiovascular diseases, and relates to paralemmin and a kit for diagnosing cardiovascular disease using the same, wherein the expression of the compound is specifically increased in tissues or serum of a cardiovascular disease patient.
심혈관계 질환은 전세계적으로 가장 많은 사망 원인 질환이며 세계보건기구에 의하면 앞으로도 세계에서 가장 많은 사망 원인을 제공하는 질환으로 남아 있을 것으로 예상된다. 2005년도에 심혈관계로 사망한 인구는 1750만 명인데, 이는 전세계 사망자수의 30%에 해당한다. 이들 사망자들 중, 760만 명은 심장마비로 사망하였고 57만명은 뇌졸중으로 사망하였다. 적절한 조치가 취하여지지 않을 경우, 2015년까지 매년 2천만 명이 심혈관계 질환, 그 중에서도 주로 심장마비와 뇌졸중으로 사망할 것으로 추산된다. 심혈관계 질환은 심장과 혈관의 장애에 기인하며 특히 관상 심장 질환 (심장마비), 관상 동맥 질환, 혈압 상승(고혈압), 말초 동맥 질환, 류마티스성 심장 질환, 선천성 심장병 및 심부전이 이에 포함된다. 심혈관 질환 중에 중요한 부분을 차지하는 관상동맥질환은 대개 동맥경화에 의해서 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이 막히거나 좁아져서 발생한다. 동맥경화에 의해 관상동맥이 완전히 막혀 심장 근육조직이 죽게 되는 질병이 심근경색증이고, 관상동맥이 좁아져서 흉부압박감 또는 흉통을 느끼는 것은 협심증이라고 한다.Cardiovascular disease is the most common cause of death worldwide, and according to the World Health Organization, it is expected to remain the leading cause of death in the world. In 2005, 17.5 million people died from cardiovascular deaths, accounting for 30% of the global death toll. Among these deaths, 7.6 million died from a heart attack, and 570,000 died from a stroke. Unless appropriate action is taken, it is estimated that by 2015, 20 million people die each year of cardiovascular disease, mainly heart attacks and strokes. Cardiovascular diseases are caused by disorders of the heart and blood vessels, particularly those involving coronary heart disease (heart attack), coronary artery disease, hypertension (hypertension), peripheral arterial disease, rheumatic heart disease, congenital heart disease and heart failure. Coronary artery disease, which is an important part of cardiovascular disease, is usually caused by clogging or narrowing of the coronary arteries supplying blood to the heart by atherosclerosis. Myocardial infarction is the disease in which the coronary artery is completely blocked by arteriosclerosis and the cardiac muscle tissue is killed, and the coronary artery is narrowed to feel chest tightness or chest pain.
심혈관 질환이 발전될 위험이 있는 개인을 확인하는 것은 상기 질환을 더욱 효과적으로 예방하거나 치료하기 위한 중요한 전략이다. 종래 심혈관 질환은 어느 정도 진행되어야 물리적인 방법을 사용하여 진단할 수 있어 조기에 진단 혹은 예측하는데 한계가 있었다. 통상 심혈관 질환의 경우 조영 장비를 이용하여 심장 내부 및 관상동맥을 X-선 및 초음파 촬영하여 진단을 하고 있으나, 이는 발병 후에나 진단이 가능하다. 또한, 혈액 샘플로부터 측정할 수 있는 심혈관 질병을 예견하는 몇몇 위험인자, 예를 들어 LDL 및 HDL 콜레스테롤 수치와 관련된 인자가 현재 임상적으로 사용되고 있으나, 죽상경화증을 앓는 많은 환자들은 이러한 위험 인자를 갖고 있지 않다. 더욱이, 심혈관 질병은 이러한 위험 인자가 나타나지 않은 많은 개인에서조차 발생하므로, 심혈관 질병을 경험할 위험이 낮은 개인에게도 고려된다. 따라서, 환자에서 심혈관 질환이 발전될 위험을 탐지하는 방법에 대한 요구는 끊임없이 존재해 왔다.Identifying individuals at risk of developing cardiovascular disease is an important strategy for more effectively preventing or treating the disease. Conventional cardiovascular disease can be diagnosed using a physical method to some extent, and there is a limit to early diagnosis or prediction. In general, cardiovascular disease is diagnosed by X-ray and ultrasound imaging of the inside of the heart and coronary arteries using a contrasting device, which can be diagnosed after the onset. In addition, several risk factors predictive of cardiovascular disease that can be measured from blood samples, such as those associated with LDL and HDL cholesterol levels, are currently being used clinically, but many patients with atherosclerosis have these risk factors not. Furthermore, cardiovascular disease occurs even in individuals who do not have these risk factors, so they are considered for individuals at low risk of experiencing cardiovascular disease. Thus, there is a constant need for a method for detecting the risk of developing cardiovascular disease in a patient.
심혈관 관련 질병은 증상 없이 갑자기 나타나기 때문에, 사람의 생명 및 일생생활의 기능제한과 아주 밀접한 연관성이 있다. 이에 따라 이러한 진행된 심혈관 질환을 사전에 예측, 진단하여 환자의 생명을 구하고 삶의 질을 높여야 할 필요가 있다. 지금까지 알려진 심혈관계 질병의 바이오마커로서는 CRP, IL-6, IL-8, MCP-1, IP-10 등이 있다. 이외에도, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxin, M-CSF, IL-3, IP-10, TNFa, Ang-2, IL-5, IL-7, 및 IGF-1 등의 조합을 이용한 심혈관계 바이오마커 관련 특허가 출원되어 있다(US 2007/0099239). 하지만, 여러 가지 검사로 인해 의료비가 증가하고, 스크리닝 목적으로 이루어지는 검사가 모든 사람들을 대상으로 시행되기에는 한계점을 가지고 있으므로 간편하게 한번 채혈로 진단할 수 있는 바이오마커에 대한 필요성이 커지고 있다.
Because cardiovascular-related illnesses appear suddenly without symptoms, they are closely related to functional limitations in human life and lifestyle. Therefore, it is necessary to predict and diagnose these advanced cardiovascular diseases to save the life of the patient and to improve the quality of life. Biomarkers of known cardiovascular diseases include CRP, IL-6, IL-8, MCP-1 and IP-10. In addition, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxin, M-CSF, IL-3, IP-10, TNFa, Ang-2, IL- (US 2007/0099239) have been filed for patent applications relating to cardiovascular biomarkers. However, there is a growing need for a biomarker that can be easily diagnosed as a blood sample because the cost of medical examination increases due to various tests, and the screening test is limited to all people.
이에, 본 발명자들은 신규한 특이적인 심혈관 질환 마커를 개발하기 위해 노력한 결과, 파랄레민(paralemmin)이 정상군에 비해 심혈관 질환 마우스 및 환자에서 증가되는 현상을 나타내고, 기존의 심혈관 질환 마커인 CK-MB 및 troponin-T의 발현 양상과 유사함을 확인함으로써, 상기 파랄레민을 심혈관 질환 마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.As a result of efforts to develop a novel specific cardiovascular disease marker, the present inventors have found that paralemmin is more effective than a cardiovascular disease mouse and Confirming that the paralamine is useful as a cardiovascular disease marker by confirming that the expression of CK-MB and troponin-T is similar to that of existing cardiovascular disease markers, .
본 발명의 목적은 파랄레민(Paralemmin)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 심혈관계 질환 진단용 키트 및 심혈관 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공하는 것이다.
An object of the present invention is to provide a kit for diagnosing cardiovascular diseases comprising an antibody that specifically binds to paralemmin and a method for detecting a protein for providing information on diagnosis of cardiovascular diseases.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파랄레민(Paralemmin)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 심혈관계 질환 진단용 키트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a kit for diagnosing cardiovascular diseases comprising an antibody that specifically binds to paralemmin.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 환자의 분리된 시료로부터 파랄레민의 발현량을 측정하는 단계; 및1) measuring the expression level of paralamine from the separated sample of the patient; And
2) 상기 단계 1)의 단백질의 발현량이 정상 대조군과 비교하여 높은 개체를 선별하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
2) a step of selecting an individual having a higher expression level of the protein of step 1) than that of a normal control, to provide information on the diagnosis of cardiovascular diseases.
본 발명은 심혈관 질환 진단용 바이오마커인 파랄레민(paralemmin)에 관한 것으로, 상기 파랄레민은 심혈관 질환 마우스 및 환자에서 증가되는 현상을 나타내고 기존의 심혈관 질환 마커인 CK-MB 및 troponin-T의 발현 양상과 유사하므로, 간단한 채혈로 간편하게 심혈관계 진단이나 진행의 정도를 판단할 수 있는 효과를 도모할 수 있으므로, 심혈관 질환 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
The present invention relates to a biomarker for the diagnosis of cardiovascular diseases, paralemmin, The present invention provides a method for diagnosing cardiovascular diseases and a method for diagnosing cardiovascular diseases in a patient, comprising the steps of: (a) And may be useful as a cardiovascular disease marker.
도 1은 LAD 결찰을 통하여 심혈관 질환 마우스 모델 구축에 관한 도이다.
도 2는 심혈관 질환 마우스 모델로부터 얻은 조직 또는 혈청을 이용하여 젤에 로딩한 후 발현되는 단백질을 염색한 도이다.
도 3은 심혈관 질환 마우스 모델로부터 얻은 조직 또는 혈청을 이용한 샘플들을 이용하여 질량 분석한 결과이다.
도 4는 심혈관 질환 마우스에서 웨스턴 블랏을 이용하여 파랄레민(Paralemmin) 단백질 패턴을 분석한 도이다.
도 5는 심혈관 질환 환자에서 웨스턴 블랏을 이용하여 파랄레민 단백질 패턴을 분석한 도이다.
도 6은 심혈관 질환 환자의 혈청으로부터 기존 마커인 CK-MB 및 Troponin-T의단백질 패턴을 분석한 도이다.
도 7은 심혈관 질환 환자의 혈청으로부터 기존 마커인 CK-MB 및 Troponin-T 단백질 패턴을 분석한 도이다.
도 8은 심혈관 질환 환자의 혈청으로부터 기존 마커와 파랄레민(Paralemmin) 단백질 패턴 비교 분석한 도이다. FIG. 1 is a diagram for constructing a cardiovascular disease mouse model through LAD ligation.
FIG. 2 is a diagram showing a protein staining after being loaded on a gel using tissues or serum obtained from a cardiovascular disease mouse model.
FIG. 3 shows the results of mass spectrometry using samples obtained from a mouse model of cardiovascular disease or samples using serum.
FIG. 4 is an analysis of a paralemmin protein pattern in a cardiovascular disease mouse using Western blot. FIG.
FIG. 5 is an analysis of a paralamine protein pattern using Western blot in a cardiovascular disease patient.
FIG. 6 is an analysis of protein patterns of existing markers CK-MB and Troponin-T from serum of cardiovascular disease patients.
FIG. 7 is an analysis of existing markers CK-MB and Troponin-T protein patterns from serum of cardiovascular disease patients.
8 is a comparative analysis chart of existing marker and paralemmin protein patterns from serum of cardiovascular disease patients.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 파랄레민(Paralemmin)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 심혈관계 질환 진단용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for cardiovascular disease diagnosis comprising an antibody that specifically binds to paralemmin.
상기 파랄레민은 심혈관계 질환 환자에서 발현량이 증가하는 것을 특징으로 한다.The paralamine is characterized by an increased expression level in a cardiovascular disease patient.
상기 항-파랄레민 항체는 파랄레민 단백질의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하고, 상기 파랄레민은 인간의 파랄레민인 것이 바람직하고, 서열번호 1로 기재되는 파랄레민 아미노산 서열을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프(epitope)와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. It is preferable that the anti-phallalamine antibody is produced through injection of a paralimumine protein, or can be used as a commercially available product, and the paralumin is preferably a paralemic human, and the paralumin amino acid described in SEQ ID NO: 1 It is more preferable to have a sequence. In addition, the antibody includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a fragment capable of binding to an epitope.
다클론 항체는 상기 파랄레민 단백질을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 쥐, 래트, 닭, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있고, 토끼를 숙주로 함이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The polyclonal antibody can be produced by a conventional method of injecting the paralamine protein into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody. Such polyclonal antibodies can be purified by any method known in the art and can be prepared from any animal species host such as goats, rabbits, rats, rats, chickens, sheep, monkeys, horses, pigs, cows, dogs And the rabbit is preferably used as a host, but the present invention is not limited thereto.
단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 및 쥐 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984). Monoclonal antibodies can be prepared using any technique that provides for the generation of antibody molecules through the cultivation of continuous cell lines. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human and murine B-cell hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology (Kohler G et al., Nature 256: 495-497, 1975 ; Cole SP et al., Mol Cell Biol 62: 109-9, 1986; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81: 31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030, 120, 1984).
또한, 상기 파랄레민 단백질에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989).In addition, antibody fragments containing specific binding sites for the paralimumine protein can be prepared. For example, F (ab ') 2 fragments can be prepared by digesting antibody molecules into pepsin, and Fab fragments can be prepared by reducing disulfide bridges of F (ab') 2 fragments, although not limited thereto. Alternatively, the Fab expression library can be miniaturized to quickly and easily identify monoclonal Fab fragments with the desired specificity (Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989).
상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.The antibody may be bound to a solid substrate to facilitate subsequent steps such as washing or separation of the complex. Solid substrates include, for example, synthetic resins, nitrocellulose, glass substrates, metal substrates, glass fibers, microspheres and micro beads. The synthetic resin includes polyester, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene, PVDF, and nylon.
상기 항체는 발색효소, 발색물질, 또는 형광분자가 결합될 수 있고, 리간드에 결합된다. 상기 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 발색물질은 콜로이드 골드(coloid gold)인 것이 바람직하고, 상기 형광분자는 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 등을 사용하는 것이 가능하다.The antibody may bind a chromogenic enzyme, a chromogenic substance, or a fluorescent molecule, and is bound to a ligand. The chromogenic enzyme is preferably HRP (horseradish peroxidase) or alkaline phosphatase. Preferably, the coloring material is a colloidal gold, and the fluorescent molecule is selected from the group consisting of fluorescein carboxylic acid (FCA), fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein thiourea (FTH), 7 -Acetoxycoumarin-3-yl, fluorescein-5-yl, fluorescein-6-yl, 2'7'-dichlorofluorescein-5-yl, 2 ', 7'-dichlorofluorescein Yl, tetramethylrhodamine-6-yl, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4- 4-diaza-s-indacene-3-ethyl or 4,4-difluoro-5,7-diphenyl-4-bora-3a, 4a-diaza- -Ethyl and the like can be used.
상기 리간드는 바이오틴, 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 대해 바이오틴과 본질적으로 동일한 결합작용을 갖는 바이오틴 유도체인 것이 바람직하고, 추가적으로 특이적 결합분자에 결합된 발색효소, 발색물질 또는 형광분자가 결합된 시각화 컨쥬게이트를 더 포함할 수 있다.The ligand is preferably a biotin derivative having essentially the same binding action as biotin to biotin or avidin or streptavidin. In addition, it is preferable that the ligand is a biotin derivative having a binding activity to biotin, Gate.
상기 리간드에는 단백질 A 또는 검출용 항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체 등이 있다.The ligand includes a secondary antibody that specifically binds to the protein A or the detection antibody.
본 발명의 심혈관 질환 진단용 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 추가로 포함할 수 있다. 분석을 위해 사용되는 시료는 혈청, 뇨, 눈물 타액 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 상기 세척액으로는 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The kit for the diagnosis of cardiovascular diseases of the present invention may further comprise a washing solution or eluent which can remove the substrate to be color-developed with the enzyme and the unbound protein and retain only the bound marker. The samples used for the analysis include biological samples capable of identifying disease-specific polypeptides that can be distinguished from normal conditions such as serum, urine, and saliva. The washing solution preferably includes a phosphate buffer solution, NaCl, and Tween 20, but is not limited thereto.
본 발명의 심혈관 질환 진단용 키트는 항원-항체 결합반응, 또는 단백질-리간드 결합반응을 통하여 결합반응을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 심혈관 질환을 진단할 수 있으며, 상기 결합 반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블랏, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.The kit for the diagnosis of cardiovascular diseases of the present invention can diagnose cardiovascular diseases by quantitatively or qualitatively analyzing the binding reaction through an antigen-antibody binding reaction or a protein-ligand binding reaction, and the binding reaction can be detected by a conventional enzyme immunoassay Methods such as ELISA, radioimmunoassay (RIA), sandwich assay, Western blot, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, fluorescent immunoassay, enzyme substrate staining, antigen-antibody aggregation . ≪ / RTI >
상기 심혈관 질환은 죽상동맥경화증, 허혈성 심장질환, 관상동맥 심장 질환 (CHD), 재협착, 뇌졸중, 고혈압, 심부전, 부정맥, 심근증, 심내막염, 말초 동맥 질환, 관상동맥 우회술, 경동맥 질환, 동맥염, 심근염, 심혈관염, 맥관염, 불안정형 협심증(UA), 불안정형 난치성 협심증, 안정형 협심증 (SA), 만성 안정형 협심증, 급성 관상동맥 증후군(ACS), 심근경색증, 1차 또는 재발성 심근경색증, 비-Q 파 심근경색증, 비-ST-분절 상승 심근경색증 및 ST-분절 상승 심근경색증을 비롯한 급성 심근경색증(AMI)으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
Wherein said cardiovascular disease is selected from the group consisting of atherosclerosis, ischemic heart disease, coronary heart disease, restenosis, stroke, hypertension, heart failure, arrhythmia, cardiomyopathy, endocarditis, peripheral arterial disease, coronary artery bypass, carotid artery disease, (SA), chronic stable angina pectoris, acute coronary syndrome (ACS), myocardial infarction, primary or recurrent myocardial infarction, non-Q disease, myocardial infarction, cardiovascular disease, vasculitis, unstable angina pectoris Myocardial infarction, myocardial infarction, non-ST-segment elevation myocardial infarction, and ST-segment elevation myocardial infarction (AMI).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 심혈관 질환 마우스 모델을 구축하고(도 1참조), 1-D 젤을 이용하여 정상군과 심혈관 질환 마우스 모델에서 발현되는 단백질을 비교하고 인-하우스 데이타베이스 서버를 이용하여 특정단백질 중 하나인 파랄레민(Paralemmin)을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 심혈관 질환 마우스에서 파랄레민 단백질 패턴을 분석한 결과, 심혈관 질환 마우스로부터 얻은 혈청의 파랄레민이 LAD 결찰 후의 시간에 의존적으로 증가함을 확인하였다(도 4 참조). 또한 심혈관 질환 환자에서 파랄레민 단백질 패턴을 분석한 결과, 파랄레민은 정상인에 비해 심근경색증이 유도된 심혈관 질환 환자에서 증가함을 확인하였다(도 5 참조). 기존의 마커인 CK-MB 및 Troponin T은 심혈관 질환 환자에서 정상인에 비해 증가함을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조). 또한, 본 발명의 파랄레민은 기존의 심혈관 질환 마커인 CK-MB 및 Troponin T의 발현 패턴과 유사함을 확인하였다(도 8 참조).In a specific example of the present invention, a cardiovascular disease mouse model was constructed (see FIG. 1), and proteins expressed in a normal group and a cardiovascular disease mouse model were compared using a 1-D gel and using an in-house database server To identify one of the specific proteins Paralemmin (see FIGS. 2 and 3). Analysis of the paralamine protein pattern in cardiovascular disease mice showed that the paralememia of serum from cardiovascular disease mice increased in a time-dependent manner after LAD ligation (see FIG. 4). Also, analysis of the paralamine protein pattern in patients with cardiovascular disease confirmed that paralumin was increased in patients with myocardial infarction-induced cardiovascular disease as compared to normal subjects (see FIG. 5). The existing markers CK-MB and Troponin T were found to increase in patients with cardiovascular disease compared to normal individuals (see FIGS. 6 and 7). In addition, it was confirmed that the paralamine of the present invention is similar to the expression patterns of the existing cardiovascular disease markers CK-MB and Troponin T (see FIG. 8).
따라서, 본 발명의 파랄레민(paralemmin) 단백질은 정상인 혈액보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 그 발현양이 증가됨이 확인되었고, 간단한 채혈로 간편하게 심혈관 질환을 진단할 수 있음으로써, 심혈관 질환 진단용 마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
Accordingly, the paralemmin protein of the present invention has been found to be more abundant in the blood of cardiovascular patients than normal blood, and can be easily diagnosed as a cardiovascular disease by simple blood collection, which is useful as a marker for diagnosing cardiovascular diseases Can be used.
또한, 본 발명은 In addition,
1) 환자의 분리된 시료로부터 파랄레민의 발현량을 측정하는 단계; 및1) measuring the expression level of paralamine from the separated sample of the patient; And
2) 상기 단계 1)의 단백질의 발현량이 정상 대조군과 비교하여 높은 개체를 선별하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.2) a step of selecting an individual having a higher expression level of the protein of step 1) than that of a normal control, to provide information on the diagnosis of cardiovascular diseases.
상기 단계 1)에서 환자로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 더욱 바람직하게는 혈청으로부터 측정될 수 있다. 시료는 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.When the sample obtained from the patient in step 1) is contacted with an antibody capable of specifically binding to the marker protein of the present invention bound to a solid substrate, the sample may be diluted to an appropriate degree before contact with the antibody. Preferably from a biological fluid sample, for example blood, serum, plasma, more preferably serum. The sample may be prepared to increase the detection sensitivity of the marker. For example, a serum sample obtained from a patient may be analyzed by anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, sequential extraction, or gel electrophoresis. However, the present invention is not limited thereto.
상기 단계 2)에서 상기 마커에 검출용 항체를 처리한 후 검출용 항체의 양을 탐색함으로써 심혈과 질환을 모니터링, 진단 및 스크리닝할 수 있다. 또는 상기 항체 및 마커 복합체에 검출용 항체 및 리간드를 순차적으로 처리한 후, 검출용 항체의 양을 탐색함으로써 심혈과 질환을 진단 및 스크리닝할 수 있다. 검출용 항체를 세척된 항체-마커 복합체와 정온배치한 후 세척하여 검출용 항체를 측정함으로써 상기 마커의 양을 측정할 수 있다. 검출용 항체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다.In step 2), the marker can be treated with the detection antibody, and then the amount of the detection antibody can be searched to monitor, diagnose and screen the cardiovascular disease. Alternatively, the antibody and the marker complex may be sequentially treated with an antibody or a ligand for detection, and then the amount of the antibody for detection may be searched to diagnose and screen cardiovascular diseases. The amount of the marker can be measured by placing the antibody for detection at a constant temperature with the washed antibody-marker complex, washing the antibody, and measuring the antibody for detection. The detection of the amount of the antibody or the detection of the presence of the detection antibody can be accomplished through fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, reflection or transmission.
또한, 상기 검출용 항체 또는 리간드의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening(HTS)) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.As a method for searching for the amount of the antibody or the ligand for detection, it is preferable to use a high throughput screening (HTS) system. The fluorescence method is performed by detecting fluorescence with the fluorescent substance attached to the detector, A radiation method carried out by attaching a radioisotope to a detection body and detecting the radiation; It is preferable to use a surface plasmon resonance (SPR) method for measuring the change in plasmon resonance of the surface in real time without a label of the detector, or a surface plasmon resonance imaging (SPRI) method for imaging the SPR system.
예를 들어, 상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 검출용 항체를 형광물질로 라벨링한 후 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것 바람직하나 이에 한정되지 않는다. For example, the fluorescence method is a method of labeling the detection antibody with a fluorescent substance using a fluorescence scanner program, spotting the fluorescence substance, and confirming a signal, and the degree of binding can be confirmed by applying this method. The fluorescent material includes Cy3, Cy5, polyL-lysine-fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine-B-isothiocyanate (RITC) , And rhodamine. However, the present invention is not limited thereto.
상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하나 동시다발적인 시료 분석이 불가능하다는 단점이 있다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하지만 탐지강도가 낮은 단점이 있다.Unlike the fluorescence method, the SPR system does not require that the sample be labeled with a fluorescent material, but it is possible to analyze the binding degree of the antibody in real time, but it has a disadvantage that it is impossible to simultaneously analyze samples. In the case of SPRI, it is possible to perform simultaneous multiple sample analysis by using the fine alignment method, but the detection strength is low.
따라서, 본 발명의 파랄레민(paralemmin) 단백질은 정상인 혈액보다 심혈관 질환 환자의 혈액에서 그 발현양이 증가됨이 확인함으로써, 상기 파랄레민의 발현 수준 특성을 통해 심혈관 질환의 진단 기술에 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the paralemmin protein of the present invention can be used for diagnosis of cardiovascular diseases through the characteristics of the paralemin expression level by confirming that the expression level of paralemmin protein is increased in the blood of cardiovascular disease patients than in normal blood .
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following Examples and Experimental Examples.
<< 실시예Example 1> 심혈관 질환 마우스 모델 구축 1> Establishment of cardiovascular disease mouse model
심혈관 질환에서 발현되는 특정 단백질을 측정하고 이를 마커로서 활용하기 위한 실험을 수행하기 위하여, 심혈관 질환이 유도된 마우스 모델을 구축하였다.A cardiovascular disease-induced mouse model was constructed to measure the specific protein expressed in cardiovascular disease and conduct experiments to utilize it as a marker.
구체적으로, 8주령의 성숙한 마우스를 주사마취하고 수술대 위에 마우스를 배쪽면이 위를 향하게 보정한 후, 기도삽관을 통해 기계호흡을 유지시켰다. 기계호흡이 안정화된 마우스의 흉부 왼쪽의 피부를 소독하고 1 cm 가량 절개하여, 피부와 바로 아래 대흉근과 소흉근의 둔선을 분리하였다. 이후 대흉근과 소흉근을 절개한 후 네 번째 늑간을 노출시켰다. 노출된 네 번째 늑간을 미세가위를 이용해 절개하여 흉강을 개방하고 리트렉터(retractor)를 이용해 네 번째 늑간을 1 - 1.5 cm 가량 벌려 심장을 노출시켰다. 심장의 왼쪽 귀 3 - 5 mm 아래쪽에 주행하는 왼쪽 앞쪽 하행관상동맥(left anterior descending coronary artery(LAD))을 폴리프롤렌(polyprolene) 수술실로 결찰하여 좌심실근으로의 혈액공급을 차단함으로써 심근 경색을 유도하였다. LAD 결찰 완료 후 네 번째와 다섯 번째 늑골을 결찰함으로써 흉강을 폐쇄하고 카테터로 흉강내 공기를 빼내주어 흉강내의 음압을 회복시켜 마우스가 자가호흡이 가능하도록 하였다. 이후에 소흉근, 대흉근, 및 피부 순으로 봉합하고 상처부위를 소독한 후 마우스를 회복시켰다(도 1).Specifically, 8-week-old adult mice were anesthetized with anesthesia, and the mice were placed on the operating table with the abdomen facing upward, and mechanical ventilation was maintained through the airway intubation. The left ventricle of the mechanical respiration stabilized mouse was disinfected and the incision was made about 1 cm to separate the skin and the pectoralis muscle from the pectoralis major muscle. Then, the pectoralis major muscle and the pectoral muscle were incised and the fourth intercostal space was exposed. The exposed fourth intercostal space was opened with a fine scissors to open the thoracic cavity and the retractor was used to expose the fourth intercostal space by 1 to 1.5 cm. The left anterior descending coronary artery (LAD), which runs 3 to 5 mm below the left ear of the heart, is ligated to the polyprolene operating room to block blood supply to the left ventricle. Respectively. After ligation of the LAD, the fourth and fifth ribs were ligated to close the thoracic cavity, and the air in the thoracic cavity was removed with a catheter to restore the sound pressure in the thoracic cavity to enable autologous breathing. Thereafter, the pectoralis major, pectoralis major, and skin were sutured in order, and the wound area was disinfected and the mouse was restored (Fig. 1).
그 결과, 심근허혈(myocardial ischemia)이 유도되었는지 여부를 수술 24시간 후 혈액 내의 크리에이팅 카이네이즈(creating kinase(CK)) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase(AST)) 분석을 통해 확인하였고, 수술 7일 후 심장을 적출해 좌심실벽이 얇아진 것을 확인하였다.
As a result, whether or not myocardial ischemia was induced was confirmed by analysis of blood forming creatine kinase (CK) and aspartate aminotransferase (AST) 24 hours after surgery , 7 days after surgery, the heart was removed and the left ventricular wall was thinned.
<< 실시예Example 2> 1-D 젤을 이용하여 심혈관 질환 마우스 모델에서 발현되는 특정단백질 분리 2> Isolation of specific proteins expressed in mouse model of cardiovascular disease using 1-D gel
상기 <실시예 1>의 심혈관 질환 마우스 모델로부터 얻은 조직 또는 혈청을 이용하여 심혈관 질환 마우스 모델에서 발현되는 특정 단백질 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.In order to identify a specific protein expressed in a cardiovascular disease mouse model using tissue or serum obtained from the cardiovascular disease mouse model of Example 1 described above, the following experiment was conducted.
구체적으로, 정상 대조군(N1, N2, N3,및 N4)과 심혈관 질환 마우스 모델군(P14, P17, P22 및 P26)의 조직 또는 혈청을 용해시킨 후, 샘플링을 하였다. 각각의 샘플을 1D-젤에 전기영동한 후, 확인을 위해 염색하였다. 도 2에 화살표로 표시된 밴드(Band)들을 약 1 mm - 2 mm의 크기로 잘라서 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 200 ㎕의 탈색용액(destaining solution)을 넣고 상온에서 밤사이 동안 탈색하였다. 다음날 파이펫으로 젤이 따라나오지 않게 조심히 탈색용액을 제거하고 다시 200 ㎕의 탈색용액으로 상온에서 2 - 3시간 동안 한번 더 염료가 완전히 제거되도록 탈색을 진행하였다. 200 ㎕의 아세토니트릴(acetonitrile)을 상기 튜브에 넣은 후 상온에서 5분 동안 탈수화(dehydrate)시키고 파이펫으로 용액을 조심스럽게 제거하였다. 2 - 3분 동안 진공 원심분리기(vacuum centrifuge)를 이용하여 완벽하게 건조시켰다. 이어서, 30 ㎕의 10 mM DTT를 넣고 상온에서 30분 동안 단백질의 이황화 결합을 환원시켰다. 파이펫으로 DTT를 제거하고 30 ㎕의 50 mM 아이오도아세트아미드(iodoacetamide) 첨가한 후 30분 동안 상온에서 단백질을 알킬화(alkylate)하였다. 파이펫으로 아이오도아세트아미드를 제거하고 200 ㎕의 아세토니트릴을 넣고 상온에서 5분 동안 탈수화시키고 용액을 다시 파이펫으로 제거하였다. 2 - 3분 동안 진공 원심분리기로 건조시켰다. 20 ㎍의 트립신(trypsin) 및 얼음으로 차거워진(ice-cold) 1000 ㎕의 50 mM 암모늄바이카보네이트(ammonium bicarbonate)를 혼합하여 트립신 용액을 얼음 상에서 준비하였다. 각각의 샘플에 30 ㎕의 트립신 용액을 넣고 45분 동안 얼음에서 재수화(rehydrate)시킨 후 30 초 동안 원심분리하여 샘플을 다운시켰다. 트립신 용액을 제거하고 샘플에 50 ㎕의 50 mM 암모늄바이카보네이트를 넣고 37℃에서 밤사이 동안 분해(digestion)를 수행하였다. 상층을 새 1.5 ㎖ 튜브로 옮기고 50 ㎕의 추출버퍼(extraction buffer)를 넣어 볼텍스하고 1시간 동안 펩타이드를 추출하였다. 30 초 동안 원심분리하여 샘플을 다운시키고 새 1.5 ㎖ 튜브에 합치고 진공 원심분리기를 이용하여 건조시키고 집 팀(zip tip)을 이용하여 펩타이드를 정제하였다.Specifically, tissues or sera from normal control groups (N1, N2, N3, and N4) and cardiovascular disease mouse model groups (P14, P17, P22 and P26) were dissolved and then sampled. Each sample was electrophoresed on 1D-gel and stained for confirmation. The bands indicated by arrows in FIG. 2 were cut into a size of about 1 mm to 2 mm, put into a 1.5 ml tube, and 200 μl of a destaining solution was added and decolorized at room temperature overnight. On the next day, the decolorizing solution was carefully removed so that the gel did not come out along with the pipette, and further decolorization was performed so that the dye was completely removed again at 200 ° C for 2 - 3 hours at room temperature. 200 μl of acetonitrile was placed in the tube, dehydrated at room temperature for 5 minutes, and the solution was carefully removed with a pipette. It was completely dried for 2 - 3 minutes using a vacuum centrifuge. Subsequently, 30 쨉 l of 10 mM DTT was added and the disulfide bond of the protein was reduced at room temperature for 30 minutes. The DTT was removed by pipetting and 30 μl of 50 mM iodoacetamide was added and the protein was alkylated at room temperature for 30 minutes. Iodoacetamide was removed with a pipette, 200 μl of acetonitrile was added, dehydrated at room temperature for 5 minutes, and the solution was again pipetted. It was dried with a vacuum centrifuge for 2-3 minutes. Trypsin solution was prepared on ice by mixing 20 μg of trypsin and 1000 μl of ice-cold 50 mM ammonium bicarbonate. 30 μl of trypsin solution was added to each sample, rehydrated on ice for 45 minutes, and then centrifuged for 30 seconds to bring the sample down. The trypsin solution was removed and 50 [mu] l of 50 mM ammonium bicarbonate was added to the sample and digestion was performed at 37 [deg.] C overnight. The upper layer was transferred to a new 1.5-ml tube and 50 μl of extraction buffer was added to the vortex and the peptide was extracted for 1 hour. The samples were centrifuged for 30 seconds to bring down the samples, combined with fresh 1.5 ml tubes, dried using a vacuum centrifuge, and the peptides were purified using a zip tip.
트립신 처리된 펩타이드는 1.7 ㎛ BEH C18 컬럼(75 ㎛ × 150 mm; Waters)를 이용한 NanoAcquity UPLC 시스템(Waters)에 의해 분리되었다. 이때 사용된 조건은 2%부터 40%(부피/부피)까지의 아세토니트릴(0.1%(부피/부피) 포름산에 있는)로부터 40-min linear gradient이고 용액 이동 속도는 300 nL/분이었다. 용출된 펩타이드(Eluting peptide)는 column output와 결합된 나노스프레이 장치(nanospray device)를 이용하여 Synapt Q-TOF MS 기계(Waters) 안으로 주입되었다. 별도의 [Glu1]피브리노펩타이드 B(fibrinopeptide B)(400 fmol/μL; Sigma)를 질량 기준값으로 사용하기 위하여 양이온 모드(positive mode)에서 매 30 초마다 스펙트럼을 얻었다. 액체크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography mass spectrometry(LC-MS)) 데이타는 데이타 의존적 ms/ms 스펙트럼 습득을 위해 사용되었고, [Glu1]피브리노펩타이드 B(fibrinopeptide B)에 의해 정확한 질량값을 측정하였다. MS/MS스펙트럼은 350 - 1,600 m/z 범위에서 MS survey scan(0.68 s)에서 검출된 가장 강한 신호를 지닌 이온들의 펩타이드 단편에 의해 수집되었다. 이때 전하와 질량값으로부터 자동적으로 조절되는 충돌에너지(collision enegy)를 사용하였고, 측정된 어미 이온의(precursur ion) m/z와 전하 상태를 기초로 이 후 30초간 ms/ms 스펙트럼의 수집을 배제하였다(도 2).
The trypsinized peptides were separated by a NanoAcquity UPLC system (Waters) using a 1.7 [mu] M BEH C18 column (75 [mu]
<< 실시예Example 3> 1-D 젤로부터 분리된 단백질 확인 3> Identification of proteins separated from 1-D gel
상기 <실시예 2>로부터 얻은 액체크로마토그래피-질량분석기 데이타를 하기의 프로그램을 이용하여 분석하였다.The liquid chromatography-mass spectrometer data obtained from the above <Example 2> was analyzed using the following program.
구체적으로, 데이타베이스(Database) 연구는 Mascot 2.3.0 (Matrix Science) 을 이용해 인-하우스 데이타베이스 서버(in-house database server)로 제출되었다. 데이타베이스 파라미터(parameters)는 분류(taxonomy)(Homo sapiens), 효소(trypsin), 가변적 변형(variable modifications) (산화(oxidation) [M]), 고정된 변형(카바미도메틸(Carbamidomethyl [C]), 질량값(monoisotopic), 펩타이드 질량 내성(peptide mass tolerance)(30 ppm), 단편 질량 내성(fragment mass tolerance)(0.1 Da), 및 최대 놓친 절편들(max missed cleavages)이었고, 기계 유형은 ESI-QUAD-TOF 이었다. Specifically, the database study was submitted to the in-house database server using Mascot 2.3.0 (Matrix Science). Database parameters include taxonomy (Homo sapiens), trypsin, variable modifications (oxidation [M]), fixed variants (carbamidomethyl [C] , Peptide mass tolerance (30 ppm), fragment mass tolerance (0.1 Da), and max missed cleavages, and the mechanical type was ESI- QUAD-TOF.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 상기 샘플들을 이용하여 질량 분석한 결과로서 파랄레민(paralemmin)을 후보마커들 중 하나로 선택하고 분석하였다.
As a result, paralemmin was selected as one of the candidate markers and analyzed as a result of mass analysis using the samples as shown in FIG.
<< 실험예Experimental Example 1> 심혈관 질환 마우스에서 1> Cardiovascular disease in mice 파랄레민Paralymine (( ParalemminParalemmin ) 단백질 패턴 분석) Protein pattern analysis
상기 <실시예 3>으로부터 얻은 데이타를 이용하여 심혈관 질환과 관련된 후보 마커 중의 하나인 파랄레민(Paralemmin)의 패턴을 조사하였다.Using the data from Example 3 above, the pattern of paralemmin, one of the candidate markers related to cardiovascular disease, was examined.
구체적으로, LAD 결찰 후 1시간, 1일, 4일 및 10일째의 각각의 심혈관모델 마우스에서 심장 조직 및 혈청 샘플은 채혈을 통해 얻었다. 심장 조직은 RIPA 버퍼에 용해시키고 혈청 샘플들은 즉시 볼텍스(vortex)하여 혼합한 후, 각각의 샘플들을 30분 동안 13,000 rpm, 4℃ 조건에서 원심분리(Hanil centrifuge model MICRO 17TR)하였다. 상층액을 RIPA 버퍼와 샘플 로딩 버퍼와 함께 1:1:1의 비율이 되도록 섞어 혼합물을 만들고 12% SDS PAGE 젤에 5 ㎕씩 로딩하였다. 이후, 코마시에 블루 염색(coomassie blue stain)을 밤 사이 동안 시행한 후 염색제거 버퍼(destaining buffer)로 20분씩 10회 세척하였다. 마우스 심장조직을 2 ㎍정도 자른 후 1 ㎖의 RIPA 버퍼와 비드(bead)와 함께 균질기(QIAGEN tiissue lyser LT homogenizer)를 이용해 단백질을 추출하였다. 단백질 정량 분석 키트(Pierce BCA Protein assay kit)를 이용해 각각의 샘플을 단백질 4 ㎍으로 정량하고 12% SDS PAGE 젤에 각 웰당 10 ㎕씩 로딩한 후, 바이오-래드 미니-단백질 테트라 시스템(Bio-rad Mini-PROTEAN Tetra system)을 이용해 80 V, 2시간 조건으로 전기영동하였다. 전기영동한 후 젤을 PVDF 멤브린으로 호퍼 TE22(hoefer TE22)를 이용해 250 V, 2시간 동안 트랜스퍼하였다. 웨스턴 블랏은 5% 탈지분유를 사용하여 1시간 동안 차단(blocking)하고 1차 항체로서 베타-엑틴(beta-actin)(santacruz, sc-8118) 및 파랄레민(paralemmin) (santacruz, sc-365869)을 각각 1:1000으로 희석하여 2시간 동안 배양하였다. 1차 항체 배양 후 5분씩 3회 동안 PBS-T로 세척하고 2차 항체인 마우스-HRP IgG(Sigma, a9917)를 사용하여 1:6000 희석비율로 40분 동안 배양한 후 PBS-T로 10 분씩 6회 세척하였다. 상기 멤브린에 ECL 용액(Bio-rad, Clarity western ECL substrate)을 뿌린후 x-ray 필름에 노출시켰다.Specifically, cardiac tissue and serum samples were obtained from each cardiovascular model mouse at 1 hour, 1 day, 4 days and 10 days after LAD ligation via blood collection. Cardiac tissue was dissolved in RIPA buffer and serum samples were immediately vortexed and mixed, and then each sample was centrifuged (Hanil centrifuge model MICRO 17TR) at 13,000 rpm, 4 ° C for 30 minutes. The supernatant was mixed with RIPA buffer and sample loading buffer at a ratio of 1: 1: 1 to prepare a mixture, and 5 μl of the mixture was loaded on a 12% SDS PAGE gel. Subsequently, coomassie blue stain was performed overnight, followed by washing with
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 심혈관 질환 마우스로부터 얻은 혈청의 파랄레민은 LAD 결찰 후 시간에 의존적으로 증가함을 확인하였다. 또한, 심혈관 질환 마우스로부터 얻은 혈청 및 조직에서 파랄레민은 대조군에 비해 증가함을 확인하였다(도 4).
As a result, as shown in Fig. 4, it was confirmed that serum paralamine from cardiovascular disease mice was time-dependent increase after LAD ligation. In addition, it was confirmed that paralamine was increased in serum and tissues from cardiovascular disease mice compared to the control (Fig. 4).
<< 실험예Experimental Example 2> 심혈관 질환 2> Cardiovascular Disease 환자에서In patients 파랄레민Paralymine (( ParalemminParalemmin ) 단백질 패턴 분석) Protein pattern analysis
인간에서 파랄레민의 패턴을 조사하기 위하여, 심혈관 질환 환자로부터 얻은 혈청을 이용하여 하기의 실험을 수행하였다.To investigate the pattern of paralamine in humans, the following experiment was conducted using serum obtained from a cardiovascular disease patient.
구체적으로, 정상인(N1 내지 N7) 및 심혈관 질환 환자(T 군 및 P 군)의 혈청 샘플을 볼텍스하여 즉시 혼합하고, 13,000 rpm, 30분 동안 , 4℃에서 원심분리(Hanil centrifuge model MICRO 17TR)하였다. 상층액을 RIPA 버퍼 및 샘플 로딩버퍼와 1:1:1이 되도록 섞고 단백질 샘플을 만든 후 12% SDS PAGE 젤에 5 ㎕씩 로딩하였다. 전기 영동한 후 코마시에 블루 염색을 밤사이 동안 실행하고 염색제거 버퍼(destaining buffer)로 20분씩 10회 세척하였다. 12% SDS PAGE 젤에 각 웰 당 5 ㎕ 씩 로딩하였고 바이오-래드 미니-단백질 테트라 시스템(Bio-rad Mini-PROTEAN Tetra system)을 이용해 80 V, 2시간 조건으로 전기영동하였다. 전기 영동 후 젤을 PVDF 멤브린으로 호퍼 TE22(hoefer TE22)를 이용해 250 V로 2시간 동안 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼된 멤브린을 5% 탈지분유를 이용하여 1시간 동안 차단하고, 1:1000으로 희석된 1차 항체 파랄레민(paralemmin)(santacruz, sc-365869), C1(santacruz, sc-61750), 트랜스페린(transferrin)(abcam, ab1223) 및 CYB5D2(santacruz, sc-136639)를 이용하여 2시간 동안 배양하였고 5분씩 3회 동안 PBS-T로 세척하였다. 2차 항체인 마우스-HRP IgG를 1:6000으로 희석하여 40분 동안 배양한 후 PBS-T로 10 분씩 6회 세척하였다. ECL 용액(Bio-rad)을 사용하여 현상하였다.Specifically, serum samples of normal subjects (N1 to N7) and patients with cardiovascular disease (T and P groups) were vortexed immediately and centrifuged (Hanil centrifuge model MICRO 17TR) at 4 ° C for 30 minutes at 13,000 rpm . The supernatant was mixed with the RIPA buffer and the sample loading buffer at a ratio of 1: 1: 1, and a protein sample was prepared. Then, 5 μl of the protein sample was loaded on a 12% SDS PAGE gel. After electrophoresis, blue staining of the comas was carried out overnight and washed 10 times with destaining buffer for 20 minutes each. 5 μl of each well was loaded onto a 12% SDS PAGE gel and electrophoresed at 80 V for 2 hours using a Bio-rad Mini-PROTEAN Tetra system. After electrophoresis, the gel was transferred to the PVDF membrane at 250 V for 2 hours using hopper TE22 (hoefer TE22). The transferred membrane was blocked with 5% skimmed milk for 1 hour, and the primary antibodies paralemmin (santacruz, sc-365869), C1 (santacruz, sc-61750), transferrin (transferrin) (abcam, ab1223) and CYB5D2 (santacruz, sc-136639) for 2 hours and washed three times for 5 minutes with PBS-T. The secondary antibody, mouse-HRP IgG, was diluted 1: 6000, incubated for 40 minutes, and washed 6 times with PBS-T for 10 minutes each. ECL solution (Bio-rad).
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 파랄레민 1은 정상인에 비해 심근경색증이 유도된 심혈관 질환 환자에서 증가함을 확인하였다. 반면에 트랜스페린 수용체(transferrin receptor), CYB5D2 및 CHMP4A는 정상인에 비해 심근경색증이 유도된 심혈관 질환 환자에서 감소함을 확인하였다(도 5).
As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that
<< 실험예Experimental Example 4> 심혈관 질환 환자의 혈청으로부터 기존 4> From the serum of patients with cardiovascular disease 마커와Marker 파랄레민( Paralymine ( ParalemminParalemmin ) 단백질 패턴 비교 분석) Protein pattern comparative analysis
심혈관 질환 환자의 혈청으로부터 기존 마커(CK-MB 및 Troponin T)와 파랄레민(Paralemmin) 단백질 패턴을 조사하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.To investigate the patterns of existing markers (CK-MB and Troponin T) and paralemmin protein from serum of cardiovascular patients, the following experiment was conducted.
구체적으로, 심혈관 질환 환자의 혈청 단백질 샘플들 중 차별적인 발현패턴을 나타내는 그룹을 묶어 상기 <실험예 3>의 동일한 방법으로 전기영동 및 웨스턴 블랏하였다. 또한, 파랄레민 웨스턴 블랏 데이타와 비교해 동일한 샘플에서 CK-MB 및 Troponin T 에 대한 ELISA를 수행하기 위하여, CK-MB 및 Troponin T에 대한 단일클론 항체(1 ㎍/㎖)를 0.1M 카보네이트 버퍼(carbonate buffer, pH 9.6)로 1 ㎍/㎖의 농도가 되도록 희석하고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 100 ㎕씩 분주하였다. 4℃에서 상기 CK-MB 및 Troponin T 단일클론 항체로 밤 사이 코팅한 후 0.05% 트윈-20(tween-20)이 포함된 PBS-T를 이용하여 3회 세척하였다. 1% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 차단한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 상기 샘플의 항원을 희석하여 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 2시간 동안 반응시키고 PBS-T 용액으로 3회 세척하였다. CK-MB 및 Troponin T 단백질에 대한 다클론 항체(1:1000 희석)를 100㎕씩 희석한 후 2시간 동안 반응시키고 세척하였다. 이후, 1000배 희석된 호오스 래디시 퍼옥시다아제(HRP)가 접합된 2차 항체 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응시키고 3회 세척하고, 마지막으로 OPD용액을 이용하여 발색시켰다. 490nm 파장에서 발색된 샘플의 흡광도를 측정기(ELISA reader, Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.Specifically, groups showing different expression patterns among serum protein samples of cardiovascular disease patients were grouped and subjected to electrophoresis and Western blotting in the same manner as in Experimental Example 3 above. To perform ELISA on CK-MB and Troponin T in the same sample as compared to paralimumine Western blot data, monoclonal antibodies (1 mu g / ml) against CK-MB and Troponin T were dissolved in 0.1 M carbonate buffer buffer, pH 9.6) to a concentration of 1 / / ml, and 100 쨉 l was dispensed into a 96-well microtiter plate. The cells were coated with the CK-MB and Troponin T monoclonal antibodies overnight at 4 ° C. and washed three times with PBS-T containing 0.05% tween-20. After blocking with 1% BSA solution at room temperature for 2 hours, it was washed 3 times with PBS-T solution. The antigen of the sample was diluted and 100 를 was added, followed by reaction at room temperature for 2 hours and washing with PBS-T solution three times. Polyclonal antibody (1: 1000 dilution) to CK-MB and Troponin T protein was diluted by 100 μl, reacted for 2 hours and washed. Then, 100 쨉 l of secondary antibody conjugated with 1,000-fold diluted horseradish peroxidase (HRP) was added thereto, reacted at room temperature for 1 hour, washed three times, and finally developed with OPD solution. The absorbance of a sample developed at a wavelength of 490 nm was measured using an analyzer (ELISA reader, Molecular Device, Sunnyvale, Calif., USA).
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이 기존의 마커인 CK-MB 및 Troponin T은 심혈관 질환 환자에서 정상인에 비해 증가함을 확인하였다(도 6). 그룹별의 CK-MB의 발현패턴은 저농도에서 고농도로 증가함에 따라 Troponin-T 발현패턴dl 유사함을 확인하였다(도 6 및 도 7). 또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 심혈관 마커인 파랄레민(paralemmin)은 기존의 심혈관 질환 마커인 CK-MB 및 Troponin T의 유사한 발현 패턴을 나타냄을 확인함으로써 신규한 심혈관 질환 마커로서 사용될수 있음을 확인하였다(도 8).
As a result, as shown in FIG. 6 and FIG. 7, it was confirmed that the existing markers CK-MB and Troponin T were increased in patients with cardiovascular disease compared with normal individuals (FIG. 6). The expression pattern of CK-MB in each group was similar to that of the Troponin-T expression pattern dl as the concentration was increased from low to high (FIGS. 6 and 7). 8, paralemmin, a novel cardiovascular marker of the present invention, was identified as a novel cardiovascular disease marker by confirming similar expression patterns of the existing cardiovascular disease markers CK-MB and Troponin T (Fig. 8).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Paralemmin as a marker of cardiovascular disorders and cardiovascular disorders diagnostic kit using thereof <130> 2014P-07-052 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 387 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Val Leu Ala Ala Glu Thr Thr Ser Gln Gln Glu Arg Leu Gln 1 5 10 15 Ala Ile Ala Glu Lys Arg Lys Arg Gln Ala Glu Ile Glu Asn Lys Arg 20 25 30 Arg Gln Leu Glu Asp Glu Arg Arg Gln Leu Gln His Leu Lys Ser Lys 35 40 45 Ala Leu Arg Glu Arg Trp Leu Leu Glu Gly Thr Pro Ser Ser Ala Ser 50 55 60 Glu Gly Asp Glu Asp Leu Arg Arg Gln Met Gln Asp Asp Glu Gln Lys 65 70 75 80 Thr Arg Leu Leu Glu Asp Ser Val Ser Arg Leu Glu Lys Glu Ile Glu 85 90 95 Val Leu Glu Arg Gly Asp Ser Ala Pro Ala Ala Ala Lys Glu Asn Ala 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Pro Val Arg Ala Pro Ala Pro Ser Pro Ala Lys Glu 115 120 125 Glu Arg Lys Thr Glu Val Val Met Asn Ser Gln Gln Thr Pro Val Gly 130 135 140 Thr Pro Lys Asp Lys Arg Val Ser Asn Thr Pro Leu Arg Thr Val Asp 145 150 155 160 Gly Ser Pro Met Met Lys Ala Ala Met Tyr Ser Val Glu Ile Thr Val 165 170 175 Glu Lys Asp Lys Val Thr Gly Glu Thr Arg Val Leu Ser Ser Thr Thr 180 185 190 Leu Leu Pro Arg Gln Pro Leu Pro Leu Gly Ile Lys Val Tyr Glu Asp 195 200 205 Glu Thr Lys Val Val His Ala Val Asp Gly Thr Ala Glu Asn Gly Ile 210 215 220 His Pro Leu Ser Ser Ser Glu Val Asp Glu Leu Ile His Lys Ala Asp 225 230 235 240 Glu Val Thr Leu Ser Glu Ala Gly Ser Thr Ala Gly Ala Ala Glu Thr 245 250 255 Arg Gly Ala Val Glu Gly Ala Ala Arg Thr Thr Pro Ser Arg Arg Glu 260 265 270 Ile Thr Gly Val Gln Ala Gln Pro Gly Glu Ala Thr Ser Gly Pro Pro 275 280 285 Gly Ile Gln Pro Gly Gln Glu Pro Pro Val Thr Met Ile Phe Met Gly 290 295 300 Tyr Gln Asn Val Glu Asp Glu Ala Glu Thr Lys Lys Val Leu Gly Leu 305 310 315 320 Gln Asp Thr Ile Thr Ala Glu Leu Val Val Ile Glu Asp Ala Ala Glu 325 330 335 Pro Lys Glu Pro Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Pro Thr 340 345 350 Glu Ala Ala Ser Arg Glu Glu Asn Gln Ala Gly Pro Glu Ala Thr Thr 355 360 365 Ser Asp Pro Gln Asp Leu Asp Met Lys Lys His Arg Cys Lys Cys Cys 370 375 380 Ser Ile Met 385 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Paralemmin as a marker of cardiovascular disorders and cardiovascular disorders diagnostic kit using <130> 2014P-07-052 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 387 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Val Leu Ala Ala Glu Thr Thr Ser Gln Gln Glu Arg Leu Gln 1 5 10 15 Ala Ile Ala Glu Lys Arg Lys Arg Gln Ala Glu Ile Glu Asn Lys Arg 20 25 30 Arg Gln Leu Glu Asp Glu Arg Arg Gln Leu Gln His Leu Lys Ser Lys 35 40 45 Ala Leu Arg Glu Arg Trp Leu Leu Glu Gly Thr Pro Ser Ser Ala Ser 50 55 60 Glu Asp Glu Asp Leu Arg Arg Gln Met Gln Asp Asp Glu Gln Lys 65 70 75 80 Thr Arg Leu Leu Glu Asp Ser Val Ser Arg Leu Glu Lys Glu Ile Glu 85 90 95 Val Leu Glu Arg Gly Asp Ser Ala Pro Ala Ala Ala Lys Glu Asn Ala 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Pro Val Ala Pro Ala Pro Ser Ala Lys Glu 115 120 125 Glu Arg Lys Thr Glu Val Val Met Asn Ser Gln Gln Thr Pro Val Gly 130 135 140 Thr Pro Lys Asp Lys Arg Val Ser Asn Thr Pro Leu Arg Thr Val Asp 145 150 155 160 Gly Ser Pro Met Met Lys Ala Met Tyr Ser Val Glu Ile Thr Val 165 170 175 Glu Lys Asp Lys Val Thr Gly Glu Thr Arg Val Leu Ser Ser Thr Thr 180 185 190 Leu Leu Pro Arg Gln Pro Leu Pro Leu Gly Ile Lys Val Tyr Glu Asp 195 200 205 Glu Thr Lys Val Val His Ala Val Asp Gly Thr Ala Glu Asn Gly Ile 210 215 220 His Pro Leu Ser Ser Ser Glu Val Asp Glu Leu Ile His Lys Ala Asp 225 230 235 240 Glu Val Thr Leu Ser Glu Ala Gly Ser Thr Ala Gly Ala Ala Glu Thr 245 250 255 Arg Gly Ala Val Glu Gly Ala Ala Arg Thr Thr Pro Ser Arg Arg Glu 260 265 270 Ile Thr Gly Val Gln Ala Gln Pro Gly Glu Ala Thr Ser Gly Pro Pro 275 280 285 Gly Ile Gln Pro Gly Gln Glu Pro Pro Val Thr Met Ile Phe Met Gly 290 295 300 Tyr Gln Asn Val Glu Asp Glu Ala Glu Thr Lys Lys Val Leu Gly Leu 305 310 315 320 Gln Asp Thr Ile Thr Ala Glu Leu Val Val Ile Glu Asp Ala Ala Glu 325 330 335 Pro Lys Glu Pro Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Pro Thr 340 345 350 Glu Ala Ala Ser Arg Glu Glu Asn Gln Ala Gly Pro Glu Ala Thr Thr 355 360 365 Ser Asp Pro Gln Asp Leu Asp Met Lys Lys His Arg Cys Lys Cys Cys 370 375 380 Ser Ile Met 385
Claims (15)
A kit for diagnosing myocardial infarction comprising an antibody specifically binding to Paralemmin consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 whose expression level increases in a cardiovascular disease patient.
The kit for diagnosing myocardial infarction according to claim 1, wherein the antibody is bound to a solid substrate.
4. The kit for diagnosing myocardial infarction according to claim 3, wherein the solid substrate is selected from the group consisting of synthetic resin, nitrocellulose, glass substrate, glass fiber, microspheres and micro beads.
The kit for diagnosing myocardial infarction according to claim 1, wherein the antibody is bound to a chromogenic enzyme, a chromogenic material, or a fluorescent molecule.
[Claim 5] The kit for diagnosing myocardial infarction according to claim 5, wherein the chromogenic enzyme is HRP (horseradish peroxidase) or alkaline phosphatase.
The kit for diagnosing myocardial infarction according to claim 5, wherein the coloring material is a colloidal gold.
6. The kit for diagnosing myocardial infarction according to claim 5, wherein the fluorescent molecule is FITC (poly-L-lysine-fluorescein isothiocyanate) or RITC (rhodamine-B-isothiocyanate).
6. The kit for diagnosing myocardial infarction according to claim 5, wherein the antibody is bound to a ligand.
10. The kit for diagnosing myocardial infarction according to claim 9, wherein the ligand is a biotin derivative having essentially the same binding action as biotin, or avidin or streptavidin.
[Claim 11] The kit for diagnosing myocardial infarction according to claim 9, wherein the ligand further comprises a visualizing conjugate having a chromogenic enzyme, a chromogenic substance or a fluorescent molecule bound to a specific binding molecule.
2) 상기 단계 1)의 단백질의 발현량이 정상 대조군과 비교하여 높은 개체를 선별하는 단계를 포함하는 심근경색증 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
1) measuring the expression level of Paralemmin from a separate sample of the patient; And
2) a step of selecting an individual having a higher expression level of the protein in the step 1) than in a normal control group to provide information on diagnosis of myocardial infarction.
14. The protein detection method according to claim 13, wherein the sample of step 1) is any one selected from the group consisting of blood, serum, plasma or tissue.
[14] The method of claim 13, wherein the measurement of step 1) is performed using two-dimensional electrophoresis, a biochip, or an antibody capable of specifically binding to the protein.
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