RU2477314C1 - RECOMBINANT PLASMID pSM-ZsGreen, CODING HUMAN PROTEINS SOX2 AND C-MYC AND FLUORESCENT PROTEIN ZsGreen, INTENDED TO PRODUCE INDUCED PLURIPOTENT HUMAN STEM CELLS - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: recombinant plasmid pSM-ZsGreen is proposed, which codes human proteins SOX2 and C-MYC and a fluorescent protein ZsGreen, intended for temporary or permanent expression of genes SOX2, C-MYC and ZsGreen in human cultivated cells and providing for stable expression of the introduced gene.

EFFECT: recombinant plasmid may be used as a vector for production of induced pluripotent human stem cells.

1 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии и может быть использовано для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.The invention relates to the field of genetic engineering, molecular and cellular biology, biotechnology and can be used to produce induced pluripotent human stem cells.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) - это тип стволовых клеток, которые могут быть получены из соматических клеток животных и человека в результате повышенной экспрессии набора определенных генов [1-3]. Для получения ИПСК человека и животных успешно используется сверхэкспрессия таких генов как OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC [2]. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a type of stem cells that can be obtained from somatic cells of animals and humans as a result of increased expression of a set of specific genes [1-3]. Overexpression of genes such as OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC has been successfully used to obtain human and animal iPSCs [2].

Известно, что для получения большинства новых линий ИПСК в настоящий момент используют генетические конструкции, полученные на основе ретро- и лентивирусных векторов. Этот метод характеризуется тем, что происходит случайное встраивание ДНК-копий геномов ретро- или лентивирусов в геномы клеток, что в свою очередь может приводить к нарушению функционирования генов [4]. It is known that to obtain the majority of new iPSC lines, genetic constructs based on retro- and lentiviral vectors are currently used. This method is characterized by the fact that there is an accidental insertion of DNA copies of the genomes of retro- or lentiviruses into the genomes of cells, which in turn can lead to disruption of the functioning of genes [4].

Для полномасштабного применения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях, таких как скрининг новых лекарственных веществ, исследования в области токсикологии и регенеративной медицины, необходимо решение ряда проблем. Во-первых, необходима разработка методов получения ИПСК без генетической модификации их геномов. Во-вторых, способ получения ИПСК должен быть достаточно эффективным. For the full use of induced pluripotent stem cells in basic and applied research, such as screening for new drugs, studies in the field of toxicology and regenerative medicine, a number of problems need to be addressed. First, the development of methods for obtaining iPSCs without the genetic modification of their genomes is necessary. Secondly, the method of obtaining iPSCs should be quite effective.

Известно, что плазмидные векторы (плазмиды) могут временно существовать в ядрах клеток, обеспечивая стабильную транскрипцию нуклеотидных последовательностей, находящихся под контролем конститутивных промоторов. Кроме того, известен метод, основанный на использовании специфических последовательностей - 2А-пептидов, позволяющий получать генетические конструкции, обеспечивающие трансляцию нескольких полипептидов (белков) с одной молекулы матричной РНК [5].It is known that plasmid vectors (plasmids) can temporarily exist in the nuclei of cells, providing stable transcription of nucleotide sequences under the control of constitutive promoters. In addition, a method based on the use of specific sequences — 2A peptides — is known that allows one to obtain genetic constructs that ensure translation of several polypeptides (proteins) from one molecule of messenger RNA [5].

Задачей данного изобретения является конструирование полицистронной неинтегрирующейся плазмидной конструкции, кодирующей белки SOX2 и C-MYC человека и флуоресцентный белок ZsGreen, обеспечивающей одновременную трансляцию данных белков и являющейся вектором при получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Белки SOX2 и C-MYC необходимы для запуска репрограммирования клеток, а флуоресцентный белок ZsGreen служит маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК. The objective of the invention is the construction of a polycistronic non-integrating plasmid construct encoding human SOX2 and C-MYC proteins and ZsGreen fluorescent protein, which provides simultaneous translation of these proteins and is a vector for the production of induced pluripotent stem cells. Proteins SOX2 and C-MYC are needed to trigger cell reprogramming, and the fluorescent ZsGreen protein serves as a marker for cell transfection and subsequent elimination of plasmid DNA.

Реализация изобретения осуществляется следующим образом.The implementation of the invention is as follows.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК выполняют на основе плазмиды pIRES (Clontech) и включает следующие стадии:The construction of recombinant plasmid DNA is performed on the basis of the plasmid pIRES (Clontech) and includes the following steps:

1. Выделяют РНК из клеток известной линии эмбриональных стволовых клеток человека HUES9 [6], и производят синтез кДНК с помощью олиго-(dT) праймеров. Полученную кДНК используют в качестве матрицы для синтеза фрагментов, кодирующих белки;1. RNA is isolated from cells of the known human embryonic stem cell line HUES9 [6], and cDNA is synthesized using oligo- (dT) primers. The obtained cDNA is used as a matrix for the synthesis of fragments encoding proteins;

2. Синтез фрагмента кДНК гена SOX2 -позиции в мРНК 428-1379- (Homo sapiens SRY (sex determining region Y)-box 2) человека, (регистрационный номер в GeneBank NM_003106.2), размером 1023 пар нуклеотидов, содержащего на 3'-конце последовательность P2A-пептида (SOX2-P2A). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hSOX2 5' XbaI 5'-TTTAGTGTCTAGAATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTG-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Xba I) и hSOX2 P2A 3'5'-TTCTCTTCGACATCCCCTGCTTGTTTCAACAGGGAGAAGTTAGTGGCTCCGCTTCCGGACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATG-3' (обратный праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид P2A);2. Synthesis of a cDNA fragment of the SOX2 gene of the position in mRNA 428-1379- (Homo sapiens SRY (sex determining region Y) -box 2) of a person (registration number in GeneBank NM_003106.2), size 1023 nucleotides containing 3 ' -terminal sequence of the P2A peptide (SOX2-P2A). Synthesis was carried out by polymerase chain reaction with primers: hSOX2 5 'XbaI 5'-TTTAGTGTCTAGAATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTG-3' (forward primer contains an artificially introduced restriction endonuclease site Xba I) and hSOX2 P2A 3'5'-TTCTCTTCGACATCCCCTGCTTGTTTCAACAGGGAGAAGTTAGTGGCTCCGCTTCCGGACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGCCGTTAATG-3 '(reverse primer, containing a nucleotide sequence encoding a peptide P2A);

3. Синтез фрагмента кДНК гена c-MYC -позиции в мРНК 571-1891- (Homo sapiens v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)) (регистрационный номер в GeneBank NM_002467.4) размером 1397 пар нуклеотидов, содержащего на 5'-конце последовательность P2A-пептида (P2A-c-MYC). Синтез проводят с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами: hcMYC P2A 5' 5'- GCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAAC-3' (прямой праймер, содержащий нуклеотидную последовательность кодирующую пептид P2A) и hcMYC 3' SalI 5'- TTTAGCAGTGGTACGTCGACTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTC-3' (прямой праймер, содержит искусственно введенный сайт эндонуклеазы рестрикции Sal I);3. Synthesis of a cDNA fragment of the c-MYC gene gene in mRNA 571-1891- (Homo sapiens v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)) (registration number in GeneBank NM_002467.4) with a size of 1397 nucleotides containing 5'- end of the sequence of the P2A peptide (P2A-c-MYC). Synthesis was carried out by polymerase chain reaction with primers: hcMYC P2A 5 '5'- GCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCAATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAAC-3' (forward primer comprising a nucleotide sequence encoding a peptide P2A) hcMYC and 3 'SalI 5'- TTTAGCAGTGGTACGTCGACTTACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTC-3' (forward primer comprises artificially the introduced restriction endonuclease site Sal I);

4. Объединение фрагментов SOX2-P2A и P2A-c-MYC осуществляют методом полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матриц перекрывающихся фрагментов SOX2-P2A и P2A-c-MYC, а также праймеров hSOX2 5'XbaI и hcMYC 3' SalI. В результате получают фрагмент SOX2-P2A-c-MYC, размером 2373 пар нуклеотидов;4. The combination of SOX2-P2A and P2A-c-MYC fragments is carried out by the polymerase chain reaction method using SOX2-P2A and P2A-c-MYC fragments as overlapping matrices, as well as hSOX2 5'XbaI and hcMYC 3 'SalI primers. The result is a fragment of SOX2-P2A-c-MYC, the size of 2373 pairs of nucleotides;

5. Фрагмент ДНК, кодирующий белок ZsGreen, вырезают из плазмиды pZsGreen (Clontech) эндонуклеазой рестрикции Xba I и клонируют в сайт Xba I, находящийся в полилинкере B плазмиды pIRES (Clontech). В результате получена плазмида pIRES-ZsGreen.5. The DNA fragment encoding the ZsGreen protein is excised from the pZsGreen plasmid (Clontech) with the Xba I restriction endonuclease and cloned into the Xba I site located in the polylinker B of the pIRES plasmid (Clontech). The resulting plasmid pIRES-ZsGreen.

6.Фрагмент ДНК SOX2-P2A-c-MYC клонируют с помощью набора реагентов pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) и штамма E.coli XL-10 Gold;6. The DNA fragment SOX2-P2A-c-MYC was cloned using the pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) reagent kit and E. coli XL-10 Gold strain;

7. Клоны плазмиды pGEM-T Easy со встройками pGEM-SOX2-P2A-c-MYC последовательности выделяют стандартным методом щелочного лизиса (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory Press);7. Clones of the pGEM-T Easy plasmid with pGEM-SOX2-P2A-c-MYC insertions are isolated by standard alkaline lysis (Maniatis, T., Fritsch, EF and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory Press);

8. Фрагмент SOX2-P2A-c-MYC вырезают из плазмиды pGEM-SOX2-P2A-c-MYC с помощью эндонуклеаз рестрикции Spe I и EcoR I и лигируют с плазмидой pIRES-ZsGreen, гидролизованной эндонуклеазами рестрикции Nhe I и EcoR I, сайты которых расположены в полилинкере А - эндонуклеазы рестрикции Spe I и Nhe I имеют совместимые липкие концы. 8. The SOX2-P2A-c-MYC fragment was excised from the plasmid pGEM-SOX2-P2A-c-MYC using the Spe I and EcoR I restriction endonucleases and ligated with the pIRES-ZsGreen plasmid hydrolyzed by the restriction endonucleases Nhe I and EcoR I, whose sites located in polylinker A - restriction endonucleases Spe I and Nhe I have compatible sticky ends.

В результате получена плазмида pSM-ZsGreen размером 9204 п.н. (SM= SOX2, c-MYC).As a result, the pSM-ZsGreen plasmid of size 9204 bp was obtained. (SM = SOX2, c-MYC).

На чертеже изображена карта плазмидной генетической конструкции pSM-ZsGreen. Фрагмент ДНК, кодирующий белки SOX2 и C-MYC, встроен между сайтами Nhe I и EcoR I в полилинкер А плазмиды pIRES, а ДНК, кодирующая ZsGreen, встроена в сайт Xba I полилинкера В плазмиды pIRES. The drawing shows a map of the plasmid genetic construct pSM-ZsGreen. The DNA fragment encoding the SOX2 and C-MYC proteins is inserted between the Nhe I and Eco R I sites in the polylinker A of the pIRES plasmid, and the DNA encoding ZsGreen is inserted into the Xba I site of the polylinker B of the pIRES plasmid.

Описание и позиции в нуклеотидной последовательности (п.н., пара нуклеотидов) функциональных элементов генетической плазмидной конструкции pSM-ZsGreen представлены в таблице 1.The description and positions in the nucleotide sequence (bp, a pair of nucleotides) of the functional elements of the genetic plasmid construct pSM-ZsGreen are presented in table 1.

Таблица 1Table 1 Элемент плазмидной генетической конструкцииElement of plasmid genetic construct Позиции в последовательности конструкции, п.н.Positions in the sequence of construction, bp p CMV IE - энхансер/промотор цитомегаловирусаp CMV IE - cytomegalovirus enhancer / promoter 1-7501-750 IVS - интронIVS - Intron 890-1022890-1022 Промотор РНК-полимеразы T7T7 RNA polymerase promoter 1067-10851067-1085 Фрагмент ДНК SOX2-P2A-c-MYCDNA fragment SOX2-P2A-c-MYC 1085-34451085-3445 IRES - внутренний сайт посадки рибосомIRES - internal ribosome landing site 3474-40553474-4055 ZsGreen - кДНК гена ZsGreenZsGreen - cDNA of the ZsGreen gene 4078-48224078-4822 Промотор РНК-полимеразы T3T3 RNA Polymerase Promoter 4968-48904968-4890 SV40 poly A - фрагмент, содержащий сигнал полиаденилирования мРНК вируса SV40 SV40 poly A — fragment containing the SV40 mRNA polyadenylation signal 4967-51894967-5189 Ориджин репликации f1Origin replication f1 5285-57415285-5741 p SV40 - энхансер/ранний промотор вируса SV40p SV40 - enhancer / early promoter of the SV40 virus 5806-62245806-6224 SV40 ori - ориджин репликации вируса SV40SV40 ori - origin of SV40 virus replication 6122-61886122-6188 Neo-r - ген устойчивости к неомицинуNeo-r - neomycin resistance gene 6269-70646269-7064 Синтетический сигнал полиаденилированияSynthetic polyadenylation signal 7129-71787129-7178 Amp-r - ген устойчивости к ампициллинуAmp-r - ampicillin resistance gene 7590-84517590-8451

Полученная плазмидная генетическая конструкция pSM-ZsGreen построена на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов SOX2 и c-MYC человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей P2A-пептид и кДНК гена, кодирующего флуоресцентный белок ZsGreen. The obtained pSM-ZsGreen plasmid genetic construct was constructed on the basis of the pIRES plasmid vector (Clontech), in which cDNA fragments of the human SOX2 and c-MYC genes were connected, connected by the nucleotide sequence encoding the P2A peptide and the cDNA of the gene encoding the ZsGreen fluorescent protein.

Транскрипция единой мРНК SOX2-P2A-c-MYC-IRES-ZsGreen осуществляется с конститутивного промотора p CMV IE, обеспечивающего высокий уровень наработки мРНК. Наличие последовательностей P2A и IRES позволяет одновременно транслировать белки SOX2, C-MYC и ZsGreen с одной молекулы мРНК. Transcription of a single SOX2-P2A-c-MYC-IRES-ZsGreen mRNA is carried out from the constitutive promoter p CMV IE, which provides a high level of mRNA production. The presence of P2A and IRES sequences allows simultaneous translation of SOX2, C-MYC and ZsGreen proteins from one mRNA molecule.

Фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок ZsGreen, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК. The DNA fragment encoding the ZsGreen fluorescent protein is a marker for cell transfection and subsequent elimination of plasmid DNA.

Плазмидная генетическая конструкция pSM-ZsGreen предназначена для временной или постоянной экспрессии генов SOX2, C-MYC и ZsGreen в культивируемых клетках человека и обеспечивает стабильную экспрессию введенного гена.The plasmid genetic construct pSM-ZsGreen is designed for temporary or permanent expression of the SOX2, C-MYC and ZsGreen genes in cultured human cells and ensures stable expression of the introduced gene.

Рекомбинантная плазмида pSM-ZsGreen может использоваться в качестве вектора для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.The recombinant plasmid pSM-ZsGreen can be used as a vector to obtain induced human pluripotent stem cells.

Список использованной литературыList of references

1. Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic1. Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic

and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126(4): p. 663-76.    and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126 (4): p. 663-76.

2. Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by2. Takahashi, K., et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by

defined factors. Cell, 2007. 131(5): p. 861-72.    defined factors. Cell, 2007.131 (5): p. 861-72.

3. Yu, J., et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318(5858): p. 1917-20.3. Yu, J., et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318 (5858): p. 1917-20.

4. Okita, K., et al., Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.4. Okita, K., et al., Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.

Science, 2008. 322(5903): p. 949-53.    Science, 2008. 322 (5903): p. 949-53.

5. Szymczak, A.L. and Vignali, D.A., Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther, 2005. 5(5): p. 627-38.5. Szymczak, A.L. and Vignali, D.A., Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther, 2005.5 (5): p. 627-38.

6. Cowan, C.A., et al., Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med, 2004. 350(13): p. 1353-6.6. Cowan, C. A., et al., Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med, 2004.350 (13): p. 1353-6.

Claims (3)

1. Рекомбинантная плазмида pSM-ZsGreen, кодирующая белки SOX2 и С-MYC человека и флуоресцентный белок ZsGreen, предназначенная для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, представляющая собой генетическую конструкцию на основе плазмиды pIRES, содержащая следующие конструктивные элементы: фрагмент ДНК, кодирующий белки SOX2 и C-MYC человека, включающий последовательность, кодирующую Р2А, расположенную между последовательностями SOX2 и C-MYC, встроен между сайтами рестрикции NheI и EcoRI в полилинкер А плазмиды pIRES, размер встройки 2360 пар нуклеотидов, и фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок ZsGreen, встроенный в сайт Xba I полилинкера В плазмиды pIRES; транскрипция полицистронной мРНК SOX2-P2A-C-MYC-IRES- ZsGreen осуществляется с конструктивного промотора pCMV IE.1. Recombinant plasmid pSM-ZsGreen, encoding human SOX2 and C-MYC proteins and fluorescent protein ZsGreen, designed to produce induced pluripotent human stem cells, which is a genetic construct based on pIRES plasmid containing the following structural elements: DNA fragment encoding SOX2 proteins and human C-MYC, including a P2A coding sequence located between the SOX2 and C-MYC sequences, inserted between the NheI and EcoRI restriction sites in the polylinker A of the pIRES plasmid, insertion size 2360 pairs ukleotidov and a DNA fragment encoding the fluorescent protein ZsGreen, built into Xba I site in the polylinker of the plasmid pIRES; the transcription of polycistronic mRNA SOX2-P2A-C-MYC-IRES-ZsGreen is carried out from the pCMV IE constructive promoter. 2. Рекомбинантная плазмида pSM-ZsGreen по п.1, где разделение последовательностей элементами Р2А и IRES позволяет экспрессировать три белка с одной плазмиды одновременно.2. The recombinant plasmid pSM-ZsGreen according to claim 1, where the separation of the sequences by P2A and IRES elements allows the expression of three proteins from one plasmid at a time. 3. Рекомбинантная плазмида pSM-ZsGreen по п.1, где фрагмент ДНК, кодирующий белки SOX2 и C-MYC человека, запускает репрограммирование клеток для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, а фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок ZsGreen, является маркером трансфекции клеток и последующей элиминации плазмидной ДНК. 3. The recombinant plasmid pSM-ZsGreen according to claim 1, where the DNA fragment encoding the human SOX2 and C-MYC proteins triggers cell reprogramming to produce induced human pluripotent stem cells, and the DNA fragment encoding the ZsGreen fluorescent protein is a marker for cell transfection and subsequent elimination of plasmid DNA.