RU2425890C2 - Method of marking human 7th chromosome in metaphasic and interphasic cells - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: what is offered is a method of marking a human 7th chromosome providing in situ hybridisation of metaphasic or interphasic cell chromosomes of a tested sample and a DNA probe presented by a marker plasmid alpha R1-13 which consists of EcoR 1-EcoR l DNA fragment of a pBR 325 vector of the value 5966 base pairs and EcoRl-EcoRl alphoid DNA fragment of the human 7th chromosome of the value 680 base pairs. The testing environment in which the used DNA-probe specifically interacts with a centromeric region of the 7th chromosome without cross hybridisation with other human chromosomes are developed.

EFFECT: more efficient identification of the presented chromosome and enabled application of the new method in medical diagnostics.

4 ex

Description

Изобретение относится к медицинской генетике, в частности к области медико-генетического консультирования и лабораторной диагностики хромосомных болезней, и может быть использовано для достоверной идентификации 7-ой хромосомы человека в норме и патологии, включая преимплантационную, пренатальную и постнатальную диагностику различных форм структурных хромосомных аномалий с вовлечением 7-ой хромосомы, анеуплоидии, кольцевых и добавочных маркерных хромосом с использованием культивируемых или некультивируемых клеток человека.The invention relates to medical genetics, in particular to the field of medical genetic counseling and laboratory diagnosis of chromosomal diseases, and can be used for reliable identification of the 7th human chromosome in norm and pathology, including preimplantation, prenatal and postnatal diagnosis of various forms of structural chromosomal abnormalities involvement of the 7th chromosome, aneuploidy, ring and additional marker chromosomes using cultured or uncultured human cells.

Целью изобретения является разработка эффективного способа маркирования 7-ой хромосомы человека в метафазных и интерфазных клетках с использованием оригинального молекулярно-генетического маркера, специфичного для центромерного района 7-ой хромосомы человека, включая гетерохроматин обоих плеч, который обладает следующими преимуществами для ускорения и повышения точности способа:The aim of the invention is to develop an effective method for marking the 7th human chromosome in metaphase and interphase cells using an original molecular genetic marker specific for the centromeric region of the 7th human chromosome, including heterochromatin of both shoulders, which has the following advantages for speeding up and increasing the accuracy of the method :

1. При применении специфических условий гибридизации in situ и пост-гибридизационной отмывки цитологических препаратов строго маркировал околоцентромерный район 7-ой хромосомы без перекрестной гибридизации с другими хромосомами.1. When applying specific in situ hybridization conditions and post-hybridization washing of cytological preparations, the near-centromeric region of the 7th chromosome was strictly marked without cross-hybridization with other chromosomes.

2. Эффективно маркировал центромерный район 7-ой хромосомы в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например клеток опухолей.2. Effectively marked the centromeric region of the 7th chromosome in interphase nuclei to identify numerical chromosome aberrations, which is necessary for karyological analysis of non-dividing cells, such as tumor cells.

Сущность изобретения заключается в том, что оригинальный клонированный фрагмент альфоидной ДНК, маркирующий центромерный район 7-ой хромосомы человека, используется в качестве ДНК-зонда для дифференциального выявления 7-ой хромосомы в специфических условиях проведения гибридизации in situ, позволяя быстро и надежно определять число хромосом 7 в интерфазных ядрах или метафазных клетках человека.The essence of the invention lies in the fact that the original cloned fragment of alphaoid DNA, marking the centromeric region of the 7th chromosome of a person, is used as a DNA probe for differential detection of the 7th chromosome under specific in situ hybridization conditions, making it possible to quickly and reliably determine the number of chromosomes 7 in interphase nuclei or metaphase cells of a person.

Известно, что к настоящему моменту клонированы и охарактеризованы ДНК зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК зондов чаще всего используют уникальные (однокопийные или малокопийные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомоспецифичные ДНК зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократно повторяющиеся от нескольких сотен до несколько тысяч раз относительно короткие (длиной до 170 пар нуклеотидов) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом 1, 3, 4, 6, 9, 11, 13, 18, 21 и X человека (Гиндилис и др., 1985, №1203108; Юров и др., 1989, №1494724; Юров и др., 1993, №1792429; Юров и др., 1997, №2087533; Соловьев и др., 1997, №2087534, Юров и др., 2000, №2161199; Юров и др., 2005, №2265060, Юров и др., 2008, №2325441). Остается актуальной задача получения ДНК зондов для эффективного, маркирования остальных хромосом человека. В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипа предлагаемой для использования в данном изобретении рекомбинантной плазмиды. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые имеются в 7-ой хромосоме (Product catalogue Vysis FISH probes "Abbott Molecular Diagnostics", www.abbottmolecular.com). Эти ДНК зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения их конструирования для маркирования 7-ой хромосомы человека в прикладных работах, в частности, для диагностики хромосомных аномалий в онкологии и медицинской генетике. При этом все описанные в литературе способы маркирования 7-ой хромосомы в метафазных и интерфазных клетках и использованием рекомбинантных плазмид, содержащих альфа-сателлитную ДНК, не обладают достаточно высокой специфичностью для центромерных районов хромосомы 7, и, следовательно, предназначены для лабораторных исследований, а не для диагностики хромосомный патологии при проведении медико-генетического консультирования. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуется корректная идентификация аномалий хромосом и последующее медико-генетическое консультирование или пренатальная диагностика с возможным прерыванием беременности вследствии аберраций 7-ой хромосомы. Актуальным для молекулярно-цитогенетической диагностики является разработка способов эффективного выявления хромосом и конструирование оригинальных маркеров для центромерного района 7-ой хромосомы человека, которые позволили бы проводить идентификацию центромерных районов в интерфазных и метафазных клетках.It is known that, to date, DNA probes for various human chromosomes have been cloned and characterized. However, unique (single-copy or small-copy DNA sequences) are most often used as DNA probes, which do not allow efficient molecular-cytogenetic diagnostics due to the low resolution of modern cytogenetic methods. An exception is chromosome-specific DNA probes containing repeating (multi-copy) DNA sequences. These include satellite (alpha and classical satellites) DNA, which are repeatedly repeated from several hundred to several thousand times relatively short (up to 170 nucleotide pairs) DNA fragments that form the centromeric regions of all human chromosomes. Based on them, alphoid DNA probes with specificity for chromosomes 1, 3, 4, 6, 9, 11, 13, 18, 21, and X of a person were created and protected by copyright certificates of DNA (Gindilis et al., 1985, No. 1203108; Yurov et al. ., 1989, No. 1494724; Yurov et al., 1993, No. 1792429; Yurov et al., 1997, No. 2087533; Soloviev et al., 1997, No. 2087534, Yurov et al., 2000, No. 2161199; Yurov et al. ., 2005, No. 2265060, Yurov et al., 2008, No. 2225441). The task of obtaining DNA probes for efficient labeling of other human chromosomes remains relevant. Currently, a number of cloned alpha satellite and classical satellite DNAs are described, which are characterized by specificity for different human chromosomes. These sequences can be considered as a prototype of the recombinant plasmid proposed for use in this invention. However, the possibility of their use for marking and identification of human chromosomes remains open. In particular, variants of human alpha-DNA were found that are on the 7th chromosome (Product catalog Vysis FISH probes "Abbott Molecular Diagnostics", www.abbottmolecular.com). These DNA probes have not been studied in sufficient detail from the point of view of their design for marking the 7th human chromosome in applied works, in particular, for the diagnosis of chromosomal abnormalities in oncology and medical genetics. Moreover, all methods described in the literature for labeling the 7th chromosome in metaphase and interphase cells and the use of recombinant plasmids containing alpha satellite DNA do not have sufficiently high specificity for the centromeric regions of chromosome 7, and, therefore, are intended for laboratory studies, and not for the diagnosis of chromosomal pathology during medical genetic counseling. Therefore, they cannot be used for effective molecular cytogenetic diagnostics in medical practice, when the correct identification of chromosome abnormalities and subsequent medical and genetic counseling or prenatal diagnostics with possible termination of pregnancy due to aberrations of the 7th chromosome are required. Relevant for molecular cytogenetic diagnostics is the development of methods for the efficient detection of chromosomes and the construction of original markers for the centromere region of the 7th human chromosome, which would allow the identification of centromere regions in interphase and metaphase cells.

Данный способ для высокоспецифичного маркирования центромерных районов 7-ой хромосомы человека с использованием оригинальной рекомбинантной плазмиды альфа R1-13 разработан впервые. Полученная рекомбинантная плазмида альфа R1-13 отличается от известных по литературе клонированных альфа-сателлитных ДНК по совокупности признаков: способу получения и по высокой специфичности для 7-ой хромосомы человека. В специальных условиях проведения гибридизации in situ с использованием стандартного солевого раствора с 55% формамидом в течение 4-18 часов при температуре 42°С и постгибридизационной отмывки в солевом растворе с 50% формамидом при температуре 42°С этот ДНК-зонд гибридизуется только с центромерными районами 7-ой хромосомы человека. Предлагаемый способ маркирования 7-ой хромосомы для диагностики хромосомной патологии не имеет вышеперечисленных общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогов, т.к. для молекулярно-цитогенетического маркирования и идентификации центромерных районов 7-ой хромосомы человека данное техническое решение разработано впервые.This method for highly specific labeling of centromeric regions of the 7th chromosome of a person using the original recombinant plasmid alpha R1-13 was developed for the first time. The obtained recombinant plasmid alpha R1-13 differs from the cloned alpha satellite DNAs known in the literature in terms of the combination of features: the production method and high specificity for the 7th human chromosome. Under special conditions of in situ hybridization using standard saline with 55% formamide for 4-18 hours at 42 ° C and posthybridization washing in saline with 50% formamide at 42 ° C, this DNA probe will hybridize only with centromere areas of the 7th human chromosome. The proposed method for marking the 7th chromosome for the diagnosis of chromosomal pathology does not have the above common features with any of the above analogues, because for molecular cytogenetic labeling and identification of centromeric regions of the 7th chromosome of a person, this technical solution was developed for the first time.

Конкретная цель исследования достигалась следующим образом. Источником выделения маркерного фрагмента альфа R1-13 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидуума мужского пола) обрабатывают рестриктазой EcoRl до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты, размером 680 пар нуклеотидов, препаративно выделяют методом электрофореза в 0,8% агарозном геле и "вшивают" с помощью лигирования по "липким" концам в EcoRl-сайт бактериального плазмидного вектора pBR325 (5966 пар нуклеотидов). Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "short-gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином.The specific goal of the study was achieved as follows. The source of the marker fragment fragment alpha R1-13 is the human lymphocyte DNA purified by electrostatic filtration on an Amicon XM-300 ultrafiltration membrane. The preparation of purified human lymphocytic DNA (obtained from a male individual) is treated with restriction enzyme EcoRl until complete hydrolysis. The resulting restriction fragments, 680 nucleotide pairs in size, were preparatively isolated by 0.8% agarose gel electrophoresis and sutured by sticky ligation to the EcoRl site of the bacterial plasmid vector pBR325 (5966 nucleotides). This plasmid carries the ampicillin resistance gene. The presence of the ampicillin resistance gene in the plasmid allows only transformed cells to be selected on the medium with this antibiotic. Thus, this vector allows the creation of a recombinant clonoteca (of the "short-gun" type) for automatic selection on a medium with ampicillin.

На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфоидной ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (³²Р) ДНК тотальной фракции ARI-ДНК человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дают позитивные рефлексы на радиоавтографах, в результате гибридизации отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.At the next stage, clones possessing homology with alpha-DNA are identified in the created clone library. For this, recombinant clones on nitrocellulose filters are introduced into a hybridization reaction with radiophosphorus-labeled ( ³² P) DNA of the total fraction of human ARI-DNA, which is represented mainly by alpha-DNA. Colonies whose DNA gives positive reflexes on radio autographs, as a result of hybridization, are selected and used to determine the chromosome localization of the restriction fragments of human DNA cloned in them directly in cytological preparations of chromosomes in situ.

Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в пенициллиновых флаконах при температуре 37°С в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 часов. За 1,5 часа до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют 10 мин при температуре 37°С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором в отношении 3: 1 трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37°С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.For this, chromosome preparations are prepared from dividing cells in a culture of peripheral blood lymphocytes according to a known method. Blood lymphocytes stimulated by division with phytohemagglutinin (Difco, USA) are cultured in penicillin vials at a temperature of 37 ° C in Eagle's medium with the addition of up to 20% bovine serum for 72 hours. 1.5 hours before the end of cultivation, colchicine is administered at a concentration of 0.5 μg / ml. Cells in the culture medium are transferred to centrifuge tubes and centrifuged for 5 min at 1000 rpm. The precipitate was resuspended in a hypotonic solution of 0.07 M KCl and incubated for 10 min at a temperature of 37 ° C. Fixation is carried out with methanol-vinegar fixative in a ratio of 3: 1 three times for 20 minutes. Chromosome preparations are stored at a temperature of 37 ° C and used in experiments no later than 2-3 weeks after preparation.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения; в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 M MgCl₂; 0,05 M дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл ³Н-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 при концентрации 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при температуре 20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25×10 импульсов в мин в расчете на 1 мкг ДНК.DNA samples for in situ hybridization on chromosomes are labeled with an isotopic tag by a known substitution method; 15 μl of a ten-fold buffer solution (0.8 M Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 M MgCl ₂ ; 0.05 M dithiothreitol), 5 μl of non-radioactive deoxynucleoside triphosphates in an equimolar mixture (0 each) are successively dissolved in 100 μl of deionized water , 01 mmol of each except thymidine triphosphate), 5 μl of DNase-1 (concentration 1 μg / ml), 10 μl of ³ N-thymidine triphosphate (specific activity 114 Ci / mol, concentration of 5 mCi / ml, 10 μl of DNA polymerase 1 at a concentration of 2 u / μl). The volume of the reaction mixture is 150 μl. The reaction is carried out for 20-40 minutes at a temperature of 20 ° C. The average specific radioactivity of labeled DNA preparations is about 25 × 10 pulses per minute per 1 μg of DNA.

Клонированные фрагменты альфоидной ДНК были картированы на хромосомах человека in situ с использованием стандартных условий гибридизации в растворе, содержащем стандартный солевой раствор (2×SSC), 50% формамид, 10% декстрансульфат-500. Все клоны гибридизировались с центромерными районами всех хромосом человека без видимой специфики для индивидуальных хромосом. Однако применение специальных условий гибридизации, повышенной жесткости гибридизации за счет повышения концентрации формамида в растворе до 55% позволило выявить рекомбинантную ДНК альфа R1-13, которая принципиально отличается по хромосомной специфичности от остальных альфоидных ДНК.Cloned alphaoid DNA fragments were mapped to human in situ chromosomes using standard hybridization conditions in a solution containing standard saline (2 × SSC), 50% formamide, 10% dextransulfate-500. All clones hybridized with the centromere regions of all human chromosomes without apparent specificity for individual chromosomes. However, the use of special hybridization conditions, increased stringency of hybridization due to an increase in the concentration of formamide in solution up to 55% made it possible to identify recombinant DNA alpha R1-13, which is fundamentally different in chromosome specificity from other alphoid DNAs.

Гибридизацию меченой радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК альфа R1-13 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 секунд в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 минут в растворах 70° и 96,6° спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 55% раствор формамида, 10% раствор декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2×SSC), в течение 10 мин при температуре 100°С. Гибридизацию проводят при температуре 37°С в течение 17-18 часов. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2×SSC при комнатной температуре, в растворах 70° и 96,6° этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимзы в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении × 1000 или × 1125.Hybridization of radiolabeled precursors of recombinant DNA alpha R1-13 with metaphase chromosomes in situ is carried out according to the following procedure: metaphase chromosome preparations are denatured in 0.07 N NaOH for 30 seconds, followed by washing for 10 minutes in solutions of 70 ° and 96.6 ° alcohol ; preparations of radioactive DNA samples were denatured in a hybridization mixture containing 55% formamide solution, 10% dextransulfate-500 solution and standard saline solution (2 × SSC) for 10 min at a temperature of 100 ° C. Hybridization is carried out at a temperature of 37 ° C for 17-18 hours. After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 2 × SSC at room temperature, in solutions of 70 ° and 96.6 ° ethyl alcohol for 15 minutes in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with a standard amidol developer, the preparations are thoroughly washed for 2 minutes with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10-15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of × 1000 or × 1125.

Образцы рекомбинантной ДНК альфа R1-13 для гибридизации на хромосомах in situ можно метить и нерадиоактивными флюоресцентными нуклеотидами, например биотин-16-dUTP (биотин-16-дезокси-уридинтрифосфат), уже описанным выше методом замещения. Для этого готовят реакционную смесь следующего состава: 50 mM Tris-HCl (рН 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-меркаптоэтанола, по 0,04 mM нуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP), 0,03 mM биотин-16-dUTP, 10U ДНК-полимеразы 1 из E.coli, 5-10 мкг ДНК-азыI и 2 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды. Объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Реакцию проводят 1 час при температуре 15°С. Реакцию останавливают добавлением EDTA (до 50 mM), меченную ДНК рекомбинантной плазмиды осаждают этиловым спиртом, высушивают и растворяют в гибридизационной смеси (55% формамид, 2×SSC). Хранят в темноте при температуре -20°С.Samples of recombinant alpha R1-13 DNA for in situ hybridization on chromosomes can also be labeled with non-radioactive fluorescent nucleotides, for example biotin-16-dUTP (biotin-16-deoxy-uridine triphosphate), already described above by the substitution method. For this, a reaction mixture of the following composition is prepared: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.04 mM nucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dCTP), 0.03 mM biotin -16-dUTP, 10U DNA polymerase 1 from E. coli, 5-10 μg DNAse I and 2 μg DNA recombinant plasmid. The volume of the reaction mixture is 50 μl. The reaction is carried out for 1 hour at a temperature of 15 ° C. The reaction was stopped by the addition of EDTA (up to 50 mM), the labeled DNA of the recombinant plasmid was precipitated with ethanol, dried and dissolved in a hybridization mixture (55% formamide, 2 × SSC). Store in the dark at a temperature of -20 ° C.

Гибридизацию меченой флюоресцентными нуклеотидами рекомбинантной ДНК альфа R1-13 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: меченную рекомбинантную плазмиду в концентрации 10-20 нг в 10 мкл гибридизационной смеси, состоящей из 55% раствора формамида в 2×SSC, помещают на цитологический препарат, содержащий фиксированные метафазные хромосомы или интерфазные ядра, накрывают покровным стеклом 22×22 мм и прогревают при температуре 75°С в течение 5 мин для одновременной денатурации ДНК хромосом и рекомбинантной ДНК; затем проводят гибридизацию при температуре 42°С в течение 4-х-18-ти часов во влажной камере. Препараты после проведения гибридизации отмывают в гибридизационной смеси (50% формамид, 2×SSC) при температуре 42°С в течение 3-х мин и растворе 2х SSC при температуре 42°С в течение 5 мин и потом ополаскивают буферным раствором: 0,1 М NaH₂PO₄ и 0,1 М Na₂HPO₄ (рН 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при комнатной температуре (или при температуре 37°С) в течение 1 мин. Далее препараты инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (флюоресцеин изотиоционат - раствор для контрастирующего окрашивания), в течение 30 мин при температуре 37°С во влажной камере; при этом на один препарат наносят 20 мкл авидина (концентрация 5 мкг/мл) и накрывают пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Промывают препараты три раза по 5-15 мин буфером 0,1 М NaH₂PO₄ и 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при температуре 37°С.Hybridization of fluorescent nucleotide-labeled recombinant DNA alpha R1-13 with metaphase chromosomes in situ is carried out according to the following procedure: labeled recombinant plasmid at a concentration of 10-20 ng in 10 μl of a hybridization mixture consisting of a 55% solution of formamide in 2 × SSC is placed on a cytological preparation containing fixed metaphase chromosomes or interphase nuclei, cover with a cover glass of 22 × 22 mm and heated at a temperature of 75 ° C for 5 min for simultaneous denaturation of chromosome DNA and recombinant DNA; then hybridization is carried out at a temperature of 42 ° C for 4 to 18 hours in a humid chamber. After hybridization, the preparations are washed in a hybridization mixture (50% formamide, 2 × SSC) at a temperature of 42 ° C for 3 min and a 2x SSC solution at 42 ° C for 5 min and then rinsed with a buffer solution: 0.1 M NaH ₂ PO ₄ and 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 at room temperature (or at 37 ° C) for 1 min. Further, the preparations are incubated with avidin labeled with fluorescein (fluorescein isothiocyanate - a solution for contrasting staining) for 30 min at a temperature of 37 ° C in a humid chamber; at the same time, 20 μl of avidin (concentration of 5 μg / ml) is applied to one preparation and covered with a plastic plate or a Parafilm film. The preparations are washed three times for 5-15 minutes with a buffer of 0.1 M NaH ₂ PO ₄ and 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 at a temperature of 37 ° C.

Для окрашивания препаратов на них наносят фотозащитный раствор: 2% 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октан (DABCO) в 50% глицерине, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (15-20 мкл), 400 нг/мл флюоресцентного красителя DAPI (4′,6-диамино-2-фенилиндол-дигидрохлорид), йодистый пропидий в концентрации 400 нг/мл и накрывают покровным стеклом (22×22 мм) для микроскопического наблюдения.To stain the preparations, a photoprotective solution is applied to them: 2% 1,4-diazobicyclo- (2,2,2) octane (DABCO) in 50% glycerol, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 (15-20 μl) , 400 ng / ml DAPI fluorescent dye (4 ′, 6-diamino-2-phenylindole-dihydrochloride), propidium iodide at a concentration of 400 ng / ml and covered with a coverslip (22 × 22 mm) for microscopic observation.

При микроскопии используют обычный флюоресцентный микроскоп, оснащенный соответствующим набором светофильтров. Например, для одновременного анализа гибридизационных сигналов (зеленый цвет - FITC) и хромосом (красный цвет - йодистый пропидий) - фильтр I3, Leitz. Для хромосом и интерфазных ядер без гибридизационных сигналов - фильтр A, Leitz (DAPI - голубой цвет) или фильтр N 2.1, Leitz (йодистый пропидий - красный цвет).Microscopy uses a conventional fluorescence microscope equipped with an appropriate set of filters. For example, for the simultaneous analysis of hybridization signals (green color - FITC) and chromosomes (red color - propidium iodide) - filter I3, Leitz. For chromosomes and interphase nuclei without hybridization signals - filter A, Leitz (DAPI - blue) or filter N 2.1, Leitz (propidium iodide - red).

При необходимости усиления гибридизационных сигналов (используя цитологические препараты низкого качества - плохая фиксация и т.п.) проводят дополнительную обработку гибридизационных сигналов - иммунологическую амплификацию.If necessary, amplification of hybridization signals (using low-quality cytological preparations - poor fixation, etc.) is carried out additional processing of hybridization signals - immunological amplification.

Для этого препараты промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20 в течение 5-15 мин; инкубируют с биотинилированными антителами к авидину (20 мкл блокирующего раствора при концентрации 5 мкг/мл) 30 мин при комнатной температуре или 20 мин при температуре 37°С во влажной камере, накрывая пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Далее препараты промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20, три раза по 5-15 мин при комнатной температуре или при темпрературе 37°-45°С, и повторно инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (20 мкл блокирующего раствора при концентрации 5 мкг/мл), в течение 30 мин при комнатной температуре или 20 мин при температуре 37°С. Затем препараты опять промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (рН 8,0), содержащем 0,1% Твин-20, три раза по 5-15 мин при комнатной температуре или при температуре 37°-45°С и подготавливают для микроскопии. Процедуру амплификации слабого гибридизационного сигнала при необходимости можно проводить 2-3 раза.For this, the preparations are washed in a buffer of 0.1 M NaH ₂ PO ₄ , 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 for 5-15 minutes; incubated with biotinylated anti-avidin antibodies (20 μl blocking solution at a concentration of 5 μg / ml) for 30 min at room temperature or 20 min at 37 ° C in a humid chamber, covering with a plastic plate or Parafilm film. Next, the preparations are washed in a buffer of 0.1 M NaH ₂ PO ₄ , 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20, three times for 5-15 minutes at room temperature or at temperature 37 ° -45 ° C, and re-incubated with avidin labeled with fluorescein (20 μl of blocking solution at a concentration of 5 μg / ml) for 30 min at room temperature or 20 min at 37 ° C. Then the preparations are again washed in a buffer of 0.1 M NaH ₂ PO ₄ , 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20, three times for 5-15 minutes at room temperature or at a temperature of 37 ° -45 ° C and prepared for microscopy. The amplification procedure of a weak hybridization signal, if necessary, can be carried out 2-3 times.

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент альфа R1-13 локализован в прицентромерных районах 7-ой пары гомологичных хромосом человека и является, таким образом, специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом.In situ hybridization on human metaphase chromosomes shows that the cloned alpha R1-13 fragment is located in the pericentromeric regions of the 7th pair of homologous human chromosomes and is thus a specific molecular marker of this pair of chromosomes.

Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды альфа R1-13 для идентификации хромосомы 7 человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами.Methods of using the obtained recombinant plasmid alpha R1-13 to identify human chromosome 7 in metaphase and interphase cells in order to conduct molecular cytogenetic diagnostics are illustrated by the following examples.

Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 М NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным раствором декстрансульфата-500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при температуре 0-4°С. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис HCl (рН 8,0) 5 мМ MgCl₂, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450g, 10 мин).Example 1. Whole heparinized blood of a healthy donor is diluted with 0.015 M NaCl in a volume ratio of 1: 3. To precipitate red blood cells, diluted blood is mixed with a 6% solution of dextransulfate-500 in a ratio of 5: 1; the mixture is left to stand for 30 minutes at room temperature; all subsequent procedures are carried out at a temperature of 0-4 ° C. Leukocytes from the supernatant are precipitated by centrifugation at 450g for 20 minutes and washed three times by centrifugation in 0.15 M NaCl (450g, 10 minutes). The washed cells are resuspended in STM buffer containing 0.5 M sucrose, 50 mM Tris HCl (pH 8.0) 5 mM MgCl ₂ , 0.02 mM EDTA with Triton X-100 at a final concentration of 0.05%. The nuclear fraction was washed three times by centrifugation in the same buffer without X-100 newt (450g, 10 min).

Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50 мМ трис HCl, рН 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1%. Лизат инкубируют при температуре 65°С не менее 1 часа до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ+1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCl, 89 мМ НВО и 5 мМ EDTA (рН 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см² в течение 6-8 часов.Nuclei are resuspended in TE buffer (50 mM Tris HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA) based on: 100 ml of buffer per 1 ml of nuclear sediment and lysed by adding sarcosyl to a concentration of 1%. The lysate is incubated at a temperature of 65 ° C for at least 1 hour until completely clear and centrifuged for 60 minutes at 2000 rpm to remove mechanical impurities. The supernatant is transferred to a cylinder, covered with an XM-300 ultrafilter (Amicon) from below. An equal volume of TE buffer + 1% sarcosyl is layered onto the supernatant. The fluid in the cylinder is separated from the anode chamber by a dialysis membrane. The lower edge of the filter cylinder is lowered into the cathode chamber; both electrode chambers are filled with buffer containing 89 mM Tris HCl, 89 mM HBO and 5 mM EDTA (pH 8.3). Electrofiltration of the solution is carried out at 5 mm / cm ² for 6-8 hours.

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ.After electrophoretic deposition of DNA on the filter, the liquid is removed from the cylinder, and the gel-like layer of DNA is dissolved in the desired volume of 0.1 M TE.

Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека клетки E.coli, несущие плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при температуре 37°С на качалке в течение 12 часов. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCl (рН 8,0), 50 мМ EDTA и 5% раствор тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при температуре 65°С. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 часов инкубации при температуре 65°С проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (температура - 18°С, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1×SSC (1×SSC г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при температуре 81°С в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1M KCl + 20 мМ трис-HCl рН 7,1 при температуре 0°С. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см³ объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают в растворах 50° изопропилового или 70° этилового спиртов, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.For preparative isolation of plasmid DNA with an insert of human DNA, E. coli cells carrying the plasmid are grown in 100 ml of LB medium (10 g / l peptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl) with the addition of necessary antibiotics (100 μg / ml ampicillin) at a temperature of 37 ° C on a rocking chair for 12 hours. Cells are pelleted by centrifugation (5000 rpm, 10 min) and resuspended in 10 ml of a solution of 50 mM glucose, 50 Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA and 5% Triton X-100. Freshly prepared lysozyme solution up to 5 mg / ml is added to the suspension and left at room temperature for 10-15 minutes. Then the sample volume is brought to 50 ml with a buffer without lysozyme and placed overnight in a thermostat at a temperature of 65 ° C. The DNA-membrane complex and denatured cell proteins are precipitated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. 100 μg / ml RNAse A is added to the supernatant and, after 2 hours of incubation at a temperature of 65 ° C, phenolic and then chloroform deproteinization is carried out. DNA from the solution is precipitated with an equal volume of isopropyl alcohol (temperature - 18 ° C, 20 min), the precipitate is dissolved in TE. The DNA solution was dialyzed on Sephadex G-50 against 0.1 × SSC (1 × SSC g / L sodium chloride and 4.8 g / L sodium citrate). This solution is heated at a temperature of 81 ° C for 10 min and quickly cooled by adding a volume of 1M KCl + 20 mm Tris-HCl pH 7.1 at a temperature of 0 ° C. The resulting mixture was passed through a column of nitrocellulose Nitro-Cell-S (Serva) at the rate of 1 mg of DNA per 10 cm ³ column volume. Fractions containing circular forms of plasmid DNA are combined; DNA is precipitated from them with an equal volume of isopropyl alcohol; the precipitate is washed in solutions of 50 ° isopropyl or 70 ° ethanol, dried under vacuum and dissolved in TE buffer to the desired concentration.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCl (рН 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 минут при температуре 0°С. К клеткам добавляют 2 мл раствора 0,2 N NaOH с 1% SDS для лизиса клеток и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию в течение 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на час при температуре 0°С. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (1200 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (температура -18°С, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (рН 8,0) + 0,1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.DNA of recombinant plasmids for screening bacterial clones was isolated from 5 ml of overnight culture, precipitated by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes, the pellet was resuspended in 1 ml of 25 mM Tris-HCl (pH 8.0); 20 mm EDTA, 50 mm glucose and 2 mg / ml lysozyme, followed by incubation for 30 minutes at 0 ° C. 2 ml of a 0.2 N NaOH solution with 1% SDS was added to the cells to lyse the cells, and after thorough mixing, incubation was continued for 5 minutes. 1.5 ml of 3 M sodium acetate is added to the lysate, the solution is gently mixed and left for an hour at a temperature of 0 ° C. The precipitate formed is removed by centrifugation (1200 rpm), nucleic acids from the supernatant are precipitated with 2.5 volumes of ethyl alcohol (temperature -18 ° C, 30 min). The precipitate was dissolved in 1 ml of 50 mm Tris-HCl (pH 8.0) + 0.1 M sodium acetate and reprecipitated with ethanol. The reprecipitation procedure is repeated twice, the final precipitate after drying is dissolved in 100 μl of TE.

Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктазы EcoR 1 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 часов при температуре 37°С. Реакцию останавливают прогреванием пробы при температуре 70°С в течение 10 мин.Endonuclease treatment of human DNA and bacterial plasmids is carried out in REB buffer containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM NaCl and 1 mM dithiothreitol (DTT). Complete endonuclease DNA hydrolysis is obtained at a relative concentration of restriction enzyme EcoR 1 5-8 u / μg DNA after the reaction for 2 hours at a temperature of 37 ° C. The reaction is stopped by heating the sample at a temperature of 70 ° C for 10 minutes

Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pBR325, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки, несущие плазмиды с ДНК человека.To obtain a genomic clonotope of human DNA, the bacterial plasmid pBR325 carrying the ampicillin resistance gene is used as a vector. The presence of the ampicillin resistance gene in the plasmid allows only transformed cells carrying plasmids with human DNA to be selected on the medium with this antibiotic.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры клеток E.coli HB 101, выращивают на качалке при температуре 37°С до мутности А=0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до температуры 0°С раствора 100 мМ CaCl₂, клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мл раствора 100 мМ CaCl₂. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М раствора CaCl₂ с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при температуре 0°С по крайней мере в течение 30 мин культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при температуре -80°С, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4-5 месяцев. В дальнейшем при использовании к 200 мкл компетентной культуры бактерий при температуре 0°С добавляют 0,1-0,2 мкг лигированной плазмидной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (температура 42°С) на 1-1,5 мин и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 часа при температуре 37°С. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) с добавлением ампициллина, обуславливающих селекцию трансформированных клонов.A competent bacterial culture for transformation is prepared as follows: in 25 ml of LB nutrient medium, 1 ml of fresh night culture of E. coli HB 101 cells is inoculated, grown on a shaker at a temperature of 37 ° C to a turbidity of A = 0.4-0.5. Cell division is stopped by placing the culture on ice for 10-15 minutes, followed by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes in the cold. The precipitate is washed with an equal volume of a solution of 100 mM CaCl ₂ cooled to a temperature of 0 ° C, the cells are precipitated and resuspended in 12 ml of a solution of 100 mM CaCl ₂ . The cell suspension is kept in the cold for 20-30 minutes, centrifuged, and the pellet is resuspended in 2.5 ml of 0.1 M CaCl ₂ solution with 15% glycerol. After incubation of the resulting suspension at a temperature of 0 ° C for at least 30 minutes, the culture can be transformed. It is stored in small portions at a temperature of -80 ° C, while its competence is maintained for 4-5 months. Subsequently, when used, to 200 μl of a competent bacterial culture at a temperature of 0 ° C, 0.1-0.2 μg of ligated plasmid DNA is added and incubated at this temperature for 45-60 minutes. Then the mixture is transferred to a water bath (temperature 42 ° C) for 1-1.5 minutes and placed on ice. LB nutrient broth is added to the transformed culture and it is grown on a rocking chair for 2-3 hours at a temperature of 37 ° C. Transformants are plated on solid medium with 1.5% agar (0.1 ml culture per Petri dish) with the addition of ampicillin, causing the selection of transformed clones.

30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М NaCl, 5 мМ СаС1₂, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при температуре 70°С 10 мин, после чего к смеси добавляют буферный раствор 0,4 М трис-HCl (рН 7,4); 50 мМ MgCl₂, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из ³²Р- дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью ПО ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 часа при температуре 37°С. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5×10⁸ имп/мин/мкг ДНК.30 μl of a solution containing 0.1-0.2 μg of plasmid DNA or 0.1 μg of a fragment prepared from the gel and 1 μl of DNAase-1 in 0.015 M NaCl, 5 mM CaCl ₂ , are incubated for 10 min at room temperature, DNA-aza-1 was inactivated at a temperature of 70 ° C for 10 min, after which a buffer solution of 0.4 M Tris-HCl (pH 7.4) was added to the mixture; 50 mM MgCl ₂ , 25 mM DTT (up to 1/5 of the final volume), 1 nmol of each of the unlabeled DNA precursors, 20-40 μCi of one of the ³² P-deoxynucleoside triphosphates with a specific PO activity of TB / mmol (3000 Ci / mmol) ( Amersham) and 1 unit of DNA polymerase-1. The volume of the reaction mixture, as a rule, is 100 μl, the reaction is carried out for 1 hour at a temperature of 37 ° C. The radioactivity of the acid-insoluble fraction of DNA is measured on a LRB 1215 counter according to a special program. The average specific activity of labeled preparations is 2-5 × 10 ⁸ imp / min / μg of DNA.

Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при температуре 37°С. Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 М NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив фильтр с нижней стороны фильтровальной бумагой дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-HCl (рН 7,5), а затем 1,5 М NaCl с 1 М трис HCl (рН 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2×SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при температуре 37°С. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при температуре 80°С в течение 1-2 часов.To identify human DNA inserts in hybrid clones, bacterial colonies previously tested as recombinant in phenotype are replicated on nitrocellulose filters (Millipore, HAWP) located directly on the surface of a solid nutrient medium in Petri dishes and grown for 24 hours at 37 ° C. The grown colonies with the filter are transferred to the surface of a solution of 0.5 M NaOH and left for 5-10 minutes. After drying the filter on the underside with filter paper, it is treated twice with 10 M solution of 1 M Tris-HCl (pH 7.5) and then 1.5 M NaCl with 1 M Tris HCl (pH 7.5). Air-dried filter is placed in a solution of 2 × SSC with proteinase K at a concentration of 50 μg / ml and incubated in it for 30 min at a temperature of 37 ° C. Next, the dried filter is washed in 0.3 M NaCl, and then dried under vacuum at a temperature of 80 ° C for 1-2 hours.

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при температуре 68°С в растворе 2×SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон - 350 в течение 60-90 минут. Вслед за этим фильтр насухо промакают фильтровальной бумагой и помещают в 4-5 мл гибридизационной смеси, содержащей 6×SSC; 0,1% SDS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу ³²Р-меченой ДНК с суммарной активностью 1-5×10⁶ имп/мин. Гибридизацию проводят при температуре 68°С в течение 18-24 часов. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5×SSC с 0,5% SDS при температуре 68°С в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2-24 часа экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.Before hybridization, the filter is soaked at a temperature of 68 ° C in a solution of 2 × SSC, 0.5% SDS, 0.1% ficol-400 and 0.1% polyvinylpyrrolidone-350 for 60-90 minutes. Following this, the filter is dry dried with filter paper and placed in 4-5 ml of a hybridization mixture containing 6 × SSC; 0.1% SDS; 10% dextransulfate-500, 50 μg / ml poly (A) and a denatured sample of ³² P-labeled DNA with a total activity of 1-5 × 10 ⁶ cpm. Hybridization is carried out at a temperature of 68 ° C for 18-24 hours. The filters are washed in several changes of a 0.5 × SSC solution with 0.5% SDS at a temperature of 68 ° C for several hours. The washed filters are finally dried and placed in a cassette with x-ray film PM-1. After 2-24 hours, the exposure is shown autographically and hybrid clones are identified by the presence of positive signals (round blackening sites).

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой EcoRl фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoRl и идентификации полосы размером 680 пар нуклеотидов. В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, одна из которых получила название альфа R1-13.The described method put the experiment on three filter replicas with a clone collection EcoRl of human DNA fragments. In this case, as a probe for hybridization with colonies on the filters, a sample of human alpha-DNA is taken, which is isolated preparatively from an agarose gel after electrophoretic separation of the hydrolyzate of human genomic DNA by endonuclease EcoRl and identification of a band of 680 nucleotide pairs. An isotopic label is introduced into the indicated DNA sample as previously described by the substitution method. After hybridization in the colonies, a positive signal is detected especially clearly in several colonies, one of which is called alpha R1-13.

Препараты хромосом готовят из культуры лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Difco", США). Клетки культивируют в пенициллиновых флаконах или шприцах при температуре 37°С в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 часов. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют в течение 10 мин при температуре 37°С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37°С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.Chromosome preparations are prepared from a culture of peripheral blood lymphocytes stimulated by division using phytohemagglutinin (Difco, USA). Cells are cultured in penicillin vials or syringes at a temperature of 37 ° C in Eagle's medium with the addition of up to 20% bovine serum for 74 hours. An hour before the end of cultivation, colchicine is administered at a concentration of 0.5 μg / ml. Cells in the culture medium are transferred to centrifuge tubes and centrifuged for 5 min at 1000 rpm. The precipitate was resuspended in a hypotonic solution of 0.07 M KCl and incubated for 10 min at a temperature of 37 ° C. Fixation is carried out with methanol-vinegar fixative (in a ratio of 3: 1) three times for 20 minutes. Chromosome preparations are stored at a temperature of 37 ° C and used in experiments no later than 2-3 weeks after preparation.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят как изотопной меткой, так и флюоресцентной метками методом замещения. В первом случае (изотопный метод), в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl₂); 0,05 M дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением Н³-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл Н³-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 5 мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл) и 5 мкл ДНК (1 мкг) пробы альфа R1-13. Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при температуре 20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25×10⁶ импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.DNA samples for in situ hybridization on chromosomes are labeled with both an isotopic tag and fluorescence tags using the substitution method. In the first case (isotopic method), 15 μl of a ten-fold buffer solution (0.8 M Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 M MgCl ₂ ) is successively dissolved in 100 μl of deionized water; 0.05 M dithiothreitol, 5 μl non-radioactive deoxynucleoside triphosphates in an equimolar mixture (0.1 mm each except H ³ -thymidine triphosphate), 5 μl DNAse-1 (concentration 1 μg / ml), 10 μl H ³ -thymidine triphosphate ( specific activity 114 Ci / mol, concentration 5 mCi / ml), 5 μl DNA polymerase 1 (concentration 2 u / μl) and 5 μl DNA (1 μg) of the alpha R1-13 sample. The volume of the reaction mixture is 150 μl. The reaction is carried out for 20-40 minutes at a temperature of 20 ° C. The average specific radioactivity of labeled DNA preparations is about 25 × 10 ⁶ pulses per minute per 1 μg of DNA.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК альфа R1-13 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 сек в 0,07Н NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70° и 96,6° этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 55% раствор формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2×SSC), в течение 10 мин при температуре 100°С. Гибридизацию проводят при температуре 37°С в течение 17-18 часов. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2×SSC при температуре 37°С, в двух сменах 2×SSC при комнатной температуре, в растворах 70° и 96,6° этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении ×1000 или ×1125.Hybridization of radiolabeled precursors of recombinant DNA alpha R1-13 with metaphase chromosomes in situ is carried out with preliminary denaturation for 30 seconds in 0.07 N NaOH followed by washing for 10 minutes in solutions of 70 ° and 96.6 ° ethyl alcohol. The preparations of radioactive DNA samples were denatured in a hybridization mixture containing 55% solution of formamide, 10% dextransulfate-500 and standard saline solution (2 × SSC) for 10 min at a temperature of 100 ° C. Hybridization is carried out at a temperature of 37 ° C for 17-18 hours. After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 2 × SSC at a temperature of 37 ° C, in two shifts of 2 × SSC at room temperature, in solutions of 70 ° and 96.6 ° of ethanol for 15 min in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with a standard amidol developer for 2 minutes, the preparations are thoroughly washed with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10-15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of × 1000 or × 1125.

Во втором случае, при мечении образцов рекомбинантной ДНК нерадиоактивными флюоресцентными нуклеотидами, например биотин-16-dUTP (биотин-16-дезокси-уридинтрифосфат), готовят реакционную смесь следующего состава: 50mM Tris-HCl (рН 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-меркаптоэтанол, по 0,04 mM нуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP), 0,03 mM биотин-16-dUTP, 10 единиц ДНК-полимеразы 1 из E.coli, 10 нг ДНК-азы I и 2 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды. Объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Реакцию проводят 1 час при температуре 15°С. Реакцию останавливают добавлением EDTA (до 50 mM), меченную ДНК рекомбинантной плазмиды осаждают этиловым спиртом, высушивают и растворяют в гибридизационной смеси (55% формамид, 2×SSC). Хранят в темноте при температуре -20°С.In the second case, when labeling samples of recombinant DNA with non-radioactive fluorescent nucleotides, for example biotin-16-dUTP (biotin-16-deoxy-uridine triphosphate), a reaction mixture of the following composition is prepared: 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.04 mM nucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dCTP), 0.03 mM biotin-16-dUTP, 10 units of DNA polymerase 1 from E. coli, 10 ng DNAase I and 2 μg of recombinant plasmid DNA. The volume of the reaction mixture is 50 μl. The reaction is carried out for 1 hour at a temperature of 15 ° C. The reaction was stopped by the addition of EDTA (up to 50 mM), the labeled DNA of the recombinant plasmid was precipitated with ethanol, dried and dissolved in a hybridization mixture (55% formamide, 2 × SSC). Store in the dark at a temperature of -20 ° C.

Гибридизацию меченой флюоресцентными нуклеотидами рекомбинантной ДНК альфа R1-13 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: меченную рекомбинантную плазмиду в концентрации 10-20 нг в 10 мкл гибридизационной смеси, состоящей из 55% раствора формамида в 2×SSC, помещают на цитологический препарат, содержащий фиксированные метафазные хромосомы или интерфазные ядра, накрывают покровным стеклом 22×22 мм и прогревают при температуре 75°С в течение 5 мин для одновременной денатурации ДНК хромосом и рекомбинантной ДНК; затем проводят гибридизацию при температуре 42°С в течение 4-х-18-ти часов во влажной камере. Препараты после проведения гибридизации отмывают в гибридизационной смеси (50% формамид, 2×SSC) при температуре 42°С в течение 3-х мин и растворе 2×SSC при температуре 42°С в течение 5 мин и потом ополаскивают буферным раствором: 0,1 М NaH₂PO₄ + 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при комнатной температуре (или при температуре 37°С) в течение 1 мин. Далее препараты инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (флюоресцеин изотиоционат - раствор для контрастирующего окрашивания), в течение 30 мин при температуре 37°С во влажной камере; при этом на один препарат наносят 20 мкл авидина (концентрация 5 мкг/мл) и накрывают пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Промывают препараты три раза по 5-15 мин буфером 0,1 М NaH₂PO₄ + 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при температуре 37°С.Hybridization of fluorescent nucleotide-labeled recombinant DNA alpha R1-13 with metaphase chromosomes in situ is carried out according to the following procedure: labeled recombinant plasmid at a concentration of 10-20 ng in 10 μl of a hybridization mixture consisting of a 55% solution of formamide in 2 × SSC is placed on a cytological preparation containing fixed metaphase chromosomes or interphase nuclei, cover with a cover glass of 22 × 22 mm and heated at a temperature of 75 ° C for 5 min for simultaneous denaturation of chromosome DNA and recombinant DNA; then hybridization is carried out at a temperature of 42 ° C for 4 to 18 hours in a humid chamber. After hybridization, the preparations are washed in a hybridization mixture (50% formamide, 2 × SSC) at a temperature of 42 ° C for 3 min and a solution of 2 × SSC at 42 ° C for 5 min and then rinsed with a buffer solution: 0, 1 M NaH ₂ PO ₄ + 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 at room temperature (or at 37 ° C) for 1 min. Further, the preparations are incubated with avidin labeled with fluorescein (fluorescein isothiocyanate - a solution for contrasting staining) for 30 min at a temperature of 37 ° C in a humid chamber; at the same time, 20 μl of avidin (concentration of 5 μg / ml) is applied to one preparation and covered with a plastic plate or a Parafilm film. The preparations are washed three times for 5-15 minutes with 0.1 M NaH ₂ PO ₄ + 0.1 M Na ₂ HPO ₄ buffer (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 at 37 ° C.

Для окрашивания препаратов на них наносят фотозащитный раствор: 2% DABCO в 50% глицерине, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (15-20 мкл), 400 нг/мл флюоресцентного красителя DAPI, йодистый пропидий в концентрации 400 нг/мл и накрывают покровным стеклом (22×22 мм) для микроскопического наблюдения.To stain the preparations, a photoprotective solution is applied to them: 2% DABCO in 50% glycerol, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 (15-20 μl), 400 ng / ml DAPI fluorescent dye, propidium iodide at a concentration of 400 ng / ml and cover with a coverslip (22 × 22 mm) for microscopic observation.

Гибридизация in situ, как радиоактивная (изотопная), так и нерадиоактивная (флюоресцентная) на метафазных хромосомах человека, показывает, что клонированный фрагмент альфа R1-13 локализуется только в прицентромерном районе 7-ой пары гомологичных хромосом человека и является, таким образом, молекулярным маркером данной пары хромосом, специфически маркирующим околоцентромерные районы.In situ hybridization, both radioactive (isotopic) and non-radioactive (fluorescent) on human metaphase chromosomes, shows that the cloned fragment of R1-13 alpha is localized only in the pericentromeric region of the 7th pair of homologous human chromosomes and is thus a molecular marker a given pair of chromosomes that specifically mark pericentromeric regions.

Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера 7-ой пары хромосом в тех случаях, когда эти хромосомы (один из гомологов) затронуты перестройкой, т.е. имеет потерю или добавление какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размере 7-ой хромосомы и ее форме.Example 2. It is especially important to use the proposed molecular marker of the 7th pair of chromosomes in those cases when these chromosomes (one of the homologs) are affected by rearrangement, i.e. has the loss or addition of any part of the chromosome material, which affects the size of the 7th chromosome and its shape.

Все процедуры по выделению образца ДНК альфа R1-13 и его обработке с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора ребенка мужского пола (пробанда) со следующими клиническими проявлениями: умственной отсталостью, эктродактилией, брахидактилией, короткой шеей, характрными лицевыми аномалиями, поперечной бороздой на ладони, готическим небом и нерегулярным расположением зубов. При цитогенетическом анализе клеток пробанда был обнаружен кариотип с предположительно сбалансированной перестройкой (перицентрическая инверсия хромосомы 7), т.е. без видимой потери хромосомного материала в околоцентромерном районе. Это должно было соответствовать нормальному фенотипу ребенка. Подобная инверсия была обнаружена и у его фенотипически нормальной матери. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом по длине оказались малоэффективны. Однако после проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой хромосомы, точно установить изменения в кариотипах пробанда и его матери не составило труда. В обоих случаях, одна из точек разрыва была локализована в перицентромерном гетерохроматине (альфоидной ДНК хромосомы 7) и легко распознавалась непосредственно под микроскопом. Тем не менее наблюдались определенные различия между носителями инверсии в данной семье. У матери инверсия образовала два отдельных блока альфоидной ДНК, тогда как у пробанда с фенотипическими аномалиями альфоидная ДНК гибридизовалась гомогенно с инвертированным участком. Известно, что гетерохроматин, сформированный альфоидной ДНК, представляет собой транскрипционно неактивную структуру хромосомы. Следовательно, инкорпорация альфоидного блока в последовательность генонасыщенных участков хромосомы может влиять на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов соответствующего участка. Клинические отличия у пробанда и его матери, вероятнее всего можно объяснить эффектом положения генов в результате их необычного перемещения из-за инверсий и следовательно, изменению порядка располоржения генов в соответствующих хромосомных участках. Таким образом, с помощью молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой хромосомы изменения в гомологичных хромосомах, затронутых перестройкой, распознаются легко при анализе под микроскопом.All procedures for the isolation of an alpha R1-13 DNA sample and its processing with an isotopic tag for in situ hybridization on metaphase chromosomes, as well as all procedures for the preparation of metaphase chromosome preparations and hybridization on chromosomes, are repeated as in Example 1. The only difference is that Example 1 uses preparations of the normal chromosome set from a healthy male donor, while example 2 uses preparations of the chromosome set of a male child (proband) with the following clinical manifestations laziness: mental retardation, ectrodactyly, brachydactyly, short neck, characteristic facial anomalies, transverse groove in the palm, Gothic palate and irregular arrangement of teeth. A cytogenetic analysis of proband cells revealed a karyotype with a presumably balanced rearrangement (pericentric inversion of chromosome 7), i.e. without visible loss of chromosomal material in the pericentromeric region. This should have been consistent with the normal phenotype of the child. A similar inversion was also found in his phenotypically normal mother. Traditional cytogenetic methods using differential staining of chromosomes along the length have been found to be ineffective. However, after hybridization on metaphase chromosomes in situ using the molecular marker alpha R1-13 for the 7th chromosome, it was not difficult to accurately determine the changes in the karyotypes of the proband and its mother. In both cases, one of the break points was localized in pericentromeric heterochromatin (alpha chromosome 7 alpha DNA) and was easily recognized directly under the microscope. Nevertheless, there were certain differences between the carriers of inversion in this family. In the mother, the inversion formed two separate blocks of alpha-DNA, whereas in the proband with phenotypic abnormalities, alpha-DNA hybridized homogeneously with the inverted region. It is known that heterochromatin formed by alpha-DNA is a transcriptionally inactive chromosome structure. Therefore, the incorporation of the alpha block into the sequence of genetically saturated regions of the chromosome can affect the epigenetic regulation of gene expression of the corresponding region. The clinical differences between the proband and his mother can most likely be explained by the effect of the position of the genes as a result of their unusual movement due to inversions and, consequently, a change in the order of the genes in the corresponding chromosome regions. Thus, using the molecular marker alpha R1-13 for the 7th chromosome, changes in the homologous chromosomes affected by the rearrangement are easily recognized by microscopic analysis.

Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой пары хромосом является опыт по идентификации этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая хромосома X, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца хроматина X, образованного одной из двух хромосом X в женском наборе, а также половая хромосома У, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью молекулярного маркера альфа R1-13, специфически маркирующего только 7-ые хромосомы человека, наличие данных хромосом в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК альфа R1-13 гибридизуется с ДНК околоцентромерных областей 7-ой пары хромосом и в том случае, когда эти хромосомы находятся в деспирализованном состоянии на стадии интерфазы. При этом в каждом интерфазном ядре можно видеть после гибридизации два скопления метки или сигнала, соответствующих 7-ой паре хромосом.Example 3. An important illustration of the practical application of the molecular marker alpha R1-13 for the 7th pair of chromosomes is the experience of identifying this chromosome in the cell nucleus directly from the picture of interphase (non-fissionable) nuclei. As is known, human chromosomes are analyzed only in the metaphase of mitosis after special treatments that facilitate the calculation and analysis of chromosome morphology. The exception is the sex chromosome X, the presence of which in normal women can be determined by definition in the interphase nucleus of the compact body of chromatin X, formed by one of the two chromosomes X in the female set, as well as the sex chromosome U, which is defined as a brightly fluorescent body stained with acrychine mustard , in the interphase nucleus of men with a normal chromosome set. However, using the molecular marker alpha R1-13, specifically marking only the 7th chromosomes of a person, the presence of these chromosomes in the cell nucleus can be established without preparing metaphase chromosome preparations, only by analyzing the image of interphase nuclei. This is because the alpha R1-13 DNA sample hybridizes with the DNA of the near-centromeric regions of the 7th pair of chromosomes even when these chromosomes are in a despiralized state at the interphase stage. Moreover, after each hybridization, two clusters of a label or signal corresponding to the 7th pair of chromosomes can be seen in each interphase nucleus.

Все процедуры по выделению образца альфа R1-13 и его обработки с изотопной и флюоресцентной меткой для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом клеток периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично процедурам, описанным в примере 1. При этом в каждом интерфазном ядре обнаруживаются два скопления гранул метки (два кластера) при изотопном мечении или 2 светящихся сигнала при нерадиоактивном мечении, соответствующих гомологичным хромосомам 7-ой пары. В разных ядрах расстояния между кластерами и сигналами различны. Итак, появляется реальная возможность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретных пар хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека.All procedures for the isolation of a sample of alpha R1-13 and its processing with an isotopic and fluorescent label for hybridization on interphase nuclei, as well as all procedures for the preparation of metaphase chromosomes of peripheral blood cells and hybridization on chromosomes are repeated similarly to the procedures described in example 1. When in this, in each interphase nucleus, two clusters of label granules (two clusters) are detected upon isotopic labeling or 2 luminous signals upon non-radioactive labeling corresponding to homologous chromosomes 7th pair. In different nuclei, the distances between clusters and signals are different. So, a real opportunity arises directly in interphase nuclei to analyze the location of homologous partners of specific pairs of chromosomes in human cells, which is of great scientific interest from the point of view of the functional organization of human hereditary structures.

Пример 4. Исключительно важной иллюстрацией практического использования молекулярного маркера альфа R1-13 является опыт по определению присутствия 7-ой пары хромосом в клетках нативных препаратов ворсин хориона в пренатальной диагностике плода.Example 4. An extremely important illustration of the practical use of the molecular marker alpha R1-13 is the experience of determining the presence of the 7th pair of chromosomes in the cells of native chorionic villus preparations in prenatal diagnosis of the fetus.

Все процедуры по выделению образца ДНК альфа R1-13, его обработке с изотопной и флюоресцентной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит в том, что в примере 1 используются препараты метафазных хромосом, приготовленные из культуры лимфоцитов периферической крови здорового донора мужского пола, тогда как в примере 4 используются нативные препараты метафазных хромосом клеток ворсин хориона.All procedures for isolating an alpha R1-13 DNA sample, processing it with an isotopic and fluorescent label for in situ hybridization on metaphase chromosomes, and performing chromosome hybridization are repeated as in Example 1. The difference is that metaphase chromosome preparations prepared in Example 1 are used from a culture of peripheral blood lymphocytes of a healthy male donor, whereas in Example 4, native preparations of metaphase chromosomes of chorionic villus cells are used.

Нативные препараты из клеток ворсин хориона получают следующим образом: образцы ворсин хориона промывают в трех сменах изотонического раствора (0,9% раствор хлорида натрия) и помещают на 5-10 мин в 60% раствор уксусной кислоты при комнатной температуре, затем прикладывают («отпечатывают») образцы ворсин хориона к чистому предметному стеклу. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом помещают в термостат (температура 37°С) и используют в опытах уже через 1-2 часа после приготовления.Native preparations from chorionic villus cells are prepared as follows: samples of chorionic villi are washed in three shifts of an isotonic solution (0.9% sodium chloride solution) and placed in a 60% acetic acid solution for 5-10 minutes at room temperature, then applied (“imprint” ") Samples of chorionic villi to a clean slide. Fixation is carried out with methanol-vinegar fixative (in a ratio of 3: 1) three times for 20 minutes. Chromosome preparations are placed in a thermostat (temperature 37 ° C) and used in experiments already 1-2 hours after preparation.

При цитогенетическом анализе препаратов клеток ворсин хориона у плода был обнаружен мужской кариотип с кольцевой хромосомой, предположительно кольцевой хромосомой 7 (r7). Следует отметить, что цитогенетический анализ метафазных хромосом на нативных препаратах клеток ворсин хориона часто затруднен из-за неудовлетворительного состояния метафазных пластинок. Однако этот метод используют в практике пренатальной диагностики, когда получить результат цитогенетического анализа необходимо в течение 3-4-х дней в первом триместре беременности. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом по длине оказались в данном случае малоэффективны. После проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой хромосомы, установлено происхождение кольцевой хромосомы в кариотипе, так как эти хромосомы легко распознавались непосредственно под микроскопом по наличию двух сигналов. При анализе этих сигналов на гомологичных хромосомах были видны одна нормальная 7-ая хромосома и кольцевая 7-ая хромосома. В результате молекулярного исследования у плода обнаружена кольцевая хромосома 7 (r7). Итак, с помощью молекулярного маркера альфа R1-13 для 7-ой хромосомы установить присутствие хромосом 7-ой пары в кариотипе плода при проведении пренатальной диагностики не представляет труда.A cytogenetic analysis of chorionic villus cell preparations in the fetus revealed a male karyotype with a ring chromosome, presumably a ring chromosome 7 (r7). It should be noted that the cytogenetic analysis of metaphase chromosomes on native preparations of chorionic villus cells is often difficult due to the unsatisfactory state of metaphase plates. However, this method is used in the practice of prenatal diagnosis, when it is necessary to obtain the result of a cytogenetic analysis within 3-4 days in the first trimester of pregnancy. Traditional cytogenetic methods using differential staining of chromosomes along the length have proved to be ineffective in this case. After hybridization on metaphase chromosomes in situ using the molecular marker alpha R1-13 for the 7th chromosome, the origin of the ring chromosome in the karyotype was established, since these chromosomes were easily recognized directly under the microscope by the presence of two signals. When analyzing these signals on homologous chromosomes, one normal 7th chromosome and a ring 7th chromosome were visible. As a result of molecular studies, a fetal chromosome 7 (r7) was detected in the fetus. So, using the molecular marker alpha R1-13 for the 7th chromosome to establish the presence of chromosomes of the 7th pair in the fetal karyotype during prenatal diagnosis is not difficult.

Таким образом, разработанный способ маркирования 7-ой хромосомы с использованием клонированной последовательности альфа-сателлитной ДНК альфа R1-13 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 7-ой хромосомы как на стандартных препаратах нормальных хромосом человека (после культивирования клеток), так и в случаях перестроенных хромосом 7-ой пары на различных стадиях клеточного цикла (метафазные и интерфазные ядра), а также на цитологических нативных препаратах клеток ворсин хориона (без культивирования клеток). Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях структурных перестроек 7-ой хромосомы человека, маркерных хромосом, кольцевых хромосом, а также при анализе анеуплоидий, особенно по 7-ым хромосомам при различных формах рака. Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.Thus, the developed method for marking the 7th chromosome using the cloned sequence of alpha-satellite DNA alpha R1-13 from the human genome is an effective tool for recognizing the 7th chromosome both on standard preparations of normal human chromosomes (after cell cultivation) and in cases of rearranged chromosomes of the 7th pair at various stages of the cell cycle (metaphase and interphase nuclei), as well as on cytological native preparations of chorionic villus cells (without cell cultivation). These opportunities expand the scope of chromosome analysis in the practice of clinical genetics, genetic counseling and prenatal diagnosis in cases of structural rearrangements of the 7th human chromosome, marker chromosomes, ring chromosomes, as well as in the analysis of aneuploidy, especially on the 7th chromosomes in various forms cancer. Perhaps the effective application of the proposed method in the analysis of hybrid cell lines that are widely used for cytogenetic mapping of normal and mutant human genes.

Claims (1)

Маркирование 7-й хромосомы человека, которое предусматривает гибридизацию in situ хромосом в метафазных и интерфазных клетках тестируемого образца и ДНК-зонда, представленного маркерной плазмидой, в условиях повышенной жесткости, отличающееся тем, что денатурацию хромосомной и плазмидной ДНК проводят одновременно в условиях in situ при температуре 75°С в течение 5 мин в гибридизационной смеси, состоящей из 55%-ного раствора формамида в стандартном солевом растворе 0,3М хлористого натрия и 0,03М цитрата натрия (2×SSC), с последующей гибридизацией в течение 4-18 ч при температуре 42°С; отмывают препараты в стандартном солевом растворе (2×SSC) с 50% формамидом при температуре 42°С в течение 3 мин и растворе 2×SSC при температуре 42°С в течение 5 мин; детекцию результатов гибридизации ДНК-зонда с ДНК интерфазных или метафазных хромосом проводят с использованием флюоресцентной микроскопии, а в качестве маркерной плазмиды используют рекомбинантную плазмиду альфа R1-13, содержащую EcoRl-EcoRl-фрагмент ДНК вектора pBR 325 размером 5966 пар нуклеотидов и EcoRl-EcoRl-фрагмент альфоидной ДНК 7-й хромосомы человека размером 680 пар нуклеотидов. Marking of the 7th human chromosome, which involves in situ hybridization of chromosomes in metaphase and interphase cells of the test sample and the DNA probe represented by the marker plasmid, under conditions of increased stiffness, characterized in that the chromosome and plasmid DNA are denatured simultaneously under in situ conditions at a temperature of 75 ° C for 5 min in a hybridization mixture consisting of a 55% solution of formamide in a standard saline solution of 0.3 M sodium chloride and 0.03 M sodium citrate (2 × SSC), followed by hybridization in ix 4-18 hours at a temperature of 42 ° C; wash the preparations in standard saline (2 × SSC) with 50% formamide at a temperature of 42 ° C for 3 min and a solution of 2 × SSC at 42 ° C for 5 min; the results of hybridization of a DNA probe with DNA of interphase or metaphase chromosomes are detected using fluorescence microscopy, and recombinant plasmid alpha R1-13 containing the EcoRl-EcoRl DNA fragment of the vector pBR 325 of size 5966 nucleotides and EcoRl-EcoRl- is used as marker plasmid a fragment of alpha 7 DNA of the 7th human chromosome with a size of 680 nucleotides.